IN VITRO –TESTIEN KEHITYSTILANNE

Hanna TähtiTampereen yliopistoSolututkimuskeskus

REACH-seminaari 03.11.2005, Helsinki

3.11.2005 HT

TAUSTA

LÄÄKKEET, KEMIKAALIT, PESTISIDIT, KOSMETIIKKA…

EU -kauppa

ihmisen & ympäristön turvallisuus

Toksikologinen riski

3.11.2005 HT

EU -kauppa

ihmisen & ympäristön turvallisuus

Toksikologinen riski

LÄÄKKEET, KEMIKAALIT, PESTISIDIT, KOSMETIIKKA…

Epidemiologinen tieto

Kliininen tieto

(Q)SAR,

Physikaalis kem. ominaisuudet

IN VIVO

Koe-eläimet

TAUSTA

3.11.2005 HT

IN VIVO

koe-eläimet

EU -kauppa

ihmisen & ympäristön turvallisuus Toksikologinen riski

LÄÄKKEET, KEMIKAALIT, PESTISIDIT, KOSMETIIKKA…

Epidemiologinen tietoKliininen tieto(Q)SAR, Physikaalis-kem. ominaisuudet

IN VITRO

vaihtoehdot

3.11.2005 HT

Koe-eläinten käyttö EU:ssa

Yhteensä 10 700 000 v. 2002 Turvallisuusarviointi 1 060 000 10 % Maatalouskemikaalit 123 000 1 % Teollisuuden kemik. 136 000 1 % Kosmetiikkateollisuus 2 700 0,025 %

3.11.2005 HT

skin sensitisation5% repeated dose

10%

chronic toxicity17%

toxicokinetics2%

mutagenicity4%

carcinogenicity4%reproductive

toxicity13%

acute systemic35%

eye irritation1%

skin irritation1%

phototoxicity3%

endocrine disruptions

2%skin-eye corrosion

3%3rd Commission Report on the Number of Animal Used in the EU

Eläinten käyttö toksikologiassa 1999

3%

3.11.2005 HT

In vitro-testien kehitykseen vaikuttavat tekijät

In 1986, the Council of Ministers: Direktiivi 86/609/EEC 3-Rs:

Reduction, Refinement, Replacement 1991 ECVAM 2003 7th amendment of cosmetics

directive 76/768/EEC Ban on animal testing for finished products 2009 for cosmetic ingredients Marketing ban on cosmetics tested on animals

where alternative methods exist REACH

3.11.2005 HT

Registration, Evaluation, Authorisation of Chemicals

REACH:in on arvioitu lisäävän koe-eläinten käyttöä

Testausvaatimus perustuu painoluokkiin, eikä esim. altistumistodennäköisyyteen

30 000 kemikaalia (tuotanto > 1tn/vuosi) tulee testata 11 vuoden kuluessa: >1000 tn 2700 kemikaalia 100-1000 tn 2500 kemikaalia 10-100 tn 5000 kemikaalia 1-10 tn 20 000 kemikaalia

3.11.2005 HT

Medical Research Council UK ( 2001) arvioi kustannukset ja keston, jos käytetään pelkästään eläinkokeita:

Financial cost: 9 billion € Animals: 13 million Timescale: for 1-100 t: 2048

for 100-1000 t:2024

for 1000+ t: 2018billions of Euro, millions of animals,

decades of testing

REACH 30,000 kemikaalia > 1 t/vuosi

3.11.2005 HT

Eu:n arvio koe-eläinten määrästä

van der Jagt et al. (2004): Alternative approaches can redusce the use of test animals under REACH.-European Commission JCR Report.

Animals: 2,1- 3,9 milj. Costs: 1143 – 2274 milj. €

Underestimation? Grindon, C., Combes, R. and Balls, M.: The scientific,

animal welfare and regulatory implications of the EU REACH system for chemical safety. Regulatory Rapporteur, April 2005. www.topra.org

Validoitujen vaihtoehtomenetelmien tarve on lisääntynyt REACHin myötä

3.11.2005 HT

Validointi

Validointi on tutkimus, jossa testi arvioidaan tieteellisesti toisistaan riippumattomien laboratorioiden toimesta seuraavien ominaisuuksien suhteen:

Luotettavuus (reliability) Toistettavuus (repeatability) Relevanssi (relevance)

tieteellinen pätevyys ennustavuus Laatu (GLP, GCCP)

Systemaattiset katsaukset, meta-analyysi

3.11.2005 HT

Testin kehittäminen ja validaatio

Euroopassa validaatiota koordinoi ECVAM (European Centre for Validation of Alternative Methods)

USA:ssa ICCVAM (Interagency Co-ordinating Committee on the Validation of Alternative Methods)

Japanissa JaCVAM (Japanese Center for Validation of Alternative Methods)

ResearchResearch & &

DevelopmentDevelopment

? years

Pre-validationPre-validation

2 years

EUEU RegulatoryRegulatoryAcceptanceAcceptance

2 years

OECDOECDRegulatoryRegulatoryAcceptanceAcceptance

+ 3 years

Vali-Vali- dation dation

1 year

PeerPeer review review

1 year

Validaatiotutkimuksen edellytyksiä:Laatu (GLP, GCCP)Systemaattiset katsaukset, meta-analyysi

3.11.2005 HT

Testimenetelmän validointi

Test method

Test system Data analysis Prediction model

Reference dataConsensus standard

Test chemicals

3.11.2005 HT

Ohjeistoihin hyväksytyt in vitro vaihtoehtotestit

Genotoksisuustesti (Amesin testi, 1982, OECD)

Valotoksisuustesti (373 NRU) EU, 67/548/EEC/B.41, 2000 OECD, 432, 2002

Ihokorroosiotesti (EpiDermTM, Rat TER, EpiSkinTM) EU, 2000 OECD (431), 2002

Iholäpäisevyystesti OECD (428), 2002

Replacements

3.11.2005 HT

Hyväksyttyjä/kehitteillä

Ihon herkistävyystesti (LLNA) OECD (429), 2002, refinement,reduction

Lisäksi testejä rokotteiden testaukseen pyrogeenisuuden testaukseen useita validoituja testejä, jotka eivät vielä ohjeistoissa

Integroituja testausstrategioita, joita ei ole validoitu,useille vaikutuksille:

akuutti letaali toksisuus iho- ja silmä-ärsytys neurotoksisuus karsinogeenisuus

Refinement, reduction

3.11.2005 HT

Ihokorroosio

EpiSkin, RatTER, EpiDerm

OECD 431 Testiaine

annostetaan iholle Mitataan vaikutus

solujen elävyyteen

EpiDermTM

3-ulotteinen ihmisen ihomalli

Validoitu 1988: 60 kemikaalia, 3 testilaboratoriota, 3 testiäHyväksytty: EU 2000,

OECD 2002

3.11.2005 HT

Ihoärsytys - Draize’n ihotestiä korvaava testi

EPISKIN osoittautunut paremmaksi malliksi kuin EPIDERM

• Ei erottele hyvin ei-ärsyttäviä, ja lievästi ärsyttäviä kemikaaleja

• Solutoksisuuden lisäksi arvioidaan spesifisempiä markkereita:

• sytokiinien vapautuminen (IL- 1a)

• geeniekspressio Validaatio 2004-2005:

3.11.2005 HT

Silmä-ärsytys –Draizen kanin silmä-ärsytystestiä korvaavat testit

Eristetty naudan silmä in vitro (BCOP) Eristetty kanin silmä in vitro (IRE) Eristetty kananpojan silmä (ICE) HET-CAM kananmunan alkio (chorion-

allantois)

Validaatio epäonnistuiEC/HO, 1995; COLIPA, 1997)

Seuraava vaiheMeta-analyysi

ECVAM-ICCVAM retrospektiivinen validaatio 2006-2007

3.11.2005 HT

3-ulotteinen malli

Ihmisen solulinjojenyhdistelmäviljelmä

3.11.2005 HT

Portaittainen testausstrategia (Reduction)

Existing information

In vitro test 1

In vitro test 2

Non irritant

Mild irritant

Severe irritant

Confirmatory test in vivo

3.11.2005 HT

Akuutti toksisuus (Refinement, Reduction)

LD50 testi poistettu ohjeistoista v. 2002 Tilalla vähemmän koe-eläimiä vaativat testit:

FDT (420): 5, 50, 300, 2000 (5000) mg/kg, 5 rottaa/annos. Määritetään alin annos, joka aiheuttaa toksisuuden

ATC (423): 5, 50, 300, 2000 (5000) mg/kg, 3 rottaa/annos. Määritetään alin annos, joka aiheuttaa kuoleman

UDP (425): Aloitetaan parhaasta kuolettavan annoksen arviosta ja haarukoidaan LD50

3.11.2005 HT

Akuutin toksisuustestin kehitys

1970 - luvulla: 150 eläintä/testaus 1980 - luvulla, OECD, TG 451: 45 eläintä 1990 - luvulla, TG:420,423,425: 12-16

eläintä

2002 - LD50 –testin poisto ohjeistoista

3.11.2005 HT

Akuutti systeeminen toksisuus in vitro

Solutoksisuus korreloi akuuttiin toksisuuteen MEIC –projekti 1989-1999

korrelaatio solutoksisuusannosten ja ihmisen veren letaaliannosten välillä

ECCVAM/ICCVAM validaatiotutkimus

A-Cute-Tox –projekti 2005-2010Tähtää uuden testisysteemin kehittämiseen akuutin

toksisuuden luokitteluun140 referenssikemikaaliaKerätään tietokanta (ihmis-, eläin- ja in vitro)In silico ja in vitro –testausten kehittäminenKineettisten tekijöiden huomioon ottaminen

3.11.2005 HT

MEIC (multicentre evaluation of in vitro cytotoxicity)

Björn Ekwall 1989-1999

100 laboratoriota/200 in vitro testimenetelmää/50 kemikaalia

3 ihmisen solulinjaa ennustivat systeemistä toksisuutta paremmin kuin eläintestit

Jatkossa haluttiin kehittää testipatteri, jonka osana olisi kineettisten tekijöiden arviointi ja eräät elintoksisuuksien määritykset (neurotoksikologia, munuais- ja maksatoksisuus)

3.11.2005 HT

-4

-3

-2

-1

0

1

2

3

-6 -4 -2 0 2 4log IC50 [mmol/l]

log

LD

50

[mm

ol/

kg]

Registry of Cytotoxicity

MEIC

Akuutin toksisuuden ja solutoksisuuden välinen korrelaatio

ECVAM-ICCVAM

Joint Validation Study of two

In Vitro Basal Cytotoxicity Assays

72 chemicalshuman keratinocyte cells

BALB/c 3T3 fibroblasts3 laboratories (2 in USA, 1 in EU)

3.11.2005 HT

Acute Systemic Toxicity

Integrated Project 37 partners (14 states), granted 9 M€

17 universities, 10 SME, 2 industry, 6 institutesCoordinator:

Expertrådet, Sweden

3.11.2005 HT

Reproductive Toxicology

Integrated Project (2004-2008)26 partners (9 states), granted 9 M€

9 universities, 5 SME, 3 industry, 7 gov.Coordinators:

Univ. Tübingen / ECVAM

3.11.2005 HT

Ihon herkistävyystesti

Sens-it-iv (2006-2010) 31 partneria 14 M€ iho- ja keuhkoreaktiot in vitro strategian kehittäminen

herkistymistä aiheuttavien kemikaalien tunnistamiseksi

3.11.2005 HT

Kehitteillä olevat testit

Mutageenisuuden ja karsinogeenisuuden arviointiin• mikronukleustesti, MNT (validaatio 2005) • solutransformaatio, CTA (validaatio 2005)

Hormonihäiritsijöiden arviointi osana ReProTect-projektia• prevalidaatio alkamassa

Toksikokinetiikka (2005)• fysiologiaan perustuva farmakokineettinen mallintaminen• suolen absorptiomalli• veri-aivoestemalli• metaboliamalli

Akuutti toksisuus kalalle• reduction alternative, peer review in 2005, Refinement, Reduction• eläintestin vaihtoehdon validaatio 2006-2007

Elintoksisuuksien arviointi• neurotoksisuus• munuais- ja maksatoksisuus

Kroonisen toksisuuden arviointi• ECVAM-Workshop 2004, suunnitelma-asteella

3.11.2005 HT

REACH

1-10 t/v n. 20 000 kemikaalia in vitro ihoärsytys/korroosio in vitro silmä-ärsytys/korroosio in vitro genotoksisuus (bakteeritesti) in vivo ihoherkistävyys (LLNA)

10-100 t/v n. 5000 in vitro sytogeenisuus, mutageenisuus in vivo ihoärsytys/korroosio in vivo silmä-ärsytys/korroosio in vivo akuutti toksisuus in vivo 28-vrk toistuva altistus in vivo lisääntymistoksikologia in vivo toksikokinetiikka in vivo lyhytkestoinen kalatoksisuus

3.11.2005 HT

REACH

100-1000 t/v, n. 2500 in vivo 90-vrk toistuva annostus in vivo teratogeenisuus, lisääntymishäiriöt in vivo krooninen kalatoksisuus bioakkumulaatio

> 1000t/v, n. 2700 in vivo mutageenisuus in vivo lisääntymistoksikologia in vivo karsinogeenisuus in vivo pitkäaikainen toksisuus (linnuissa)

3.11.2005 HT

BackgroundName

Scale of use etc.

PhysicochemicalProperties

VolatilitySolubility etc.

Existing toxicological datareview

Data sufficient for classification

Priorities for further testing Tier 2

QSARPredicted metabolismPercutaneous absorptionCorrosivitySensitization

In vitro testing Tier 1No

Yes

NoYesTesting required

Further informationrequired

3Rs

Testaus-strategiat