INAUGURAL - DISSERTATION

zur Erlangung der Doktorwürde

der Naturwissenschaftlich-Mathematischen Gesamtfakultät

der Ruprecht - Karls - Universität

Heidelberg

vorgelegt von Diplom-Biologe Thorsten Ruppert

aus Frankenthal (Pfalz) Tag der mündlichen Prüfung: ................................................

Molekularbiologische Ursachen der chronischen tubulointerstitiellen Nephritis bei

Methylmalonazidurie-Patienten

Gutachter: Herr Prof. Dr. rer. nat. Gert Fricker

Herr Prof. Dr. med., Prof. h.c. (RCH) Georg F. Hoffmann

Abstract The aim of this study was to investigate the renal pathogenesis of chronic tubulointerstitial nephritis in patients of methylmalonic aciduria, which causes chronic kidney failure. As a research model we chose proximal tubule epithelial cells of patients of methylmalonic aciduria. Since in some studies a multiple disturbance of mitochondrial energy metabolism has been shown to be the cause of organ failure in patients of methylmalonic aciduria, we focused first on a description of the energy metabolism of the proximal tubule epithelial cells. The decreased activity of phosphofructokinase 1 results in less flux and thus causes a deterioration of glycolysis. In context of the unsuccessful isolation of mitochondria, the decreased activity of mitochondrial aconitase, 2-oxoglutarate-dehydrogenesis complex and cytochrome c oxidase suggest a mitochondrial defect in proximal tubule epithelial cells of patients of methylmalonic aciduria that manifested structurally and functionally. The mitochondrial defect led further to increased ROS production, which could be increased even more by metabolic stress due to the application of glucose, pyruvate, methylmalonic acid, propionic acid and isoleucine. A higher amount of reduced glutathione and a lower amount of free glutathione due to higher concentration of ROS strengthened the hypothesis of increased oxidative stress in proximal tubule epithelial cells of patients of methylmalonic aciduria. Higher concentrations of ROS resulted in concert with increased expression of pIRE1 and degenerated endoplasmic reticulum with enlarged lumen, which were recognizable on electron micrographs, in stress of endoplasmic reticulum in proximal tubule epithelial cells of patients of methylmalonic aciduria. Reduced activity of mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1) under metabolic stress and disturbances in the energy metabolism in proximal tubule epithelial cells of patients of methylmalonic aciduria indicated a positive regulation of autophagosome formation. In concert, structures surrounded by a double membrane were recognizable on electron micrographs, and the increased expression of P62 and LC3-II under metabolic stress led to the adoption of increased macro-autophagy. This could be confirmed by a higher amount of autolysosomes. It is known that inflammation of a tissue is always accompanied by the infiltration by cells of the immune system. With respect to cytokines required for recruitment of the immune system the expression of interleukin-8 was higher and its apical and basolateral secretion was stronger in proximal tubule epithelial cells of patients of methylmalonic aciduria. The strong correlation between autophagy and the secretion of interleukin-8 in proximal tubule epithelial cells of patients of methylmalonic aciduria pointed out that autophagy is a direct cause of the increased transcription of interleukin-8 or promotes indirectly causes of the transcription of interleukin-8. This can lead to an infiltration of the interstitium of the proximal tubule by neutrophils, macrophages and T cells. The inflammatory response is triggered further and leads over a long period to failure of kidney function.

Übersicht Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der renalen Pathogenese der chronischen tubulointerstitiellen Nephritis bei Methylmalonazidurie-Patienten, die zur Entwicklung eines chronischen Nierenversagens führt. Als Untersuchungsmodell wählten wir proximale Tubulusepithelzellen von Methylmalonazidurie-Patienten. Da in einigen Studien eine multiple Störung des mitochondrialen Energiestoffwechsels als Ursache des Organversagens bei Methylmalonazidurie-Patienten gezeigt wurde, fokussierten wir uns zunächst auf eine Beschreibung des Energiemetabolismus der proximalen Tubulusepithelzellen. Die verringerte Aktivität der Phosphofruktokinase 1 führt zu einem geringeren Flux und damit zu einer Beeinträchtigung der Glykolyse. In Zusammenhang mit der erfolglosen Isolierung von Mitochondrien, ließ die verminderte Aktivität der mitochondrialen Aconitase, des 2-Oxoglutarat-Dehydrogenasekomplexes und der Cytochrom c-Oxidase auf einen mitochondrialen Defekt in proximale Tubulusepithelzellen von Methylmalonazidurie-Patienten schließen, der sich strukturell und funktionell manifestierte. Der mitochondriale Defekt führte weiterhin zu erhöhter ROS-Produktion, die sich durch metabolischen Stress aufgrund der Applikation von Glukose, Pyruvat, Methylmalonsäure, Propionsäure und Isoleucin steigern ließ. Erhöhtes Glutathiondisulfid und verringertes freies Glutathion aufgrund höherer ROS-Konzentration stärkten die Hypothese erhöhten oxidativen Stresses in proximalen Tubulusepithelzellen von Methylmalonazidurie-Patienten. Die höhere ROS-Konzentration führte im Zusammenspiel mit erhöhter Expression von pIRE1 und degeneriertem endoplasmatischen Retikulum mit vergrößertem Lumen, die auf elektronenmikroskopischen Bildern erkennbar waren, zu Stress des Endoplasmatischen Retikulums in proximalen Tubulusepithelzellen von Methylmalonazidurie-Patienten. Verringerte Aktivität von mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1) unter metabolischem Stress und die Störungen im Energiemetabolismus deuteten bei proximalen Tubulusepithelzellen von Methylmalonazidurie-Patienten auf eine positive Regulation der Autophagosombildung hin. In diesem Zusammenhang führten von einer Doppelmembran umgebene Strukturen, die auf elektronenmikroskopischen Bildern zu sehen waren, und die erhöhte Expression von P62 und LC3-II unter metabolischem Stress zur Annahme erhöhter Makro-Autophagie. Diese ließ sich durch mehr Autolysosomen bestätigen. Es ist bekannt, dass die Inflammation eines Gewebes immer mit der Infiltrierung durch Zellen des Immunsystems einhergeht. Die Expression der zur Rekrutierung des Immunsystems notwendigen Zytokine war bei proximalen Tubulusepithelzellen von Methylmalonazidurie-Patienten in Form von Interleukin-8 höher, die apikale und basolaterale Sekretion fiel stärker aus. Die starke Korrelation zwischen Autophagie und der Sezernierung von Interleukin-8 bei proximalen Tubulusepithelzellen von Methylmalonazidurie-Patienten deutete darauf hin, dass Autophagie eine direkte Ursache der erhöhten Transkription von Interleukin-8 ist oder indirekt Ursachen der Transkription von Interleukin-8 fördert. Dies kann zu einer Infiltration des Interstitiums des proximalen Tubulus durch Neutrophile, Makrophagen und T-Zellen führen. Die inflammatorische Reaktion wird somit weiter getriggert und führt über längere Zeit zum Versagen der Nierenfunktionen.

Eidesstattliche Versicherung

Hiermit versichere ich eidesstattlich, dass ich die vorliegende Dissertation

selbstständig verfasst und keine anderen als die von mir aufgeführten Hilfsmittel

verwendet habe.

Heidelberg, Januar 2015

Thorsten Ruppert

Danksagung Ich danke:

Herrn Prof. Dr. rer. nat. Gert Fricker und Herrn Prof. Dr. med., Prof. h.c. (RCH) Georg

Hoffmann für die Supervision des Promotionsvorhabens.

Herrn Priv.- Doz. Dr. rer. nat. Sven Sauer für die Bereitstellung des sehr komplexen

und interessanten Themas, die sehr gute persönliche und fachliche Betreuung, die

hilfreichen Denkanstöße und Diskussionen und seine Geduld.

Herrn Prof. Dr. med. Stefan Kölker und Herrn Priv.- Doz. Dr. phil. nat. Jürgen Okun

für die fruchtbaren Diskussionen.

Meinen (ehemaligen) Kolleginnen und Kollegen Silvana, Verena, Shoko, Tunc,

Roland 1, Roland 2, Thorsten 2, Sonja und Helga, sowie den Kolleginnen und

Kollegen der Nachbararbeitsgruppe.

Meinen Eltern für ihre unendliche Unterstützung, Rückendeckung, Vertrauen und

Geduld.

Bianca Baumert und ihren Eltern für ihre Motivation, Unterstützung und Geduld.

Teile dieser Arbeit wurden als Kongressbeiträge vorgestellt: Ruppert T, Opp S, Suormala T, Okun JG, Kölker S, Morath MA, Sauer SW (2011). Isolation and characterization of proximal tubule epithelial cells from urine of methylmalonic aciduria patients. Poster, SSIEM Genf, Schweiz. Ruppert T, Opp S, Suormala T, Okun JG, Kölker S, Morath MA, Sauer SW (2012). Isolation und Charakterisierung von proximalen Tubulusepithelzellen aus dem Urin von Methylmalonazidurie-Patienten. Poster, GPN Heidelberg, Deutschland. Ruppert T, Tuncel AT, Opp S, Suormala T, Okun JG, Kölker S, Morath MA, Sauer SW (2012). Nephrotoxicity of maleic acid and methylmalonic acid - on the difference of Fanconi Syndrome and tubulointerstitial nephritis. Poster, SSIEM Birmingham, England. Ruppert T, Tuncel AT, Opp S, Okun JG, Kölker S, Morath MA, Sauer SW (2013). Nephrotoxizität von Maleinsäure und Methylmalonsäure – Unterschied zwischen Fanconi-Syndrom und tubulointerstitieller Nephritis. Poster, APS Fulda, Deutschland. Ruppert T, Opp S, Tagscherer KE, Kastl L, Gröne HJ, Hoffmann GF, Kölker S, Okun JG, Morath MA, Sauer SW (2013). Activation of autophagic and proinflammatory cascades in proximal tubule of methylmalonic aciduria patients. Poster, ICIEM Barcelona, Spanien.

Inhaltsverzeichnis Verzeichnisse

1 Einleitung 11.1 Angeborene Störungen im zellulären Stoffwechsel 1

1.2 Organoazidurie 1

1.3 Methylmalonazidurie 2

1.4 Propionazidurie 4

1.5 Funktionsweise der Methylmalonyl-CoA-Mutase und beteiligte Co-Faktoren 4

1.6 Tiermodelle zur MMA 6

1.6.1 Die Mut+/- und Mut-/- Maus 6

1.6.2 Artifizielles Rattenmodell durch Applikation von Methylmalonsäure 8

1.7 Renale Manifestation bei MMA-Patienten 8

1.7.1 Aufbau und Funktionen der Niere 8

1.7.2 Eigenschaften und Funktionen von proximalen Tubulusepithelzellen 9

1.7.3 Inflammatorische Funktionen der Niere und Entwicklung einer chronischen

Nephritis 9

1.8 Mögliche Ursachen der cTIN bei MMA-Patienten 12

1.8.1 Stress des endoplasmatischen Retikulums - Unfolded Protein Response 13

1.8.2 Die Regulation von mTOR-Komplex 1 14

1.8.3 Aufbau von mTORC1 und Einfluss auf Autophagie 17

1.8.4 Autophagie 18

1.8.4.1 Makroautophagie 19

1.9 Fragestellung der Arbeit 21

2 Material 232.1 Chemikalien 23

2.2 Geräte 25

2.3 Verbrauchsmaterialien 25

2.4 Zellkulturmedien 26

2.5 Antikörper 26

2.6 ELISA-Kits 27

2.7 Lösungen für proteinbiochemische Methoden 27

3 Methoden 303.1 Zellkultur 30

3.1.1 Isolierung von humanen primären proximalen Tubulusepithelzellen (hPTEC) 30

3.1.2 Kultivierung von eukaryotischen Zellen 30

3.1.3 Kultivieren und Passagieren von PTEC 30

3.1.4 Kultivieren und Passagieren von immortalisierten Zellen 31

3.1.5 Ernten von immortalisierten Zellen 31

3.2 Molekularbiologische Methoden 31

3.2.1 Polymerase-Kettenreaktion 32

3.2.2 Agarosegelelektrophorese 32

3.2.3 Transformation von DNS in kompetente Bakterienzellen wofür 33

3.2.4 Analytische Isolierung von Plasmid-DNS mit dem „QIAprep Spin Miniprep Kit“ 33

3.2.5 Präparative Isolierung von Plasmid-DNS 33

3.2.6 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 34

3.2.7 Herstellung kompetenter Bakterienzellen 34

3.2.8 Transfektion eukaryotischer Zellen zur Immortalisierung 34

3.3 Proteinbiochemische Methoden 35

3.3.1 Proteinbestimmung 35

3.3.2 SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese) 35

3.3.3 Färbung von Proteingelen durch Coomassie-Brillant Blau 36

3.3.4 Western Blot 36

3.3.5 Semi-Dry Blot 37

3.3.6 Entwicklung von Western Blots mittels Chemilumineszenz 37

3.3.7 Wiederverwendung von Western Blots 38

3.3.8 Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) 38

3.3.9 Expressionsnachweis von Proteinen mit Dotplots 38

3.4 Färbung der Zellen mit Acridinorange und FACS-Analyse 38

3.5 Spektrophotometrische Methoden 39

3.5.1 Subzellulare Fraktionierung durch differentielle Zentrifugation 40

3.5.2 Probenaufarbeitung für Enzyme des Krebszyklus und der Atmungskette 40

3.5.3 Bestimmung der Einzelenzymaktivitäten der Glykolyse 413.5.3.1 Hexokinase 41

3.5.3.2 Phosphofruktokinase 41

3.5.3.3 Triosephosphatisomerase 41

3.5.3.4 Glutaraldehydphosphatdehydrogenase 41

3.5.3.5 Phosphoglyzeratmutase 42

3.5.3.6 Enolase 42

3.5.3.7 Pyruvatkinase (hoch affin) 42

3.5.3.8 Pyruvatkinase (niedrig affin) 42

3.5.3.9 Laktatdehydrogenase 43

3.5.4 Bestimmung der Einzelenzymaktivitäten des Zitrat-Zyklus 43

3.5.4.1 Zitratsynthase 43

3.5.4.2 Mitochondriale Aconitase 43

3.5.4.3 Isozitratdehydrogenase 43

3.5.4.4 Fumarase 44

3.5.4.5 Malatdehydrogenase 44

3.5.4.6 Bestimmung der Aktivität von Pyruvatdehydrogenasekomplex (PDHc) und 2-

Oxoglutaratdehydrogenasekomplex (OGDHc) 44

3.5.5 Bestimmung der Aktivität der Enzyme der Atmungskettenkomplexe 443.5.5.1 Komplex I (NADH-Reduktase) 44

3.5.5.2 Komplex II (Succinat-Dehydrogenase) 45

3.5.5.3 Komplex III (Cytochrom c-Reduktase) 45

3.5.5.4 Komplex IV (Cytochrom c-Oxidase) 45

3.5.5.5 Komplex V (ATP-Synthase) 46

3.6 Bestimmung des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs 46

3.7 ROS-Nachweis durch reduziertes Glutathion 47

3.8 Färbung der Zellen mit H2DCFDA und ROS-Nachweis 47

3.9 Quantitative Analyse von MMA mittels MS/MS 48

3.10 Statistische Auswertung 48

4 Ergebnisse 494.1 Relevante Werte der Zellspender 49

4.2 Charakterisierung der verwendeten humanen PTEC 51

4.3 Produktion von Methylmalonsäure 55

4.4 Bioenergetik 56

4.4.1 Sauerstoffverbrauch der Mitochondrien 56

4.4.2 Glykolyse 57

4.4.3 Pyruvat-Dehydrogenasekomplex 59

4.4.4 Zitrat-Zyklus 60

4.4.5 Oxidative Phosphorylierung 61

4.5 Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) 62

4.5.1 Nachweis von ROS durch die Oxidierung von reduziertem Glutathion 62

4.5.2 Nachweis von ROS durch 2’,7’-Dichloro-Dihydrofluoresceindiacetat 63

4.6 Subzellulare Strukturen der humanen PTEC im Elektronenmikroskop 65

4.7 Initiation, Entwicklung und Abbau von Autophagosomen bei PTEC

von MMA-Patienten 68

4.7.1 Regulation der Reifung der Phagophore durch mTORC1 68

4.7.2 Reifung der Phagophore 71

4.7.3 Lysosomaler Abbau des Autophagosoms 74

4.8 Stress des endoplasmatischen Retikulums - unfolded protein response 76

4.9 Inflammation 77

4.9.1 Expressionsvergleich löslicher Rezeptoren 77

4.9.2 Expressionsvergleich von Rezeptoren 79

4.9.3 Qualitativer Nachweis exprimierter Zytokine im Zellmedium 80

4.9.4 Quantitativer Nachweis von Interleukin-8 intrazellulär und im Zellmedium 81

4.10 Korrelationen der Expression von IL8, Generierung von ROS, erhöhter

Autophagie und verringerter Aktivität der Cytochrom c-Oxidase 83

5 Diskussion 855.1 Auswahl des verwendeten Zellkulturmodells 85

5.2 Charakterisierung des verwendeten Zellkulturmodells 86

5.3 PTEC von MMA-Patienten zeigen Defekte im Energiemetabolismus 87

5.4 PTEC von MMA-Patienten haben eine erhöhte ROS-Produktion 91

5.5 PTEC von MMA-Patienten zeigen erhöhte Makro-Autophagie 94

5.6 ER-Stress bei PTEC von MMA-Patienten verstärkt die Autophagie 97

5.7 PTEC von MMA-Patienten exprimieren Zytokine und Rezeptoren

zur Interaktion mit Immunzellen 98

5.8 Korrelation von Autophagie und IL-8-Expression bei PTEC von

MMA-Patienten 101

5.9 Ausblick 103

5.10 Zusammenfassung 105

6 Literaturverzeichnis 109

7 Anhang I7.1 Abkürzungsverzeichnis I

7.2 Tabellarische Auflistung von im Ergebnisteil nur graphisch dargestellter

Messwerte V

7.3 Western Blots der im Ergebnisteil graphisch dargestellten Expression

einzelner Proteine VII

Abbildungsverzeichnis

Abbildung (1) Die Umlagerung von D-Methylmalonyl-CoA zu L-Methylmalonyl-CoA 4

Abbildung (2) Schematische Darstellung der Umlagerungsreaktion von L-Methylmalonyl-CoA zu Succinyl-CoA 6

Abbildung (3) Die Aktivierung und Regulation von mTORC1 16

Abbildung (4) Lichtmikroskopische Aufnahmen aller verwendeten humanen PTEC 53

Abbildung (5) Expression von γ-Glutamyltransferase 1 (γGT1) und Aquaporin 1 (AQP1) der verwendeten PTEC 54

Abbildung (6) MMS-Konzentration im Medium von PTEC von Kontrollen und MMA-Patienten 55

Abbildung (7) Mitochondrialer Sauerstoffverbrauch der humanen PTEC 57

Abbildung (8) Enzymaktivitäten der glykolytischen Enzyme 58

Abbildung (9) Enzymaktivität des PDHc 59

Abbildung (10) Enzymaktivitäten des Zitrat-Zyklus 60

Abbildung (11) Enzymaktivitäten der Atmungskettenkomplexe von PTEC der Kontrollen, PA- und MMA-Patienten 61

Abbildung (12) Glutathion-Gehalt der PTEC von Kontrollen und MMA-Patienten 62

Abbildung (13) Entstehung von ROS 64

Abbildung (14) Elektronenmikroskopische Bilder der PTEC 67

Abbildung (15) Verlauf der Ratio der relativen Expression von pPRAS40/PRAS40 70

Abbildung (16) Verlauf der Ratio der relativen Expression von pmTO/mTOR 71

Abbildung (17) Relative Expression von LC3-II 72

Abbildung (18) Relative Expression von P62 74

Abbildung (19) Ratio der Acridinorangefärbung 75

Abbildung (20) Relative Expression von pIRE1 77

Abbildung (21) Relative Expression potentiell an der Interaktion mit Immunzellen beteiligter Proteine von PTEC der Kontrollen und MMA-Patienten 78

Abbildung (22) Expressionsvergleich der Immunrezeptoren CD46, CD55, CD59 und CD88 80

Abbildung (23) Relative Konzentration von IL-8 im Medium 81

Abbildung (24) Konzentration von Interleukin-8 in apikalem und basolateralem Medium 82

Abbildung (25) Zusammenwirkender Mechanismus der molekularbiologischen Ursachen der chronischen tubulointerstitiellen Nephritis in PTEC von MMA-Patienten 107

Tabellenverzeichnis

Tabelle (1) Zusammensetzung von Sammel- und Trenngelen für SDS-PAGE 36

Tabelle (2) Übersichtsdaten von Kontrollen, MMA- und PA-Patienten 49

Tabelle (3) Funktionen der untersuchten Immunrezeptoren CD46, CD55, CD59 und CD88 79

Tabelle (4) Schwellenwerte für die Stärke des Zusammenhangs zwischen 2 Variablen 83

Tabelle (5) Bestimmtheitsmaß und Zusammenhang der Korrelationsvariablen 84

1 Einleitung

1.1 Angeborene Störungen im zellulären Stoffwechsel

Als angeborene Störung im zellulären Stoffwechsel wird eine Gruppe von erblichen

Defekten bezeichnet, die bei Neugeborenen mit einer kumulativen Inzidenz von etwa

1:500 auftritt (Zschocke und Hoffmann, 2004). In der Medizin stellt die Erforschung

der angeborenen Stoffwechseldefekte ein relativ junges Gebiet dar, welches mit der

Entwicklung neuer diagnostischer Methoden etabliert wurde. Für Patienten sind die

Folgen unbehandelter Stoffwechselstörungen oft dramatisch, da häufig bereits kurz

nach der Geburt die klinische Symptomatik auftritt und sich ohne adäquate Therapie

rasch verschlechtert. Somit ist eine frühzeitige Diagnose der Störung und ihrer

unmittelbaren Behandlung von großer Wichtigkeit, da viele Defekte schon in den

ersten Lebensmonaten durch irreversible Schädigungen von Organen den

Krankheitsverlauf charakterisieren. Durch die Etablierung des

Neugeborenenscreenings konnten schon große Fortschritte zur Früherkennung von

angeborenen Stoffwechseldefekten erzielt werden. Da schon wenige Blutstropfen

ausreichen um mit der Massenspektrometrie Defekte zu erkennen und eine frühe

Behandlung zu ermöglichen, können so Organschäden oft verhindert werden. Zur

Entwicklung von Therapien für noch nicht oder schlecht behandelbare

Stoffwechselstörungen ist jedoch zudem die Entschlüsselung der zugrunde

liegenden Pathomechanismen notwendig.

1.2 Organoazidurie

Der Begriff Organoazidurie ist eine Sammelbezeichnung für eine heterogene Gruppe

von Stoffwechselerkrankungen, bei welchen der Abbau von Aminosäuren oder

Fettsäuren betroffen ist. Verschiedene Stoffwechselintermediate können nicht oder

nur unvollständig abgebaut werden und es kommt durch die Akkumulierung

organischer Säuren zu einer Intoxikation des gesamten Organismus, was auf

verschiedenen Ebenen Auswirkungen hat. Die Auswirkungen auf den

Gesamtorganismus sind im klinischen Bereich Hyperammonämie, Hypoglykämie,

Laktatazidose, Ketose oder Carnitinmangel. Typisch für den Verlauf der

Organoazidurien ist eine neonatale Stoffwechselkrise, welche wenige Stunden oder

Tage nach der Nahrungsaufnahme zu schweren metabolischen Entgleisungen

führen kann. Im weiteren Verlauf treten häufig wiederkehrende Krisen sowie mentale

oder Wachstumsretardierungen auf.

Die Organoazidurien lassen sich in sogenannte klassische Organoazidurien und

zerebrale Organoazidurien unterteilen. Zu den zerebralen Organoazidurien gehören

u.a. die Glutarazidurie Typ 1, D-2- und L-2-Hydroxyglutarazidurie. Die klassischen

Organoazidurien umfassen die Propionazidurie, Isovalerianazidurie und

Methylmalonazidurie.

1.3 Methylmalonazidurie

Zuerst beschrieben wurden die Auswirkungen der Methylmalonazidurie (MMA) 1967

von Oberholzer und Kollegen. Die MMA bilden eine Gruppe von ätiologisch

heterogenen, angeborenen Stoffwechseldefekten, welche sich im Abbau

verzweigtkettiger Aminosäuren, ungeradzahliger Fettsäuren und der Cholesterol-

seitenkette zeigen. Sie treten in einer kumulativen Inzidenz von 1:50.000 – 1:100.000

auf (Sniderman et al., 1999). Auf molekularer Ebene liegen die Ursachen der

autosomal-rezessiv vererbten Defekte der MMA bei einem Funktionsverlust des

mitochondrialen Enzyms Methylmalonyl-CoA-Mutase (MCM; EC 5.4.99.2, Ledley et

al., 1988), des Cobalamintransports oder der Synthese von 5´-

Deoxyadenosylcobalamin, welches als Cofaktor der MCM (Mahoney et al., 1975)

fungiert. Ist die MCM unmittelbar betroffen, liegt eine isolierte MMA vor, wobei der

Funktionsverlust komplett (mut0) oder partiell (mut-) sein kann. Bei einem Defekt im

Stoffwechsel des Cofaktors von MCM (CblA, CblB, CblC, CblD) kann die

Enzymaktivität durch Applikation von Hydroxycobalamin gesteigert werden.

Methylmalonyl-CoA wird von der MCM katalytisch zu Succinyl-CoA metabolisiert,

welches als Succinat den Zitrat-Zyklus speist und somit der Energieversorgung der

Zelle dient. Die Akkumulation von Methylmalonsäure (MMS) und den Metaboliten 3-

Hydroxypropionsäure, 2-Methylzitronensäure des alternativen Propionat-

Stoffwechselwegs tritt bei allen Formen der MMA auf (Fenton et al., 2001). Patienten

entwickeln häufig durch katabolen Stress metabolische Entgleisungen (z.B. im

Rahmen von fieberhaften Infektionskrankheiten), welche durch Laktatazidose,

Hypoglykämie, Hyperketose und Hyperammonämie gekennzeichnet sind. Bei

verzögertem oder ausbleibendem Therapiebeginn ist meist eine starke

Verschlechterung der Patienten zu beobachten, was über Multiorganversagen bis

zum Tod führen kann. Zudem treten schwere chronische Schädigungen des ZNS

und der Nieren, sowie anderer Organe (Herz, Pankreas, Auge) auf. Bei neonatalen

Patienten zeigen sich oft Episoden von Lethargie, Erbrechen, Hypotonie,

Hyperthermie, Atemproblemen und Thrombozytopenie.

Beim Pathomechanismus auf der Ebene des Energiemetabolismus zeigt MMS keine

direkte inhibitorische Effekte (Okun et al., 2002, Kölker et al., 2003). Weitere

Metabolite wie Propionyl-CoA und 2-Methylzitrat hemmen jedoch synergistisch den

mitochondrialen Energiestoffwechsel durch die Inhibition des Zitrat-Zyklus, des

Pyruvatdehydrogenase-Komplexes und der Atmungskette (Okun et al., 2002; Kölker

et al., 2003; Schwab et al., 2006; Morath et al., 2008).

Bei Patienten mit isolierter MMA, bei welchen die Krankheit durch einen partiellen

(mut-) oder kompletten (mut0) Mutasedefekt oder durch angeborene Defekte im

Cobalaminstoffwechsel (CblA, CblB) verursacht werden, entwickelt sich häufig eine

chronische tubulointerstitielle Nephritis (cTIN). Akuten schweren, metabolischen

Krisen wird mit einer Kurzzeit-Therapie oder einer Langzeittherapie mit metabolischer

Dauerbehandlung begegnet.

Die Kurzzeittherapie sieht eine Gabe von 1) L-Carnitin, 2) Antibiotika, sowie

zusätzlich 3) eine Gabe von Glukose und Insulin zur Energieversorgung, 4) einen

Stopp der Proteinzufuhr vor, um die Krise zu mildern. Das Ziel ist die Minimierung

des Katabolismus und die Förderung des Anabolismus durch Glukose bei

gleichzeitiger Reduzierung der Proteinzufuhr. Die Langzeit-Therapie umschließt 1)

eine proteinarme Diät, 2) eine Aminosäuremischung, die eine Zufuhr der

verzweigtkettigen Aminosäuren Leucin, Isoleucin, Valin und Threonin minimiert, 3)

eine Supplementation von L-Carnitin, das toxisches Acyl-CoA bindet und aus der

Zelle transportiert werden kann, 4) eine Supplementation von Hydroxycobalamin bei

cobalaminsensitiven Patienten, 5) Gabe von Antibiotika gegen propionsäurebildende

Bakterien im Darm (Morath et al., 2013).

Trotz allem führt beim Großteil der Patienten die cTIN zu einer chronischen

Niereninsuffizienz und weitergehend zur Dialysepflicht (Rötig et al., 1995; Buemi et

al., 1997; Hörster et al., 2009; Zwickler et al., 2008). Patienten mit mut0- und CblB-

Defekt zeigen die größte Anfälligkeit für die Entwicklung einer cTIN (Hörster et al.,

2007).

1.4 Propionazidurie

Patienten der Propionazidurie (PA) besitzen ähnliche Symptome wie Patienten der

MMA. Bei ihnen ist der Enzymdefekt in der Propionyl-CoA-Carboxylase lokalisiert,

die einen enzymatischen Schritt vor der Methylmalonyl-CoA-Mutase liegt. Die

Propionyl-CoA-Carboxylase verwendet Biotin als Co-Faktor und katalysiert die

Umwandlung von Propionyl-CoA zu D-Methylmalonyl-CoA (Deodato et al., 2006).

Systematische Studien über eine cTIN bei PA-Patienten wurden noch nicht

durchgeführt, es existieren nur vereinzelte Berichte und Fallbeschreibungen über

Patienten, die im Verlauf des Erwachsenenalters eine Niereninsuffizienz entwickeln

haben. Der Hauptunterschied zwischen dem Verlauf der MMA und der PA ist somit

das Auftreten der cTIN bei MMA-Patienten.

1.5 Funktionsweise der Methylmalonyl-CoA-Mutase und beteiligte Co-Faktoren

Die Methylmalonyl-CoA-Mutase (EC 5.4.99.2) (MCM) gehört zur Gruppe der

Isomerasen und katalysiert in den Mitochondrien die Umlagerungsreaktion von L-

Methylmalonyl-CoA zu Succinyl-CoA, das nach Abspaltung von CoA als Succinat in

den Zitrat-Zyklus einfließt. Die in Abbildung (1) gezeigte Reaktion ist reversibel, läuft

aber im Normalfall nur in eine Richtung.

Abbildung (1) Die Umlagerung von D-Methylmalonyl-CoA zu L-Methylmalonyl-CoA wird durch die Methylmalonyl-CoA Isomerase katalysiert. Im anschließenden Schritt katalysiert die Methylmalonyl-CoA Mutase mit dem Cofaktor Adenosylcobalamin die Isomerisierung von L-Methylmalonyl-CoA zu Succinyl-CoA.

Das 750 Aminosäuren große Protein wird beim Menschen vom Mut-Gen codiert und

ist auf Chromosom 6 lokalisiert.

Der zur Reaktion benötigte Cofaktor ist Adenosylcobalamin (AdoB12, Vitamin B12). Da

Cobalamin (Cbl) nicht von Menschen, Tieren und Pflanzen, sondern nur von

Bakterien gebildet werden kann, bezieht der Körper das benötigte Cobalamin von

Bakterien aus dem Verdauungstrakt. Cobalamin ist der einzige bekannte Naturstoff

mit einem Cobaltatom. Das sechswertige Cobaltatom ist von fünf Stickstoffatomen

umgeben und einem variablen Rest. Anhand des Rests lässt sich zwischen Cyano-

Cbl (R= -C≡N), Aquocobalamin (R= -OH2), Hydroxy-Cbl (R= -OH) und Methyl-Cbl

(R= -CH3) unterscheiden.

Der katalytische Mechanismus ist in Abbildung (2) dargestellt und beginnt mit der

homolytischen Spaltung der C-Co(III) Bindung, wobei Kohlenstoff- und Cobaltatom je

ein Elektron behalten. Das Cobaltatom wechselt daraufhin zwischen den zwei

Oxidationszuständen Co(III) und Co(II). Im katalytischen Prozess stellt AdoB12 somit

reversibel freie Radikale zur Verfügung, welche die Umlagerungsreaktion einleiten

(Abbildung (2)). Das freie Elektron des Ethylrests des AdoB12 zieht ein Elektron mit

Wasserstoffatom vom Methylrest des L-Methylmalonyl-CoA so dass ein Methylrest

entsteht. Das dadurch freigewordene Elektron des C-Atoms des entstandenen

Ethylrests von L-Methylmalonyl-CoA geht eine lose Bindung mit dem Co(II)-Atom von

AdoB12 ein, das dadurch in den Co(III)-Zustand übergeht. Das Elektronenpaar der

Kohlenstoffbindung zwischen C2- und C3-Atom wird zum Ethylrest gezogen (2). Das

freie Elektron springt vom Ethylrest zum Sauerstoff. Dadurch rückt ein

Elektronenpaar der Doppelbindung zwischen C3- und Sauerstoffatom zum C-Atom

des Ethylrests und die leichte Bindung geht vom Ethylrest des L-Methylmalonyl-CoA

und das Co(III)-Atom in den Co(II)-Zustand über und löst sich(3). Das Elektronenpaar

zwischen C2- und C3-Atom füllt die Doppelbindung zwischen C3-Atom und

Sauerstoffatom wieder auf. Das C2-Atom geht eine schwache Bindung mit dem

Co(II)-Atom ein, die Bindung zum C3-Atom besteht nur noch durch ein freies Elektron

(4). Das Wasserstoffatom welches zu Beginn vom Methylrest von L-Methylmalonyl-

CoA auf Adenosylcobalamin übertragen wurde, geht nun auf das C3-Atom von L-

Methylmalonyl-CoA über. Die Bindung zwischen Ethylrest und C3-Atom bildet sich

aus und das freie Elektron geht wieder auf das Co(II)-Atom des Adenosylcobalamin

über, so dass sich die Oxidationsstufe wieder in de Co(III)-Zustand ändert und das

Co(III)-Atom wieder eine Bindung mit dem Ethylrest des Adenosylcobalamins eingeht

und der Zyklus von neuem beginnen kann (5).

Abbildung (2) Schematische Darstellung der Umlagerungsreaktion von L-Methylmalonyl-CoA zu Succinyl-CoA durch die Methylmalonyl-CoA-Mutase und den Cofaktor Adenosylcobalamin.

1.6 Tiermodelle zur MMA

Das murine Mut-Gen liegt auf Chromosom 17 und weißt eine Homologie von 94 %

zum humanen Gen auf. Das Gen codiert für ein 748 Aminosäuren langes Protein mit

einer 30 Aminosäuren langen mitochondrialen Zielsequenz. Die murine und humane

MCM zeigen eine ähnlich hohe Aktivität. Die Aktivität wird indirekt über den 14C-

Einbau in Propionat ermittelt und liegt bei etwa 230 nmol/µmol Leucin (Wilkemeyer et

al., 1990).

1.6.1 Die Mut+/- und Mut-/- Maus

Zur Ursachenforschung der MMA existieren mehrere Mausmodelle mit

verschiedenen Charakteristiken. Zur Generierung von heterozygoten (Mut+/-) und

homozygoten (Mut-/-) Knock out-Mäusen kann das Mut-Gen auf unterschiedliche

Weise zerstört werden.

Durch Zerstörung des Mut-Gens im Bereich der Bindungsstelle für Coenzym A

wurden heterozygote Knock out-Mäuse (Mut+/-) generiert, die einen unveränderten

Phänotyp mit normaler Entwicklung haben und fruchtbar sind. Durch heterozygotes

Kreuzen erzeugte Nachkommen waren nach der Geburt unauffällig, erkrankten

jedoch nach 15 Stunden und verstarben nach 24 Stunden. MMS-Level im Urin und

die Werte von Propionylcarnitin waren erhöht. Frühes Versterben der Mäuse

verhinderte eine Beobachtung und Untersuchung von Langzeitfolgen (Peters et al.,

2003). Ein modifiziertes Knock out-Mausmodell, welches die humane MCM

hemizygot (Mut-/- Mut2h, 4h, 6h) oder homozygot (Mut-/- Mut2h/2h, 4h/4h, 6h/6h) exprimierte,

führte zum Überleben der neonatalen Periode und ermöglichte eine Beobachtung der

Entwicklung der MMA über eine längere Zeit. Durch die Expression der MCM wurde

der MMS-Spiegel auf einem tolerierbaren Niveau gehalten, die renale Dysfunktion

wurde jedoch nicht verbessert. Untersuchungen des proximalen Tubulus der Mäuse

zeigten vergrößerte Mitochondrien mit verminderter Cristae-Struktur, was auf eine

Dysfunktion der Mitochondrien hindeutete. Eine Inflammation oder cTIN konnte

jedoch nicht beobachtet werden (Peters et al., 2003).

Da die Mäuse ohne MCM die neonatale Phase nicht überlebten, war ein weiterer

Ansatz die stabile MCM-Expression in der Leber. Ein erhöhter MMS-Spiegel bei

tragenden Muttertieren von homozygoten (Mut-/-)-Mäusen, deutete auf pränatalen

Stoffwechsel und Intoxikationen der Föten hin. Depletionen von reduziertem

Glutathion und disulfidgebundenem Glutathion bei Hepatozyten wiesen auf radikale

Sauerstoffspezies (ROS) hin. In einigen Geweben mit hohem Energieumsatz (z.B.

proximale Tubuluszellen, Pankreaszellen und Leberzellen) waren

Megamitochondrien erkennbar, in anderen Geweben mit hohem Energieumsatz (z.B.

Herz- und Skelettmuskelzellen) nicht (Chandler et al., 2009).

Bei einem optimierten Modell von Peters und Kollegen wurde in (Mut-/-)-Mäusen die

MCM transgen unter dem Albuminpromotor stabil in der Leber exprimiert. Die

neonatale Mortalität konnte dadurch verhindert werden. Männliche Tiere verstarben

jedoch nach 2 Monaten, bei Weibchen trat nur ein Gewichtsverlust auf und die renale

Dysfunktion blieb bestehen. Nach proteinreicher Diät entwickelte sich eine

chronische Niereninsuffizienz und es kam zu einer Erhöhung der MMS-Werte im

Plasma und im Hirn, sowie zu einer Verminderung der glomerulären Filtrationsrate

(GFR). Zudem waren vergrößerte Mitochondrien des proximalen Tubulus mit

verkürzten Cristae und elektronendichten Partikel erkennbar; Glomeruli, Podozyten

und Hepatozyten waren unverändert. Antioxidationsmittel im Futter senkten den

Gewichtsverlust und die Verringerung der GFR. Dies deutete ebenfalls auf das

Vorkommen von ROS hin. Die Genexpression in Hinblick auf alternative,

lektinaktivierte und klassische Aktivierung des Komplementsystems in der Niere war

erhöht (Manoli et al., 2013).

1.6.2 Artifizielles Rattenmodell durch Applikation von Methylmalonsäure

Die subkutane Applikation von MMS bei Ratten stellt ein weiteres Tiermodell dar.

Nach 4 Wochen war ein Anstieg der proinflammatorischen Faktoren TNF-α und

TNF-β erkennbar. Dies deutete auf den Beginn einer Inflammation und auf

Differenzierungsprozesse im renalen Kortex hin. Beide Faktoren sind an der

Modulation der Zellproliferation und durch Stimulation der Zytokinsezernierung an der

Immunantwort beteiligt (Goyenechea et al., 2012).

1.7 Renale Manifestation bei MMA-Patienten

Bei MMA-Patienten (mut0, mut-, CblA, CblB) entwickelt sich im Verlauf der

Pathogenese eine chronische tubulointerstitielle Nephritis (cTIN) mit Ursprung im

Interstitium des proximalen Tubulus. Im Verlauf der Erkrankung wird die Funktion der

ganzen Niere geschädigt so dass es zu einer chronischen Niereninsuffizienz und

Dialysepflichtigkeit kommt (Rötig et al., 1995; Buemi et al., 1997; Hörster et al., 2007,

2009; Zwickler et al. 2008). Die Folge ist der Verlust einer oder beider Nieren, so

dass eine Transplantation notwendig wird.

1.7.1 Aufbau und Funktionen der Niere

Die Niere kommt in allen Wirbeltieren vor und ist ein paarweise angelegtes Organ.

Beim Menschen hat die Niere etwa die Größe und Form einer Bohne (engl.: kidney).

Sie setzt sich von außen nach innen durch die Nierenrinde, dem äußeren und dem

inneren Nierenmark zusammen.

Das Nephron ist die Grundfunktionseinheit der Niere und besteht aus dem in der

Rinde lokalisierten Glomerulus und dem Tubulus, der das äußere und teilweise das

innere Mark durchzieht. Beim Menschen besitzt jede Niere etwa 1-1,4 Millionen

Nephrone (Klinke & Silbernagl, Lehrbuch der Physiologie, 4. Auflage, 2003).

1.7.2 Eigenschaften und Funktionen von proximalen Tubulusepithelzellen

In der Niere ist das proximale Tubulusepithel für die Resorption filtrierter Substanzen

und die Sekretion von Abfallprodukten und Xenobiotika verantwortlich. Viele lösliche

Substanzen wie Phosphat, Urat, Glukose und Aminosäuren werden im Glomerulus

filtriert und im proximalen Tubulus durch elektrochemisch getriebenen

carriervermittelten Transport resorbiert (Madsen et al., 2008). Andere Bestandteile

des glomerulären Filtrats wie Albumin und Proteine mit geringem Molekulargewicht

werden durch rezeptorvermittelte Endozytose wieder aufgenommen (Gekle, 2005).

Die Exkretion metabolischer Abfallprodukte oder Medikamente und ihre

umgewandelten Moleküle erfolgt durch viele organische Ionentransporter. Sie

steuern den Influx aus dem Blut an der basolateralen Membran und den

anschließenden Efflux über die apikale Membran der proximalen

Tubulusepithelzellen (PTEC). Einige Transporter gehören zur solute carrier (SLC)

und ATP-binding cassette (ABC) Familie. Sie werden in PTEC exprimiert und

vermitteln die renale Ausscheidung verschiedener endogener und exogener

Moleküle. ABC-Transporter sind primäraktiv und verwenden ATP als Energiequelle

für den Efflux von Medikamenten. Viele Mitglieder der SLC-Familie sind

sekundäraktiv und koppeln den Transport ihrer Substrate an Diffusion oder Symport

bzw. Antiport mit anorganischen oder organischen Molekülen (Russel et al., 2002).

Durch primär aktiven Transport können sekundär aktive Transporter einen

Konzentrationsgradienten schaffen, der anschließend durch tertiär aktiven Transport

genutzt werden kann.

1.7.3 Inflammatorische Funktionen der Niere und Entwicklung einer chronischen Nephritis

Eine chronische Nephritis entwickelt sich über Monate oder Jahre, ist durch eine

fortschreitende Verringerung der GFR charakterisiert und mit vielen Symptomen

renaler tubulärer Dysfunktion verbunden. Primäre chronische interstitielle Nephritis ist

mit einer Infektion durch das Epstein-Barr Virus assoziiert, sekundäre chronische

interstitielle Nephritis mit renaler tubulärer Schädigung durch verschiedene andere

Ursachen wie Infektionen, Medikamente, Toxine, hämolytische/neoplastische

Erkrankungen, immunvermittelte Erkrankungen, genetische oder metabolische

Erkrankungen. Die häufigsten Ursachen sind Schädigungen durch Diabetes mellitus

Typ II (20 %; diabetische Nephropathie), Entzündung der Glomeruli (20 %;

chronische Glomerulonephritis), sowie tubulointerstitielle Nephritis (TIN; 15 %)

(Renz-Polster et al., 2011).

Eine TIN liegt bei einer entzündlichen Erkrankung des interstitiellen Gewebes des

proximalen Tubulus vor. Für die Entstehung der chronischen TIN (cTIN) mit

terminaler Niereninsuffizienz wurden zwei Modelle mit Schwerpunkt auf

Tubulointerstitium und Glomerulus entwickelt (Kriz und LeHir, 2005). Zum einen kann

ein Verlust an funktionellen Nephronen zu einer Überlastung noch funktionierender

Nephrone führen. Die Überlastung führt zu Ausfällen weiterer Nephrone und

schließlich zur Niereninsuffizienz. Zum anderen können verschiedene Einflüsse wie

verringertes interstitielles Volumen, Fibrose, eine Abnahme peritubulärer Kapillaren

und morphologische Veränderungen tubulärer Epithelzellen mit der Intensität der

cTIN korreliert werden (Bohle et al., 1990).

Der proximale Tubulus ist aktiv in die Modulation des Immunsystems durch die

Sekretion von Cytokinen und die Aktivierung des Komplementsystems, v.a. des C-

Systems involviert (Sacks et al. 1996; Daha und van Kooten, 2000; Quigg 2003;

Eardley und Cockwell 2005). Bei einer chronischen Entzündung des Interstitiums im

proximalen Tubulus kommt es zur Infiltration durch Makrophagen und anderen Zellen

des Immunsystems. Neutrophile, Basophile und T-Zellen können durch Sekretion

von Cytokinen wie Interleukin 8 (IL-8) durch Epithelzellen rekrutiert und aktiviert

werden.

Im Interstitium der Niere befinden sich auch unter physiologischen und nicht-

inflammatorischen Bedingungen Zellen des Immunsystems, wie dendritische Zellen

und Makrophagen, aber auch Lymphozyten, die jedoch nicht aktiv sind (Kaissling &

Le Hir, 1994; Kruger et al., 2004; Soos et al., 2006). Dendritische Zellen leiten die

primäre Immunantwort ein (Mellman et al., 2001). Ihre Vorläufer werden im

Knochenmark gebildet und in den Blutkreislauf entlassen. Von dort aus können sie

verschiedene Gewebe infiltrieren (Roake et al., 1995; del Hoyo et al., 2002). In

tubulointerstitiellen Regionen der humanen Niere konnten verschiedene Arten

dendritischer Zellen nachgewiesen werden, wobei myeloide dendritische Zellen in

höherer Anzahl vorkommen als plasmazytoide (Woltmann et al., 2007).

Zu Beginn der Inflammation kommt es zunächst zur Aktivierung residenter

Immunzellen im Interstitium der Niere, sowie zur weiteren Infiltration des Interstitiums

durch Lymphozyten, Monozyten und Makrophagen, je nach Ätiologie akkumulieren

auch Neutrophile, Eosinophile oder Plasmazellen. Die Folgen sind interstitielle

Fibrose, tubuläre Atrophie, abgeflachtes Epithel, tubuläre Dilation und Verdickung

der tubulären Basismembran. Indirekt kann es zum Verlust von Glomeruli kommen

(Glomerulosklerose). Hyperkalämie kann zur Bildung medullärer Mikrozysten führen

(Braden et al., 2005). Am Ende der chronischen Niereninsuffizienz tritt das

vollständige Versagen der Nierenfunktion ein und es kommt zur terminalen

Niereninsuffizienz (Baenkler et al.: Innere Medizin, Thieme Verlag. 2. Auflage 2009).

Die Niereninsuffizienz wird in fünf Stadien eingeteilt, die sich an der GFR orientieren.

In Stadium 1 beträgt die GFR noch mehr als 90ml/min und es kommt zu keinen

großen Auffälligkeiten. Kreatinin und Eiweißwerte können im Urin leicht erhöht sein.

In Stadium 2 sinkt die GFR auf 60 – 89 ml/min, es sind jedoch immer noch keine

großen Auffälligkeiten im Blut erkennbar, so dass nur gezielte Untersuchungen eine

gestörte Filterleistung erkennen lassen.

In Stadium 3 sinkt die GFR weiter bis auf 30 – 59 ml/min ab und die Blutwerte von

Kreatinin und Harnstoff steigen an. Die Folgen sind Bluthochdruck, Leistungsabfall

und rasche Ermüdbarkeit, sowie eine höhere Wahrscheinlichkeit für Herz-Kreislauf-

Erkrankungen. Um Nebenwirkungen zu vermeiden muss die Dosis von

Medikamenten, die normalerweise über die Nieren ausgeschieden werden, verringert

werden.

In Stadium 4 erreicht die GFR nur noch 15-29 ml/min, so dass stärkere Beschwerden

wie etwa Übelkeit, Erbrechen, Müdigkeit, Nerven- und Knochenschmerzen auftreten.

Zusätzlich können sich Ödeme im Gesicht oder an den Beinen bilden.

In Stadium 5 sinkt die GFR auf unter 15 ml/ml was auch als terminale

Niereninsuffizienz bezeichnet wird. Es kommt zum Ausfall der Nierenfunktion, das

Blut kann nicht mehr gereinigt werden und eine Vergiftung des Körpers mit

harnpflichtigen Substanzen tritt ein. Ohne Nierenersatzverfahren wie Blutwäsche

(Hämodialyse, HD), Bauchwäsche (Peritonealdialyse, PD) oder Nierentransplantation

kommt es zum Tod des Patienten.

1.8 Mögliche Ursachen der cTIN bei MMA-Patienten

Die renale Pathogenese der cTIN bei MMA-Patienten ist bisher noch weitgehend

unerforscht. Der Energiehaushalt ihrer Zellen ist auf mehreren Ebenen gestört (Okun

et al., 2002; Kölker et al., 2003; Schwab et al., 2006; Morath et al., 2008), was zu

Energiemangel führen kann. Patienten anderer Erkrankungen mit Defekten der

mitochondrialen Atmungskette entwickeln häufig eine chronische renale Schädigung.

Die verringerte mitochondriale Aktivität tritt in Verbindung mit erhöhten ROS-Werten

auf (Brasil et al., 2014). Durch mitochondrial generierte ROS erhöht sich die

Expression von TGF-β in PTEC und führt zu einer akuten tubulointerstitiellen

Nephritis (aTIN), welche sich zu einer cTIN entwickeln kann (Gentle et al., 2013).

ROS können zudem zu einer Entwicklung von Stress des endoplasmatischen

Retikulums (ER) führen, was eine Einleitung der unfolded protein response (UPR)

zur Folge hat. Eine weitere Ursache der Einleitung der UPR könnte der Verlust der

korrekten Faltung mit damit verbundenem kompletten (mut0) oder partiellen (mut-)

Aktivitätsverlust der MCM aufgrund der Mutation des Gens sein (Buck et al., 2012).

Fehlgefaltete Proteine werden im Proteasom der Zelle abgebaut. Eine genaue

Untersuchung von ER-Stress und UPR hat viele Verbindungen zu wichtigen

entzündungs- und stressinduzierten Signalwegen aufgezeigt. Dazu gehören die

Aktivierung der JNK-AP1 und NF-kB-IKK Signalwege (Deng et al., 2004; Hu et al.,

2006) und die Produktion von ROS und Nitritoxid (Cullinan & Diehl, 2006; Gotoh &

Mori, 2006). In Zellkultur löst die experimentelle Induktion der UPR eine erhöhte

Expression der proinflammatorischen Moleküle IL-8, IL-6, MCP-1 und TNF-α aus (Li

et al., 2005).

Die Störung des Energiehaushalts kann weiterhin einen Einfluss auf den mTOR-

Signalweg (mammalian target of rapamycin) ausüben, welcher in 2 Komplexen

organisiert ist. mTORC1 ist ein Sensor für die Verfügbarkeit von Energie und

(verzeigtkettige) Aminosäuren. Bei MMA-Patienten ist der Abbau von

verzweigtkettigen Aminosäuren, ungeradzahligen Fettsäuren und Cholesterol gestört

(Sniderman et al., 1999). Durch ausreichend Energie und Aminosäuren wird

mTORC1 aktiviert, bei Mangel wird mTORC1 inaktiviert, was zur Stimulation von

Autophagie führen kann (Guertin und Sabatini, 2007). Zusätzlich können ROS und

ER-Stress zu erhöhter Autophagie führen (Yorimitsu et al., 2006; Djavaheri-Mergny

et al., 2007).

Der Einfluss von Autophagie auf inflammatorische Prozesse ist noch weitgehend

ungeklärt und wird kontrovers diskutiert. Einerseits übt Autophagie eine negative

Regulation auf die Prozession und Sekretion von IL-1β und IL-18, sowie die

Sekretion von IL-1α in Makrophagen und dendritischen Zellen aus. Andererseits

reguliert Autophagie die Transkription und Sekretion von TNF-α, IL-8 und eventuell

IL-6 positiv, was eine erhöhte Cytokinsekretion zur Folge haben kann (Harris, 2011).

Proximale Tubulusepithelzellen sezernieren im Fall einer Inflammation IL-8.

Daraufhin infiltrieren Zellen des Immunsystems das Interstitium (Baggiolini et al.,

1989 ; Larsen et al., 1989; Baggiolini & Clark-Lewis 1992; Gerritsma et al., 1996).

TNF-α ist für vielfältige Effekte verantwortlich, z.B. die Expression der

Adhesionsmoleküle ICAM-1, VCAM-1 und E-Selectin bei Endothelzellen oder die

Aktivierung von Leukozyten und die Induktion der Expression von MHC-I und MHC-II.

Weiterhin wird die Sekretion von Cytokinen wie MCP-1, RANTES, IL-1, IL-6, IL-8 und

dem Komplementfaktor C3, von Prostaglandinen, Leukotrienen, Nitritoxid und ROS

stimuliert (Ernandez & Mayadas, 2009). In Kombination führt dies zu einer Infiltration

des Interstitiums des proximalen Tubulus durch Neutrophile, Makrophagen und T-

Zellen. Dadurch wird die inflammatorische Reaktion weiter getriggert. Hält dieser

Zustand über längere Zeit an, versagt die Nierenfunktionen (Lubrano et al., 2001).

Wie weit die Störung der Energiehomöostase, ROS, ER-Stress, mTOR-Regulierung

und Autophagie zu einer Schädigung der Zellen beitragen, die zu einer Produktion

und Sekretion von Cytokinen führt, soll in dieser Arbeit geklärt werden.

1.8.1 Stress des endoplasmatischen Retikulums - Unfolded Protein Response

ER-Stress kann durch Energie- oder Nährstoffüberschuss ausgelöst werden und hat

direkten Einfluss auf Inflammationssignalwege, die daraufhin die Cytokinexpression

stimulieren. Bei MMA können Dysfunktionen in Mitochondrien zu ROS führen, die zu

diesem Zyklus beitragen können. Die Verbindung einer chronischen Inflammation

und dem ER liegt in der als unfolded protein response (UPR) bezeichneten Antwort

des ER auf Stresszustände. Die Stressantwort beinhaltet die Aktivierung von 3 als

Sensoren dienenden Transmembranproteinen, die jeweils eine Domäne im Lumen

des ER aufweisen und damit ungefaltete Proteine erkennen. Eine weitere Domäne

leitet Signale an transkriptorische oder translationale Moleküle weiter. Die Proteine

sind 1) IRE1 (inositol requiring enzyme, 2) PERK (PKR-like endoplasmic reticulum

kinase) und 3) ATF6 (activating transcription factor) (Schröder & Kaufman, 2005;

Cullinan & Diehl, 2006; Gotoh und Mori, 2006; Ron & Walter, 2007; Zhang &

Kaufman, 2008).

IRE1 besitzt eine Proteinkinaseaktivität und eine Endoribonukleaseaktivität (Mori et

al., 1993; Cox et al., 1993), PERK besitzt ebenfalls eine Proteinkinaseaktivität, mit

welcher es die α-Untereinheit des eukaryotischen Translations-Initiationsfaktors 2α

(eIF2α) phosphorylieren kann (Shi et al., 1998; Harding et al., 1999), ATF6 ist ein

Transkriptionsfaktor mit Leucinzipper-Domäne (Haze et al., 1999). Normalerweise

liegen diese drei ER-Stresssensoren in inaktivem Zustand vor und sind mit dem ER-

Chaperon BiP (auch GRP78) assoziiert. Bei beginnendem ER-Stress sondert sich

BiP durch Bindung an ungefaltete Polypeptidketten und Proteine ab, wodurch es zur

Freisetzung und damit verbundener Aktivierung der ER-Stresssensoren kommt

(Bertolotti et al., 2000). Zu Beginn der UPR wird PERK durch Oligomerisierung und

Autophosphorylierung aktiviert und phosphoryliert daraufhin eIF2α, wodurch die

Assemblierung der ribosomalen 80 S Untereinheit und somit die Proteinsynthese

inhibiert wird. Die Autophosphorylierung von IRE1α führt zur Aktivierung seiner

RNAse-Aktivität worauf ein 26 Basen großes Intron aus der mRNS des

Transkriptionsfaktors X-Box-binding-Proteins 1 (XBP1) gespleißt wird und diesen

aktiviert (Schroder et al., 2005; Ron et al., 2007). ATF6 dissoziiert von BiP und wird

im Golgi-Apparat von der site-1 und site-2 Protease (S1P, S2P) geschnitten. Dies

führt zur Freisetzung eines aktiven ATF6-Fragments in das Zytosol, zur Migration

zum Zellkern und zur Aktivierung der Transkription (Haze et al., 1999; Ye et al.,

2000). Das ATF6-Fragment und aktiviertes XBP1 induzieren parallel die

Transkription von Genen, die für Chaperone und andere Enzyme der Proteinfaltung,

Reifung, Sekretion und ER-vermittelter Degradierung codieren (Yamamoto et al.,

2007; Wu et al., 2007).

1.8.2 Die Regulation von mTOR-Komplex 1

Bei der MMA akkumulieren Stoffwechselzwischenprodukte im Körper, da der Abbau

von verzweigtkettigen Aminosäuren, ungeradzahligen Fettsäuren und Cholesterol

gestört ist (Sniderman et al., 1999). Weiterhin ist der Energiehaushalt der Zellen auf

mehreren Ebenen gestört (Okun et al., 2002; Kölker et al., 2003; Schwab et al.,

2006; Morath et al., 2008), was zu einem Energiemangel führen kann.

Der Multiproteinkomplex mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1)

verarbeitet zelluläre Signale und reagiert auf die Verfügbarkeit von

Wachstumsfaktoren, Sauerstoff, und vor allem auf die Verfügbarkeit von Energie und

Aminosäuren. In Abhängigkeit davon werden einige Prozesse beeinflusst, die das

Zellwachstum betreffen. Bei der Aktivitätsregulierung von mTORC1 ist der wichtigste

Sensor das Heterodimer TSC (tuberous sclerosis complex), das aus TSC1 und TSC2

gebildet wird. TSC1/2 wirkt für die GTPase Rheb (Ras-related homolog enriched in

brain) als aktivierendes Protein für die GTPase (GAP, GTPase-activating protein).

Die aktive Form von Rheb ist GTP gebunden und aktiviert mTORC1 direkt (Long et

al., 2005; Sancak et al., 2007). Umgekehrt inhibiert Rheb mTORC1, wenn es GDP

gebunden ist (Inoki et al., 2003; Tee et al., 2003).

Die Aktivierung von mTORC1 erfolgt weiterhin durch den Ras Signalweg und den

kanonischen Insulin Signalweg. In beiden Fällen führt eine Stimulierung zur

Phosphorylierung von TSC2 durch die Proteinkinase B (PKB bzw. AKT) (Potter et al.,

2002; Inoki et al., 2002), durch ERK1/2 (extracellular signal regulated kinase 1/2) (Ma

et al., 2005) und durch RSK1 (p90 ribosomal S6 Kinase 1) (Roux et al., 2004). Durch

die Phosphorylierung wird TSC1/2 inhibiert und mTORC1 somit aktiviert. Zusätzlich

kann durch Wachstumsfaktoren aktiviertes AKT mTORC1 unabhängig von TSC1/2

durch Phosphorylierung und Dissoziation von PRAS40 von mTORC1 aktivieren

(Wang et al., 2007; Sancak et al., 2007; van der Haar et al., 2007). Die volle Aktivität

von AKT benötigt seine Phosphorylierung an 2 Stellen: An Serin308 wird es von der

PDK1 (Phosphoinositid dependent Kinase 1) und an Serin473 durch mTORC2

phosphoryliert (Sarbassov et al., 2005). Gleichzeitig können Komponenten von

mTORC2 aber auch die Phosphorylierung von AKT oder manche seiner Substrate

hemmen (Jacinto et al., 2006; Guertin et al., 2006). Das Binden von Insulin an den

membranständigen Zellrezeptor fördert die Tyrosinkinase-Aktivität des Insulin-

Rezeptors, die Rekrutierung von IRS1 (insulin receptor substrate 1), die Produktion

von Phosphatidylinositol-(3,4,5)-triphosphat durch die Aktivierung von PI3K und die

Rekrutierung und Aktivierung von AKT an der Plasmamembran. In einigen Zellarten

führt die Aktivierung von mTORC1 zur Blockade der Achse von PI3K und AKT. Wird

S6K1 durch mTORC1 aktiviert, erfolgt durch die Phosphorylierung von IRS1 eine

Destabilisierung (Harrington et al., 2005). Dieser autoregulatorische Signalweg ist

eine S6K1 abhängige negative Rückregulierung und wird mit metabolischen

Erkrankungen und Tumorgenese in Verbindung gebracht (Manning, 2004).

Die Übertragung des Energiestatus der Zelle an mTORC1 wird durch die AMPK

(AMP-aktivierte Proteinkinase) gewährleistet (Hardie, 2007). Als Reaktion auf eine

niedrige ATP:ADP Ratio wird die AMPK aktiviert und phosphoryliert daraufhin TSC2,

das die Aktivität der GAP in Richtung Rheb erhöht und mTORC1 reduziert (Inoki et

al., 2003). Zusätzlich ist die AMPK als Antwort auf Energiedepletion in der Lage, die

Aktivität von mTORC1 durch Phosphorylierung zu vermindern (Gwinn et al., 2008).

Durch den Sauerstoffgehalt kann die Aktivität von mTORC1 durch verschiedene

Signalwege reguliert werden. Bei geringer Hypoxie aktiviert der Abfall an ATP die

AMPK, welche wie beschrieben TSC1/2 phosphoryliert und mTORC1 hemmt

(Arsham et al., 2003; Liu et al., 2006).

Die Verfügbarkeit von Aminosäuren reguliert mTORC1 positiv (Guertin und Sabatini,

2007) und unabhängig von TSC1/2 (Nobukuni et al., 2005). mTORC1 interagiert mit

den 4 verwandten GTPasen der Rag-Proteine und wird dadurch aktiviert. In der

Anwesenheit von Aminosäuren bindet Rag an Raptor und fördert die Verschiebung

von mTORC1 von verschiedenen Orten zum perinukleär gelegenen Aktivator Rheb

(Kim et al., 2008; Sancak et al., 2008).

Abbildung (3) Die Aktivierung und Regulation von mTORC1 hängt von verschiedenen Einflüssen wie Energiestatus der Zelle, Verfügbarkeit von Wachstumsfaktoren, Aminosäuren und Sauerstoff ab. Der Komplex ist an der Steuerung von Zellwachstum, Proteinbiosynthese, Lipidsynthese und der Regulation der Autophagie beteiligt.

1.8.3 Aufbau von mTORC1 und Einfluss auf Autophagie

mTORC1 ist für die positive Regulation von Proliferation und Zellwachstum

verantwortlich. Bei seiner Aktivierung kommt es zur Stimulation anaboler Prozesse

wie Proteinbiosynthese und Aufbau von Lipiden und Zellorganellen. Gleichzeitig

reduziert er die Einleitung kataboler Stoffwechselwege wie Autophagie (Guertin und

Sabatini, 2007).

Insgesamt bilden 5 Komponenten mTORC1 und steuern und beeinflussen die

Aktivität der TOR-Kinase, dazu zählen neben der TOR-Kinase noch Raptor

(regulatory-associated protein of mTOR), mLST8 (mammalian lethal with Sec13

protein), PRAS40 (proline-rich AKT substrate 40 kDa) und Deptor (DEP-domain-

containing mTOR interacting potein) (Peterson et al., 2009). Die Rolle jedes

einzelnen Proteins ist teilweise noch unverstanden. Raptor ist für die Regulation der

Aktivität des Komplexes verantwortlich, indem es der Assemblierung dient und die

Rekrutierung von Substraten beeinflusst (Hara et al., 2002; Kim et al., 2002). Die

Funktion von mLST8 ist unklar, da eine Deletion die Aktivität und Funktion von

mTORC1 nicht zu beeinflussen scheint (Guertin et al., 2006). Von PRAS40 und

Deptor hingegen ist bekannt, dass sie als Negativregulatoren eine Rolle spielen

(Peterson et al., 2009; Sancak et al., 2007; van der Haar et al., 2007). Ist die Aktivität

von mTORC1 reduziert, sind PRAS40 und Deptor näher am Komplex lokalisiert. Es

wurde eine direkte Funktion durch Inhibierung der Substratbindung postuliert (Wang

et al., 2007). Im Gegenzug kann mTORC1 PRAS40 und Deptor direkt

phosphorylieren, so dass ihre Bindung zum Komplex verringert und die Aktivierung

von mTORC1 gesteigert wird (Peterson et al., 2009; Wang et al., 2007).

Ein Hauptbestandteil der Funktion von mTORC1 ist die Regulation der Autophagie,

durch welche (defekte) Proteine oder Organellen in Autolysosomen abgebaut

werden. Dadurch kann bei Nährstoffmangel ein Abbau von Organellen und Proteinen

erfolgen um biologisches Material für die Biosynthese von Proteinen für die

Energieproduktion bereitzustellen. Die Entwicklung von Autophagie ist stark

abhängig von der Regulierung durch mTORC1. Aktivierung von mTORC1 hemmt

Autophagie, Inhibierung von mTORC1 fördert sie (Codogno und Meier, 2005). Der

Grund hierfür ist ein Komplex aus den 3 Proteinen ULK1 (unc-51-like kinase 1),

ATG13 (autophagy related gene 13) und FIP200 (focal adhesion kinase family-

interacting protein of 200 kDa), der auf Signale von mTORC1 reagiert und bei

Aktivierung die Reifung der Phagosome stimuliert (Jung et al., 2009; Ganley et al.,

2009; Hosokawa et al., 2009). Durch die Aktivierung von mTORC1 erfolgt die

Phosphorylierung von ULK1 und ATG13, was den Zerfall dieses Komplexes und die

Inhibition der Autophagie zur Folge hat. Umgekehrt führt eine Inhibition von mTORC1

zur Stimulation der Autophagie (Noda und Ohsumi, 1998; Kamada et al., 2000;

Loewith et al., 2002).

1.8.4 Autophagie

Autophagie kann die Expression von Cytokinen beeinflussen und stimulieren und

somit an inflammatorischen Prozessen wie sie z.B. bei einer chronischen Nephritis

auftreten, beteiligt sein. Umgekehrt sind auch einige Cytokine in der Lage, die Stärke

der Autophagie zu beeinflussen (Harris, 2011).

Autophagie ist der generelle Überbegriff für eine Vielzahl intrazellulärer Prozesse, bei

welchen zytosolische Bestandteile abgebaut werden. Auf zellulärer Ebene existieren

grundsätzlich zwei Abbauwege für Proteine: Der Ubiquitin Proteasom-Weg degradiert

kurzlebige Proteine selektiv (Edinger und Thompson, 2003; Kim et al., 2000;

Mizushima, 2007). Langlebigere Proteine werden in den Lysosomen abgebaut.

Lysosomen sind saure Zellkompartimente mit einem pH Wert von 5, welche sich vom

Golgi-Apparat abschnüren. Sie sind mit hydrolysierenden Enzymen angereichert, so

dass über die saure Hydrolyse der Abbau von Metaboliten erfolgt. So werden

Proteine, Nukleinsäuren und Lipide zu ihren Grundbausteinen Aminosäuren,

Nukleotiden und freien Fettsäuren abgebaut. Weiterhin werden auf diesem Weg

Toxine, Krankheitserreger, ROS, veränderte zytosolische Komponenten wie

Proteinaggregate, beschädigte und ungebrauchte Organellen und Proteine abgebaut

(Levine und Deretic, 2007; Levine und Kroemer, 2008; Mizushima, 2007). Der

Großteil intrazellulärer Proteine hat eine lange Halbwertszeit. Ändert sich die

Degradationsrate langlebiger Proteine aufgrund von Defekten, können sich

Proteinmasse und Proliferation von Zellen erheblich verändern.

Fehlerhafte Regulierung von Autophagie wird bei vielen Krankheiten mit der

jeweiligen Pathogenese in Zusammenhang gebracht und kann auch den

programmierten Zelltod einleiten. Häufig sind ausdifferenzierte (nichtproliferierende)

Zellen wie Neurone oder Muskelzellen betroffen, bei welchen die Akkumulation

beschädigten Materials eine Belastung der Zellfunktionen darstellt. (Maiuri et al.,

2007; Mizushima et al., 2008; Thorburn, 2008). Weiterhin kann die fehlerhafte

Regulierung der Autophagie bei (Embryonal)-Entwicklung, Wachstumskontrolle

(Proliferation, Änderung des Zellvolumens), Immunabwehr (Antigenpräsentation,

Entfernung intrazellulärer Krankheitserreger und toxischer Metabolite), Anpassung an

schlechte Umweltbedingungen (Nährstoff-, Sauerstoff- oder Energiemangel,

Temperatur, Zelldichte), Alterung und Zelltod (Cuervo et al., 2005; Maiuri et al., 2007;

Levine und Deretic, 2007; Levine, 2007; Thorburn, 2008; Mizushima et al., 2008), zu

schweren Krankheiten wie neurodegenerativen Erkrankungen, verschiedenen

Tumoren, muskulären Atrophien und Kardiomyopathien führen (Mizushima et al.,

2008; Levine und Kroemer, 2008). Der Großteil der intrazellulären Degradierung wird

von der Makroautophagie geleistet (Levine und Klionsky, 2004; Mizushima, 2007).

1.8.4.1 Makroautophagie

Die Einleitung der Makroautophagie kann direkt durch mTORC1-Inhibierung oder

indirekt über Dephosphorylierung von Atg13 erfolgen (Kamada et al., 2000; Kabeya

et al., 2005). Die Induktion der Autophagie erfolgt nach Aktivierung von Atg1 (Yang

und Klionsky, 2009), und es kommt zur Rekrutierung mehrerer Atg-Proteine zum Ort

der Assemblierung des Autophagosoms (PAS – phagophore assembly site) führt

(Suzuki et al., 2001; Kim et al., 2002). Die Membranherkunft des späteren

Autophagosoms ist noch weitgehend unbekannt. Neuere Erkenntnisse in

Säugerzellen weisen darauf hin, dass Mitochondrien an der Entstehung der

Membranen beteiligt sein können (Noda et al., 2000; He et al., 2006; Hailey et al.,

2010). Jedoch werden auch das ER und der Golgi Apparat oder auch eine komplette

Neubildung als Ursprung der Membran als mögliche Quellen diskutiert. Durch

Phosphatidylinositol-3-phosphat und die Rekrutierung weiterer Atg-Proteine und

deren Bindung an die PAS reift das Autophagosom weiter (Yang und Klionsky,

2009). Zur Vergrößerung und Fertigstellung des Autophagosoms werden zwei

Protein-Konjugationssysteme benötigt: Atg12-Atg5 und Atg8 (Kim et al., 2002). Das

integrale Membranprotein Atg8-PE lagert sich im Autophagosom in die innere und

äußere Membran ein. Das Atg12- als auch das Atg8-Konjugationssystem könnte

dabei als äußere Hülle fungieren, welche die Fusion des Autophagosoms mit der

Vakuole vor seiner Fertigstellung verhindert. Vor der Fusion mit dem Lysosom

dissoziieren beide Konjugationssysteme mit den meisten anderen Atg-Proteinen

wieder vom Autophagosom.

Ein Großteil der Proteine der Außenmembran wird wieder zu einer PAS recycelt. Das

Autophagosom gelangt als Einfach-Membran-Vesikel ins Lumen des Lysosoms, wo

es durch Hydrolasen abgebaut wird. Essenziell für den Abbau sind der saure pH-

Wert der Vakuole und die vakuolären Hydrolasen.

1.9 Fragestellung der Arbeit

Das Ziel der Arbeit ist, die der chronischen, tubulointerstitiellen Nephritis (cTIN) bei

Patienten mit Methylmalonazidurie zugrundeliegenden Mechanismen zu

entschlüsseln. Eine cTIN ist immer mit der Infiltration durch Immunzellen verbunden.

Aus dieser Tatsache wurde die Hypothese entwickelt, dass vor einer Infiltration des

Interstitiums des proximalen Tubulus eine vorausgehende Schädigung der hier

lokalisierten Zellen stattfinden muss. Diese Schädigung führt zu einer Rekrutierung

von Immunzellen, die daraufhin das Interstitium des proximalen Tubulus infiltrieren

und die Zellen schädigen, was am Ende zu einem Funktionsverlust der proximalen

Tubuluszellen führt und eine Niereninsuffizienz nach sich zieht.

Ausgehend von dieser Hypothese wird in dieser Arbeit untersucht, ob

1) sich der gestörte Energiemetabolismus und eine erhöhte ROS-Produktion bei

MMA-Patienten auf die Entwicklung einer cTIN auswirkt,

2) der mTOR-Signalweg an der Entwicklung der chronischen Inflammation des

proximalen Tubulus involviert ist,

3) eine veränderte Zytokinsekretion und eine hierdurch erhöhte Rekrutierung von

Immunzellen beteiligt ist.

Als Modell für die Untersuchung der zugrundeliegenden Mechanismen der cTIN

wurden humane immortalisierte Epithelzellen des proximalen Tubulus (PTEC) von

mut0- und CblB-Patienten als Modell verwendet. Als Kontrollen dienten PTEC von

gesunden Probanden sowie von Propionazidurie-Patienten.

2 Material

2.1 Chemikalien

2-Mercaptoethanol AppliChem, Darmstadt

6-Aminocapronsäure Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Agarose Invitrogen, Karlsruhe

Ammoniumpersulfat Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Acrylamid Bio-Rad, München

Bromphenolblau

BSA Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Coomassie G-250 Serva, Heidelberg

Cytochrom c aus Pferdeherz Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Cumarin Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

3-Dimethoxy-5-methyl-6-decyl– Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

1,4-benzochinon

D-Glukose Merck, Darmstadt

Dichlorophenolindophenol Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Dulbecco’s modified Eagle medium PAA Laboratories GmbH, Linz

EDTA Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Ethanol Carl Roth, Karlsruhe

Essigsäure Carl Roth, Karlsruhe

Glukose Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Glycin Carl Roth, Karlsruhe

Glyzerin Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Hepes Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Insulin Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Isopropanol Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Kaliumchlorid Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Kaliumdihydrogenphosphat Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Kalziumchlorid Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Kalziumsulfat Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Kollagen

Laktatdehydrogenase Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Laurylmaltosid Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Luminol AppliChem, Darmstadt

Magnesiumchlorid Carl Roth, Karlsruhe

Methylmalonsäure Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Magnesiumsulfat Merck, Darmstadt

Methanol Carl Roth, Karlsruhe

Natriumchlorid Carl Roth, Karlsruhe

Natriumdeoxycholat Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Natriumhydrogencarbonat Merck, Darmstadt

Natriumazid Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Natriumzyanid Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Natriumhydroxid Carl Roth, Karlsruhe

N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamin Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

β-Nicotinamidadenindinukleotid Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

β-Nicotinamidadenindinukleotid-Phosphat Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Nonidet™ P-40 Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

PBS PAA Laboratories, Linz

Phosphoenolpyruvat Roche Diagnostics, Mannheim

Pyruvatkinase Roche Diagnostics, Mannheim

Sodiumdodecylsulfat Serva, Heidelberg

Succinat Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Tri Reagent Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Tris Carl Roth, Karlsruhe

Triton X-100® (Alkylphenylpolyethylenglykol) Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Trypanblau Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Trypsin/EDTA PAA Laboratories GmbH, Linz

Turbofect Fermentas

Tween 20 Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Vectashield-HardSet Vector Laboratoeries, Peterborough,

USA

Wasserstoffperoxid 30 % Merck, Darmstadt

2.2 Geräte

Blot-Kammer, Perfect Blue Semi-Dry Peqlab Biotechnologie, Erlangen

Elektrophoresekammer Hoefer Serva, Heidelberg

SE260 Mighty Small II)

Fluoreszenzmikroskop CTR 4000 Leica, Wetzlar

Lichtmikroskop Leica, Wetzlar

Magnetrührer IKA-Combimag RCT Ika-Werk, Staufen

Mehrkanalpipetten Brand, Wertheim

pH-Meter Mettler-Toledo, Giessen

Pinzetten neoLab, Heidelberg

Pipette 1-10 µl Eppendorf, Hamburg

Pipette 10-100 µl Eppendorf, Hamburg

Pipette 20-200 µl Eppendorf, Hamburg

Pipette 100-1000 µl Eppendorf, Hamburg

Pipette 1000-2500 µl Eppendorf, Hamburg

Pipettierhilfe (Automatikpipette) Integra Biosciences, Fernwald

Spectramax 340 PC Plus Microplate Reader Molecular Devices, Sunnyvale, USA

Tischzentrifuge “Biofuge Pico” Heraeus, Hanau

Thermomixer Eppendorf, Hamburg

Vakuumpumpe Laboport® KNF Neuberger, Freiburg

Vortex-Genie Bender-Hobein, Zürich

Waage Sartorius AG, Göttingen

Werkbank HERAsafe Heraeus, Hanau

Zählkammer nach Neubauer Renner, Darmstadt

Zentrifuge Beckman TJ-6 Beckman Instruments, München

2.3 Verbrauchsmaterialien

Blottingmembran PVDF GE Healthcare, München

Eingefriergefäße Cellstar® 1,5ml Greiner, Frickenhausen

Eukit® Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim

Filtereinheit Steritop Millipore, Eschborn

Handschuhe Maimed GmbH, Neuenkirchen

Kryoröhrchen neoLab, Heidelberg

Magermilchpulver Carl Roth, Karlsruhe

Objekträger (24 x 50 mm) Carl Roth, Karlsruhe

Objektträger rund (18 mm) Carl Roth, Karlsruhe

Pasteurpipetten WU, Mainz

Pipettenspitzen Sarstedt, Nürnbrecht

(1-10µl, 10-200µl, 100-1000, 1-2,5ml)

PCR Gefäße Stein Labortechnik, Remchingen

Reaktionsgefäße (1,5 ml) Stein Labortechnik, Remchingen

Reaktionsgefäße Safe-Lock Stein Labortechnik, Remchingen

Sterile Einmalpipetten Corning Costar, Wiesbaden

(2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml)

TransWell Filterplatten Corning Costar, Wiesbaden

Verschlussfolie Parafilm Brand, Wertheim

Whatman-Papier neoLab, Heidelberg

Zellkulturplatten 96 Well Sarstedt, Nürnbrecht

Zentrifugenröhrchen (15 ml, 50 ml) Sarstedt, Nürnbrecht

2.4 Zellkulturmedien

Dulbecco’s Modified Eagle Medium PAA Laboratories, Linz

high glucose

Dulbecco’s Modified Eagle Medium PAA Laboratories, Linz

low glucose

Ham’s F12 PAA Laboratories, Linz

Fötales Kälberserum Gibco

Trypsin-Lösung Gibco

Penicillin/Streptomycin Gibco

2.5 Antikörper

Anti GammaGlutamyltransferase GeneTex, Irvine, USA

Anti Aquaporin 1 Santa-Cruz, Heidelberg

Anti mTOR Cell Signaling, Frankfurt am Main

Anti Phospho-mTOR Cell Signaling, Frankfurt am Main

Anti Phospho-Raptor Cell Signaling, Frankfurt am Main

Anti PRAS40 Cell Signaling, Frankfurt am Main

Anti Phospho-PRAS40 Cell Signaling, Frankfurt am Main

Anti LC3 Sigma-Aldrich, Steinheim

Anti p62 Santa-Cruz, Heidelberg

Anti Tubulin Santa-Cruz, Heidelberg

Anti Phospho-IRE1 Abcam, Cambridge, UK

Anti Maus Santa-Cruz, Heidelberg

Anti Kaninchen Santa-Cruz, Heidelberg

2.6 ELISA-Kits

Multi-Analyte ELISArray Kit SA Biosciences, Qiagen

Eli-Pair IL8 Hölzel Diagnostika, Köln

2.7 Lösungen für proteinbiochemische Methoden

RIPA Puffer 150 mM Natriumchlorid

50 mM Tris/HCl pH 8

5 mM EDTA

1 % (w/v) Nonidet P40

0,1 % (w/v) SDS

0,5 % (w/v) Natriumdeoxycholat

Sammelgelpuffer (4 x) 0,25 M Tris/HCl pH 6,8

0,4 % (w/v) SDS

Trenngelpuffer (4 x) 1,5 M Tris/HCl pH 8,8

0,4 % (w/v) SDS

6 x Probenpuffer 480 mM Tris/HCl pH 6,8

45 % (w/v) Glyzerin

12 % (w/v) β-Mercaptoethanol

12 % (w/v) SDS

0,06 % (w/v) Bromphenolblau

Elektrophoresepuffer (10 x) 0,25 M Tris pH 8,3

1,92 M Glycin

1 % (w/v) SDS

TBS (10 x) 1,5 M Natriumchlorid

0,5 M Tris/HCl pH 7,5

TBST 1 x TBS

0,1 % Tween-20

Anodenpuffer Western Blot 750 mM Tris/HCl pH 7,4

20 % (v/v) Methanol

Kathodenpuffer Western Blot 25 mM Tris / HCl pH 9

40 mM 6-Aminocapronsäure

20 % (v/v) Methanol

Blockierungspuffer 1 x TBST

5 % (w/v) Magermilchpulver

Regenerierungspuffer 2 % (w/v) SDS

100 mM β-Mercaptoethanol

625 mM Tris/HCl pH 6,8

Enzym-Assay-Puffer 250 mM Saccharose

(EA-Puffer) 50 mM Kaliumchlorid

5 mM Magnesiumchlorid

20 mM Tris/HCl pH 7,4

Krebs-Ringer-Puffer 142 mM Natriumchlorid

3 mM Kaliumchlorid

1,5 mM Kaliumdihydrogenphosphat

100 mM Hepes

4 mM Glukose

1,2 mM Magnesiumchlorid

1,4 mM Kalziumchlorid

3 Methoden

3.1 Zellkultur

3.1.1 Isolierung von humanen primären proximalen Tubulusepithelzellen (hPTEC)

In der vorliegenden Arbeit wurden primäre humane proximale Tubulusepithelzellen

verwendet, die aus dem Urin von Patienten und Kontrollprobanden isoliert wurden.

Dazu wurde der Urin möglichst direkt in eine sterile Flasche mit DMEM

supplementiert mit 10% FKS, 100 U/ml Penicillin und 0.1 mg/ml Streptomycin

überführt und für 30 Minuten inkubiert. Anschließend wurde der Ansatz in sterile 50

ml Röhrchen (Falcon) überführt und bei 600 × g für 10 Minuten zentrifugiert. Das

Sediment wurde einmal mit DMEM inklusive genannter Supplemente gewaschen,

anschließend in PTEC-Medium resuspendiert und in mit Kollagen beschichteten

Kulturflaschen kultiviert.

Zusatz: Für die Gewinnung und Untersuchung von hPTEC aus Patientenurin liegt ein

positives Votum der Ethikkommission (S-074/2008) der medizinischen Fakultät

Heidelberg vor.

3.1.2 Kultivierung von eukaryotischen Zellen

Die Arbeiten mit eukaryotischen Zellen wurden unter einer Sicherheitswerkbank

(Modell SG 400, Baker USA) durchgeführt. Die verwendeten Medien und Lösungen

wurden entweder steril bezogen oder steril filtriert. Für Gebrauchsgegenstände

wurden sterilisierte Einmalartikel verwendet. Die Kultivierung der Zellen erfolgte bei

37°C in wasserdampfgesättigter 5% CO2-Atmosphäre im Brutschrank (Binder).

3.1.3 Kultivieren und Passagieren von PTEC

Um eine fortwährende Vitalität der Zellen zu gewährleisten, mussten adherente

Zellen bei Erreichen der Konfluenz verdünnt und neu ausgesät werden. Adherente

Zellen wurden durch Akkutasebehandlung vom Kulturflaschenboden gelöst und zum

weiteren Wachstum auf neue Kulturflaschen verteilt. Dazu wurde das Medium

entfernt und der Zellrasen mit PBS-Puffer pH 7,4 gewaschen. Anschließend wurden

die Zellen mit Akkutase-Lösung (0,5 mg/ml Akkumax, PAA) bedeckt und bei 37 °C

inkubiert. Nach einer Einwirkzeit von wenigen Minuten wurden die Zellen durch

Klopfen vom Gefäßboden gelöst. Die Inaktivierung der Akkutase erfolgte durch

Zugabe von frischem Medium. Anschließend wurden die Zellen resuspendiert und

auf neue Kulturflaschen verteilt.

3.1.4 Kultivieren und Passagieren von immortalisierten Zellen

Die Kultivierung immortalisierter Zellen wurde wie unter Abschnitt 3.1.3 beschrieben

mit folgenden Änderungen durchgeführt: Die Zellen wurden durch Behandlung mit

Trypsin-EDTA-Lösung (0,5 mg/mlTrypsin und 0,2 mg/ml EDTA-4 Na, Gibco) vom

Gefäßboden gelöst.

3.1.5 Ernten von immortalisierten Zellen

Zum Ernten von immortalisierten Zellen wurde das Medium abgesaugt und die Zellen

mit PBS-Puffer pH 7,4 gewaschen. Die Zellen wurden entweder mit einem

sterilisierten Zellschaber mechanisch oder durch Behandlung mit Trypsin-EDTA-

Lösung (0,5 mg/mlTrypsin und 0,2 mg/ml EDTA-4 Na, Gibco) vom Boden des

Kulturgefäßes gelöst und durch Zentrifugation bei 600 x g für 10 Minuten

sedimentiert. Nach erneutem Waschen mit PBS-Puffer pH 7,4 wurde das

Zellsediment mit für den jeweiligen Versuch adäquaten Puffer versetzt und weiter

verwendet.

3.2 Molekularbiologische Methoden

Die Durchführung gentechnologischer Arbeitsschritte erfolgte nach

molekularbiologischen Standardmethoden. Reagenzien und Proben für die Versuche

wurden auf Eis gekühlt. Alle verwendete Puffer, Medien und sonstige Lösungen

wurden, sofern nicht kommerziell erworben, mit destilierten Wasser angesetzt und

bei Bedarf durch Filtrieren sterilisiert. Die folgenden Vorschriften und Methoden

wurden, soweit nicht anders angegeben, dem Laborhandbuch "Molecularcloning"

(Sambrook und Russel, 2001) entnommen.

3.2.1 Polymerase-Kettenreaktion

Die Polymerase-Kettenreaktion (polymerase chain reaction, PCR) wurde dazu

verwendet, den zur Immortalisierung verwendeten Vektor pRNS1 zu amplifizieren.

Zur Durchführung einer PCR wurden in einem 0,2 ml Eppendorf-Reaktionsgefäß

folgende benötigten Reagenzien angesetzt:

X μl Matrizen-DNS

2,5 μl Primer 1

2,5 μl Primer 2

5 μl 10 x Reaktions-Puffer

1 μl 10 mM dNTPs

0,5 μl Polymerase

mit H2O steril. auf 50 μl aufgefüllt.

Zur Amplifikation der DNS-Fragmente wurde das folgende Protokoll angewandt:

98 °C Denaturierung 30 Sekunden

98 °C Denaturierung 5 Sekunden

TM + 2 °C Annealing 10 Sekunden 30-35 Zyklen

72 °C Elongation 10 Sekunden pro 1000 Basen

72 °C Elongation 2 Minuten

Zur Überprüfung der PCR wurde jeweils 1 μl des Ansatzes mittels Agarose-

Gelelektrophorese analysiert.

3.2.2 Agarosegelelektrophorese

Um die in der PCR erhaltenen DNS-Fragmente zu analysieren, wurde die

linearisierte DNS in Agarosegelen aufgetrennt. Es wurden 1,3 %-ige Agarosegele

verwendet, welche eine Auftrennung von DNS-Molekülen von 0,2 bis 7 kb Länge

ermöglichen. Ein entsprechender Größenstandard wurde zur Größenbestimmung der

DNS-Fragmente mitgeführt. Die elektrophoretische Trennung der DNS erfolgte bei

80–120 Volt.

3.2.3 Transformation von DNS in kompetente Bakterienzellen wofür

Der für die Immortalisierung der hPTEC benötigte Vektor pRNS1 wurde durch

Bakterien (Echerischia Coli) amplifiziert. Hierfür wurden die Bakterien zunächst mit

der Plasmid-DNS transformiert. Als Transformation wird die Aufnahme von Fremd-

DNS durch kompetente Bakterien bezeichnet. Dies wurde durch einen kurzen

Hitzeschock erreicht (Chung et al., 1989). Zur Transformation wurden 100 μl

kompetente Zellen auf Eis aufgetaut und mit 1μg Plasmid-DNS gemischt. Der Ansatz

wurde für weitere 30 Minuten auf Eis inkubiert und anschließend einem Hitzeschock

für eine Minute bei 42 °C unterzogen. Danach wurde der Ansatz für zwei Minuten auf

Eis inkubiert. Im Anschluss erfolgte die Zugabe von 900 μl LB-Medium und die

Inkubation für eine Stunde bei 37°C unter Schütteln. Von der Bakteriensuspension

wurden 150 μl auf LB-Agarplatten mit Ampicillin ausplattiert. Der restliche Ansatz

wurde für 5 Minuten bei 1000 x g zentrifugiert, der Überstand dekantiert, das

erhaltene Sediment im restlichen Medium resuspendiert und anschließend ebenfalls

ausplattiert. Die LB-Agarplatten wurden anschließend für 16 Stunden bei 37 °C im

Brutschrank inkubiert.

3.2.4 Analytische Isolierung von Plasmid-DNS mit dem „QIAprep Spin Miniprep Kit“

Um nach einer Transformation eines Ligationsansatzes Bakterienklone mit der

gewünschten pRNS1-DNS zu identifizieren, wurde von 3-5 Bakterienklonen eine

analytische Isolierung von Plasmid-DNS durchgeführt. Die Vorgehensweise erfolgte

nach Herstellerangaben.

3.2.5 Präparative Isolierung von Plasmid-DNS

Die für die Transformationen benötigten Mengen an pRNS1-DNS reichten durch

analytische Isolierung nicht aus und wurden durch präparative Isolierung gewonnen.

Hierzu wurde eine 200 ml Kultur mit 200 μl einer Vorkultur beimpft und für 16

Stunden bei 37 °C unter Schütteln inkubiert. Zur Reinigung größerer Mengen an

Plasmid-DNS wurde das „Qiagen™ HiPurePlasmid Maxiprep Kit“ nach

Herstellerangaben verwendet.

3.2.6 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren

Die Bestimmung der Konzentration und Reinheit einer DNS-Probe erfolgte

photometrisch.

3.2.7 Herstellung kompetenter Bakterienzellen

Die Transformation durch pRNS1-DNS erfolgte mit kompetenten Bakterien. Als

Kompetenz wird bei Bakterienzellen die Fähigkeit beschrieben, Fremd-DNS

aufzunehmen. Für die Herstellung von kompetenten Bakterienzellen der

unterschiedlichen Bakterienstämme wurde das Protokoll von Chung et al.

herangezogen (Chung et al., 1989). Vom gewünschten Bakterienstamm wurde

hierfür ein fraktionierter Bakterienausstrich angefertigt, von welchem eine einzelne

Bakterienkolonie in 5 ml LB-Medium ohne Antibiotikum überführt und für 16 Stunden

bei 37 °C unter Schütteln inkubiert wurde. Von dieser Vorkultur wurde ein Milliliter in

einen Erlenmeyer-Kolben mit 100 ml LB-Medium überführt und bis zu einer optischen

Dichte von 0,4–0,5 bei 578 nm ebenfalls bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Danach

wurden die Bakterienzellen bei 4500 x g für 10 Minuten bei 4 °C sedimentiert. Der

Überstand wurde verworfen und das Bakteriensediment auf 5-10 ml Volumen mit

kaltem TSS-Puffer aufgefüllt und resuspendiert. Im Anschluss wurde die

Bakteriensuspension in 100 μl Aliquots in kalte Eppendorfgefäße pipettiert und in

flüssigem Stickstoff schockgefroren. Bis zur weiteren Verwendung wurden die

kompetenten Bakterienzellen bei -80 °C gelagert.

3.2.8 Transfektion eukaryotischer Zellen zur Immortalisierung

Unter dem Immortalisieren von Zellen wird das Einbringen von Fremd-DNS in die

Zelle verstanden, welche dann zeitweise oder dauerhaft exprimiert wird. Wird die

Fremd-DNS dauerhaft in das Genom der Zelle integriert, wurde eine stabile Zelllinie

generiert. Zur Transfektion der hPTEC mit Plasmid-DNS (pRNS1; Litzkas et al.,

1984; Small et al., 1982) wurde Transfect (Roche, Mannheim) verwendet. Diese

Methode orientiert sich an der Lipofektion, die von Felgner und Kollegen erstmals

beschrieben wurde (Felgner et al., 1987). Die Zellen wurden im Transfektionsansatz

für 24 Stunden inkubiert. Anschließend wurde DMEM mit 10 % FKS, 100 U/ml

Penicillin und 0.1 mg/ml Streptomycin zur Kultivierung verwendet.

3.3 Proteinbiochemische Methoden

3.3.1 Proteinbestimmung

Die Proteinkonzentrationen wurden mittels des DC Protein Assay Kit von Bio-Rad

(Katalognummer: 500-0112) bestimmt. Das Kit baut auf der von Lowry publizierten

colorimetrischen Methode auf (Lowry et al., 1951). Zur Quantifizierung wurde ein

Proteinstandard aus BSA-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen parallel

pipettiert. Zuvor wurden alle Ansätze in einer wässrigen, 1 %igen SDS-Lösung für die

Messung verdünnt. Nach 15 Minuten Inkubation auf einem Plattenschüttler wurde die

Extinktion bei 750 nm im Photometer gemessen und die jeweilige

Proteinkonzentration in Abhängigkeit von der BSA-Standardkurve berechnet.

3.3.2 SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese)

Um die Expression von Proteinen zu untersuchen, wurde die diskontinuierliche SDS-

Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach Laemmli (Laemmli, 1970) eingesetzt.

Proteine wurden durch Zugabe von Natriumdodecylsulfat (sodiumdodecylsulfate,

SDS) und β-Mercaptoethanol denaturiert und was zum Verlust der Ladungs- und

Konformationsunterschiede. Somit bewegzen sie sich nur in Abhängigkeit ihrer

relativen molaren Masse in einem angelegten elektrischen Feld durch die Gelmatrix.

Je nach Bedarf wurden die Gele in verschiedenen Stärken verwendet (Tabelle 1).

Tabelle (1) Zusammensetzung von Sammel- und Trenngelen für SDS-PAGE. Das Sammelgel wurde stets 4,5 %ig angesetzt. Das Trenngel wurde je nach zu detekierender Proteingröße zwischen 7 und 15 % verwendet. SG: Sammelgelpffer pH 6,8; TG-Trenngelpuffer pH 8,8.

Sammelgel 4,5 % Trenngel 7 % 10 % 12 % 15 %

H2O [µl] 2100 H2O [µl] 6173 5950 4120 2913

SG-Puffer [µl] 450 TG-Puffer [µl] 3000 3000 3000 3000

AA/BA 40 %,

37,5 : 1 [µl]

AA/BA 40 %,

37,5 : 1

2777 3000 4830 6037

APS 10 %ig [µl] 40 APS 10 %ig [µl] 40 40 40 40

TEMED [µl] 4 TEMED [µl] 4 4 4 4

Die Proben wurden mit SDS-Probenpuffer im Verhältnis 1:6 verdünnt und für 5

Minuten bei 95 °C denaturiert. Um die Größe der Proben zu bestimmen, wurden

parallel dazu Proteine mit bekannten relativen Molekulargewichten aufgetrennt. Die

Elektrophorese wurde zunächst mit 80 Volt und ab Erreichen des Trenngels mit 130

Volt durchgeführt. Der Endpunkt der Elektrophorese war bei Auslaufen des im SDS-

Probenpuffer enthaltenen Bromphenolblaus aus dem Gel erreicht.

3.3.3 Färbung von Proteingelen durch Coomassie-Brillant Blau

Um die aufgetrennten Proteine nach der Elektrophorese sichtbar zu machen, wurde

das Gel mit PageBlueTM Protein Staining Solution (Fermentas, St. Leon-Roth)

gefärbt. Diese Methode basiert auf der Färbung durch Coomassie Brillant Blau

(Chrambach et al., 1967). Anschließend wurde es mit deionisiertem Wasser entfärbt,

bis die Proteinbanden gut sichtbar waren und dokumentiert.

3.3.4 Western Blot

Um ein relevantes Protein in einem Gemisch aus verschiedenen Proteinen gezielt

nachzuweisen, wurde für das gesuchte Protein ein spezifischer Antikörper

verwendet. Zunächst wurden die Proteine wie unter Abschnitt 3.3.2 beschrieben

elektrophoretisch aufgetrennt und anschließend auf eine Membran transferiert. Im

Anschluss wurde das Antigen (Protein) mit einem Antikörper auf der Membran

nachgewiesen.

Dieser Transfer erfolgte nach der diskontinuierlichen SDS-Gelelektrophorese durch

einen „Semi-Dry Blot“ auf eine PVDF-Membran (GE Healthcare, München).

3.3.5 Semi-Dry Blot

Das Blotten der Gele wurde mit einem Semi-Dry Blotsystem (Peqlab Biotechnologie

GmbH, Erlangen) durchgeführt. Der Vorteil dieser Methode liegt in der kurzen

Transferzeit von 90 Minuten gegenüber 180 Minuten beim Sandwich Blot. Der

Proteintransfer aus dem Gel auf die Membran erfolgte bei Gelen der Größe 9 x 9 cm.

Es wurde ein gefärbter Größenmarker verwendet, welcher auf der Membran sichtbar

war. Der Blot wurde so aufgebaut, dass ein luftblasenfreier Kontakt zwischen Gel und

Membran zustande kam. Pro Quadratzentimeter Membranfläche wurde eine

Spannung von 1 mA angelegt. Im Anschluss wurden die freien Bindestellen auf der

Membran für 1 Stunde in Blockierungspuffer geblockt und anschließend über Nacht

bei 4 °C mit dem Erstantikörper auf einem Drehrad inkubiert.

3.3.6 Entwicklung von Western Blots mittels Chemilumineszenz

Nichtgebundene Erst-Antikörper wurden entfernt, indem die Membran dreimal 10

Minuten mit TBS mit 0,1 % Tween (TBST) gewaschen wurde. Um die an die Proteine

gebundenen Erst-Antikörper zu detektieren, wurde ein peroxidasekonjugierter Zweit-

Antikörper verwendet. Nach einstündiger Inkubation mit dem Zweit-Antikörper wurde

die Membran zweimal 10 Minuten mit TBST und einmal 10 Minuten lang mit TBS

gewaschen. Anschließend wurde die Membran für 5 Minuten mit dem nach

Herstellerangaben frisch angesetzten ECL-Reagenz (Western Lighting

ChemilumineszenzPlus, NEN Perkin Elmer Life Sciences, Boston, USA) bedeckt.

Das Reagenz wurde entfernt und die entstandene Chemilumineszenz mit dem

Dokumentationssystem NIH image program (Peqlab) über einen Zeitraum von

maximal einer Stunde detektiert.

3.3.7 Wiederverwendung von Western Blots

Ein Western Blot kann nacheinander mit unterschiedlichen Erst-Antikörpern inkubiert

werden. Hierfür ist es notwendig, bereits gebundene Antikörper von der Membran zu

entfernen. Die Membran wurde viermal für 5 Minuten mit TBST gewaschen und im

Anschluss 30 Minuten lang bei 50 °C mit Regenerierungs-Puffer unter leichtem

Schütteln inkubiert. Das im Puffer enthaltene SDS und ß-Mercaptoethanol wurde

durch sechsmaliges Waschen für jeweils 5 Minuten mit TBST vollständig entfernt.

Die freiliegenden Proteinbindungsstellen werden erneut für eine Stunde mit

Blockierungspuffer gesättigt, so dass eine weitere Inkubation mit einem anderen

Erst-Antikörper möglich wurde.

3.3.8 Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)

Zum spezifischen Nachweis verschiedener Proteine wurde ein qualitativer (Mix-N-

Match ELISArray Kit, SA Bioscience) und quantitative (IL-8 human Eli-pair Kit,

abcam) ELISA im 96-Lochbodenplattenverfahren verwendet. Die Experimente

wurden nach Herstellerangaben durchgeführt.

3.3.9 Expressionsnachweis von Proteinen mit Dotplots

Um eine Übersicht von exprimierten Proteinen und Expressionsunterschieden

zwischen Kontrollen und Patientenzellen zu erhalten, wurde ein kommerzielles Kit

verwendet (Human Soluble Receptor Array Kit Non-Hematopoietic Panel, RnD

systems), welches auf dem Dotplot-Verfahren beruht. Die Experimente wurden nach

Herstellerangaben durchgeführt.

3.4 Färbung der Zellen mit Acridinorange und FACS-Analyse

Zur Bestimmung der Autophagierate wurden die Zellen mit dem Farbstoff

Acridinorange gefärbt. Acridinorange ist ungeladen, lipohil und kann durch einen

unspezifischen Permeations-Mechanismus biologische Membranen durchqueren

(Rundquist, 1984). Das Fluorophor hat die Eigenschaft einer schwachen Base und

kann bei saurem pH ein Proton aufnehmen, durch die Ladungsänderung wird die

freie Membranüberquerung unterbunden. Acridinorange mit gebundenem Proton

verbleibt in sauren Zellkompartimenten und reichert sich dort an. Bei der

Aufkonzentrierung des Farbstoffs in sauren Kompartimenten kommt es zu einer

Aufstapelung, die eine Lumineszenzverschiebung bewirkt. Die Anregung von

Monomeren mit blauem Laser (488 nm) führt zu grüner Fluoreszenz (525 nm; FL1).

Bei Multimeren verschiebt sich die Fluoreszenz in den roten Bereich (630 nm; FL3).

Die Intensität der roten Fluoreszenz ist proportional zum Volumen bzw. der Anzahl

saurer Kompartimente in der Zelle. Da es während dem Autophagieprozess zu einer

Zunahme von autophagosomalen und lysosomalen Kompartimenten kommt, lässt

sich direkt auf die Stärke der Autophagie rückschließen (Traganos, 1994).

Die Zellen wurden für 48 Stunden in 6 cm Schalen kultiviert und mit Acridinorange (1

µg/ml) in farblosem DMEM bei 37 °C für 20 Minuten inkubiert. Danach wurden die

Zellen gewaschen, geerntet und auf Eis gestellt. Die Messung der

Fluoreszenzintensität erfolgte durch FACS-Analyse (Canto II, Becton Dickinson) und

die Software CellQuestTMPro (Becton Dickinson). Als Grundautophagierate wurden 5

% der Kontrollzellinien festgelegt und die Patientenzelllinien wurden dazu in Relation

gesetzt. Durch Bildung des Quotienten von roter zu grüner Fluoreszenz (FL3/FL1)

konnte auf die Autophagierate geschlossen werden.

3.5 Spektrophotometrische Methoden

Die Aktivitätsmessung der Enzyme erfolgt wurde mit einem Computer gesteuerten

Spektrophotometer (Spectramax Plus Microplate Reader, Molecular Devices,

Sunnyvale, California, U.S.A.) durchgeführt. Zur Bestimmung der Aktivität wurde die

stabile Phase (Steady state) der Enzyme verwendet. Um störende

Umgebungseinflüsse wie z.B. Trübungen zu eliminieren wurden alle Enzymkinetiken

im Einstrahl-Zweiwellenlängenverfahren aufgenommen, mit Ausnahme von 5',5"-

Dithiobis-(2-Nitrobenzoat) (DTNB), welches im Einstrahl-Einlängenverfahren

aufgenommen wurde. Alle Messungen erfolgten mit einem finalen Volumen von 300

μl in temperierten 96-Lochbodenplatten (Greiner Bio-One). Die Bestimmung der

spezifischen Enzymaktivitäten (U/mg) erfolgte durch Proteinnormierung der

Enzymaktivität und des Extinktionskoeffizient des jeweils verwendeten Chromogens.

Es wurden folgende Extinktionskoeffizienten verwendet:

NAD/NADH: ε 340-400 nm = 6,1 mM-1 × cm-1

DCPIP: ε 610-750 nm = 22,0 mM-1 × cm-1

Cytochrom c: ε 540-550 nm = 19,0 mM-1 × cm-1

DTNB: ε 412 nm = 14,2 mM-1 × cm-1

3.5.1 Probenaufarbeitung für glykolytische Enzyme

Die Zellen wurden durch Abschaben geerntet und nach zweimaligem Waschen mit

PBS in EA-Puffer bestehend aus 250 mM Saccharose, 50 mM KCl, 5 mM MgCl2, 20

mM Tris/HCl, pH 7,4 aufgenommen und auf Eis gekühlt. Der Zellaufschluss erfolgte

mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle.

3.5.1 Subzellulare Fraktionierung durch differentielle Zentrifugation

Die aufgeschlossenen Zellen lassen sich durch differentielle Zentrifugation in

Fraktionen bestehend aus Zellmembranen und Zelltrümmern, Zellkernen,

Zellorganellen und Zytosol aufteilen. Durch unterschiedliche Zentrifugations-

geschwindigkeiten und unterschiedliche Sedimentationsgeschwindigkeiten einzelnen

Komponenten, die auf den unterschiedlichen Dichten beruhen lassen sich die Zellen

physikalisch auftrennen. Die Zellkerne und große Membranbruchstücke besitzen die

höchste Dichte des Zellhomogenats, so dass diese durch Zentrifugation bei 600 x g

für 5 min aus dem Homogenat entfernt werden können. Die mitochondriale Fraktion

wurde durch Zentrifugation bei 5.200 x g für 10 min aus dem Überstand des ersten

Zentrifugationsschrittes isoliert und in EA-Puffer aufgenommen. Der nach dem

zweiten Zentrifugationsschritt erhaltene Überstand wurde bei 16.000 x g für 20

Minuten zentrifugiert, der Überstand bildete die zytosolische Fraktion.

3.5.2 Probenaufarbeitung für Enzyme des Krebszyklus und der Atmungskette

Aufgrund der Zerstörung der Mitochondrien beim Zellaufschluss mit einer Kanüle bei

PTEC von MMA-Patienten, erfolgte die Probenvorbereitung für die

Aktivitätsbestimmung der Enzyme des Zitrat-Zyklus und der Atmungskette durch

Permeabilisierung mit Digitonin. Die Zellen wurden durch Abschaben geerntet, in

PBS gewaschen und 20 Minuten auf Eis in EA-Puffer supplementiert mit 0,02 %

Digitonin (w/v) inkubiert.

3.5.3 Bestimmung der Einzelenzymaktivitäten der Glykolyse

Alle Einzelenzymmessungen der Glykolyse wurden in der zytosolischen Fraktion

durchgeführt. Es wurden je nach Enzym unterschiedliche Volumina verwendet und

zur Messung mit dem jeweiligen Reaktionspuffer auf 300 µl aufgefüllt.

3.5.3.1 Hexokinase

Die Aktivität der Hexokinase (HK) wurde in EA-Puffer supplementiert mit 0,2 mM

NADP, 2 mM Glukose, 2 mM ATP und 0,05 U/ml Glukose-6-

Phosphatdehydrogenase bei pH 7,4 und 25 °C gemessen. Die HK-Aktivität wurde als

NADP- Reduktion bei λ = 340-400 nm bestimmt.

3.5.3.2 Phosphofruktokinase

Die Aktivität der Phosphofruktokinase (PFK) wurde in EA-Puffer supplementiert mit

0,5 mM NADH, 4 mM Fruktose-6-Phosphat, 2 mM ATP, 0,2 U/ml Aldolase, 0,8 U/ml

Triosephosphatisomerase und 0,1 U/ml α-Glyzerophosphatdehydrogenase bei pH

7,4 und 25 °C gemessen. Die PFK-Aktivität wurde als NADH-Oxidation bei λ = 340-

400 nm bestimmt.

3.5.3.3 Triosephosphatisomerase

Die Aktivität der Triosephosphatisomerase (TPI) wurde in EA-Puffer supplementiert

mit 0,2 mM NADH, 4,9 mM DL-Glyzeraldehyd-3-Phosphat und 0,4 U/ml α-

Glyzerophosphatdehydrogenase bei pH 7,4 und 25 °C gemessen. Die TPI-Aktivität

wurde als NADH-Oxidation bei λ = 340-400 nm bestimmt.

3.5.3.4 Glutaraldehydphosphatdehydrogenase

Die Aktivität der Glutaraldehydphosphatdehydrogenase (GAPDH) wurde in EA-Puffer

supplementiert mit 83 mM Triethanolamin, 6,7 mM 3-Phosphoglyzerat, 3 mM L-

Cystein, 2 mM MgSO4, 0,1 mM NADH, 1,1 mM ATP und 10 U/ml 3-

Phosphoglyzeratphosphokinase bei pH 7,4 und 25 °C gemessen. Die GAPDH-

Aktivität wurde als NADH-Oxidation bei λ = 340-400 nm bestimmt.

3.5.3.5 Phosphoglyzeratmutase

Die Aktivität der Phosphoglyzeratmutase (PGM) wurde in EA-Puffer supplementiert

mit 1 mM 3-Phosphoglyzerat, 1 mM ADP, 0,5 mM NADH, 2 U/ml

Laktatdehydrogenase und 2 U/ml Pyruvatkinase bei pH 7,4 und 25 °C gemessen.

Die PGM-Aktivität wurde als NADH-Oxidation bei λ = 340-400 nm bestimmt.

3.5.3.6 Enolase

Die Aktivität der Enolase (E) wurde in EA-Puffer supplementiert mit 1 mM 2-

Phosphoglyzerat, 1 mM ADP, 0,5 mM NADH, 2 U/ml Laktatdehydrogenase und 2

U/ml Pyruvatkinase bei pH 7,4 und 25 °C gemessen. Die Enolase-Aktivität wurde als

NADH-Oxidation bei λ = 340-400 nm bestimmt.

3.5.3.7 Pyruvatkinase (hoch affin)

Die Aktivität der hoch affinen Pyruvatkinase (PK HA) wurde in der zytosolischen

Fraktion der Zellen in EA-Puffer supplementiert mit 1 mM ADP, 0,1 mM

Phosphoenolpyruvat, 0,5 mM NADH, 2 U/ml Laktatdehydrogenase bei pH 7,4 und 25

°C gemessen. Die PK HA-Aktivität wurde als NADH-Oxidation bei λ = 340-400 nm

bestimmt.

3.5.3.8 Pyruvatkinase (niedrig affin)

Die Aktivität der niedrig affinen Pyruvatkinase (PK LA) wurde in EA-Puffer

supplementiert mit 1 mM ADP, 10 mM Phosphoenolpyruvat, 0,5 mM NADH, 2 U/ml

Laktatdehydrogenase bei pH 7,4 und 25 °C gemessen. Die PK LA-Aktivität wurde als

NADH-Oxidation bei λ = 340-400 nm bestimmt.

3.5.3.9 Laktatdehydrogenase

Die Aktivität der Laktatdehydrogenase (LDH) wurde in EA-Puffer supplementiert mit 1

mM Natriumpyruvat und 0,5 mM NADH bei pH 7,4 und 25 °C gemessen. Die LDH-

Aktivität wurde als NADH-Oxidation bei λ = 340-400 nm bestimmt.

3.5.4 Bestimmung der Einzelenzymaktivitäten des Zitrat-Zyklus

Alle Einzelenzymmessungen des Zitrat-Zyklus wurden mit Ausnahme des 2-

Oxoglutarat-dehydrogenasekomplexes (OGDHc) mit Digitonin permeabilisierten

Zellen durchgeführt. Es wurden je nach Enzym unterschiedliche Volumina verwendet

und zur Messung mit dem jeweiligen Reaktionspuffer auf 300 µl aufgefüllt.

3.5.4.1 Zitratsynthase

Die Aktivität der Zitratsynthase (ZS) wurde in EA-Puffer supplementiert mit 0,5 mM

Oxalacetat, 0,3 mM Acetyl-CoA und 0,1 mM 5',5"-Dithiobis-(2-nitrobenzoate) (DTNB)

bei pH 7,4 und 25 °C gemessen. Die ZS-Aktivität wurde als DTNB-Reduktion bei λ =

512 nm bestimmt.

3.5.4.2 Mitochondriale Aconitase

Die Aktivität der Aconitase (A) wurde in EA-Puffer supplementiert mit 0,5 mM

Oxalacetat, 0,3 mM Acetyl-CoA und 0,1 mM 5',5"-Dithiobis-(2-nitrobenzoate) (DTNB)

bei pH 7,4 und 25 °C gemessen. Die A-Aktivität wurde als DTNB-Reduktion bei λ =

512 nm bestimmt.

3.5.4.3 Isozitratdehydrogenase

Die Aktivität der Isozitratdehydrogenase (IDH) wurde in EA-Puffer supplementiert mit

10 mM Natriumphosphat, 2 mM Zitrat und 0,2 mM NADH bei pH 7,4 und 25 °C

gemessen. Die CS-Aktivität wurde als NADH-Oxidation bei λ = 340-400 nm

bestimmt.

3.5.4.4 Fumarase

Die Aktivität der Fumarase (Fum) wurde in EA-Puffer supplementiert mit 2 mM

Fumarat, 10 mM Kaliumphosphat, 0,33 mM NAD, 100 µM Acetyl-CoA, 660munits/ml

Malatdehydrogenase und 400munits/ml Zitratsynthase bei pH 7,4 und 37 °C

gemessen. Die F-Aktivität wurde als NAD-Reduktion bei λ = 340-400 nm bestimmt.

3.5.4.5 Malatdehydrogenase

Die Aktivität der Malatdehydrogenase (MDH) wurde in EA-Puffer supplementiert mit 2

mM Malat, 10 mM Kaliumphosphat, 0,33 mM NAD, 100 µM Acetyl-CoA und

400munits/ml Zitratsynthase bei pH 7,4 und 37 °C gemessen. Die MDH-Aktivität

wurde als NAD-Reduktion bei λ = 340-400 nm bestimmt.

3.5.4.6 Bestimmung der Aktivität von Pyruvatdehydrogenasekomplex (PDHc) und 2-Oxoglutaratdehydrogenasekomplex (OGDHc)

Die Aktivitätsbestimmung von PDHc und OGDHc erfolgte aufgrund der geringen

Aktivität radiometrisch. Die Zellen wurden für 48 Stunden in 6-Bodenlochplatten

kultiviert, geerntet und in KRB supplementiert mit Pyruvat oder 2-Oxoglutarat

überführt. Der Ansatz wurde nach Zugabe von 0,2 µC 14C-Pyruvat bzw. 14C-2-

Oxoglutarat für 10 Minuten inkubiert. Das 14C markierte CO2 wurde in Hyalin

gebunden und ausgezählt.

3.5.5 Bestimmung der Aktivität der Enzyme der Atmungskettenkomplexe

3.5.5.1 Komplex I (NADH-Reduktase)

Die Aktivität von Komplex I (CI) wurde in EA-Puffer supplementiert mit 0,2 mM

NADH, 0,05 % Laurylmaltosid (w/v), 60 µM 2,3-Dimethoxy-5-Methyl-6-Decyl–1,4-

Benzochinon (DBQ) und 2 mM NaN3 bei pH 7,4 und 30 °C gemessen. Die CI-

Aktivität wurde als NADH-Oxidation bei λ = 340-400 nm bestimmt.

3.5.5.2 Komplex II (Succinat-Dehydrogenase)

Die Aktivität von Komplex II (CII) wurde in EA-Puffer supplementiert mit 20 mM

Succinat, 0,05 % Triton X-100 (w/v), 40 µM 2,3-Dimethoxy-5-Methyl-6-Decyl–1,4-

Benzochinon (DBQ), 60 µM Dichlorphenolindophenol (DCPIP) und 2 mM NaN3 bei

pH 7,4 und 37 °C gemessen. Die CII-Aktivität wurde als DCPIP-Oxidation bei λ =

610-700 nm bestimmt.

3.5.5.3 Komplex III (Cytochrom c-Reduktase)

Die Aktivität von Komplex III (CIII) wurde in EA-Puffer supplementiert mit 50 μM

Decylubihydrochinon (DBH), 0,05 % Triton X-100 und 2 mM NaN3 bei pH 7,4 und 25

°C gemessen. In jedes Well wurden 2 μl oxidiertes Cytochrom c (10 mM in 20 mM

KPi und pH 7,4) vorgelegt und die CIII-Aktivität als Cytochrom c-Reduktion bei λ =

540-550 nm bestimmt.

Die Herstellung von DBQ aus durch Reduktion DBH erfolgte durch Zugabe von

Natrium-Dithionit (Brandt und Okun, 1997). Die Konzentrationsbestimmung von DBH

erfolgte bei 290-350 nm ε290-350 = 4,2 mM-1 × cm-1).

3.5.5.4 Komplex IV (Cytochrom c-Oxidase)

Die Aktivität von Komplex IV (CIV) wurde in EA-Puffer supplementiert mit 120 mM

KPi und 0,05 % Laurylmaltosid bei pH 7,4 und 25 °C gemessen. In jedes Well

wurden 2 μl reduziertes Cytochrom c (10 mM in 20 mM KPi und pH 7,4) vorgelegt

und die CIV-Aktivität als Cytochrom c-Oxidation bei λ = 540-550 nm bestimmt.

Die Herstellung von reduziertem aus oxidiertem Cytochrom c erfolgte durch Zugabe

von 0,3 ml einer 1 M Natriumdithionitlösung zu 2,7 ml einer 10 mM Cytochrom c-

Lösung in 20 mM KPi. Nach der Äquilibrierung einer Säule (Econo-Pac 10 DG

Columns) mit 100 ml wurde die Cytochrom c-Dithionitlösung auf die Säule gegeben.

Die Elution erfolgte mit stickstoffbegastem 20 mM KPi-Puffer und die reduzierte

Cytochrom c-Lösung wurde in 200 µl Fraktionen aufgefangen. Der Gehalt an

reduziertem Cytochrom c (ε 540-550 nm = 19,0 mM-1 × cm -1) in der Lösung wurde

spektroskopisch bestimmt.

3.5.5.5 Komplex V (ATP-Synthase)

Die Aktivität von Komplex V (CV) wurde in EA-Puffer supplementiert mit 250 µM

NADH, 1mM Phosphoenolpyruvat, 2,5 U/ml Laktatdehydrogenase, 2 U/ml

Pyruvatkinase, 2 mM ATP und 1 µM DQA bei pH 7,4 und 37 °C gemessen. Die CV-

Aktivität wurde als reverse Reaktion durch Hydrolyse von ATP zu ADP gemessen.

Die Pyruvatkinase setzt Phosphoenolpyruvat, zu Pyruvat um, dabei wird ATP aus

ADP gebildet. Die Laktatdehydrogenase katalysiert die Reaktion von Pyruvat zu

Laktat, die Enzymaktivität wurde durch die damit verbundene Oxidation von NADH

zu NAD bei λ = 340-400 nm bestimmt.

3.6 Bestimmung des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs

Zur Ermittlung des mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs von Kontrollen und

Patientenzellen wurde ein Oroboros 1 oxygraph system der AG Mairbäurl (Paar,

Österreich) verwendet. Die Messung erfolgte für 2 Proben parallel, so dass immer

Kontrollen mit Patienten verglichen werden konnten. Die Elektrode im Oxygraph

erfasste die Sauerstoffkonzentration der Reaktionskammer sowie die Änderung der

Sauerstoffkonzentration über die Zeit. Die Zellen wurden geerntet, gewaschen und in

die Elektrodenkammern gegeben. Als Medium wurde DMEM + 10 % FKS, KRB mit 4

mM Glukose oder KRB mit 4 mM Pyruvat verwendet. Für die Initiation des Systems

und die Messung wurden die Zellen 20 Minuten unter leichtem Rühren in den

Kammern inkubiert, nach Zugabe von 10 mM Kaliumcyanid (KCN) wurde der

Sauerstoffverbrauch der Atmungskette unterbunden. Der folgende

Sauerstoffverbrauch umfasste alle Prozesse der Zelle außer der mitochondrialen

Atmung. Durch Bildung der Differenz von insensitiven (vor Zugabe KCN) und

sensitiven (nach Zugabe KCN) Sauerstoffverbrauch, wurde der mitochondriale Anteil

des Sauerstoffverbrauchs ermittelt (Krawczyk et al., 2010).

ΔO2 (sensitiv) = ΔO2 (insenstitv + sensitiv) - ΔO2 (insensitiv)

3.7 ROS-Nachweis durch reduziertes Glutathion

Zum Nachweis von ROS wurde der Gehalt an reduziertem und oxidiertem Glutathion

durch die Aktivität der Glutathionreduktase spektrophotometrisch ermittelt.

Reduziertes Glutathion (GSH) besitzt eine freie Thiolgruppe und kann durch

Elektronenabgabe an ROS oxidiert werden, wodurch sich zwei Glutathion-Moleküle

über eine Disulfidbrücke zu Glutathion-Disulfid (GSSG) verbinden.

Die Zellen von Kontrollen und Mut0-Patienten wurden für 48 Stunden in T25-

Kulturflaschen kultiviert. Anschließend wurden sie geerntet, gewaschen, in PBS

aufgenommen und auf Eis gestellt. Nach der Proteinbestimmung wurde der

Proteingehalt jeder auf den gleichen Wert eingestellt und durch Zugabe von

Sulfosalicylsäure deprotoniert. Die Proben wurden zentrifugiert und der Überstand

mit Triethylaminlösung und Vinylpyridinlösung für 1 Stunde bei Raumtemperatur

inkubiert. Danach konnten die Proben spektrophotometrisch gemessen werden. Zur

Einordnung des GSH und GSSG-Gehalts wurde eine Kalibrierreihe mit bekannter

Menge GSH parallel mitgemessen. Die Aktivität der Glutathionreduktase wurde in

einem Puffer bestehend aus 180 mM Dinatriumhydrogenphosphat, 6 mM EDTA, 0,3

mM NADPH und 0,6 mM DTNB bei 37 °C und einem pH-Wert von pH 7,5 gemessen.

Die Glutathionreduktase katalysiert die Reaktion von oxidiertem (GSSG) zu

reduziertem Glutathion (GSH), die Enzymaktivität wurde durch die damit verbundene

Oxidation von NADPH zu NADP bei λ = 340-400 nm bestimmt.

3.8 Färbung der Zellen mit H2DCFDA und ROS-Nachweis

Der Fluoreszenzfarbstoff 2’,7’-Dichloro-Dihydrofluoresceindiacetat (H2DCFDA) ist

zellpermeabel und ändert nach Abspaltung seiner Acetatgruppen durch intrazelluläre

Esterasen und Oxidation sein Absoprtionsspektrum. Es ist ein Derivat von

Fluorescein und besitzt Acetatgruppen, die nach Diffusion ins Zelllumen intrazellulär

von Esterasen abgespalten werden. ROS oxidieren die freigewordenen

Thiolgruppen, das Extinktionsmaximum ändert sich und die Fluoreszenz kann mit

einem Plattenfluorometer gemessen werden. Nach der Abspaltung der

Acetatgruppen ist der Farbstoff nicht mehr zellpermeabel und verbleibt in der Zelle.

Die Zellen wurden 48 Stunden in 6 Lochbodenplatten kultiviert und 4 Stunden in

Medium oder Krebs-Ringer-Puffer mit unterschiedlichen Supplementen inkubiert.

Nach 30 Minuten Färbung mit H2DCFDA wurde die Fluoreszenz mit einem

Plattenfluorometer in jedem Well an 9 Punkten gemessen und der Mittelwert gebildet.

3.9 Quantitative Analyse von MMA mittels MS/MS

MMS wurde im Medium von Kontrollen und Mut0-Zellen durch electrospray ionization

mass spectrometry (MS/MS) nachgewiesen. Dafür wurden die Zellen zunächst in

T75-Kulturflaschen für 96 Stunden kultiviert. Das Medium wurde abgenommen und

mit 1µl 3-fach deuterierter MMS als Standard versetzt (d3-MMS, 10 mM) versetzt.

Anschließend wurde das Medium mit Salzsäure angesäuert und gemischt um alle

Säuren in die organische Phase zu überführen. Durch Zugabe von Natriumchlorid

wurde der pH-Wert neutralisiert. Danach wurden die organischen Säuren mit

Ethylacetat extrahiert. Nach Zentrifugation konnte die organische von der wässrigen

Phase getrennt und in neue Pyrex-Röhrchen überführt werden. Das Eluat wurde bei

40 °C auf einem Heizblock unter Stickstoffbegasung eingedampft. Durch Zugabe

eines Lösungsmittels aus Ethanol/Acetonitril/Ameisensäure (50:50:1) (v/v) wurde das

Eluat wieder gelöst. Eine parallele Aufarbeitung erfolgte mit Medium das mit MMS

bekannter Konzentration zur Quantifizierung der Ergebnisse versetzt war. Nach der

Überführung in 96-Lochbodenplatten erfolgte die Analyse in einem Quattro Ultima

Micro API mass spectrometer (Micromass, Manchester, UK) mit einer Elektrospray

Ionenquelle und Micromass MassLynx data system statt. Durch einen Strom aus

Acetonitril/Wasser (60:40) (v/v) durch einen MS2777 autosampler (Waters SAS, St.

Quentin, Frankreich) und einer Flux Rheos 2000 HPLC Pumpe (Flux Instruments,

Basel, Suisse) wurde die Probe injiziert.

3.10 Statistische Auswertung

Bei Vergleichen aller Zelllinien (Kontrollen: n=3-9; PA: n=3; MMA: n=6) wurde eine

univariate Varianzanalyse (ANOVA) durchgeführt. Das Signifikanzniveau wurde auf 5

% festgesetzt. Als Kontraste wurden Ergebnisse von Kontrollen oder PA-Patienten

mit MMAzidurie-Patienten verglichen. Die statistische Auswertung der Ergebnisse

erfolgte mit der Software SPSS Version 22. Bei der Verwendung von 2 Zelllinien

wurde ein Student’s T-Test durchgeführt.

4 Ergebnisse

4.1 Relevante Werte der Zellspender

Die aus dem Urin isolierten humanen PTEC wurden von Kontrollen, MMA- und PA-

Patienten unterschiedlichen Alters und Geschlechts gewonnen. Für diese Arbeit

wurden Zellen von 9 Kontrollen, 3 PA-Patienten und 6 MMA-Patienten verwendet.

(Tabelle 2). Da sich die fünf mut0-Patienten und der CblB-Patient in allen

durchgeführten Versuchen nicht voneinander unterschieden, wurden sie unter der

Gruppe MMA zusammengefasst.

Tabelle (2) Übersichtsdaten von Kontrollen, MMA- und PA-Patienten die als Spender von PTEC dienten

PTEC Alter Geschlecht Mutation im Gen und Protein

MMS im Plasma über 2 Jahre [µmol/L]

Ctrl_1 37 W n.a. n.a.

Ctrl_2 29 M n.a. n.a.

Ctrl_3 22 W n.a. n.a.

Ctrl_4 24 M n.a. n.a.

Ctrl_5 12 M n.a. n.a.

Ctrl_6 7 M n.a. n.a.

Ctrl_7 6 M n.a. n.a.

Ctrl_8 11 W n.a. n.a.

Ctrl_9 10 M n.a. n.a.

PA_1 18 M n.a. n.a.

PA_2 11 M n.a. n.a.

PA_3 10 W n.a. n.a.

Mut0_1 22 W T862C Ser288Pro 4112 (± 1430)

Mut0_2 23 M C982T Leu328Phe 4239 (± 2845)

Mut0_3 18 W G607A Gly203Arg 1230 (± 414)

Mut0_4 11 W G607A Gly203Arg

C1105T Arg369Cys

3278 (± 1527)

Mut0_5 16 M T862C Ser288Pro

A1157G H386R

4579 (± 1527)

CblB_1 40 M C556T Arg186W 3143 (± 453)

Die Gruppe der MMA-Patienten bestand aus 5 mut0-Patienten und 1 Cobalamin B-

Patient (CblB). Die Mutationen der Patienten Mut0_1-5 befinden sich im Mut-Gen,

das für die MCM codiert. Die Mutation des Patienten CblB_1 befindet sich im MMAB-

Gen, das für die Cobalamin-Adenosyltransferase codiert. Werte für die MMS-

Konzentration im Blutplasma wurden nur von MMA-Patienten im Zuge ambulanter

oder stationärer Patientenbesuche mittels Tandem-MS erhoben. Das Plasma der

MMA-Patienten wurde im Zeitraum von 365 Tagen vor und nach Zellgewinnung auf

seine MMS-Konzentration untersucht. Die Höhe der MMS-Konzentration im Plasma

der Patienten Mut0_1 (4112 µmol/L), Mut0_2 (4239 µmol/L), Mut0_3 (1230 µmol/L),

Mut0_4 (3278 µmol/L), Mut0_5 (4579 µmol/L) und CblB_1 (3143 µmol/L) war von

starken Schwankungen gekennzeichnet.

Der Vergleich der MMS-Werte zeigt, dass die Menge an MMS bei 5 Patienten mit

Defekt der MCM und einem Patienten mit Defekt der Cobalamin-Adenosyltransferase

ein Jahr vor und nach Isolierung der PTEC stark erhöht war.

4.2 Charakterisierung der verwendeten humanen PTEC

Die verwendeten humanen PTEC sollten zunächst auf ihre Spezifität hin untersucht

werden. Es sollte überprüft werden, ob die Zellen der Kontrollen, MMA- und PA-

Patienten Charakteristiken von PTEC aufweisen. Dafür wurden sie auf Morphologie

und Expression von Markerproteinen hin getestet.

Epithelzellen weisen ein für sie typisches Wachstum in

Kopfsteinsteinpflasteranordnung auf. Alle verwendeten Zelllinien zeigten im

Lichtmikroskop eine kopfsteinpflasterartige Morphologie und Wachstum in

Einzelzellschicht (Abb. 4).

Ctrl_2 Ctrl_1

Ctrl_4 Ctrl_3

Ctrl_6 Ctrl_5

Ctrl_8 Ctrl_7

PA_1 Ctrl_9

PA_3 PA_2

Abbildung (4) Lichtmikroskopische Aufnahmen aller verwendeten humanen PTEC. Sie zeigten ein für Epithelzellen typisches Wachstum. Die Zellen der Kontrollen Ctrl_1-9, PA_1-3, Mut0_1-5 und CblB_1 wachsen alle in Kopfsteinpflasteranordnung.

Im Urogenitaltrakt des Menschen finden sich verschiedene Epithelzellen, die das

Interstitium zum Primärharn und Harn hin abschließen. Diese Zellen exprimieren

jeweils für sie charakteristische Proteine. Beim Epithel des proximalen Tubulus sind

dies das integrale Membranprotein Aquaporin 1 (AQP1) und das membranständige

Protein γ-Glutamyltransferase 1 (γGT1).

Mut0_1 Mut0_2

Mut0_4 Mut0_3

CblB_1 Mut0_5

Aquaporin 1 bildet eine Pore, die an der Regulation des Wassergehalts des

Primärharns im proximalen Tubulus beteiligt ist. Es wird beim Menschen im

proximalen, nicht aber im distalen Tubulus exprimiert (Bedford et al., 2003). Die γ-

Glutamyltransferase 1 überträgt den Glutamylrest von reduziertem Glutathion (GSH)

auf Peptide oder Wasser. Beide Proteine wurden in allen verwendeten Zelllinien

exprimiert (Abb. 5).

Abbildung (5) Expression von γ-Glutamyltransferase 1 (γGT1) und Aquaporin 1 (AQP1) der verwendeten PTEC. Im Western Blot zeigten alle verwendeten Zelllinien die Expression der Markerproteine AQP1 und γGT1. Der Nachweis von β-Aktin diente als innerer Standard.

4.3 Produktion von Methylmalonsäure

Neben Morphologie und der Expression von Markerproteinen sollten die Zellen in

Hinblick auf ihren enzymatischen Defekt der MCM bzw. des Cofaktors

Hydroxycobalamin hin untersucht werden. Dies wurde durch die Bestimmung der

Konzentration der MMS im Medium der Zellen überprüft. MMS entsteht direkt beim

Abbau von Propionsäure (PS) und wird normalerweise durch die MCM weiter zu

Succinat metabolisiert, um danach dem Zitrat-Zyklus zugeführt zu werden. Durch den

enzymatischen Defekt kommt es zur Akkumulation von MMS in der Zelle. Durch

Bindung der Säure an Carnitin kann die Zelle die Säure an ihre Umgebung abgeben,

um Schädigungen der Zelle und des Organismus zu verringern.

Im Medium der PTEC von MMA-Patienten war die MMS-Konzentration signifikant um

mehr als 100% gegenüber den Zellen der Kontrollen erhöht (p < 0,05; Abb. 6).

Abbildung (6) MMS-Konzentration im Medium von PTEC von Kontrollen und MMA-Patienten. PTEC von MMA-Patienten produzierten und sezernierten mehr MMS als PTEC von Kontrollen. Im Mittel lag die MMS-Konzentration mit 6 mmol/mg Protein gegenüber 2,5 mmol/mg Protein mehr als doppelt so hoch. *p < 0,05. (Ctrl: n=4, MMA: n=4).

*

4.4 Bioenergetik

Bei Patienten mit MMA wurde in unterschiedlichen Modellen gezeigt, dass es zu

einer Beeinträchtigung des Energiemetabolismus kommt, welche sich in einer

Unterversorgung vor allem der Zellen mit erhöhtem Energiebedarf äußert. Für

humane PTEC liegen bislang keine Daten hierzu vor. Um den Energiehaushalt

dieser Zellen zu überprüfen, wurden die Glykolyse, der Pyruvatdehydrogenase-

Komplex, der Zitrat-Zyklus und die Atmungskette untersucht.

4.4.1 Sauerstoffverbrauch der Mitochondrien

Der Sauerstoffverbrauch der mit Digitonin permeabilisierten Zellen wurde in 1)

DMEM, sowie in 2) Krebs-Ringer-Puffer mit Glukose und 3) Krebs-Ringer-Puffer mit

Pyruvat bestimmt. Die Bedingungen in DMEM stellen für die Zellen die

Idealbedingungen dar, unter welchen ihnen Energie in Form von Glukose,

Reduktionsmitteln und Aminosäuren zur Verfügung stehen. In KRB mit Glukose wird

speziell die Energiegewinnung durch die Glykolyse angesteuert, bei KRB mit Pyruvat

der Zitrat-Zyklus. Durch die verschiedenen Ansätze kann ein Defekt leichter der

Glykolyse, dem Zitrat-Zyklus oder der Atmungskette zugeordnet werden.

In DMEM zeigten Zellen von MMA- und PA-Patienten einen signifikant verringerten

Sauerstoffverbrauch um 70 % im Vergleich zu Kontrollen (p < 0,05; Abb. 7). Unter

Bedingungen, in welchen die Zellen alleine auf Glukose als Energieträger

zurückgreifen konnten, wiesen Zellen von MMA-Patienten einen signifikant

verringerten Sauerstoffverbrauch auf 30 % auf, bei PA-Patienten war die

Verringerung aufgrund der großen Streuung auf 26 % nicht signifikant (p < 0,05; Abb.

7). Bei Pyruvat als Energieträger war der Sauerstoffverbrauch von MMA-Patienten

gegenüber PA-Patienten signifikant um 50 % verringert, die Verringerung gegenüber

den Kontrollen war aufgrund der großen Streuung nicht signifikant (p < 0,05; Abb. 7).

Abbildung (7) Mitochondrialer Sauerstoffverbrauch der humanen PTEC in KRB mit 4 mM Glukose, KRB mit 4 mM Pyruvat und DMEM. *p < 0,05. (Ctrl: n=5, PA: n=3, MMA: n=6).

Da der verringerte mitochondriale Sauerstoffverbrauch, der bei PTEC von MMA-

Patienten unter DMEM, Glukose und Pyruvat als Energieträger und bei PA-Patienten

unter DMEM auftrat, wurde der Energiemetabolismus auf den Ebenen der Glykolyse,

des Zitrat-Zyklus und der Atmungskette untersucht.

4.4.2 Glykolyse

Zunächst wurden aufgrund des verringerten mitochondrialen Sauerstoffverbrauchs

bei PTEC von MMA-Patienten die Einzelenzymaktivitäten der Glykolyse untersucht.

Der Vergleich der Einzelenzymaktivität der glykolytischen Enzyme von Kontrollzellen,

Zellen von MMA- und PA-Patienten zeigte, dass bei PTEC der MMA-Patienten

gegenüber Kontrollen und PA-Patienten die Aktivität der Phosphofruktokinase (PFK)

signifikant auf 35 % verringert, die Aktivität der Triosephosphat-Isomerase (TPI)

signifikant um 30 % erhöht und die Aktivität der Glyceraldehydphosphat-

Dehydrogenase (GAPDH) signifikant um 15 % erhöht war (p < 0,05%; Abb. 8). Die

* * **

Aktivitäten von Phosphoglyceratmutase (PGM) und Enolase (E) war bei PTEC von

PA-Patienten im Vergleich zu MMA-Patienten signifikant verringert, die Aktivität der

beiden Enzyme bei PTEC von MMA-Patienten befanden sich jedoch etwa auf dem

Niveau von Kontrollzellen (p < 0,05; Abb. 8). Die anderen Enzyme der Glykolyse,

welche Hexokinase (HK), hoch affine und niedrig affine Pyruvatkinase (PK HA, PK

LA) sowie die Laktadehydrogenase (LDH) umfassen, waren nicht signifikant

verändert (Abb. 8).

Abbildung (8) Enzymaktivitäten der glykolytischen Enzyme. HK: Hexokinase; PFK: Phosphofruktokinase; TPI: Triosephosphatisomerase; GAPDH: Glyceraldehydphosphat-Dehydrogenase; PGM: Phosphoglyceratmutase; E: Enolase; PK HA: Pyruvatkinase tetramer; PK LA: Pyruvatkinase dimer; LDH: Laktatdehydrogenase in % der Kontrolle (*p < 0,05). (Ctrl: n=4, PA: n=3, MMA: n=5).

Insgesamt wurden 9 Enzymen der Glykolyse gemessen, bei 3 Enzymen wurden

signifikante Unterschiede zwischen Kontrollen und MMA-Patienten, sowie bei 5

Enzymen signifikante Unterschiede zwischen MMA- und PA-Patienten festgestellt.

*

* *

**

* **

4.4.3 Pyruvat-Dehydrogenasekomplex

Die Bestimmung der Aktivität des Pyruvat-Dehydrogenasekomplexes (PDHc) erfolgte

durch einen radiometrischen Ansatz. In der ersten Teilreaktion erfolgt eine

Decarboxylierung von Pyruvat. Durch Zugabe von radioaktiv markiertem Pyruvat zum

Versuchsansatz konnte das entstehende 14C-CO2 gemessen werden.

Die Aktivität des PDHc zeigte beim Vergleich bei PTEC der MMA-Patienten im

Vergleich zu PTEC von Kontrollen eine Tendenz zur Verringerung auf 65 %, die

aufgrund der großen Streuung der Kontrollen jedoch nicht signifikant war, bei PA-

Patienten fiel die Verringerung der Aktivität gegenüber PTEC von Kontrollen noch

etwas größer aus, war jedoch ebenfalls nicht signifikant (Abb. 9).

Abbildung (9) Enzymaktivität des PDHc der PTEC von PA- und MMA-Patienten als 14C-Produktion in % der Kontrolle (*p < 0,05). (Ctrl: n=9, PA: n=3, MMA: n=6).

4.4.4 Zitrat-Zyklus

Die Einzelenzymaktivitäten von Zitratsynthase (CS), mitochondrialer Aconitase (A),

Isozitrat-Dehydrogenase (IDH), Fumarase (Fum) und Malatdehydrogenase (MDH)

wurden spektrophotometrisch analog zur Glykolyse bestimmt (4.4.2), die

Aktivitätsbestimmung des 2-Oxoglutarat-Dehydrogenasekomplexes (OGDHc)

erfolgte analog zum PDHc radiometrisch (4.4.3).

Die Aktivität der A war bei PTEC von MMA-Patienten signifikant um 30 % verringert

(p < 0,05; Abb. 10). Die A besitzt ein Eisenatom im katalytischen Zentrum, welches

das Enzym anfällig für reaktive Sauerstoffspezies (ROS) werden lässt. Der OGDHc

war bei MMA-Patienten signifikant um 45 % verringert, die Verringerung bei PA-

Patienten um 50 % war nicht signifikant (p < 0,05; Abb. 10). Er katalysiert den

geschwindigkeitsbestimmenden Schritt im Zitrat-Zyklus.

Abbildung (10) Enzymaktivitäten des Zitrat-Zyklus. CS: Zitrat-Synthase; A: mitochondriale Aconitase; IDH: Isozitrat-Dehydrogenase; OGDHc: 2-Oxoglutarat-Dehydrogenasekomplex; Fum: Fumarase; MDH: Malat-Dehydrogenase in Prozent der Kontrolle (*p < 0,05). (Ctrl: n=9, PA: n=3, MMA: n=6)

* *

Die signifikant verringerten Aktivitäten der A und des OGDHc bei PTEC von MMA-

Patienten können auf eine Beeinträchtigung der Enzymaktivität, sowie einen

verlangsamten Ablauf des Zitrat-Zyklus hinweisen.

4.4.5 Oxidative Phosphorylierung

Die Aktivitätsbestimmung der Einzelenzymkomplexe der Atmungskette erfolgte in mit

Digitonin permeabilisierten PTEC. Zellen von PA-Patienten zeigten lediglich eine

nicht signifikante Verringerung der Aktivität der NADH-Dehydrogenase (Komplex I).

Bei PTEC von MMA-Patienten war eine signifikante Verringerung der Aktivität der

Cytochrom c-Oxidase (Komplex IV) gegenüber Kontrollzellen feststellbar (p < 0,05;

Abb. 11).

Abbildung (11) Enzymaktivitäten der Atmungskettenkomplexe von PTEC der Kontrollen, PA- und MMA-Patienten. CI: Komplex I; CII: Komplex II; CIII: Komplex III; CIV: Komplex IV; CV: Komplex V in % der Kontrolle (*p < 0,05). (Ctrl: n=9, PA: n=3, MMA: n=6).

*

4.5 Freisetzung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS)

4.5.1 Nachweis von ROS durch die Oxidierung von reduziertem Glutathion

Die Gesamtmenge des interzellulären Glutathions war bei Kontrollen und MMA-

Patienten unverändert (Gesamt GSH). Die oxidierte Form von Glutathion, das

Glutathiondisulfid (GSSG), lag hingegen bei MMA-Patienten signifikant um 50 %

höher als bei Kontrollzellen vor, die reduzierte Form von Glutathion (GSH) lag

signifikant um 60 % geringer vor als bei Kontrollzellen (p < 0,05; Abb. 12).

Abbildung (12) Glutathion-Gehalt der PTEC von Kontrollen und MMA-Patienten in % der Kontrolle von Gesamt GSH: Gesamtglutathiongehalt; GSSG: disulfidgebundenes oxidiertes Glutathion; GSH: reduziertes Glutathion (*p < 0,05). (Ctrl: n=8, MMA: n=4).

* *

4.5.2 Nachweis von ROS durch 2’,7’-Dichloro-Dihydrofluoresceindiacetat

Zur Untersuchung der erhöhten ROS-Produktion bei PTEC von MMA-Patienten

wurde 2’,7’-Dichloro-Dihydrofluoresceindiacetat (H2DCFDA) verwendet.

Die Zellen wurden in William's E-Medium sowie in KRB mit verschiedenen

Supplementen kultiviert. Es sollte überprüft werden, ob die Entwicklung von ROS mit

einem Defekt des Energiemetabolismus verbunden sein könnte. KRB wurde mit

Glukose, Pyruvat oder Glutamin (4 mM) supplementiert, um den Energiegewinn

durch Glykolyse bzw. Zitrat-Zyklus und Atmungskette zu stimulieren. Desweiteren

wurde untersucht, ob sich die ROS-Produktion durch Inkubation mit PS, MMS oder

Isoleucin (Ile) (jeweils 5 mM) stimulieren ließ.

Williams E-Medium enthält viele Antioxidantien, die ROS teilweise entgegenwirken

können. Die Erhöhung der ROS war bei PTEC von MMA- und PA-Patienten nicht

signifikant verändert. In KRB, sowie in KRB supplementiert mit Glukose, Pyruvat und

Glutamin als Energiequelle war die ROS-Produktion von MMA-Patienten gegenüber

Kontrollen signifikant erhöht, in KRB supplementiert mit MMS oder Isoleucin als

Belastung war die ROS-Produktion gegenüber Kontrollen und PA-Patienten ebenfalls

signifikant erhöht (p < 0,05; Abb. 13).

Abbildung (13) Entstehung von ROS in PTEC von Kontrollen, PA- und MMA-Patienten in Williams E Medium, KRB, KRB mit Glukose, KRB mit Pyruvat, KRB mit Glutamin (Gln), KRB mit 5 mM Propionsäure (PS), KRB mit 5mM Methylmalonsäure (MMS), KRB mit 5mM Isoleucin (Ile) in % der Kontrolle. Alle Medien waren mit 10 µM H2DCFDA supplementiert (*p < 0,05). (Ctrl: n=3, PA: n=3, MMA: n=6).

* * * * * *

* **

4.6 Subzellulare Strukturen der humanen PTEC im Elektronenmikroskop

Neben Morphologie, Expression von Markerproteinen und Produktion von MMS

sollten die verwendeten Zellen auf Unterschiede und Auffälligkeiten in ihrer

Substruktur untersucht werden. Dafür wurden von 12 Zelllinien (6 Kontrollen: Ctrl_1,

Ctrl_2, Ctrl_3, Ctrl_5, Ctrl_6, Ctrl_7; 5 MMA-Patienten: Mut0_1, Mut0_2, Mut0_3,

Mut0_5, CblB_1; 1 PA-Patient: PA_1) elektronenmikroskopische Aufnahmen

angefertigt.

Auf den Bildern ist bei PTEC der MMA-Patienten die Akkumulation von

vesikelartigen, von einer Doppelmembran umgebenen Strukturen erkennbar, die auf

gebildete Autophagosome hinweisen (roter Pfeil). Weiterhin ist bei PTEC von MMA-

Patienten erkennbar, dass Teile des rauen endoplasmatischen Retikulums (ER)

ringförmige Strukturen bilden, die mit Mitochondrien assoziiert waren und ein

vergrößertes Lumen zeigten (Abb. 4.14, Mut0_1 – Mut0_5; CblB_1). Dies könnte ein

Hinweis auf Stress des ER sein (blauer Pfeil). Bei PTEC der Kontrollen und des PA-

Patienten sind weder von einer Doppelmembran umgebene Strukturen, noch

Auffälligkeiten des ER erkennbar (Abbildung 14, Ctrl_1 – Ctrl_7; PA_1). Die

Mitochondrien der MMA- und PA-Patienten erschienen im Vergleich zu Kontrollen

nicht unterschiedlich oder auffällig (Abb. 14).

Ctrl_1 Ctrl_2

Ctrl_5 Ctrl_3

Ctrl_7 Ctrl_6

Mut0_2 Mut0_1

Abbildung (14) Elektronenmikroskopische Bilder der PTEC von 6 Kontrollen, 5 Mut0-Patienten, einem CblB-Patienten und einem PA-Patient. Bei Zellen der MMA-Patienten sind von einer Doppelmembran umgebenen Vesikel erkennbar, die Autophagosome darstellen können (roter Pfeil). Das raue ER zeigt bei PTEC von MMA-Patienten Strukturveränderungen und ein vergrößertes Lumen (blauer Pfeil). Die Anfertigung der EM-Bilder erfolgte durch Frau Kaden in der Abteilung „Zelluläre und Molekulare Pathologie“ von Prof. Gröne im Deutschen Krebsforschungszentrum in Heidelberg.

Die von einer Doppelmembran umgrenzten vesikelartigen Strukturen und das

ausgedehnte Lumen des ER bei PTEC von MMA-Patienten können auf

autophagozytotische Prozesse und ER-Stress hinweisen.

Mut0_3 Mut0_5

PA_1 CblB_1

4.7 Initiation, Entwicklung und Abbau von Autophagosomen bei PTEC von MMA-Patienten

Um den Ursprung und die Entwicklung der mit einer Doppelmembran umschlossenen

vesikelartigen Strukturen zu untersuchen, welche bei PTEC von MMA-Patienten auf

elektronenmikroskopischen Bildern erkennbar waren, wurden die Zellen auf den drei

Ebenen 1) Regulation der Reifung der Phagophore, 2) Entwicklung der Phagophore

und 3) lysosomaler Abbau des Autophagosoms auf autophagozytotische Prozesse

hin untersucht.

Die statistische Signifikanz der Unterschiede zwischen den Zelllinien wurde

angegeben durch:

(CM* < 0,05): Kontrollen – MMA-Patienten

(CP* < 0,05): Kontrollen – PA-Patienten

(MP* < 0,05): MMA-Patienten – PA-Patienten

Die statistische Signifikanz der Unterschiede innerhalb der Zelllinien wurde

angegeben durch:

( *: p < 0,05): MMA-Patienten

( *: p < 0,05): PA-Patienten

4.7.1 Regulation der Reifung der Phagophore durch mTORC1

Zunächst wurde der Signalweg, der an der Steuerung der Reifung der Phagophore

beteiligt ist, untersucht. Die Regulierung der Reifung erfolgt über den

Multiproteinkomplex mTORC1. Die Aktivierung des mTOR-Signalweges wurde mit

Hilfe von Antikörpern gegen Proteine von mTORC1 (mTOR Regulation Antibody

Sampler Kit, Cell Signaling) bei Kontroll- und Patientenzellen im Western Blot

untersucht. Die Regulation von mTORC1 erfolgt über Phosphorylierung und

Dephosphorylierung der mTOR-Kinase, und durch am Komplex beteiligte

Regulatoren, wie z.B. PRAS40.

Das Protein PRAS40 ist dephosphoryliert an Raptor gebunden und inhibiert die

Assemblierung von mTORC1. Durch Phosphorylierung von PRAS40 (pPRAS40)

dissoziiert dieses von Raptor, die Assemblierung und die Aktivierung von mTORC1

wird gefördert.

Die Kinase mTOR ist an der Regulation von Autophagie durch Inhibierung des

Komplexes aus ULK1/FIP200/ATG13 beteiligt. Durch Phosphorylierung von mTOR

(pmTOR) wird mTORC1 aktiv und hemmt die Reifung der Phagophore.

Um die PTEC verschiedenen Stufen metabolischen Stresses auszusetzen, wurden

sie für 48 Stunden unter Bedingungen mit hohem (20 %), geringem (1 %) und sehr

geringem (0,5 %) FKS-Gehalt in DMEM kultiviert. Untersucht wurde der Verlauf der

Expressionslevel von Phospho-mTOR (Ser2448), mTOR, Phospho-PRAS40

(Thr246), PRAS40 und pRaptor (Ser792) in Abhängigkeit des FKS-Gehalts. Die

Werte der MMA- und PA-Patienten wurden auf die Kontrollen normiert dargestellt.

Unter Bedingungen mit 0,5 % FKS war die Ratio der relativen Expression von

pPRAS40/PRAS40 bei MMA-Patienten mit 180 % Expressionsstärke im Vergleich zu

Kontrollen am höchsten (CM*, MP*: p < 0,05), sie sank bei höheren

Supplementationen des Mediums mit 1 % FKS auf 140 % Expressionsstärke im

Vergleich zu Kontrollen (CM*, MP*: p < 0,05) und bei 20 % FKS auf 60 %

Expressionsstärke im Vergleich zu Kontrollen ab (CM*, MP*, *: p < 0,05). Somit

zeigte PRAS40 bei MMA-Patienten einen Zusammenhang mit dem FKS-Gehalt und

sank bei hohen FKS-Werten ab ( *: p < 0,05), was auf eine geringere Assemblierung

von mTORC1 hindeutete. Die Ratio der relativen Expression von pPRAS40/PRAS40

war unter Bedingungen mit 20 % FKS bei PA-Patienten mit 30 % Expressionsstärke

im Vergleich zu Kontrollen am geringsten (CP*, MP*: p < 0,05), sie stieg bei 1% FKS

auf 60 % Expressionsstärke im Vergleich zu Kontrollen an (CP*, MP*: p < 0,05), sank

jedoch bei 0,5 % FKS wieder auf 50 % Expressionsstärke im Vergleich zu Kontrollen

ab. (CP*, MP*: p < 0,05). Bei PRAS40 war kein Zusammenhang zwischen der

Phosphorylierung von PRAS40 und dem FKS-Gehalt erkennbar ( *: p < 0,05) (Abb.

15).

Abbildung (15) Verlauf der Ratio der relativen Expression von pPRAS40/PRAS40 als Intensität der Bandenstärke im Western Blot bei PTEC von MMA-und PA-Patienten unter Kultivierung in 20 %, 1 % und 0,5 % FKS supplementiertem DMEM nach 48 Stunden. Die Bandenintensität wurde auf Aktin als internen Standard normalisiert. (CM* < 0,05): Kontrollen – MMA-Patienten; (CP* < 0,05): Kontrollen – PA-Patienten; (MP* < 0,05): MMA-Patienten – PA-Patienten; ( *: p < 0,05): MMA-Patienten; ( *: p < 0,05): PA-Patienten. (MMA: n=5; PA: n=3).

Unter Bedingungen mit 0,5 % FKS war die Ratio der relativen Expression von

pmTOR/mTOR bei MMA-Patienten mit 300 % Expressionsstärke im Vergleich zu

Kontrollen am höchsten (CM*, MP*: p < 0,05), sie sank bei höheren

Supplementationen des Mediums mit 1 % FKS auf 110 % Expressionsstärke im

Vergleich zu Kontrollen ab (CM*, MP*: p < 0,05) und blieb bei 20 % FKS mit 105 %

Expressionsstärke auf der Höhe der Kontrollen. Somit zeigte mTOR bei niedrigem

FKS-Gehalt einen höheren Phosphorylierungsstatus, der auf eine stärkere

Assemblierung von mTORC1 hindeutete, mit steigender FKS-Konzentration sank

jedoch die Phosphorylierung von mTOR und damit verbunden die Assemblierung

von mTORC1 ( *: p < 0,05). Die Ratio der relativen Expression von pmTOR/mTOR

war unter Bedingungen mit 20 % FKS bei PA-Patienten mit 160 % Expressionsstärke

im Vergleich zu Kontrollen am höchsten, jedoch nicht signifikant unterschiedlich. Bei

1 % und 0,5 % FKS war sie auf der Höhe der Kontrollen (MP*: p < 0,05). Der

*** *** *

CM*

CP*

CM*

CP*

CM*

CP*

Phosphorylierungsstatus von mTOR, und die damit verbundene Assemblierung von

mTORC1, war bei PA-Patienten unabhängig vom FKS-Gehalt und nicht signifikant

unterschiedlich zu Kontrollen (Abb. 16).

Abbildung (16) Verlauf der Ratio der relativen Expression von pmTO/mTOR als Intensität der Bandenstärke im Western Blot bei PTEC von MMA- und PA-Patienten unter Kultivierung in 20 %, 1 % und 0,5 % FKS supplementiertem DMEM nach 48 Stunden. Die Bandenintensität wurde auf Aktin als internen Standard normalisiert. (CM* < 0,05): Kontrollen – MMA-Patienten; (CP* < 0,05): Kontrollen – PA-Patienten; (MP* < 0,05): MMA-Patienten – PA-Patienten; ( *: p < 0,05): MMA-Patienten; ( *: p < 0,05): PA-Patienten. (MMA: n=5; PA: n=3).

4.7.2 Reifung der Phagophore

Um zu überprüfen, ob mTORC1 tatsächlich zu einer Reifung der Phagophore und

damit verbundenen höheren Autophagie-Rate führt, wurde die Expression von zwei

Markerproteinen für die Reifung der Phagophore untersucht. Das microtubule light

chain protein 3 (LC3-II) und P62 binden an die reifende Phagophore und sind mit ihr

bis zur Degradierung in den Autolysosomen assoziiert.

**

CM*

MP*

CM*

MP*

Unter Bedingungen mit 0,5 % und 1 % FKS war die relative Expression von LC3-II

bei MMA-Patienten auf Höhe der Kontrollen, sie stieg bei 20 % FKS signifikant auf

150 % Expressionsstärke der Kontrollen an (CM*: p < 0,05). Somit zeigte die

Expression von LC3-II bei MMA-Patienten einen Zusammenhang mit dem FKS-

Gehalt und stieg bei hohen FKS-Werten an ( *: p < 0,05). Die erhöhte Expression

LC3-II bei hohem FKS-Gehalt deutete auf eine stärkere Reifung der Phagophore hin.

Die Expression von LC3-II war unter Bedingungen mit 20 % FKS bei PA-Patienten

mit 160 % Expressionsstärke im Vergleich zu Kontrollen am höchsten, jedoch nicht

signifikant unterschiedlich. Bei 1 % und 0,5 % FKS war sie auf der Höhe der

Kontrollen (MP*: p < 0,05). Der Phosphorylierungsstatus von mTOR und damit die

verbundene Assemblierung von mTORC1 war bei PA-Patienten unabhängig vom

FKS-Gehalt und nicht signifikant unterschiedlich zu Kontrollen (Abb. 17).

Abbildung (17) Relative Expression von LC3-II bei MMA- und PA-Patienten als Intensität der Bandenstärke im Western Blot unter Kultivierung in 20 %, 1 % und 0,5 % FKS supplementiertem DMEM nach 48 Stunden. Die Bandenintensität wurde auf Aktin als internen Standard normalisiert. (CM* < 0,05): Kontrollen – MMA-Patienten; (CP* < 0,05): Kontrollen – PA-Patienten; (MP* < 0,05): MMA-Patienten – PA-Patienten; ( *: p < 0,05): MMA-Patienten; ( *: p < 0,05): PA-Patienten. (MMA: n=5; PA: n=3).

*

CM*

Unter Bedingungen mit 0,5 % und 1 % FKS war die relative Expression von P62 bei

MMA-Patienten im Vergleich zu Kontrollen auf 60 % Expressionsstärke verringert

(CM*: p < 0,05), sie stieg bei 20 % FKS signifikant auf 200 % Expressionsstärke der

Kontrollen an (CM*: p < 0,05). Somit zeigte die Expression von P62 bei MMA-

Patienten einen Zusammenhang mit dem FKS-Gehalt und stieg bei hohen FKS-

Werten an ( *: p < 0,05). Die erhöhte Expression von P62 bei hohem FKS-Gehalt

deutete auf eine stärkere Reifung der Phagophore hin. Die Expression von P62 war

unter Bedingungen mit 20 % FKS bei PA-Patienten mit 180 % Expressionsstärke im

Vergleich zu Kontrollen am höchsten (CP*: p < 0,05), sie sank bei 1 % FKS auf 70 %

Expressionsstärke der Kontrollen ab (CP*: p < 0,05) und stieg bei 0,5 % FKS auf 120

% Expressionsstärke im Vergleich zu Kontrollen an (CP*: p < 0,05). Bei PA-Patienten

zeigte die Expression von P62 keinen Zusammenhang mit dem FKS-Gehalt da sie

bei der Änderung von 20 % auf 1 % FKS sank ( *: p < 0,05), bei 0,5 % FKS jedoch

wieder anstieg ( *: p < 0,05). Die erhöhte Expression von P62 bei hohem und sehr

niedrigem FKS-Gehalt deutete auf eine stärkere Reifung der Phagophore unter

diesen Bedingungen hin (Abb. 18).

Abbildung (18) Relative Expression von P62 bei MMA- und PA-Patienten als Intensität der Bandenstärke im Western Blot unter Kultivierung unter Kultivierung in 20 %, 1 % und 0,5 % FKS supplementiertem DMEM nach 48 Stunden. Die Bandenintensität wurde auf Aktin als internen Standard normalisiert. (CM* < 0,05): Kontrollen – MMA-Patienten; (CP* < 0,05): Kontrollen – PA-Patienten; (MP* < 0,05): MMA-Patienten – PA-Patienten; ( *: p < 0,05): MMA-Patienten; ( *: p < 0,05): PA-Patienten. (MMA: n=5; PA: n=3).

Die Analyse des Verlaufs der Expressionsstärken von LC3-II und P62 zeigte nur bei

MMA-Patienten erhöhte Werte mit steigendem FKS-Gehalt, bei PA-Patienten war

kein Zusammenhang zwischen der Expression und dem FKS-Gehalt erkennbar.

4.7.3 Lysosomaler Abbau des Autophagosoms

Aus der fertig gereiften Phagophore entstehen Autophagosome, die von Lysosomen

umschlossen und in den gebildeten Autolysosomen durch saure Hydrolyse

degradiert werden. Die Anzahl an Autolysosomen ist proportinal zur Höhe der

Autophagie. Die Ermittlung des Anteils an Autolysosomen und damit der

Autophagosome in Zellen von Kontrollen, MMA-Patienten und PA-Patienten erfolgte

mit dem Fluoreszenzfarbstoff Acridinorange. Dieser ändert in saurer Umgebung

** *

** *

*

CM*

CP*

CM*

CP*

CM*

CP*

durch einen pH-Umschlag sein Absorbtionsmaximum von orange zu grün. Je höher

die Konzentration an Autolysosomen ist, desto weiter verschiebt sich die Fluoreszenz

von orange (FL1) zu grün (FL3), so dass eine erhöhte Ratio von FL3/FL1 auf eine

erhöhte Autophagierate hinweist.

In FACS-Analysen zeigten PTEC von MMA-Patienten im Vergleich zu PTEC von

Kontrollen und PA-Patienten eine signifikant stärkere Verschiebung des

Absorptionsmaximums von FL1 zu FL3 um das 1,5 fache (p < 0,05; Abb. 19).

Abbildung (19) Ratio der Acridinorangefärbung von grüner zu orangener Emission (FL3/FL1) als relative Intensität (*p < 0,05). (Ctrl: n=4, PA: n=3, MMA: n=5). Die FACS-Analysen wurden von Frau Dr. Katrin Tagscherer aus der Abteilung „Molekulare Tumorpathologie“ des Deutschen Krebsforschungszentrums Heidelberg (DKFZ) durchgeführt.

Die höhere Ratio von FL3/FL1 ließ auf eine höhere Anzahl von Lysosomen und

Autophagosomen und damit verbundener Autophagie-Rate bei PTEC von MMA-

Patienten schließen.

*

4.8 Stress des endoplasmatischen Retikulums - unfolded protein response

Die Untersuchung der Antwort auf ER Stress in PTEC von MMA-Patienten erfolgte

durch Western Blot Analysen der Expression von phosphoryliertem IRE1 (pIRE1).

Unter Bedingungen mit 0,5 % und 1 % FKS war die relative Expression von pIRE1

bei MMA-Patienten auf Höhe der Kontrollen, sie stieg bei 20 % FKS signifikant auf

145 % Expressionsstärke der Kontrollen und PA-Patienten an (CM*, CP*: p < 0,05).

Die Expression von pIRE1 zeigte bei MMA-Patienten einen Zusammenhang mit dem

FKS-Gehalt und stieg bei hohen FKS-Werten an ( *: p < 0,05). Die erhöhte

Expression von pIRE1 bei hohem FKS-Gehalt deutete auf die Einleitung der UPR

und damit verbundenen stärkeren Stress des ER hin. Bei PA-Patienten war die

Expression von pIRE1 unter Bedingungen mit 20 %, 1 % und 0,5 % FKS auf Höhe

der Kontrollen und deutete auf keinen Zusammenhang mit dem FKS-Gehalt hin.

Somit fand sich kein Hinweis auf die Einleitung der UPR und damit assoziierten ER-

Stress (Abb. 20).

Abbildung (20) Relative Expression von pIRE1 als Intensität der Bandenstärke im Western Blot bei MMA-und PA-Patienten unter Kultivierung in 20 %, 1 % und 0,5 % FKS supplementiertem DMEM nach 48 Stunden. Die Bandenintensität wurde auf Aktin als internen Standard normalisiert. (CM* < 0,05): Kontrollen – MMA-Patienten; (CP* < 0,05): Kontrollen – PA-Patienten; (MP* < 0,05): MMA-Patienten – PA-Patienten; ( *: p < 0,05): MMA-Patienten; ( *: p < 0,05): PA-Patienten. (MMA: n=5; PA: n=3).

4.9 Inflammation

Bei einer Inflammation kommt es zu einer Infiltrierung des Gewebes mit aktivierten

Zellen des Immunsystems. Ihre Aktivierung erfolgt über die Wechselwirkung von

Signalmolekülen und Rezeptoren und kann das angeborene oder das erworbene

Immunsystem betreffen.

4.9.1 Expressionsvergleich löslicher Rezeptoren

Um an der Aktivierung des Immunsystems beteiligte Moleküle und Rezeptoren

einzugrenzen, die von PTEC exprimiert werden können, wurde ein screening mit

**

CM*

CP*

MP* MP*

einem Array durchgeführt, der verschiedene Rezeptoren auf Proteinbasis enthielt

(Soluble Receptor Array, R&D Systems).

Bei PTEC von MMA-Patienten wurde eine 3-4-fach erhöhte Expression von IL-8 im

Vergleich zum Mittelwert der Kontrollen festgestellt. Der Rezeptor IL-1RII (Interleukin-

1 Rezeptor Typ 2) war bei MMA-Patienten um den Faktor 5-8 höher exprimiert, der

Rezeptor IL-15R zeigte eine 1,5-fach erhöhte Expression. Das Adhäsionsprotein

VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule 1) war um das 12.000 – 25.000-fache

erhöht und sorgt für die Bindung von Monozyten an andere Zellen (Abb. 21). Die

Ergebnisse ließen sich aufgrund der kleinen Gruppen (n = 2) nicht statistisch

belegen.

Abbildung (21) Relative Expression potentiell an der Interaktion mit Immunzellen beteiligter Proteine von PTEC der Kontrollen und MMA-Patienten. Relative Expression von CXCL8/IL8: Interleukin-8; IL-1RII: Rezeptor für Interleukin 1 Subtyp 2; IL-15 Rα: alpha-Untereinheit des Interleukin-15 Rezeptors in % der Kontrolle (Ctrl: n=2, MMA: n=2).

4.9.2 Expressionsvergleich von Rezeptoren

Zur Ermittlung einer möglichen Involvierung des Komplementsystems in die

Pathogenese der cTIN wurden die Expressionen von vier Rezeptoren des CD-Typs

(cluster of differentiation) verglichen. Die untersuchten Rezeptoren CD46, CD55,

CD59 und CD88 binden verschiedene Faktoren des Komplementsystems und

unterdrücken die Ausbildung des MAC (membrane attacking complex), so dass die

Zellen nicht lysiert werden (Tabelle 3).

Tabelle (3) Funktionen der untersuchten Immunrezeptoren CD46, CD55, CD59 und CD88

Rezeptor Bindungspartner Funktion

CD46 C3b, C4b Inhibiert Zelllyse durch binden der

Komplementfaktoren

CD55 C5 Inhibiert Zelllyse durch Unterbrechung der

Kaskade

CD59 C8, C9 Inhibiert Zelllyse durch Unterbrechung der

Kaskade

CD88 C5a Rezeptor für C5a

Der Vergleich der CD-Proteine zeigte keinen Unterschied zwischen Zellen von

Kontrollen und MMA-Patienten. Eine erhöhte Expression an Rezeptoren, die PTEC

vor Zellen des angeborenen Immunsystems und des MAC schützen, konnte nicht

nachgewiesen werden (Abb. 22).

Abbildung (22) Expressionsvergleich der Immunrezeptoren CD46, CD55, CD59 und CD88 der PTEC von MMA-Patienten in Prozent der Kontrolle (Ctrl: n=5, MMA: n=5).

4.9.3 Qualitativer Nachweis exprimierter Zytokine im Zellmedium

Um zu überprüfen, ob PTEC von MMA-Patienten neben IL-8 noch andere Zytokine

exprimieren und sezernieren, wurde ein ELISA für verschiedene Zytokine

durchgeführt. Zur qualitativen Analyse der Zytokinsekretion wurde das Medium der

Zellen auf TNF-ß, CCL2, CCL3, CCL5 und IL-8 überprüft. Die Zellen wurden dafür

auf TransWell-Filterplatten ausplattiert, nach Konfluenz wurde das Medium auf

Zytokine untersucht. Die Wachstumsseite der Zellen entsprach dabei der

basolateralen Seite, welche im Körper dem Interstitium zugewandt ist, wohingegen

die apikale Seite zum Lumen des proximalen Tubulus weist. Da die Sekretion zur

Aktivierung von Immunzellen vorwiegend ins Interstitium erfolgt und weniger über die

Harnseite, wurde das Medium der basolateralen Zellseite verwendet.

Zellen der MMA-Patienten zeigten gegenüber PTEC von Kontrollen und PA-

Patienten eine tendenziell erhöhte Expression von IL-8, die jedoch nicht signifikant

war (p < 0,05; Abb. 23). Die Expressionen von TNF-ß, CCL2, CCL3, CCL5 waren bei

allen Zellen unter der Nachweisgrenze der Herstellerangaben und sind nicht

aufgeführt.

Abbildung (23) Relative Konzentration von IL-8 im Medium der PTEC von Kontrollen, MMA- und PA-Patienten in Prozent der Kontrolle (Ctrl: n=3, PA: n=3, MMA: n=6).

4.9.4 Quantitativer Nachweis von Interleukin-8 intrazellulär und im Zellmedium

Zellen von MMA-Patienten sezernierten im Mittel mit etwa 2740 pg/mg signifikant fast

doppelt so viel IL-8 ins apikale Medium wie Zellen von Kontrollen und die signifikant

1,5-fache Menge wie PA-Patienten, die etwa 1520 bzw. 1850 pg/mg sezernierten. Im

basolateralen Medium konnten mit 4060 pg/mg bei Zellen von MMA-Patienten die

1,5-fache Menge bzw. die signifikant fast doppelte Menge an IL-8 nachgewiesen

werden wie bei Kontrollen und PA-Patienten, welche im Mittel 2760 bzw. 2100 pg/mg

IL-8 sezernierten. In den Zellen war die Konzentration mit 1200 pg/mg im Mittel bei

MMA-Patienten signifikant dreifach bzw. 1,5-fach höher als bei Kontrollen und PA-

Patienten, welche 460 bzw. 830 pg/mg IL-8 intrazellulär aufwiesen (p < 0,05; Abb.

24).

Abbildung (24) Konzentration von Interleukin-8 in apikalem und basolateralem Medium der PTEC von Kontrollen, MMA- und PA-Patienten, sowie intrazellulär in pg/mg (*p < 0,05). (Ctrl: n=3, PA: n=3, MMA: n=6).

Das erhöhte Expressionslevel und die Sezernierung von IL-8 bei PTEC von MMA-

Patienten deuten auf eine Rekrutierung des Immunsystems hin. Dies deckt sich auch

mit der Entwicklung und dem Auftreten einer cTIN bei MMA-Patienten, welche durch

Invasion von Makrophagen gekennzeichnet ist.

* * *

*

4.10 Korrelationen der Expression von IL8, Generierung von ROS, erhöhter Autophagie und verringerter Aktivität der Cytochrom c-Oxidase

Zur Überprüfung eines direkten Zusammenhangs zwischen erhöhter IL8-Expression,

ROS und Autophagie bei PTEC von MMA-Patienten, wurde eine Korrelationsanalyse

durchgeführt. Als Variablen wurden „Erhöhte Autophagie“ (Ratio der Acridinorange-

Färbung), „Generierung von ROS“ (Färbung mit H2DCFDA), „Expression von IL8“ “

(IL-8 als Signalmolekül und Sezernierung zur basolateralen Zellseite) und

„verringerte Aktivität der Cytochrom c-Oxidase“ (Defekte Integrität der Mitochondrien)

verwendet.

Das Bestimmtheitsmaß R2 diente als Messgröße zur Einordnung der Hypothese, ob

die verwendeten Variablen in einem linearen Zusammenhang stehen. Die Werte für

R2 liegen zwischen 0 und 1, wobei der Zusammenhang größer wird, je näher er dem

Wert 1 kommt. Die Einordnung der Stärke der Korrelation erfolgt in schwacher,

mittlerer, starker und sehr starker Zusammenhang (Tabelle 4).

Tabelle (4) Schwellenwerte für die Stärke des Zusammenhangs zwischen 2 Variablen

Zusammenhang Korrelationseffizient R Bestimmtheitsmaß R2

Sehr stark 0,87 - 1 0,75 - 1

Stark 0,71 – 0,86 0,5 – 0,74

Mittel 0,5 – 0,7 0,25 – 0,49

Schwach 0 – 0,49 0 – 0,24

Die Korrelationsanalyse der Variablen „Generierung von ROS“, „Erhöhte

Autophagie“, „verringerte Aktivität der Cytochrom c-Oxidase“ und „Expression von

IL8“ bei PTEC von MMA-Patienten zeigte zwischen Autophagie und ROS, Aktivität

von Komplex IV der Atmungskette und IL8-Expression, sowie Aktivität von

Cytochrom c-Oxidase der Atmungskette und ROS nur einen schwachen

Zusammenhang. Die Korrelation von ROS und IL8-Expression, sowie der Aktivität

von Cytochrom c-Oxidase der Atmungskette und IL8-Expression einen mittelstarken

Zusammenhang. Ein starker Zusammenhang konnte zwischen Autophagie und

Expression von IL-8 festgestellt werden (Tabelle 5).

Tabelle (5) Bestimmtheitsmaß und Zusammenhang der Korrelationsvariablen

Korrelations-Variablen Zusammenhang Bestimmtheitsmaß R2

ROS und Expression von IL-8 Mittel 0,465458

Autophagie und ROS Schwach 0,216896

Autophagie und Expression von

IL-8

Sehr stark 0,80946

Aktivität Cytochrom c-Oxidase

und Autophagie

Schwach 0,0568924

Aktivität Cytochrom c-Oxidase

und Expression von IL-8

Mittel 0,285974

Aktivität Komplex IV und ROS Schwach 0,049656

Die Korrelationsanalyse macht einen Zusammenhang zwischen dem Auftreten von

erhöhter Autophagie und verstärkter Expression von IL-8 sehr wahrscheinlich. Da im

Experiment keine Interleukine oder anderen Botenstoffe eingesetzt wurden, kann

erhöhte Autophagie als mögliche Ursache für erhöhte Expression von IL-8 bei PTEC

von MMA-Patienten postuliert werden.

5 Diskussion

5.1 Auswahl des verwendeten Zellkulturmodells

Als Modell zur Untersuchung der Entstehung der chronischen tubulointerstitiellen

Nephritis diente ein Zellkultursystem aus immortalisierten humanen PTEC.

Der Vorteil des verwendeten Zellkulturmodells gegenüber bisher beschriebenen

Tiermodellen war der Gebrauch von humanen Zellen, da sich mit ihnen besser die

Charakteristiken und Ursachen der Erkrankung beim Menschen analysieren lassen,

als mit murinen Zellen oder Zellen anderer Organismen. Bei der Entwicklung einer

cTIN im Verlauf der MMA sind die PTEC der Patienten bereits in der Anfangsphase

von Schädigungen betroffen. Ihre Verwendung kann auf die Ursachen schließen

lassen, welche für die Entwicklung der Nephritis verantwortlich sind.

Nachteile des verwendeten Zellkulturmodells gegenüber Tiermodellen war die

Beschränkung der Ursachenanalyse der cTIN auf einen Zelltyp des betroffenen

Organs, da für die durchgeführten Experimente nur PTEC verwendet wurden.

Potenzielle Einflüsse durch die natürliche Umgebung der proximalen Tubuluszellen

der Niere und Wechselwirkungen mit anderen Zellen werden durch das verwendete

Modell folglich nicht erfasst. Tiermodelle lassen eine systemische Betrachtung der

Ursachen und der Pathologie zu, wodurch sich eine Beteiligung des Immunsystems

oder anderer Gewebetypen an der MMA noch umfassender analysieren lassen.

Die PTEC wurden aus dem Urin isoliert, somit war die Art der Zellgewinnung nicht

invasiv, für alle Probanden risikofrei und mit keinen unerwünschten Wirkungen

verbunden. Das Epithel erneuert sich ständig, PTEC werden mit dem Urin

ausgeschieden. Somit stehen theoretisch immer wieder neue primäre PTEC zur

Verfügung. Jedoch lässt sich aus organisatorischen Gründen nicht zu beliebigen

Zeitpunkten Patienten- und Probandenurin gewinnen. Die Limitierung in der Anzahl

der Zellen lag darüber hinaus ganz wesentlich im begrenzten Wachstum der

primären PTEC, welches sich auf höchstens 3-5 Passagen beschränkte.

Um diese Limitierung zu umgehen, wurden die PTEC mit dem Vektor pRNS1

transfiziert. Dieser enthält alle Teile des SV40-Genoms, die ori-Region besitzt jedoch

eine Deletion von 6 Nukleotiden um eine Selbstreplikation zu unterbinden (Small et

al., 1982; Litzkas et al., 1984). Dadurch erfolgte die Generierung sich fortwährend

teilenden Zelllinien, die sich bis über Passage 20 hinaus kultivieren ließen. Alle

Experimente wurden jedoch nur mit Zellen der Passagen 5 bis 10 durchgeführt, da

höher passagierte und damit ältere Zellen zu Veränderungen der Charakteristika, wie

z.B. DNS-Mutationen, neigen können (Hughes et al., 2007).

5.2 Charakterisierung des verwendeten Zellkulturmodells

Nach der Transfektion mit dem Vektor pRNS1 (Small et al., 1982; Litzkas et al.,

1984) wurden alle Zelllinien nach Passage 5 in Bezug auf 1) die typische

Morphologie von PTEC, 2) die Expression von Markerproteinen wie Aquaporin 1 und

γ-Glutamyltransferase 1, sowie 3) die Ausbildung von Mikrovilli und 4) tight junctions

hin untersucht.

Alle generierten Zelllinien von Patienten und Kontrollen wuchsen als

Einzelzellschicht. In elektronenmikroskopischen Aufnahmen waren die für

Epithelzellen des proximalen Tubulus charakteristischen Mikrovilli erkennbar, welche

nur an der apikalen Zelloberfläche ausgebildet werden und die Membranoberfläche

vergrößern.

Weiterhin wurden mit AQP1 und γGT1 Markerproteine nachgewiesen, die

charakteristisch für das Epithel des proximalen Tubulus sind und im Urogenitaltrakt

nur in diesen Zellen vorkommen. Das Transmembranprotein AQP1 wird in der Niere

nur in PTEC der Segmente S1-S3 des proximalen Tubulus an der apikalen

Membranseite der Mikrovilli exprimiert. Es ist an der Resorption von Wasser aus dem

Primärharn beteiligt, um es dem Körper wieder zurück zu führen (Sabolic et al., 1992;

Kim et al., 1999; Baer et al., 2006; Wilmers et al., 2010). Die γGT1 wird ebenfalls nur

im proximalen Tubulusepithel exprimiert (Helbert et al., 1997). Sie dient der

Übertragung des Glutamylrests des Tripeptids Glutathion auf Peptide, wodurch der

Abbau von GSH erfolgt. Da es keinen Transporter für Glutathion gibt, ist dies eine

Möglichkeit Cystein in die Zelle zu transportieren, wo es für den Glutathionaufbau

verwendet wird. Alle Zelllinien zeigten im Western Blot die für PTEC charakteristische

Expression von AQP1 und γGT1.

Die erhöhte MMS-Konzentration bei MMA-Patienten wurde auf zwei

unterschiedlichen Wegen nachgewiesen: 1) Im Plasma der MMA-Patienten lag die

MMS-Konzentration im untersuchten Zeitraum von einem Jahr vor und einem Jahr

nach Zellisolierung über dem Normalwert. Die Festlegung des Normalwerts erfolgte

über Literaturangaben, da kein Plasma der Kontrollen zur Verfügung stand. 2) Im

Medium der kultivierten PTEC von Patienten war die MMS-Konzentration mehr als

doppelt so hoch wie in kultivierten PTEC von Kontrollen. Beides belegte den

funktionellen Defekt der MMA-Patienten bzw. ihrer kultivierten PTEC, MMS in

Succinat umzuwandeln.

5.3 PTEC von MMA-Patienten zeigen Defekte im Energiemetabolismus

Bei der Pathogenese von MMA- und PA-Patienten spielt ein Defekt in der

Energiehomöostase nach bisherigen Erkenntnissen eine große Rolle. Eine

verringerte Leistung der am Energiemetabolismus beteiligten Enzyme kann eine

Ursache für Schädigungen der Zelle bis hin zum ihrem Untergang sein. Dabei ist

MMS nicht direkt verantwortlich, vielmehr führen die intrazellulär aus MMS gebildeten

Metabolite Malonsäure, Methyl-Zitrat und Propionyl-CoA zu Aktivitätseinbußen

einiger am Energiemetabolismus beteiligten Enzyme. Malonsäure führt in murinen

Neuronen des Striatums zu einer Inhibition von Komplex II der Atmungskette, Methyl-

Zitrat führt zur Inhibition der Zitrat-Synthase, Aconitase und Isozitrat-Dehydrogenase,

was einen verminderten Flux des Zitrat-Zyklus zur Folge hat (Okun et al., 2002;

Kölker et al., 2003), Propionyl-CoA hemmt die Aktivität von isoliertem PDHc (Schwab

et al., 2006; Morath et al., 2008). In der vorliegenden Arbeit konnten ebenfalls

verringerte Aktivitäten in einigen Enzymen des Energiemetabolismus gezeigt

werden. Der Vergleich des Energiemetabolismus auf den Ebenen der Glykolyse, des

Zitrat-Zyklus und der Atmungskette zeigte in allen Bereichen Veränderungen und

Beeinträchtigungen der Energieversorgung bei PTEC von MMA-Patienten, zudem

war der mitochondriale Sauerstoffverbrauch beeinträchtigt.

Auf Ebene der oxidativen Phosphorylierung war bei MMA-Patienten die Aktivität der

Cytochrom c-Oxidase verringert. Bei PTEC von MMA-Patienten war eine Präparation

von Fraktionen mit angereicherten intakten Mitochondrien durch differentielle

Zentrifugation nach Zelllyse nicht erfolgreich, da sich die Mitochondrien nicht

sedimentieren ließen. Bei PTEC von Kontrollen und PA-Patienten traten diese

Probleme nicht auf. Die in elektronenmikroskopischen Aufnahmen gefundenen

morphologischen Auffälligkeiten der PTEC von MMA-Patienten könnten zu fehlender

Integrität der Mitochondrien führen und für ihre Zerstörung bei Belastung durch

Zentrifugalkräfte verantwortlich sein. Die fehlende Integrität lässt in Verbindung mit

der verringerten Aktivität der Cytochrom c-Oxidase auf einen mitochondrialen Defekt

schließen, der die Funktion der Mitochondrien beeinträchtigt.

Beides wurde bereits in der Literatur bei der Präparation von Mitochondrien aus

Nieren von MCM-defizienten Knock out-Mäusen beschrieben. Chandler und Kollegen

konnten ebenfalls keine intakten und funktionellen Mitochondrien aus Mäusenieren

isolieren. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten ebenfalls morphologische

Auffälligkeiten, die sich jedoch unterschiedlich zur vorliegenden Arbeit äußerten.

Während bei humanen PTEC der vorliegenden Arbeit Strukturen erkennbar waren,

die auf Autophagie schließen lassen, war in den Zellen der Mäusenieren die

Auflösung der mitochondrialen Cristae-Struktur erkennbar. Diese wurde als Ursache

für das Präparationsproblem der Mitochondrien diskutiert. Die Bestimmung der

enzymatischen Aktivität der Atmungskettenkomplexe zeigte im Einklang mit der

vorliegenden Arbeit die verringerte Aktivität der Cytochrom c-Oxidase (Chandler et

al., 2009).

In Nierenzellen aus Gewebepunktionen eines MMA-Patienten konnten

Beeinträchtigungen der Atmungskettenkomplexe I – V gezeigt werden (de Keyzer et

al., 2009). In einer kürzlich erschienenen Arbeit wurde im Einklang mit den

Ergebnissen der vorliegenden Arbeit bei einem mut0-Patienten ebenfalls eine

Verringerung der Aktivität der Cytochrom c-Oxidase in Nierenzellen publiziert

(Zsengellér et al., 2014).

Es lässt sich postulieren, dass die MMA einen mitochondrialen Defekt verursacht, der

sich in einer verringerten Enzymaktivität der Cytochrom c-Oxidase manifestiert.

Auf Ebene der Glykolyse zeigten PTEC von MMA-Patienten eine stark verringerte

Enzymaktivität der Phosphofruktokinase 1 (PFK1), sowie eine Erhöhung der

Enzymaktivität der Triosephosphat-Isomerase (TPI) und der Glyceraldehydphosphat-

Dehydrogenase (GAPDH).

Der größte Unterschied zeigte sich im Abfall der Enzymaktivität der PFK1, die 45 %

der Aktivität der Kontrollen hatte. Sie katalysiert die Übertragung eines Phosphatrests

von ATP auf Fruktose-6-Phosphat, was zu Fruktose-1,6-bisphosphat und ADP führt.

Diese Reaktion stellt den geschwindigkeitsbestimmenden Schritt der Glykolyse dar,

und eine Verlangsamung wirkt sich stark auf die Gesamtrate der Glykolyse aus

(Yalcin et al., 2009b; Jenkins et al., 2011).

Die PFK1 ist ein Teil eines bifunktionellen Enzyms und katalysiert die Reaktion von

Fruktose-6-Phosphat und ATP zu Fruktose-1,6-bisphosphat und ADP. Die reverse

Reaktion zu Fruktose-6-Phosphat und anorganischem Phosphor wird durch die

Fruktose-1,6-Bisphosphatase (F1,6BPase) katalysiert, die den anderen Teil des

bifunktionellen Enzyms darstellt. Der wichtigste Regulator dieses bifunktionellen

Enzyms ist das auf die PFK1 stimulierend wirkende Fruktose-2,6-bisphosphat. Die

PFK1 ist nur dann aktiv, wenn Fruktose-2,6-bisphosphat in ausreichender Menge zur

Verfügung steht, es hemmt die Aktivität der F1,6BPase (Hers und van Schaftingen,

1982; Voet and Voet, 1995).

Die Reaktion von Fruktose-6-Phosphat und ATP zu Fruktose-2,6-bisphosphat wird

durch die PFK2 katalysiert, die einen Teil eines weiteren bifunktionellen Enzyms, der

PFKFB bildet. Die reverse Reaktion von Fruktose-2,6-bisphosphat zu Fruktose-6-

Phosphat und anorganischem Phosphor wird durch die F2,6BPase katalysiert, die

den anderen Teil der PFKFB bildet. Wird die PFKFB phosphoryliert, ist die

F2,6BPase aktiviert und die Konzentration von Fruktose-2,6-bisphosphat sinkt durch

ihre Umsetzung zu Fruktose-6-Phosphat und anorganischem Phosphor. Bei

Dephosphorylierung ist die PFK2 aktiv und die Konzentration an Fruktose-2,6-

bisphosphat steigt (Kurland und Pilkis, 1995; Rider et al., 2004). Der Energiemangel

bei PTEC von MMA-Patienten könnte zur Bildung von cAMP und daraus

resultierender Aktivierung der Proteinkinase A führen. Diese kann die PFKFB

phosphorylieren und damit die F2,6BPase aktivieren. Dadurch sinkt die

Konzentration von Fruktose-2,6-bisphosphat, die Enzymaktivität der F1,6BPase

würde steigen und die Aktivität der PFK1 sinken.

Die geringere Aktivität der PFK1 bei PTEC von MMA-Patienten könnte weiterhin zu

höheren Konzentrationen von Fruktose-6-Phosphat, das durch die F1,6BPase

gebildet wird, führen. Fruktose-6-Phosphat könnte in Glukose-6-Phosphat

umgewandelt werden und in den Pentosephosphatweg einfließen. Dort wird durch

die Oxidaton von Glukose-6-Phosphat und NADP+ Ribose-5-Phosphat und NADPH

gebildet. Der Pentosephosphatweg liefert weiterhin Derivate, die als Grundgerüst für

DNS, RNS, sowie ATP, NADH und Coenzym A dienen. Das Reduktionsäquivalent

NADPH wird von der Glutathionreduktase als Cofaktor benötigt, um Glutathiondisulfid

zu Glutathion zu reduzieren. Reduziertes Glutathion dient der Zelle dazu, ROS zu

binden, wodurch wiederum Glutathiondisulfid entsteht. Dieses muss erneut zu

Glutathion reduziert werden, um weitere ROS zu binden (Patra & Hay, 2014). Die

verringerte Aktivität der PFK1 bei MMA-Patienten könnte die Hypothese stützen,

dass Glukose-6-Phosphat vermehrt dem Pentosephosphatweg als Substrat zur

Verfügung gestellt wird, um mehr Reduktionsäquivalente wie NADPH zu bilden.

Dadurch könnte Glutathiondisulfid schneller zu Glutathion reduziert werden, um ROS

schneller und effektiver zu binden.

Durch die verringerte Aktivität der PFK1 in PTEC von MMA-Patienten und die damit

verbundene Verlangsamung der Glykolyse ließe sich der geringere mitochondriale

Sauerstoffverbrauch in mit Glukose supplementiertem KRB erklären. Durch eine

Verlangsamung der Glykolyse wird weniger Acetyl-CoA in den Zitrat-Zyklus

eingebracht. Dies führt dazu, dass auch weniger Substrate für die oxidative

Phosphorylierung zur Verfügung stehen.

Im Vergleich der enzymatischen Aktivität des Zitrat-Zyklus waren bei PTEC von

MMA-Patienten die Aktivitäten der mitochondrialen Aconitase und des 2-Oxoglutarat-

Dehydrogenase-komplex (OGDHc) verringert. Die Aconitase katalysiert die

Umlagerung von Zitrat über cis-Aconitat zu Isozitrat. Ihr katalytische Zentrum enthält

ein Eisen-Schwefel-Cluster und reagiert empfindlich auf die Gegenwart von ROS, die

das Eisenatom oxidieren (Chinopoulos et al., 1999; Nulton-Persson und Szweda,

2001; Tretter und Adam-Vizi, 2005; Lushchak et al., 2014). Die Inhibition der

Aconitase durch ROS wirkt neurotoxisch (Cantu et al., 2009), zudem kann das

Enzym selbst ROS in Form von Wasserstoffperoxid (H2O2) und Superoxidradikal

generieren (Vasquez-Vivar et al., 2000).

Der OGDHc wandelt mit Hilfe von Coenzym A 2-Oxoglutarat unter oxidativer

Decarboxylierung zu Succinyl-CoA um und reduziert NAD+ zu NADH. Er ist ein

geschwindigkeitsbestimmendes Schlüsselenzym des Zitrat-Zyklus (Sauer et al.,

2005) und kann ebenfalls an der Produktion von ROS mitwirken oder als Ziel von

ROS in Erscheinung treten. ROS führen zur Oxidation des Eisen-Schwefel-Clusters

im katalytischen Zentrum und zur Verringerung der Enzymaktivtät (Starkov et al.,

2004; Tretter & Adam-Vizi, 2005).

Der mit Mikro-Respirometrie ermittelte Sauerstoffverbrauch ist spezifisch für

Mitochondrien, ermittelt wurde der Verbrauch pro Zeit. Durch Zugabe von

Kaliumzyanid konnte die Cytochrom c-Oxidase inhibiert werden und der

mitochondriale Sauerstoffverbrauch kam zum Erliegen. Durch Subtraktion des

verbliebenen Sauerstoffverbrauchs vom gesamten Sauerstoffverbrauch ließ sich der

mitochondriale Sauerstoffverbrauch ermitteln. Dieser war in Abhängigkeit des

Energieträgers sowohl bei PTEC von MMA- als auch von PA-Patienten verringert.

Die Supplementation von KRB mit Glukose stimulierte die Glykolyse im Zytosol, die

über die Atmungskette an den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch gekoppelt war,

die Supplementation mit Pyruvat stimulierte den Zitrat-Zyklus in den Mitochondrien,

der ebenfalls über die Atmungskette an den mitochondrialen Sauerstoffverbrauch

gekoppelt war. In DMEM konnten die Zellen neben Glukose zusätzlich auch auf

Aminosäuren zur Energiegewinnung zurückgreifen.

Der mitochondriale Sauerstoffverbrauch von MMA-Patienten war bei Stimulation der

Glykolyse, des Zitrat-Zyklus und in DMEM reduziert. Bei PA-Patienten trat unter

Stimulierung der Glykolyse und in DMEM ebenfalls ein verminderter

Sauerstoffverbrauch auf, jedoch nicht bei der Stimulation des Zitrat-Zyklus. Dies

könnte auf einen wichtigen Unterschied im Pathomechanismus beider Erkrankungen

hinweisen und die Hypothese stützen, dass ein mitochondrialer Defekt bei MMA-

Patienten vorliegt.

5.4 PTEC von MMA-Patienten haben eine erhöhte ROS-Produktion

Die Defekte der Cytochrom c-Oxidase, der mitochondrialen Aconitase und des

OGDHc bei PTEC von MMA-Patienten könnten auf einer erhöhten ROS-Bildung

beruhen. Eine vermehrte ROS-Produktion führt zu einer Oxidation von Proteinen,

Lipiden und anderen Makromoleküle, wodurch diese ihre ursprüngliche Funktion

verlieren (Kowaltowski et al., 1999). Präparierte Zellen aus den Nieren von MCM

Knock-out Mäusen zeigten ebenfalls erhöhte ROS-Werte (Chandler et al., 2009).

Bei den PTEC der MMA-Patienten wurden Hinweise auf ROS auf zwei Ebenen

gefunden. Zum einen lag der oxidative Stressmarker Glutathion vermehrt in oxidierter

Form als Glutathiondisulfid vor, zum anderen war die ROS-Produktion erhöht, was

durch Oxidation einer reduzierten Form von Fluorescein gezeigt werden konnte, die

als Indikator für ROS diente.

Der Nachweis der ROS-Konzentration über die Bestimmung des Gehalts an

Glutathion und Glutathiondisulfid zeigte bei PTEC von MMA-Patienten verringertes

reduziertes Glutathion (GSH) und erhöhtes Glutathiondisulfid (GSSG), die

Gesamtmenge an zellulärem Glutathion war unverändert. Diese Veränderungen sind

bekannte gegenregulatorische Maßnahmen bei erhöhtem oxidativen Stress.

Glutathion dient der Zelle neben anderen Antioxidantien wie Vitaminen (z.B.

Ascorbinsäure) oder bestimmten Enzymen der Neutralisation von ROS. Sie sind in

der Lage, freie Elektronen aufzunehmen, so dass die Oxidation der für die Zelle

wichtigen Moleküle reduziert wird. Glutathiondisulfid muss jedoch immer wieder zu

Glutathion reduziert werden, da nur die reduzierte Form ROS binden kann. Dies

stützt die Hypothese, dass die PTEC von MMA-Patienten über die Stimulation des

Pentose-Phosphatwegs vermehrt NADPH bilden, um die Reduktion von Glutathion

aus Glutathiondisulfid zu beschleunigen. In Leberextrakten von Mut-defizienten

Mäusen war der Gehalt an reduziertem Glutathion ebenfalls geringer, im Gegensatz

zu den PTEC der MMA-Patienten in der vorliegenden Arbeit war der Gehalt an

Glutathion der Mäuse jedoch insgesamt erniedrigt (Treacy et al., 1996). Reaktives

Acryloyl-CoA, welches aus Propionyl-CoA entsteht, kann ebenfalls die Ursache für

ROS sein (Ando et al., 1972). Dies konnte in der vorliegenden Arbeit jedoch nicht

bestätigt werden, da PTEC von PA-Patienten durch den Defekt der Propionyl-CoA-

Decarboxylase ebenfalls erhöhte Werte an Propionyl-CoA aufweisen. Sie zeigten in

der vorliegenden Arbeit jedoch keine erhöhte ROS-Bildung gegenüber Kontrollen.

Der Nachweis der ROS-Produktion erfolgte durch das zellpermeable H2DCFDA

(2',7'-Dichloro-dihydrofluoresceindiacetat), dessen Diazetat-Rest intrazellulär von

Esterasen abgespalten wird und DCF•- entsteht, das nach Reaktion mit ROS

fluoresziert (Kalyanaraman et al., 2012).

Auf Ebene der ROS-Produktion wurden bei PTEC von MMA-Patienten bereits in KRB

ohne Supplementation mit potentiellen Stimulanzen der ROS-Bildung erhöhte Werte

festgestellt. Durch Supplementation mit Glutamin, PS, MMS und Isoleucin wurde die

ROS-Produktion noch zusätzlich gesteigert. Dies lässt darauf schließen, dass die

genannten Supplemente zu metabolischem Stress bei PTEC von MMA-Patienten

führten, der sich in einer erhöhten ROS-Produktion äußerte. Die Supplementation mit

Glukose bzw. Pyruvat führte zur höchsten gemessenen ROS-Produktion. Bei PTEC

von MMA-Patienten war weiterhin bei beiden Supplementen die Verwertung als

Energieträger aufgrund verringerter Enzymaktivitäten von PFK1, Aconitase und

OGDHc eingeschränkt, was sich im reduzierten mitochondrialen Sauerstoffverbrauch

äußerte (unter 5.3 beschrieben). Es lässt sich postulieren, dass die erhöhte ROS-

Produktion in PTEC von MMA-Patienten zu Defekten im Energiemetabolismus

beitragen und an der Inhibierung der mitochondrialen Aconitase, des OGDHc und

der Cytochrom c-Oxidase beteiligt sind.

Die häufigste Quelle für ROS-Bildung bei Säugetieren sind die Enzymkomplexe

NADH-Dehydrogenase (Komplex I) und Cytochrom c-Reduktase (Komplex III) der

mitochondrialen Atmungskette. Die erhöhte ROS-Bildung führt zur reduzierten

Aktivität der Cytochrom c-Oxidase (Komplex IV), was wiederum zu stärkerer

Reduktion der Redox-Zentren der NADH-Dehydrogenase und der Cytochrom c-

Reduktase führen kann. Dadurch kann die ROS-Produktion dieser Komplexe weiter

ansteigen (Dawson et al., 1993; Chen et al., 2003). Bei der ROS-Bildung an der

Atmungskette entsteht zunächst das Superoxid-Anion (O2•-) wenn molekularer

Sauerstoff ein Elektron aufnimmt. Bei der NADH-Dehydrogenase ist eines der Eisen-

Schwefel-Cluster N-1 oder N-2 die Hauptursache der Bildung von Superoxid-Anionen

(Genova et al., 2001; Kushnareva et al., 2002). Als Quelle von Superoxid-Anionen

der Cytochrom c-Reduktase konnte die Autoxidation von Ubisemiquinon an der

inneren und äußeren Seite der inneren Mitochondrienmembran identifiziert werden

(Boveris et al., 1976; Cadenas et al., 1977; Turrens et al., 1985; Han et al., 2001).

Superoxid ist nicht sehr reaktiv, bildet jedoch den Vorläufer mehrerer verschiedener

anderer Sauerstoff- und Stickstoffradikale. Es kann Cytochrom c im

Intermembranraum reduzieren oder durch Aufnahme von Protonen zu

Wasserstoffperoxid (H2O2) und molekularem Sauerstoff umgesetzt werden, sowie in

der Matrix und im Intermembranraum akkumulieren. Wasserstoffperoxid kann durch

unvollständige Übertragung der Elektronen von molekularem Sauerstoff auf Wasser

entstehen, die an der Atmungskette durch die Cytochrom c-Oxidase katalysiert wird.

Vermehrt auftretende reduzierte Metallionen wie Fe2+ oder Cu2+ begünstigen die

Umwandlung von dauerhaft erhöhten Konzentrationen des Superoxid-Anions zum

Hydroxyl-Radikal (OH•). Dieses kann wiederum durch Reaktion mit Stickstoffoxiden

zur Bildung von Peroxinitrit (ONOO-/ONOOH) führen (Beckman & Koppenol, 1996;

Radi et al., 2002). Hydroxyl-Radikale und Peroxynitrit sind starke Oxidationsmittel

und reagieren mit Nukleinsäuren und Proteinen, was deren Strukturzerstörung und

die Inhibition ihrer Funktionen zur Folge hat (Turrens, 2003).

Das aus H2DCFDA entstandene DCF•- bindet radikalisches Stickstoffdioxid (•NO2),

Hydroxyl-Radikale und Peroxinitrit, die im Verlauf der Reaktionen des Superoxid-

Anions mit Wasserstoffperoxid und Stickstoffoxiden entstehen, Wasserstoffperoxid

kann nicht gemessen werden, da es nicht mit DCF•- reagiert (Kalyanaraman et al.,

2012).

Den negativen Auswirkungen von ROS für die einzelne Zelle können auch positive

Auswirkungen für den Gesamtorganismus gegenüberstehen. ROS können eine

second-messenger Funktion übernehmen und die Aktivierung der Zytokinexpression

einleiten (Rada et al., 2011). Dies führt zur Aktivierung und Rekrutierung des

Immunsystems zum Ursprung der Inflammation (D'Autréaux & Toledano, 2007). Da

jedoch nur in Zellkultur gewachsene PTEC verwendet wurden, konnte die Wirkung

der Sezernierung von Zytokinen (IL-8) auf andere Gewebe nicht untersucht werden.

Somit erfolgte nur eine Abbildung des Zusammenhangs zwischen ROS-Bildung und

Zytokinsezernierung.

Weiterhin können unter Hungerbedingungen, und damit verbundenem

Nährstoffmangel, mitochondrial generierte ROS Einfluss auf autophagozytotische

Prozesse ausüben, indem sie die Bildung von Autophagosomen stimulieren (Scherz-

Shouval et al., 2007). Durch die Defekte im Energiemetabolismus in PTEC von MMA-

Patienten könnten Bedingungen auftreten, wie sie bei Energiemangel vorliegen und

die Bildung und Degradierung von Autophagosomen fördern.

Mitochondrien können an der Entstehung der Membranen von Autophagosomen

beteiligt sein (Hailey et al., 2010). Das erhöhte Vorkommen der Autophagosomen bei

PTEC von MMA-Patienten könnte zu einer Destabilisierung der Mitochondrien

beitragen und eine Ursache für ihre fehlende Integrität sein, die das Isolieren

mitochondrial angereicherter Fraktionen verhinderte (unter 5.3 beschrieben).

5.5 PTEC von MMA-Patienten zeigen erhöhte Makro-Autophagie

Auf elektronenmikroskopischen Aufnahmen waren bei PTEC der MMA-Patienten von

einer Doppelmembran umgebene Strukturen erkennbar, die am ehesten

Autophagosomen entsprechen. Da mTORC1, einer der Regulatoren der Makro-

Autophagie, sensibel auf den Energiestatus der Zelle reagiert und bei PTEC von

MMA-Patienten Defekte im Energiemetabolismus auf den Ebenen der Glykolyse, des

Zitrat-Zyklus und der mitochondrialen Atmungskette nachgewiesen werden konnten,

wurden die Zellen in Hinblick auf die Reifung der Phagophore und die Degradierung

der Autophagosome gezielt untersucht. Der Ablauf der Makroautophagie lässt sich in

die Schritte 1) Initiation und Nukleation, 2) Elongation, 3) Autophagosom-

Bildung/Maturation, 4) Fusion mit Lysosom, 5) Autolysosombildung und Cargo-

Degradation einteilen (Randall-Demllo et al. 2013).

Durch die Kultivierung der PTEC in Medium mit hohem FKS-Gehalt (20 %), sowie mit

geringem und sehr geringem FKS-Gehalt (1 % und 0,5 %), sollte metabolischer

Stress induziert werden. Die im FKS enthaltenen ungeradzahligen Fettsäuren

können von MMA-Patienten nicht vollständig degradiert werden und es kommt zur

Bildung potenziell toxischer Substanzen.

Der Nachweis der Makro-Autophagie erfolgte an der 1) Kontrollstelle durch

mTORC1, sowie auf Ebene der 2) Autophagosombildung/Maturation und 3) der

Menge an Autolysosomen. Um Fehler aufgrund unterschiedlicher Zellcharakteristika

zwischen den Gruppen Kontrollen, PA-Patienten und MMA-Patienten

auszuschließen, wurde der Verlauf der Expression an der 1) Kontrollstelle und der 2)

Autophagosombildung beteiligter Proteine innerhalb der Zell-Gruppen (kontrollen,

MMA-Patienten, PA-Patienten) in Abhängigkeit der FKS-Konzentration verglichen.

Zusätzlich wurde das Emissionsspektrum der Acridinorangefärbung untersucht, um

auf die Menge der 3) Autolysosomen zurückzuschließen.

1) Die Reifung der Phagophore wird durch mTORC1 reguliert. Die

Dephosphorylierung von mTOR ist mit der Dissoziierung und Inaktivierung von

mTORC1 verbunden, was zur Assemblierung des Multiproteinkomplexes aus

ULK1/FIP200/ATG13 führt, der die Reifung der Phagophore stimuliert (Codogno und

Meijer, 2005; Jung et a.l, 2009; Ganley et al., 2009; Hosokawa et al., 2009). Die

Assemblierung und Aktivierung von mTORC1 hängt von der Kinase mTOR ab, ihre

Aktivität wird durch dephosphoryliertes PRAS40 reduziert und mTORC1 dissoziiert.

Der Verlauf der Ratios von pPRAS40/PRAS40 und pmTOR/mTOR über die FKS-

Konzentration zeigte bei PTEC von MMA-Patienten eine Korrelation zwischen

sinkenden Ratios von pmTOR/mTOR und pPRAS40/PRAS40, sowie dem

ansteigenden FKS-Gehalt. Daraus lässt sich auf eine stärkere Dissoziierung und

Inaktivierung von mTORC1 und positiver Regulation der Reifung der Phagophore bei

steigendem metabolischen Stress schließen.

Bei PTEC von PA-Patienten war der Verlauf der Ratios über den FKS-Gehalt sehr

unregelmäßig und ließ keine Abhängigkeit erkennen, sie unterschieden sich in

diesem Punkt grundlegend von PTEC der MMA-Patienten.

2) Die Autophagosombildung/Maturation wurde anhand der Expressionsstärke von

LC3-II und P62, die mit der reifenden Phagophore assoziiert sind, untersucht (Choi &

Ryter, 2011). Bei PTEC von MMA-Patienten weist die steigende Expression von

LC3-II und P62 mit steigendem FKS-Gehalt auf eine erhöhte Autophagosombildung

und Maturation hin und dient als Ausdruck erhöhter Makro-Autophagie mit

zunehmendem metabolischen Stress.

Die Expression von LC3-II war bei PA-Patienten unabhängig vom FKS-Gehalt, P62

war bei hohem und sehr geringem FKS-Gehalt höher und bei geringem FKS-Gehalt

geringer exprimiert, eine Abhängigkeit vom FKS-Gehalt ließ sich somit nicht

feststellen. Auch dies war ein grundlegender Unterschied zwischen PTEC von MMA-

und von PA-Patienten.

3) Der Nachweis der Degradierung der Autophagosome in sauren Autolysosomen

bei PTEC von MMA-Patienten erfolgte durch den Nachweis der erhöhten Anzahl der

Autolysosomen. Das Lysosom umschließt das Autophagosom und bildet das

Autolysosom, das Lumen wird durch Protonenpumpen angesäuert und der Inhalt

durch saure Hydrolyse degradiert (Yang und Klionsky, 2009; Weidberg et al., 2011;

Rubinsztein et al., 2012). Die höhere Ratio von FL3/FL1 nach Färbung mit

Acridinorange bei PTEC von MMA-Patienten deutete auf eine höhere Anzahl von

Autolysosomen hin. Die erhöhte Anzahl von Autolysosomen kann zum einen auf

erhöhte Autophagie hinweisen, zum anderen aber auch aus einer verminderten

Degradierungsrate analog zum Vici-Syndrom resultieren. Bei dieser Erkrankung

akkumulieren Autolysosomen in der Zelle, da sie aufgrund eines Defekts im EPG5-

Gen nicht abgebaut werden können und die Patienten leiden unter schweren

Schädigungen (Cullup et al., 2013).

Insgesamt weisen die Ergebnisse auf eine erhöhte Autophagie bei PTEC von MMA-

Patienten hin. Von einer Doppelmembran umgebene Strukturen, wie sie auf EM-

Bildern von PTEC von MMA-Patienten erkennbar waren, treten bei Autophagosomen

auf (Tooze, 2013) und lassen in Zusammenhang mit den Verläufen der Expressionen

von pmTOR/mTOR, pPRAS40/PRAS40, LC3-II und P62, sowie der höheren Anzahl

von Autolysosomen ein erhöhtes Vorkommen von Makro-Autophagie postulieren.

In den bekannten Mausmodellen für die MMA konnte Autophagie bislang nicht

nachgewiesen werden (Peters et al., 2003; Chandler et al., 2009; Manoli et al.,

2013). Ein Grund hierfür könnte sein, dass der Zelltod der murinen Zellen eingetreten

ist, bevor es zur Einleitung autophagozytotischer Wege kam. Es wurden bei den

Knock out-Mäusen jedoch degenerierte Mitochondrien mit aufgelöster Cristae-

Struktur nachgewiesen (Chandler et al., 2009). Bei den PTEC der MMA-Patienten

war die Struktur und Morphologie der Mitochondrien nicht unterschiedlich im

Vergleich zu Kontrollen. Eine mögliche Erklärung hierfür könnte sein, dass in der

vorliegenden Arbeit reine PTEC verwendet wurden. Chandler und Kollegen

verwendeten nicht genauer spezifizierte Zellen aus dem Nierengewebe von Mäusen,

die einen Mix verschiedener Zellen darstellten (Chandler et al., 2009). Somit könnten

auch in der Niere von MMA-Patienten Schädigungen der Mitochondrien auftreten, die

durch die Verwendung reiner PTEC in der vorliegenden Arbeit jedoch nicht

abgebildet werden konnten.

Erhöhte Autophagie dient zudem als Schutzmechanismus gegen chronischen,

metabolischen mitochondrialen Stress bei PTEC und die Zelle versucht durch

Aminosäurekatabolismus die Energieversorgung durch die Mitochondrien zu

umgehen, um den mitochondrialen Stress zu verringern (Kimura et al., 2013). Es

lässt sich postulieren, dass bei PTEC von MMA-Patienten ein ähnlicher

Mechanismus wirken könnte. Der Abbau von verzweigtkettigen Aminosäuren kann im

Zuge katabolischen Stresses zu metabolischen Entgleisungen führen.

5.6 ER-Stress bei PTEC von MMA-Patienten verstärkt die Autophagie

Die Einleitung der Autophagie kann ebenfalls mit der Aktivierung von IRE1, sowie

elF-2α über PERK erfolgen (Kouroku et al., 2007; Fujita et al., 2007, Benbrook &

Long, 2012). IRE1, PERK und ATF6 sind Sensorproteine im ER, die bei Stress des

ER als Transkriptionsfaktoren wirken und die Transkription verschiedener Gene

veranlassen. Das auf EM-Bildern erkennbare vergrößerte Lumen des ER trat nur bei

PTEC von MMA-Patienten auf. Es bildete kreisförmige Strukturen und war mit

Mitochondrien assoziiert, beides sind Kennzeichen für ER-Stress. Bei MEF-Zellen ist

die Bildung von LC3-II konjugierten, autophagischen Vesikeln chemisch durch

Tunicamycin oder Thapsigargin induzierbar und von IRE1abhängig, jedoch nicht von

ATF6 und PERK (Ogata et al., 2006). Der Verlauf der Expression von pIRE1 zeigte

nur bei PTEC von MMA-Patienten einen Zusammenhang mit der Höhe des FKS-

Gehalts und stieg bei höheren FKS-Werten und damit steigendem metabolischen

Stress an. Bei PA-Patienten war die Höhe der Expression von pIRE1 unabhängig

von der Höhe des FKS-Gehalts, sie ließ somit keinen Zusammenhang erkennen und

stellt einen wichtigen Unterschied zwischen PTEC von MMA- und PA-Patienten dar.

Es lässt sich postulieren, dass metabolischer Stress bei PTEC von MMA-Patienten

zu ER-Stress führt.

Weiterhin lässt sich ein Zusammenhang zwischen ER-Stress und Autophagie bei

PTEC von MMA-Patienten postulieren. Dieser kann in der für das Autophagosom

benötigten Membran liegen. Die Membran kann ihren Ursprung in der Abschnürung

eines Teils des ER haben, wofür ER-Stress eine Voraussetzung ist (Hamasaki et al.,

2013; Tooze, 2013; Uemura et al., 2014).

Die in elektronenmikroskopischen Aufnahmen erkennbaren autophagozytotischen

Strukturen in PTEC von MMA-Patienten zeigen Ähnlichkeit zu Aufnahmen von

Aggresomen. Aggresom-ähnliche Strukturen sind im Zytosol vorkommende

Proteinaggregate, die eine weitere Art der Degradierung aggregierter Proteine

darstellen. Am Ende werden sie ebenfalls durch Autophagosome eingeschlossen

und lysosomal abgebaut (Garcia-Mata et al., 2002). In beiden Fällen ist das Protein

P62 mit den aggregierten Proteinen assoziiert. P62 dient als Regulator des

Proteinabbaus, vermittelt die Bildung aggresom-ähnlicher Strukturen und verbindet

Inflammation mit ER-Stress. Im Gegensatz zur Autophagie wird bei Aggresomen

jedoch nur P62 an die zu degradierenden Strukturen gebunden. Die Prozession von

LC3 zu LC3-I und anschließend zu LC3-II tritt nur bei Autophagie auf, was einer

Beteiligung von Aggresomen widersprechen würde und stärker für Autophagie als für

Aggresome bei PTEC von MMA-Patienten spricht (Liu et al., 2012).

Bei chronischem ER-Stress sind UPR und oxidativer Stress mit erhöhten Werten von

ROS durch UPR-stimulierten Hochregulation der Chaperone, die bei der Bildung von

Disulfidbindungen im ER-Lumen beteiligt sind, miteinander assoziiert (Cullinan and

Diehl, 2006). Die für die Bildung von Disulfidbindungen verantwortlichen Enzyme

verwenden Oxidations- und Reduktions-Reaktionen mit molekularem Sauerstoff als

letztem Elektronenempfänger (Haynes et al., 2004). Die in der vorliegenden Arbeit

beschriebene erhöhte Bildung von ROS bei PTEC von MMA-Patienten könnte neben

Defekten der Enzyme von Atmungskette und Zitrat-Zyklus somit zusätzlich durch

erhöhten ER-Stress begründet sein, der durch UPR hochregulierten Chaperone

verursacht werden könnte.

5.7 PTEC von MMA-Patienten exprimieren Zytokine und Rezeptoren zur Interaktion mit Immunzellen

Inflammationen sind durch die Infiltration des entzündeten Gewebes durch Zellen

des Immunsystems gekennzeichnet. Voraussetzung dafür ist die Kommunikation

zwischen den Zellen des Immunsystems und den Zellen des entzündeten Gewebes

über Zytokine und Rezeptoren. Es wurde zum einen untersucht, ob PTEC von MMA-

Patienten Rezeptoren zur Signalweiterleitung des angeborenen Immunsystems

exprimierten, zum anderen ob sie Rezeptoren oder Moleküle zur Interaktion und

Kommunikation mit Zellen des erworbenen Immunsystem exprimierten.

Auf der Ebene des angeborenen Immunsystems wurden Elemente untersucht, die an

der Weiterleitung der Signale des Komplementsystems an der Zielzelle beteiligt sind.

Ein Vergleich von Rezeptoren, die auf der Zelloberfläche Faktoren des

Komplementsystems binden, ergab keine Unterschiede zwischen Kontrollen und

MMA-Patienten. Eine Involvierung der angeborenen Immunantwort scheint somit bei

der durch MMA ausgelösten cTIN keine oder nur eine untergeordnete Rolle zu

spielen.

Auf der Ebene des erworbenen Immunsystems wurde bei PTEC von Kontrollen und

MMA-Patienten ein Expressionsvergleich mit löslichen Rezeptoren sowie mit

Zytokinen durchgeführt. Die Ergebnisse wurden nur durch je zwei Zelllinien

gewonnen und dienten dazu, mögliche Moleküle für die Immunzellaktivierung

qualitativ zu erfassen.

Der Expressionsvergleich löslicher Rezeptoren zeigte bei PTEC von MMA-Patienten

eine stark erhöhte Expression von VCAM-1 (vascular cell adhesion molecule 1)

gegenüber Kontrollen und ließ auf eine mögliche Interaktion der PTEC mit Zellen des

Immunsystems schließen. VCAM-1 ist ein Zelladhäsionsprotein und vermittelt die

Bindung von Monozyten an Epithelzellen (Alpers et al., 1993; Seron et al., 1991;

Brady, 1994; Hill et al., 1995). Die Expression von VCAM-1 in Epithelzellen der Niere

wird bei Inflammationen drastisch erhöht und korreliert mit der tubulointerstitiellen

Schädigung von infiltrierenden Leukozyten.

Die erhöhte Expression der löslichen Form von IL-1RII (Interleukin-1 Rezeptor Typ 2)

bei PTEC von MMA-Patienten ließ auf eine weitere mögliche Interaktion mit Zellen

des Immunsystems schließen. Nach subkutaner MMS-Applikation wiesen Ratten

erhöhte Mengen an Interleukin-1β im Blut auf, verursacht durch eine erhöhte Anzahl

an Neutrophilen und eine allgemeine Aktivierung des Immunsystems (Ribeiro et al.,

2013). IL-1RII ist in der Lage die Interleukine IL-1α, IL-1β sowie den Rezeptor IL-1RI

(Interleukin-1 Rezeptor Typ 1) zu binden, leitet jedoch keine Signale weiter

(Dinarello, 1996). Dadurch würden die Rezeptoren der PTEC von MMA-Patienten

diese Zytokine aus dem Blutkreislauf entfernen, so dass ihre Wirkung am Zielort

verringert werden würde. Eine verminderte Pathogenabwehr könnte die Folge sein

(Dinarello, 2005).

Der Rezeptor IL-15R kann aus den Untereinheiten α oder β und γ aufgebaut sein.

Die Untereinheiten β und γ teilt sich der Rezeptor für IL-15 mit den Rezeptoren für IL-

2 (Anderson et al., 1995). Zu den IL-15 exprimierenden Zellen gehören

Makrophagen, Monozyten, dendritische Zellen, Keratinozyten, Fibroblasten und

Nervenzellen (Grabstein et al., 1994). IL-15 fungiert über den Rezeptor IL-15Rα in

der Niere als Überlebensfaktor von Epithelzellen (Giron-Michel et al., 2013).

Zytokine üben ihre Wirkung über Rezeptoren aus und vermitteln zwischen humoraler

und zellbasierter Immunantwort. Sie regulieren Reifung, Wachstum und Antwort

bestimmter Zellarten. Interleukine sind Peptidhormone und eine Untergruppe der

Zytokine. Sie tragen zur Kommunikation zwischen Immunzellen oder Immunzellen

mit anderen Zellen bei. Humane PTEC sind grundsätzlich in der Lage verschiedene

Zytokine wie CCL2 (MCP-1), CCL8 (MCP-2), CCL3 (MIP-1α), CCL4 (MIP-1β), CCL5

(RANTES), und CXCL8 (IL-8) zu bilden und zu sezernieren (Cockwell et al., 1998;

Rovin et al., 1996; Mezzano et al., 2000; Chakravorty et al., 2001; Tang et al., 2003).

Insbesondere IL-8 ist ein wichtiges Protein in der Immunantwort und dient der

Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten und Makrophagen zum

Entzündungsherd (Baggiolini & Clark-Lewis, 1992). Während sich eine vermehrte

Sekretion von CCL2, CCL3, CCL4 und CCL5 nicht nachweisen ließ, sezernierten

Zellen von MMA-Patienten apikal und basolateral qualitativ mehr IL-8 ins Medium.

Die quantitative Analyse zeigte, dass die Menge an sezerniertem IL-8 gegenüber

Kontrollen (apikal, basolateral, intrazellulär) und PA-Patienten (apikal, basolateral)

erhöht war. Als stärkste Expressionsstimuli für IL-8 in PTEC-Kulturen in vitro wurden

IL-1α und TNF-α identifiziert (Gerritsma et al., 1996). Die Kultivierung der PTEC in

der vorliegenden Arbeit erfolgte in Medium ohne Supplementation von FKS oder

anderer Agenzien, da FKS ebenfalls zur Genexpression von IL-8 führen kann. In vivo

dient IL-8 als Signalmolekül und wirkt auf Zellen des Immunsystems chemotaktisch.

Die Menge an exprimiertem IL-8 von PTEC ist proportional zur chemotaktischen

Aktivierung von T-Zellen und ihrer Rekrutierung zum Ort der Inflammation (Demmers

et al., 2013). Die Signalentfaltung erfolgt über GTP-gekoppelte Rezeptoren, die

Zielzellen sind Neutrophile, Granulozyten und Makrophagen (Baggiolini & Clark-

Lewis, 1992). Bei intestinalen Epithelzellen führt erhöhte Autophagie zu stärkerer IL-

8 Sekretion (Li et al., 2011). Die Expression von IL-8 ist weiterhin durch ROS wie

Wasserstoffperoxid induzierbar (Vlahopoulos et al., 1999) und kann somit als

Weiterleitung von ROS-Signalen an Zellen des Immunsystems dienen, welches die

Rekrutierung von Neutrophilen, Basophilen und T-Zellen zum Herd der Inflammation

zur Folge hat.

5.8 Korrelation von Autophagie und IL-8-Expression bei PTEC von MMA-Patienten

Zwischen der Stärke der Autophagie und der Höhe des exprimierten IL-8 bestand in

PTEC von MMA-Patienten eine sehr starke Korrelation und deutete auf einen

Zusammenhang hin.

Autophagie und die Expression von Zytokinen können sich gegenseitig beeinflussen

und regulieren, Interleukine nehmen bei der Regulation von Autophagie kontroverse

Rollen ein. Zum einen wirkt IL-13 in der Epithelzelllinie HT29 als Inhibitor von durch

Nahrungsmangel ausgelöster Autophagie (Petiot et al., 2000; Arico et al., 2001),

andererseits übernimmt IL-8 die Rolle eines Aktivators der Autophagie indem es

mTORC1 hemmt und somit die Autophagie stimuliert. In diesem Zusammenhang

existiert ein Zusammenspiel zwischen ROS, Autophagie, Zytokinexpression und

Inflammation (Harris, 2011).

Autophagie hat einen unmittelbaren Einfluss auf die Transkription, Prozessierung

und Sekretion einer Reihe von Zytokinen. Die Störung der in allen Zellen auf einem

Grundniveau ablaufenden Autophagie steht in Verbindung mit erhöhter Sekretion der

proinflammatorischen Zytokine IL-1α, IL-1β und IL-18 (Saitoh et al., 2008; Crisan et

al., 2011; Harris et al., 2011; Nakahira et al., 2011; Zhou et al., 2011). Autophagie

reguliert die Transkription und Sekretion von TNF-α und IL-8 positiv (Harris, 2011).

Für einen direkten Zusammenhang zwischen erhöhter Autophagie und der

Expression und Sezernierung von IL-8 gibt es bisher noch keine Hinweise. Das

parallele Auftreten von Autophagie und akuter Nierenschädigung kann sich jedoch zu

einer chronischen Inflammation entwickeln (Tögel und Westenfelder, 2014).

In Patienten mit diabetischer oder nicht-diabetischer Nephritis im Endstadium kann

die Induktion der IL-8 Transkription durch ROS wie Wasserstoffperoxid erfolgen

(Lakshminarayanan et al., 1998). Der unmittelbare Einfluss von ROS auf die direkte

Aktivierung von NF-κB über Modifikation von Aminosäurenresten der einzelnen

Proteine P50, P52, P65, P100 und P105 von NF-κB kann je nach Zelltyp

unterschiedlich sein und NF-κB kann aktiviert oder deaktiviert werden (Morgan und

Liu, 2011). In der vom humanen proximalen Tubulus stammenden Zelllinie HK-2

führen Proteinbelastung und ROS über die Aktivierung von NF-κB zur Transkription

von Chemokinen (Morigi et al., 2002). Der Abbau von reduziertem Glutathion und die

anschließende Erhöhung von zytosolischem Glutathiondisulfid als Antwort auf

oxidativen Stress führen ebenfalls zu der Aktivierung von NF-κB (Raman und McNee,

2000). Die in der vorliegenden Arbeit verwendeten PTEC der MMA-Patienten wurden

alle von Spendern isoliert, die bereits eine starke Beteiligung der Nieren im

Krankheitsbild zeigten. Es wurden intrazellulär ebenfalls verringerte Konzentrationen

an reduziertem Glutathion und erhöhte Konzentrationen an zytosolischem

Glutathiondisulfid nachgewiesen, so dass hier auch eine Aktivierung von NF-κB mit

anschließender Transkription von IL-8 stattgefunden haben könnte.

Die Expressionsstimuli IL-1α und TNF-α wirken über ihre Rezeptoren und die

Aktivierung von NF-κB. In Rinderzellen stimulieren TNF-α und NF-κB die

Genxpression von IL-8 (Fitzgerald et al., 2007). In Fibroblasten führt erhöhte

Autophagie zur Aktivierung der IKK. Durch Aktivierung der IKK wird auch der NF-κB

Signalweg stimuliert und die Genexpression von Interleukinen (z.B. IL-8) kann

eingeleitet werden (Criollo et al., 2010). In PTEC von MMA-Patienten wäre beim

Zusammenhang zwischen Autophagie und der Expression von IL-8 der gleiche

Mechanismus vorstellbar.

Eine Rolle für das Zusammenspiel aus Autophagie, ROS und Inflammation könnte

das NLRP3-Inflammasom spielen, das auf ROS reagiert und zu Autophagie,

Apoptose, Fibrose und zur proinflammatorischen Zytokinausschüttung führen kann.

Dabei reichen bereits einzelne Komponenten des Inflammasoms aus, der komplette

Ablauf der Kaskade ist keine Voraussetzung (Shigeoka et al., 2010; Chang et al.,

2014).

Die erworbene Immunantwort wird durch die Interaktion zwischen dem T-Zell-

Rezeptor und Peptidsequenzen eingeleitet, die durch MHC-II Moleküle (major

histocompatibility class II) präsentiert werden. MHC-II Moleküle werden vor allem von

antigenpräsentierenden Zellen wie zirkulierenden Makrophagen oder dendritischen

Zellen gebildet, können jedoch auch von PTEC gebildet werden (Muller et al., 1989).

Die autophagische Antigenprozessierung stellt Peptide für die Präsentation auf MHC-

II Moleküle bereit. So können die nachgeschalteten immunologischen Effekte der

Präsentation von MHC-II Antigenen als ein Ergebnis der vorgelagerten Autophagie

gesehen werden (Leventhal et al., 2013). PTEC von MMA-Patienten könnten

ebenfalls durch autophagie-vermittelte MHC-II Bildung und IL-8 Sekretion mit T-

Zellen interagieren und die Inflammation einleiten.

5.9 Ausblick

Die in dieser Dissertation erarbeiteten Ergebnisse lassen auf einen Zusammenhang

zwischen der Entstehung und Stärke der Autophagie und der Expression von IL-8 als

Signalmolekül zur Rekrutierung des Immunsystems zum Herd der Inflammation bei

der Entstehung der cTIN bei MMA-Patienten schließen.

Das verwendete Zellkulturmodell lässt jedoch nur einen eingeschränkten Blickwinkel

auf einen Zelltyp des betroffenen Organs zu, da alle Versuche an PTEC durchgeführt

wurden.

Weiterführende Versuche könnten an PTEC zusätzlicher MMA- und PA-Patienten

erfolgen, um die jeweiligen Gruppen zu vergrößern und die in dieser Dissertation

erarbeiteten Ergebnisse zu stützen. Zusätzlich könnten Versuche an isolierten

humanen Zellen des Immunsystems von MMA-Patienten durchgeführt werden, um

die Aktivierbarkeit von T-Zellen, Neutrophilen und Makrophagen durch Kokultur mit

PTEC zu untersuchen.

Weiterhin könnte an einem neu entwickelten oder bereits etablierten MCM-knockout

Mausmodell eine systemische Betrachtung der gefundenen Ergebnisse durchgeführt

werden, in welche andere Gewebearten wie Skelettmuskelzellen, Herzmuskelzellen,

Leberzellen und verschiedene Zellen des Immunsystems mit einbezogen werden

könnten.

Im Rahmen dieser Dissertation wurden Zellen von MMA-Patienten verwendet, die

bereits eine cTIN und damit verbundene Schädigung der Niere entwickelt haben.

Weitere Untersuchungen bei PTEC von MMA-Patienten ohne cTIN könnte die

Hypothese unterstützen, dass ein Zusammenhang zwischen erhöhter Autophagie

und Sezernierung von IL-8 besteht. Als Hypothese ließe sich formulieren, dass nur

bei Patienten mit cTIN ein Zusammenhang zwischen erhöhter Autophagie und

Sezernierung von IL-8 besteht. Ergänzend dazu könnten Analysen anderer

Erkrankungen dienen, die ebenfalls eine cTIN entwickeln, um zu überprüfen, ob es

ein Pathomechanismus ist, der nur im Zuge der MMA auftritt, oder ob es ein Modell

darstellt, welches auch auf andere Erkrankungen zutrifft und allgemeiner gesehen

werden kann. Weiterhin könnte das NLRP3-Inflammasom als Schnittstelle zwischen

Autophagie, Apoptose und Fibrose dienen, die an der Sezernierung

proinflammatorischer Zytokine beteiligt ist. Dieser oder ein ähnlich funktionierender

Mechanismus wäre auch bei der cTIN von MMA-Patienten vorstellbar.

Ein weiterer wünschenswerter Aspekt wäre die Generierung eines Markers, der die

Entwicklung der cTIN schon früher prognostizierbar machen würde. Ein

naheliegender Kandidat dafür wäre IL-8, das bei PTEC von MMA-Patienten erhöht

war. Bei Hämodialysepatienten sind die Serumkonzentrationen der Zytokine

Interleukin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 12, 13 und Tumornekrosefaktor J (TNFJ) erhöht (Kimmel

et al. 1998). IL-8 ist davon nicht betroffen, so dass es keine Verfälschungen durch

eine Behandlung geben würde. Die Bestimmung von IL-8 im Plasma wäre dennoch

nur bedingt als Marker für eine cTIN zu verwenden, da die MMA eine

multisystemische Erkrankung ist und IL-8 auch aus anderen Geweben stammen

kann. Der gemessene Plasma-Wert lässt sich nicht einzelnen Quellen zuordnen,

somit kann im Plasma gemessenes IL-8 nicht als Marker für eine cTIN verwendet

werden. Mit dem Urin ausgeschiedenes IL-8 könnte jedoch unter Umständen als

Marker dienen, es korreliert kaum mit dem Plasma-Wert (Jacobsen et al., 1996).

Aufgrund seiner geringen Größe könnte es den glomerulären Filter passieren. Da die

IL-8 Werte bei PTEC von MMA-Patienten auch intrazellulär erhöht waren, könnten

die in der vorliegenden Arbeit verwendete Methode der Isolierung von humanen

PTEC im Rahmen der Ambulanztermine der Patienten verwendet werden. Bei

stationären Klinikaufenthalten, wie sie z.B. nach metabolischen Krisen notwendig

werden, könnten die Zellen jedoch zu sehr geschädigt sein und zu falschen

Schlussfolgerungen führen. Die isolierten Zellen können für einige Passagen

kultiviert werden und reichen zur Bestimmung der Konzentration von IL-8 aus.

5.10 Zusammenfassung

Ziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der renalen Pathogenese der chronischen

tubulointerstitiellen Nephritis bei Methylmalonazidurie-Patienten, die zur Entwicklung

eines chronischen Nierenversagens führt. Als Untersuchungsmodell wählten wir

proximale Tubulusepithelzellen von Methylmalonazidurie-Patienten. Da in einigen

Studien eine multiple Störung des mitochondrialen Energiestoffwechsels als Ursache

des Organversagens bei Methylmalonazidurie-Patienten gezeigt wurde, fokussierten

wir uns zunächst auf eine Beschreibung des Energiemetabolismus der proximalen

Tubulusepithelzellen. Die verringerte Aktivität der Phosphofruktokinase 1 führt zu

einem geringeren Flux und damit zu einer Beeinträchtigung der Glykolyse. In

Zusammenhang mit der erfolglosen Isolierung von Mitochondrien, ließ die

verminderte Aktivität der mitochondrialen Aconitase, des 2-Oxoglutarat-

Dehydrogenasekomplexes und der Cytochrom c-Oxidase auf einen mitochondrialen

Defekt in proximale Tubulusepithelzellen von Methylmalonazidurie-Patienten

schließen, der sich strukturell und funktionell manifestierte.

Der mitochondriale Defekt führte weiterhin zu erhöhter ROS-Produktion, die sich

durch metabolischen Stress aufgrund der Applikation von Glukose, Pyruvat,

Methylmalonsäure, Propionsäure und Isoleucin steigern ließ. Erhöhtes

Glutathiondisulfid und verringertes freies Glutathion aufgrund höherer ROS-

Konzentration stärkten die Hypothese erhöhten oxidativen Stresses in proximalen

Tubulusepithelzellen von Methylmalonazidurie-Patienten.

Die höhere ROS-Konzentration führte im Zusammenspiel mit erhöhter Expression

von pIRE1 und degeneriertem Endoplasmatischen Retikulum mit vergrößertem

Lumen, die auf elektronenmikroskopischen Bildern erkennbar waren, zu Stress des

Endoplasmatischen Retikulums in proximalen Tubulusepithelzellen von

Methylmalonazidurie-Patienten.

Verringerte Aktivität von mTORC1 (mammalian target of rapamycin complex 1) unter

metabolischem Stress und die Störungen im Energiemetabolismus deuteten bei

proximalen Tubulusepithelzellen von Methylmalonazidurie-Patienten auf eine positive

Regulation der Autophagosombildung hin. In diesem Zusammenhang führten von

einer Doppelmembran umgebene Strukturen, die auf elektronenmikroskopischen

Bildern zu sehen waren, und die erhöhte Expression von P62 und LC3-II unter

metabolischem Stress zur Annahme erhöhter Makro-Autophagie. Diese ließ sich

durch mehr Autolysosomen bestätigen.

Es ist bekannt, dass die Inflammation eines Gewebes immer mit der Infiltrierung

durch Zellen des Immunsystems einhergeht. Die Expression der zur Rekrutierung

des Immunsystems notwendigen Zytokine war bei proximalen Tubulusepithelzellen

von Methylmalonazidurie-Patienten in Form von Interleukin-8 höher, die apikale und

basolaterale Sekretion fiel stärker aus. Die starke Korrelation zwischen Autophagie

und der Sezernierung von Interleukin-8 bei proximalen Tubulusepithelzellen von

Methylmalonazidurie-Patienten deutete darauf hin, dass Autophagie eine direkte

Ursache der erhöhten Transkription von Interleukin-8 ist oder indirekt Ursachen der

Transkription von Interleukin-8 fördert. Dies kann zu einer Infiltration des Interstitiums

des proximalen Tubulus durch Neutrophile, Makrophagen und T-Zellen führen. Die

inflammatorische Reaktion wird somit weiter getriggert und führt über längere Zeit

zum Versagen der Nierenfunktionen.

Abbildung (25) Zusammenwirkender Mechanismus der molekularbiologischen Ursachen der chronischen tubulointerstitiellen Nephritis in PTEC von MMA-Patienten

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7 Anhang

7.1 Abkürzungsverzeichnis

A mitochondriale Aconitase

ABC ATP Bindekassette

AQP Aquaporin

ATF6 activating transcription factor

AdoB12 Adenosylcobalamin, Vitamin B12

ADP Adenosin 5'-Diphosphat

AMPK Adenosin 5'-Monophosphat Kinase

ATG13 autophagy related gene 13

aTIN akute tubulointerstitielle Nephritis

ATP Adenosin 5'-Triphosphat

BSA Albumin aus Rinderserum

Cbl Cobalamin

CCL Chemokin (C-C Motiv) Ligand

CD Cluster of Differentiation

CoA Coenzym A

CS Zitratsynthase

cTIN chronische tubulointerstitielle Nephritis

Da Dalton

DBH Decylubihydrochinon

DBQ 3-Dimethoxy-5-Methyl-6-Decyl–1,4-Benzochinon

DCF Dichloro-Dihydrofluorescein

DCPIP Dichlorophenolindophenol

DQA 2-n-Decylquinazolin-4-yl-Amin 2

DMEM Dulbeccos’s modified Eagle medium

DTNB 5',5"-Dithiobis-(2-Nitrobenzoat)

E Enolase

EDTA Ethylendiamin-N, N, N´, N´-Tetraessigsäure

ER Endoplasmatisches Retikulum

ERK extracellular signal regulated kinase

Fum Fumarase

FAD Flavinadenindinukleotid, oxidiert

FADH2 Flavinadenindinukleotid, reduziert

FKS Fötales Kälberserum

g Erdbeschleunigung

GAPDH Glutaraldehydphosphat-Dehydrogenase

MS Malonsäure

MS/MS Tandem-Massenspektrometrie

GCDH Glutaryl-CoA-Dehydrogenase

GDP Guanosin-Diphosphat

GFR glomeruläre Filtrationsrate

GSSG Glutathion-Disulfid

GSH Glutathion, reduziert

GTP Guanosin-Triphosphat

H2DCFDA 2’,7’-Dichloro-Dihydrofluoresceindiacetat

HK Hexokinase

IDH Isozitrat-Dehydrogenase

IKK IκBα-Kinase-Komplex

IL Interleukin

Ile Isoleucin

IRE1 inositol requiring enzyme 1

IRS1 Insulinrezeptorsubstrat 1

Kb Kilobasenpaar

KCN Kaliumcyanid

KPi K2HPO4

KRB Krebs-Ringer Puffern

LB Luria Broth

LC3 Microtubule light chain protein 3

LDH Laktatdehydrogenase

MCM Methylmalonyl-CoA Mutase

MCP Monocyte chemotactic protein

MHC Major Histocompatibility Complex

MDH Malat-Dehydrogenase

MMA Methylmalonazidurie

MMS Methylmalonsäure

mTOR mammalian target of rapamycin

mTORC1 mammalian target of rapamycin complex 1

n Anzahl

NaCN Natriumzyanid

NAD β-Nicotinamid Adenin Dinucleotid, oxidiert

NADH β-Nicotinamid Adenin Dinucleotid, reduziert

NADP Nikotinamidadenindinukleotidphosphat, oxidiert

NADPH Nikotinamidadenindinukleotidphosphat, reduziert

OGDHc 2-Oxoglutarat-Dehydrogenase-Komplex

p Wahrscheinlichkeit, dass die Nullhypothese richtig ist

PA Propionazidurie

PS Propionsäure

PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung

PCR Polymerase Chain Reaction

PDHc Pyruvat-Dehydrogenase-Komplex

PE Phosphatidylenositol

PEP Phosphoenolpyruvat

PERK PKR-like endoplasmic reticulum kinase

PFK Phosphofruktokinase

PGM Phosphoglyzerat-Mutase

PK Pyruvatkinase

PRAS40 proline-rich AKT substrate 40 kDa

PS Propionsäure

(h)PTEC (humane) proximale Tubulusepithelzellen

PVDF Polyvinyliden-Fluorid

R Bestimmtheitsmaß

RANTES Regulated on activation, normal T cell expressed and secreted

Raptor Regulatory associated protein of mTOR

Rheb Ras-related homolog enriched in brain

RIPA (Puffer) Radio Immuno Protein Assay Puffer

ROS reaktive Sauerstoffspezies

RSK1 p90 ribosomal S6 Kinase 1

SDS Sodium Dodecylsulfat

SLC solute carrier

TNF Tumornekrosefaktor

TPI Triosephosphat-Isomerase

Tris Trishydroxymethyaminomethan

TSC tuberous sclerosis complex

U/mg Units pro mg [μmol min-1 mg-1], spezifische Aktivität

ULK1 unc-51-like kinase 1

upm Umdrehungen pro Minute

UPR unfolded protein response

7.2 Tabellarische Auflistung von im Ergebnisteil nur graphisch dargestellter Messwerte

Messgröße Maßeinheit Kontrolle MMA PA MMS im Medium Konzentration mmol/L/mg 2,79 ± 0,63 6,53 ± 1,84 n.a. Mt. Sauerstoffverbrauch O2-Änderung/Zeit DMEM ΔO2 (sensitiv)/mg 0,50 ± 0,06 0,14 ± 0,20 0,13 ± 0,14 KRB+Glukose ΔO2 (sensitiv)/mg 0,58 ± 0,22 0,26 ± 0,15 0,40 ± 0,52 KRB+Pyruvat ΔO2 (sensitiv)/mg 2,54 ± 2,21 0,98 ± 0,75 2,63 ± 1,17 Glykolyse Enzymaktivität HK mOD/min/mg 0,66 ± 0,14 0,56 ± 0,07 0,54 ± 0,03 PFK mOD/min/mg 2,57 ± 0,73 0,94 ± 0,61 2,59 ± 0,59 TPI mOD/min/mg 2,39 ± 0,29 3,17 ± 0,29 2,24 ± 0,40 PGM mOD/min/mg 12,35 ± 0,93 12,69 ± 0,76 8,13 ± 3,97 GAPDH mOD/min/mg 6,53 ± 0,49 7,47 ± 0,38 5,39 ± 0,40 E mOD/min/mg 13,8 ± 1,37 15,49 ± 1,09 9,56 ± 4,61 PK HA mOD/min/mg 1,51 ± 0,28 1,10 ± 0,37 1,10 ± 0,12 PK LA mOD/min/mg 11,33 ± 1,14 11,10 ± 0,79 10,74 ± 1,94 LDH mOD/min/mg 8,20 ± 0,58 11,37 ± 3,28 7,17 ± 4,12 PDHc 14C-Einbau/mg 24,53 ± 15,10 14,60 ± 4,72 18,61 ± 5,20 Zitrat-Zyklus Enzymaktivität CS mOD/min/mg 33,83 ± 16,88 20,91 ± 14,52 37,82 ± 15,07 mA mOD/min/mg 7,48 ± 2,02 5,22 ± 1,55 5,98 ± 0,94 IDH mOD/min/mg 28,13 ± 7,21 29,68 ± 6,11 36,08 ± 9,32 OGDHc 14C-Einbau/mg 38,49 ± 18,34 21,25 ± 11,00 22,37 ± 11,56 Fum mOD/min/mg 10,43 ± 5,96 11,97 ± 3,03 8,40 ± 4,84 MDH mOD/min/mg 38,51 ± 13,10 44,15 ± 12,61 36,58 ± 6,94 Atmungskette Enzymaktivität Komplex I mOD/min/mg 4,50 ± 1,52 4,37 ± 0,86 2,89 ± 0,84 Komplex II mOD/min/mg 0,51 ± 0,14 0,51 ± 0,11 0,41 ± 0,08 Komplex III mOD/min/mg 1,40 ± 0,22 1,48 ± 0,41 1,61 ± 0,43 Komplex IV mOD/min/mg 1,67 ± 0,49 1,10 ± 0,47 1,32 ± 0,34 Komplex V mOD/min/mg 13,30 ± 3,26 16,01 ± 4,07 12,17 ± 4,21 Glutathion-Gehalt Gesamt GSH nmol/mg 0,68 ± 0,33 0,57 ± 0,16 n.a. GSSG nmol/mg 0,36 ± 0,14 0,60 ± 0,14 n.a. Freies GSH nmol/mg 0,32 ± 0,29 0,04 ± 0,05 n.a. ROS-Produktion Intensität Williams E Intensität/mg 5,13 ± 0,40 10,15 ± 4,63 7,13 ± 1,75 KRB Intensität/mg 13,87 ± 2,21 39,38 ± 21,27 15,83 ± 9,04 KRB+Glukose Intensität/mg 0,57 ± 0,12 1,97 ± 1,07 1,07 ± 0,40 KRB+Pyruvat Intensität/mg 2,37 ± 0,71 8,65 ± 4,41 5,10 ± 1,35 KRB+Glutamin Intensität/mg 0,50 ± 0,10 1,40 ± 0,70 0,70 ± 0,26 KRB+PS Intensität/mg 7,20 ± 1,04 22,62 ± 15,78 6,17 ± 4,61 KRB+MMS Intensität/mg 13,87 ± 2,56 38,68 ± 21,93 18,93 ± 8,44 KRB+Ile Intensität/mg 10,37 ± 2,37 29,35 ± 16,40 12,60 ± 5,41

Messgröße Messeinheit Kontrolle MMA PA Autophagie Expressionsstärke pRAS40/PRAS40 20%FKS

Intensität/mg 1,55 ± 0,39 0,88 ± 0,36 0,43 ± 0,07

pRAS40/PRAS40 1%FKS Intensität/mg 0,39 ± 0,09 0,58 ± 0,13 0,27 ± 0,02 pRAS40/PRAS40 0,5%FKS

Intensität/mg 0,61 ± 0,18 1,12 ± 0,68 0,34 ± 0,12

pmTOR/mTOR 20%FKS Intensität/mg 0,12 ± 0,05 0,14 ± 0,03 0,18 ± 0,07 pmTOR/mTOR 1%FKS Intensität/mg 2,16 ± 0,75 2,84 ± 0,28 2,05 ± 0,46 pmTOR/mTOR 0,5%FKS Intensität/mg 0,76 ± 0,37 2,26 ± 1,13 0,63 ± 0,22 LC3-II 20% FKS Intensität/mg 1,30 ± 0,48 1,95 ± 0,52 1,26 ± 0,23 LC3-II 1% FKS Intensität/mg 1,60 ± 0,36 2,20 ± 0,85 1,75 ± 0,42 LC3-II 0,5% FKS Intensität/mg 4,09 ± 0,80 5,23 ± 1,54 4,43 ± 0,56 P62 20%FKS Intensität/mg 1,10 ± 0,28 2,24 ± 0,47 1,92 ± 0,13 P62 1%FKS Intensität/mg 2,94 ± 0,33 1,98 ± 0,66 2,09 ± 0,09 P62 0,5%FKS Intensität/mg 2,33 ± 0,27 1,81 ± 0,42 2,86 ± 0,36 pIRE1 20%FKS Intensität/mg 4,34 ± 1,60 6,23 ± 0,04 5,07 ± 0,55 pIRE1 1%FKS Intensität/mg 2,05 ± 0,44 1,94 ± 0,24 2,36 ± 0,24 pIRE1 0,5%FKS Intensität/mg 2,87 ± 0,67 2,34 ± 0,76 3,47 ± 0,60 AO Ratio Intensität FL3/FL1/mg 1,76 ± 0,35 2,46 ± 0,66 1,90 ± 0,36 Soluble Receptor Array Expressionsstärke Ctrl_1; Ctrl_7 MMA_1; MMA_2 IL-8 Intensität/mg 1194; 3886 9865 n.a. IL-1RII Intensität/mg 220; 23 595; 940 n.a. IL-15Ra Intensität/mg 189; 0 257; 189 n.a. VCAM-1 Intensität/mg 37; 0 2610; 4666 n.a. Immunrezeptoren Anzahl Moleküle CD46 Moleküle/Zelle 59684 ± 8792 58249 ± 18124 n.a. CD55 Moleküle/Zelle 27834 ± 11405 23046 ± 9139 n.a. CD59 Moleküle/Zelle 519648 ± 110158 530239 ± 139626 n.a. CD88 Moleküle/Zelle 16474 ± 1161 13984 ± 10822 n.a. Expression IL-8 Intensität IL-8 qualitativ Intensität/mg 4,53 ± 2,44 6,25 ± 2,26 4,09 ± 2,04 IL-8 quantitativ Konzentration Apikal pg/mg 1521 ± 410 2870 ± 1092 1854 ± 624 Basolateral pg/mg 2757 ± 382 4321 ± 1616 2098 ± 1295 Intrazellulär pg/mg 459 ± 302 1294 ± 692 828 ± 612

7.3 Western Blots der im Ergebnisteil graphisch dargestellten Expression einzelner Proteine