INDICE DE CONTENIDOS

INDICE DE CONTENIDOS ........................................................................................................... 1

INDICE DE FIGURAS ................................................................................................................... 5

INDICE DE TABLAS ..................................................................................................................... 7

ABREVIATURAS ........................................................................................................................... 9

GLOSARIO BIOINFORMÁTICO ................................................................................................ 11

INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................... 19

1 Inquilinus limosus: SU RELEVANCIA EN LOS PACIENTES CON FIBROSIS QUÍSTICA ......... 19

1.1 Breve reseña acerca de la fibrosis quística y de la relevancia que presentan las

infecciones broncorespiratorias en los pacientes fibroquísticos ...................................... 19

1.2 El género Inquilinus en el ámbito hospitalario .......................................................... 23

1.3 Inquilinus limosus: su relevancia en los PFQ ............................................................... 25

1.3.1 Dificultad para recuperar a Inquilinus de muestras clínicas ........................... 25

1.3.2 Dificultad para su identificación certera ........................................................... 26

1.3.3 Perfil natural de multiresistencia antimicrobiana de Inquilinus ....................... 30

1.3.4 Persistencia - Difícil erradicación ......................................................................... 29

1.3.5 Otros aspectos del género Inquilinus .................................................................. 30

2 MECANISMOS DE RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS EN BACTERIAS .......................... 33

2.1 Generalidades .............................................................................................................. 33

2.2 Resistencia a ß-lactámicos mediada por ß-lactamasas en BGN .......................... 37

2.2.1 Clasificación de las ß-lactamasas ...................................................................... 38

2.2.2 Estructura molecular de las serino-ß-lactamasas ............................................. 42

2.2.3 Mecanismo de acción de las serino-ß-lactamasas ......................................... 45

2.2.4 Aspectos cinéticos de las ß-lactamasas ............................................................ 46

2.3 Bombas de eflujo (BE) de resistencia a múltiples drogas ....................................... 49

2.3.1 Familias de BE de Resistencia a Múltiples Drogas (BE-RMD) ........................... 49

2.3.2 Inhibidores e inductores de BE ............................................................................. 53

2.4 Ensayos de sensibilidad a antimicrobianos. La resistencia clínica y el uso de

terapias antimicrobianas combinadas en PFQ................................................................... 53

3 FACTORES DE VIRULENCIA .............................................................................................. 57

3.1 Enfoques de la virulencia y sus estrategias ............................................................... 57

3.1.1 Búsqueda bioinformática de determinantes asociados a la virulencia ....... 60

3.2 Las biopelículas bacterianas o biofilms ..................................................................... 61

3.2.1 Regulación de la formación y establecimiento de biofilms ........................... 62

3.2.2 Análisis sobre biofilms formados en ensayos in vitro ......................................... 63

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS .......................................................................................................... 65

MATERIALES y METODOLOGÍA - PARTE I - Microbiología Clínica Aplicada ....................... 69

1 AISLAMIENTOS CLÍNICOS: SU IDENTIFICACIÓN, TIPIFICACIÓN Y CONSERVACIÓN ..... 69

1.1 Aislamientos bacterianos ............................................................................................. 69

1.2 Caracterización fenotípica ......................................................................................... 71

1.2.1 Morfología macroscópica ................................................................................... 71

1.2.2 Morfología microscópica ..................................................................................... 71

2

1.2.3 Pruebas bioquímicas convencionales de laboratorio, sistema de galerías

API® y sistema automatizado VITEK® .................................................................................. 71

1.2.4 Espectrometría de masa por MALDI-TOF ........................................................... 74

1.2.5 Estudio del perfil proteico total mediante electroforesis en geles de

poliacrilamida desnaturalizantes (SDS-PAGE).................................................................. 75

1.3 Caracterización genotípica ........................................................................................ 76

1.3.1 Métodos basados en la secuenciación de segmentos de ADN ................... 76

1.4 Tipificación molecular por electroforesis en gel de campo pulsado ................... 77

1.5 Ensayos de conservación ............................................................................................ 78

2 ENSAYOS DE SENSIBILIDAD FRENTE A DROGAS ANTIMICROBIANAS: DETECCIÓN Y

CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE MECANISMOS DE RESISTENCIA .................................. 79

2.1 Ensayo cualitativo por difusión en medio sólido: Antibiograma ........................... 79

2.1.1 Detección fenotípica y caracterización de enzimas ß-lactamasas ............. 81

2.2 Ensayo cuantitativo: Determinación de la concentración inhibitoria mínima en

medio líquido ............................................................................................................................ 83

2.3 Ensayo de desarrollo en medio BCSA ........................................................................ 84

3 FORMACIÓN DE BIOFILMS IN VITRO ................................................................................ 85

3.1 Biofilms: Biomasa – CIM-b – CMEB –CMR ................................................................... 85

4 CURVAS DE LETALIDAD Y SINERGIA ANTIMICROBIANA ................................................. 88

5 MÉTODOS GENERALES ..................................................................................................... 90

5.1 Obtención de extractos celulares ............................................................................. 90

Los extractos celulares utilizados en distintos ensayos se obtuvieron mediante el

siguiente protocolo. ................................................................................................................. 90

5.2 Cuantificación proteica .............................................................................................. 91

5.3 SDS-PAGE y SDS-PAGE con posterior renaturalizacion de ß-lactamasas ............. 91

MATERIALES y METODOLOGÍA - PARTE II - Microbiología Molecular Básica ...................... 93

6 MÉTODOS GENERALES ..................................................................................................... 93

6.1 Extracción y purificación del ADN ............................................................................. 93

6.1.1 Mediante técnicas manuales de laboratorio ................................................... 93

6.1.2 Mediante métodos comerciales ......................................................................... 93

6.2 Electroforesis en gel de agarosa para ADN ............................................................. 94

6.3 Detección de ADN plasmídico de gran tamaño .................................................... 94

6.3.1 Extracción de ADN plasmídico de alto peso molecular ................................. 94

6.3.2 Detección de ADN plasmídico mediante PFGE-S1 nucleasa ........................ 94

7 SECUENCIACIÓN DEL ADN .............................................................................................. 96

7.1 Método enzimático de Sanger ................................................................................... 96

7.2 Pirosecuenciación ........................................................................................................ 96

8 GENERALIDADES DEL GENOMA – ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO .................................... 97

9 ANÁLISIS DE LAS RELACIONES FILOGENÉTICAS DE I. limosus MP06 ............................... 99

9.1 Evaluación de genes que podrían contribuir con la identificación molecular .. 99

10 RESISTOMA ...................................................................................................................... 101

10.1 Metodología general del análisis in silico de secuencias genómicas ................ 101

10.1.1 Análisis in silico de posibles bombas de eflujo ................................................ 105

10.1.2 Análisis in silico de posibles ß-lactamasas ........................................................ 105

10.2 Detección fenotípica de bombas de eflujo ........................................................... 106

10.3 Clonado, expresión y purificación de posibles ß-lactamasas ............................. 106

10.3.1 Clonado molecular “al azar” sobre el ADN genómico ................................. 107

10.3.2 Clonado molecular de blaINQ-2 y blaINQ-3 ......................................................... 109

10.3.3 Purificación de la proteína INQ-1 ...................................................................... 111

10.3.4 Purificación de la proteína INQ-2 ...................................................................... 113

3

10.4 Caracterización de las ß-lactamasas ...................................................................... 114

10.4.1 Detección de actividad ß-lactamasa por método iodométrico ................ 114

10.4.2 Detección de actividad ß-lactamasa por el método de la cefalosporina

cromogénica ...................................................................................................................... 115

10.4.3 Detección de ß-lactamasas de tipo AmpC inducibles ................................. 115

10.4.4 Determinación del pI mediante isoelectroenfoque analítico (IEFA) ........... 116

10.4.5 Determinación espectrofotométrica de parámetros cinéticos ................... 116

11 ANÁLISIS IN SILICO: GENES ASOCIADOS A LA FORMACIÓN DE BIOFILM Y EVASIÓN DE

LA RESPUESTA INMUNE .......................................................................................................... 123

11.1 Biofilm: búsqueda de genes reguladores de la formación del biofilm en el

genoma de Inquilinus ............................................................................................................ 123

11.2 Detección de determinantes génicos asociados a la virulencia o de evasión de

la respuesta inmune .............................................................................................................. 123

RESULTADOS y DISCUSIÓN - PARTE I - Microbiología Clínica Aplicada ........................... 125

1 AISLAMIENTOS CLÍNICOS: SU IDENTIFICACIÓN, TIPIFICACIÓN Y CONSERVACIÓN ... 125

1.1 Caracterización fenotípica ....................................................................................... 125

1.1.1 Morfología macroscópica de aislamientos estudiados ................................ 125

1.1.2 Morfología microscópica ................................................................................... 129

1.1.3 Pruebas bioquímicas convencionales de laboratorio, sistema de galerías

API® y sistema automatizado VITEK® ................................................................................ 130

1.1.4 Espectrometría de masa por MALDI-TOF ......................................................... 131

1.1.5 Determinación de los perfiles proteicos totales mediante SDS-PAGE ......... 134

1.2 Caracterización genotípica ...................................................................................... 135

1.2.1 Métodos basados en la secuenciación de segmentos de ADN: ARNr 16S 135

1.2.2 Métodos basados en ADN total ........................................................................ 138

1.3 Combinación de resultados para optimizar la identificación de Inquilinus ...... 138

1.4 Tipificación molecular por PFGE ............................................................................... 143

1.5 Ensayos de conservación .......................................................................................... 145

2 ENSAYOS DE SENSIBILIDAD A DROGAS ANTIMICROBIANAS. DETECCIÓN Y

CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE .................................................................................... 148

MECANISMOS DE RESISTENCIA ............................................................................................. 149

3 FORMACIÓN de BIOFILMS ............................................................................................. 159

3.1 Cuantificación de la biomasa de biofilm formado en ausencia y presencia de

concentraciones sub-CIM de antimicrobianos ................................................................. 159

3.2 Sensibilidad del biofilm formado in vitro .................................................................. 165

4 CURVAS DE LETALIDAD Y SINERGIA ANTIMICROBIANA ............................................... 167

RESULTADOS y DISCUSIÓN - PARTE II - Microbiología Molecular Básica .......................... 171

5 GENERALIDADES: ........................................................................................................... 171

ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO DEL GENOMA DE I. limosus MP06 .......................................... 171

5.1 Métrica de ensamblado y contenido de G+C ...................................................... 171

5.2 Análisis del sesgo en el uso de codones sinónimos ............................................... 176

5.3 Anotación funcional de secuencias codificantes................................................. 178

5.4 Reconstrucción metabólica genómica .................................................................. 181

6 RESISTOMA ...................................................................................................................... 187

6.1 Bombas de eflujo: abordaje bioinformático y fenotípico .................................... 187

6.1.1 Análisis in silico de BE ........................................................................................... 187

6.1.2 Detección fenotípica de BE ............................................................................... 190

6.2 ß-lactamasas: abordaje bioinformático, fenotípico y bioquimico ..................... 192

6.2.1 Clonado molecular “al azar” - Detección y caracterización enzimática.. 192

4

6.2.2 Clonado molecular - Detección y caracterización enzimática ................. 200

6.2.3 Clonado de blaINQ-2 y blaINQ-3. Detección de actividad enzimática ............ 209

6.2.4 Caracterización cinética parcial de la ß-lactamasa INQ-2 ......................... 210

7 ENFOQUES DE LA VIRULENCIA ...................................................................................... 213

7.1 Detección de determinantes génicos asociados a la virulencia y evasión de la

respuesta inmunitaria ............................................................................................................ 213

7.1.1 Determinantes génicos asociados a la formación del biofilm ..................... 220

8 ANÁLISIS DE LAS RELACIONES FILOGENÉTICAS DE I. limosus MP06 ............................... 223

8.1 Evaluación de genes que podrían contribuir con la identificación molecular ..... 223

CONCLUSIONES ..................................................................................................................... 235

RESUMEN ................................................................................................................................ 241

BIBLIOGRAFÍA ........................................................................................................................ 245

ANEXOS ..…………………………………………………………….……………………………….. 261

ANEXO I - Microorganismos y medios de cultivo utilizados ……………………………….. 263

ANEXO II - Tinciones …………………………………………………………………………………265

ANEXO III - Protocolos experimentales ………………………………………………………….267

ANEXO IV - Oligonucleótidos cebadores y amplificación de ADN por PCR ……………277

ANEXO V - Producción científica …………………………………………………………………285

5

INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Árbol filogenético según la secuencia del ARNr 16S. Muestra la posición del

género Inquilinus .......................................................................................................................... 24

Figura 2. Mecanismos de resistencia bacteriana a los antimicrobianos ............................ 35

Figura 3. Estructura terciaria de la ß-lactamasa TEM-1, enzima prototipo de la clase

molecular A .................................................................................................................................. 42

Figura 4. Reacción general y mecanismo de hidrólisis de antibiótico ß-lactámico ......... 45

Figura 5. Diagrama de los componentes y ubicación de las bombas de eflujo de

resistencia a múltiples drogas de las familias RND, ABC y MFS ............................................ 50

Figura 6. Distribución estratégica de discos para la detección fenotípica de ß-

lactamasas, según las recomendaciones de la Subcomisión de Antimicrobianos

(SADEBAC-AAM) .......................................................................................................................... 82

Figura 7. Esquema de la metodología realizada para el clonado de las posibles ß-

lactamasas blaINQ-2 y blaINQ-3 .................................................................................................... 109

Figura 8. Aspecto macroscópico de aislamientos por agotamiento en superficie ........ 127

Figura 9. Observación microscópica (1000 X) de extendidos del aislamiento MP06,

preparados con tinción de Gram y las tinciones para visualización de cápsula

bacteriana de Duguid y Hiss. ................................................................................................... 129

Figura 10. Perfiles de proteínas totales de los aislamientos estudiados y su comparación

con los obtenidos para las cepas de colección, resueltos por SDS-PAGE al 12% ........... 134

Figura 11. Dendrograma resultante del análisis comparativo de las secuencias

codificantes del ARNr 16S ........................................................................................................ 137

Figura 12. Comparación entre aislamientos con características fenotípicas similares

provenientes de PFQ. ................................................................................................................ 142

Figura 13. Patrones de bandas (pulsotipos) de los distintos aislamientos de Inquilinus,

resueltos mediante PFGE por digestión del ADN con las enzimas de restricción XbaI

(izquierda) y BcuI (derecha) .................................................................................................... 144

Figura 14. Aspecto macroscópico del crecimiento microbiano según el método

empleado para la preparación del inóculo, previo a la realización de antibiogramas

por difusión en medio sólido .................................................................................................... 149

Figura 15. Determinación del pI de enzimas ß-lactamasas en el extracto proteico total

de I. limosus MP06, mediante IEFA revelado por método iodométrico en presencia de

CEF ............................................................................................................................................... 155

Figura 16. Comparación de la biomasa formada por los aislamientos (mucosos y no

mucosos), desarrollados en presencia sub-CIM de antibiótico ......................................... 160

Figura 17. Relación entre la biomasa formada por las variantes isogénicas MP13-M y

MP13-NM, desarrollados en presencia sub-CIM de antibiótico ......................................... 161

Figura 18. Relación entre la biomasa formada por aislamientos de fenotipo mucoso (I.

limosus MP13-M, I. limosus 161-13 e I. limosus LMG20952T), desarrollados en presencia

sub-CIM de antibiótico ............................................................................................................. 162

Figura 19. Relación entre la biomasa formada por aislamientos de fenotipo no mucoso

(I. limosus MP13-NM e Inquilinus sp. LMG20953), desarrollados en presencia sub-CIM de

antibiótico ................................................................................................................................... 163

6

Figura 20. Curvas de letalidad para I. limosus MP06 en función del tiempo en presencia

de distintos antimicrobianos y sus combinaciones .............................................................. 169

Figura 21. Histograma de frecuencias de distribución acumuladas del contenido

porcentual de G+C de las lecturas obtenidas en el proceso de secuenciación del ADN

total de I. limosus MP06 ............................................................................................................ 172

Figura 22. Mapa físico de la distribución del sesgo del contenido medio de G+C de la

secuencia particular de cada contig .................................................................................... 173

Figura 23. Mapa físico y génico del contig 1 según la anotación realizada .................. 174

Figura 24. Distribución de las CDS con función biológica asignada en los subsistemas del

RAST según su anotación funcional ....................................................................................... 179

Figura 25. Distribución de las 66 CDS que conforman la categoría “Resistencia a

antibióticos y compuestos tóxicos” según la anotación funcional del servidor RAST para

el genoma de I. limosus MP06 ................................................................................................. 180

Figura 26. Reconstrucción metabólica de la biosíntesis de fitohormonas. Mapeo de las

CDS de I. limosus MP06 en la biblioteca de genes y genomas KEGG .............................. 183

Figura 27. Reconstrucción del metabolismo del azufre; su reducción y fijación ............ 186

Figura 28. Disposición de las CDS para BE-RMD presentes en I. limosus MP06 ................ 188

Figura 29. Detección y caracterización fenotípica de ß-lactamasas en transformante

obtenido por clonado “al azar” a partir del ADN total de I. limosus MP06 ..................... 192

Figura 30. Secuencia traducida de blaINQ-1 .......................................................................... 193

Figura 31. Dendrograma para INQ-1 frente a la secuencia de distintas clases

moleculares de serino-ß-lactamasas ...................................................................................... 194

Figura 32. Entorno génico de blaINQ-1 en I. limosus MP06. Anotación funcional y

contenido porcentual de G+C en el inserto de pK-INQ-1a................................................ 195

Figura 33. Perfiles proteicos de fracción soluble, resueltos por SDS-PAGE al 12%, para la

estimación del grado de purificación de INQ-1 ................................................................... 197

Figura 34. Alineamientos entre secuencias de INQ-1 de I. limosus MP06 y LMG 20952T . 199

Figura 35. Secuencia traducida de blaINQ-2 ........................................................................... 201

Figura 36. Alineamientos entre las secuencias de la posible ß-lactamasa INQ-2 y las ß-

lactamasas de tipo AmpC, PAO1 y OCH-8 .......................................................................... 202

Figura 37. Modelado in silico de la secuencia traducida de blaINQ-2 ............................... 205

Figura 38. Entorno génico de blaINQ-2 en I. limosus MP06. Anotación funcional y

contenido porcentual de G+C de los genes vecinos ........................................................ 206

Figura 39. Secuencia traducida de blaINQ-3 .......................................................................... 208

Figura 40. Entorno génico de blaINQ-3 en I. limosus MP06. Anotación funcional y

contenido porcentual de G+C de los genes vecinos ........................................................ 208

Figura 41. Perfiles proteicos de fracción soluble, resueltos por SDS-PAGE al 12%, para la

estimación del grado de purificación de INQ-2 .................................................................. 210

Figura 42. Reconstrucción del metabolismo de dicarboxilatos y glioxilato .................... 215

Figura 43. Genómica comparativa. Análisis por sintenia génica para establecer la

correspondencia de genes involucrados en la formación de biofilm .............................. 221

Figura 44. Árboles filogenéticos construidos para I. limosus y especies relacionadas .... 225

Anexo III - Figura 45. Vectores empleados. Se observa en detalle los sitios de restricción

que presenta cada vector. A. Vector de clonado molecular pK19. B. Vector de

clonado de expresión pET-28b(+) ........................................................................................... 271

Anexo IV - Figura 46. Posiciones de los oligocebadores utilizados .................................... 279

7

INDICE DE TABLAS

Tabla 1. Características epidemiol. y clínicas que presentan los PFQ con Inquilinus........ 27

Tabla 2. Esquema de clasificación de serino-ß-lactamasas ................................................. 41

Tabla 3. Motivos conservados de los elementos para cada clase molecular de serino-ß-

lactamasa y sus posiciones en la secuencia proteica madura. .......................................... 43

Tabla 4. Resumen de programas online para el análisis in silico de secuencias ............ 103

Tabla 5. Descripción macroscópica de los cultivos en medios de cultivo ....................... 126

Tabla 6. Identificación presuntiva como I. limosus por MALDI-TOF ................................... 132

Tabla 7. Métodos ensayados para la conservación del aislamiento MP06. .................... 147

Tabla 8. Ensayos de sensibilidad - Antibiograma y CIM en aislamientos de Inquilinus ... 151

Tabla 9. Ensayo de desarrollo de Inquilinus en medio BCSA ............................................... 156

Tabla 10. Determinación de los parámetros para evaluar la sensibilidad del biofilm y la

población planctónica. ........................................................................................................... 165

Tabla 11. Análisis in silico del sesgo en el uso de codones sinónimos en la secuencia

codificante de I. limosus. .......................................................................................................... 177

Tabla 12. Determinación de CIM de I. limosus MP06 en presencia y ausencia de

inhibidores e inductores de bombas de eflujo ..................................................................... 191

Tabla 13. Determinación de CIM para I. limosus MP06 y los transformantes de E. coli.

Principales parámetros de la caracterización cinética de INQ-1 ß-lactamasa .............. 198

Tabla 14. Determinación de CIM para I. limosus MP06 y los transformantes de E. coli, y

caracterización cinética preliminar de la ß-lactamasa INQ-2. .......................................... 211

Tabla 15. Productos génicos de I. limosus MP06 con alta similitud frente a bacterias con

distinta relación filogenética. .................................................................................................. 216

Tabla 16. Porcentajes de identidad de secuencias génicas observados entre I. limosus

MP06 y AU476. ............................................................................................................................ 224

Tabla 17. Porcentajes de identidad de secuencias génicas observados entre I. limosus

MP06 y los dos microorganismos que corresponden al mayor hit en los repositorios

públicos. ...................................................................................................................................... 234

Anexo I - Tabla 18. Descripción y procedencia de los microorganismos utilizados ........ 263

Anexo III - Tabla 19. Mezcla de polimerización para SDS-PAGE (12%) .............................. 267

Anexo III - Tabla 20. Mezcla de polimerización para IEFA no desnaturalizante ............... 274

Anexo III - Tabla 21. Longitudes de onda y coeficientes molares de extinción

correspondientes de los antibióticos utilizados para las determinaciones cinéticas. .... 275

Anexo IV - Tabla 22. Cebadores utilizados en este trabajo de tesis .................................. 277

Anexo IV - Tabla 23. Programa gral. para la amplificación de ADN por PCR ................. 280

Anexo IV - Tabla 24. Programa gral. de amplificación de fragmentos de ADN por

Touchdown-PCR ........................................................................................................................ 281

Anexo IV - Tabla 25. Mezcla de reacción para la amplificación del gen ARNr 16S ..... 282

Anexo IV - Tabla 26. Programa para la amplificación del gen ARNr 16S por PCR .......... 282

Anexo IV - Tabla 27. Mezcla de reacción para la amplificación de blaINQ-2 y blaINQ-3 .... 283

Anexo IV - Tabla 28. Programa Touchdown-PCR para blaINQ-2 ........................................... 283

Anexo IV - Tabla 29. Programas 1 y 2 de Nested-PCR para blaINQ-3 ................................... 284

8

9

ABREVIATURAS

Abrev. Compuesto Abrev. Compuesto

ADN Ácido Desoxirribonucleico IMI Imipenem

AHL Acil-homoserinlactona IPTG Isopropil-β-D-1-tiogalactopiranósido

ALev Agar Levine KAN Kanamicina

AMC Amoxicilina-ácido clavulánico k cat Número de recambio - Constante catalítica

AMH Agar Müller Hinton k cat/K M Eficiencia catalítica

AMI Amicacina KEGG Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes

AMP Ampicilina Ki Constante de inhibición competitiva

AMPc Adenosín monofosfato cíclico K M Constante de Michaelis-Menten

AmpC ß-lactamasa clase C LB Luria-Bertani

AMS Ampicilina-sulbactama LBA Luria-Bertani Agar

AMX Amoxicilina LEV Levofloxacina

APC Ampicilina-ácido clavulánico MER Meropenem

ARN Ácido Ribonucleico MIN Minociclina

ATM Aztreonam NAL Ácido nalidíxico

AZI Azitromicina NH3 Amoníaco

BCSA Agar Selectivo para Burkholderia cepacia NIT Nitrofurantoína

BE Bombas de Eflujo NitTM

Cefalosporina cromogénica - NitrocefinTM

BE-RMD Bombas de Eflujo de Resistencia a Múltiples Drogas DOR Doripenem

BGN Bacilo Gram Negativo TIG Tigeciclina

BGNNF Bacilo Gram Negativo No Fermentador ERT Ertapenem

BHI Infusión Cerebro Corazón (caldo) FIX Cefixima

BHIA Infusión Cerebro Corazón (agar) ntds Nucleótidos

BOR Ácido 3-fenilborónico OXA Oxacilina

BSA Seroalbúmina bovina PAßN Fenil-arginil-alanil-ß-naftilamida

CAR Carbencilina PBP proteínas de unión a la penicilina

CAZ Ceftacidima PCR Reacción en Cadena de la Polimerasa

CdG Ciclo del glioxilato PEG Genes codificantes de proteinas - protein-encoding genes

CDS Secuencia de ADN codificante - coding-DNA sequence PEN Penicilina

CEF Cefalotina PFGE Electroforesis en gel de campo pulsado

CEP Cefpirome PFQ Paciente fibroquístico

CFZ Cefazolina PGAAP Prokaryotic Genomes Annotation Pipeline 2.0

CIM Concentración Mínima Inhibitoria pI Punto isoeléctrico

CIM-b Concentración Inhibitoria Mínima del biofilm PIP Piperacilina

CIP Ciprofloxacina PM Peso Molecular

CLI Clindamicina STR Estreptomicina

CLO Cloramfenicol ERI Eritromicina

CLOX Cloxacilina POL Polimixina B

CLSI Clinical Laboratory Standards Institute PZT Piperacilina-tazobactam

CMEB Concentración Mínima de Erradicación del biofilm RAST Rapid Annotation using Subsystem Tecnology

CMH Caldo Müller Hinton RES Reserpina

CMR Concentración Mínima de Re-crecimiento RIF Rifampicina

COL Colistina RND Resistance/Nodulation/Division

CRO Ceftriaxona SAL Salicilato de sodio

CTX Cefotaxima SDS Dodecil sulfato de sodio

FUR Cefuroxima SDS-PAGE Electroforesis en geles de poliacrilamida desnaturalizantes

DES Desoxicolato de sodio SF Solución Fisiológica

di-GMPc di-guanosina monofosfato ßLEA ß-lactamasa de espectro ampliado

FOS Fosfomicina ßLEE ß-lactamasa de espectro extendido

EBE Estimuladores de bombas de eflujo sub-CIM Concentración sub-Mínima Inhibitoria

EDTA Ácido Etilendiaminotetraacético SUL Sulbactama sódica

EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing TAZ Tazobactam

FEP Cefepime TCA Ciclo de los ácidos tricarboxílicos

VAN Vancomicina TET Tetraciclina

FOX Cefoxitina TMS Trimetoprima/Sulfametoxazol

FPLC Fast Performance Liquid Chromatography TOB Tobramicina

FQ Fibrosis Quística Tris Tris(hidroximetil)aminometano

G+C Guanina y Citosina (contenido) TSA Tripteína soja Agar

GEN Gentamicina TSB Caldo Tripteína Soja

H2S Sulfhídrico X-Gal 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranósido

IAA Ác. 3-indol-acético PAMP Patrones Moleculares Asociados a Patógenos

IBE Inhibidores de bombas de eflujo MALDI-TOF Espectrometría de masa - Matrix-Assisted Laser

IEFA Isoelectroenfoque analítico Desorption/Ionization, Time of Flight

IMAC Cromatografía de afinidad de metal inmovilizado

10

11

GLOSARIO BIOINFORMÁTICO

Análisis in silico. El análisis en un entorno informático (in silico) es un tipo de

experimentación biológica, al igual que los ensayos realizados sobre un ser vivo

(in vivo) o en un entorno artificial (in vitro). No es una modalidad marginal o

pasajera y representa la parte básica de la mayoría de los avances más

recientes en el campo de la biología. Cuando se realiza un análisis desde el

punto de vista informático se asume que, si como resultado del proceso se

predijo un determinado gen, con una función biológica asociada, se considera

como certeza, pues existe suficiente evidencia (no necesariamente

experimental sobre el mismo gen en particular), sobre la cual se realizó la

predicción [3-5].

Algoritmo. Lista bien definida, ordenada y finita de operaciones que permiten

hallar la solución a un problema. Problemas complejos, requieren algoritmos

complejos. Son los algoritmos los que le darán confiabilidad a la predicción

realizada.

Programa (Software). Implementación computacional de un algoritmo,

mediante el uso de un determinado lenguaje de programación. Los lenguajes

de programación más usados en bioinformática son Perl, R y Matlab.

Minería de datos (Data mining). Extracción no trivial de información que reside

de manera implícita en los datos. Los datos, per se, no son lo relevante, sino los

patrones, relaciones y estructura que encierran. Se basa en el análisis estadístico

e inteligencia artificial [6].

Pipeline. Se refiere a las herramientas que permiten el análisis de datos y

expresión de resultados que no es definitivo (“gestión”), sino que están

sometidas a un constante análisis y por lo tanto su posible cambio. Se llama así

a las plataformas para el análisis y la gestión de cualquier tipo de datos a partir

de la secuencias genómicas, metagenómicas y transcriptómicas, pues

constantemente se enriquecen con nuevas secuencias y evidencia

experimental o in silico. El análisis de secuencias y su anotación funcional, están

en constante cambio a medida que la minería de datos va cambiando y los

algoritmos de las plataformas se van complejizando. Por ejemplo, el genoma

aquí estudiado hoy presenta 7170 genes, de los cuales 6229 son secuencias de

ADN codificantes (coding-DNA sequences, CDS). Estas cantidades podrían

cambiar al aplicar otros algoritmos. La herramienta de anotación funcional de

procariontes que utiliza el NCBI, denominada PGAAP (Prokaryotic Genomes

Annotation Pipeline 2.0), es un pipeline [7].

12

Lecturas - Profundidad o cobertura de la secuenciación. Las lecturas o reads son

secuencias cortas de ADN, de tamaño variable, obtenidas mediante el empleo

de plataformas de secuenciación genómicas o metagenómicas, como la

plataforma de pirosecuenciación 454-Roche. Corresponden a lo que

comúnmente se denomina “lectura cruda” o short-read archive (SRA) y

representa la salida de secuencias sin procesar, directamente desde la

plataforma. Durante el proceso de secuenciación, las distintas regiones de un

genoma son secuenciadas en forma azarosa (en mayor o menor proporción),

con el objetivo final de que todas las regiones del genoma estén realmente

secuenciadas. Este es el concepto de “profundidad o cobertura” del proceso

de secuenciación, que es un estimador del número de veces que se secuenció

cada región del genoma. A mayor número de lecturas obtenidas, mayor es la

probabilidad de que se hayan secuenciado el genoma en su totalidad. Cuanto

mayor sea el tamaño genómico, será necesario obtener un mayor número de

lecturas, para que la profundidad o cobertura del proceso sea óptima [6].

El cálculo de cobertura (coverage) consiste en la siguiente fórmula:

Cobertura = bases secuenciadas (acumuladas) / tamaño estimado de genoma

Cobertura= 148.316.117 bases acumuladas /6.934.542 pb = 21,38 X.

Este resultado numérico expresado como “21,38 X” significa que cada base del genoma fue

secuenciada en promedio 21 veces según las estimaciones realizadas.

Contigs - Scaffolds - Montaje de genoma. Luego que las regiones del genoma

fueron leídas múltiples veces, las secuencias cortas obtenidas (lecturas) pueden

solaparse. Los solapamientos cortos se denominan contigs. Cuando varios

contigs solapan entre sí, forman estructuras más grandes que se denominan

scaffolds. No existe un tamaño que defina a uno u otro. Entre los sucesivos

contigs o scaffolds existe una zona en la que se desconoce la secuencia de

ADN y representa una brecha o gap en la secuencia de ADN. Es posible estimar

el tamaño de esta brecha de ADN (gap) e incluso suponer la secuencia que

podría contener cuando existe un genoma de referencia, entonces esos contigs

ya no se denominan como tales y se los llama scaffolds. Por lo que la

clasificación del grado de solapamiento como contig o scaffold es algo

subjetivo, e indica el grado de ensamblaje que presenta una secuencia.

Debido al gran volumen de datos que se desea solapar o “ensamblar”, se

realiza este proceso utilizando distintos programas ensambladores para realizar

este montaje del genoma. El proceso de ensamblado puede realizarse solo

utilizando las lecturas obtenidas de ese proceso (ensamblado de novo). O bien,

empleando las SRA en bases de datos (NCBI-SRA) provenientes de otro proceso

de secuenciación o cualquier otro tipo de secuencia de ADN que sirva de

referencia. La finalidad del proceso de ensamblaje es obtener una secuencia

consenso, la cual se considera que es la reconstrucción más próxima a la real

[3, 8].

13

Anotación de secuencias: 1) Estructural. Identifica la ubicación de los genes,

promotores, pseudogenes, y ARN (ARNr, ARNt, etc.), y regiones no traducidas. 2)

Funcional. La anotación funcional predice y define el rol (biológico) de las

estructuras genéticas codificadas en la secuencia de ADN. Inicialmente localiza

los genes al identificar los marcos de lectura abierta u ORF automáticamente y

asigna la función biológica al caracterizar la secuencia bajo algún algoritmo [3-

5]. Estos algoritmos pueden contemplar la similitud/identidad de secuencias, la

ortología y la sintenia génica, entre otros posibles (ver más adelante).

Alineamiento de secuencias. El alineamiento de secuencias biológicas consiste

en establecer un segmento entre ellas donde el número de coincidencias sea

máximo. Una coincidencia se presenta cuando el nucleótido de la secuencia A

sea igual al nucleótido en la secuencia B. Al estudiar alineamientos de

secuencias, se puede trabajar con solo 2 secuencias o tratarse de

alineamientos múltiples. A la vez, pueden analizarse ambos grupos mediante

algoritmos con niveles de análisis distintos: Alineamiento global: Consiste en

buscar sub-secuencias grandes que coincidan en las secuencias bajo estudio.

Menos específico, más rápido, resultados más variados. Por ejemplo, los

algoritmos BLASTP y BLASTN. Alineamiento local: consiste en buscar las

coincidencias nucleótido a nucleótido (ácidos nucleicos) o aminoácido a

aminoácido (proteínas). Por ejemplo, los algoritmos PSI-BLAST y PHI-BLAST.

http://blast.be-md.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Este programa encuentra regiones

de similitud entre secuencias. Mediante la comparación de secuencias de

aminoácidos o de nucleótidos frente a distintas bases de datos, calcula la

significancia estadística de los alineamientos. Permite inferir sobre las relaciones

funcionales o evolutivas entre secuencias así como puede ayudar a identificar

miembros de familias génicas. PSI-BLAST (Position-Specific Iterative BLAST). El

usuario puede construir una matriz de tipo PSSM (position-specific scoring matrix)

con los resultados de un BLASTP inicial. PHI-BLAST (Pattern Hit Initiated-BLAST).

Realiza la búsqueda pero solo alinea los resultados respetando una breve

secuencia exacta de aminoácidos. Para la búsqueda de ß-lactamasas, por

ejemplo, se puede iniciar la búsqueda en base a la secuencia de algún motivo

conservado como el sitio de serina “SXXK”, en las posiciones señaladas como

“XX” buscará cualquier aminoácido, pero respetará exactamente los 2 residuos

laterales.

Similitud vs. Identidad. Cuando se analizan secuencias es común utilizar los

términos similitud/identidad y homología de forma indiscriminada, pero estos

dos términos hacen referencia a conceptos distintos. La similitud es el resultado

de una medida cuantitativa, la homología es una hipótesis postulada por el

investigador basándose en la similitud de las secuencias y en otros datos

14

biológicos que previamente conozca sobre el origen de dichas secuencias. Es

correcto establecer el porcentaje de similitud o identidad entre dos o más

secuencias, pero esto no es posible para la homología, ya que las secuencias

son o no son homólogas. Es el resultado del análisis (observación cuantitativa)

de la estructura primaria de dos o más secuencias; las secuencias pueden ser

ácidos nucleicos o proteínas. Puesto que se refiere a la simple observación de

las secuencias no puede ser tomada como un indicador para establecer la

relación biológica (descendencia) entre las secuencias, ya que el grado de

similitud puede deberse a cambios aleatorios acumulados en las secuencias a

través del tiempo. Cuando se analizan secuencias proteicas el término

identidad indica que el residuo de aminoácido es el mismo para las secuencias

comparadas. Si el cambio de residuos ocurre manteniendo las propiedades

fisicoquímicas, es considerado como similitud [4].

Homología. La homología es una medida cualitativa entre las secuencias se

presenta cuando la similitud que estás tienen es atribuible a razones evolutivas y

no al azar, es decir, la homología establece regiones entre las secuencias que

se han conservado con el tiempo. Dos secuencias son homólogas si están

relacionadas por divergencia de un ancestro común. No implica que

necesariamente deba existir similitud de secuencia. La homología de

secuencias puede deberse a que la relación de estos genes es como genes:

Ortólogos: tienen una misma función aunque estén en 2 especies distintas,

porque ambas comparten un antepasado en común, pues se originaron por

un evento de especiación (divergencia por especiación).

Parálogos: poseen funciones distintas, y ambos se encuentran en un mismo

organismo, donde un gen proviene de un evento de duplicación del otro.

Xenólogos: el gen se encontraba originalmente en otra especie, su

localización actual es producto de la transferencia horizontal de genes.

Como no es posible contemplar la historia de grupos de genes homólogos, en la

mayoría de los estudios se adopta una definición más práctica de ortología,

que es la de equipararlos a los llamados Best Bidireccional Hits (BBHs). Según

esta definición, dos proteínas P1 y P2, de los organismos O1 y O2,

respectivamente, son ortólogas (o BBHs) si P1 es la proteína más similar a P2 en el

organismo O1, y viceversa. Y se imponen dos restricciones más: que la similitud

tenga una puntuación por encima de cierto valor (en el caso de BLAST, el e-

value debe ser menor de 1e-5) y que las regiones de similitud entre las dos

proteínas cubran, al menos, el 75% de sus longitudes (cuando ocurre esto el

BLAST asigna un score alto).

15

KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes): La base de datos KEGG

(Enciclopedia de genes y genomas de Kyoto) organiza secuencias como

grupos de ortólogos basados en la ortología génica, (y no necesariamente en la

similitud de secuencia), este es el motor de la búsqueda. Estos son conjuntos de

secuencias homólogas de la más amplia gama de organismos como sea

posible que tengan una función molecular asignada. Estas funciones están

dispuestas de manera jerárquica y se agrupan en las vías biológicas. De esta

forma los genes identificados son mapeados automáticamente en KEGG

pathways y asignados a las jerarquías de la ontología BRITE (Boston university

Representative Internet Topology gEnerator) (denominación informativa acerca

de los genes, ver más abajo en “GO”). KEGG incluye a 16 bases de datos

clasificadas en información de sistemas, información genómica e información

química, cada una con un código de color. Sirve para analizar las funciones y

utilidades de un sistema biológico con base en información molecular

generada por secuenciación de genomas. KEGG ofrece redes moleculares,

que son modelos que muestran interacción molecular, reacciones y relaciones

entre elementos de un sistema biológico; estos modelos se construyen a partir

de datos en la literatura y se organizan en tres grupos: KEGG PATHWAY (vías

metabólicas), KEGG BRITE (ontología génica) y KEGG MODULE y DISEASE. KO

(KEGG Ortology). En éste se definen de forma manual grupos de ortólogos que

corresponden a nodos de vías depositadas en KEGG y nodos jerárquicos de

BRITE. http://www.genome.jp/kegg/

COG (Clusters of Orthologous Groups of proteins). Los COG son grupos de

proteínas ortólogas que se obtienen al comparar las secuencias de proteínas en

genomas completos, que guardan una relación filogenética. Cada COG está

compuesto por proteínas individuales o grupos de parálogos de al menos 3

linajes y corresponde, por tanto, a un dominio conservado. Establecen una

clasificación filogenética para las proteínas codificadas en un genoma, a través

de los genes codificantes predichos o codificantes de proteínas (protein-coding

genes, PEG). Constituye una forma de anotación funcional, que además brinda

rápida información descriptiva de los sistemas y categorías en los que podría

estar implicado ese PEG. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/

GO (Gene Ontology u ontología de genes.). Iniciativa en bioinformática cuya

meta es estandarizar la representación de un gen y de su producto en

diferentes especies y bases de datos. Provee un vocabulario controlado de

términos para describir las características del producto del gen así como

herramientas para acceder y procesar a la información. La GO desarrolla

vocabularios biológicos, aplicables a todas las especies, con el propósito de

anotar los productos génicos de forma consistente en las diferentes bases de

datos. GO abarca todos los procesos biológicos, y permite una comunicación

16

con vocabularios estandarizados dentro de la comunidad científica. Las

evidencias experimentales enriquecen este tipo de motores de búsqueda para

el análisis funcional de los genomas. Las ontologías con las que actualmente

cuenta son función molecular, proceso biológico y componente celular. [9].

http://geneontology.org/

Sintenia génica. Se refiere a la conservación del contexto o vecindario génico.

Se basa en la observación de que existe un cierto porcentaje de genes cuyo

vecindario está conservado entre diferentes organismos. Un ejemplo de una

situación más evidente de conservación de grupos de genes es representado

por los operones conservados de procariotas, como el operón lactosa. Por

tanto, se asume que dos genes con vecindario génico similar pueden presentar

la misma función, con una probabilidad más alta que la que se esperaría por

azar [10, 11]. Cuando se conserva el orden de los genes se define a esta

situación como la existencia de sintenia. La anotación de genes puede ser

realizada basada en sintenia.

GenBank. Base de datos de secuencias genéticas del NIH (National Institutes of

Health, EEUU), en la que se encuentran a disposición del público secuencias de

ADN. Está integrada por la base de datos de Japón [DNA DataBank of Japan

(DDBJ)], el Laboratorio Europeo de Biología Molecular [European Molecular

Biology Laboratory (EMBL)] y el GenBank del National Center for Biotechnology

Information. Actualmente es la base de datos curada con mayor número de

secuencias integradas que existe en el mundo, conformadas y compartidas

entre DDBJ/EMBL/GenBank. Para obtener datos se pueden buscar

identificadores de secuencia con Entez Nucleotide, que está dividida en tres

grupos: CoreNucleotide, dbEST y dbGSS. Para alinear secuencias se puede usar

BLAST, que obtiene información independientemente de los tres grupos

mencionados. http://www.ddbj.nig.ac.jp/ http://www.embl.de/

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank

Swiss-Prot. Es la sección manualmente anotada y revisada de la base de datos

UniProtKB. Al igual que el Protein Data Bank (PDB), es una base de datos no

redundante, de secuencias de proteínas de alta calidad. Integra resultados

experimentales, datos computacionales y conclusiones obtenidas de la

literatura. Las secuencia depositadas corresponden a proteínas que se

encuentran bien caracterizadas, con estructura tridimensional, función,

modificaciones post-traduccionales y variantes dilicidadas. Estas bases resultan

particularmente útiles para realizar modelados in silico de secuencias

traducidas, porque se modela (en forma computacional) la secuencia posible

sobre una con estructura cristalina definida, realizando así modelados más

certeros, no ab initio [4]. http://web.expasy.org/docs/swiss-prot_guideline.html

17

RAST (Rapid Annotations using Subsystems Technology). El servidor identifica

proteínas codificadas y los genes de ARNr y ARNt, asigna funciones a los genes

y predice cuales subsistemas están representados en el genoma. Utiliza la

información dilucidada para reconstruir la red metabólica a la vez que permite

una visualización “amigable” de los resultados. Asimismo, los resultados de las

asignaciones realizadas por el RAST pueden ser depuradas (“curadas”)

manualmente por el usuario [12]. Es un servicio de anotación totalmente

automatizado para genomas completos, o casi completos, para arqueas y

bacterias. ). La plataforma asigna 2 clases de funciones génicas: la inclusión o

no en un subsistema. Subsistemas (del RAST): están definidos (por default) como

un conjunto de funciones (vía metabólica, complejo o clase de proteínas) que

un anotador decide que deben considerarse como relacionadas. Cada

subsistema está definido por un determinado algoritmo y su vez varios

subsistemas pueden presentar un mismo algoritmo. Existen unos 600 subsistemas

pre-definidos sobre los que pueden ser clasificados y asignados funcionalmente

los genes que se analicen. En el transcurso del 2014, la base se amplió en forma

notoria por el uso y aporte de los usuarios. http://rast.nmpdr.org/

GLIMMER (Gene Locator and Interpolated Markov ModelER). Es un sistema que

permite predecir genes en genomas de bacterias, arqueas y virus. Utiliza

modelos interpolados de Markov para identificar las regiones codificantes y

distinguirlas de las no codificantes. Este programa es utilizado por el servidor

RAST como predictor [13, 14]. https://ccb.jhu.edu/software/glimmer/

18

19

INTRODUCCIÓN

1 Inquilinus limosus: SU RELEVANCIA EN LOS PACIENTES CON

FIBROSIS QUÍSTICA

1.1 Breve reseña acerca de la fibrosis quística y de la relevancia que presentan las

infecciones broncorespiratorias en los pacientes fibroquísticos

La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad producida por mutaciones en el gen

cftr, localizado en el cromosoma 7 (7q3.1). Este gen codifica para la proteína

reguladora transmembrana CFTR (del inglés, Cystic Fibrosis Transmembrane

Regulator) de 1480 aminoácidos, comúnmente denominada como regulador

de la conductancia transmembrana. Han sido reportadas más de 1500

mutaciones naturales causantes de la enfermedad y sus frecuencias varían en

las diferentes poblaciones (éstas pueden ser consultadas en la base de datos

Cystic Fibrosis Mutation Database [15]). La FQ representa la enfermedad

hereditaria autosómica recesiva más frecuente en la población de origen

caucásico. Se presenta en 1 de cada 2000 a 2500 nacidos vivos. Un individuo de

cada 20 a 25 resulta ser portador del gen mutado [16].

Las mutaciones en cftr ocasionan alteraciones en el transporte iones,

principalmente cloruros a través de las membranas apicales de las células

epiteliales donde se localiza la proteína CFTR. Esto ocasiona la presencia de

secreciones espesas en las vías aéreas, páncreas, intestino y conducto

deferente [16]. Las principales manifestaciones clínicas de la enfermedad son

infecciones pulmonares crónicas recurrentes provocadas por las secreciones

obstructivas de las vías respiratorias que favorecen la infección bacteriana, y el

mal funcionamiento del páncreas exócrino que produce un síndrome de mala

digestión (lo que conduce a una mala absorción y su consecuencia, un estado

20

de malnutrición general). De forma que la FQ se presenta como una

enfermedad multiorgánica [16].

En los últimos 20 años se ha registrado un gran incremento en la expectativa de

vida de los pacientes fibroquísticos (PFQ), principalmente en países

desarrollados, según la tendencia de sus informes anuales [17, 18]. En 1986 se

estimaba en 27 años de edad la mediana de la edad de supervivencia.

Actualmente se registra en unos 37,4 años de edad aproximadamente.

Asimismo, el incremento en la supervivencia de estos pacientes también se

encuentra acompañado por sustanciales mejoras en su calidad de vida

(actividades deportivas, laborales, relaciones sociales, etc.) [17].

Sin embargo las infecciones del tracto respiratorio conducen a un rápido

deterioro de la función pulmonar [19], de forma que siguen siendo la principal

causa de morbilidad y mortalidad en esta población [20, 21].

Los típicos patógenos que se aíslan del esputo de los PFQ incluyen

principalmente a Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa,

Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae y organismos del complejo

Burkholderia cepacia [22]. Además, los pulmones de los PFQ parecen proveer el

nicho ecológico adecuado para el crecimiento de una amplia variedad de

bacterias inusuales solo infrecuentemente asociadas con enfermedades en

humanos [1]. Del esputo de estos pacientes pueden ser recuperados, entre

otras, bacterias no fermentadores de la glucosa como Ralstonia pickettii,

Achromobacter xylosoxidans, Stenotrophomonas maltophilia y Burkholderia

gladioli [22, 23]. Las infecciones oportunistas son usuales en estos pacientes

debido a su estado inmunitario afectado [24, 25].

Si bien en las vías aéreas de los pacientes más jóvenes se observa una mayor

diversidad de microorganismos aislados, mientras que en pacientes mayores se

observa el establecimiento de comunidades de patógenos asociados con una

función pulmonar deficiente [27], algunos estudios sugieren que diferentes

mutaciones presentes en el gen cftr podrían proveer nichos con características

21

diferentes, que repercutirían en la abundancia bacteriana, y favorecerían el

establecimiento de diferentes microorganismos o subpoblaciones de ellos.

La mutación más frecuente, a nivel global, es la denominada ΔF508, que

consiste en la deleción de 3 pares de bases (pb) en el gen, resultando en la

pérdida del aminoácido fenilalanina en la posición 508 de la proteína. Esta

mutación es la lesión genética más severa para homocigotas [26].

En los pacientes heterocigotas para las mutaciones ΔF508 y no ΔF508 se han

observado diferencias importantes en el perfil de microorganismos aislados en

adultos de mayor edad. En los heterocigotas ΔF508 predomina la recuperación

de miembros de las familias Moraxellaceae y Sphingobacteriaceae, dos familias

bacterianas que recientemente han sido asociadas con la enfermedad

pulmonar obstructiva crónica. Mientras que en los pacientes no ΔF508 los

microorganismos recuperados se asocian a un perfil relativamente menos claro

[28]. La mutación homocigótica ΔF508 está asociada con el cambio más

sustancial en la estructura de la comunidad bacteriana, y lleva a una reducción

de la variedad filogénica microbiana de las vías respiratorias en pacientes de

mayor edad, con predominio de miembros de la familia Pseudomonadaceae

por sobre otras familias bacterianas [27].

Como la colonización del tracto respiratorio por microorganismos patógenos se

produce desde edad temprana [20] y se torna crónica en la vida adulta

temprana, los pacientes suelen recibir terapias antimicrobianas durante

períodos prolongados, además de glucocorticoides para reducir la reacción

inflamatoria (principalmente pulmonar) y otras medicaciones asociadas con la

función digestiva alterada que presentan. Distintos estudios han mostrado que

una terapia antimicrobiana precisa y adecuada es de gran importancia para

evitar una rápida destrucción de la función pulmonar y la diseminación de

patógenos altamente virulentos y/o la multirresistencia [29].

En la FQ es importante una correcta identificación de los patógenos presentes,

ya que en ésta subyacen las medidas de control efectivas para contener la

infección y que deben servir de guía para la intervención terapéutica [30]. No

22

obstante, en muchos casos poder aislar e identificar las bacterias provenientes

del esputo de los PFQ suele ser difícil. Los métodos convencionales utilizados

para su aislamiento usualmente consisten en el uso de medios selectivos

adaptados para el cultivo de numerosos patógenos [31]. Sin embargo, estos

sólo detectan una pequeña proporción de las bacterias presentes en el tracto

respiratorio de estos pacientes, frecuentemente identificadas en forma

incorrecta mediante métodos fenotípicos comerciales, de forma que se

subestima a la compleja comunidad microbiana presente en esta patología

pulmonar [32]. Además el empleo de técnicas basadas en cultivo resulta

frecuentemente inadecuado para detectar bacterias fastidiosas o emergentes,

agravado por el hecho que estas muestras son por lo general polibacterianas e

inclusive podrían presentar hongos [33].

La complejidad diagnóstica se ve incrementada ya que aún después del

aislamiento, la correcta identificación es a menudo difícil debido a variaciones

fenotípicas [34]. A modo de ejemplo, mientras que la mayoría de los

aislamientos clínicos de P. aeruginosa son fáciles de identificar, los provenientes

de muestras respiratorias de los PFQ pueden presentar un desafío en cuanto a

su identificación taxonómica, por la presencia de atipias y un lento crecimiento

[35, 36].

La epidemiología asociada a estas infecciones es cambiante, pues se

reconocen incrementos en las tasas de infección y la emergencia de especies

bacterianas que no habían sido previamente asociadas a FQ, como Inquilinus

limosus, entre otros [21].

23

1.2 El género Inquilinus en el ámbito hospitalario

En 1999, Pitulle et al [37] reportaron un aislamiento no identificable, la cepa

DS15158, como un bacilo gram negativo “muy mucoide” (literalmente en su

descripción) que había sido recuperado de una PFQ de 22 años luego de

haber recibido, en forma reciente, un transplante respiratorio bilobular,

procedente de 2 familiares sanos, no fibroquísticos. Basado en el análisis de la

secuencia del gen codificante para el ARNr 16S y su caracterización

bioquímica, concluyen que la cepa DS15158 representa un nuevo género

bacteriano perteneciente a la clase Alfaproteobacteria.

Fue recién en el año 2002, cuando este nuevo género, Inquilinus, fue descripto

por Coenye et al [1] al examinar 8 aislamientos provenientes de pacientes con

FQ. Estudios basados en taxonomía polifásica (incluyendo el análisis de

proteínas celulares y de ácidos grasos, la secuenciación del ARNr 16S, estudios

de hibridación ADN-ADN y pruebas fenotípicas) mostraron que los aislamientos

provenientes de secreciones respiratorias de estos 8 pacientes estadounidenses,

pertenecían a una nueva taxa que no había sido (o solo raramente) reportado

en PFQ.

De acuerdo a las secuencias del ARNr 16S, estos aislamientos evidenciaron un

porcentaje de similitud entre sí mayor al 99,5%; el análisis filogenético los

confirmó como pertenecientes a la clase Alfaproteobacteria, pero solo

lejanamente relacionados con P. aeruginosa y organismos del complejo B.

cepacia (ambos típicos patógenos de PFQ), siendo sus vecinos más cercanos

los miembros del género Azospirillum (< 88,6% de similitud) [1] (Figura 1). De esta

forma, algunos aislamientos fueron clasificados en una nueva especie: Inquilinus

limosus, mientras otros, aunque se sabe que pertenecen a éste género, no se les

ha podido asignar especie con certeza.

24

Figura 1. Árbol filogenético según la secuencia del ARNr 16S. Muestra la posición del

género Inquilinus. La barra de la escala representa el 10% de diferencias de entre

secuencias. Extraído del trabajo publicado por Coenye et al, 2002 [1]

El nuevo género Inquilinus fue definido como “el habitante de un lugar que no

es el propio”. En la caracterización realizada se lo describe como un bacilo

gram negativo (BGN), no esporulado, no pigmentado, con actividad catalasa,

aislado de las secreciones de los PFQ. Capaz de desarrollar entre 25 y 42°C, y en

presencia de NaCl 1%, pero no cuando la concentración es del 10%. Sin

capacidad para reducir nitratos a nitritos, ni de producir indol. Carente de la

actividad de las enzimas lisina decarboxilasa, ornitina decarboxilasa y arginina

dehidrolasa. Respecto del metabolismo de hidratos de carbono, no utiliza

glucosa, manitol, inositol, sorbitol, ramnosa, sacarosa, melibiosa, arabinosa,

amigdalina ni citrato. El contenido porcentual de G+C del genoma se

estableció mediante cromatografía líquida de alta performance en un rango

entre 70,3 y 70,9 %. Esta descripción coincide con la que presenta la cepa tipo

de I. limosus (I. limosus AU0476), cuyo epíteto especifico significa “lleno de limo”,

por el aspecto mucoso que presentan las colonias. La cepa tipo se aisló en 1998

en Estados Unidos, de las secreciones respiratorias de un PFQ [1].

El género Inquilinus fue ubicado dentro de la familia Rhodospirillaceae.

25

Respecto de la situación taxonómica del género, en el año 2011, Jung et al [38]

caracterizaron una nueva especie, Inquilinus ginsengisoli, recuperada de

muestras de suelo de campos de cultivo de ginseng en Corea del Sur. Hasta el

momento no se ha aislado esta especie en muestras humanas.

1.3 Inquilinus limosus: su relevancia en los PFQ

Luego de su descripción, surgieron reportes mencionando

colonizaciones/infecciones especialmente en PFQ. En la Tabla 1 se resumen las

características epidemiológicas y clínicas que presentaron los PFQ con

Inquilinus, los que se mencionarán en el análisis posterior.

Inquilinus sp. e I. limosus se han recuperado en pacientes de todos los grupos

etarios. Estos pacientes presentaron manifestaciones clínicas variadas en el

momento en que se lo recuperó de las secreciones respiratorias, desde cuadros

estables hasta exacerbaciones. El bajo número de reportes no permite dilucidar

algún tipo de asociación que pudiera existir entre la presencia de Inquilinus en

PFQ con una determinada mutación en cftr, pues en general no es reportada

por los autores.

Ciertas características surgen sistemáticamente en el análisis de estos reportes:

a) La dificultad para recuperar al microorganismo de muestras respiratorias de

los PFQ.

b) La dificultad para identificarlo en forma certera.

c) La presencia de un perfil natural de multirresistencia a antimicrobianos.

d) La colonización/infección durante períodos prolongados (persistencia), o

sea, su difícil erradicación.

1.3.1 Dificultad para recuperar a Inquilinus de muestras clínicas

Uno de los microorganismos que usualmente se recupera de las secreciones

respiratorias de los PFQ es P. aeruginosa con fenotipo mucoide, que invade

toda la superficie del medio agarizado en las placas de Petri, lo que dificulta

aislar otras bacterias [33] ya que enmascaran el desarrollo de microorganismos

26

de crecimiento más lento (como Inquilinus), que requieren normalmente entre 3

a 6 días para su aislamiento primario (Tabla 1) cuando se recupera de muestras

respiratorias.

Asimismo, su recuperación puede ser dificultosa por el contexto polimicrobiano

que suele presentar este tipo de muestras, en las que además de P. aeruginosa

pueden recuperarse diversos organismos como Proteus mirabilis,

Staphylococcus aureus, Achromobacter xylosoxidans, Aspergillus fumigatus,

Haemophilus influenzae, Serratia marcescens, Stenotrophomonas maltophilia,

etc.

En diferentes ocasiones se ha sugerido la presencia de Inquilinus en las

secreciones respiratorias de los PFQ, aún mucho antes de poder conseguir su

desarrollo a partir de la muestra de esputo, tanto mediante técnicas

moleculares por amplificación por PCR en tiempo real [39] como por detección

de IgG específica frente a antígenos específicos de I. limosus [40].

1.3.2 Dificultad para su identificación certera

La identificación de Inquilinus mediante pruebas fenotípicas convencionales de

laboratorio, sistemas de galerías comerciales y métodos automatizados no

parece resultar adecuada. De acuerdo a lo descrito en la literatura, dentro de

la misma especie existe variabilidad en muchas pruebas bioquímicas

importantes desde el punto de vista de la caracterización de aislamientos como

la presencia de oxidasa, ureasa, ß-galactosidasa, α-glucosidasa, γ-L-glutamil

aminopeptidasa, gelatinasa, o el desarrollo en medios de cultivo como el agar

selectivo para Burkholderia cepacia (BCSA) o en caldo con 6% de NaCl, por

mencionar solo algunas [1, 37, 41, 42].

27

Tabla 1. Características epidemiológicas y clínicas que presentan los PFQ con Inquilinus

Edad a

/ Sexo

Manifestación Clínica

(primer aislamiento) Mutación cftr

Tiempo de

incubación

(días)

Identificación b

Fenotípica

inicial

Otros patógenos

asociados Referencia

22/F Neumonía - - AR PA, PM [37]

17/M Estable - 6 SP SA, PA, CA [41]

14/F Estable - 5 SP PA, AF, CA [41]

12/M Estable ΔF508/ΔF508 - SP PA, SM, SA, AX [42]

13/F Exacerbación ΔF508/ΔF508 - SP PA, SA, AF [42]

8/M Estable ΔF508/ΔF508 - SP PA [42]

10/M Estable ΔF508/ΔF508 - SP Ninguno [42]

18/M Exacerbación ΔF508/ΔF508 - AR PA, SA, AF [42]

16/F Exacerbación severa - - PA PA [40]

19/M Estable - - ND PA [40]

17/F Exacerbación - - ND PA, CA, AF [40]

20/F Exacerbación - - ND PA, SA, CA, AF [40]

17/F Estable - - ND PA, SA, SM, CA, AF [40]

35/M Función resp. disminuida - - PA PA, SMA [40]

9/F Estable - - AR Ninguno [43]

17/F Estable - 4 SP CA [39]

2/M Tos Productiva - 3 SP SA, HI [39]

21/M Exacerbación - 3 AR PA, AF [39]

15/M Fiebre y Dolor Torácico - 3 AR SA [39]

20/F - - - SP PA, SA, AF [44]

36/F - - - SP PA [44]

20/M Estable ΔF508/N1303K - - PA, SA [45]

20/M Exacerbación ΔF508/ΔF508 - - - [46]

23/F Estable ΔF508/ΔF508 - SP/AR PA, AF [47]

8/F Exacerbación ΔF508/ΔF508 - BD PA, SA, CA, AF [48]

20/M Estable - 5 - HI [49]

a Edad del PFQ al recuperar Inquilinus por primera vez b Identificación fenotípica realizada mediante equipos semi-automatizados o sistemas de galería

F: paciente femenino, M: paciente masculino - : no reportado por los autores

AR, Agrobacterium radiobacter; PA, Pseudomonas aeruginosa; PM, Proteus mirabilis; SP, Sphingomonas paucimobilis; SA, Staphylococcus aureus; CA,

Candida albicans; AF, Aspergillus fumigatus; SM, Stenotrophomonas maltophilia; AX, Achromobacter xylosoxidans; SMA, Serratia marcescens; HI, Haemophilus

influenzae; BD, Brevundimonas diminuta

28

Al emplear sistemas de galerías comerciales para proceder a la identificación

de muestras clínicas de Inquilinus se puede arribar a una identificación

incorrecta, con resultados variados como P. aeruginosa, Agrobacterium

radiobacter, Sphingomonas paucimobilis, Brevundimonas diminuta, etc. como

detallaron los reportes mencionados en la Tabla 1. En general, en especies

bacterianas descriptas recientemente o que no son frecuentemente

encontradas en muestras clínicas, las pruebas fenotípicas necesarias para

identificar a estos microorganismos (y diferenciarlos de otros) no están incluidas

en las bases de datos de los sistemas comerciales o automatizados, lo que ante

esta nueva especie, conduce a la identificación errónea [1].

En estos casos, si la identificación ocurre con un bajo porcentaje de certeza,

permite la sospecha de “identificación errónea”. Sin embargo hay reportes de

identificaciones incorrectas de aislamientos de Inquilinus, realizadas con

sistemas comerciales ampliamente utilizados en la clínica que indican un

porcentaje de certeza del 99% para A. radiobacter [42]. Asimismo, los resultados

obtenidos con galerías comerciales de distintos fabricantes, o incluso respecto

de las pruebas realizadas en forma convencional en el laboratorio, pueden

presentar resultados variables sobre un mismo aislamiento, lo que obviamente

aporta mayor confusión al proceso de identificación [42].

Cuando se procesan aislamientos de las especies A. xylosoxidans, S. maltophilia

e I. limosus recuperados de PFQ puede ocurrir que sean incorrectamente

identificados como P. aeruginosa. Si bien al parecer existe una baja tasa de

identificación errónea de P. aeruginosa en PFQ, un estudio multicéntrico llevado

a cabo por Kidd et al, muestra que las asignaciones incorrectas de especies

habrían ocurrido debido al aspecto similar que presentaron de los aislamiento

respecto de P. aeruginosa [44].

29

1.3.3 Perfil natural de multiresistencia antimicrobiana de Inquilinus

Inquilinus limosus presenta resistencia (que se asume como natural) a la mayoría

de los antimicrobianos que se utilizan ampliamente para el tratamiento o

prevención de infecciones en los PFQ. Se ha observado resistencia a drogas

como polimixinas, tobramicina, fosfomicina, trimetoprima-sulfametoxazol y todos

los ß-lactámicos (excepto a carbapenemes) [40-42, 45, 47, 50]. Sin embargo, se

desconocen los mecanismos asociados a esta resistencia.

1.3.4 Persistencia - Difícil erradicación

Las bacterias persistentes poseen la capacidad de tolerar y sobrevivir a la

exposición de concentraciones letales de antimicrobianos bactericidas, aún

cuando en los ensayos convencionales de laboratorio parecieran ser sensibles a

éstos, de forma que no presentan una resistencia verdadera. No obstante, se

convierten en imposibles de erradicar, lo que en un contexto clínico puede

generar una infección crónica. Esta propiedad puede deberse a un lento

crecimiento microbiano (que genera un estado denominado de “indiferencia

al fármaco”), a la capacidad adaptativa de una subpoblación en activo

crecimiento (denominada persistencia propiamente dicha), a la formación de

estructuras generalmente refractarias a los fármacos (como los biofilms o

biopelículas bacterianas), o a la simultaneidad de todas las situaciones

mencionadas [51].

Existen numerosos estudios realizados sobre P. aeruginosa acerca de este

fenómeno, pues una vez que se establece en los pulmones de los PFQ es

difícilmente erradicada, lo que lleva a un tratamiento antimicrobiano más

exigente y a una disminución acelerada de la función pulmonar, la calidad y la

esperanza de vida [52, 53].

Algo similar parece observarse en los PFQ colonizados/infectados crónicamente

con Inquilinus.

30

Aunque en un principio era discutida la patogenicidad de Inquilinus, varios

reportes de casos clínicos muestran como el deterioro de la función pulmonar

ocurrió luego de la adquisición de este microorganismo, aislándolo además

durante el periodo de exacerbación del cuadro clínico respiratorio [40, 42, 45].

Si lo comparamos con P. aeruginosa, independientemente de la sensibilidad

que presente a los antimicrobianos, la recuperación de los fenotipos mucoides

en muestras respiratorias de los PFQ representan un pronóstico no favorable

[20]. Asimismo, se ha postulado que el fenotipo mucoide de I. limosus podría

contribuir a la colonización de las vías respiratorias de los PFQ y a la respuesta

refractaria a muchos antimicrobianos [42]. Herasimenka et al en un estudio

tendiente a caracterizar los exopolisacáridos producidos por I. limosus han

reportado una composición similar al producido por P. aeruginosa, reconocido

usualmente como un importante factor de virulencia [54].

1.3.5 Otros aspectos del género Inquilinus

Hasta el momento se desconoce el nicho ecológico de I. limosus. Se postula

que podría ser ambiental, pues está filogenéticamente relacionado con

microorganismos ambientales, como Azospirillum, un microorganismo asociado

a plantas [55]. A esta hipótesis se suma como posible evidencia que mediante

estudios metagenómico, se ha recuperado ADNr 16S de I. limosus de una

muestra de raíz de una de las únicas hierbas perennes que se desarrollan en el

desierto de Thar, en Rajasthan, India [56]. Además, como se mencionó

previamente, el nicho ecológico de I. ginsengisoli parece ser ambiental al

describirse como un microorganismo recuperada de muestras de suelo [38].

El bajo número de reportes que existe sobre I. limosus no permite estimar su

prevalencia. En un pequeño estudio realizado por Wellinghausen et al. [41]

durante el período Mayo 2002 - Septiembre 2004, de 85 pacientes concurrentes

a la Clínica de Fibrosis Quística del Hospital Universitario, en Ulm, Alemania, se

obtuvieron un total de 459 muestras de esputo y se recuperó I. limosus del

esputo de 2 pacientes (el 0,9% de las muestras procesadas) indicando una

31

prevalencia del 2,4% en esa clínica durante el periodo en cuestión. Además, el

estudio descartó una relación clonal entre los aislamientos de estos pacientes

mediante el análisis por electroforesis en campo pulsado (PFGE, Pulsed-field

gel electrophoresis), excluyendo una infección cruzada entre pacientes, al igual

que en otros casos reportados [40-42].

Inquilinus limosus no solo podría estar presente en PFQ, sino también en aquellos

que cursen otra situación de inmunosupresión, incluso farmacológica. En 2006,

Kiratisin et al., reportaron la recuperación de Inquilinus en un paciente no FQ,

como único espécimen recuperado de un hemocultivo, definiéndolo como el

causante de una endocarditis temprana post-trasplante de válvula cardíaca

[50].

Durante el desarrollo de este trabajo de tesis se abordaron

muchos de estos interrogantes acerca de I. limosus y su posible

papel como patógeno oportunista emergente. A continuación

se presentan los aspectos más relevantes del análisis.

32

33

2 MECANISMOS DE RESISTENCIA A ANTIMICROBIANOS EN

BACTERIAS

2.1 Generalidades

A medida que el uso de antibióticos se incrementó, también lo hizo el nivel y la

complejidad de los mecanismos de resistencia que exhiben las bacterias

patógenas. La emergencia de cepas resistentes es un evento frecuente en las

instituciones de salud [57].

La prescripción masiva de antimicrobianos (tanto de los antibióticos de origen

natural o semisintético como de los agentes quimioterápicos - totalmente

sintéticos -) y su uso no regulado y extensivo (entre otros motivos) ha dado lugar

al desarrollo de un amplio espectro de resistencia a antimicrobianos en los

microorganismos. Las características de la comunidad bacteriana juega un

papel importante en el intercambio de genes, pero los agentes antimicrobianos

son los que proporcionan la presión que conduce a la selección de

microorganismos resistentes y favorecen la diseminación de genes de

resistencia entre bacterias [58]. La resistencia bacteriana, a menudo, es

responsable del fracaso terapéutico, con graves consecuencias especialmente

en pacientes en estado crítico. Así, las terapias antibacterianas empíricas o

preventivas pueden resultar inadecuadas, conducir a tratamientos prolongados

y a la diseminación de resistencia de bajo nivel, cuya detección puede no ser

posible por los métodos de rutina utilizados en laboratorios [57].

Algunas especies bacterianas son intrínseca o naturalmente resistentes a una

clase o familia de antimicrobianos, lo que implica que todos los aislamientos de

dicha especie bacteriana tendrán en común esa resistencia. De mayor

preocupación son los casos de resistencia adquirida, donde poblaciones

bacterianas inicialmente sensibles al antimicrobiano pueden tornarse resistentes

34

a través de la adquisición de nuevo material genético proveniente de

organismos resistentes dando lugar a una transferencia horizontal de genes (o

evolución horizontal) [57]. Este fenómeno se sustenta al contemplar la

promiscuidad con la que bacterias de la misma especie e incluso entre géneros

diferentes pueden intercambiar ADN. La presión selectiva ejercida por el

fármaco contribuye a la diseminación y permanencia de los determinantes de

resistencia adquiridos en las poblaciones bacterianas sometidas al mismo [57].

Existen básicamente cuatro mecanismos generales de resistencia bacteriana,

los que pueden estar presentes simultáneamente. Además, la resistencia a una

misma familia de antimicrobianos puede involucrar a más de un mecanismo. A

continuación se describen brevemente los mecanismos de resistencia a

antimicrobianos [57, 59], los que se esquematizan en la Figura 2.

a) Modificación o inactivación enzimática del antimicrobiano: Las enzimas

modificadoras o inactivantes son producidas de manera constitutiva o inducible

por las bacterias. Como ejemplos clásicos, las enzimas ß-lactamasas clivan el

anillo ß-lactámico de los antibióticos ß-lactámicos, de forma que estos fármacos

quedan inactivos, mientras que las enzimas modificadoras de aminoglucósidos

pueden acetilar, adenilar y/o fosforilar a estas moléculas, e impiden que pueda

unirse al sitio blanco de acción.

b) La disminución de la accesibilidad del fármaco al sitio blanco, por

modificaciones en la permeabilidad de la membrana o debido a su expulsión

activa fuera de la célula: este mecanismo consiste en disminuir el acceso del

fármaco y por consiguiente su llegada al sitio blanco intracelular. Para esto, la

estrategia puede ser que las membranas sean menos permeables al fármaco

evitando así su ingreso a la célula. Por ejemplo, por alteración en la estructura o

por disminución en la expresión de los canales proteicos ubicados en

membrana externa, necesarios para el ingreso del fármaco (ej. disminución de

la porina OmpF en E. coli) [57]. Además, puede ocurrir que luego del ingreso del

antimicrobiano a la célula este sea expulsado activamente fuera de la misma

35

por distintas estructuras proteicas [57]. Existen proteínas capaces de expulsar

fármacos específicos como fenicoles (como cloranfenicol y florfenicol) [60] y

tetraciclinas, y otras proteínas que forman sistemas tripartitos en bacterias gram

negativas, denominadas bombas de eflujo de resistencia a múltiples drogas (BE-

RMD), que se caracterizan por poder expulsar activamente de la célula

bacteriana una gran cantidad de compuestos químicamente diferentes,

incluidos los antibióticos.

Figura 2. Mecanismos de resistencia bacteriana a los antimicrobianos. Esquema general

de los mecanismos de resistencia a antimicrobianos en bacterias. Adaptado de

Hawkey, 1998 [59].

c) La alteración del sitio blanco de acción: en este mecanismo el fármaco

puede ingresar a la célula pero debido a cambios estructurales que presenta su

blanco molecular no se produce una correcta interacción, por lo que el

antimicrobiano no produce el efecto deseado. Algunos ejemplos pueden ser las

mutaciones que conducen a la producción de las proteínas de unión a la

penicilina (PBP, Penicillin-Binding Protein/s) con una menor afinidad por el

antibiótico ß-lactámico o la resistencia a eritromicina por modificación de la

36

subunidad ribosomal 50S. En ambas situaciones mencionadas se encuentra

modificado el sitio blanco de acción del fármaco.

d) La adquisición o sobreexpresión de vías metabólicas alternativas: mediante

este mecanismo las bacterias producen un sitio blanco alternativo para el

fármaco. Generalmente involucra a una enzima resistente a la inhibición del

antimicrobiano, a la vez que el blanco original sensible continúa

produciéndose. Por ejemplo, la resistencia a trimetoprima y sulfonamidas se

debe a la producción bacteriana de enzimas con actividad biológica

específica (dihidrofolato reductasa y dihidropteroato sintetasa,

respectivamente) pero con una afinidad disminuida a los antimicrobianos

respectivos. Otro ejemplo asociado con la resistencia a antibióticos ß-

lactámicos es representado por la adquisión del gen mecA que codifica para

una PBP extranumeraria, la PBP2a o PBP2’, que presenta baja afinidad de unión

por los ß-lactámicos y constituye el principal mecanismo de resistencia a todos

los ß-lactámicos en S. aureus (a la vez que puede estar asociada a la resistencia

de otras familias de antimicrobianos). O por ejemplo, la sobreexpresión de una

PBP de baja afinidad por ß-lactámicos como ocurre en Enterococcus faecium,

en los que debido a mutaciones en el promotor se sobreexpresa la PBP5 de

baja afinidad, intrínseca de la especie, y le permite a este microorganismo

conseguir un mayor nivel de resistencia a los ß-lactámicos.

A continuación se describen los aspectos más relevantes en

cuanto a la inactivación de los antibióticos ß-lactámicos por

acción de enzimas ß-lactamasas, y debido a la expulsión de

antimicrobianos mediada por bombas de eflujo de resistencia

a múltiples drogas, pues representan una parte importante del

análisis realizado en este trabajo de tesis.

37

2.2 Resistencia a ß-lactámicos mediada por ß-lactamasas en BGN

Las ß-lactamasas, (EC 3.5.2.6.) son enzimas que pueden hidrolizar el enlace

amida característico del anillo ß-lactámico, inactivándolo. La mayoría de las ß-

lactamasas junto con las PBP, pertenecen a una familia de proteínas que

depende de un residuo de serina en su sitio activo para realizar sus funciones

biológicas. Ambas tienen afinidad por los antibióticos ß-lactámicos pero

mientras que las PBP son inactivadas por estos, las ß-lactamasas pueden

hidrolizarlos [61].

La hidrólisis de los antibióticos ß-lactámicos por ß-lactamasas es el mecanismo

más común de resistencia a este tipo de antimicrobianos en bacterias gram

negativas de relevancia de clínica. En general, se sospecha de la producción

de estas enzimas cuando un gram negativo (aislado de muestras significativas

desde el aspecto clínico) presenta resistencia a un antibiótico ß-lactámico [62].

También es el mecanismo de resistencia bacteriana que produce mayores

diferencias cuantitativas en la sensibilidad de los microorganismos [63]. Tanto la

presencia como las características particulares de estas enzimas juegan un

papel crítico en la selección de la terapia apropiada [62].

Las bacterias gram negativas producen a estas enzimas en forma soluble,

concentrándose casi exclusivamente en el espacio periplásmico, por lo que no

requieren una producción masiva de las mismas ni una elevada eficiencia

hidrolítica sobre el ß-lactámico. Esta particularidad le puede conferir al

microorganismo altos niveles de resistencia a ß-lactámicos [61].

Los genes codificantes para estas enzimas pueden estar localizados en el

cromosoma o en elementos extracromosomales, muchas veces asociados a

plataformas como transposones e integrones, que a su vez, pueden estar

integrados en el cromosoma o en plásmidos, y expresarse en forma constitutiva

o inducible [64, 65]. Al menos para muchos ejemplos de aquellos de localización

cromosómica, los genes preexisten al descubrimiento y la introducción de los

antibióticos en la práctica clínica [66, 67].

38

2.2.1 Clasificación de las ß-lactamasas

Existen distintas clasificaciones de estas enzimas. A continuación se mencionan

las más empleadas por el valor descriptivo que aportan.

Estas enzimas pueden ser clasificadas en forma comparativa según su

capacidad para hidrolizar distintos sustratos ß-lactámicos. Es decir, clasificadas

según el sustrato “preferido” para ser hidrolizado, así hay penicilinasas

(penicilina), cefalosporinasas (cefalosporinas clásicas), ß-lactamasas de amplio

espectro (ßLEA, penicilinas y cefalosporinas clásicas), ß-lactamasas de espectro

extendido (ßLEE, penicilinas y cefalosporinas resistentes a ßLEA), y

carbapenemasas (carbapenemes) [62, 68]. Es una clasificación sencilla,

descriptiva desde el punto de vista funcional y estable.

Otra de las clasificaciones que existe sobre estas enzimas está basada en la

secuencia primaria de aminoácidos. Ésta es la denominada clasificación

molecular propuesta por Ambler [69] que según la secuencia son agrupadas en

4 clases moleculares: A, B, C y D. Cada una de ellas presenta motivos de

aminoácidos distintivos y conservados. Es una clasificación simple y estable [69].

Las clases A, C, y D están constituidas por enzimas que hidrolizan sus sustratos

mediante la formación de un complejo acil-enzima a través de la serina

presente en el sitio activo, constituyendo el grupo de serino-ß-lactamasas. En

tanto, que en la clase B se encuentran agrupadas las metaloenzimas, que

requieren al menos un ión zinc (Zn2+) en su sitio activo para realizar la hidrólisis

del anillo ß-lactámico [62].

Por último, encontramos la clasificación basada en las características

funcionales (fenotípicas) de estas enzimas [62, 70, 71]. Esta clasificación divide a

las ß-lactamasas en grupos, e intenta establecer una correlación entre las

propiedades de una enzima específica respecto del perfil de resistencia

microbiológica observado en un aislamiento clínico. Se contemplan sus

propiedades hidrolíticas frente a distintos sustratos ß-lactámicos y la inhibición

enzimática en presencia de distintos compuestos como CLA, SUL, TAZ y EDTA

39

[62]. Esta clasificación se encuentra en actualización constantemente, y

aunque establece una relación con la clasificación molecular de Ambler (pues

es claro que existe una relación estructura-función), ha generado tantos

subgrupos que puede ser compleja y confusa. La gran desventaja de esta

clasificación es la inestabilidad: si en la secuencia codificante se produce una

única mutación puntual que se traduzca en un único cambio en la secuencia

primaria, puede variar considerablemente el espectro de actividad de la ß-

lactamasa, provocando que la enzima deba ser re-ubicada en otro grupo.

Además, los límites de cada grupo se presentan poco definidos

Como parte de la caracterización general de estas enzimas se suelen aportar

otros datos como su peso molecular (PM) y su punto isoeléctrico (pI), la

localización del gen codificante (cromosomal o extracromosomal, transferible o

no) y la expresión del mismo (inducible, constitutiva).

A continuación se continúa con la descripción de las serino-ß-lactamasas. En la

Tabla 2 se muestra el esquema de las clasificaciones mencionadas, molecular y

funcional de estas enzimas [62]. En este esquema se puede observar que las

serino-ß-lactamasas están clasificadas desde el aspecto funcional en los grupos

1 y 2.

El grupo 2 está formado mayoritariamente por ß-lactamasas de clase A e

incluye muchas de las enzimas más relevantes desde el aspecto clínico. Según

el sustrato preferencial al que hidrolizan, encontramos a las enzimas de tipo

ßLEA y ßLEE, y a su vez podemos distinguir distintos grupos según presenten

resistencia a la inactivación por inhibidores enzimáticos clásicos. En este grupo

también encontramos a todas las enzimas que corresponden a la clase

molecular D, muchas reportadas como oxacilinasas o carbapenemasas (no

metalo-ß-lactamasas). Las enzimas de clase A y D presentan un peso molecular

que oscila entre 25 y 31 kDa y pueden hidrolizar PEN con una constante

catalítica kcat >5 s-1 [62, 71].

40

El grupo 1 incluye a todas las ß-lactamasas de la clase molecular C, también

denominadas AmpC. Estas hidrolizan con mayor eficiencia cefalosporinas que

PEN, incluyendo cefamicinas (como FOX), y en algunos casos también las

cefalosporinas de tercera generación (como CTX, CAZ, CRO), por lo que

presentan una constante catalítica baja frente a PEN (kcat <5 s-1). No son

inhibidas adecuadamente por los inhibidores clásicos de uso clínico (CLA, TAZ),

pudiendo tener IC50 > 2 µM de CLA, con excepciones [71]. Las AmpC

constituyen un tipo de ß-lactamasas que a diferencia de las ßLEE no poseen en

la actualidad un método para su detección fenotípica estandarizado por el

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Debido a la carencia de

inactivadores enzimáticos de uso clínico resulta importante la detección en el

laboratorio de este tipo de enzimas empleando otras metodologías que basan

en la utilización de sustancias derivadas del ácido borónico, frecuentes

inhibidores de ß-lactamasas de clase C [79]. También resulta importante

reconocer si se encuentran o no asociadas a estructuras movilizables.

Generalmente están codificadas en el cromosoma bacteriano y son

típicamente inducibles por sustratos ß-lactámicos, aunque pueden carecer de

genes reguladores y expresarse en forma constitutiva, o haber sido reclutadas a

estructuras movilizables. En su estructura presentan unos 100 aminoácidos más

que las ß-lactamasas de otras clases, de forma que su peso molecular es,

generalmente, mayor a 35 kDa [71].

41

Tabla 2. Esquema de clasificación de serino-ß-lactamasas

Clase a

Molecular Grupo b Sustrato de hidrólisis preferencial

Inhibición c

por CLA Característica clasificadora

Enzimas

representativas

A 2a Penicilinas Si Mayor hidrólisis de bencil-PEN que de cefalosporinas PC1

A 2b Penicilinas, cefalosporinas de 1ra.

generación Si Hidrólisis similar entre bencil-PEN y cefalosporinas TEM-1, TEM-2, SHV-1

A 2be Cefalosporinas de espectro

extendido, monobactamas Si

Capacidad aumentada de hidrólisis de oximino -ß-

lactamas (CTX, CAZ, CRO, FEP, ATM)

TEM-3, SHV-2, CTX-M-15,

PER-1, VEB-1

A 2br Penicilinas No Ausencia de inhibición (resistencia) en presencia de CLA,

SUL y TAZ TEM-30, SHV-10

A 2ber Cefalosporinas de espectro

extendido, monobactamas Variable

Capacidad aumentada de hidrólisis de oximino -ß-

lactamas combinada con resistencia al CLA, SUL y TAZ TEM-50

A 2c Carbenicilina Si Capacidad aumentada de hidrólisis de CAR PSE-1, CARB-3

A 2ce Carbenicilina, cefepime Si Hidrólisis de CAR, FEP y CEP RTG-4

A 2e Cefalosporinas de espectro

extendido Si Hidrólisis de cefalosporinas. No hidroliza ATM. CepA

A 2f Carbapenemes Si Capacidad aumentada de hidrólisis de carbapenemes,

oximino -ß-lactamas, cefamicinas KPC-2, IMI-1, SME-1

C 1 Cefalosporinas No Mayor hidrólisis de cefalosporinas que de bencil-PEN.

Capacidad para hidrolizar cefamicinas.

AmpC, P99, ACT-1,

CMY-2, FOX-1, MIR-1

C 1e Cefalosporinas No Capacidad aumentada de hidrólisis de ceftazidima y

con frecuencia oximino-ß-lactamas GC1, CMY-37

D 2d Cloxacilina Variable Capacidad aumentada de hidrólisis de CLOX u OXA OXA-1, OXA-10

D 2de Cefalosporinas de espectro

extendido Variable Hidrólisis de CLOX u OXA y oximino -ß-lactamas OXA-11, OXA-15

D 2df Carbapenemes No Hidrólisis de CLOX u OXA y carbapenemes OXA-23, OXA-48

a Según clasificación descripta por Ambler, 1980 [69] b Según la clasificación propuesta por Bush et al, 2010 y Bush, 2013 [62, 71] c Inactivación enzimática en presencia de CLA: ácido clavulánico.

PEN: penicilina, CTX: cefotaxima, CAZ: ceftacidima, CRO: ceftriaxona, FEP: cefepima, ATM: aztreonam, SUL: sulbactam, TAZ: tazobactam, CAR: carbenicilina, CEP: cefpirome,

CLOX: cloxacilina, OXA: oxacilina

42

2.2.2 Estructura molecular de las serino-ß-lactamasas

Las serino-ß-lactamasas poseen un residuo de serina esencial para la

funcionalidad del sitio activo, y por consiguiente su actividad biológica. Estas

enzimas, al igual que las PBP, son proteínas monoméricas que presentan un

dominio estructural “todo-α” y uno “α/ß” (Figura 3) [72].

El residuo de serina activo se encuentra en la región N-terminal de la primer

hélice del dominio “todo-α” y se posiciona en una cavidad situada entre ambos

dominios. Cercano a este residuo, existen varios motivos conservados que

conforman el denominado “bolsillo activo” de la enzima. Estos residuos de

aminoácidos quedan organizados en una estructura proximal en la que

interactúan en alguna forma (directa o indirecta) en el reconocimiento del

sustrato y en la catálisis que realizan. El sitio catalítico se estabiliza mediante la

formación de puentes de hidrógeno [72]. Sin embargo, debe considerarse que

el sitio activo de una ß-lactamasa no es rígido, sino que permite un

reacomodamiento del sustrato.

Figura 3. Estructura terciaria de la ß-lactamasa TEM-1, enzima prototipo de la clase

molecular A. En rosa se indican las α-hélices y en marrón las cadenas ß. Con una

estrella roja se indica la posición de la serina activa (elemento 1). El resto de los residuos

importantes para la actividad catalítica de la enzima se muestran indicados con

puntos negros y numerados desde el primer aminoácido de la cadena proteica

madura. Modificada de Matagne et al, 1998 [72].

43

Estudios realizados sobre la secuencia de estas proteínas, su cristal y el posterior

análisis cristalográfico por difracción de rayos X, ha permitido inferir las

secuencias de aminoácidos que conforman los motivos proteicos que

interaccionan en el sitio catalítico para hidrolizar el anillo ß-lactámico. En la

secuencia que presentan las serino-ß-lactamasas se pueden encontrar 4

elementos con una secuencia aminoacídica (motivo) característica, altamente

conservada para cada clase molecular de enzima. A continuación se

describen los elementos que presentan las serino-ß-lactamasas y sus motivos

conservados. En la Tabla 3 se resume los motivos aminoacídicos que presenta

cada clase molecular de serino-ß-lactamasas y las posiciones de estos

aminoácidos en la cadena proteica madura.

Tabla 3. Motivos conservados de los elementos para cada clase molecular de serino-ß-

lactamasa y sus posiciones en la secuencia proteica madura [71, 74, 75].

Clase

Molecular

Motivos aminoacídicos característicos

A S70xxK S130xN E166xxxN170(a) K234TG

C S64xxK Y150xN D217(b) K315SG

D S70xxK S118xV Y144GN K216TG

F144GN K216SG

x: indica un residuo de aminoácido variable (a) omega loop: motivo exclusivo de las ß-lactamasas de clase A (b) Aspartato generalmente ubicado a 153 aminoácidos de la serina64 del sitio activo

S: serina, K: lisina, N: asparagina, E: ác. glutámico, K: , T: treonina , G: glicina, Y: tirosina, D: ác.

aspártico, V: valina, F: fenilalanina

Elemento 1: El primer elemento conservado está representado por el motivo

SxxK, en la hélice α-2. Incluye a la serina activa, posicionada en el sitio activo de

la enzima y al residuo de lisina, cuya cadena lateral también apunta hacia el

interior del sitio activo. La distancia de 2 residuos de aminoácidos entre las

cadenas laterales de los residuos de serina y lisina permite que ambas cadenas

laterales queden con una localización suficientemente proximal para

establecer puentes de hidrogeno, lo que sugiere que la lisina también participa

en el proceso catalítico [72, 73].

44

Elemento 2: Luego, en un pequeño loop (bucle) en el dominio “todo-α”, se

encuentra el segundo motivo conservado (SxN, YxN, FGN), posicionado en uno

de los laterales de la cavidad catalítica. Está formado por un primer

aminoácido hidroxilado y un tercer aminoácido que usualmente es asparagina.

Los residuos laterales del primer y tercer aminoácido están dirigidos hacia el

interior del sitio catalítico, mientras que el residuo del segundo aminoácido no lo

está. En las ß-lactamasas de clase A, el aminoácido hidroxilado es casi

exclusivamente serina, mientras que en las enzimas de clase C y D se encuentra

tirosina [73].

Elemento 3: Está ubicado en la hoja ß más interna del dominio “α/ß”, conforma

el lateral opuesto al elemento 2 en el sitio catalítico, y presenta los motivos KTG

o KSG. El primer aminoácido parece presentar siempre carga positiva, es

seguido por uno hidroxilado y el tercero carece de cadena lateral, pues sino

generaría un impedimento estérico para el sustrato [73].

Elemento 4: En las ß-lactamasas de clase A existe un motivo con función

catalítica denominado omega-loop (o bucle omega), que está formado por un

residuo de ácido glutámico en la posición 166 y un residuo de asparagina en la

170 (E166xxxN170). Ambos residuos parecen ser esenciales para el posicionamiento

de la molécula de agua cerca de la serina del elemento 1. El residuo de

glutámico, parece imprescindible por su carga negativa y actuaría como un

secuestrador de protones al incrementar la nucleofilicidad de la serina activa,

para luego activar la molécula de agua durante el paso de hidrólisis del

intermediario acilado entre el ß-lactámico y la enzima [72].

45

2.2.3 Mecanismo de acción de las serino-ß-lactamasas

Estas enzimas (al igual que las PBP) poseen actividad peniciloil-transferasa que

depende de un residuo de serina en su sitio activo. La diferencia principal entre

ambas radica en el aspecto cinético luego de hidrolizar el enlace amida

característico del anillo ß-lactámico. Las PBPs quedan inactivadas por el sustrato

ß-lactámico luego de su interacción, en cambio las ß-lactamasas hidrolizan al

antibiótico y nuevamente vuelven a quedar disponibles para hidrolizan más

moléculas de ß-lactámico (Figura 4).

Figura 4. Reacción general y mecanismo de hidrólisis de antibiótico ß-lactámico. A.

Reacción general de hidrólisis de las serino-ß-lactamasas sobre un sustrato ß-lactámico.

E, enzima ß-lactamasa; S, sustrato (antibiótico ß-lactámico); P, producto (antibiótico

hidrolizado, inactivado); k -1 y k +1, constantes de la reacción reversible de formación del

complejo no covalente de Henri-Michaelis; k +2, constante de acilación; k +3, constante

de deacilación. B. Mecanismo de acción de las serino-ß-lactamasas. Enz-Ser-OH, serino-

ß-lactamasa. Adaptado de Ghuysen, 1991 [61].

La primer etapa de la reacción consiste en el ataque nucleofílico del hidroxilo

de la serina activa (del elemento 1) de la enzima (E), al grupo carbonilo del

anillo ß-lactámico (S), formándose el intermediario acilado, gobernado por la

constante de la velocidad de acilación k+2, con la posterior ruptura del enlace

amida de la droga. Finalmente, la presencia de una molécula de agua en el

46

sitio activo de la enzima conduce a la hidrólisis del intermediario, liberándose el

ß-lactámico inactivo (P) y la enzima regenerada. Esta última etapa está

caracterizada por la constante de desacilación k+3 [61].

2.2.4 Aspectos cinéticos de las ß-lactamasas

La diferencia entre la reacción de la ß-lactamasas y las PBP con los sustratos ß-

lactámicos radica en el aspecto cinético luego de la formación de la acil-

enzima. Las PBP son inactivadas por el antibiótico por permanecer aciladas, ya

que la constante de desacilación (k+3) tiene un valor despreciable, por lo que la

reacción es demasiado lenta, y así es como las PBP pierden su función

biológica. En las ß-lactamasas las reacciones de acilación y deacilación son

rápidas (valores altos), resultando en un alto recambio de molécula de sustrato

y eficiencia hidrolítica enzimática [61].

La caracterización cinética de estas enzimas se realiza determinando algunas

constantes que brindan información acerca del comportamiento de la enzima

frente a ese sustrato.

El número de recambio se representa por la constante catalítica kcat (kcat = k+2 .

k+3/ k+2 + k+3). Relaciona las constantes de primer orden de acilación (k+2) y

desacilación (k+3) y en rasgos generales orienta acerca de la capacidad que

posee el complejo acilado ES* formado de convertirse en producto. Esta

constante indica la tasa de recambio enzimático.

La eficiencia catalítica, en este caso de hidrólisis, se refleja normalmente por

medio de los parámetros cinéticos kcat y la constante de especificidad de

segundo orden kcat/KM, donde KM es la constante de afinidad de Michaelis-

Menten (que indica la afinidad de la enzima por el sustrato y representa la

constante aparente de todas las especies unidas a la enzima).

Un valor de KM elevado indica que la enzima es poco afín por ese sustrato

indicando que biológicamente para llegar a un estado de saturación, la enzima

necesitaría una concentración de sustrato que no podría ser alcanzada in vivo,

por lo que en presencia de este sustrato (denominado sustrato pobre) no será

posible que la enzima funcione en condiciones de velocidad máxima de

47

reacción (Vmáx). En forma opuesta, los valores bajos de KM indican que la enzima

presenta una alta afinidad por el sustrato en cuestión (denominado buen

sustrato), pudiendo ser alcanzada una condición de saturación enzimática y

por lo tanto lograr que la enzima en adecuadas condiciones pueda funcionar

en Vmáx [76-78].

Las ß-lactamasas de clase A generalmente no interactúan significativamente

con sus sustratos más pobres, mostrando bajas eficiencias de hidrólisis (bajos

valores de kcat/KM).

En cambio, la interacción enzima-sustrato que presentan las ß-lactamasas de

clase C se caracteriza por su elevado valor de kcat/KM, a expensas de una

constante de disociación, representada por KM muy baja (alta afinidad por el

sustrato) y también un valor de kcat extremadamente bajo. En algunos casos se

observa que los valores elevados de kcat/KM se deben a que estas ß-lactamasas

se mantienen aciladas por más tiempo debido a una desacilación lenta,

(siendo que k+2 >>> k+3, el bajo valor de kcat ocurre a expensas de que k+3 es

bajo) provocando que este sea el paso limitante de la reacción de hidrólisis del

ß-lactámico [61, 77].

2.2.4.1 Inhibidores de ß-lactamasas

Como se mencionó en la clasificación funcional de las ß-lactamasas, es

importante evaluar la inactivación enzimática en presencia de inhibidores de

estas enzimas como parte de su caracterización. El término inhibidores de ß-

lactamasas engloba a compuestos de estructura química muy diversa y

mecanismos de acción variados, que al interaccionar con la ß-lactamasa,

provoca la pérdida parcial o total de la actividad enzimática catalítica.

Los inhibidores competitivos ocupan el sitio activo libre de la enzima e impiden

que pueda unirse el sustrato. Como lo indica su nombre compiten con el

sustrato por el mismo sitio activo en la enzima; la inhibición es reversible cuando

desaparece en presencia de elevadas concentraciones de sustrato pues es

desplazado por ley de acción de masas. Dentro de este grupo encontramos al

ácido borónico y sus derivados aromáticos como el ác. 3-fenil borónico (BOR)

48

[63]. Si bien no son de uso clínico, resultan útiles para detectar y caracterizar a

las ß-lactamasas de clase C, que suelen ser inhibidas (no así las enzimas de

clase A) [79].

Los antibióticos ß-lactámicos que son pobremente hidrolizados por las ß-

lactamasas (“malos” sustratos) se comportan (con limitaciones) como si fueran

inhibidores competitivos cuando están en presencia de un buen sustrato

enzimático, por lo que algunas de las características de su interacción pueden

ser obtenidos por ensayos de inhibición competitiva [77, 80].

Por otro lado, los inhibidores “irreversibles” provocan que la enzima resulte (en

términos biológicos) incapaz de catalizar nuevamente la conversión de sustrato

en producto, y aún cuando dejen de estar presentes, no es posible regenerar la

actividad enzimática. Dentro de este grupo de inhibidores encontramos a los

compuestos inactivantes de ß-lactamasas, inhibidores suicidas o, más

correctamente, inhibidores basados en mecanismo: CLA, SUL y TAZ, que al

unirse al sitio activo provocan un cambio catalítico que inactiva la enzima. Estos

inhibidores son ß-lactámicos de acuerdo a su estructura química, pero con

escasa actividad antibiótica. Su importancia radica en el uso clínico como

inactivadores de las serino-ß-lactamasas de clase A, sin presentar efecto

inhibitorio sobre las enzimas de clase C ni sobre las PBPs [62] (con excepciones).

Otros inhibidores sin uso clínico que usualmente se emplean para caracterizar ß-

lactamasas son el NaCl y el EDTA. El NaCl es un inhibidor de serino-ß-lactamasas

de clase D. El quelante de metales, EDTA, provoca el secuestro reversible de el o

los iones zinc que forman parte del sitio activo de las metalo-ß-lactamasas, con

la consiguiente inhibición enzimática [62].

49

2.3 Bombas de eflujo (BE) de resistencia a múltiples drogas

Las BE consisten en estructuras proteicas asociadas a membranas, que actúan

como verdaderas bombas que expulsan distintos sustratos fuera de la célula,

inclusive antibióticos, de forma que disminuye la concentración efectiva del

mismo. Los genes codificantes de las BE pueden ser cromosómicos o

plasmídicos y su expresión puede ser constitutiva o inducida por algún sustrato

[81, 82]. En muchos microorganismos la expresión constitutiva les confieren

resistencia natural a ciertas drogas [2]. Si bien cada familia y cada tipo de BE

presenta selectividad para el eflujo de ciertos sustratos, pueden expulsar

sustratos muy variados, lo que implica usualmente la expulsión de

antimicrobianos de familias distintas. Existen varias familias de BE y un solo

organismo puede expresar simultáneamente más de una familia, así es en P.

aeruginosa y E. coli que pueden expresar más de un tipo de BE de la familia

RND y, en general, su sobreexpresión se relaciona con resistencias clínicamente

significativas [83].

2.3.1 Familias de BE de Resistencia a Múltiples Drogas (BE-RMD)

Fundamentalmente, hay cinco familias diferentes de BE-RMD, según los arreglos

proteicos que presentan podemos encontrar [2]:

a) La familia RND (Resistance/Nodulation/División),

b) La superfamilia ABC (ATP binding cassette, o casete de unión a ATP),

c) La superfamilia MFS (Major Facilitator Superfamily),

d) La familia MATE (Multi Antimicrobial Extrusion), y por último,

e) La familia SMR (Small Multidrug Resistance), es exclusiva de bacterias gram

positivas.

La Figura 5 muestra la localización en las bacterias gram negativas de los

componentes de las BE-RMD de las familias RND, ABC y MFS, todos ellos

formando un sistema tripartito con una proteína de membrana externa (outer

membrane protein, Omp) como por ejemplo TolC que tiene la capacidad de

interactuar con diferentes clases de transportadores en membrana interna de

tipo antiportadores (pertenecientes a familias diferentes) [2].

50

A continuación se exponen algunas de las principales características de las

familias RND, ABC, MFS y MATE, por estar presentes en bacterias gram negativas.

a) Familia RND: Las bacterias gram negativas expresan principalmente esta

familia de BE. Estas funcionan como co-transportadores de tipo antiportadores

de protones. El flujo de salida de las distintas moléculas a través de la

membrana es impulsado por el gradiente de protones que contra-corriente

ingresa a la célula, produciéndose el intercambio de un ion H+ para una

molécula de sustrato eliminado. Se organizan como sistemas tripartitos. En E. coli

y otras bacterias gram negativas se describen tres componentes que pueden

presentar distinta nomenclatura conocidos como: la proteína AcrB en la

membrana interna, AcrA como proteína accesoria periplásmica y TolC u Omp

conformando el canal proteico externo [2].

AcrB captura sus sustratos dentro de la célula (a nivel de la bicapa lipídica de la

membrana citoplasmática o directamente desde el citoplasma) y los transporta

hacia el medio externo a través de TolC. La cooperación entre AcrB y TolC está

mediada por la proteína periplásmica AcrA (Figura 5), que cierra un canal que

atraviesa, de esta manera, las dos membranas y el espacio periplasmico.

Figura 5. Diagrama de los componentes y

ubicación de las bombas de eflujo de

resistencia a múltiples drogas de las familias

RND, ABC y MFS.

En la membrana interna presentan una

proteína transportadora del flujo de salida

(AcrB, MacB y EmrB, respectivamente).

En espacio periplásmico se ubica una

proteína accesoria (AcrA, MacA y EmrA,

respectivamente).

Finalmente, una proteína que conforma el

canal exterior de la membrana como por

ejemplo TolC.

Extraída de Piddock, 2006, [2].

51

Existe un alto grado de similitud entre los genes de la bomba (> 70% de

identidad) y entre las secuencias de aminoácidos (> 80% de similitud) de las

proteínas que conforman la BE de la familia RND tanto dentro de una especie

como entre diferentes especies bacterianas, por ejemplo, E. coli: AcrB, P.

aeruginosa: MexB, Campylobacter jejuni: CmeB y Neisseria gonorrhoeae: MtrD.

La proteína MexA tiene 71% de similitud con AcrA y MexB tiene 89% de similitud

con AcrB. OprM tiene 35% de similitud con TolC [84]. La organización de los

genes que codifican estos sistemas de eflujo tripartitos también son similares

entre las diferentes especies. Usualmente, los genes se organizan como un

operón: el gen regulador se encuentra adyacente al gen que codifica la

proteína accesoria periplásmica, que a su vez se encuentra adyacente al gen

que codifica la proteína de la bomba de flujo de salida, que se encuentra junto

a la de la Omp. Para algunos sistemas y/o especies, el gen codificante de la

Omp no se coloca con los otros genes, por lo que se observan arreglos como

estos: acrAB-tolC en E. coli y mexXY-oprM en P. aeruginosa.

Las BE de la familia RND pueden expulsar, entre otros, al bromuro de etidio,

acriflavina, SDS, triclosan, solventes orgánicos, sales biliares, Tritón X-100,

cloranfenicol, ácido nalidíxico, fluoroquinolonas, antibióticos ß-lactámicos,

macrólidos, tigeciclina, novobiocina, rifampicina, y tetraciclinas [85-88].

Además, contribuyen con la virulencia bacteriana asociada a la formación de

biofilms [2] pues es mediante estas bombas, entre otros transportadores, que las

bacterias monitorizan las concentraciones de acil-homoserinlactonas (AHL)

implicadas en la señalización de quórum sensing. En este sentido, se ha

observado un aumento de la expresión de algunas BE tipo RND en la población

que forma el biofilm, respecto de la población planctónica [89]. Asimismo, la

inhibición química de estas BE revela una disminución en el biofilm formado por

algunos microorganismos, lo que sugiere el papel que presenta la familia RND

en la formación del biofilm [90].

b) Superfamilia ABC: en contraste con las familias de transportadores RND, MSF y

MATE, el flujo de salida en los transportadores ABC es impulsado por la hidrólisis

52

de ATP. Los compuestos que inhiben la actividad ATPasa del transportador ABC

resultan inhibidores de estas BE.

Difieren de las proteínas de las BE de las familias RND y MFS respecto del número

de regiones transmembrana, y secuencias características (signature) que

conforman sitios específicos para unir el ATP e hidrolizarlo sin afectar al sustrato

que se desea transportar.

Estos transportadores ABC se han encontrado en genomas de bacterias

patógenas y también se ha evidenciado que confieren resistencia a múltiples

drogas. Están implicados en la secreción de un gran número de compuestos

hidrofílicos, antibióticos y polímeros complejos como el LPS, polisacáridos

capsulares, etc. La especificidad del sustrato depende de cada familia de

transportador ABC.

c) Familia MFS: la superfamilia de transportadores MFS están conformada por, al

menos 17 familias, cada una con una especificidad de sustrato diferente. Al

igual que las familias RND y ABC, transportan fármacos y sustancias muy

diversas, en contra de su gradiente, impulsado por la fuerza protonmotriz, pero

también pueden realizar transporte de tipo uniportador y simportador. Algunos

de los antimicrobianos que pueden expulsar este tipo de BE son, por ejemplo,

fluoroquinolonas y tetraciclinas. En bacterias gram negativas presentan una

conformación tripartita.

d) Familia MATE: No son sistemas tripartitos. Presentan un único componente.

Están presentes en bacterias gram positivas y negativas. Realizan la expulsión de

distintas drogas mediante un anti-transporte de iones sodio.

53

2.3.2 Inhibidores e inductores de BE

El papel de las BE en la resistencia puede ser puesto en evidencia al evaluar las

modificaciones en la sensibilidad de un microorganismo frente a distintos

antimicrobianos en presencia de sustancias que provoquen la inactivación o

inducción química de estos sistemas de eflujo [91].

Como ejemplos, el compuesto fenil-arginil-ß-naftilamida (PAßN) es un inhibidor

inespecífico de bombas de eflujo de la familia RND [90, 92, 93], mientras que la

reserpina ha sido ampliamente utilizado para inhibir las BE principalmente en

bacterias gram positivas, con algunos reportes en gram negativas [94].

El salicilato de sodio actúa como un estimulador inespecífico de las bombas de

la familia RND, principalmente con arreglos génicos acrAB y tolC, y mexX-Y y

oprM, mediante la inducción de la expresión de la proteína de membrana

externa [95-98]. Asimismo, el desoxicolato de sodio es conocido como un

inductor inespecífico de las BE de la familia RND con arreglos génicos tipo

cmeABC, entre otros [95-97].

2.4 Ensayos de sensibilidad a antimicrobianos. La resistencia clínica y el uso de

terapias antimicrobianas combinadas en PFQ

El estudio de la sensibilidad a antimicrobianos de las bacterias aisladas en

muestras clínicas tiene 2 objetivos fundamentales e individuales: guiar al equipo

de salud en la elección del mejor tratamiento para el paciente del que se

obtuvo la muestra, y un objetivo epidemiológico que consiste en monitorear la

evolución de la resistencia bacteriana con el objetivo de revisar el espectro del

antimicrobiano y poder actualizar los tratamientos empíricos [99].

El método mas frecuentemente empleado es el antibiograma por difusión en

medio sólido que determina la sensibilidad in vitro de una bacteria frente a

diferentes antimicrobianos, y a partir de estos resultados, se predice la eficacia

in vivo. Con un antibiograma se pueden obtener resultados cualitativos que

indican si la bacteria es sensible o resistente a un antimicrobiano. Por otra parte,

54

también existen técnicas de dilución que permiten obtener resultados

cuantitativos que determinan la concentración mínima inhibitoria (CIM) de

antimicrobiano que inhibe el crecimiento microbiano.

En cualquier caso, la interpretación de los resultados se realiza en función de los

valores establecidos por diferentes comités, como el Clinical and Laboratory

Standards Institute en Estados Unidos (CLSI) y el European Committee on

Antimicrobial Susceptibility Testing en Europa (EUCAST), entre otros, que

determinan y establecen puntos de corte basados en propiedades

microbiológicas, farmacocinéticas y de eficacia clínica, para definir una

relación entre la sensibilidad y el éxito terapéutico o resistencia de las diferentes

especies bacterianas a cada antimicrobiano [99, 100].

Sin embargo, debe recordarse que los tratamientos antimicrobianos empíricos

fallan cuando los microorganismos presentan una sensibilidad disminuida o

resistencia frente a estos, pero también la eficacia clínica de un tratamiento

antimicrobiano está limitada a factores relacionados con el paciente o con la

atención médica, que en conjunto llevan al fracaso terapéutico[59]

Para que los antibióticos ß-lactámicos puedan ejercer su efecto antimicrobiano,

las bacterias deben encontrarse en un estado de replicación activa [51].

En muchos casos, además, para que los fármacos ejerzan su efecto

eficazmente resulta necesario que el paciente posea una respuesta inmune

adecuada. Los pacientes neutropénicos (inmunosuprimidos) pueden no

responder al tratamiento antimicrobiano, aún cuando el microorganismo sea

sensible en ensayos in vitro. Por otro lado, muchas alteraciones metabólicas del

paciente pueden afectar la farmacocinética del antimicrobiano, pues por

ejemplo, podría permanecer como pro-droga (forma inactiva) o presentar una

penetración tisular disminuida con la consiguiente baja concentración en el sitio

de infección. También, las interacciones entre fármacos (entre otras) también

pueden alterar la farmacocinética del antimicrobiano.

En todas estas situaciones descriptas puede ocurrir que la concentración de

antimicrobiano necesaria para inhibir efectivamente el crecimiento bacteriano

55

no puede ser alcanzada. Este es el complejo concepto de resistencia clínica,

que no siempre guarda relación con la resistencia antimicrobiana definida en

términos de métodos de laboratorio [59].

En algunos casos, la utilización de una terapia antimicrobiana combinada

puede resultar útil para ampliar el espectro antimicrobiano en infecciones

polimicrobianas, prevenir la aparición de resistencia, reducir la toxicidad de

algunos compuestos (especialmente cuando se requieren altas dosis para

lograr una concentración efectiva en el sitio de infección) y proporcionar una

actividad sinérgica cuando existe una multiresistencia bacteriana [101].

Desde un punto de vista general, algunos modelos farmacodinámicos de

distintas familias de antimicrobianos se encuentra ampliamente descripto. Así,

por ejemplo, para ejercer su efecto bactericida los ß-lactámicos requieren

(entre otros factores) superar los valores de CIM determinada in vitro durante

cierto tiempo (modelo tiempo-dependiente). En tanto que otros

antimicrobianos como los aminoglucósidos y quinolonas, presentan modelos

concentración-dependientes, requiriendo superar ampliamente los valores de

CIM en el sitio de infección. Sin embargo, estos modelos farmacodinámicos, así

como el efecto que ejerce el antimicrobiano (bactericida o bacteriostático),

depende del sitio de infección y debe ser evaluado para cada microorganismo

en particular [102].

En relación a nuestro tema de trabajo, el empleo de la terapia antimicrobiana

combinada es ampliamente utilizada con el objetivo de erradicar y controlar la

diseminación de patógenos en los PFQ, principalmente aquellos infectados con

P. aeruginosa por su implicancia clínica [103-105].

56

57

3 FACTORES DE VIRULENCIA

3.1 Enfoques de la virulencia y sus estrategias

La patogenicidad es la capacidad que posee un microorganismo de producir

daño. Sin embargo, no todos los microorganismos pertenecientes a una misma

especie bacteriana producen el mismo daño, pues el grado de patogenicidad

está determinado por los factores de virulencia presentes [106].

La capacidad de los patógenos exitosos para establecer infecciones, producir

la enfermedad y sobrevivir en un ambiente hostil es proporcionada, en parte,

por los factores de virulencia involucrados en un determinado mecanismo de

patogenicidad. Así, por ejemplo para poder invadir los tejidos, el patógeno

necesitará inicialmente colonizar al paciente, producir proteínas extracelulares

que promuevan la invasión, y simultáneamente evadir las defensas del

hospedador. En el transcurso del proceso puede provocar respuestas

inmunitarias exageradas y equivocadas como estrategia de evasión, y producir

toxinas que colaboren con la invasión y daño al hospedador [106].

Los factores de virulencia juegan un papel clave en el proceso de infección.

Son componentes estructurales, productos o estrategias que contribuyen a la

virulencia, y permiten a un microorganismo establecerse en o dentro de una

especie en particular y mejorar su potencial de causar enfermedad. Pueden

estar codificados en el cromosoma o en elementos móviles [106]. Las proteínas

housekeeping que se requieren para mantener las funciones celulares básicas

(y no están relacionadas con la patogénesis), no son consideradas como

factores de virulencia [107, 108].

Si bien los mecanismos patogénicos son complejos, muchos organismos distintos

comparten estrategias similares [106, 109-112].

58

A continuación se mencionan a modo de muy breve reseña introductoria, solo

algunos factores de virulencia asociados a la evasión de la respuesta

inmunitaria descriptos en distintos microorganismos.

Durante la colonización es necesario que el patógeno se adhiera y multiplique

(generalemente asociado a alguna superficie celular). Pueden participar de

este proceso diversas estructuras y proteínas, como las adhesinas, fimbrias,

proteínas de unión a fibronectina, receptores bacterianos a células eucariontes,

lectinas, componentes de la pared celular, cápsulas ricas en polisacáridos con

o sin restos de ácido siálico, etc. Incluso, las bacterias pueden colonizar al

crecer y conformar estructuras denominadas biofilms, que les permite contribuir

con la virulencia evitar a los elementos de la respuesta inmune [106].

También es necesario que compita con la microbiota normal y adquiera los

nutrientes necesarios. Así, distintas sustancias bacterianas que son liberadas al

medio pueden resultar útiles. Entre ellas, los péptidos antibacterianos como las

bacteriocinas que permiten inhibir el crecimiento de bacterias cercanas, las

sustancias quelantes (secuestrantes) de metales como los sideróforos (incluído el

salicilato) y sustancias almacenadoras de iones (como la ferritina bacteriana

fijadora de hierro), etc [113-116].

Posteriormente, para provocar la penetración de las barreras anatómicas, la

invasión de las células hospederas y la diseminación a distintos tejidos,

participan sustancias como invasinas, hialuronidasas, neuraminidasas,

coagulasas, colagenasas, hemolisinas, leucocidinas, lecitinasas, fosfolipasas,

endotoxinas, exotoxinas, etc [106].

Incluso desde que comienza la colonización es necesario que la bacteria

evada las defensas inmunitarias del hospedador, esa es la clave para el éxito

de un patógeno invasivo [106].

Uno de los elementos esenciales para iniciar la respuesta inmunitaria innata es el

reconocimiento de patógenos. Los receptores de reconocimiento de patrones

(pattern-recognition receptors, PRR), presentes en las células efectoras del

59

sistema inmune reconocen estructuras moleculares denominadas patrones

moleculares asociados a patógenos (PAMP, Pathogen-Associated Molecular

Patterns,) como lipopolisacáridos que se encuentran en forma abundante en los

microorganismos patógenos, como el peptidoglicano bacteriano o estructuras

ricas en manosa, el ADN bacteriano, entre otras moléculas. Los PAMP son

estructuras fundamentales para la vida del patógeno y son producidos

exclusivamente por estos, de forma que no se encuentran presentes en el

hospedador [117, 118]. Las bacterias pueden “camuflar” los PAMP que expresan

en su superficie, y de esta forma no sólo evadir el reconocimiento inmunológico

de los PRR sino que además impedir la activación celular que conduce a la

activación de las vías alternativa y de las lectinas del sistema complemento, lo

que implica una importante estrategia de evasión de la respuesta inmunitaria.

Las defensas fagocíticas puede ser sorteadas cuando el patógeno libera

sustancias con efecto repelente de fagocitos, lo que conduce a una inhibición

de la quimiotaxis de estas células. Aún cuando las bacterias sean fagocitadas,

estas pueden evitar o retrasar su muerte dentro del fagosoma al prevenir el

estallido respiratorio mediante enzimas, como catalasa, peroxidasa, superóxido

dismutasa, entre otras, que inactivan los productos intermediarios reactivos del

O2. La obtención de energía mediante la activación de vías metabólicas

secundarias en forma adaptativa frente a las condiciones de estrés, como el

ciclo del glioxilato, permite la latencia de los microorganismos fagocitados

[119]. También pueden secretar sustancias (como amoníaco) que neutralizan al

menos parcialmente la acidez del fagolisosoma, o minimizar la fusión fagosoma-

lisosoma. Algunas bacterias pueden escapar del fagosoma al liberar proteínas,

como las hemolisinas (incluyendo algunas fosfolipasas), que provocan la ruptura

de la membrana [120].

Luego de ser fagocitadas pueden evitar la activación de los macrófagos (y de

otras líneas celulares de defensa) mediante la liberación de sustancias

quimiotácticas o citoquinas. Además pueden inhibir la presentación de

antígenos, o incluso destruir al fagocito luego de un período de vida intracelular

[109-112].

60

Por el contrario, otras bacterias buscan adrede la fagocitosis, con el objetivo de

persistir en forma intracelular en las propias células del sistema inmune, sin ser

detectadas [111, 112].

Algunas bacterias basan sus características patogénicas en una forma

intracelular durante la infección, aunque sólo ocurra en un instante inicial de la

infección en los que producen una breve multiplicación intracelular con

posterior diseminación extracelular. Estos son usualmente denominados

patógenos intracelulares facultativos. Y para poder realizar esto están

involucrados múltiples factores de virulencia [106, 120].

Asimismo, pueden evadir la respuesta inmunitaria al camuflar sus antígenos de

superficie (mimetismo molecular), o por el contrario, recurriendo a numerosos y

constantes cambios antigénicos (variación antigénica). Un mismo factor de

virulencia puede estar involucrado en más de un proceso de los mencionados,

así por ejemplo, los polisacáridos capsulares colaboran en la adhesión inicial y

colonización del hospedador, a la vez que evitan la activación de la vía alterna

del sistema complemento. De forma que, al evitar la opsonización y

consecuente fagocitosis podría evadir además la respuesta adaptativa. [106,

108].

La comprensión de estos aspectos en común que presentan los

microorganismos patógenos es fundamental para el desarrollo de nuevos

agentes "anti-virulencia", que tanto se necesitan para reemplazar a los

antibióticos [106].

3.1.1 Búsqueda bioinformática de determinantes asociados a la virulencia

Las plataformas bioinformáticas como los servidores para la anotación funcional

de genes, sistemas de gestión de datos (pipelines) y diversos programas

computacionales, intentan facilitar el análisis de un gran volumen de datos

como los provenientes de la secuenciación de genomas o estudios

metagenómicos. Una parte mínima de los algoritmos que utilizan estas

herramientas se basa en la similitud de secuencias. Su valor predictivo principal

se encuentra en la inmensa capacidad para entrecruzar datos de distinta

61

índole y origen (data mining). Esta es la base para que la predicción de genes y

su función biológica predicha sean lo más cercanas a la realidad. En el Glosario

se encuentran mencionadas algunas de los conceptos bioinformáticas que más

se mencionaran a lo largo de este trabajo de tesis.

Actualmente, existen distintas bases de datos (en constante actualización)

exclusivas para la búsqueda de verdaderos genes de virulencia, genes

asociados a la virulencia y genes de estilo de vida de virulencia [121-123].

Determinar los factores de virulencia utilizados por una especie bacteriana

patógena resulta clave en la comprensión de la patogénesis, y para la

identificación de dianas para nuevos fármacos y el diseño de nuevas vacunas.

Los factores de virulencia pueden ser los objetivos potenciales de

medicamentos para tratar enfermedades infecciosas específicamente, sin

matar o inhibir el crecimiento bacteriano de otras [107, 108].

3.2 Las biopelículas bacterianas o biofilms

Las bacterias existen en la naturaleza esencialmente bajo dos formas o estados:

bacterias planctónicas de libre flotación y bacterias que en medio líquido son

capaces de adherirse irreversiblemente a un sustrato, interface, o unas con

otras, encerradas en una matriz de sustancias poliméricas extracelulares que

ellas han producido y formar una biopelícula o biofilm. El biofilm es una

comunidad microbiana sésil y compleja, a menudo compuestas de múltiples

especies que interactúan entre sí y con su entorno. La mayoría de las bacterias

que se encuentran en entornos naturales, clínicos o industriales son capaces de

persistir en asociación con las superficies [124, 125].

El establecimiento del biofilm les aporta una protección adicional, en la que

ocurre una sensibilidad bacteriana reducida a los antimicrobianos junto con

una evasión de las defensas del hospedador, lo cual contribuye a la

persistencia de las infecciones con la consecuente implicancia clínica [124-128].

De hecho, frecuentemente la población del biofilm se encuentra en un estado

62

refractario a los agentes antimicrobianos, independientemente de la

sensibilidad que se pueda observarse in vitro en la población planctónica. Esta

característica parece tener un origen multifactorial generada por la barrera de

difusión a la penetración de los antimicrobianos que constituye la matriz de

exopolisacáridos, con crecimiento más lento de las bacterias del biofim debido

a la limitación de nutrientes, la existencia de microambientes que antagonizan

con la acción del antibiótico y la activación de respuestas al estrés (responsable

de cambios fisiológicos bacterianos que combaten los efectos de los

antimicrobianos) [126-128].

3.2.1 Regulación de la formación y establecimiento de biofilms

Los eventos que regulan las etapas de formación y establecimiento del biofilm

están mediados por señales químicas que permiten la coordinación entre las

comunidades [124]. Estos mecanismos de comunicación celular pueden ocurrir

mediante señales de largo alcance dependientes de la densidad poblacional o

mediante señales de corto alcance.

El mecanismo de regulación de la formación del biofilm por quórum sensing

(QS) o señales dependientes de la densidad poblacional se ha encontrado en

bacterias de muy diversos géneros. El monitoreo de la densidad celular es

realizado de manera indirecta, a través de pequeñas moléculas difusibles, que

ellas mismas producen y pueden percibir, así controlan su comportamiento en

respuesta a las variaciones en el número de células [129]. La estrecha

proximidad célula-célula facilita la comunicación mediante estas moléculas y

beneficia a la bacteria al permitirle percibir la presencia de microorganismos

vecinos. De esta forma, cada bacteria que se une a una superficie produce

una molécula señal, de manera tal que mientras más bacterias permanezcan

asociadas, se incrementa la concentración local de esta señal. Una vez logrado

esto, se inducen diferentes fenómenos en la bacteria, para finalmente activar la

diferenciación en el biofilm. Las moléculas señalizadoras o auto-inductoras (AI)

más conocidas en las bacterias son las AHL que predominan en bacterias gram

negativas y son expulsadas de las células mediante bombas de eflujo de la

familia RND y otros transportadores que parecen ser específicos de estas

63

moléculas. Una vez conseguida una densidad poblacional suficiente, estas

señales alcanzan las concentraciones requeridas para activar los genes

implicados en la diferenciación del biofilm [130].

Opuesto a la regulación por QS se encuentra el mecanismo de señales de corto

alcance, que requiere el contacto directo célula-célula para el intercambio de

información y que utiliza una señalización intracelular mediada por segundos

mensajeros como adenosín monofosfato cíclico (AMPc) y di-guanosín

monofosfato cíclico (di-GMPc), que también están implicados en otros procesos

celulares, evidenciando una compleja red de regulación génica.

Por otro lado, la vía más recientemente descripta en Psedomonas sp., la vía

Gac/Rsm, que se interconecta con la regulación por QS y por corto alcance

mediante la activación de genes en cascada, y que regula distintos procesos

para favorecer a la formación del biofilm, como reprimir la movilidad

bacteriana e inducir la formación de sustancias mucilaginosas [130].

Todos estos sistemas de señalización pueden estar presentes en una misma

especie simultáneamente. Por su importancia clínica, si bien la formación de

biofilms en P. aeruginosa es una de las más descriptas, aun no esta

completamente dilucidada. Presenta (al menos) 4 vías de regulación: la

señalización AMPc/Vfr, di-GMPc, el sistema de QS y la vía Gac/Rsm [130].

Inquilinus limosus presenta la habilidad de formar biofilms simples y mixtos con P.

aeruginosa en ensayos in vitro [131, 132]. Sin embargo se desconocen los genes

que podrían estar implicados en el proceso de formación y establecimiento del

biofilm, así como las propiedades que presenta el biofilm formado y su

implicancia en los PFQ.

3.2.2 Análisis sobre biofilms formados en ensayos in vitro

La formación de biofilm puede ser estudiada in vitro en distintos dispositivos,

como la cámara de Calgari y en policubetas (microplacas). Puede

cuantificarse la biomasa de biofilm formada en distintas condiciones,

evaluando posteriormente el total de células que lo conforman (viables y no

viables) por tinción de las mismas con cristal violeta, un colorante básico que se

64

une a las cargas negativas superficiales de las moléculas y polisacáridos de la

matriz extracelular. Sin embargo, este ensayo no contribuye a la evaluación de

la viabilidad de las células en el biofilm [133].

Es posible estudiar un biofilm intentando caraterizar la sensibilidad a distintos

antimicrobianos que presentan las células que lo constituyen.

Experimentalmente pueden determinarse algunos parámetros para establecer

comparaciones entre el comportamiento de las poblaciones planctónicas y

sésiles [134, 135]. Algunos de estos son:

CIM del biofilm (CIM-b), definido como la menor concentración de

antimicrobiano que impide el desarrollo de la población planctónica

provenientes de la disrupción bacteriana del biofilm.

Concentración mínima de erradicación del biofilm (CMEB) definido como la

menor concentración de antimicrobiano necesaria para desprender el

biofilm y erradicarlo del pocillo (o dispositivo de ensayo).

Concentración mínima de recrecimiento (CMR) definido como la mínima

concentración de antimicrobiano que luego de actuar sobre el biofilm

impide el crecimiento posterior (recrecimiento) de la población microbiana

remanente.

65

HIPÓTESIS Y OBJETIVOS

Ahora bien, es necesario considerar que las combinaciones de antimicrobianos

(como las que reciben por ejemplo los PFQ) pueden ser la antesala de su uso

irracional, si las estrategias de defensa que utiliza el microorganismo no son

consideradas en el análisis. Si el fenómeno de resistencia clínica es

acompañado además por el desconocimiento de los perfiles de sensibilidad de

los diferentes gérmenes (en la comunidad y en las instituciones) se favorece al

uso indiscriminado e irracional de antimicrobianos, contribuyendo a la presión

selectiva necesaria (y en muchos casos suficiente) para una efectiva

diseminación y selección de los genes de resistencia por transferencia

horizontal.

Aunque, el perfil de multiresistencia de I. limosus e Inquilinus sp. se encuentra

ampliamente reportado, hay un desconocimiento absoluto acerca de los

mecanismos de resistencia asociados a la misma. Por lo tanto, para minimizar en

parte esta situación, es menester conocer los mecanismos moleculares

involucrados en la resistencia antimicrobiana a fin de instaurar tratamientos

exitosos, proporcionar las bases para el descubrimiento y síntesis de nuevos

fármacos antimicrobianos y conocer las plataformas biológicas de donde estos

genes podrían ser reclutados. Sin embargo, aún en presencia de un tratamiento

empírico anti-Inquilinus que fuera exitoso, el paciente podría no recibirlo debido

a la dificultad que existe para asignar esta especie bacteriana en forma

correcta.

La virulencia y la resistencia a los antimicrobianos son mecanismos considerados

similares del punto de vista de la adaptación selectiva que le permiten a la

bacteria sobrevivir en condiciones hostiles de estrés, durante la invasión al

hospedador o bajo tratamiento antibacteriano. Ambas situaciones constituyen

un “cuello de botella evolutivo” tendiente a reducir la diversidad genética

bacteriana; del que surge un pequeño grupo de bacterias, específicas,

capaces de colonizar el hospedador bajo ciertas condiciones. Así, resulta

relevante evaluar la capacidad que presenta Inquilinus para persistir por

66

tiempos prolongados en estos pacientes, y analizar si esta situación (además de

por su multiresistencia antimicrobiana) está vinculada a la formación de

biofilms, a la presencia de una estrategia patogénica que le permita evadir la

respuesta inmune, entre otras situaciones posibles.

Lo aquí expuesto permitió elaborar la siguiente hipótesis sobre la cual se

desarrolló este trabajo de tesis.

Hipótesis de trabajo

El conocimiento del genoma de este microorganismo, la caracterización

genética y molecular de los mecanismos de resistencia asociados y la respuesta

del microorganismo tanto en su estado planctónico como al formar biofilm en

presencia de diferentes antimicrobianos permitirán conocer la potencialidad de

I. limosus como patógeno oportunista emergente en los PFQ, a la vez que

resulten en un aporte de información para proponer tratamientos tendientes al

éxito terapéutico.

67

Objetivos

El objetivo general de este trabajo se enfoca en el estudio bioquímico y

molecular de I. limosus. Se contempló analizar las herramientas disponibles para

la detección microbiológica y molecular, conocer los mecanismos de

resistencia presentes y aportar información para caracterizar a este patógeno

emergente en los PFQ.

El desarrollo del estudio se realizó con base en los siguientes objetivos.

Objetivos específicos:

1. Acerca de la identificación, conservación y tipificación de aislamientos

clínicos provenientes de PFQ y no FQ:

a) Analizar metodologías convencionales y alternativas para identificar a este

microorganismo, y diferenciarlo de otros comúnmente presentes en los PFQ.

b) Estudiar la conservación y recuperación de microorgnismos viables de I.

limosus.

c) Evaluar la relación de clonalidad entre aislamientos clínicos secuencialmente

recuperados de un mismo PFQ a lo largo del tiempo y tras recibir distintos

tratamientos antimicrobianos.

2. Acerca de la caracterización de los mecanismos responsables de la

resistencia a los antibióticos ß-lactámicos y no ß-lactámicos:

a) Evaluar y comparar el perfil de sensibilidad de distintos aislamientos clínicos

de I. limosus frente a diferentes familias de antimicrobianos.

b) Caracterizar las posibles ß-lactamasas presentes en los aislamientos en

estudio. Estudiar el entorno genético donde se localizan las mismas.

c) Analizar la presencia de las potenciales BE presentes en de I. limosus y

evaluar su funcionalidad.

d) Estudiar la velocidad de muerte del microorganismo frente a posibles

combinaciones estratégicas de antimicrobianos.

68

3. Acerca de la presencia de biofilm y su implicancia clínica:

a) Evaluar la formación de biofilm y su rol en la sensibilidad del microorganismo

frente a diferentes familias de antibióticos.

b) Comparar la biomasa formada por diferentes aislamientos de Inquilinus en

ausencia y presencia de diferentes antibióticos.

4. Acerca de su genoma:

a) Realizar la secuenciación completa del genoma de un aislamiento clínico

de I. limosus. Realizar un análisis bioinformático del mismo.

b) Detectar y analizar in silico los posibles determinantes asociados a la

virulencia y la resistencia a antimicrobianos.

c) Caracterizar su relación taxonómica con otros microorganismos mediante la

reconstrucción filogenética al emplear diferentes marcadores moleculares

(clásicos y no convencionales).

69

MATERIALES y METODOLOGÍA

PARTE I - Microbiología Clínica Aplicada

1 AISLAMIENTOS CLÍNICOS: SU IDENTIFICACIÓN, TIPIFICACIÓN Y

CONSERVACIÓN

1.1 Aislamientos bacterianos

Inicialmente, en el año 2006, se recuperó un BGNNF de lento desarrollo y

aspecto mucoso a partir del esputo de un PFQ pediátrico concurrente al

Hospital de Niños “Dr. O. Alassia” (Santa Fe, Argentina) desde los 2 años de vida.

En ese momento, el paciente de 8 años de edad, homocigota para la

mutación ΔF508, y cuya familia realiza actividades vinculadas al cultivo agrario,

presentó un estado de exacerbación del cuadro clínico respiratorio. Este

aislamiento recibió la denominación “MP” y se nombró según su año de

recuperación (2006): MP06. La misma muestra de esputo también presentó otros

microorganismos: P. aeruginosa (fenotipo mucoso), S. aureus, C. albicans y A.

fumigatus.

Luego, en los años 2010 y 2012, se recuperaron del esputo del mismo PFQ lo que

pareció ser el mismo espécimen bacteriano por la presencia de características

similares con las previamente observadas en el año 2006. En ambas

oportunidades las muestras fueron tomadas durante el procedimiento de

control, con el paciente en estado clínico estable (según la comunicación

personal del médico infectólogo Dr. Fernando Meneghetti). Ambos aislamientos

se denominaron MP10 y MP12, respectivamente. Nuevamente se recuperaron

las mismas especies microbianas como organismos acompañantes.

En el año 2013 uno de los microorganismos recuperados del esputo del mismo

PFQ durante un control en estado clínico estable presentó características

70

similares a las que se habían observado previamente, aunque el laboratorio de

Bacteriología advierte algunos posibles cambios en el antibiotipo observado,

derivando este aislamiento para su estudio. Una vez en nuestro laboratorio se

observa la presencia de 2 microorganismos de lento crecimiento, que fueron

denominados según su aspecto macroscópico distintivo, como mucoso (M) y

no mucoso (NM): MP13- M y MP13-NM.

Los aislamientos “MP” colectados durante el período 2006-2013 fueron

recuperados y derivados para su estudio por la Dra. María Rosa Baroni,

bioquímica del Laboratorio de Bacteriología de dicho hospital.

Otro de los aislamientos estudiados, denominado 161-13, fue recuperado en el

año 2013 en el Hospital de Clínicas “José de San Martín”, CABA, Argentina. En

este caso, el aislamiento 161-13 fue obtenido de un hemocultivo positivo de un

paciente no FQ (de 4 hemocultivos realizados), al que se consideró como un

contaminante sin relevancia clínica y fue inicialmente identificado mediante

MALDI-TOF como I. limosus (comunicación personal del Dr. Carlos Vay).

Además, se incluyeron dos aislamientos del género Inquilinus, I. limosus LMG

20952T e Inquilinus sp. LMG 20953, que corresponden a la cepa tipo de I. limosus

AU0476T y a Inquilinus sp. AU1979, respectivamente, caracterizadas por Coenye

et al en la descripción inicial del género Inquilinus y especie I. limosus. Estos

fueron obtenidos en la colección de cultivos microbianos “Belgian Coordinated

Collections of Microorganisms / Laboratory of Microbiology Gent Bacteria

Collection” (BCCM/LMG).

Los microorganismos y medios de cultivo utilizados para el desarrollo de este

trabajo de tesis se describen en el Anexo I.

71

1.2 Caracterización fenotípica

1.2.1 Morfología macroscópica

La comparación subjetiva del aspecto macroscópico de los aislamientos

estudiados con la correspondiente a las cepas de referencia se realizó por

agotamiento en superficie en agar Levine (ALev) y en agar tripteína soja (TSA)

(Laboratorios Britania S.A., Argentina) después de incubación de las placas de

forma no invertida a 37°C durante 2-4 días registrando el aspecto, color, bordes

y tamaño de las colonias [1].

1.2.2 Morfología microscópica

La observación microscópica se realizó por microscopía de campo claro

empleando un equipo marca Olympus Color 3 modelo BX51 (America Inc.

Melville, NY, EEUU) con objetivo de inmersión (100X) y ocular (10X), tanto sobre

tinciones de gram de los respectivos cultivos puros en TSA, como para las

tinciones de Duguid y Hiss [136] para la visualización de cápsula. Las imágenes

microscópicas se recolectaron por medio de la cámara digital acoplada al

equipo mencionado, y se digitalizaron mediante el programa Image-Pro® Plus

v.6.2 (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD, EEUU). El protocolo seguido para

las tinciones diferenciales se encuentra en el Anexo II.

1.2.3 Pruebas bioquímicas convencionales de laboratorio, sistema de galerías

API® y sistema automatizado VITEK®

Los aislamientos “MP” fueron derivados a la Cátedra de Microbiología para su

estudio habiendo intentado identificarse un cultivo fresco y puro, en TSA,

mediante el sistema comercial automatizado VITEK®2 (bioMérieux Marcy-l’Etoile,

Francia) por el Laboratorio de Bacteriología del Hospital de Niños “Dr. O.

Alassia“, el cual informó al aislamiento MP06 como “no identificable” (según la

comunicación personal de la Dra. María Rosa Baroni). Por lo que se evaluaron

otras características fenotípicas para realizar la identificación bacteriana.

Se emplearon pruebas bioquímicas convencionales de laboratorio para BGNNF

[137] y la galería comercial para BGN no entéricos, nutricionalmente no

72

exigentes API® 20 NE (bioMérieux) para proceder a la identificación de los

aislamientos y a su vez se emplearon los resultados de cada prueba bioquímica

para completar una descripción que permita arribar a una identificación

fenotípica.

Los medios de cultivo y galerías comerciales se prepararon y utilizaron de

acuerdo a las sugerencias de cada fabricante. Los aislamientos fueron

cultivados en placas de Petri con TSA, incubados a 35°C por 48 h en posición

no-invertida debido a su mucosidad, para ser utilizados para inocular tanto las

pruebas bioquímicas como la galería API®. Las pruebas bioquímicas se

incubaron a 35°C. La interpretación como positiva o negativa se realizó según

las especificaciones de cada fabricante y según la bibliografía consultada

[137]. Por otro lado, a diferencia de lo estipulado por los fabricantes, se

prolongó el periodo de incubación, en cámara húmeda. Las pruebas se

observaron diariamente durante un período máximo de 1 semana. Si luego de

ese periodo no se observaron cambios, la prueba se consideró negativa. Se

incluyeron microorganismos de colección sugeridos por los fabricantes como

control de la prueba bioquímica para evitar falsas interpretaciones. Se

realizaron los ensayos para la detección de:

● La enzima citocromo c-oxidasa (oxidasa). Se utilizaron discos impregnados

con oxalato de dimetil-p-fenilendiamina (Laboratorios Britania S.A.).

● La enzima catalasa utilizando peróxido de hidrógeno al 3% (v/v).

● La utilización del citrato como única fuente de carbono y las sales de amonio

inorgánico como única fuente de nitrógeno (citrato de Simmons) (Laboratorios

Britania S.A.), dispensado en tubos de hemólisis de vidrio, en pico de flauta.

● La hidrólisis de esculina (API® 20 NE).

● La enzima ß-galactosidasa (API® 20 NE).

● La utilización de distintos sustratos: ácido adípico, L-arabinosa, ácido cáprico,

ácido cítrico, D-maltosa, D-manitol, D-manosa, Gluconato de potasio, N-acetil-

glucosamina, ácido fenilacético, ácido málico (API® 20 NE).

● La reducción de nitratos a nitritos y de nitratos a nitrógeno (denitrificación)

(API® 20 NE).

73

● La alcalinización del medio por la hidrólisis de urea debido a la presencia de

la enzima ureasa. Se utilizó caldo con urea de Rustigian y Stuart (Laboratorios

Britania S.A.) alicuotado en tubos de ensayo, y agar base para urea de

Christensen (Laboratorios Britania S.A.) con el agregado de urea de alta pureza

(Sigma) dispensado en pico de flauta. También se realizó con galería comercial

(API® 20 NE). (Ureasa).

● La producción de sulfhídrico, (SH2-SIM) (Laboratorios Britania S.A.).

● La producción de acetoína como producto intermedio en la fermentación

butanodiólica, por la prueba de Voges-Proskauer (API® 20 NE).

● La producción de triptofano deaminasa, mediante la formación de indol,

(Indol-SIM) (Laboratorios Britania S.A.), al agregar unas gotas de Reactivo de

Ehrlich (Laboratorios Britania S.A.) en la superficie del medio SIM. En este caso se

realizó además con la galería comercial (API® 20 NE).

● La producción de arginina dehidrolasa mediante la hidrólisis de L-arginina

(API® 20 NE) cerrando la galería con aceite mineral.

● La producción de lisina decarboxilasa por decarboxilación de L-lisina

(Laboratorios Britania S.A.).

● La producción de ornitina decarboxilasa por decarboxilación de L-ornitina

(Laboratorios Britania S.A.).

● La producción de fenilalanina deaminasa (Laboratorios Britania S.A.).

● La producción de gelatinasas mediante la hidrólisis de gelatina de origen

bovino (API® 20 NE).

● La oxidación/fermentación (O/F) de D-glucosa (API® 20 NE).

● La movilidad del microorganismo se evaluó mediante distintas metodologías;

con la galería comercial (API® 20 NE), por inoculación de la prueba SIM

(Laboratorios Britania S.A.) y por observación mediante microscopía de campo

claro al fresco con solución fisiológica empleando un objetivo de 40X y ocular

de 10X (Microscopio Olympus Serie CX2, NY, EEUU).

● La producción de hemolisinas, por cultivo de los microorganismos en placas

de Petri con TSA suplementado con 5% de sangre. Se ensayó tanto el agregado

de sangre ovina (Laboratorios Britania S.A.) como humana. Las placas se

74

incubaron en forma no invertida (para evitar que el cultivo mucoso caiga sobre

la tapa de la placa), en atmósfera normal, 37°C durante 48-72 h.

● La capacidad de desarrollo en medios de cultivo con diversas características:

con alto contenido de sales biliares (agar Mac Conkey, Laboratorios Britania

S.A.), con alto contenido de cloruro de sodio (agar Chapman, Laboratorios

Britania S.A.), con eosina, azul de metileno y lactosa (ALev, Laboratorios Britania

S.A.), caldo con distinto contenido de cloruro de sodio (3 y 6% NaCl) y en agar

selectivo para Burkholderia cepacia (BCSA) (Laboratorios Britania S.A.), cuya

fórmula contiene polimixina B (POL) (600.000 UI/L), gentamicina (GEN) (10,0

mg/L) y vancomicina (VAN) (2,5 mg/L).

● El desarrollo en caldo tripteína soja (TSB, Laboratorios Britania S.A.) a 37 y 42°C

en baño de agua (Viking S.R.L., Argentina).

1.2.4 Espectrometría de masa por MALDI-TOF

Se evaluó la identificación de los aislamientos estudiados mediante

espectrometría de masa por MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption

Ionization-Time of Flight). Los cultivos fueron desarrollados en medio de cultivo

AMH (agar Müeller Hinton, Laboratorios Britania S.A), incubadas a 37°C durante

el menor tiempo posible para obtener cultivos jóvenes (30 hs de incubación

aproximadamente). Las muestras se procesaron en un espectrómetro Microflex

MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania) y se analizaron mediante el

software acoplado FlexControl v3.0 (Bruker Daltonics). La determinación se

realizó en el laboratorio de la sección “Bacteriología”, del Hospital de Clínicas

“José de San Martín”, de la CABA. Se incluyeron las cepas de colección I.

limosus LMG 20952T e Inquilinus sp. LMG 20953. Además se incluyó el estándar de

proteínas N°1 (Bruker Daltonics) para la calibración del equipo. Todas las

muestras fueron analizadas por duplicado.

El análisis se realizó por metodología directa desde el medio de cultivo (es decir,

sin paso previo de extracción proteica). Solo si los puntajes de la identificación

fueron menores a 2, se repitieron con un paso previo de extracción de proteínas

[138-140]. Para el análisis por metodología directa, se tomó una colonia

empleando un palillo de madera, la cual se depositó sobre una placa para

75

MALDI-TOF y se dejó secar a temperatura ambiente. Posteriormente, las

muestras se fijaron con 1 µl de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico para permitir la

co-cristalización de la solución matriz con la muestra a temperatura ambiente.

Cuando se realizó el paso de extracción proteica previo al análisis de los

muestras se empleó el protocolo de extracción y kit comercial (Sigma) sugeridos

por el fabricante.

Los positrones se extruyeron linealmente a una aceleración de 20 kV. Los

espectros obtenidos representan la suma de los iones obtenidos luego del

impacto (en distintas regiones de un mismo pocillo) de 350 disparos automáticos

del láser. Los espectros se analizaron en un rango de m/z (relación masa/carga

iónica) de 3.500 a 20.000.

La identificación se realizó utilizando el programa MALDI BiotyperTM v3.1 (Bruker

Daltonics) por comparación entre los espectros de masa obtenidos para los

microorganismos en estudio respecto de los que están incluidos en su base de

datos. Se consideró un error posible de una variación de +10 del valor del pico

de m/z. Los resultados se interpretaron a partir del puntaje que el software le

asignó a cada muestra (en el contexto del análisis que se realizó sobre los

microorganismos en estudio) [138, 139].

1.2.5 Estudio del perfil proteico total mediante electroforesis en geles de

poliacrilamida desnaturalizantes (SDS-PAGE).

Se resuspendió una ansada de los respectivos cultivos puros, desarrollados en

iguales condiciones de cultivo [infusión cerebro corazón agar (BHIA,

Laboratorios Britania S.A.), 37°C, 48 h] en 200 µl de agua calidad Milli Q con 20 µl

de una solución de lisis formada por SDS al 10% (p/v) y 1% de NaOH (p/v). Se

extrajeron las proteinas solubilizables luego de incubar en baño de agua a

100°C durante 20 minutos. Alicuotas de 75 μl fueron desnaturalizadas con 25 μl

de buffer muestra durante 10 min en baño de agua a 100°C, se centrifugó

durante 2 min a máxima velocidad en microcentrífuga a temperatura ambiente

(Sorvall Legend Micro 17, Thermo Scientific, Alemania) y se conservó en baño de

hielo. Un volumen de 8 μl se resolvió por SDS-PAGE al 12% en una minicuba (Mini

Protean® System, Bio-Rad), conectada a una fuente a 100 V (PowerPacTM HC,

76

Bio-Rad). Los geles de poliacrilamida y buffers se prepararon como se indica en

el Anexo III.

En la corrida electroforética se incluyó un marcador de peso molecular

comercial pre-teñido (SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range, Bio-

Rad). Además se incluyó una cepa no relacionada con el género Inquilinus (P.

aeruginosa ATCC 27853). Luego de la electroforesis, se revelaron las bandas

proteicas en los geles de poliacrilamida por coloración con azul brillante de

Coomasie [1, 141].

1.3 Caracterización genotípica

1.3.1 Métodos basados en la secuenciación de segmentos de ADN

La identificación molecular de los aislamientos se realizó mediante un análisis

comparativo de la secuencia nucleotídica que codifica para el ARN ribosomal

16S respecto (ARNr 16S) de secuencias depositadas en bases de datos [142]. La

amplificación de secuencias de ADN se realizó mediante la reacción en

cadena de la polimerasa (PCR) con los oligonucleótidos cebadores 16S-27F y

16S-1492R que hibridan en segmentos conservados del dicho gen, en un

termociclador (TGradient, Biometra, Alemania). La mezcla de reacción, el

protocolo de ciclado, y las secuencias de los cebadores empleados se detallan

en el Anexo IV. Se obtuvo un amplicón de aproximadamente 1300 nucleótidos

del gen ARNr 16S. La secuenciación se realizó sobre ambas cadenas según se

comenta en el apartado 7.1.

Las secuencias obtenidas se ensamblaron manualmente con la aplicación

“Assemble” del programa Vector NTI Advance ™ 11 (Invitrogen) y se

compararon con las secuencias completas o casi completas del gen

codificante del ARNr 16S depositadas en los repositorios públicos Ribosomal

Database Proyect (RDP-II) [143] y DDBJ/EMBL/GenBank [144]. Los alineamientos

múltiples y ediciones de gaps y longitud se realizaron con el programa Clustal X

77

v2.1 [145]. Los dendrogramas se construyeron con el algoritmo del vecino más

cercano [146] realizando las matrices de distancia con el software MEGA 5.05,

con el cual también se editaron las longitudes a comparar. Además se incluyó

un outgroup conformado por una bacteria no perteneciente a la clase

Alfaproteobacteria. Se midió la robustez realizando un bootstrap de 1000

réplicas. La visualización y edición del árbol se realizó con el programa FigTree

v1.3.1.

1.4 Tipificación molecular por electroforesis en gel de campo pulsado

Se analizó la relación clonal de los aislamientos estudiados por comparación de

los pulsotipos obtenidos mediante electroforesis en gel de campo pulsado

(PFGE). Se incluyeron las cepas de colección I. limosus LMG 20952T e Inquilinus

sp. LMG 20953.

Los microorganismos se cultivaron en medio AMH, a 37°C por 48 hs. Las colonias

se resuspendieron en buffer Tris-NaCl 0,5 M pH 7,6. La densidad óptica (DO) de

la suspensión se ajustó a 0.08 mediante un espectrofotómetro (T80 UV/VIS, PG

Instruments Ltd), realizando las lecturas a una longitud de onda de 620 nm,

temperatura ambiente y un paso óptico de 1 cm. El ADN total se extrajo en

moldes de agarosa (“plugs”) según fue descrito previamente [147, 148], y se

realizó la macrorrestricción con endonucleasas que, por datos bibliográficos

previos [41, 42], se conoce que potencialmente permiten obtener un patrón de,

al menos, 10 fragmentos [149].

Para cada microorganismo en estudio se prepararon varios plugs. El ADN total

se digirió in situ, por separado, con las endonucleasas de restricción XbaI

(Fermentas) y BcuI (Fermentas) en una concentración final de 30 U/plug, en

presencia del buffer recomendado para cada enzima, a 37°C durante 20 h. El

PFGE se realizó en un equipo con variante CHEF (Contour-clamped

Homogeneous Electric Field) (CHEF-DR III system, Bio-Rad). Los parámetros de

corrida fueron los siguientes: pulso inicial de 5 s, pulso final de 60 s, ángulo 120°,

voltaje 6,0 V/cm. Los fragmentos se separaron en el gel de agarosa calidad

78

PFGE (Bio-Rad) al 1% en TBE 0,5X (Bio-Rad) por electroforesis en campo pulsado

durante 20 h, a una temperatura de 14°C. Los geles se tiñeron con 0,5 µg/ml de

bromuro de etidio, se visualizaron y fotografiaron bajo luz UV (GelDoc, Bio-Rad).

Los patrones de bandas de ADN obtenidos se compararon por inspección visual

y se interpretaron según los criterios de Tenover et al. [149] y los reportes

realizados por distintos autores acerca del empleo de PFGE en el género

Inquilinus [41, 42].

1.5 Ensayos de conservación

Se ensayaron distintos métodos de conservación para el aislamiento MP06,

como repique, congelamiento y supercongelamiento [150, 151]. Las variables

que se estudiaron fueron:

● la temperatura de conservación (ambiente, y 8, 37, -20 y -196)°C,

● el agente crioprotector (sin agregado, glicerol (Merck, Darmstadt, Alemania)

al 20% (v/v) y leche descremada en polvo (San Regim, Sancor, Argentina) 10 %

(p/v), previamente esterilizados por calor húmedo (a 121°C, 15 min y 116°C, 30

min, respectivamente), y

● el medio de contención del inóculo utilizado: criotubos plásticos o botellas

con medio TSB o caldo infusión cerebro corazón (BHI), (Laboratorios Britania

S.A.), agar semisólido al 0,8% (p/v) dispensado en criotubos, placas de Petri con

TSA y criotubos con agua destilada previamente esterilizada.

Los inóculos empleados se prepararon a partir de aislamientos por agotamiento

en superficie en BHIA y se incubaron a 35°C por 48 h.

Se evaluó la recuperación del inoculo viable en botellas con 20 ml de BHI,

tomando 200 µl de alícuota de cada conservación a distintos tiempos de

almacenamiento: 1, 2, 6, 9, 12, 37 y 66 meses. Se registró la presencia o ausencia

de desarrollo (y posteriormente se confirmó la pureza del cultivo por aislamiento

en BHIA).

79

2 ENSAYOS DE SENSIBILIDAD FRENTE A DROGAS ANTIMICROBIANAS:

DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE MECANISMOS

DE RESISTENCIA

Si bien las pruebas de sensibilidad para el género Inquilinus aún no se

encuentran estandarizadas por ningún comité, los ensayos se realizaron

siguiendo las recomendaciones metodológicas generales del CLSI [152] con

tiempos de incubación adaptados al microorganismo en estudio.

Los microorganismos empleados como controles de los distintos ensayos

realizados se encuentran descriptos en el Anexo I: E. coli ATCC 25922, E. coli

ATCC 35218, Enterococcus faecalis ATCC 29212, S. aureus ATCC 25953, P.

aeruginosa ATCC 27853. Todos los ensayos se realizaron con medios Müeller

Hinton, agar y caldo (AMH y CMH) de origen comercial (Laboratorios Britania

S.A.), preparados según las indicaciones del fabricante.

2.1 Ensayo cualitativo por difusión en medio sólido: Antibiograma

La preparación del inoculo se realizó por el método directo de inoculación a

partir de colonias aisladas y por el método de desarrollo previo, con protocolos

similares a los descriptos por el CLSI, con tiempos de incubación adaptados al

microorganismo en estudio. Ambos métodos se detallan a continuación:

● Método directo de inoculación a partir de colonias aisladas: el inóculo se

realizó en solución fisiológica (SF) a partir de colonias obtenidas en AMH, de 48 a

72 h de incubación (hasta aspecto mucoso). La turbidez de la suspensión se

ajustó con SF hasta ser semejante al tubo 0,5 de la escala de McFarland

(bioMérieux), por comparación visual con el estándar.

● Método de desarrollo previo: a partir de un cultivo puro en AMH incubado por

48 h a 35°C, se seleccionaron 4 o 5 colonias bien aisladas de igual morfología

de la placa de cultivo. Se preparó una suspensión en una botella con 20 ml de

CMH y se incubó a 35 ºC en agitación hasta que este alcanzó o excedió

80

ligeramente la turbidez del estándar (de 6 a 8 h). Se ajustó la turbidez del

inoculo con SF o con CMH hasta el tubo 0,5 de la escala de McFarland, por

comparación visual con el estándar.

Los inóculos obtenidos, se sembraron con hisopo en placas con 4 mm de

espesor de AMH. Los ensayos se realizaron por duplicado. Los discos con cada

droga antimicrobiana o las combinaciones enunciadas se realizaron con discos

comercializados para tal fin (Laboratorios Britania S.A.).

Luego de colocados los discos, las placas inoculadas se incubaron (en posición

no-invertida) durante 48 h a 35°C en atmósfera normal, momento en el que se

midieron los halos de inhibición. En tanto, los controles fueron incubados durante

16 h, momento en que se leyeron sus resultados.

Los discos ensayados fueron:

Agente Antimicrobiano

Contenido

del disco

(µg)

Agente Antimicrobiano

Contenido

del disco

(µg)

Ácido Nalidíxico NAL 30 Cloranfenicol CLO 30

Amicacina AMI 30 Colistín COL 10

Amoxicilina AMX 20 Eritromicina ERI 15

Amoxicilina+ác.clavulánico AMC 20+10 Estreptomicina STR 10

Ampicilina+sulbactama AMS 10+10 Fosfomicina FOS 200

Azitromicina AZI 15 Gentamicina GEN 10

Aztreonam AZT 30 Imipenem IMI 10

Cefalotina CEF 30 Kanamicina KAN 30

Cefepime FEP 30 Levofloxacina LEV 5

Cefotaxima CTX 30 Meropenem MER 10

Cefoxitina FOX 30 Minociclina MIN 30

Ceftacidima CAZ 30 Nitrofurantoína NIT 300

Ceftacidima+ác.clavulánico CAZ+CLA 30+10 Piperaciclina PIP 100

Ceftriaxona CRO 30 Piperaciclina+tazobactam PZT 100+10

Ceftriaxona+ác.clavulánico CRO+CLA 30+10 Rifampicina RIF 5

Ciprofloxacina CIP 5 Tetraciclina TET 30

Clindamicina CLI 2 Trimetoprima + sulfametoxazol TMS 1,25+23,75

81

2.1.1 Detección fenotípica y caracterización de enzimas ß-lactamasas

Con la finalidad de detectar y caracterizar preliminarmente en forma fenotípica

la resistencia a antibióticos ß-lactámicos, se ensayaron las distribuciones

estratégicas de discos que se comentan a continuación [153-155].

Para la detección fenotípica de distintos tipos de enzimas ß-lactamasas se

distribuyeron los discos conteniendo las sustancias a ensayar según la ubicación

estratégica que se muestra en la Figura 6 (Ay B). Estos esquemas están basados

en las recomendaciones de la Subcomisión de Antimicrobianos (SADEBAC-

AAM) para BGN fermentadores y no fermentadores, y permiten inferir sobre la

presencia y tipo de ß-lactamasas implicadas en la resistencia de diferentes

bacilos gram negativos. Se ensayaron inicialmente las distancias sugeridas y

posteriormente se ensayó la variación de las mismas según el tamaño de los

halos de inhibición obtenidos.

Una deformación del halo de inhibición de CTX, CAZ y/o FEP, en la zona

adyacente al disco que contiene el inhibidor se interpretó como la posible

presencia de una ß-lactamasa de espectro extendido (ßLEE).

La detección de metalo-ß-lactamasas de clase B de Ambler con actividad

sobre carbapenemes se realizó empleando una modificación del ensayo de

sinergia descripto inicialmente por Arakawa et al en 1995 [156]. Se colocaron

discos con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) (1 μmol) entre discos con IMI

y MER a una distancia de 1 cm de borde a borde. Los discos con EDTA se

prepararon en nuestro laboratorio al impregnar discos de papel Whatman Nº 3

esterilizado con 2 µl de una solución de EDTA 500 mM pH 8,0. Una deformación

o incremento en el área de inhibición (“efecto huevo”) entre el disco que

contiene un carbapenem y la zona adyacente al disco con EDTA se consideró

como posible presencia de metalo- ß-lactamasas.

82

Figura 6. Distribución estratégica de discos para la detección fenotípica de ß-

lactamasas, según las recomendaciones de la Subcomisión de Antimicrobianos

(SADEBAC-AAM). En ambas figuras se señalan las distancias entre los bordes de los

discos. A: Distribución estratégica de los antibióticos para la detección de serino-ß-

lactamasas, AMC: ampicilina/ácido clavulánico, CTX: cefotaxima, CAZ: ceftacidima,

AMP: ampicilina, FOX: cefoxitina, FEP: cefepime, BOR: ácido 3-fenil borónico. B:

Distribución estratégica de los antibióticos para la detección de carbapenemasas

metalo-ß-lactamasas y carbapenemasas no metalo- ß-lactamasas, IMI: imipenem, MER:

meropenem, PZT: piperacilina/tazobactam, CAZ: ceftacidima, CAZ/CLA: CAZ/ácido

clavulánico, FEP: cefepime, EDTA: ácido etilendiaminotetraacético.

Para la detección de ß-lactamasas de clase A con actividad sobre

carbapenemes se colocaron discos con PZT y AMC entre IMI y MER (a una

distancia de 2 cm borde a borde).

Para la detección de ß-lactamasas de tipo GES se enfrentaron discos con CAZ e

IMI (1,5 cm borde a borde). Una deformación sinérgica en la zona de inhibición

ubicada entre estos discos se consideró como una posible presencia de este

tipo de enzimas, debido a la capacidad de IMI para inhibirlas.

Para la detección de enzimas de tipo AmpC, se estudió la inhibición en

presencia de cloxacilina (CLOX) [157]. Se enfrentaron discos conteniendo

CLOX 500 µg (ROSCO Neo-SensitabsTM, ROSCO Diagnostica, Taastrup,

Dinamarca) colocados a 1 cm, borde a borde, con discos conteniendo CAZ y

CTX. Una deformación (incremento) en la zona de inhibición entre los discos con

CAZ o CTX y el inhibidor (CLOX) se interpretaron como posible presencia de una

enzima de tipo AmpC.

83

Como estas enzimas de tipo AmpC también pueden ser inactivadas en

presencia de ácido 3-fenil borónico (BOR) [157], se enfrentaron discos con CEF,

FOX, CAZ, FEP, CTX+CLA y CAZ+CLA con discos de BOR (300 µg, Laboratorios

Britania S.A.) colocados a 1 cm de distancia entre borde y borde. Un efecto

sinérgico, observado como la deformación del halo de inhibición presente entre

el disco con antimicrobiano y el disco con BOR, se interpretó como posible

presencia de una enzima tipo AmpC.

2.2 Ensayo cuantitativo: Determinación de la concentración inhibitoria mínima

en medio líquido

Se determinó la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) de distintos

antimicrobianos por duplicado, mediante el método de microdilución en medio

líquido, según las recomendaciones generales del CLSI [158] aún cuando no

está descripto un protocolo estandarizado para el género Inquilinus.

Se ensayaron los siguientes antimicrobianos: NAL, AMI, AMX, AMC, AMP,

ampicilina + ác.clavulánico (APC), AMS, AZI, AZT, CEF, FEP, cefixima (FIX), CTX,

CTX+CLA, FOX, CAZ, CAZ+CLA, CRO, CRO+CLA, cefuroxima (FUR), CIP, CLO,

COL, FOS, GEN, IMI, MER, NIT, PZT, RIF, TET, tobramicina (TOB).

Se utilizaron policubetas estériles de 96 pocillos con fondo en “U” (Greiner Bio-

One) y CMH (Laboratorios Britania S.A.). Los inóculos se prepararon por el

método del desarrollo previo (detallado en el apartado 2.1), luego se ajustó su

turbidez respecto a la del tubo 0,5 de la escala de McFarland. Se realizaron

diluciones seriadas al medio de los antibióticos a ensayar. Se incluyeron los

controles de calidad interno de la determinación según las sugerencias del CLSI,

además de incluir los controles del medio de cultivo y de viabilidad del inóculo

utilizado. Las lecturas de CIM para las cepas en estudio se realizaron luego de 30

h de incubación. La lectura de los controles se realizó luego de 16 h de

incubación. El punto final se definió a simple vista por la falta de turbidez del

caldo en el pocillo.

84

Puntualmente para algunos antimicrobianos: LEV, MIN, TMS, doripenem (DOR),

ertapenem (ERT) y tigeciclina (TIG), el ensayo se realizó con el sistema comercial

Sensititre® GNXF para bacilos gram negativos no fermentadores (Trek Diagnostic

System, Gran Bretaña). Se realizó según las especificaciones del proveedor,

utilizando un inoculo preparado por el método de desarrollo previo (apartado

2.1). Se incluyeron los microorganismos sugeridos por el fabricante como

controles del procedimiento. Luego de 30 h de incubación a 35°C en atmósfera

normal se procedió a la lectura del ensayo. La lectura de los controles se realizó

luego de 16 h de incubación.

2.3 Ensayo de desarrollo en medio BCSA

Se analizó el desarrollo de los aislamientos estudiados en medio BCSA

(Laboratorios Britania S.A.) con la composición antimicrobiana comercial: POL

(600.000 UI/L), GEN (10,0 mg/L) y VAN (2,5 mg/L) y en el medio base de BCSA sin

el agregado de estos agente y solo adicionando un antimicrobiano a la vez en

placas de Petri realizadas en gradiente de concentración (POL de 0-600 UI/ml,

GEN de 0-10,0 µg/ml y VAN de 0-2,5 µg/ml). Se sembró una estría de cada

microorganismo y se registró la presencia o no de desarrollo microbiano a lo

largo de toda la estría sembrada luego de 96 h a 35°C.

85

3 FORMACIÓN DE BIOFILMS IN VITRO

3.1 Biofilms: Biomasa – CIM-b – CMEB –CMR

La formación de biofilms en condiciones in vitro se evaluó en policubetas

estériles de 96 pocillos con fondo plano (Greiner Bio-One), con un protocolo

similar al descripto previamente por Passerini et al [134], con modificaciones

para adaptarlo a los tiempos de crecimiento de los microorganismos en estudio.

Se estandarizó el inoculo con una turbidez comparable con el tubo 0,5 de la

escala de McFarland a partir de un cultivo en medio TSB incubado a 35°C en

forma estática durante 12 h. Se depositaron alícuotas de 200 µl en cada pocillo

de la policubeta, y se incubaron durante 72 h a 35°C, en atmósfera normal y en

condiciones estáticas.

Para realizar la cuantificación de la biomasa (en el biofilm formado) a

concentraciones sub-CIM de antibióticos se preparó el inóculo. Una vez

alicuotado se le agregó el antimicrobiano a ensayar: AZI, IMI, CIP, TOB y COL, en

una concentración final de 1, 0,12, 0,5, 512 y 512, µg/ml, respectivamente

(cercana a ½ de la CIM). Una alícuota de inoculo estandarizado permaneció

sin antibiótico y representó la biomasa formada en ausencia de antimicrobiano

(control). El ensayo fue realizado realizando 12 réplicas de cada aislamiento y

para cada condición ensayada (con o sin antimicrobiano). También se

incluyeron pocillos con TSB sin inocular, que representaron el control de

absorbancia del ensayo (DOc), que recibieron el mismo tratamiento posterior

que los pocillos inoculados.

Para realizar el lavado de los biofilms se descartó cuidadosamente el

sobrenadante de los cultivos y se emplearon 200 µl de buffer de fosfato salino

(PBS), (20 mM, pH 7,4), (Anexo III), que posteriormente se descartó. Una vez

lavados, los biofilms formados fueron secados y fijados por calor al colocar las

policubetas durante 15 min en la estufa a 56°C.

Posteriormente se colorearon con solución acuosa de cristal violeta (CV) 0,01%

(g/l) previamente filtrada. Luego de 30 min se descartó el excedente de CV por

86

aspiración suave con pipeta automática y se realizó un lavado con 200 µl de

PBS. El CV incorporado se solubilizó con 100 µl de etanol 95% (v/v). Luego de 30

min se determinó la densidad óptica (DO) de cada pocillo a 540 nm

empleando un lector de microplacas (MultiSkan EX, Thermo Scientific). El punto

de corte se definió como tres desviaciones estándar por sobre la media de la

DOc, la que fue restada a la medición de DO de cada pocillo. Se graficó la

DOmedia a 540 nm para los dodecuplicados, y su respectivo desvío estándar en

función de la ausencia o presencia de los distintos antibióticos ensayados en

concentraciones sub-CIM. El análisis estadístico incluyo análisis de varianza

seguido por el test de Tukey; en cada caso se representó para cada condición

la DOmedia 540nm ± desvío estándar. Los resultados se consideraron

estadísticamente significativas cuando P <0,05 (GraphPad Prism v6.3, California,

EEUU).

La sensibilidad del biofilm formado in vitro frente a distintos antibióticos se evaluó

mediante el estudio de los parámetros CIM-b, CMEB y CMR. Luego de realizar la

formación del biofilm como se describe al inicio de este apartado y de realizar

su lavado 200 µl de PBS, se los enfrentó a distintas concentraciones de

antibióticos. Se reservaron algunos pocillos que representaron los controles

correspondientes al medio de cultivo y de viabilidad. Las soluciones madre de

los antimicrobianos considerados en el estudio (AZI, IMI, CIP, TOB y COL), se

diluyeron en forma seriada, al medio, en el medio de cultivo CMH, de forma

que el rango de concentraciones a evaluar fue de 1 a 2048 µg/ml, en el pocillo.

Se incorporaron alícuotas de 100 µl de cada una de estas diluciones sobre el

biofilm preformado (4 réplicas). Las policubetas se incubaron durante 30 h a

35°C, en atmósfera normal.

Se consideró que CIM-b era la menor concentración capaz de inhibir la

aparición de turbidez en el sobrenadante, a la vez que se observó la presencia

del biofilm preformado en el fondo plano del pocillo.

El valor de CMEB fue establecido como la mínima concentración que

desprendía el biofilm del fondo del pocillo o daba ausencia de turbidez en todo

el pocillo.

87

En las mismas policubetas donde se evaluó CIM-b se evaluó la viabilidad

remanente que presentaban estos biofilms. Se extrajo el sobrenadante de los

pocillos, y se lavaron los biofilms cuidadosamente 1 vez con 200 µl de PBS. Se

agregaron 100 µl de TSB en cada pocillo con biofilm, y se incubó por 48 h a

35°C, en atmósfera normal. La mínima concentración de antibiótico

inicialmente presente que impidió el recrecimiento, detectable como turbidez

en el sobrenadante a simple vista, fue definida como la CMR.

88

4 CURVAS DE LETALIDAD Y SINERGIA ANTIMICROBIANA

Se determinó la velocidad de muerte del aislamiento MP06 por construcción de

curvas de letalidad (triplicado) según la actividad in vitro de tres agentes

antimicrobianos (CIP, AZI, IMI) y sus combinaciones (CIP+AZI, AZI+IMI, IMI+CIP).

El ensayo se realizó al valor de CIM de cada antibiótico (CIP, AZI e IMI: 1, 2 y 0,25

µg/ml, respectivamente) en medio de cultivo CMH (Laboratorios Britania S.A.).

Se siguieron los lineamientos generales y controles sugeridos por el documento

M26-A del NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) [159].

A partir de un aislamiento por agotamiento de MP06 de 48 h a 35°C en AMH, se

inoculó una botella con 20 ml de CMH que se incubó por 10 h a 35°C. Se realizó

una dilución de este inóculo con medio de cultivo CMH de forma de ajustar la

turbidez a la del tubo 0,5 de la escala de McFarland. A botellas con 20 ml de

CMH se les agregaron las soluciones de los antibióticos (solos y en sus

respectivas asociaciones), y 0,2 ml del inóculo estandarizado. Las botellas se

incubaron a 35 °C en atmósfera normal durante 48 h en forma estática. La

curva de control de crecimiento se realizó en CMH libre de antimicrobiano, en

forma simultánea y bajo las mismas condiciones que el ensayo de letalidad.

Se realizaron recuentos de viables como mínimo por duplicado (como

unidades formadoras de colonias, UFC) a las 0, 3, 6, 12, 24 y 48 h de incubación.

Para ello se diluyeron serialmente al décimo en solución fisiológica muestras de

cada una de las botellas. Alícuotas de 100 µl se sembraron sobre placas con TSA

usando espátulas de Drigalsky. En algunos casos, cuando se esperaban

recuentos por debajo del límite de detección por recuento en superficie, se

realizaron en forma paralela como mínimo 10 réplicas del recuento de viables

en superficie descripto, y recuentos de viables en profundidad, tomando 1 ml

de alícuota, colocándolo sobre el fondo de una placa de Petri sobre la cual se

vertió medio de cultivo TSA previamente fundido y termostatizado a 42°C,

agitándose suavemente hasta la solidificación del medio.

89

El efecto carry over se minimizó tanto por dilución como al permitir que la

siembra de cada una de las diluciones se absorbiera durante

aproximadamente 30 s, antes de que el líquido remanente fuera distribuido en

la superficie de cada una de las placas con TSA.

El conteo de las UFC se efectuó luego de incubar las placas durante 72 h a

35°C en atmósfera normal. El análisis estadístico de las réplicas y las

construcciones gráficas de las respectivas curvas de letalidad se realizaron con

el software GraphPad Prism v6.0. Se realizaron gráficas de log10 UFC/ml en

función del tiempo (en horas) para analizar y comparar los resultados del

ensayo.

La actividad antimicrobiana se definió como [159]:

● Bactericida: cuando se produjo una disminución de ≥ 3 log10 del inoculo

inicial, en el tiempo máximo en el que fue realizado el ensayo, 24 h en este

caso.

● Sinergia: cuando, en presencia de la combinación de drogas, ocurrió la

disminución de ≥ 2 log10 en el número de UFC/ml respecto del agente más

activo en forma individual a las 24 h.

● Antagonismo: cuando, en presencia de la combinación de drogas, se

observo un incremento en el número de UFC de, al menos, 2 log10 con la

combinación de antimicrobianos, respecto del agente más activo en forma

individual a las 24 h.

● Indiferencia: cuando se produjo para una determinada asociación de

antimicrobianos, una disminución en el número de UFC de < 2 log10, respecto

del agente más activo en forma individual a las 24 h.

90

5 MÉTODOS GENERALES

5.1 Obtención de extractos celulares

Los extractos celulares utilizados en distintos ensayos se obtuvieron mediante el

siguiente protocolo.

En el caso de Inquilinus, a partir cultivos puros se inocularon recipientes con el

medio de cultivo 2XYT y AMP (100 μg/ml) y se incubaron durante 24 h, a 35-37ºC

con agitación de 100 r.p.m.

En el caso de las células portadoras de las construcciones realizadas (todas E.

coli) se suplementó el medio con KAN (20~30 μg/ml) y se incubó a 35-37ºC

durante 24 h, sin agitación.

Las células se cosecharon por centrifugación en frio (8000 r.p.m., 20 min, 4ºC,

rotor Sorvall GSA). Se descartó el sobrenadante. El paquete celular se

resuspendió en 20 a 30 ml de buffer de fosfato de sodio (de concentración 10-

100 mM según el objetivo a ser utilizado), pH 7,0 a 4ªC y se centrifugó

nuevamente en las mismas condiciones. Se descartó el sobrenadante y las

células se resuspendieron en 5 ml del mismo buffer. Se utilizó un buffer 10 mM

(baja concentración de sales) cuando el extracto proteico se utilizó para

realizar un isoelectroenfoque analítico o SDS-PAGE. Y se lo utilizó con alta

molaridad (mayor efecto amortiguador del buffer) cuando al extracto proteico

se lo utilizó para purificar proteínas o determinar el comportamiento cinético de

las ß-lactamasas potencialmente presentes en el mismo.

Las células se sonicaron utilizando un equipo Cell (Sonics & Materials Inc, EEUU).

Se realizaron de 8 a 12 ciclos de 30 a 50 s de duración, de forma discontinua

(output: entre 3-5 y duty cicle: 30%-50%), en baño de hielo. Entre los ciclos se

incluyeron periodos de 1 a 2 min de enfriamiento. Los restos celulares se

removieron por centrifugación (15000 r.p.m., 10 min, 4ºC, rotor Sorvall SS-34). Se

reservó el sobrenadante, que se alicuotó y conservó a -20°C para posteriores

ensayos.

91

5.2 Cuantificación proteica

La concentración de proteínas se estimó utilizando el método de Bradford [160,

161], utilizando seroalbúmina bovina (BSA) (Sigma-Aldrich, Alemania) como

estándar. La absorbancia se midió a 595 nm (A595). Las distintas diluciones de

BSA se realizaron en el mismo buffer donde se encuentra la proteína a ensayar.

En cada pocillo de una policubeta de 96 pocillos de fondo plano (Greiner Bio-

One) se colocaron 180 μl de reactivo de Bradford (Anexo III) y 20 μl de las

diluciones de la proteína de interés o de las diluciones de BSA patrón, por

triplicado. Se incubó en oscuridad a 37°C durante 40 min, y se midió la A595

empleando un lector de microplacas (MultiSkan EX).

5.3 SDS-PAGE y SDS-PAGE con posterior renaturalizacion de ß-lactamasas

El perfil total de proteínas solubles (como las ß-lactamasas) y la cuantificación

del grado de pureza proteica obtenida al realizar purificaciones de diferentes ß-

lactamasas se analizó mediante SDS-PAGE.

Se tomó una alícuota de 75 μl de extracto total o de proteína purificada, y se

desnaturalizó con 25 μl de buffer muestra durante 2 min en baño de agua a

100°C. Una vez a temperatura ambiente, las muestras se centrifugaron 2 min a

máxima velocidad en microcentrífuga. Un volumen de 17 μl se resolvió por SDS-

PAGE al 12% en una minicuba (Mini Protean® System, Bio-Rad), conectada a

una fuente a 100 V (PowerPacTM HC, Bio-Rad). En cada corrida electroforética

se incluyó un marcador de peso molecular comercial pre-teñido (PageRuler

Prestained Protein Ladder, 10-260 kDa, Fermentas). Los geles de poliacrilamida y

buffers se prepararon como se indica en el Anexo III.

Los geles se corrieron por duplicado. Uno se coloreó con azul brillante de

Coomasie, mientras que el otro fue lavado con buffer de fosfatos de sodio 50

mM, pH 7,0, durante 30 min. Posteriormente se procedió a la renaturalización de

las ß-lactamasas por incubación durante 1 hora en una solución 30 mg/ml de

bencil-PEN preparada en el mismo buffer, y se lavó durante 30 min con el buffer

de fosfatos. Para evidenciar la actividad ß-lactamasa se empleó el método

92

iodométrico, utilizando CEF (500 μg/ml) como sustrato. De esta forma se estimó

el peso molecular de la proteína purificada con actividad ß-lactamasa [162].

93

MATERIALES y METODOLOGÍA

PARTE II - Microbiología Molecular Básica

6 MÉTODOS GENERALES

6.1 Extracción y purificación del ADN

6.1.1 Mediante técnicas manuales de laboratorio

6.1.1.1 Extracción de ADN genómico mediante lisis de colonia

A partir de cultivos puros de 48 h en BHIA se tomó una ansada de

microorganismo y se resuspendió en 400 μl de agua calidad Milli Q con 0,25%

(p/v) de SDS y 0,05 M de NaOH [1]. Se calentó en baño de agua en ebullición

durante 10 min. Finalmente, se centrifugó durante 2 min a máxima velocidad en

microcentrífuga a temperatura ambiente (Micro Centaur, Sanyo). El

sobrenadante se reservó hasta su uso.

6.1.1.2 Extracción de ADN plasmídico mediante lisis alcalina

Se utilizó un protocolo basado en la técnica de extracción descripta por

Birnboim y Doly [163] para realizar extracciones de plásmidos de los

microorganismos en estudio. Las condiciones particulares se detallan en el

Anexo III.

6.1.2 Mediante métodos comerciales

Se emplearon los siguientes métodos; para la extracción de ADN genómico

(Genomic Prep Cells and Tissue DNA isolation kit, Amersham Biosciences, EEUU) o

plasmídico (JetQuick, AccuPrep Plasmid Mini Extraction Kit, Genbiotech). Para la

94

purificación de productos de PCR en forma directa o a partir de gel de agarosa

se utilizó Gene Clean® PCR DNA y Gel Band Purification Kit, respectivamente

(Amersham Biosciences, EEUU).

6.2 Electroforesis en gel de agarosa para ADN

Los amplicones y el ADN proveniente de extracciones, se visualizaron mediante

electroforesis en gel de agarosa al 0,8 - 1,5% en buffer TAE 1X (Tris-Acetato

0,04M, EDTA 0,001M, pH 8,5). La electroforesis se llevó a cabo durante 30-50 min

a 120 mAmp y 70-90 V utilizando una cuba electroforética (Bio-Rad). Los geles

se revelaron con bromuro de etidio (0,5 g/ml) y las bandas resultantes fueron

visualizadas con un transiluminador UV (Gel DocTM, Bio-Rad). Se utilizó el

marcador comercial de peso molecular (GeneRulerTM 1 kb DNA Ladder, ready-

to-use 250-10.000 bp, Fermentas) según las necesidades especificas.

6.3 Detección de ADN plasmídico de gran tamaño

6.3.1 Extracción de ADN plasmídico de alto peso molecular

Se utilizó una modificación de la técnica de Hansen y Olsen [164] según el

protocolo que se detalla en el Anexo III.

6.3.2 Detección de ADN plasmídico mediante PFGE-S1 nucleasa

La detección y estimación de tamaño de ADN plasmídico se realizó mediante

PFGE, con el ADN digerido en presencia de la enzima S1 nucleasa. Esta enzima

digiere una única vez el ADN plasmídico superenrrollado, logrando que este

pase a una conformación lineal, y de esta forma, pueda ingresar al gel, en

tanto el ADN cromosómico no es digerido por la enzima. De esta forma pueden

detectarse megaplásmidos de hasta 609 Kpb [165].

Basado en el protocolo descripto en el apartado 1.4, se realizaron los moldes de

agarosa para cada una de las cepas en estudio. Estos moldes contienen el ADN

total del microorganismo. Los moldes se incubaron durante 30 min a 37°C con el

buffer adecuado para la S1 nucleasa (200 μl de NaCl 50 mM, acetato de sodio

95

30 mM y ZnSO4 5 mM), se agregó S1 nucleasa (Fermentas) a una concentración

final de 0,005 U/μl y se incubó por 45 minutos a 37°C.

Se incluyeron moldes de ADN sin digerir y moldes de microorganismos con

plásmidos de tamaño conocido como control, además de un marcador de

peso molecular para estimar el tamaño de los plásmidos (Lambda Ladder PFG

Marker, New England BioLabs). Las condiciones de la corrida electroforética,

revelado y visualización de los fragmentos de ADN se detallan en el apartado

6.2).

96

7 SECUENCIACIÓN DEL ADN

7.1 Método enzimático de Sanger

Las construcciones de ADN realizadas y los productos amplificados por PCR

fueron secuenciados por método automatizado basado en el método de

Sanger, mediante los equipos ABI PRISM DNA 3700 y 3130XL Genetic Analyzer

(Applied Biosystems) en los servicios de secuenciación de Macrogen (Seúl,

Corea) y del INTA (Castelar, Buenos Aires, Argentina), respectivamente. Los

cebadores diseñados y utilizados para las secuenciaciones en estos servicios se

describen en el Anexo IV.

7.2 Pirosecuenciación

Una alícuota del ADN genómico del aislamiento MP06 fue procesado por el

servicio de secuenciación del Instituto de Agrobiotecnología Rosario (INDEAR),

Santa Fe, Argentina, con el objetivo de secuenciar el genoma completo por el

método de pirosecuenciación. Esta metodología para secuenciar una muestra

de ADN se basa en la detección de una señal quimioluminiscente emitida por el

pirofosfato que se libera durante la incorporación del nucleótido en la síntesis

del ADN. Una cámara de detección de fotones capta la señal y se traduce

como la adición de un nucleótido, lo que genera una secuencia individual

[166].

La pirosecuenciación se realizó por el método de Whole Genome Sequencing

(WGS) con una plataforma 454 GS FLX Titanium (454®Roche Life Sciences

Corporation). En INDEAR se realizó el ensamblado de novo (sin emplear un

genoma de referencia) de las lecturas obtenidas (350.329 lecturas, 148.316.117

bases acumuladas) mediante el programa Newbler versión 2.6 (provisto por la

misma plataforma 454).

97

8 GENERALIDADES DEL GENOMA – ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO

Se analizó en forma comparativa la métrica obtenida con distintos

ensambladores de novo: MIRA3 [167], CAP3 [168] y Newbler (provisto por la

misma plataforma Roche 454), en busca de la mejor opción de ensamble de las

lecturas acumuladas obtenidas durante el proceso de secuenciación. Se

analizó la calidad obtenida de los contigs de novo.

Se evaluó la profundidad de la secuenciación realizada, el tamaño estimado

del genoma y la presencia de elementos móviles. También se analizó el

contenido medio de G+C y la distribución del mismo con la aplicación CGView

[169].

La anotación preliminar del genoma se realizó en INDEAR mediante los

procedimientos operativos estándares para procariotas (SOP) para el servidor

RAST v.4.0 (Rapid Annotation using Subsystem Tecnology) [12]. La predicción de

genes para su posterior anotación funcional en RAST, se realizó con el

procedimiento por defecto mediante el programa GLIMMER (Gene Locator and

Interpolated Markov ModelER) [14] por interpolación de los modelos de Markov

para la identificación de las regiones codificantes. Luego se realizó la anotación

funcional según el RAST, de forma que las secuencias codificantes (CDS, Coding

DNA Sequences) se asignaron por comparación de secuencias mediante los

algoritmos BLASTP y PSI-BLAST (Position-Specific Iterated BLAST), con la utilización

de la base de datos de la Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes basada

en ortología (KEGG Orthology) [6], sobre la cual se construyeron los mapas

metabólicos del aislamiento MP06.

El análisis (in silico y experimental) de la anotación funcional del servidor RAST se

realizó con la metodología que se detalla en cada apartado. En forma general,

se analizaron las distribuciones de las CDS en los subsistemas y categorías que

fueron asignados por el RAST. Además, se las comparó con las distribuciones

que presentan los microorganismos más cercanos en filogenia, de la familia

Rhodospirillaceae, cuya anotación funcional genómica se encuentre disponible

en el RAST.

98

La reconstrucción de las vías metabólicas se realizó mediante el mapeo de

genes detectados con los presentes en la colección de bases de datos KEGG

[170] y de esta forma se obtuvieron los mapas metabólicos de MP06 para ser

analizados y comparados con los de otros microorganismos.

Además se estudió el sesgo de codones que utilizaría este microorganismo con

la herramienta GCUA 1.2 [171, 172]. La detección de codones denominados

raros o atípicos (denominados así por no formar parte del sesgo de codones

preferido por E. coli) [173] se realizó para fragmentos específicos de secuencia

mediante la herramienta RaCC (Rare Codon Calculator) [174]. Ambos análisis

se realizaron a partir de las CDS obtenidas según la anotación del servidor RAST.

El montaje final del genoma y los archivos de calidad correspondientes al

proceso de secuenciación se depositaron mediante el software tbl2asn a través

del portal del NCBI, en la base de datos DDBJ/EMBL/GenBank con los

procedimientos operativos estándares para proyectos de WGS de procariontes.

La anotación definitiva se realizó sobre la primer y única versión depositada del

genoma, mediante la herramienta PGAAP (Prokaryotic Genomes Annotation

Pipeline 2.0) del NCBI [7].

99

9 ANÁLISIS DE LAS RELACIONES FILOGENÉTICAS DE I. limosus MP06

9.1 Evaluación de genes que podrían contribuir con la identificación

molecular

Se analizó la posición taxonómica de I. limosus MP06 respecto de otros

microorganismos relacionados mediante el análisis comparativo de genes

housekeeping alternativos al ARNr 16S con resolución taxonómica en distintas

especies bacterianas [175].

El estudio se realizó con las secuencias completas (o casi completas) de los

genes gyrB (subunidad ß de la ADN girasa), gyrA (subunidad α de la ADN

girasa), recA (recombinasa A), rpoD (factor sigma de la ARN polimerasa), fusA

(factor de elongación G), parC (subunidad α de la topoisomerasa IV), dnaK

(chaperona), groEL/groES (chaperona/chaperonina/co-chaperonina), rpoB

(subunidad ß de la ARN polimerasa dirigida por ADN) que se encontraron

disponibles en el repositorio público DDBJ/EMBL/GenBank. También se

incluyeron en el estudio las secuencias de otros genes como los codificantes

para ciertas enzimas con diversas actividades metabólicas: ornitina

decarboxilasa, nitrilasa, isocitrato liasa y superóxido dismutasa, entre otros.

Cuando se consideró necesario los árboles filogenéticos se enraizaron

incluyendo como outgroup secuencias de una especie bacteriana no

perteneciente a la familia Rhodospirillaceae.

Los alineamientos múltiples se realizaron con el programa CLUSTAL X v2.1 [145].

La longitud de las secuencias y los gap que pudieron existir se editaron con el

programa BioEdit [176, 177]. Las distancias evolutivas se calcularon mediante el

modelo de Kimura de 2 parámetros [178]. Las reconstrucciones filogenéticas

[179] se realizaron mediante un método basado en distancias mediante el

algoritmo del vecino más cercano [146] y un método basado en caracteres

aplicando máxima parsimonia [180].

100

Las matrices de distancia se construyeron con el software MEGA 5.05. La

construcción y búsqueda del árbol consenso (más parsimonioso) se realizó

mediante el software TNT v1.1. Se evaluó la robustez de los dendrogramas

obtenidos mediante un análisis del bootstrap, realizando 1000 réplicas [181, 182].

Se utilizó el programa FigTree v1.3.1 para la visualización y edición de los

dendrogramas.

101

10 RESISTOMA

10.1 Metodología general del análisis in silico de secuencias genómicas

A partir de las CDS detectados por análisis in silico del genoma de MP06, se

obtuvieron sus respectivas secuencias aminoacídicas traducidas. Estas fueron

estudiadas en búsqueda de secuencias ortólogas y motivos conservados a ß-

lactamasas y bombas de eflujo.

La búsqueda de regiones de similitud local entre secuencias (nucleotídicas y

proteicas) depositadas en bases de datos se realizó mediante la herramienta

informática BLAST. Para el estudio de las secuencias traducidas se utilizaron los

algoritmos BLASTP y PSI-BLAST, sobre las secuencias proteicas de la base de

datos no redundantes y del Protein Data Bank (PDB). En el análisis también se

utilizó la herramienta BLAST para el análisis de dominios conservados y de

arquitectura de los mismos [183].

Los alineamientos de secuencias fueron evaluados con el programa Clustal W

v2.1 [184, 185], y se compararon mediante matrices de sustitución en bloque

(BLOSUM) mediante el programa EMBOSS Needle [186].

La búsqueda de elementos conservados y de las posibles variantes (con

aminoácidos con propiedades fisicoquímicas similares, no descriptas en

literatura) se realizó utilizando la aplicación “Analyzes” del programa Vector NTI

Advance ™ 11.

Además se utilizaron los links que se encuentra en la Tabla 4 para acceder a los

programas online que sirven de predictores para el estudio de secuencias [6].

102

103

Tabla 4. Resumen de programas online utilizados para el análisis in silico de secuencias

Programa Uso

Predicción de Sistemas De Secreción Clásico y No Clásico

SignalP3.0 y 4.0 http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ Predicción del péptido señal [187, 188]

TatP1.0 http://www.cbs.dtu.dk/services/TatP/ Secreción por twin de argininas [189]

SecretomeP http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/ Secreción No Clásica [190]

SecretP.v2 http://cic.scu.edu.cn/bioinformatics/secretPV2/index.htm Secreción No Clásica [191]

Predicción de Rol Celular/Localización Subcelular

ProtFun 2.2 http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun-2.2/

PSORTb v.3.0 http://www.psort.org/psortb/

CELLO http://cello.life.nctu.edu.tw/ [192]

ProtCompB http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=pcompb&group=programs&subgroup=proloc

Predicción de Proteínas de Membrana

TOPCONS http://topcons.net/ [193, 194]

TMHMM http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ [195]

SignalP 4.0 http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/ [188]

Predicción de Promotores Bacterianos

BPROM http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=bprom&group=programs&subgroup=gfindb

Modelado de Proteínas

CPH 3.0 http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/ ab initio [196]

Phyre 2 http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index intensivo, no -ab initio

Swiss Model http://swissmodel.expasy.org intensivo, no - ab initio

Varios

ExPASy-ProtParam http://web.expasy.org/protparam/ pI, PM, estabilidad proteica

SearchLauncher http://searchlauncher.bcm.tmc.edu/ Traducción proteica y ORF

GeeCee http://emboss.bioinformatics.nl/cgi-bin/emboss/geecee Contenido de G+C de fragmentos

RaCC http://nihserver.mbi.ucla.edu/RACC/ Codones raros/atípicos

104

105

10.1.1 Análisis in silico de posibles bombas de eflujo

Se buscaron los arreglos génicos en MP06 que fueran compatibles con los

sistemas tripartitos que presentan las BE de las familias RND, ABC y MFS, y de la

familia MATE de un componente. Se analizó comparativamente la sintenia

génica de los arreglos hallados respecto de las presentes en bases de datos.

10.1.2 Análisis in silico de posibles ß-lactamasas

El objetivo inicial del análisis fue diferenciar las CDS que podrían codificar para

serino-ß-lactamasas, de los que pueden codificar para otras proteínas capaces

de ser aciladas por penicilina, como por ejemplo las PBP. Se utilizó el siguiente

criterio para diferenciar estos tipos de secuencias codificantes y definir a las

posibles serino-ß-lactamasas que serían objetivo de clonado y posterior

caracterización:

1). Las secuencias proteicas traducidas no pueden contener regiones

transmembrana ni ser proteínas de membrana [193, 195].

2). Las ß-lactamasas en bacterias gram negativas se encuentran concentradas

casi exclusivamente en el periplasma, por lo que las secuencias deben poseer

señales de secreción, ya sea por el mecanismo de secreción clásica [péptido

señal para sistemas sec dependiente o twin de argininas (TAT)] o por el

mecanismo de secreción no clásico [189-191]. Cuando las secuencias

cumplieron estos dos criterios se continuó con la búsqueda de los motivos

conservados de los elementos y posiciones típico de clase de serino-ß-

lactamasa. También se consideró la búsqueda de variaciones de secuencia

por aminoácidos con función química similar.

Los programas empleados para realizar este análisis se enumeran en la Tabla 4.

Luego se realizó el modelado intensivo de las secuencias proteicas traducidas

por homología con cristales proteicos de alta resolución, a fin de medir las

distancias entre los distintos elementos conservados mediante el programa

3Dmol.js Application [197].

106

10.2 Detección fenotípica de bombas de eflujo

Se evaluó la funcionalidad de las bombas de eflujo asociadas a la resistencia

de múltiples drogas antimicrobianas (BE-RMD) presentes en el aislamiento MP06

al enfrentarlo a sustancias inhibidoras y estimuladoras de las mismas.

Para esto se realizó la determinación de la CIM de AMP, APC, AMS, FOX, CRO,

GEN, AMI, NAL, CIP, AZI, TET, RIF y CLO, en presencia y ausencia de inhibidores

(IBE) y estimuladores de bombas de eflujo (EBE).

El ensayo se realizó por el método de microdilución en caldo, con el inóculo

preparado por el método de desarrollo previo (apartado 2.1). Para este ensayo

se utilizaron policubetas estériles de 96 pocillos con fondo en “U” (Greiner Bio-

One) y se realizó con los lineamientos generales sugeridos por el CLSI, que se

comentaron previamente en el apartado 2.2.

Los IBE utilizados en el ensayo fueron: reserpina (RES) (20 μg/ml) y fenil-arginil-

alanil-ß-naftilamida (PAßN) (50 μg/ml). En tanto los EBE ensayados fueron:

salicilato de sodio (SAL) (100 μg/ml) y desoxicolato de sodio (DES) (1 mg/ml). Se

procedió a la lectura del ensayo luego de 30 h de incubación a 35°C en

atmósfera normal.

La inhibición o inducción de BE se consideró arbitrariamente al observar una

variación de al menos 3 diluciones en los valores de CIM.

10.3 Clonado, expresión y purificación de posibles ß-lactamasas

Con el objetivo de detectar y caracterizar posibles enzimas con actividad ß-

lactamasa en el genoma de MP06, se realizaron las 3 estrategias que se

detallan a continuación:

● Clonado molecular “al azar” sobre el ADN genómico

● Subclonado molecular de blaINQ-1

● Clonado molecular de blaINQ-2 y blaINQ-3

107

10.3.1 Clonado molecular “al azar” sobre el ADN genómico

La primer estrategia consistió en realizar un clonado molecular “al azar” de

fragmentos de ADN genómico, que una vez clonados fueron tamizados para la

detección de actividad ß-lactamasa.

Para esto se realizaron digestiones del ADN genómico de I. limosus MP06 con

distintas endonucleasas de restricción, por separado, respetando las

condiciones sugeridas por todos los fabricantes: EcoRI (Roche), HindIII

(Amersham), KpnI (Amersham) y BamHI (Amersham). Para la construcción de los

plásmidos se utilizó el vector de clonado pK19 (Anexo III), con resistencia a KAN

como marcador de selección para el clonado directo de fragmentos de ADN

[198]. El vector pK19 se digirió con las mismas enzimas de restricción, por

separado, y luego fue defosforilado con fosfasata alcalina (Shrimp Alkaline

Phosphatase, Promega) para evitar la recircularización del mismo. Finalmente se

realizó la inactivación de la enzima defosforilante por calor. Por último, se

purificó esta preparación de ADN mediante equipo comercial para tal fin. La

correcta digestión de todos los productos se analizó por electroforesis en gel de

agarosa. Los fragmentos de ADN digeridos fueron ligados al vector digerido, de

modo que sus extremos sean compatibles. El protocolo de ligación utilizado se

detalla en el Anexo III.

La mezcla de ligación (que contiene las construcciones plasmídicas realizadas)

se utilizó para transformar en células competentes E. coli TOP 10 F- (Invitrogen)

obtenidas por preparación química con CaCl2 (Protocolo de competencia y

transformación en el Anexo III). La selección de transformantes se realizó por

alfa-complementación, el marcador seleccionable del vector pK19 (KANR) y en

presencia de antibiótico ß-lactámico. Se prepararon placas de Petri con LBA

adicionado con IPTG (0,1 mM) (Fermentas), X-Gal (40 mg) (Fermentas), KAN (20

μg/ml) y AMP (30 μg/ml). Se incubaron durante 24 h, a 37°C en atmósfera

normal. Se continuó con el estudio de las colonias blancas (células con el vector

pK19 y un fragmento de ADN exógeno insertado objeto de estudio), que fueron

108

sometidas al ensayo de detección y caracterización fenotípica de ß-

lactamasas (apartados 2.1.1 y 10.4).

Se estimó el tamaño de los insertos mediante electroforesis en gel de agarosa

(apartado 6.2). Para esto se realizó una extracción del ADN plasmídico de las

colonias blancas (las células que se espera sean las transformantes deseadas)

mediante lisis alcalina (Anexo III), y posteriormente se digirió con la

endonucleasa de restricción con la que fue obtenida esta construcción; de

esta forma se libera el fragmento insertado en el vector de clonado pK19.

10.3.1.1 Subclonado molecular de blaINQ-1

Mediante el clonado molecular “al azar” realizado sobre el ADN de MP06, con

la enzima de restricción KpnI, se obtuvo la construcción pK-INQ-1a de

aproximadamente 10 kb. Dentro de esta construcción se encontró un gen de

interés, con posible actividad ß-lactamasa, que se subclonó con la metodología

explicada a continuación.

El ADN plasmídico de la construcción pK-INQ-1a fue doblemente digerido con

las endonucleasas de restricción XhoI + EcoRI, liberándose un fragmento de 1,4

kb (que contiene al gen blaINQ-1). Este fragmento se ligó al vector pK19

(previamente digerido con SalI + EcoRI), de forma que sus extremos fueron

compatibles (protocolo de ligación en Anexo III). El plásmido construido se

denominó pK-INQ-1b. Se transformó E. coli TOP 10 F- competente con la

construcción pK-INQ-1b (protocolo en Anexo III). La selección de células

transformantes se realizó por alfa-complementación, el marcador de resistencia

antimicrobiana del vector pK19 y con antibiótico ß-lactámico. Se prepararon

placas de Petri con LBA adicionado con IPTG (0,1 mM) (Fermentas), X-Gal (40

mg) (Fermentas), KAN (20 μg/ml) y AMP (30 μg/ml). Se incubaron durante 24 h, a

37°C en atmósfera aerobia. Se continuó el estudio con las colonias blancas, que

fueron sometidas al ensayo de detección y caracterización fenotípica de ß-

lactamasas (apartados 2.1.1 y 10.4).

109

10.3.2 Clonado molecular de blaINQ-2 y blaINQ-3

La tercera estrategia de clonado molecular utilizada se diseñó para estudiar dos

genes, denominados arbitrariamente blaINQ-2 y blaINQ-3, que podrían codificar

para posibles ß-lactamasas. Ambos genes fueron objeto de estudio a partir del

análisis in silico realizado sobre la secuencia genómica de MP06 obtenido por

pirosecuenciación. La Figura 7 resume el esquema experimental. Las mezclas de

reacción, cebadores y programas de ciclado empleados para la amplificación

de los genes blaINQ-2 y blaINQ-3, por PCR se detallan en el Anexo IV.

Figura 7. Esquema de la metodología realizada para el clonado de las posibles ß-

lactamasas blaINQ-2 y blaINQ-3

El gen blaINQ-2 fue amplificado por Touchdown-PCR [199] a partir de

preparaciones de ADN genómico del aislamiento de I. limosus MP06, con

oligonucleótidos cebadores específicos, 244-FORW-EcoRI y 244-REV-XhoI-CS,

diseñados para este fin. Estos cebadores contienen en su secuencia el sitio de

restricción para las endonucleasas EcoRI y XhoI, respectivamente.

110

Por otro lado, blaINQ-3 fue amplificado por Nested-PCR [200] con el par de

cebadores: 26-FORW-EcoRI y 26-REV-XhoI-CS, también con sitios de restricción

EcoRI y XhoI, respectivamente.

Los amplicones fueron objeto de doble digestión enzimática con EcoRI + XhoI. Y

ligados correctamente orientados en el vector de expresión pET-28b(+)

(Protocolo de ligación, Anexo III).

Las construcciones obtenidas, pET-INQ-2 y pET-INQ-3, fueron transformadas en E.

coli BL21(DE3) (Novagen, Inc. Madison, WI, EEUU) competente por preparación

química con CaCl2 (Protocolo de competencia y transformación en Anexo III).

La selección de las células transformantes se realizó por el marcador de

resistencia antimicrobiana del vector pET28b(+) (KANR) utilizando placas de Petri

con LBA adicionado con KAN (30 μg/ml). Se controlaron los transformantes

recuperados por secuenciación del inserto presente en cada construcción con

los oligonucleótidos cebadores universales T7promotor y T7terminator, descriptos

en el Anexo IV. El sistema de clonado utilizado permite la expresión de la

proteína objeto de estudio bajo un sistema inducible con IPTG.

10.3.2.1 Subclonado molecular de blaINQ-2

A partir de la construcción pET-INQ-2 se realizó el subclonado de blaINQ-2 en el

vector pK19, y se transformó en E. coli TOP 10 F’ competente, para determinar la

CIM frente a diversos antibióticos ß-lactámicos en estas células, con la

metodología descripta en el apartado 2.2.

10.3.2.2 Inducción de la expresión proteica de INQ-2 e INQ-3

Las construcciones pET-INQ-2 y pET-INQ-3 transformadas en E. coli BL21 (DE3) se

utilizaron para la producción de las proteínas en estudio INQ-2 e INQ-3,

respectivamente, según se describe a continuación.

Se tomó una ansada de los aislamientos de E. coli pET-INQ-2 y E. coli pET-INQ-3

desarrollados en LBA adicionado con KAN (30 μg/ml) e incubados durante 16 h

a 35°C, y se inoculó una botella con 50 ml de caldo LB suplementado con KAN

111

(30 μg/ml) que se incubó por 16 h a 35°C. Se realizó una dilución 1/100 de cada

cultivo en erlenmeyers con 100 ml de caldo LB suplementado con KAN (30

μg/ml). Los cultivos se incubaron a 37°C, en baño de agitación a 180 r.p.m.,

durante aproximadamente 3 h hasta alcanzar una DO600nm de 0,650. Se tomó

una alícuota de 1ml de cada uno de los cultivos, en forma previa a la

inducción, para luego ser comparada.

Posteriormente se realizó la inducción de la expresión proteica de los cultivos

por adición de 500 µl de una solución estéril de IPTG 100 mM (Sigma-Aldrich),

para lograr una concentración final de inductor de 1 mM. Los cultivos

continuaron siendo incubados a 28°C y 37°C a 180 r.p.m., tomando 2 alícuotas

de 1 ml a las 3, 7 y 20 h de iniciada la inducción, con el objetivo de buscar una

condición óptima de inducción.

Una de las alícuotas tomada a cada tiempo se centrifugó durante 5 min a

12000 r.p.m. en centrifuga de mesada a temperatura ambiente, reservando el

pellet y el sobrenadante de cultivo, a fin de desnaturalizar las proteínas

presentes y observar el perfil proteico total en geles de SDS-PAGE (apartado

1.2.5), con el objetivo de elegir la mejor condición de inducción.

La segunda alícuota se centrifugó en las mismas condiciones y se descartó el

sobrenadante. La ruptura celular se realizó mediante 4 ciclos de congelado a -

20°C y descongelado rápido a 37°C en baño de agua, con posterior detección

de actividad actividad ß-lactamasa mediante el método de la cefalosporina

cromogénica, con NitrocefinTM (NITTM) (Oxoid, UK), (apartado 10.4.2).

10.3.3 Purificación de la proteína INQ-1

A partir de 1 litro de cultivo de E. coli TOP 10 F- competente transformada con la

construcción pK-INQ-1b, se obtuvieron 60 ml de un extracto proteico total en

buffer de fosfatos, al cual se le realizó una cromatografía de exclusión

molecular, seguido por una cromatografía de intercambio aniónico con la

112

finalidad de purificar la proteína INQ-1 para su posterior caracterización. Las

cromatografías empleadas se detallan a continuación.

10.3.3.1 Cromatografía de exclusión molecular

Se utilizó una columna, de 26 cm de longitud y 10 cm de diámetro interno, la

cual se empacó Sephadex G-75 (Amersham Pharmacia) y se empleó buffer Tris-

HCl 20 mM, pH 8,6 + NaCl 0,1 M como fase móvil. Se sembraron 5 ml del extracto

proteico total previamente concentrado 10 veces utilizando membranas de

diálisis de límite de exclusión 12-14 kDa (Medicell International Ltd, GB) y

compuesto PEG (PM: 15-20 kDa, Sigma-Aldrich), manteniéndolo durante todo el

proceso de concentración refrigerado a 8°C. Se eluyó con una velocidad de

flujo constante de 0,2 ml/min.

Se recogieron manualmente fracciones de 1,5 ml, en tubos de microcentrífuga

en baño de hielo y se evaluó la actividad ß-lactamasa por método iodométrico

de cada fracción recogida, empleando como sustrato CEF (500 μg/ml). Los

eluatos activos frente al sustrato fueron reunidos (30 ml) y dializados a 8°C, con

agitador magnético, utilizando la membrana de diálisis antes mencionada y

frente a buffer Tris-HCl 20 mM, pH 8,6. Finalmente, el extracto proteico

parcialmente purificado se filtró con filtros esterilizantes (poro: 0,2 μm) (GBO,

Argentina). Se reservó a 8°C durante 2 h para ser utilizada como se explica a

continuación.

10.3.3.2 Cromatografía de intercambio iónico

El paso final para la purificación de INQ-1 se realizó mediante una

cromatografía de intercambio aniónico por FPLC (Fast Performance Liquid

Chromatography). La purificación se realizó por duplicado en un equipo de

FPLC (ÄKTA purifier, GE Healthcare, Uppsala, Suecia) con un sistema acoplado

que controló la velocidad de flujo de las fases móviles y el gradiente de elución,

así como también detectores espectrofotométricos que monitorearon las

moléculas eluídas y un software que permitió el seguimiento de la elución

(Unicorn 5.0).

113

Se conectó al equipo una columna cromatográfica (SepharoseTM Fast Flow IEX,

HiTrapTM Q HP, GE Healthcare), de 5 ml. La velocidad de flujo, los buffers

utilizados para la elución y etapas de lavado, equilibrado y regeneración de la

columna para su posterior utilización, se realizaron según las recomendaciones

del fabricante [201].

La velocidad de flujo utilizada en todo momento fue de 5 ml/min. Para

equilibrar la columna se utilizó buffer Tris-HCl 20 mM, pH 8,6, mismo buffer frente

al que fue dializada la muestra luego de su elución de la cromatografía de

exclusión molecular, para asegurar minimizar la fuerza iónica de la misma.

Luego del sembrado y lavado de la columna [hasta nivelación de la línea de

base del detector UV (absorbancia = 0)], se eluyó usando un gradiente de 0 a

100% en 20 min en buffer Tris-HCl 20 mM, pH 8,6 / Tris-HCl 20 mM, pH 8,6 + NaCl

1M (alta fuerza iónica). Se recogieron manualmente fracciones (según la señal

observada en el espectro UV), en tubos plásticos colocados en baño de hielo y

se evaluó la actividad ß-lactamasa de cada fracción recogida, por método

iodométrico, empleando como sustrato CEF (500 μg/ml). El éxito de la

purificación se evaluó mediante SDS-PAGE (apartado 0) y se cuantificó la

proteína purificada por método de Bradford (apartado 5.2).

10.3.4 Purificación de la proteína INQ-2

Se obtuvo previamente el pellet post-inducción correspondiente a un volumen

de cultivo de 300 ml (inducción a 37°C, concentración final de IPTG 1 mM,

durante 20 hs). Este pellet se resuspendió en buffer de unión (20 mM de fosfatos

de sodio, 500 mM NaCl, 5 mM de imidazol, pH 7,4), y se obtuvo el extracto

proteico total por ruptura ultrasónica como de detalla en el apartado 5.1.

Se realizó una IMAC por FPLC, en un equipo (ÄKTA purifier) con control de la

velocidad de flujo de las fases móviles y el gradiente de elución, acoplado a

detectores espectrofotométricos que monitorearon las moléculas eluídas y un

software que permitió el seguimiento de la elución (Unicorn 5.0).

114

La velocidad de flujo, los buffers utilizados para la elución y etapas de lavado,

equilibrado y regeneración de la columna para su posterior utilización, se

realizaron según las recomendaciones del fabricante [202].

La muestra (previamente filtrada) se cargó en una columna de afinidad de 1 ml

HisTrapTM HP (GE Heathcare), previamente equilibrada con el buffer de unión,

con una velocidad de flujo de 1 ml/min. Se continuó haciendo circular el mismo

buffer hasta nivelación de la línea de base del detector UV (absorbancia = 0).

La elución se llevo a cabo por un aumento lineal del gradiente de imidazol

(Merck), de 5 mM a 500 mM, durante 100 min a una velocidad de flujo

constante de 1 ml/min. Se recogieron manualmente las fracciones (según la

señal observada en el espectro UV a 280 nm), en tubos plásticos en baño de

hielo. Los eluatos que presentaron actividad ß-lactamasa por el método de la

cefalosporina cromogénica (NITTM) (apartado 10.4.2) fueron dializados con

membranas para este fin frente a buffer de fosfatos 25 mM, pH 7,00. Su grado

de purificación se estimó mediante geles de SDS-PAGE [203]. Los eluatos fueron

conservados a -20°C hasta el momento de su uso.

10.4 Caracterización de las ß-lactamasas

10.4.1 Detección de actividad ß-lactamasa por método iodométrico

Para poner en evidencia la actividad ß-lactamasa [204] se prepararon 100 ml

de solución agar almidón [1 g de agar-agar (Lab. Britania S.A.), 0,5 gr de

almidón soluble (Sigma-Aldrich) en 100 ml de buffer de fosfatos 20 mM, pH 7,0].

Se le adicionaron 1,6 ml de solución acuosa de I2/I- [I2 2% (p/v), KI 55% (p/v),

Merck]. Se utilizaron como sustrato diferentes antibióticos ß-lactámicos a la

concentración que se indica en cada caso.

Se sembraron 20 μl del extracto proteico total o de proteína purificada

directamente sobre el agar y se incubó a 37°C durante 20 minutos. O bien se

depositó una fina capa sobre geles (de SDS-PAGE o de IEFA). Se observó como

115

reacción positiva la aparición de halos de decoloración. Se incluyó como

control negativo el mismo buffer de fosfatos utilizado para lavado del pellet

bacteriano y resuspensión celular. Como controles positivos se incluyeron

extractos proteicos totales de cepas productoras de ß-lactamasas (Anexo I).

10.4.2 Detección de actividad ß-lactamasa por el método de la cefalosporina

cromogénica

Sobre un soporte plástico se colocaron 20 µl del extracto proteico total o de la

proteína purificada y luego 15 l de solución de NITTM 50 M. Se incluyó como

control negativo el mismo buffer fosfato utilizado para lavado del pellet

bacteriano y resuspensión celular. También se incluyeron extractos proteicos

como control positivo. Se consideró como reacción positiva el viraje del color

amarillo al color rosado-rojo, en forma inmediata (no más de 2 minutos) [205].

10.4.3 Detección de ß-lactamasas de tipo AmpC inducibles

En este ensayo se estudió la detección de la expresión de AmpC inducibles en

E. coli TOP 10 F- transformada con las construcciones pK-INQ-1a y pK-INQ-1b.

Para esto se realizó la misma técnica que la descripta para realizar el

antibiograma por difusión en medio sólido (apartado 2.1), y se enfrentaron dos

discos con antimicrobiano, uno contiene un sustrato pobre para este tipo de

enzimas y el otro contiene un inductor de la síntesis de las mismas [206].

Este ensayo es llamado D-test, en el cual se observa un achatamiento del halo

de inhibición en la zona del disco de antibiótico que se enfrenta al inductor. Las

placas de Petri con AMH se hisoparon con E. coli TOP 10 F- transformada con las

construcciones pK-INQ-1a y pK-INQ-1b. Se emplearon discos comerciales (Lab.

Britania S.A.) con AMP, CEF, FOX, IMI, AMC, CAZ+CLA y realizados en el

laboratorio con ácido 6-amino-penicilánico (6-APA) (Sigma-Aldrich), como

inductores de AmpC. Se probaron distancias entre 15 y 25 mm de centro a

centro de los discos. Posteriormente se incubaron las placas durante 16 horas a

37°C, momento en que se midieron los halos de inhibición y se interpretaron los

resultados.

116

10.4.4 Determinación del pI mediante isoelectroenfoque analítico (IEFA)

El IEFA es un método de separación de moléculas anfóteras como las proteínas,

en las que su carga neta depende del pH del medio. El gel en el que se

produce la migración de estas proteínas presenta un gradiente de pH. Cada

proteína migra hasta que la carga neta sea cero. Este método se realizó en gel

de poliacrilamida en condiciones no desnaturalizantes según lo descripto por

Mathew y col. [207].

El gel fue armado sobre la cara hidrofílica de un soporte inerte (Gel-Bond,

Amersham Pharmacia) utilizando una solución 1% de Tritón X-100 para fijar su

lado hidrofóbico a uno de los vidrios. La mezcla de polimerización (Anexo III) se

vertió en el molde y se dejó polimerizar a temperatura ambiente. Se prepararon

los electrodos cortando tiras de papel de filtro Whatman Nº5, embebidas

respectivamente en las soluciones de los electrodos. El ánodo (polo positivo) se

embebió con ácido fosfórico 0,5 M y ácido iminodiacético 0,05 M. El cátodo

(polo negativo) se embebió con hidróxido de sodio 0,1 N y etilendiamina 0,01

M. El pre-enfoque de los anfolitos se realizó a 4°C a 500 V, 20 mA, 20 W, durante

30 min.

Se sembraron 20 l de la muestra y 10 l de -lactamasas de pI conocido, como

control. Los papeles sembradores se retiraron luego de 40 minutos de iniciada la

electroforesis. Las condiciones de enfoque fueron: 1500 V, 20 mA, 20 W, a 4°C,

durante aproximadamente 2 ½ h. El revelado se realizó por método iodométrico

[204] (apartado 10.4.1).

10.4.5 Determinación espectrofotométrica de parámetros cinéticos

La determinación de los principales parámetros cinéticos de las ß-lactamasas

estudiadas se realizó por método espectrofotométrico, al enfrentar a la enzima

a diferentes sustancias con un núcleo funcional ß-lactámico (antibióticos y

cefalosporina cromogénica) y también frente a posibles inactivadores

enzimáticos [77, 162, 208, 209]. Además se compararon estos parámetros

117

respecto de otras enzimas descriptas en bibliografía mediante la base de

enzimas BRENDA (The Comprehensive Enzyme Information System) [210, 211].

Para INQ-1 se determinaron los parámetros cinéticos kcat, KM, kcat/ KM e IC50.

En el caso de INQ-2 se determinaron KM e IC50. Se calculó la Vmáx relativa

porcentual de INQ-2, respecto del sustrato ß-lactámico con mayor velocidad

de hidrólisis (V0).

La hidrólisis del anillo ß-lactámico por acción de estas enzimas fue seguida por

monitoreo de la variación de la absorbancia, a la longitud de onda adecuada

para cada una de las soluciones de antibiótico (Anexo III) en buffer de fosfato

de sodio 10 mM, pH 7,0 en las determinaciones correspondientes a INQ-1, y en

buffer de fosfato de sodio 25 mM, pH 7,0, en las determinaciones

correspondientes a INQ-2.

Todas las determinaciones se realizaron, por triplicado (como mínimo),

mediante un espectrofotómetro (T80 UV/VIS, PG Instruments Ltd) acoplado al

programa que permite la recolección y procesamiento posterior de datos

(UVWin v.5.1.1, PGeneral). Las reacciones se realizaron en un volumen final de

500 μl a 24°C. La metodología empleada para la determinación experimental

de los coeficientes de extinción molar de los sustratos utilizados se detalla en el

Anexo III.

Previo a la determinación de los parámetros cinéticos se comprobó la

estabilidad enzimática de las ß-lactamasas en estudio a 24°C. Para esto se

midió la actividad residual de la enzima luego de intervalos crecientes de

incubación frente a CEF (110 μM) (Klonal, Argentina) o NITTM (150 µM). Además,

se comprobó la estabilidad de las enzimas frente a la acumulación de

productos de la hidrólisis de sustratos. Esto se realizó al enfrentar una alícuota

enzimática con los sustratos reportadores mencionados y determinando la

velocidad inicial (V0). Luego de consumirse al menos un 80% del sustrato se

adicionó a la misma reacción una pequeña cantidad de CEF o NITTM (según

118

corresponda respectivamente), repitiéndose la determinación de V0 (velocidad

de hidrólisis). Una inhibición de la enzima por los productos de hidrólisis debería

reflejarse en una disminución en la V0 (velocidad inicial) de hidrólisis.

Los ensayos se realizaron en condiciones de estado estable (steady state),

donde la formación de los intermediarios enzimáticos se mantiene estable.

Teniendo en cuenta estas consideraciones, se determinó la V0 de la enzima ß-

lactamasa a estudiar frente a una solución de antibiótico (inicialmente 100 μM),

trabajando a la longitud de onda adecuada y de acuerdo a la actividad

observada se consideró al antibiótico ß-lactámicos según su comportamiento

frente a la enzima en estudio en una de las siguientes categorías [77, 208, 212]:

buenos sustratos enzimáticos, sustratos enzimáticos pobres y sustratos con

valores de KM muy bajos. La metodología utilizada para las determinaciones

cinéticas y el tratamiento de los datos para el cálculo de los principales

parámetros cinéticos se resume a continuación [77, 78, 212].

10.4.5.1 Buenos sustratos enzimáticos

Cuando los antibióticos ß-lactámicos ensayados resultaron ser buenos sustratos

enzimáticos, la determinación se realizó siguiendo la desaparición de la señal

característica de cada antibiótico o la aparición de su producto de hidrólisis (en

el caso colorimétrico de NITTM), en forma directa.

Para ello, se realizó una serie de diluciones de cada sustrato, comenzando con

una dilución 100 μM, y continuando con concentraciones menores y mayores

de sustrato dentro del rango de trabajo lineal del equipo y de la Ley de Lambert

y Beer. Se ensayaron, al menos, 7 diluciones por triplicado. Se determinó la V0

para cada dilución de antibiótico, frente a una misma cantidad de enzima

(puesto a punto anteriormente).

● Tratamiento de datos y cálculo de kcat y kcat/KM

Se graficó la V0 en función de la concentración de sustrato, al que sigue la

ecuación de Michaelis-Menten,

V0= Vmáx . [S] / KM + [S]

119

V0 es la velocidad inicial de la reacción, Vmáx es la velocidad máxima de la

reacción, [S] es la concentración molar de sustrato ß-lactámico, KM es la

constante de Michaelis-Menten, que nos indica la afinidad de la enzima por el

sustrato.

Un valor de KM elevado indica que la enzima es poco afín por ese sustrato

(sustrato pobre), en tanto que los valores bajos de esta constante indican que la

enzima presenta una alta afinidad por el sustrato en cuestión (buen sustrato).

Se utilizó el programa GraphPad Prism v5.0 para calcular la constante KM y Vmáx

y expresar el error en las determinaciones. Además se realizó un tratamiento de

los datos a fin de linealizarlos, mediante la linealización de Hanes-Woolf.

La linealización de Hanes-Woolf se utilizó para el tratamiento de los datos por su

mayor rango lineal. Se graficó S/V0 en función de S. La ecuación es:

[S]/V0 = KM/Vmáx + [S]/Vmáx

Alternativamente, se comprobó la validez de los datos mediante la linealización

de Lineweaver-Burk, al graficar 1/S en función de 1/V0, según la siguiente

fórmula: 1/V0 = KM/Vmáx . 1/[S] + 1/Vmáx

Otro parámetro cinético que permite caracterizar el comportamiento de una

enzima frente a un sustrato en su valor de kcat.

La kcat es la constante catalítica o tasa de recambio enzimático. Se define

como el número de moles de sustrato que se convierten en producto por

unidad de tiempo.

Para calcular la kcat se determinó la cantidad de enzima utilizada en las

reacciones, presente en la cubeta (en unidades que reflejen la concentración

molar). Para esto es necesario realizar la mejor estimación posible sobre el grado

de pureza. [E0] es la concentración de enzima utilizada en la reacción, en

concentración molar, Vmáx (fue en cálculos anteriores ya determinada). En

condiciones de steady state, se cumple que: Vmáx kcat . [E0] Las unidades son

entonces seg-1.

120

Además, se determinó la relación kcat/KM como parámetro de eficiencia

catalítica, en caso de las ß-lactamasas como parámetro de eficiencia

hidrolítica. Este parámetro permite comparar fácilmente la actividad biológica

de distintas enzimas. A mayor valor de kcat/KM, más eficaz es la enzima.

10.4.5.2 Sustratos enzimáticos pobres y sustratos con bajos valores de KM

Para los sustratos pobres con valores de KM muy elevados y aquellos sustratos

que presentan valores de KM muy bajos en los que se dificulta la determinación

metodológica, se determinó una KM “aparente” establecida como Ki (constante

de inhibición competitiva) mediante ensayos de competencia directa

utilizando un buen sustrato como reportador.

Se fijó una concentración de sustrato a utilizar como reportador, CEF 110 μM o

NITTM 100 μM. Se realizaron como mínimo 7 diluciones del antibiótico a ensayar

como inhibidor competitivo, abarcando un rango tal que se observe tanto

inhibición completa (V0 despreciable) como ausencia de inhibición (V0 igual al

control). Se determinó la V0 (como Vi) para cada dilución de antibiótico, frente

a la cantidad de enzima puesta a punto anteriormente.

● Tratamiento de datos y cálculo de Ki =KM aparente, kcat y kcat/KM aparente

Se graficó V0/Vi en función de la concentración de sustrato. La pendiente

obtenida (m) representa: m = (KM / KM + [S]) x 1/Ki

Donde KM: constante de afinidad por el sustrato reportador, S: concentración

utilizada de sustrato reportador en concentración molar, Ki es la KM aparente del

sustrato pobre.

Para calcular kcat, se determinó la velocidad a partir de una reacción de

hidrólisis total, de 5 a 30 min, o incluso horas cuando fue necesario (y la

estabilidad enzimática lo permitía), de concentraciones del sustrato mayores a,

al menos 5 veces la KM aparente calculada anteriormente, suponiendo que en

estas condiciones (S >> KM) la V0 obtenida es Vmáx. Luego se calculó kcat/KM

aparente.

121

10.4.5.3 Comportamiento enzimático frente a inhibidores: cálculo de IC50

Como parte de la caracterización de los ß-lactamasas en estudio se evaluó la

inactivación enzimática en presencia de inhibidores clásicos. El parámetro

utilizado para analizar el comportamiento enzimático es el denominado IC50,

que representa la concentración de inhibidor capaz de provocar una

disminución del 50% de la actividad enzimática, en las condiciones del ensayo.

Mediante este parámetro se estudió la inactivación enzimática por acción de

CLA (Sigma-Aldrich), SUL (Sigma-Aldrich), BOR (Lab. Britania/Boron Molecular),

NaCl (Anedra) y EDTA (Bio-Rad).

El ensayo se realizó midiendo la hidrólisis enzimática del sustrato reportador a la

longitud de onda de máxima absorbancia para cada reportador, en presencia

de distintas concentraciones de los inhibidores. De esta forma cuando el

sustrato inactivador tiene efecto sobre la actividad enzimática, a medida que

se aumenta la concentración de este, se detecta una menor capacidad de

hidrólisis enzimática del sustrato ß-lactámico reportador con el cual se

monitorea la reacción, lo que se detecta como una velocidad de hidrólisis

menor.

Para determinar la IC50 se realizaron ensayos directos, donde la reacción se

inició por agregado de la enzima, de esta forma se determina la IC50 Directa, sin

una instancia previa de incubación.

En los casos en los que aún en presencia de altas concentraciones de sustrato

inactivante no es posible conseguir el 50% de disminución de la actividad

enzimática, se realizó el ensayo en forma indirecta, donde el sustrato reportador

fue agregado luego de 20 min de pre-incubación de la enzima con el inhibidor,

determinando así la IC50 Indirecta.

A partir de los gráficos de absorbancia en función del tiempo se calcularon las

pendientes correspondientes a la velocidad de hidrólisis del sustrato reportador

en ausencia de inhibidor (como control y corresponderá al 100% de la actividad

enzimática) y en presencia de las distintas concentraciones de cada inhibidor.

122

Se interpoló la concentración (μM) de inhibidor capaz de reducir la actividad

inicial (curva control) al 50%.

123

11 ANÁLISIS IN SILICO: GENES ASOCIADOS A LA FORMACIÓN DE

BIOFILM Y EVASIÓN DE LA RESPUESTA INMUNE

11.1 Biofilm: búsqueda de genes reguladores de la formación del biofilm en el

genoma de Inquilinus

Los eventos que regulan las etapas de formación y establecimiento del biofilm

están mediados por señales químicas que permiten la coordinación entre las

comunidades [124]. El análisis realizado consistió en la búsqueda de

determinantes génicos, a lo largo del genoma de I. limosus MP06, de secuencias

relacionadas con los sistemas reguladores de formación y establecimiento del

biofilm que se encuentran descriptos en otros microorganismos como P.

aeruginosa, que presenta 4 vías de regulación: la señalización AMPc/Vfr, la

acoplada al segundo mensajero di-GMPc, la vía Gac/Rsm y el sistema de

quórum sensing que está regulado principalmente por la producción de AHL

[213, 214].

Además de realizar la búsqueda por similitud entre secuencias, se comparó el

contexto o vecindario génico (sintenia génica) [10] mediante la herramienta

ACT (Artemis Comparision Tool) [215] con la descripta para microorganismos

que forman biofilms con genomas secuenciados en su totalidad como

Pseudomonas [130] y Xanthomonas [216-218].

11.2 Detección de determinantes génicos asociados a la virulencia o de

evasión de la respuesta inmune

Se realizó una búsqueda sobre el genoma de MP06 de genes codificantes para

factores de virulencia o estrategias de evasión que emplean las bacterias

patógenas que persisten con ciclo intracelular [106, 109-112, 213].

124

La minería de datos (data mining) se realizó entrecruzando la información

relativa a los verdaderos genes de virulencia, asociados a la virulencia y de

estilo de vida de virulencia que se encontraron en los programas y repositorios:

SPAAN [121], VFDB [122, 219] y MvirDB [123, 220], además de los modelos y

genes descriptos en la bibliografía citada en el párrafo anterior.

125

RESULTADOS y DISCUSIÓN

PARTE I - Microbiología Clínica Aplicada

1 AISLAMIENTOS CLÍNICOS: SU IDENTIFICACIÓN, TIPIFICACIÓN Y

CONSERVACIÓN

Para proceder a la identificación de los aislamientos estudiados, se reunió el

mayor número de características fenotípicas y genotípicas posibles.

1.1 Caracterización fenotípica

1.1.1 Morfología macroscópica de aislamientos estudiados

Los sucesivos aislamientos clínicos recuperados del mismo PFQ provenientes del

Hospital de Niños “Dr. O. Alassia”, Sta. Fe, entre los años 2006 y 2013,

presentaron el mismo aspecto macroscópico mucoso (y similar en ALev y TSA), a

excepción del denominado MP13-NM que presentó aspecto no mucoso.

El aislamiento 161-13, proveniente del Hospital de Clínicas “José de San Martín”

(CABA), presentó un aspecto mucoso al desarrollarse en ALev y TSA. Las

características macroscópicas de los aislamientos en estudio se resumen en la

Tabla 5.

126

Tabla 5. Descripción macroscópica de los cultivos en medios ALev y TSA

Aislamiento Descripción macroscópica

MP06

MP10

MP12

MP13-M

161-13

MP13-NM aspecto liso, no mucoso,

borde regular y tamaño pequeño

I. limosus LMG 20952T aspecto liso, mucoso, borde regular y tamaño pequeño

Inquilinus sp. LMG 20953 aspecto rugoso, seco, no mucoso, de borde regular y

tamaño pequeño

En la Figura 8 se pueden observar las características macroscópicas de los

aislamientos en los medios de cultivo ALev y TSA (Figura 8, A y B). Todos los

aislamientos estudiados mostraron color blanquecino-amarillento en medio de

cultivo TSA y ausencia de pigmentos. No evidenciaron fermentación de la

lactosa en ALev (Figura 8, A), y sus características fenotípicas se mantuvieron

estables con el número de repiques. Las diferencias fenotípicas entre los

aislamientos MP13-M y MP13-NM pueden verse con detalle en la Figura 8, C.

También puede observarse el deslizamiento que presentan las colonias mucosas

al ser cultivadas en un medio como TSA e inclinar la placa de cultivo (Figura 8,

D).

aspecto liso, muy mucoso,

borde no definido, difíciles de obtener en

forma aislada

127

Figura 8. Aspecto macroscópico de

aislamientos por agotamiento en superficie.

A. En placas con ALev. B. En TSA. C.

Aislamientos con fenotipo mucoso (MP13-

M) y no-mucoso (MP-13NM). D. Aislamiento

MP06 en TSA. La mucosidad del aislamiento

se desplaza por la placa al inclinarla

(flecha verde)

A

B

D

I. limosus LMG 20952T MP06 MP13-NM 161-13 Inquilinus sp. LMG 20953

MP13-MN

MP13-M

C

128

129

1.1.2 Morfología microscópica

La observación microscópica de extendidos sometidos a las distintas tinciones

diferenciales realizadas (Gram, Duguid y Hiss) se muestra en la Figura 9. Los

preparados de los aislamientos estudiados fueron coloreados con la tinción de

Gram que reveló que se trataba de BGN, con morfología similar, sin agrupación

definida (Figura 9, A). Además, mediante las tinciones de Duguid y Hiss se

observó la presencia de cápsula en los aislamientos MP06 y MP13-M (Figura 9, B

y C). Acorde al aspecto no mucoso que presentan las colonias de MP13-NM, no

se evidenció la presencia de cápsula con ninguna de las tinciones empleadas.

Figura 9. Observación microscópica (1000 X) de extendidos del aislamiento MP06,

preparados con tinción de Gram y las tinciones para visualización de cápsula

bacteriana de Duguid y Hiss.

130

1.1.3 Pruebas bioquímicas convencionales de laboratorio, sistema de galerías

API® y sistema automatizado VITEK®

Se realizaron las pruebas bioquímicas convencionales de laboratorio para

BGNNF y también se utilizaron galerías comerciales para BGN no entéricos,

nutricionalmente no exigentes (API® 20 NE) sobre el aislamiento MP06.

En el aislamiento MP06 se detectó actividad catalasa, oxidasa, ß-galactosidasa

y gelatinasa. Desarrolló en caldo con 3% de NaCl pero no cuando la

concentración fue del 6% de NaCl. Desarrolló en BCSA, pero no en agar Mac

Conkey ni agar Chapman. Presentó desarrollo en TSB a 37 y 42°C. No se detectó

fermentación de glucosa, lactosa ni sacarosa. No utilizó D-glucosa, ác. adípico,

L-arabinosa, ác. cáprico, ác. cítrico, citrato, D-manitol, D-manosa, gluconato de

potasio, N-acetil-glucosamina, ác. fenilacético ni ác.málico. En cambio, utilizó

D-maltosa. No se detectó hidrólisis de esculina, actividad ureasa, producción de

indol, denitrificación, movilidad, producción de H2S. Tampoco se evidenció la

actividad de las enzimas arginina dihidrolasa, lisina decarboxilasa, ornitina

decarboxilasa ni fenilalanina deaminasa. Los ensayos de rojo de metilo y Voges-

Proskauer resultaron negativos. Se detectó actividad hemolítica del aislamiento

MP06 en presencia de sangre humana pero no en presencia de sangre de

origen ovino al 5% (v/v).

La identificación del aislamiento MP06 mediante la galería comercial API®20 NE

indicó que se trataba de Brevundimonas vesiculares con un 63% de certeza

(número de perfil 0030204). Los ensayos de gelatinasa, ß-galactosidasa y de

asimilación de D-maltosa y ácido málico, no coincidieron con el perfil descripto

para B. vesicularis.

El empleo del equipo automatizado VITEK®2, informó al aislamiento MP06 como

“no identificable” (comunicación personal de la Dra. María Rosa Baroni).

Respecto a la caracterización fenotípica realizada con base en las

características fisiológicas expresadas por el aislamiento MP06 no fue posible

131

identificarlo mediante el empleo de pruebas bioquímicas convencionales de

laboratorio y sistemas comerciales (de galería y equipo automatizado VITEK®).

1.1.4 Espectrometría de masa por MALDI-TOF

Los aislamientos MP06, MP13-M, MP13-MN y 161-13 fueron identificados

presuntivamente como I. limosus. Los puntajes asignados por la base de datos

del equipo se detallan en la Tabla 6.

MP06, MP13-M, MP13-NM recibieron un puntaje entre 1,624 y 1,644. La

realización de la extracción de proteínas previo al análisis por MALDI- TOF, como

parte de la preparación de la muestra, mejoró el puntaje de los aislamientos

MP06 y MP13-M (de 1,624 a 1,775), y en forma notoria para el aislamiento MP13-

NM (de 1,644 a 2,499). Además, estos puntajes fueron acompañados por una

diferencia mayor al 10% entre el primer y segundo match (1,313; Aeromonas

caviae 60 PIM).

Mediante MALDI-TOF se asignó la especie I. limosus al aislamiento 161-13, con un

puntaje de 2,527, por preparación directa de la muestra desde el medio de

cultivo.

Se validaron los puntajes asignados por el equipo incluyendo en la

determinación dos aislamientos del género Inquilinus, previamente

caracterizados por Coenye y col. [1]. Se emplearon las cepas equivalentes a la

cepa tipo de I. limosus AU476T y la cepa no perteneciente a esa especie,

Inquilinus sp. AU1979, que se encuentran depositadas en la Colección de

Bacterias BCCM/LMG, I. limosus LMG 20952T e Inquilinus sp. LMG 20953,

respectivamente. El puntaje asignado para la cepa tipo de I. limosus, por

comparación con los presentes de su base de datos, resultó mayor a 2 (2,362).

Es importante destacar que la base de datos utilizada solo presentaba

almacenado, por defecto, un único espectro, el correspondiente a la cepa

tipo. También se empleó la cepa de colección Inquilinus sp. LMG 20953, no

perteneciente a la especie I. limosus, que registró un puntaje menor a 1,5, el

132

cual no mejoró luego de realizar la extracción proteica previa a su análisis

espectrométrico (1,423 y 1,425, respectivamente), y cuya diferencia de puntaje

porcentual entre el primer y segundo match no superó el 10% (2do. match:

1,310; Cellulosimicrobium cellulans B480). Las diferencias de puntajes observadas

entre las cepas I. limosus LMG 20952T e Inquilinus sp. LMG 20953 sugieren que

MALDI-TOF puede ser una metodología que permita diferenciar distintas

especies dentro del género Inquilinus.

Tabla 6. Identificación presuntiva como I. limosus por MALDI-TOF

Extracción de proteínas previo al análisis

Sin extracción Con extracción

Aislamiento Puntaje Puntaje

MP06 1,624 1,775

MP13-M 1,624 1,775

MP13-NM 1,644 2,499

161-13 2,527 nr

I. limosus LMG 20952T 2,362 nr

Inquilinus sp. LMG 20953 1,423 1,425

nr: extracción proteica no realizada

Particularmente cuando se emplea esta metodología para identificar BGNNF se

considera que la identificación a nivel de especie es certera cuando los

puntajes asignados son > 2 y la diferencia entre el primer y segundo match es >

10% [139]. Debido a que la base de datos del equipo utilizado solo presentaba

un único espectro proteico de referencia, resulta lógico que los puntajes

asignados puedan ser menores. Sin embargo, el equipo pudo discriminar

eficazmente entre la cepa tipo de I. limosus y una cepa que pertenece al

género Inquilinus pero no a la misma especie (2,362 y 1,423, respectivamente).

Por lo que, podría considerarse que se puede obtener una identificación

presuntiva cuando los puntajes estén entre 1,7 y 2,0 como proponen Bizzini et al

[138], requiriendo el empleo de otra metodología (como la secuenciación del

133

gen codificante del ARNr 16S) para la confirmación de la especie [139]. Por lo

que se utilizó otra técnica para confirmar la identidad de los aislamientos MP06,

MP13-M, MP13-NM y 161-13, presuntivamente identificados mediante MALDI-TOF

como I. limosus.

Debido a propiedades estructurales de la pared celular de algunas bacterias o

incluso a su crecimiento lento, puede ocurrir que no se obtenga suficiente señal

proteica para construir un espectro que resulte comparable con los presentes

en la base de datos del equipo cuando se analizan las colonias directamente

desde el medio de cultivo (es decir, sin paso previo de extracción proteica). Así,

el sistema podría asignar un puntaje menor a 2, dificultando la identificación.

Cuando esto ocurre es necesario considerar realizar el proceso de extracción

previo al análisis proteómico, con la finalidad de exponer las proteínas

intracelulares [138]. El puntaje que el equipo asignó a MP06, MP13-M, MP13-NM

aumentó cuando se realizó la extracción de proteínas previo al análisis

espectrométrico. Es probable que el fenotipo (mucoso o no mucoso) que

presenta Inquilinus pudiera dificultar la ruptura de la pared y no se obtenga una

adecuada liberación de las proteínas necesarias para emplear la

espectrometría.

Mediante MALDI-TOF fue posible identificar como I. limosus al aislamiento 161-13,

con un puntaje de 2,527, coincidentemente con reportes previos que existen

sobre el empleo de MALDI-TOF como metodología adecuada para la

identificación de I. limosus [49, 139, 221].

134

1.1.5 Determinación de los perfiles proteicos totales mediante SDS-PAGE

Como parte de la identificación fenotípica de los aislamientos estudiados, se

compararon los perfiles de proteínas totales mediante SDS-PAGE. En la Figura 10

se pueden observar comparativamente los perfiles proteicos totales de los

aislamientos estudiados y las cepas del género Inquilinus.

En las condiciones ensayadas, los perfiles proteicos totales de los aislamientos

MP06, MP10, MP12, MP13-M, MP13-NM y 161-13 resultaron muy similares o

indistinguible entre sí, y respecto del presentado por la cepa tipo de I. limosus

(calle 8), independientemente del fenotipo que presentan los distintos

aislamientos.

El perfil proteico total de Inquilinus sp. LMG 20953 resultó visualmente distinto con

la presencia de un perfil de peso molecular muy diferente al presentado por los

aislamientos estudiados y distinto al presentado por la cepa tipo I. limosus LMG

20952T, acorde a lo observado por Coenye y col. [1].

Figura 10. Perfiles de proteínas totales de los aislamientos estudiados y su comparación

con los obtenidos para las cepas de colección, resueltos por SDS-PAGE al 12%.

Coloración con azul brillante de Coomasie. Calle 1: marcador de peso molecular

comercial pre-teñido (SDS-PAGE Molecular Weight Standards, Broad Range, Bio-Rad), 2:

MP06, 3: MP10, 4: MP12, 5: MP13-M, 6: MP13-NM, 7: 161-13, 8: I. limosus LMG 20952T, 9:

Inquilinus sp. LMG 20953.

135

La determinación del perfil proteico electroforético por SDS-PAGE es una

técnica rápida y de fácil realización, que puede aportar información sobre la

situación de proximidad entre aislamientos, especies, subespecies o

biovariedades en distintas bacterias, históricamente útil como criterio de

identidad [222], también podría contribuir con la diferenciación entre posibles

especies pertenecientes al género Inquilinus, aún no caracterizadas.

1.2 Caracterización genotípica

1.2.1 Métodos basados en la secuenciación de segmentos de ADN: ARNr 16S

La confirmación de la identidad de los aislamientos MP06, MP13-M, MP13-NM y

161-13, presuntivamente identificados mediante MALDI-TOF como I. limosus, se

realizó mediante la amplificación por PCR y análisis de la secuencia génica que

codifica para el ARNr 16S.

En la Figura 11 se muestran las posiciones filogenéticas de los aislamientos

estudiados en el dendrograma construido como parte del análisis comparativo

de las secuencias del ARNr.

Si bien en los repositorios públicos se encuentran numerosas secuencias

codificantes del ARNr 16S depositadas como I. limosus, la mayoría no pueden

ser consideradas en este estudio por importantes motivos. Muchas de esas

secuencias sólo corresponden a un fragmento interno del gen de unos 500 ntds

aproximadamente, que no abarca la región en la que se encuentran los

cambios nucleotídicos en Inquilinus spp. En otros casos no se encontró una

sólida evidencia acerca de la identificación certera de las cepas sobre las que

se encuentran esas secuencias, pues sólo arribaron a esa identificación

basados en el propio análisis del 16S, sin reportar ninguna característica

fisiológica del microorganismo. Por lo que sólo se emplearon secuencias casi

completas del gen (aprox. 1400 ntds) correspondientes a cepas con una

robusta caracterización bioquímica de su metabolismo. En todos los casos se

136

determinó la similitud entre secuencias sólo de la región alineada, comparando

la misma longitud de secuencias.

La secuencia del aislamiento 161-13 presentó un 99,9% de similitud respecto de

los 1418 ntds secuenciados de la cepa tipo de I. limosus AU476T (Nro. de acceso

AY043374).

Las secuencias de los aislamientos MP06, MP13-M, MP13-NM, de 1479 ntds,

exhibieron un 100 % de identidad entre sí. Esa secuencia presentó un 99,4% de

identidad frente a 1423 ntds alineados correspondientes a la cepa Inquilinus sp.

AU1979 (Nro. de acceso AY043375), cuya secuencia se encuentra

confusamente depositada como I. limosus, pero que fue caracterizada como

no perteneciente a esa especie [1]. Además presentó un 98,7% de identidad

frente a 1417 ntds alineados correspondientes a la secuencia de la cepa tipo

de I. limosus AU476T (Nro. de acceso AY043374), y un 98,7% de identidad con los

1393 ntds alineados correspondientes a la cepa tipo de la especie más

recientemente descripta del género Inquilinus, I. ginsengisoli (Nro. de acceso

AB245352). Las diferencias porcentuales observadas en el análisis de similitud de

secuencias, en el presente estudio, son consistentes con la variación

intraespecie reportada por Coenye y col. [1].

Por otro lado, la secuencia de los aislamientos MP presentó 99,9% de identidad

frente a los 1428 ntds alineados de la secuencia correspondiente a Inquilinus sp.

RB35 (Nro. de acceso DQ512800). El aislamiento RB35 fue considerado como el

microorganismo causante de una endocarditis infecciosa protésica precoz en

un paciente no FQ [50]. Como parte de esa caracterización, Kiratisin y col.

consideraron adecuado identificar a RB35 solo hasta el nivel de género,

basados en la similitud de distancias existentes entre las secuencias del ARNr 16S

de RB35 y las cepas AU1979 y AU476T [50].

137

Figura 11. Dendrograma resultante del análisis comparativo de las secuencias

codificantes del ARNr 16S muestra la relación filogenética de los aislamientos MP06,

MP13-M, MP13-NM y 161-13, respecto de otros microorganismos de la clase

Alfaproteobacteria y particularmente respecto del género Inquilinus. Entre paréntesis se

indica el número de acceso a la secuencia depositada en el DDBJ/EMBL/GenBank. La

barra de escala indica el número de sustituciones por posición nucleotídica.

Inicialmente, cuando se caracterizó el género Inquilinus, se consideró que,

aunque las secuencias del ARNr 16S de las cepas AU476T y AU1979 presentaban

un 99,0% de identidad entre sí, debido a las diferencias que se observaron en los

perfiles proteicos totales resueltos por SDS-PAGE, la cepa AU1979 no quedaría

agrupada dentro de la especie I. limosus [1]. En forma similar, las secuencias del

ARNr 16S correspondientes a las cepas tipo de las dos únicas especies

descriptas hasta el momento dentro del género Inquilinus, I. limosus AU476T e I.

ginsengisoli Gsoil080T, resultan idénticas en un 98,9% [38]. Esto sugiere que la

diferenciación entre especies de Inquilinus podría no ser posible basándose

únicamente en las secuencias del ARNr 16S y resulta necesario considerar otras

características en su contexto.

138

1.2.2 Métodos basados en ADN total

1.2.2.1 Contenido de G+C y tamaño del genoma

El contenido medio de G+C del genoma del aislamiento MP06 se estimó en

69,60% mediante pirosecuenciación completa del genoma, con plataforma

454®Roche (Nro. de acceso JANX01000000).

Para la cepa tipo de I. limosus LMG 20952, otros estudios han reportado un

contenido de G+C en un rango entre 70,3 y 70,9% mediante técnica

cromatográfica [1], y de 69,90% mediante pirosecuenciación completa del

genoma, con plataforma illumina®HiSeq 2000 (Nro. de acceso AUHM01000000).

El genoma del aislamiento MP06 se estimó en (al menos) 6,94 Mbp (Nro. de

acceso JANX01000000), mientras que el correspondiente cepa tipo de I. limosus

en 7,41 Mbp (Nro. de acceso AUHM01000000). Aunque ambas estimaciones se

realizaron sobre las lecturas pirosecuenciadas en distintas plataformas y con

diferentes grados de avance en el ensamblaje de las secuencias, tanto el

contenido de G+C como el tamaño del genoma de MP06 no puede, al menos,

diferenciarse del de la cepa tipo de I. limosus.

1.3 Combinación de resultados para optimizar la identificación de Inquilinus

Los aislamientos MP06, MP13-M y 161-13 presentaron un aspecto macroscópico

mucoso similar al descripto por Coenye et al [1] para la cepa tipo de I. limosus.

Las características de los cultivos se mantuvieron estables con el número de

repiques, acorde a la descripción realizada por Pitulle et al cuando reportaron

un aislamiento no identificable, la cepa DS15158 [37] que posteriormente seria

definido dentro del género Inquilinus [1]. También, la presencia de cápsula en

MP06 concuerda con lo observado mediante microscopía de contraste de

fases para la cepa DS15158 por Pitulle et al. [37].

139

Al igual que lo reportado por otros estudios acerca de Inquilinus [1, 42, 50], no

fue posible identificar los aislamientos mediante pruebas bioquímicas

convencionales de laboratorio, pruebas bioquímicas de galería como el sistema

API® o el empleo de equipo automatizado de identificación tipo VITEK®. Los

resultados de las pruebas bioquímicas realizadas a MP06 coincidieron con la

descripción de la especie I. limosus realizada por Coenye y col. [1].

Por último, aunque la distancia de la secuencia del ARNr16S de MP06, MP13-M y

MP13-NM respecto de Inquilinus sp. AU1979 es ligeramente menor que la

observada frente a la cepa tipo AU476T (99,4% y 98,7%, respectivamente) se

identificó a estos aislamientos como pertenecientes a la especie I. limosus, con

base en la información obtenida por las distintas metodologías empleadas, en

su conjunto. Para esto se consideró principalmente que los perfiles proteicos

totales de estos aislamientos, resueltos por SDS-PAGE resultaron indistinguibles

del obtenido para la cepa tipo de I. limosus y distinto al presentado por

Inquilinus sp. (definido como no perteneciente a la especie I. limosus). Asimismo,

los espectros proteicos obtenidos por espectrometría de masa (MALDI-TOF)

recibieron un alto puntaje (mayor a 1,7), al ser contrastados con el espectro de

la cepa tipo de I. limosus, mientras que el puntaje máximo obtenido para

Inquilinus sp. (no I. limosus) LMG 20953 fue de 1,425.

El aislamiento 161-13 fue identificado como I. limosus mediante MALDI-TOF, y se

confirmó su especie mediante el análisis de la secuencia del ARNr 16S.

La limitación en el empleo de MALDI-TOF reside en el costo del equipo. La base

de datos de los software (como el MALDI BiotyperTM, entre otros) que se utilizan

acoplados a los equipos para MALDI-TOF, incluye por defecto únicamente el

espectro proteico de la cepa tipo de I. limosus, lo que puede representar un

inconveniente en la identificación de Inquilinus. Sin embargo, las bases de datos

de estos equipos pueden ser enriquecidas con actualizaciones informáticas y

con las mismas muestras clínicas que el usuario utilice (y tengan una

identificación confirmada por otra metodología, como el análisis del ARNr 16S)

140

[139, 223, 224]. Los resultados de la identificación por MALDI-TOF pueden

obtenerse rápidamente, pudiéndose procesar hasta 50 muestras en 1 hora

aproximadamente. El costo de procesamiento es 4 veces menor respecto del

sistema API® y 7 veces menor respecto del sistema VITEK®, aún incluyendo los

gastos de mantenimiento del equipo para un periodo de 5 años [225, 226], de

forma que se calcula un costo aproximado de € 0,9/50 muestras [139].

Particularmente, en el caso de Inquilinus, los tiempos necesarios para procesar

las muestras pueden prolongarse cuando es necesario un paso de extracción

proteica previo a su análisis. Agregar este paso de extracción toma seis minutos

por muestra (pudiendo reducirse si las muestras se trabajan en serie) [226].

Las herramientas moleculares como la secuenciación del ARNr16S proporcionan

resultados confiables para la identificación de microorganismos provenientes de

pacientes con FQ, como Inquilinus [1, 41, 42, 227]. Sin embargo, a pesar de la

buena precisión que tienen las técnicas moleculares, estas no pueden ser

utilizadas rutinariamente por su alto costo, el tiempo que debe invertirse hasta la

interpretación del ensayo y por requerir la participación de personal entrenado

[139].

La identificación de los microorganismos presentes en las muestras clínicas de

los PFQ resulta de suma importancia para administrar el tratamiento clínico

adecuado, y controlar el manejo clínico de estos pacientes al considerar la

potencial patogenicidad y transmisibilidad de microorganismo que estos

pacientes pueden presentar [228]. Los procedimientos para realizar la

identificación de aislamientos clínicos dependen de la disponibilidad que cada

laboratorio de microbiología. Aunque el empleo de MALDI-TOF combinado con

el análisis del ARN 16S parecen metodologías óptimas para la identificación

certera de Inquilinus spp., en los laboratorios sin disponibilidad para realizar estas

técnicas, no sería posible lograr la adecuada identificación de Inquilinus, e

incluso podría arribarse a una identificación incorrecta, al basarse en los

resultados de otras técnicas de identificación como los sistemas comerciales de

amplia utilización API® o VITEK®. E intentar arribar a una identificación certera

141

solo estudiando la secuencia codificante del ARNr 16S no sería suficiente, según

ya había observado Coenye y col. [1], las secuencias de las cepas AU476T y

AU1979 presentan un 99,0% de identidad entre sí, sin embargo se ubican en

categorías taxonómicas distintas. Por lo que sería necesario considerar la

amplificación y secuenciación de genes alternativos al ARNr 16S, como por

ejemplo fragmentos internos de genes implicados en el metabolismo celular

(genes housekeeping) que permitan una tipificación molecular, como

abordamos más adelante en esta tesis.

Los aislamientos no mucosos podrían ser subestimados y no ser considerados

como Inquilinus, precisamente porque la mucosidad de los cultivos se menciona

como una característica distintiva del género. Uno de los aislamientos aquí

estudiados (MP13-NM) no presentó aspecto mucoso e incluso por el aspecto

seco y rugoso que presentan sus colonias en distintos medios de cultivo, podría

ser interpretado como un contaminante ambiental. Hasta este momento, solo

existe un reporte que mencione la recuperación de Inquilinus con fenotipo no

mucoso [42]. Las características fenotípicas que Inquilinus presenta en cultivos in

vitro pueden ser sumamente útiles para orientar al personal que procesa las

muestras clínicas en centros de salud y que carecen de la posibilidad de realizar

metodologías moleculares o basadas en proteomica. Sin embargo, tanto el

aspecto mucoso como el no mucoso que presentan los aislamientos de

Inquilinus puede ser confundidos con las colonias de P. aeruginosa, como fue

reportado por Kidd y col. [44]. En la Figura 12 se puede observar en forma

comparativa la similitud que presentaron los aislamientos de I. limosus MP13-M e

I. limosus MP13-NM con un aislamiento de P. aeruginosa, con fenotipos mucoso

y no mucoso, provenientes de un PFQ.

La caracterización inicial de I. limosus realizada por Coenye et al en el 2002 [1],

es la única que existe en la actualidad. La presencia de numerosos reportes

acerca de aislamientos clínicos de Inquilinus con identificación molecular

confirmada por ARNr16S pero con características fenotípicas que no coinciden

con la descripción fenotípica de la cepa tipo de I. limosus [37, 40-42], sugiere

142

que es necesario evaluar la diversidad de especies que podría presentar este

género, a fin de redefinirlo con un nuevo estudio taxonómico que comprenda

un mayor número de aislamientos.

Figura 12. Comparación entre aislamientos con características fenotípicas similares

provenientes de PFQ. Cultivos de: A. I. limosus MP13-NM (fenotipo no-mucoso). B. I.

limosus MP13-M (fenotipo mucoso). C y D: Figura extraída de la presentación "CF

Microbiology Past, Present, Future" realizada por J. LiPuma, en la 28va. North American

Cystic Fibrosis Conference 2014, correspondiente a un cultivo de P. aeruginosa, con

fenotipo no mucoso (C) y mucoso (D).

A B C D

143

1.4 Tipificación molecular por PFGE

Se estudió la posible relación clonal de los sucesivos aislamientos de I. limosus

con denominación “MP”, recuperados entre los años 2006 y 2013, de un mismo

PFQ mediante PFGE.

Los aislamientos MP presentaron el mismo número de bandas, con un mismo

tamaño aparente, de forma que los pulsotipos obtenidos fueron indistinguibles,

tanto por XbaI-PFGE como por BcuI-PFGE (Figura 13).

Wellinghause et al habían demostrado con anterioridad que el empleo de PFGE

en Inquilinus se presenta como técnica útil para descartar la infección cruzada

en distintos PFQ concurrentes al mismo centro de salud, mediante la obtención

de pulsotipos distintivos [41]. A su vez, existen reportes que describen una

relación clonal confirmada mediante PFGE en los sucesivos aislamientos clínicos

en pacientes colonizados por Inquilinus [40-42].

El pulsotipo indistinguible observado para los aislamientos MP sugiere que el

paciente estaba persistentemente colonizado con la misma cepa. Esta cepa

presentó dos variantes de expresión, una variante con fenotipo mucoso y otra

con fenotipo no mucoso.

Los pulsotipos de 161-13 resultaron muy similiares a los obtenidos para la cepa

tipo de I. limosus LMG 20952T mediante XbaI-PFGE y BcuI-PFGE. Solo parecieron

presentar algunas bandas con un ligero menor tamaño. Entre estos aislamientos

no existe una relación epidemiológica.

La utilización de BcuI (SpeI) y XbaI ha sido probada (cada una de ellas por

separado) para analizar por PFGE aislamientos de Inquilinus provenientes de

distintos PFQ, a fin de estudiar un posible vinculo clonal entre ellos [41, 42], y

excepto en aquellos aislamientos que provenían de un mismo paciente, no se

han reportado pulsotipos indistinguibles entre aislamientos, lo que demuestra

que el empleo de XbaI-PFGE y BcuI-PFGE puede ser una metodología suficiente

para distinguir aislamientos sin relación clonal.

144

Los estudios de biología poblacional que existen acerca de Inquilinus hasta este

momento, presentaron un limitado número de aislamientos, acotados a una

clínica o región geográfica, sólo emplearon PFGE [41, 42] y no recabaron

suficientes datos que permitan dilucidar acerca de la existencia de clones

epidémicos o complejos clonales prevalentes que se pudieran estar

diseminando. Ante este hallazgo de pulsotipos indistinguibles sin relación

epidemiológica, resultaría interesante analizar la genética poblacional de

Inquilinus ante la posible emergencia evolutiva de líneas genéticas de

relevancia clínica.

Figura 13. Patrones de bandas

(pulsotipos) de los distintos

aislamientos de Inquilinus,

resueltos mediante PFGE por

digestión del ADN con las enzimas

de restricción XbaI (izquierda) y

BcuI (derecha).

Calles (mismo orden en ambas

macrorrestricciones):

1: I. limosus MP06, 2: I. limosus

MP10, 3: I. limosus MP12, 4: I.

limosus MP13-M, 5: I. limosus MP13-

NM, 6: I. limosus LMG 20952T, 7: I.

limosus 161-13, 8: Inquilinus sp.

LMG 20953.

145

1.5 Ensayos de conservación

Se estudió la conservación del aislamiento MP06 mediante distintos métodos

como repique, congelamiento y supercongelamiento. El análisis realizado surge

ante nuestra propia dificultad para recuperar viables los aislamientos luego de

un tiempo de almacenamiento y el comentario de Hayes y col. [45] quienes

reportaron que no pudieron realizar estudios de genotipificación de muestras

clínicas seriadas por la pérdida de viabilidad de los aislamientos de Inquilinus.

No se encuentra descripto en bibliografía información acerca de la

conservación en el laboratorio de aislamientos del género Inquilinus, y para

muchos laboratorios de microbiología resulta importante almacenar los mismos

para realizar estudios posteriores.

En la Tabla 7 se detallan los resultados obtenidos para los ensayos de

preservación, según el tiempo máximo de conservación para la recuperación

viable de MP06, de acuerdo a la temperatura y el agente crioprotector

utilizados.

El supercongelamiento a -196°C resultó ser el mejor método de preservación de

los ensayados para la recuperación viable de Inquilinus, independientemente

del crioprotector empleado [glicerol 20% (v/v) o leche descremada en polvo 10

% (p/v)], con un tiempo de preservación de, al menos, 66 meses en las

condiciones ensayadas. La dificultad del supercongelamiento radica en los

costos para adquirir y especialmente mantener sustentable el tanque de

nitrógeno líquido.

Una de las estrategias que comúnmente se aplican para conservar

microorganismos mesófilos es la preservación de inóculos a -20°C utilizando

glicerol al 20% (v/v) como crioprotector. Sin embargo, en el presente estudio se

observó la perdida de la viabilidad de I. limosus MP06 en un periodo

relativamente corto de tiempo (menos de un año de almacenamiento),

cuando se realizó la conservación por congelamiento con glicerol como

crioprotector. Esta metodología es ampliamente utilizada en laboratorios,

146

especialmente en aquellos que no disponen de un equipamiento o

infraestructura que les permita criopreservar a otras temperaturas (como

freezers de -70, -80 o -196°C en tanques de nitrógeno).

La utilización de leche descremada en concentración final 10 % (p/v) (skim milk)

resultó ser el crioprotector probado más adecuado para la recuperación de

Inquilinus, cuando solo se dispone equipamiento que permita el

almacenamiento a -20°C (36 a 42 meses).

147

Tabla 7. Métodos ensayados para la conservación del aislamiento MP06.

Condiciones de Conservación

Método Temperatura de

almacenamiento

(°C)

Agente

crioprotectora

Medio utilizado Tiempo máximo de

conservación

(mes)

8 - Agua destilada < 1

Ambiente - Agua destilada < 1

Repique 8 - Agar semisólido (0,8%) 1

8 - TSA 1

Ambiente - TSA 2

37 - TSB 1-2

8 - TSB 6

Ambiente - Agar semisólido (0,8%) 7

Congelamiento -20 Glicerol BHI 9-12

-20 Leche Leche 36-42

Supercongelamiento -196 Glicerol BHI > 66

-196 Leche Leche > 66

a Agente crioprotector: Glicerol 20% (v/v) - Leche descremada 10 % (p/v). b Tiempo máximo de conservación en el que se logró recuperar el microorganismo, bajo esas condiciones, siendo 1 mes el mínimo de tiempo y 66

meses (5 años y medio) el máximo probado experimentalmente

148

149

2 ENSAYOS DE SENSIBILIDAD A DROGAS ANTIMICROBIANAS.

DETECCIÓN Y CARACTERIZACIÓN FENOTÍPICA DE

MECANISMOS DE RESISTENCIA

Si bien aun no se ha propuesto una estandarización (y sus correspondientes

criterios de interpretación de resultados) para el ensayo de la sensibilidad de

Inquilinus spp., se evaluó (como primer aproximación) la sensibilidad mediante

ensayos cualitativos por difusión en medio sólido (antibiograma) preparando al

inoculo por las distintas metodologías generales sugeridas por el CLSI.

Sólo se obtuvo un crecimiento confluente del microorganismo cuando el

inóculo se preparó por el método de desarrollo previo (Figura 14, A), ya que en

nuestras manos, el método directo de inoculación a partir de colonias aisladas

no permitió el desarrollo confluente deseado (Figura 14, B), dando lugar a halos

de tamaño irregular, no medibles, especialmente en las cepas con

características mucosas. Por consiguiente los inoculos de Inquilinus para realizar

las pruebas de sensibilidad se obtuvieron por el método de desarrollo previo.

Figura 14. Aspecto macroscópico del crecimiento microbiano según el método

empleado para la preparación del inóculo, previo a la realización de antibiogramas

por difusión en medio sólido. A: se puede observar el crecimiento confluente del

microorganismo hisopado sobre el AMH cuando el inoculo se preparó por el método

de desarrollo previo. B: la preparación del inoculo por el método directo de

inoculación a partir de colonias aisladas no permitió el desarrollo confluente necesario

para realizar antibiogramas por difusión en medio sólido.

Con el objetivo de caracterizar (preliminarmente al menos) el perfil de

sensibilidad de los aislamientos en estudio, frente a distintos antibióticos, se

realizaron los antibiogramas y la determinación de la CIM, preparando los

inóculos por el método del desarrollo previo. Los resultados se detallan en la

Tabla 8 y se comentan a continuación.

A B

150

151

Tabla 8. Ensayos de sensibilidad - Antibiogramas y CIM en aislamientos de Inquilinus

Tabla 8. Ensayos de sensibilidad - Antibiograma y CIM en aislamientos de Inquilinus

Compuesto

Ácido Nalidíxico 6 6 6 6 64 -

Amicacina 30 6 15 21 2 2

Amoxicilina 6 6 6 6 > 1024 > 1024

Amoxicilina+CLA 6 6 6 6 64/32 64/32

Ampicilina - - - - > 1024 > 1024

Ampicilina+CLA - - - - 512/256 512/256

Ampicilina+SUL 6 6 6 6 256/128 -

Azitromicina 20 30 20 20 2 2

Aztreonam 6 6 6 6 512 -

Cefalotina 6 6 6 6 > 1024 > 1024

Cefepime 6 6 6 6 128 128

Cefixima - - - - > 1024 > 1024

Cefotaxima 6 6 6 6 256 256

Cefotaxima+CLA - - - - > 8/4 -

Cefoxitina 6 6 6 10 128 128

Ceftacidima 6 6 6 6 128 128

Ceftacidima+CLA 6 6 6 6 64/4 64/4

Ceftriaxona 6 6 6 6 256 256

Ceftriaxona+CLA 6 6 6 6 128/4 -

Cefuroxima - - - - > 1024 > 1024

Ciprofloxacina 40 35 30 28 1 1

Clindamicina 6 6 6 6 - -

Cloramfenicol 6 6 6 6 > 1024 -

Colistín 6 6 6 6 > 1024 > 1024

Doripenem - - - - < 8 -

Eritromicina 8 9 6 6 - -

Ertapenem - - - - < 2 -

Estreptomicina 6 6 6 6 - -

Fosfomicina 6 6 6 6 > 16 -

Gentamicina 6 14 10 14 128 128

Imipenem 55 55 48 55 0,25 0,25

Kanamicina 6 18 15 6 - -

Levofloxacina 25 20 20 20 2 -

Meropenem 40 42 38 50 < 0,5 < 0,5

Minociclina 15 20 35 15 < 4 -

Nitrofurantoína 6 6 6 6 > 64 -

Piperacilina 6 6 6 6 - -

Piperacilina+TAZ 6 6 6 6 > 64/4 -

Rifampina 6 15 15 6 16 -

Tetraciclina 6 11 6 6 64 -

Tigeciclina - - - - 1 -

Tobramicina - - - - > 1024 > 1024

Trimetoprima-sulfametoxazol 6 6 6 6 > 2/38 -

- no realizado

I. limosus

161-13

Ensayo cuantitativo de Antibiograma por difusión en disco en medio sólido

inhibición del crecimiento CIM (µg/ml) Diámetro del halo de inhibición (mm)

I. limosus MP06, MP10,

MP12,MP13-M y MP13-NM

I. limosus MP13-M y

MP13-NMI. limosus MP06

Inquilinus sp.

LMG 20953

I. limosus

LMG 20952

152

153

Como puede verse en la Tabla 8, no se observaron halos de inhibición para

muchos de los antibióticos ensayados, excepto cuando los discos contenían

fluoroquinolonas (CIP y LEV), AZI, RIF, TET, GEN y carbapenemes (IMI y MER).

Particularmente en el caso de AMI se observó un rango de halos amplio (6-30

mm), según el aislamiento en estudio, y su ausencia en 161-13. Ninguno de los

aislamientos denominados MP presentó halos de inhibición frente a RIF y los

aminoglucósidos GEN y KAN.

Resulta controversial definir la emergencia de variantes resistentes intra-

tratamiento antibiótico. Si bien Schmoldt y col. [40] detectaron la emergencia

de resistencia a MER en un PFQ, durante una antibioticoterapia de 3 meses con

MER, TOB y CIP, Wellinghausen y col. [41] no observaron variaciones en los

valores de CIM en los sucesivos aislamientos recuperados de un PFQ en un

estudio realizado durante un breve periodo de tiempo. En nuestro caso todos los

aislamientos obtenidos en el período de seguimiento del paciente (2006-2013)

conservaron el mismo antibiotipo y valores de CIM para los antimicrobianos

ensayados, pese a los numerosos episodios en los que recibió tratamiento

antibiótico.

En general, lo presencia de halos de inhibición de gran tamaño correlacionó

con bajos niveles de CIM, mientras que la ausencia de halos lo hizo con altos

niveles de CIM.

La presencia de ß-lactamasas no pudo ser detectada fácilmente por ensayos

de doble disco. Sin embargo, los ensayos cuantitativos en presencia de

inhibidores de ß-lactamasas de clase A (CLA, SUL) mostraron discretas

reducciones en los niveles de CIM en presencia de los mismos en las

combinaciones AMC, APC y AMS (con reducciones en un factor de entre 3 y 5

veces.

En general, en los escasos trabajos en los que se informa la sensibilidad

antibiótica, las CIM se estimaron con el sistema comercial Etest® como

describieron inicialmente Wellinghausen y col. [41]. Debido a que no existe un

criterio de interpretación para los valores de CIM en Inquilinus, usualmente la

154

interpretación se realiza aplicando el criterio para P. aeruginosa [50]. Los valores

de CIM de Inquilinus que se reportan se encuentran en un rango al que se lo

considera tradicionalmente resistente frente a cefalosporinas, polimixinas, TOB,

FOS y TMS [50], antimicrobianos en los que se observa una ausencia total de

halos de inhibición en los antibiogramas. Frente a otros antimicrobianos, las

respuestas de Inquilinus parecen ser más variables. Las sensibilidades frente a

quinolonas, RIF, TET, y algunos aminoglucósidos como GEN, AMI y KAN parecen

depender de cada aislamiento en cuestión, según lo que se observa en distintos

reportes [40-42, 47, 50]. Aunque en general se lo describe como sensible a

carbapenemes con CIM < 0,5 µg/ml y halos de inhibición de entre 40-50 mm,

existen varios aislamientos reportados como resistentes [40, 45], y cuya

importancia radicó en la ausencia de una opción terapéutica.

La actividad ß-lactamasa de MP06 se evidenció mediante el uso de NITTM y se

confirmó empleando el método iodometrico en presencia de AMP y CRO como

sustratos; en presencia de CAZ (1000 μg/ml) no se detectó hidrólisis enzimática

en el tiempo del ensayo.

Mediante IEFA revelado por método iodométrico en presencia de CEF se

detectó la presencia de, al menos, una ß-lactamasa con pI aparente de 6,0 a

8,0 aproximadamente (Figura 15).

Aunque el valor de CIM frente a CAZ resultó relativamente alto (128 μg/ml),

sugiriendo que la cepa “MP” presenta algún mecanismo de resistencia, no se

detectó la hidrólisis de CAZ en las condiciones ensayadas por método

iodométrico, y tampoco se observaron variaciones significativas al determinar la

CIM frente a la combinación CAZ+CLA. Esto podría deberse a la presencia de

una ß-lactamasa con capacidad para hidrolizar CAZ aunque a una velocidad

suficientemente lenta, o que su actividad enzimática sea relativamente

inestable en el ensayo como para que su actividad hidrolítica pueda

evidenciarse por método iodométrico. También podrían existir una baja

inhibición de las PBP por CAZ u ocurrir por la presencia de un mecanismo de

resistencia no enzimático, como la presencia de bombas de eflujo.

155

Figura 15. Determinación del pI de enzimas ß-lactamasas en el extracto proteico total

de I. limosus MP06, mediante IEFA revelado por método iodométrico en presencia de

CEF. Calles: 1: Extracto enzimático marcador y control de hidrólisis, contiene las enzimas

ß-lactamasas TEM-1 y OXA-10 (pI=5,4 y 6,1, respectivamente). 2: Extracto proteico total

de E. coli ATCC 35218, control del proceso de ruptura celular, productora de TEM-1 (pI=

5,4). 3: Extracto proteico total de I. limosus MP06. 4: Extracto enzimático marcador y

control de hidrólisis, portador de SHV-2 y CMY-2 (pI= 7,6 y 9,0, respectivamente).

De forma que podría ocurrir que la ausencia de sinergia que presentan los

aislamientos MP en los antibiogramas podría deberse a una actividad ß-

lactamasa que presente una dificultosa inhibición por inhibidores de ß-

lactamasas como CLA, SUL, TAZ o BOR. También podría ocurrir que estén

presentes varias ß-lactamasas cuyas sensibilidades a inhibidores y su propia

regulación impidan la detección fenotípica. Y que además, el nivel de

resistencia que se observa en Inquilinus, con ausencia de halos de inhibición

frente a antibióticos ß-lactámicos pueda deberse a la combinación de distintos

mecanismos de resistencia.

En los ensayos realizados para estudiar el desarrollo de Inquilinus en medio BCSA

(un medio usualmente empleado para procesar las muestras clínicas de PFQ),

con y sin antimicrobianos en su composición, se observó que solo MP06 y LMG

20952T desarrollaron en medio BCSA con los 3 antimicrobianos (Tabla 9). En tanto

la cepa LMG 20953 no desarrolló a lo largo de toda la estría sembrada en

presencia de un gradiente de GEN de 0-10 μg/ml. Esto sugiere que las distintas

sensibilidades que se observan en Inquilinus pueden afectar su recuperación en

medios que contengan GEN.

156

Tabla 9. Ensayo de desarrollo de Inquilinus en medio BCSA

Medio base BCSA

adicionado con:

Aislamiento

MP06

I. limosus

LMG 20952T

Inquilinus sp.

LMG 20953

POL, GEN, VAN a D D ND

POL b D D D

GEN c D D ND

VAN d D D D

sin antimicrobianos D D D

a Composición del medio BCSA-Laboratorios Britania S.A. Concentraciones de cada

antimicrobiano: POL: polimixina B (600.000 UI/L), GEN: gentamicina (10,0 mg/L) y VAN:

vancomicina (2,5 mg/L). b Gradiente de POL: 0-600 UI/L c Gradiente de GEN: 0-10 μg/ml d Gradiente de VAN: 0-2,5 μg/ml

D: desarrollo; ND: sin desarrollo a lo largo de toda la estría sembrada

Particularmente para Inquilinus existen al menos unos 34 aislamientos reportados

como tales. Sin embargo, solo 2 aislamientos fueron recuperados en medio

BCSA (POL (600.000 UI/L), GEN (10 μg/ml) y VAN (2,5 μg/ml) y estos presentaron

una CIM a GEN > 8 μg/ml. Mientras que para 12 aislamientos se reportó que no

desarrollaron en BCSA, y fueron recuperadas en medios de cultivo no selectivos,

generalmente, junto con muchos otros microorganismos (Tabla 1).

En algunos países europeos se observó una mayor recuperación de Inquilinus en

esos medios que no contienen GEN como agente selectivo. Esto ocurrió en

países en los que el uso de BCSA no está tan difundido y se comercializan

medios de cultivo de composición similar, como MAST Diagnostica agar (que

contiene 100 μg/ml de ticarcilina y 300 UI/L de POL) o OFPBL (bacitracina, POL y

lactosa), los cuales no contienen GEN en su composición. Por lo que, es posible

que la utilización de BCSA (o un medio similar con GEN en su composición)

pueda impedir la recuperación de Inquilinus debido al contenido de GEN que

suele adicionarse a este medio.

La búsqueda de Inquilinus podría realizarse en medio con polimixina, sin el

agregado de GEN [42].

157

Debido al fenotipo mucoso que presenta Inquilinus y que generalmente la

prueba de citocromo-oxidasa resulta positiva, su desarrollo microbiano en

muestras de PFQ contribuyó para que, en numerosas oportunidades, fuera

identificado erróneamente como P. aeruginosa, especialmente en laboratorios

que no utilizan COL en pruebas de rutina, según se reportó en un estudio multi-

céntrico realizado en Australia [44].

Sin embargo, el antibiotipo que presenta Inquilinus puede facilitar su

identificación. El perfil de sensibilidad a 2 grupos de antimicrobianos en

particular (polimixinas y carbapenemes) permite orientarse hacia uno u otro

género. En el antibiotipo de I. limosus se observa ausencia de halos de inhibición

para COL y usualmente grande halos para carbapenemes (con algunas

excepciones). Mientras que P. aeruginosa presenta un perfil de resistencia

invertido, en general, sensible a COL y resistente a carbapenemes [229].

El perfil de multiresistencia que presenta Inquilinus se encuentra ampliamente

mencionado en bibliografía, y parece ser la característica más preocupante en

los PFQ que están usualmente bajo constante tratamiento con antimicrobianos.

A pesar de reportes que sugieren que I. limosus se presenta como un patógeno

en estos pacientes [40, 45], capaz de ocasionar el declinamiento de la función

pulmonar e incluso el desenlace fatal debido a la falta de terapia

antimicrobiana [40, 45], aún los mecanismos asociados a la resistencia

antibióticos no se encuentran caracterizados.

158

159

3 FORMACIÓN de BIOFILMS

3.1 Cuantificación de la biomasa de biofilm formado en ausencia y presencia

de concentraciones sub-CIM de antimicrobianos

Se evaluó la formación in vitro de biofilms de los aislamientos MP13-M, MP13-

NM, 161-13 y de las cepas de colección I. limosus LMG 20952T e Inquilinus sp.

LMG 20953. La formación de los biofilms se realizó en ausencia de

antimicrobiano y en concentración sub-mínima inhibitoria (sub-CIM) a distintos

antimicrobianos (AZI, IMI, CIP, TOB y COL).

La Figura 16 permite una comparación visual de la magnitud de las biomasas

formadas por todos los aislamientos ensayados (mucosos y no mucosos), en

presencia sub-CIM de antibiótico, respecto del control sin antimicrobiano. Se

observaron distintos comportamientos entre los aislamientos, según se describe

a continuación.

En general, los valores de biomasa (DO540nm) en este estudio, se correlacionan

con una baja formación de biofilm, respecto de lo descripto

experimentalmente para otras especies [132, 134, 230, 231], incluso al prolongar

el período de incubación.

Se determinó que el biofilm formado en el pocillo por el aislamiento MP13-M,

desarrollado en ausencia de antimicrobianos (control) presentó

aproximadamente un recuento de 3,2x108 UFC/pocillo. En tanto, que en las

condiciones ensayadas, la población planctónica en contacto con el biofilm

fue determinada en 5,5x106 UFC/ml.

Estudios previos realizados sobre I. limosus también reportaron que las biomasas

formadas por Inquilinus, determinadas por DO, son mucho menores que las que

presentan otros microorganismos (como P. aeruginosa), aún cuando emplearon

otros dispositivos (cámara de Calgari) que suelen ser más eficientes para la

formación de los mismos [131, 132].

160

Figura 16. Comparación de la biomasa formada por los aislamientos (mucosos y no-

mucosos), desarrollados en presencia sub-CIM de antibiótico Control: sin antibiótico,

nivel basal de formación in vitro de biofilm en ausencia de ATB. COL: colistín, TOB:

tobramicina, CIP: ciprofloxacina, AZI: azitromicina, IMI: imipenem.

Variantes isogénicas MP13-M y MP13-NM

Las biomasas formadas por la variante no mucosa (MP13-NM), resultaron

significativamente mayores respecto de la variante mucosa (MP13-M), tanto en

ausencia como en presencia de concentraciones sub-MIC de COL, TOB, CIP y

AZI (P<0,05) (Figura 17).

A pesar de que la variante mucosa produjo menor cantidad de biofilm, la

biomasa formada, al menos se duplicó en presencia de sub-MIC de COL y TOB,

de forma que resultó significativamente mayor respecto de la formada en su

ausencia (P<0,05).

161

Figura 17. Relación entre la biomasa formada por las variantes isogénicas MP13-M y

MP13-NM, desarrollados en presencia sub-CIM de antibiótico. Control: sin antibiótico,

nivel basal de formación in vitro de biofilm en ausencia de ATB. COL: colistín, TOB:

tobramicina, CIP: ciprofloxacina, AZI: azitromicina, IMI: imipenem.

En contraste, en presencia de una concentración sub-CIM de IMI no se estimuló

la formación de biofilm en ninguna de las variantes MP13. Particularmente, a la

concentración sub-CIM de IMI empleada en el ensayo se observó que la

biomasa formada por MP13-NM se redujo casi 3,6 veces respecto del control.

También se observó una disminución significativa de la biomasa de MP13-NM

formada en presencia de sub-CIM de CIP respecto del control (P<0,05).

Las biomasas formadas por MP13-M y MP13-NM en concentraciones sub-CIM de

AZI ensayada resultaron similares a las obtenidas para los respectivos controles

desarrollados en su ausencia.

162

Aislamientos con fenotipo mucoso: MP13-M, 161-13 e I. limosus LMG 20952T

En presencia de sub-CIM de COL se observó que todos los aislamientos

formaron una biomasa mayor respecto del control en su ausencia (P<0,05)

(Figura 18).

MP13-M e I. limosus LMG 20952T prácticamente duplicaron la biomasa formada

cuando TOB estaba presente (P<0,05). Este efecto no fue observado en el

aislamiento 161-13, que formó una biomasa similar al control. Los biofilms de 161-

13 e I. limosus 20952T, presentaron un comportamiento distinto en presencia de

TOB.

En el caso de AZI, su presencia sub-CIM implicó que estos tres aislamientos

formaran una biomasa menor respecto de su control (P<0,05).

Figura 18. Relación entre la biomasa formada por aislamientos de fenotipo mucoso (I.

limosus MP13-M, I. limosus 161-13 e I. limosus LMG20952T), desarrollados en presencia

sub-CIM de antibiótico. Control: sin antibiótico, nivel basal de formación in vitro de

biofilm en ausencia de ATB. COL: colistín, TOB: tobramicina, CIP: ciprofloxacina, AZI:

azitromicina, IMI: imipenem.

En el caso de CIP, a la sub-CIM ensayada se observó un aumento significativo

de la biomasa formada por MP13-M. Este efecto no se evidenció en 161-13 e I.

limosus LMG 20952T.

163

Respecto de IMI, a la sub-CIM empleada la biomasa de MP13-M fue similar al

control, mientra si se observó un incremento estadísticamente significativo

(P<0,05) en la formación de biofilm de 161-13 e I. limosus LMG 20952T.

Aislamientos con fenotipo no mucoso: MP13-NM e Inquilinus sp. LMG 20953

En la Figura 19 se puede observar que las biomasas formadas por los

aislamientos con fenotipo no mucoso en sub-CIM de COL y TOB fueron similares

a sus respectivos controles sin antimicrobiano.

Figura 19. Relación entre la biomasa formada por aislamientos de fenotipo no-mucoso

(I. limosus MP13-NM e Inquilinus sp. LMG20953), desarrollados en presencia sub-CIM de

antibiótico. Control: sin antibiótico, nivel basal de formación in vitro de biofilm en

ausencia de ATB. COL: colistín, TOB: tobramicina, CIP: ciprofloxacina, AZI: azitromicina,

IMI: imipenem.

Se observaron disminuciones significativas en presencia de sub-CIM de CIP e IMI

de ambos aislamientos (P<0,05). Particularmente también se observó la

disminución de formación de biofilm por Inquilinus sp. LMG 20953 en sub-CIM de

AZI (P<0,05).

Los aislamientos no mucosos (MP13-NM e Inquilinus sp. LMG 20953) fueron

mejores formadores de biofilm (entre 2 y 3 veces más que los mucosos (MP13-M,

161-13, I. limosus LMG 20952T)). También produjeron más biofilm en presencia de

concentraciones subinhibitorias de COL y TOB.

164

Un comportamiento similar al observado en presencia de TOB fue observado en

patógenos comúnmente relacionados con la FQ, como P. aeruginosa, en los

que la presencia de concentraciones subinhibitorias de TOB provocaba un

efecto agonista y además inductor de la formación de biofilm. Esta respuesta al

exponerse a otros antibióticos como la POL [214, 232, 233].

Desde un punto de vista clínico es habitual tener concentraciones

subinhibitorias al inicio y fin de un régimen de dosis, entre dosis, o en forma

contínua durante el curso de una terapia de dosis bajas [234, 235]. Más aún, la

presencia de biofilm reduce el acceso al antibiótico, lo que aumenta la

posibilidad de exposición a dosis subinhibitorias y resulta importante si esto sirve

de estímulo para la formación de biofilms [236].

Dados los altos valores de CIM de COL y TOB, es razonable esperar que se

produzca una situación de subdosificación que sirva de estímulo en los

aislamientos mucosos.

Por el contrario CIP, AZI e IMI a las concentraciones ensayadas, solo permitieron

la formación de biofilm a los niveles basales (o inferiores) según el aislamiento en

cuestión, independientemente del fenotipo.

165

3.2 Sensibilidad del biofilm formado in vitro

La Tabla 10 resume los valores de los parámetros CIM-b, y CMR. Además permite

la comparación con la CIM del cultivo planctónico para las variantes mucosa y

no mucosa de MP13.

La tendencia muestra que, general la variante mucosa mostró menores CIM-b

excepto para CIP. En estos casos, la CMR fue muy elevada para ambas

variantes.

Tabla 10. Determinación de los parámetros para evaluar la sensibilidad del biofilm y la

población planctónica.

ATB: antibiótico, CIM: Concentración Inhibitoria Mínima, CIM-b: Concentración Inhibitoria Mínima del

biofilm, CMR: Concentración Mínima de Recrecimiento, AZI: azitromicina, IMI: imipenem, CIP:

ciprofloxacina, TOB: tobramicina, COL: colistín.

Si bien no fue posible erradicar los biofilms formados por ambas variantes aún

con 2048 µg/ml de ninguno de los antimicrobianos ensayados (CMEB >2048

µg/ml), CIP parece afectar tanto el desarrollo de la población planctónica,

como la viabilidad del biofilm en ambas variantes por igual, debido a los bajos

valores registrados para la CIM-b y CMR (1 µg/ml).

CIP es uno de los agentes antimicrobianos más activos in vitro frente al biofilm

de patógenos acompañantes de Inquilinus en PFQ como P. aeruginosa y S.

aureus, al parecer por cualidades particulares que presentan las quinolonas

para penetrar el biofilm [237].

ATB Determinaciones (µg/ml)

CIM

CIM-b CMR CIM CIM-b CMR

MP13-M MP13-NM

AZI 2 <1 64 2 1 64

IMI 0,25 4 128 0,25 16 256

CIP 1 1 1 1 1 1

TOB >1024 128 512 >1024 512 >2048

COL >1024 1 >2048 >1024 >2048 >2048

166

Estudios previos realizados por Lopes et al sobre la formación de biofilm de I.

limosus también mostraron altos valores de CMEB, especialmente cuando

Inquilinus formó biofilms mixtos in vitro junto con P. aeruginosa, una situación

próxima a la realidad del PFQ [132].

La alta viabilidad remanente que presentó el biofilm de Inquilinus, la

imposibilidad de erradicarlo en condiciones in vitro a pesar de ser un biofilm

simple, formados por biomasas relativamente bajas (respecto de otras especies)

y la posibilidad de que algunos antibióticos en concentraciones sub-CIM

puedan tener un efecto agonista sobre la formación del mismo, advierte sobre

la implicancia clínica que puede tener una colonización/infección por I. limosus

y podría justificar el fenómeno de persistencia que se observa en PFQ.

CIP, AZI e IMI fueron considerados como candidatos para realizar estudios de

sinergia ya que en las condiciones ensayadas no contribuyeron a la formación

de biofilm.

167

4 CURVAS DE LETALIDAD Y SINERGIA ANTIMICROBIANA

El tratamiento óptimo para erradicar a Inquilinus de las vías respiratorias de estos

PFQ aún es desconocido [40-42, 45]. En el presente estudio se analizó la

velocidad de muerte de I. limosus MP06 realizando las curvas de letalidad frente

al valor de la CIM de CIP, AZI e IMI (1, 2 y 0,25 µg/ml, respectivamente) y de sus

combinaciones en duplas; CIP+AZI, AZI+IMI y IMI+CIP.

Los antimicrobianos fueron seleccionados según los resultados obtenidos en

etapas anteriores y también a las características farmacocinéticas que

presentan en tejido pulmonar en los PFQ (relación tiempo-concentración) [238-

242].

En la Figura 20 se encuentran las curvas de letalidad del ensayo antimicrobiano

realizado (como UFC en función del tiempo).

AZI no mostró actividad bactericida per se ni sinergismo en las combinaciones

ensayadas (Figura 20, A y B). Si bien no llega a límites de antagonismo claro,

resultó inquietante que la presencia de AZI (2 µg/ml) redujera parcialmente la

respuesta a IMI (0,25 µg/ml), de forma que en la combinación AZI+IMI fue menos

bactericida entre 12 y 24 h (Figura 20, B). La combinación

(macrólido+carbapenem) es ampliamente utilizada en los PFQ, especialmente

ante el hallazgo de Inquilinus.

Los carbapenemes son los ß-lactámicos más empleados para el tratamiento de

pacientes con Inquilinus por su multi resistencia [40-42, 45], y por poder alcanzar

concentraciones altas y estables durante la administración intravenosa

prolongada [238, 239].

Usualmente estos pacientes son co-administrados con varios antimicrobianos

simultáneamente, con el objetivo de ampliar el espectro de acción y evitar la

aparición de resistencia. En algunos casos, los antimicrobianos se combinan

además con la finalidad de lograr un efecto sinérgico (potenciador)

antimicrobiano, sin embargo este efecto no puede ser predicho a priori, sino

168

que debe ser evaluado en ensayos in vitro e in vivo, y para cada especie

microbiana en particular [243].

AZI es un antibiótico ampliamente utilizado en PFQ, panbroquiolitis difusa,

enfermedad pulmonar obstructiva crónica y asma, no solo como

antimicrobiano sino además por sus cualidades farmacológicas como anti-

inflamatorio. De forma que parece tener un efecto modulador y reforzador de

la respuesta innata. Además contribuye a mejorar la viscoelasticidad del esputo

al corregir la disfunción cloruro de flujo de salida [244].

Aunque P. aeruginosa, el principal patógeno que presentan los PFQ, es

resistente a este macrólido a concentraciones alcanzables, AZI parece demorar

la formación del biofilm, a la vez que aumenta la actividad in vitro de los

agentes antimicrobianos denominados “anti-pseudomonas” (como CAZ, CIP,

IMI, MER, y TOB) cuando interactúan en el biofilm [237, 245].

Asimismo, numerosos estudios han mostrado que la administración constante de

AZI en los PFQ parece disminuir la frecuencia con la estos pacientes registran

exacerbaciones respiratorias agudas, entre otros beneficios. De forma que la

utilización de AZI se expandió al punto que, en el 2013 en el 71% de los PFQ

estadounidenses se había encontrado P. aeruginosa, y el 75% de ellos se les

prescribía AZI oral en forma crónica [246].

Estudios recientes (publicados en 2014) mostraron que AZI antagoniza el efecto

bactericida de TOB sobre P. aeruginosa, advirtiendo sobre la co-administración

de AZI frente a uno de los dos aerosoles más utilizados en estos pacientes [246].

Por lo tanto, resulta necesario re-evaluar las combinaciones de fármacos (no

solo antimicrobianos), que se utilizan sobre los PFQ en particular, y frente a los

nuevos patógenos emergentes como Inquilinus.

169

Figura 20. Curvas de letalidad para I. limosus MP06 en función del tiempo en presencia de distintos antimicrobianos y

sus combinaciones. A: CIP, AZI, CIP+AZI. B: AZI, IMI, AZI+IMI. C: IMI, CIP, IMI+CIP.

CIP: ciprofloxacina, AZI: azitromicina, IMI: imipenem, Control de Crecimiento: sin antimicrobiano

170

En nuestro caso, la combinación IMI+CIP (0,25 y 1 µg/ml), demostró sinergia

antimicrobiana, a sólo 6 h de iniciado el ensayo (Figura 20, C). El análisis

individual de IMI y CIP indica que ambos se comportaron como bactericidas

dentro de las 24 h, pero sólo IMI se mostró bactericida en las primeras 12 h del

ensayo. Sin embargo, en ambos casos se observó el recrecimiento a las 48 h.

La combinación IMI+CIP resultó ser la única de las ensayadas para la cual no se

detectó recrecimiento a las 48h.

Bustamente y col. [247] también reportaron la asociación IMI+CIP como

sinérgica frente a P. aeruginosa sensible a IMI.

La asociación IMI+CIP podría ser potencialmente útil para el tratamiento de la

infección por I. limosus, en concentraciones alcanzables en el sitio de la

infección en los PFQ, debido al efecto sinérgico que se observa sobre la

población planctónica de Inquilinus. Además CIP podría afectar la viabilidad

del biofilm de Inquilinus según los resultados mostrados anteriormente.

171

RESULTADOS y DISCUSIÓN

PARTE II - Microbiología Molecular Básica

5 GENERALIDADES:

ANÁLISIS BIOINFORMÁTICO DEL GENOMA DE I. limosus MP06

Se analizaron las características generales que presentó el genoma de I. limosus

MP06.

5.1 Métrica de ensamblado y contenido de G+C

La mejor métrica de ensamble de novo se obtuvo con el ensamblador 454-

Newbler versión 2.6, con la opción -urt. Los ensamblajes de las lecturas

obtenidos con los programas MIRA3 y CAP3, no resultaron adecuados pues solo

generaron un alto número de contigs (secuencias solapadas de ADN) de

pequeño tamaño (< 200 pb).

El montaje final del genoma fue conformado por 1186 contigs. De estos, 476

presentaron un tamaño mayor a 5000 pb, siendo el más largo de 119.858 pb.

Respecto de la calidad de la secuenciación, los contigs presentaron una alta

calidad, es decir, formados por más de 200 pb y sin bases nucleotídicas

detectadas como “N”.

A pesar del alto número de lecturas secuenciadas, la excelente calidad de las

mismas y la buena profundidad de secuenciación realizada, no fue posible

ensamblar en forma completa el cromosoma de I. limosus MP06 en 1 único

fragmento. La secuenciación obtenida representó el 99,8% del genoma total de

este microorganismo, el cual se estimó en 6,94 Mpb (6.934.542 pb), con una

cobertura de 21 veces según la secuenciación realizada.

172

El genoma de I. limosus MP06 se encuentra depositado en la base de datos

DDBJ/EMBL/GenBank con el número de acceso JANX00000000. En este trabajo

de tesis se analiza la versión JANX01000000. Los accesos a cada contig se

encuentran numerados secuencialmente (JANX01000001 a JANX01001186).

El genoma presentó un contenido medio de G+C de 69,60%. La distribución del

contenido de G+C presentadas por el total de lecturas obtenidas en el proceso

de secuenciación se muestra en la Figura 21. El rango estadístico del contenido

de G+C se estimó en 80%, con secuencias con un contenido mínimo de 18% y

uno máximo de 97%.

Figura 21. Histograma de frecuencias de distribución acumuladas del contenido

porcentual de G+C de las lecturas obtenidas en el proceso de secuenciación del ADN

total de I. limosus MP06. El contenido medio (M) se encuentra indicado en rojo,

delimitado por los desvíos estandares (DS).

Además, se analizó la distribución del contenido de G+C en las secuencias de

los contigs de mayor tamaño. Se destacan las amplias regiones de ADN (20 a 25

Kpb) con un sesgo constante de G+C en el contig 1 depositado con el número

de acceso JANX01000001 (Figura 22). La anotación realizada en estas regiones

del contig 1 codifican para posibles proteínas (hypothetical proteins) o bien

conforman regiones intergénicas (Figura 23, A). Los marcos de lectura abierta

(ORF, Open Reading Frame) y consecuentemente las secuencias codificantes

(CDS, Coding DNA Sequences) correspondientes a estos sectores se detectan

en forma casi exclusiva en la misma cadena de ADN (Figura 23, B). Esta

particularidad se observa en algunas zonas del genoma de I. limosus MP06.

173

Figura 22. Mapa físico de la distribución del sesgo del contenido medio de G+C de la secuencia particular de cada contig. Las

inclinaciones del sesgo, determinado como: GCSesgo= (G-C)/(G+C), se indican en verde cuando resultaron positivas y en violeta

las negativas. 1, 2, 3 y 4, corresponden al número de los 4 contigs de mayor tamaño (Números de acceso JANX01000001 a

JANX01000004). Las secuencias presentan una topología lineal (abierta), que se representa circularizada solo para facilitar la

visualización global. En el contig 1 se observan amplias regiones en las que se mantiene constante el sesgo de G+C.

1 2 3 4

Longitud (pb)

Nro. de CDS detectadas

Contenido medio

de G+C (%)

119 858 67 049 49 219 37 746

127 44 43 32

67,19 63,56 69,82 68,72

174

Figura 23. Mapa físico y génico del contig 1 según la anotación realizada. Las secuencias presentan una topología lineal (abierta), que se

representa circularizada solo para facilitar la visualización global. A. Se encuentran enfocados los cambios del sesgo (verde: positivo,

violeta: negativo) y se describen los genes anotados en los sectores indicados. B. Se observa cada marco de lectura abierta (ORF)

detectado (1, 2, 3, -1, -2, -3) representado por un anillo separado. También se señalan las regiones codificantes anotadas (CDS) y se indica

la cadena donde se encuentra codificada: cadena positiva (más externa) o cadena negativa (anillo interno). Se observa que en algunas

regiones los ORF que resultan ser codificantes se detectan en forma casi exclusiva en una sola de las cadenas. Estos “sectores” coinciden

con las regiones en las que se mantiene constante el sesgo del contenido de G+C.

CDS

ORF

A B

175

En la secuencia genómica no se detectaron secuencias de orígenes de

replicación alternativos al cromosómico, que sugirieran la presencia de

plásmidos. En forma concordante, tampoco se detectó la presencia de ADN

plasmídico mediante la técnica de extracción de ADN de alto peso molecular

de Hansen y Olsen, ni mediante PFGE-S1 nucleasa para la detección de este

tipo de ADN.

Respecto al elevado número de contigs obtenidos, la bibliografía referida a la

pirosecuenciación empleando la plataforma 454®Roche [248, 249], señala que

al menos un 10% de las secuencias obtenidas son réplicas artificiales, y

representan un artefacto intrínseco de la técnica. Este inconveniente ocurre

durante la amplificación por PCR de emulsión, previa a la secuenciación

propiamente dicha, en la que algunas zonas del genoma son amplificadas un

mayor número de veces respecto de otras, sin embargo no se encuentran

realmente repetidas en el genoma.

Los ensambladores pueden, en parte, eliminar estas réplicas artificiales pero no

pueden diferenciarlas de las réplicas no artificiales, como las secuencias

repetitivas (con un formato similar a las réplicas) pero que pueden estar

distribuidas, naturalmente, en un genoma [250]. Si un genoma presenta un alto

contenido de cortas secuencias repetidas, estas secuencias también podrían

ser descartadas por los algoritmos de estos programas. Frecuentemente, ocurre

esto cuando los genomas presentan gran cantidad de elementos móviles [251,

252].

Asimismo, cuando un genoma posee un contenido de G+C muy alto (> 65%) o

muy bajo (< 45%), es posible que, a lo largo de la secuencia del genoma, se

generen secuencias homopolímeras, ricas en G o C, o A o T, respectivamente

(ej. GGGGGG o CCCCC). Estas secuencias son eliminadas, en determinado

porcentaje, por los programas ensambladores, como si se tratasen de replicas

artificiales, pues no pueden distinguirse de las naturales. Todo esto, en conjunto,

176

genera lecturas que no se pueden alinear en fragmentos grandes, y llevan

consecuentemente a un alto número de contigs [248].

La calidad del ensamblado podría mejorarse a futuro mediante un nuevo re-

ensamblado de las lecturas al utilizar un genoma de referencia, que permita

ordenar la distribución de las lecturas e incluso completar los gaps (regiones de

secuencias faltantes, no secuenciadas o eliminadas en el proceso de

ensamblado), si existiera suficiente identidad entre las secuencias como para

poder hacerlo.

5.2 Análisis del sesgo en el uso de codones sinónimos

Se analizó el sesgo de codones que utilizaría preferencialmente este

microorganismo. Los resultados del análisis in silico se resumen en la Tabla 11.

En general, no se observa un uso preferencial de codones raros (codones

sinónimos que E. coli y otros microorganismos no utilizan). El codón raro CCC

(prolina) presentó una frecuencia de aparición relativa mayor que el resto, con

un uso relativo de codones sinónimos (RSCU, Relative Synonymous Codon

Usage, uso relativo de codones sinónimos) de 0,95, ligeramente menor a la

esperada (RSCU: 1).

Respecto del uso de codones para el inicio de la traducción, se observó que el

codón alternativo de inicio GUG (codificante para valina) podría tener un uso

preferencial en este microorganismo pues presentó una frecuencia de

aparición relativa mayor a la esperada (RSCU: 1,88). El sesgo preferencial del

codón GUG para codificar al aminoácido valina, concuerda con el alto

contenido de C+G que presenta el genoma. Sin embargo, el valor obtenido de

RSCU no hace referencia a la posición del codón en el transcripto, pudiendo no

solo estar localizado en el sitio de inicio de traducción, sino también en forma

interna en la secuencia.

177

Tabla 11. Análisis in silico del sesgo en el uso de codones sinónimos en la secuencia

codificante de I. limosus. Los codones utilizados con mayor frecuencia a la esperada

presentan un RSU mayor a 1,00.

AA: aminoácido.

N: número de veces en el que se observó la aparición de un codón en particular en la secuencia

genómica codificante.

RSCU (uso relativo de codones sinónimos): corresponde al uso relativo de codones sinónimos y su valor

representa el número de veces que un codón en particular es observado, relativo al número de veces que

el codón sería observado en ausencia de otro sesgo. En ausencia de otro sesgo el valor de RSCU es 1,00.

Cuando un codón es usado menos frecuentemente que lo esperado, el valor de RSCU es menor a 1,00. En

tanto, que si un codón es usado más frecuentemente que lo esperado, el valor de RSCU es mayor a 1,00.

En color naranja se encuentran remarcados los codones usualmente denominados raros o atípicos.

Los codones alternativos de inicio de la traducción (no AUG) se encuentran remarcados en turquesa.

nc: no corresponde informar el RSCU, pues los codones de terminación (TER) no codifican para ningún

aminoácido

Sesgo Acumulativo de Codones

AA Codón N RSCU AA Codón N RSCU

Phe UUU 2060 0,07 Ile AUU 2450 0,09

UUC 60293 1,93 AUC 82079 2,89

Tyr UAU 15675 0,80 AUA 689 0,02

UAC 23459 1,20 Met AUG 37983 1,00

Leu CUU 3531 0,12 Asn AAU 7164 0,37

CUC 34178 1,13 AAC 31506 1,63

CUA 841 0,03 Lys AAA 3115 0,14

CUG 136908 4,54 AAG 41924 1,86

UUA 212 0,01 Val GUU 3061 0,09

UUG 5220 0,17 GUC 66766 1,99

His CAU 15263 0,88 GUA 1198 0,04

CAC 19531 1,12 GUG 63225 1,88

Gln CAA 2912 0,11 Asp GAU 20284 0,39

CAG 51443 1,89 GAC 82918 1,61

Ser UCU 1079 0,08 Glu GAA 12108 0,27

UCC 19996 1,44 GAG 78255 1,73

UCA 1183 0,09 Thr ACU 1562 0,07

UCG 31317 2,26 ACC 61219 2,71

AGU 932 0,07 ACA 1714 0,08

AGC 28776 2,07 ACG 26191 1,16

Cys UGU 653 0,09 Ala GCU 5220 0,09

UGC 13180 1,91 GCC 129071 2,28

Trp UGG 25705 1,00 GCA 5383 0,10

Pro CCU 2460 0,10 GCG 86417 1,53

CCC 23322 0,95 Gly GGU 6325 0,16

CCA 2203 0,09 GGC 123720 3,06

CCG 69864 2,86 GGA 5352 0,13

Arg CGU 4601 0,21 GGG 26148 0,65

CGC 71287 3,25 TER UGA 4464 nc

CGA 3294 0,15 TER UAG 1288 nc

CGG 47456 2,16 TER UAA 538 nc

AGA 843 0,04

AGG 4127 0,19

178

5.3 Anotación funcional de secuencias codificantes

La anotación realizada mediante el servidor RAST predijo un total de 6587 genes

que codifican proteínas (PEG, protein-encoding genes), distribuidas en 6535

secuencias codificantes (CDS, Coding DNA Sequences) y 52 ARN estructurales.

El sistema determinó una posible pérdida de 124 genes en el proceso.

El servidor le asignó una función biológica conocida al 67% (4376) del total de

las CDS predichas (6535). Las 2159 CDS restantes (33%), el sistema los clasificó

como posibles proteínas (comúnmente denominadas proteínas hipotéticas). El

36% de las CDS fue anotado en algunos de los subsistemas del servidor RAST. De

esta forma se cubrieron 410 subsistemas. La métrica obtenida respecto al

número de los PEG predichos resultó acorde con el tamaño estimado del

genoma.

Existió un muy buen porcentaje (67%) de CDS con función biológica asignada

por similitud de secuencia y/u ortología génica. Generalmente se espera que el

50% de las CDS se correspondan con proteínas hipotéticas, sin importar el

genoma en cuestión, cuando se realiza un análisis de secuencia de ADN [253],

pero al analizar el genoma de I. limosus MP06 se encuentra una mayor

asignación de la función biológica que la esperada, lo que destaca a la

anotación realizada mediante el servidor RAST, que parece resultar adecuado

para un microorganismo poco descripto como I. limosus pero no tan alejado del

cluster de microorganismos analizados en la referencia.

Asimismo, la determinación del inicio del gen según el algoritmo del RAST puede

ser más adecuado para un microorganismo con alto contenido de G+C, al

considerar el uso de codones de inicio alternativos, respecto de otras

plataformas que solo utilizan como codón de inicio la detección del triplete

ATG, [254], por lo que es más probables que este algoritmo efectivamente

asigne la función biológica a un mayor número de CDS.

179

En la Figura 24 se muestran las distribuciones de las CDS con función biológica

asignada en los distintos subsistemas del servidor RAST.

Figura 24. Distribución de las CDS con función biológica asignada en los subsistemas del

RAST según su anotación funcional

De las 72 CDS que se ubicaron en el subsistema “Virulencia, Enfermedad y

Defensa”, 66 de estas pertenecieron a la categoría “Resistencia a antibióticos y

compuestos tóxicos”. Dentro de esta categoría, 31 CDS fueron reconocidos por

el RAST, como secuencias potencialmente relacionadas con la resistencia y

transporte a nivel de membrana de compuestos tóxicos ambientales. Se

encontraron dos operones de resistencia a arsénico en distintas regiones del

genoma y numerosos determinantes de resistencia a cobre, cobalto, zinc y

cadmio, entre otros. En la Figura 25 se muestra la distribución de estos CDS de I.

limosus MP06 en la mencionada categoría.

180

Figura 25. Distribución de las 66 CDS que conforman la categoría “Resistencia a

antibióticos y compuestos tóxicos” según la anotación funcional del servidor RAST para

el genoma de I. limosus MP06. Casi la mitad de las CDS (31), se encontró

potencialmente relacionada con la resistencia y transporte de compuestos tóxicos

ambientales.

Se decidió analizar la distribución de los CDS en los subsistemas del RAST en

forma comparativa para I. limosus MP06 respecto de otro miembro de la familia

Rhodospirallaceae. Se eligió la cepa Rhodospirillum centenum SW en particular

porque su genoma se encuentra secuenciado en su totalidad, su anotación se

encuentra realizada con el servidor RAST por lo que permite una comparación

bajo los mismos criterios bioinformáticos y además resultó ser el microorganismo

más cercano en relación filogenética con Inquilinus que reuniera estas

condiciones. Si bien, en general, la distribución de las CDS de los genomas de

estos microorganismos fue similar, presentaron marcadas diferencias en algunos

subsistemas, con una mayor abundancia de CDS en Inquilinus, como por

ejemplo a nivel de:

el transporte a través de membrana (291 vs. 81),

el metabolismo de compuestos aromáticos (92 vs. 14),

el metabolismo de aminoácidos y derivados (491 vs. 297),

el metabolismo del azufre (99 vs. 22) y

el metabolismo del fósforo (117 vs. 42)

181

5.4 Reconstrucción metabólica genómica

Se reconstruyeron 155 mapas metabólicos específicos (además de los globales)

a partir de la secuencia genómica codificante de I. limosus MP06, de 163

mapas posibles según la biblioteca de genes y genomas KEGG. Se analizaron

particularmente algunas reconstrucciones metabólicas, según se describen a

continuación.

En la reconstrucción de las vías metabólicas implicadas en la hidrólisis de urea a

amoníaco (NH3), nitrificación y desnitrificación, decarboxilación de L-lisina,

hidrólisis de arginina y desaminación de fenilalanina, solo se encontraron

algunos de los genes participantes. Esto resultó acorde con los resultados de las

respectivas pruebas bioquímicas convencionales realizadas sobre I. limosus

MP06, en las que tampoco se había evidenciado esa actividad enzimática,

sugiriendo que estas vías metabólicas están incompletas en este

microorganismo y el mapping logrado es bastante aproximado al real.

Respecto de la conversión de urea a NH3 y dióxido de carbono, en esta vía

participan al menos 2 enzimas, la urea carboxilasa (EC 6.3.4.6) y la alofanato

hidrolasa (o urea-1-carboxilato hidrolasa) (EC 3.5.1.54). Ambas parecen ser

necesarias para llevar a cabo la catálisis y en los últimos años fueron

ampliamente estudiadas en otros microorganismos por formar parte de la vía

del metabolismo del ácido cianúrico, relacionado con la degradación de

herbicidas [255, 256]. En I. limosus MP06 se encontró el gen codificante de la

alofanato hidrolasa que cataliza la conversión de urea-1-carboxilato en NH3 y

dióxido de carbono.

Por otro lado, se encontró el gen que codificaría para una ornitina

decarboxilasa (EC 4.1.1.17), que cataliza la decarboxilación de L-ornitina a

putrescina, sin embargo el resultado negativo de esta prueba bioquímica

sugiere que el gen podría no ser funcional o bien que en I. limosus esta reacción

podría requerir la participación de otras enzimas o co-factores enzimáticos no

presentes en el ensayo.

182

Respecto de la metabolización el triptofano no se detectó la CDS necesaria

para la desaminación e hidrólisis de este aminoácido a indol, ác. pirúvico y NH3,

acorde con el resultado de la prueba bioquímica respectiva (indol negativo).

Sin embargo, se encontraron las CDS de otras vías de metabolización del

triptofano que conducen a la formación de auxinas, como el ác. 3-indol-

acético (IAA). Las auxinas son compuestos promotores del crecimiento de

plantas, que son sintetizados por plantas (fitohormona) y bacterias (promotoras

del crecimiento) [257].

En relación a las vías metabólicas implicadas en la síntesis de metabolitos

secundarios como las fitohormonas, se encontró gran robustez para la biosíntesis

de citocininas (como zeatina), estrigolactona, brasinoesteroides, ác. salicílico e

isoprenoides (mediante una vía que no involucra el mevalonato), además de

las ya mencionadas auxinas. En la Figura 26 se puede observar la

reconstrucción metabólica de estas biosíntesis.

La acción ejercida por las fitohormonas es considerada como uno de los

mecanismos más importantes para la promoción del crecimiento vegetal. Estos

compuestos orgánicos regulan el crecimiento y desarrollo en plantas, y en bajas

concentraciones influencian sus procesos bioquímicos, fisiológicos y

morfológicos. El IAA es la fitohormona más común y la auxina fisiológicamente

más activa en las plantas. Al igual que las citocininas, el IAA promueve el

crecimiento vegetal, principalmente a nivel radicular, así como la

diferenciación del tejido vegetal, y junto a otros compuestos, como el ác.

salicílico, promueve la defensa vegetal contra fitopatógenos [257-260].

No se detectaron las CDS implicadas en la vía de síntesis de giberelinas (otro

importante grupo de fitohormonas). La vía relacionada con la biosíntesis de

etileno se encontró solo parcialmente presente.

183

Figura 26. Reconstrucción metabólica de la biosíntesis de fitohormonas. Mapeo de las CDS de I. limosus MP06 en la biblioteca de genes y

genomas KEGG. Se encuentran remarcadas en color azul intenso las vías metabólicas reconstruidas para la biosíntesis de: A: auxinas (IAA: ác. 3

indol-acético), B: citocininas (zeatina) y estrigolactona, C: brasinoesteroides, D: ác. salicílico, E: isoprenoides (por una vía que no involucra el

mevalonato, indicada como MEP/DOXP), F: etileno.

Biosíntesis de hormonas vegetales

A

B D

C

E

F

184

185

En congruencia con las pruebas bioquímicas realizadas a MP06, no se halló la

presencia de los genes necesarios para producir sulfhídrico (H2S) a partir de

tiosulfato.

Sin embargo, la comparación de los mapas metabólicos de MP06 con los de

algunos microorganismos ambientales metabolizadores de azufre, como

(Desulfatibacillum alkenivorans, Desulfococcus oleovorans, Desulfovibrio

magneticus y Desulfuromonas acetoxidans), reveló que I. limosus MP06

presentaría un porcentaje de genes igual o mayor en las vías que enmarcan

metabolización del azufre (como la reducción de sulfato), respecto de los

hallados para esos microorganismos. En la reconstrucción implicada en el

metabolismo de cisteína, cistina y metionina, que constituyen la principal fuente

de los sulfatos mineralizados, se detectó la presencia del 40 % de los genes

globalmente descriptos para esta metabolización. Esto sugiere una importante

versatilidad metabólica de I. limosus para utilizar distintas fuentes de azufre.

En la Figura 27 se observa el mapa correspondiente al metabolismo del azufre

de I. limosus MP06, en el que las casillas verdes indican las CDS halladas en la

secuencia genómica.

Respecto al metabolismo del nitrógeno, la reconstrucción realizada fue

contrastada con las vías que presentan las bacterias fijadoras de nitrógeno y las

que realizan las reacciones de nitrificación y desnitrificación. No se encontraron

en el genoma de Inquilinus suficientes genes para completar alguna ruta

metabólica en particular de las mencionadas. Obviamente, tampoco se

detectaron genes ortólogos que pudieran estar relacionados con el proceso de

nodulación en plantas. A diferencia de lo observado respecto de la

reconstrucción metabólica del azufre, se detectaron solo algunos genes

potencialmente participantes a la reducción y fijación del nitrógeno.

Se postula que el nicho ecológico de I. limosus podría ser ambiental por su

cercanía filogenética con microorganismos asociados a plantas como

Azospirillum [55]. Esta hipótesis se ve reforzada con la recuperación de ADNr de

186

I. limosus de la raíz de una de las únicas hierbas perennes que se desarrollan en

el desierto de Thar, en India [56]. También por el hallazgo de I. ginsengisoli (la

especie del género Inquilinus más recientemente descripta), recuperado del

suelo de campos de cultivo de ginseng [38].

Figura 27. Reconstrucción del metabolismo del azufre; su reducción y fijación. Las CDS

mapeadas de I. limosus MP06 se distinguen en color verde, según la reconstrucción

realizada por KEGG. Se encuentran recuadradas en verde las vías metabólicas

relacionadas que también presentaron reconstrucción metabólica.

La presencia en el genoma de Inquilinus de numerosos determinantes de

resistencia a metales y compuestos tóxicos ambientales, la robustez de la

reconstrucción metabólica del azufre y de la biosíntesis de fitohormonas,

fortalecerían la hipótesis de un nicho ecológico ambiental, quizás asociativo a

raíces de plantas. De ser así, si bien no participaría como bacteria fijadora de

nitrógeno, podría desempeñar algún papel en la transformación de los

compuestos orgánicos e inorgánicos azufrados involucrados en la nutrición de

las plantas y posiblemente en la promoción del desarrollo vegetal.

Metabolismo del azufre: Reducción y Fijación

187

6 RESISTOMA

La multirresistencia encontrada en estos microorganismos nos condujo a la

búsqueda de los determinantes génicos que pudieran asociarse a la misma. Por

ello se examinó particularmente la categoría “Resistencia a antibióticos y

compuestos tóxicos” del subsistema del RAST denominado “Virulencia,

Enfermedad y Defensa”; el examen preliminar mostró 11 CDS que podrían

codificar para ß-lactamasas u otras proteínas capaces de interaccionar con

compuestos ß-lactámicos, y 18 CDS que podrían constituir BE-RMD.

A continuación se detallan los resultados obtenidos del análisis in silico de estas

secuencias y de los ensayos realizados para la detección fenotípica de las

mismas.

6.1 Bombas de eflujo: abordaje bioinformático y fenotípico

6.1.1 Análisis in silico de BE

Se realizó el análisis in silico para la búsqueda de posibles BE en el genoma de I.

limosus MP06. Se determinó la presencia de 18 CDS, generalmente distribuídos

en forma tripartita (Figura 28), con sintenia similar a las observadas en la

organización génica funcional y caracterizada en otros microorganismos [2].

Se encontraron 2 arreglos génicos pertenecientes a la familia RND

(Resistance/Nodulation/Division), la principal familia expresada por las BGN [2].

Un operón CmeABC (cmeA, cmeB, ATPase AAA Family) y un arreglo AcrA-B,

NodT, potencialmente asociado a un sistema regulador de 2 componentes. La

disposición de las CDS se muestra en las Figuras 28, A y B, respectivamente.

188

Figura 28. Disposición de las CDS para BE-RMD presentes en I. limosus MP06. A: operón

CmeABC (cmeA, cmeB, ATPase AAA Family) de la familia RND, B: arreglo AcrA-B, NodT,

de la familia RND, potencialmente asociado a un sistema regulador de 2

componentes, C: sistema de eflujo MacA-B (macA, macB, nodT) de la superfamilia

ABC.

A

C

B

189

En otros microorganismos, las BE de la familia RND pueden expulsar diversos

antimicrobianos como cloranfenicol, ác. nalidíxico, fluoroquinolonas, ß-

lactámicos, macrólidos, tigeciclina, novobiocina, rifampicina y tetraciclina,

además de otros compuestos y moléculas implicadas en las señalización de la

formación de biofilms, entre otros procesos [85-88].

También se encontró el sistema de eflujo MacA-B (macA, macB, nodT) de la

superfamilia ABC (ATP binding cassette, o casete de unión a ATP) (Figura 28, C).

Los transportadores ABC están implicados en la expulsión activa de un gran

número de compuestos hidrofílicos, antibióticos y polímeros complejos.

Particularmente el arreglo encontrado podría estar relacionado con la expulsión

de macrólidos, como ocurre en otros BGN.

El análisis comparativo realizado para evaluar las similitudes de las secuencias

codificantes de estos arreglos con los presentes en E. coli y P. aeruginosa mostró

que CDS de la lipoproteína de membrana externa NodT presentó una identidad

proteica del 35% con E. coli y un 45% con P. aeruginosa. Por otro lado, los

arreglos AcrA-B y MacA-B presentaron hasta un 52 % de identidad proteica con

E. coli y un 45% con P. aeruginosa.

Además se encontró en el genoma una única CDS para una BE de la familia

MATE (Na+/antiporter de drogas). Otras 7 CDS para BE, principalmente de la

familia RND, fueron encontrados en distintos contigs, por lo que I. limosus MP06

aún podría contener más arreglos génicos para BE-RMD, lo que será resuelto

cuando logren cerrarse los gaps entre los contigs.

190

6.1.2 Detección fenotípica de BE

Con el hallazgo de múltiples arreglos génicos codificantes para BE-RMD, se

buscó evaluar su funcionalidad al emplear inhibidores y estimuladores de estos

sistemas de eflujo.

En la determinación de la CIM de I. limosus MP06 en presencia y ausencia de

inhibidores (IBE) e inductores de bombas de eflujo (EBE) se obtuvieron los

resultados que se comentan a continuación y se resumen en la Tabla 12.

El agregado de PAßN redujo la CIM de CIP y RIF, en al menos 8 y 32 veces,

respectivamente.

Ningún IBE modificó significativamente la CIM de los antibióticos ß-

lactámicos y aminoglucósidos ensayados.

Respecto de los EBE ensayados, ambos incrementaron en, al menos, 16

veces la CIM de AMI y AZI.

El SAL incrementó 4 veces la CIM de AMS, y en al menos 16 veces la CIM de

FOX.

Tal cual era esperable, no se observaron modificaciones significativas en la CIM

de ningún antimicrobiano con el agregado de RES, ya que este es un inhibidor

preferentemente de los BE que presentan las bacterias gram positivas. PAßN, en

cambio, más frecuentemente reportado como un IBE principalmente de la

familia RND en BGN [93, 261], mostró su efecto inhibitorio sobre las bombas

presentes en Inquilinus, evidenciado por los incrementos de las CIM de CIP y RIF.

Si bien los EBE (como SAL y DES) actúan preferentemente sobre la actividad de

las BE-RND, también pueden estimular o inducir la expresión de otras proteínas

en forma no específica [95-97], en algunas de las pocas drogas en las que I.

limosus MP06 exhibió niveles de sensibilidad, las CIM se incrementaron al

enfrentarse a SAL y DES.

Estos resultados sugieren la funcionalidad de, al menos, algún arreglo génico

codificante para BE-RMD.

191

Tabla 12. Determinación de CIM de I. limosus MP06 en presencia y ausencia de

inhibidores e inductores de bombas de eflujo

Antimicrobiano CIM (µg/ml)

control + RES + PAßN + SAL + DES

AMP >1024 1024 >1024 >1024 >1024

APC 512/256 128/64 256/128 512/256 128/64

AMS 256/128 128/64 256/128 1024/512 128/64

FOX 128 256 256 >1024 128

CTX 256 64 128 512 128

GEN 128 64 64 128 128

AMI 2 32 4 32 >32

NAL 64 128 128 64 256

CIP 1 2 <0,25 1 1

AZI 2 4 2 >32 32

RIF 16 32 <0,5 32 32

TET 64 128 16 128 128

CLO >1024 >1024 >1024 >1024 >1024

control: cada uno de los antimicrobianos sin aditivos,

+: agregado de reserpina (RES), fenil-arginil-alanil-ß-naftilamida (PAßN), salicilato de sodio (SAL),

desoxicolato de sodio (DES)

AMP: ampicilina, APC: ampicilina-ác.clavulánico, AMS: ampicilina-sulbactama, FOX: cefoxitina,

CTX: cefotaxima, GEN: gentamicina, AMI: amicacina, NAL: ác. nalidíxico, CIP: ciprofloxacina,

AZI: azitromicina, RIF: rifampicina, TET: tetraciclina, CLO: cloranfenicol

Los compuestos PAßN, SAL y DES se comportaron como posibles herramientas

para la detección (parcial) de BE en I. limosus.

192

6.2 ß-lactamasas: abordaje bioinformático, fenotípico y bioquimico

6.2.1 Clonado molecular “al azar” - Detección y caracterización enzimática

En las etapas iniciales del estudio (antes de disponer del secuenciamiento) se

realizó un clonado molecular “al azar” sobre el ADN genómico de I. limosus

MP06, con el objetivo de buscar ß-lactamasas en su genoma. Se clonaron

múltiples fragmentos de gran tamaño (mayores a 5000 pb). De los clones

inicialmente obtenidos, uno en particular, con un inserto de aproximadamente

10 kb obtenido con la endonucleasa KpnI pudo ser seleccionado en presencia

de AMP. La construcción fue denominada pK-INQ1a.

Como se muestra en la Figura 29, el transformante seleccionado demostró

sinergia en presencia de BOR, detectándose la deformación del halo de

inhibición hacia el disco de BOR cuando se enfrentaba con discos con CEF y

AMP en el ensayo de difusión en medio sólido. Esta sinergia se interpretó como

la posible presencia de una enzima de tipo AmpC, debido a que la actividad

enzimática de este tipo de ß-lactamasas puede resultar inactivada en

presencia de BOR [157].

Figura 29. Detección y caracterización fenotípica de ß-lactamasas en transformante

obtenido por clonado “al azar” a partir del ADN total de I. limosus MP06. Ensayo de

sinergia entre BOR y antibióticos ß-lactámicos (AMP y CEF), por método de difusión en

medio sólido. La deformación del halo de inhibición hacia el BOR (sinergia) puede

sugerir la presencia de ß-lactamasas de tipo AmpC, cuya actividad enzimática resulta

inactivada por el BOR.

193

Por otro lado, el transformante presentó igual tamaño de halos de inhibición

frente a otros antibióticos ß-lactámicos (como FOX, CAZ, CTX, IMI, MER) respecto

del control sin inserto.

El extracto proteico del transformante mostró hidrólisis de la cefalosporina

cromogénica NitrocefinTM (NitTM). Posteriormente se confirmó la actividad ß-

lactamasa del extracto por método iodométrico frente a AMP y CEF como

sustratos, sin evidenciarse la hidrólisis de CRO y CAZ.

La secuencia completa del inserto mostró un alto contenido de G+C

(aproximadamente 70%), a lo largo de todo el fragmento acorde al porcentaje

que presentó la secuencia cromosómica.

El análisis in silico realizado predijo un ORF de 1083 pb, el cual se denominó

blaINQ-1 que presentó similitud con genes de posibles ß-lactamasas de tipo

AmpC de varias especies pertenecientes a la clase Alphaproteobacteria. La

secuencia traducida mostró un 50% de identidad con la posible ß-lactamasa de

clase C de Microvirga sp., (Nro. de acceso WP_009493224).

El ORF predicho codificaría una proteína de 361 aminoácidos con un codón de

inicio inusual (GTG), y un posible péptido señal que dejaría una proteína madura

de 348 aminoácidos. La secuencia traducida, con un pI estimado en 6,2 y un

PM estimado en 37,6 kDa, mostró motivos de elementos conservados en ß-

lactamasas como el elemento SxxK, un posible loop YSD y el elemento HTG,

compatible con la descripción de ß-lactamasas de clase C (Figura 30).

Figura 30. Secuencia traducida de blaINQ-1. Se señala el primer aminoácido de la

secuencia madura de INQ-1, el sitio activo de serina (SLTK), el elemento HTG, y un

posible loop YSD, compatible con las ß-lactamasas de clase C

MRPPSPYPPPARGGGHHQVFGRRPMTLAAAADAAFALVDEAIDAGRIPGAVLGLVTRDGDRAI

RFGGQAALVPQLVPLAEDTLFDLASLTKVILTATEVLRLVEQGRVDLSDPLALHLPDLRQYQ

PEHWVRQVTIRQLLSHRSGLPAVEPLYTWGSDAETLKALVLQKDWTAGADGYSDVNYVLLGI

LVERLRDKPLRDLLPPGDFAVSPGPARAAATERCTWRGRVMRGEVHDENAFALGGLAGHAGLF

GSAAAVLDFAQRFLAEEVLRPATVAEMLRAEGHPHGLGWQVRHEGWSGGSLCSPDTIGHTGF

TGTAMWIDLERGHAWTLLTNRVHPSRHVETGIQALRRGVSNTVSAGWPF

194

Los elementos conservados que se observaron en la secuencia de INQ-1

presentaron dificultad para alinearse con las secuencias de ß-lactamasas de

actividad enzimática conocida, pues no presentaron las mismas distancias

entre elementos. La comparación de la secuencia traducida de la posible ß-

lactamasa INQ-1 con las secuencias de algunas de las serino-ß-lactamasas más

representativas de cada clase molecular (cuya organización cristalina y

actividad biológica es conocida) resultó en el dendrograma que se muestra en

la Figura 31. Puede observarse que en el análisis realizado, INQ-1 no se ubicó en

ninguna clase molecular en particular, sino “emergiendo” como una profunda

rama del agrupamiento de ß-lactamasas de clase C.

Figura 31. Dendrograma para INQ-1 frente a la secuencia de distintas clases

moleculares de serino-ß-lactamasas. La barra de la escala indica 2 sustituciones de

residuos de aminoácido cada 10 residuos en la secuencia.

No se detectaron genes reguladores corriente arriba de blaINQ-1, lo que

correlaciona con la ausencia de inducción en el ensayo realizado para la

detección de ß-lactamasas inducibles de tipo AmpC (D-test) en presencia de 6-

APA, AMP, CEF, FOX, IMI y CLA como inductores.

195

La anotación funcional realizada sobre los genes del entorno de blaINQ-1 indica

que pueden participar en el metabolismo de los productos de reciclaje y/o

síntesis de peptidoglicano. El arreglo génico se muestra a continuación en la

Figura 32. La secuencia completa del inserto y su anotación funcional se

encuentra depositada en la base de datos DDBJ/EMBL/GenBank con el número

de acceso HG326253.

Figura 32. Entorno génico de blaINQ-1 en I. limosus MP06. Anotación funcional y

contenido porcentual de G+C en el inserto de pK-INQ-1a. El entorno génico de blaINQ-1

presenta un porcentaje de G+C similar al cromosómico, y parece implicado en el

metabolismo del reciclaje y/o síntesis de peptidoglicano. Se encuentran indicadas las

posiciones de restricción (XhoI y EcoRI), utilizadas para el subclonado de blaINQ-1.

196

6.2.1.1 Clonado de blaINQ-1. Detección de actividad enzimática y purificación

de INQ-1

La construcción pK-INQ-1b representó el subclonado del fragmento XhoI-EcoRI

de 1400 pb, controlado por secuenciación, que contiene blaINQ-1 (Figura 31).

Las células E. coli Top 10 F’ transformadas con esta construcción mostraron tener

el mismo perfil de actividad ß-lactamasa que se había detectado en aquellas

que portaban la construcción pK-INQ-1a. Se evidenció la sinergia en presencia

de BOR, frente a discos con CEF y AMP en el ensayo de difusión por medio

sólido. También fueron comparables los halos de inhibición frente a FOX, CAZ,

CTX, IMI y MER. El extracto proteico total hidrolizó NitTM.

Su actividad ß-lactamasa también se puso en evidencia por método

iodométrico en presencia de AMP y CEF, pero no cuando los sustratos fueron

CRO y CAZ.

En el extracto proteico total, el pI aparente de INQ-1 se determinó en 6

mediante IEFA, y el PM aparente como 37 kDa mediante SDS-PAGE seguido de

renaturalización, ambos revelados por método iodométrico con CEF como

sustrato. Estos parámetros experimentales estuvieron en concordancia con los

valores teóricos determinados in silico.

Los valores de CIM de distintos antibióticos ß-lactámicos del transformante con

la construcción pK-INQ-1b se muestran en la Tabla 13. Se observó que este

transformante modificó en forma significativa la CIM de AMP, CEF y FUR,

respecto del control (construcción sin inserto). No se observaron modificaciones

frente a FOX, CAZ y CRO.

Respecto de la purificación proteica realizada a partir de un cultivo inicial de 1

litro del transformante portador de blaINQ-1, se obtuvieron 30 ml de un eluato

parcialmente purificado por cromatografía de exclusión molecular, de los

cuales luego de someter 15 ml a una cromatografía de intercambio aniónico se

obtuvo un eluato de aprox. 3 ml con actividad ß-lactamasa remanente. En este

197

eluato se estimó la presencia de 3,19 mg de proteína total (por el método de

Bradford), con una pureza estimada mediante SDS-PAGE como >95%. La enzima

purificada exhibió un PM aparente de 37 kDa (Figura 33).

6.2.1.1.1 Caracterización cinética de la ß-lactamasa INQ-1

Los principales parámetros cinéticos obtenidos para INQ-1 se resumen en la

Tabla 13 y se describen a continuación.

Aunque esta enzima exhibió una hidrólisis preferencial por CEF (KM=20 μM),

respecto de bencil-PEN, que resultó comportarse como un sustrato pobre (KM

aparente=1 μM), la eficiencia catalítica fue similar para ambos sustratos

(kcat/KM=0,056 y 0,048 μM-1.s-1, respectivamente). Como lo muestra el parámetro

kcat, la tasa de recambio enzimático para CEF fue unas 100 veces mayor que

para FOX. No se detectó hidrólisis de CAZ, CRO e IMI. Se observó que la FUR

puedo ser hidrolizado por INQ-1, y aunque la reacción en las condiciones

ensayadas transcurrió en forma suficientemente lenta como para determinar la

tasa de hidrólisis con precisión (kcat=<0,0001 s-1) se detectó un aumento

significativo en la CIM en las células portadoras de la construcción que

contienen a blaINQ-1.

Figura 33. Perfiles proteicos de fracción soluble,

resueltos por SDS-PAGE al 12%, para la estimación

del grado de purificación de INQ-1. Revelado

con azul brillante de Coomasie. Se encuentran

indicadas las bandas del marcador de peso

molecular (MPM) comercial pre-teñido

(PageRuler Prestained Protein Ladder, 10-260 kDa,

Fermentas).

Calle 1: Eluato proveniente de la cromatografía

de intercambio aniónico (2do. paso de

purificación para la obtención de INQ-1

purificada). 2: Extracto proteico total de E. coli

Top 10F’-pK-19. 3: Extracto proteico total de E. coli

Top 10F’-INQ-1b (subclonado molecular portador

de blaINQ-1).

198

Tabla 13. Determinación de CIM para I. limosus MP06 y los transformantes de E. coli.

Principales parámetros de la caracterización cinética de INQ-1 ß-lactamasa

CIM (µg/ml) Parámetros cinéticos a

Compuesto I. limosus

MP06

E. coli b

pK-19

E. coli b

INQ-1 b

kcat

(s-1)

KM

(μM)

kcat/KM

(μM-1.s-1)

Bencil-PEN NR NR NR 0,05 1 c 0,048

AMP > 1024 2 16 0,03 2 c 0,017

CEF > 1024 4 32 1,07 20 0,056

FUR > 1024 2 32 <0,0001d 4 c (-)

FOX 256 1 1 0,01 1 c 0,008

CAZ 128 0,25 0,25 ND ND (-)

CRO 256 0,06 0,13 ND ND (-)

IMI 0,25 NR NR ND NR (-)

PEN: penicilina, AMP: ampicilina, CEF: cefalotina, FUR: cefuroxima, FOX: cefoxitina, FOX:

cefoxitina, CAZ: ceftacidima, CRO: ceftriaxona, IMI: imipenem a El desvió estandar fue menor al 15% b E. coli Top 10F’ c Estos son valores de Ki (Sustrato reportador: CEF) d La tasa de hidrolisis fue muy lenta como para obtener un valor preciso de kcat

NR: No realizado, ND: actividad no detectable, (-): no corresponde

En los ensayos cinéticos de inhibición se observó la inactivación enzimática en

presencia de CLA solo en condiciones de pre-incubación (IC50 indirecto = 56

µM). La difícil inactivación enzimática de INQ-1 por CLA, un inhibidor suicida

clásico de ß-lactamasas de clase A, sugiere que INQ-1 no pertenece a esta

clase molecular.

En forma congruente con la sinergia observada frente a BOR en el ensayo por

difusión en medio sólido sobre el transformante portador de blaINQ-1, también se

observó inactivación enzimática por ensayo cinético. Tanto por ensayo

competitivo como en condición de pre-incubación (indirecto) aunque a altas

concentraciones (IC50 directo = 390 µM, IC50 indirecto = 151 µM).

199

Si bien la secuencia INQ-1 parece suficientemente divergente (Fig. 31) como

para plantear si existe una evolución de las AmpC a partir de una secuencia

como la de INQ-1 o similar a esta, la caracterización enzimática preliminar

indicó que bioquímicamente se trata de una enzima de tipo cefalosporinasa

compatible con la descripción del grupo funcional 1, de tipo AmpC (de

localización cromosómica), aunque poco inactivable por BOR que típicamente

inhibe a las ß-lactamasas de clase C.

Acorde a lo esperado para una serino-ß-lactamasa clase C, no se detectaron

inhibiciones en presencia de NaCl ni EDTA.

6.2.1.1.2 blaINQ-1 en la cepa tipo I. limosus LMG 20952T

Recientemente (Julio/2014) se publicó la secuencia del genoma de la cepa

tipo de tipo I. limosus LMG 20952T (Nro. de acceso AUHM01000000). Se

determinó la presencia de blaINQ-1 en la cepa tipo. Los alineamientos de las

secuencias traducidas exhibieron una identidad del 92,6% y una similitud entre

residuos del 95,3%. No se detectaron discontinuidades entre las secuencias

(Figura 34).

Figura 34. Alineamientos entre secuencias de INQ-1 de I. limosus MP06 y LMG 20952T

* (asterisco) indica las posiciones con un único residuo conservado : (dos puntos) indica la

conservación entre residuos que comparten propiedades fuertemente similares . (punto) indica

la conservación entre residuos que comparten propiedades débilmente similares

200

Debido la localización cromosomal que presenta blaINQ-1 y por su secuencia

particular, poco similar a otras depositadas, este gen podría ser específico, al

menos, del género Inquilinus. Resultaría útil evaluar su presencia en otros

aislamientos de I. limosus, así como también en I. ginsengisoli, a fin de definir si

la detección por amplificación y secuenciación de blaINQ-1 puede contribuir

con la identificación de Inquilinus spp.

6.2.2 Clonado molecular - Detección y caracterización enzimática

Inicialmente, el servidor RAST predijo 11 CDS como posibles ß-lactamasas, pero

ese análisis realizado también incluye a otras proteínas capaces de

interaccionar con el anillo ß-lactámico, como las PBP.

En el análisis de predicción de dominios conservados las secuencias traducidas,

coincidieron con el cluster (agrupamiento mayor) de grupos ortólogos COG

1680, que corresponde a la categoría “ß-lactamasas de clase C y otras

proteínas de unión a la penicilina” (ß-lactamase class C and other penicillin

binding proteins).

Un análisis de la secuencia traducida no es suficiente para diferenciar una ß-

lactamasa de clase C de una PBP de bajo peso molecular (de distribución

ubicua) que participa o regula el entrecruzamiento en la síntesis de la pared

celular (por ejemplo, como D-alanina carboxipeptidasa) y, por consiguiente

carece de actividad ß-lactamasa [157]. Por lo que resulta necesario estudiar la

conformación espacial teórica (in silico) que tendría esa secuencia, considerar

la localización espacial (al verificar la presencia de señales de secreción y la

ausencia de dominios transmembrana) y analizar las distancias que presentan

los aminoácidos de los motivos conservados, pues en esto radica la capacidad

que tiene una ß-lactamasa para poder hidrolizar efectivamente al ß-lactámico.

Posteriormente, proseguir con el clonado de expresión del gen de interés a fin

de demostrar la actividad biológica in vitro.

201

Luego del análisis in silico realizado sobre todos estos genes, se determinó la

presencia de al menos otras 2 posibles ß-lactamasas. Sus genes se denominaron

arbitrariamente blaINQ-2 y blaINQ-3, sobre el supuesto de tratarse de genes

codificantes de las posibles ß-lactamasas INQ-2 e INQ-3.

6.2.2.1 Análisis in silico de INQ-2

Una región de 1191 pb presentó una identidad de 71% y 73% con la secuencia

nucleotídica de una hipotética ß-lactamasa/D-carboxipeptidasa de

Pseudomonas brassicacearum DF41 (Nro. de acceso CP007410) y para una

posible ß-lactamasa de Methylobacterium populi BJ001 (Nro. de acceso

CP001029), respectivamente.

El ORF predicho in silico presentó los motivos típicos de ß-lactamasas de clase C,

encontradas en posiciones precisas (Figura 35): el elemento SxxK, el loop YSN, el

elemento KTG y el ácido aspártico en la posición 217 de la secuencia (D217).

Esta enzima con posible actividad ß-lactamasa podría codificar para una

proteína madura de 367 aminoácidos (pI teórico 5,7 y PM teórico 39,4 kDa).

Figura 35. Secuencia traducida de blaINQ-2. Se señala el primer aminoácido de la

secuencia madura de 367 aminoácidos de INQ-2, el sitio activo de serina (SVSK), el loop

YSN, elemento KTG y el ácido aspártico en la posición 217 de la secuencia (D217),

compatibles con las ß-lactamasas de clase C.

La secuencia traducida mostró un 58,4% de identidad y 74% de similitud en los

residuos, respecto de la secuencia de la ß-lactamasa PAO1 de P. aeruginosa

cepa PAO1 (PDB nro. 4GZB_A) y un 59,6% de identidad y 72,6% de similitud

frente a los residuos de la ß-lactamasa OCH-8 de Ochrobactrum anthropi cepa

MSPVSRRRALARTLLAAPVFAGLAALLLGAAPDPADAPIARIVDDARPVMARNDVPGIAVAVT

AGGRHHFFSYGVASKESGQAVTEDTLFELGSVSKTFTATLGATAQLQGALALSDAASRHMPE

LAGSRFDRISLLDLATYTAGGLPLQFPDEVTDDAGMIAWYRGWRPDWAPGTRRLYSNPSIGL

FGHLAALSLGRPFDELMQQRIFPALGLSHTFIRVPPERMPAYAWGYNKTGKPVRVNPGPLDAE

AYGVKSTAADMIRFVDANIDGAGLDDSTRRAIAATHAGYDRVGDMTQGLGWEMYAWPVALDRL

LAGNSPEMSSKPNPVDRLDPPLPPQDDVLLNKTGSTNGFGAYVAFVPSRRIGVVILANRNYP

IADRVTAAYRILTALGGTTGTE

202

SLO74 (Nro. de acceso ABF50909). PAO-1 y OCH-8 son ß-lactamasas de tipo

AmpC, que se encuentran caracterizadas [262, 263]. Los alineamientos entre

estas secuencias se encuentran en la Figura 36 donde se remarcan los motivos

conservados entre ß-lactamasas.

Como parte de la predicción de la función biológica se realizó el modelado in

silico de la secuencia traducida (madura) de blaINQ-2 sobre el cristal de la ß-

lactamasa de tipo AmpC de P. aeruginosa PAO1.

Figura 36. Alineamientos entre las secuencias de la posible ß-lactamasa INQ-2 y las ß-

lactamasas de tipo AmpC, PAO1 y OCH-8. Se encuentran señalados en rojo los motivos

conservados típicos de ß-lactamasas de clase C.

PAO1 de Pseudomonas aeruginosa PAO1 (PDB: 4GZB_A), OCH-8 de Ochrobactrum anthropi

SLO74 (Nro. de acceso ABF50909)

* (asterisco) indica las posiciones con un único residuo conservado : (dos puntos) indica la

conservación entre residuos que comparten propiedades fuertemente similares . (punto) indica

la conservación entre residuos que comparten propiedades débilmente similares

Las estructuras globulares teóricas de INQ-2 y PAO1 presentaron una

conformación estructural general diferente, posiblemente atribuíble a los

diferentes aminoácidos que conforman ambas estructuras primarias. (Figura 37,

A). En el modelado globular de INQ-2 es posible distinguir los dominios “todo-α”

y “α/ß”, que presentan la serino ß-lactamasas.

203

No obstante, una comparación predictiva acerca de la localización de los

motivos conservados en la estructura secundaria teórica en ambas secuencias

indicó que los elementos se encuentran ubicados en el mismo tipo de estructura

secundaria, según puede verse en la Figura 37, B. Los residuos de aminoácidos

que podrían interaccionar con un sustrato ß-lactámico y conferir a INQ-2

actividad enzimática como ß-lactamasa presentaron una disposición y

orientación espacial adecuada (Figura 37, C). Estos residuos determinaron una

cavidad accesible desde el exterior que podría definir un posible sitio catalítico

para INQ-2 (Figura 37, D).

204

205

INQ-2 A PAO1

B

Figura 37. Modelado in silico de la secuencia traducida de blaINQ-2. A. Estructura globular teórica de INQ-2 y PAO1. Pueden

observarse diferencias en el plegamiento teórico de ambas proteínas atribuibles a los distintos residuos en la secuencia

primaria. B. Comparación de la localización de los motivos conservados de las serino-ß-lactamasas de clase molecular C en la

estructura secundaria teórica en INQ-2 y PAO1. Los elementos se encuentran ubicados en el mismo tipo de estructura

secundaria. C. Disposición espacial teórica de los residuos de los aminoácidos que podrían conferir la actividad ß-lactamasa a

INQ-2. D. Visualización del sitio catalítico teórico de INQ-2 (en gris), accesible desde el exterior (fucsia).

206

Continuación Figura 37.

Respecto de la regulación de la expresión de blaINQ-2, no se detectaron genes

vecinos (Figura 38) que puedan estar implicados en esta función, como ampR u

otro posible regulador.

Figura 38. Entorno génico de blaINQ-2 en I. limosus MP06. Anotación funcional y

contenido porcentual de G+C de los genes vecinos.

C

D

207

6.2.2.2 Análisis in silico de INQ-3, posible ß-lactamasa

Una secuencia de 1125 pb con COG 1680 asignado y ORF predicho in silico

podría codificar para una proteína madura de 356 aminoácidos cuya

secuencia presentó similitud con otras posibles ß-lactamasas presentes en

repositorios.

Una región interna de 298 aminoácidos de la secuencia traducida mostró entre

un 51 y 51,4% de identidad y entre un 64 y 64,8% de similitud con las posibles ß-

lactamasas de Chryseobacterium taeanese ARB2 (Nro. de acceso

WP_017407637) y Delftia sp. CS 1-4 (Nro. de acceso WP_013802504). Nos resultó

llamativo la identidad entre secuencias respecto de C. taeanese debido a que

pertenece a la clase Flavobacteria, y fue aislado de la raíz de una planta que

crece habitualmente en las dunas de la costa de Corea [264]. En la base de

datos del PDB, la secuencia de INQ-3 presentó un 26 % de similitud con la

secuencia de una ß-lactamasa de clase C caracterizada, de Pseudomonas

fluorescens (PBD: 2QZ6_A) [265].

En la secuencia traducida de blaINQ-3 (Figura 39) se encontraron dos de los

motivos típicos de las serino-ß-lactamasas en posiciones precisas: los elementos

SxxK y KTG. En cuanto a los restantes elementos, el bucle del elemento 2 no se

observó definido, así como tampoco presentó el “omega loop” característico

de las enzimas de clase A (ExxxN). Sin embargo, a una distancia aproximada a

la que debería encontrarse el omega loop respecto de la serina activa (unos 95

aminoácidos) se encontró el motivo ExxxY. Se consideró que era posible que

con la sustitución de asparagina (N) por tirosina (Y) pudiera presentar actividad

ß-lactamasa [266] por lo que se continuó con el estudio, aun ante la baja

posibilidad de confirmar enzimáticamente a esta proteína como una ß-

lactamasa. La proteína madura predicha tiene un pI teorico de 5,1 y un PM de

38,9 kDa.

208

Figura 39. Secuencia traducida de blaINQ-3. Se señala el primer aminoácido de la

secuencia madura prevista de 356 aminoácidos de INQ-3, el sitio activo de serina (SITK),

el elemento KTG y un posible omega loop (EDLPY).

No se detectaron genes vecinos que puedan estar implicados en la regulación

de blaINQ-3. La anotación funcional del entorno de blaINQ-3 con su respectivo

contenido porcentual de G+C se encuentran en la Figura 40.

Figura 40. Entorno génico de blaINQ-3 en I. limosus MP06. Anotación funcional y

contenido porcentual de G+C de los genes vecinos.

MPLRRALPLIALLASPAVAADTPPDCHAPAVLNDGWAIAVPADEGFDPATLCAVGPALEARNAH

AVLVVRHGTLVYERYFAGEDERWGQPLGRVAHDAATKHDLRSITKSVTSLLVGIAVDHGWIKDI

DAPVLSLLPQYADLRSPETDRITLRHLLTMSSGLAWSEDLPYSDPRNSERLMSDAPDPYRYVL

EQPFATAPGERWTYSGGATALLSAVLKQVSGRPLDVLAREVLFAPLGIDDVEWVRYPNGDPVAA

SGLRLRPRDIAKTGRLVLDHGAWQGKQIVSPGWIAQSTTRQIAAEDEIDYGFQWWLGHSQIGGQ

DLRWSAGVGWGGQRLFLVPDRDLLVVVTAGLYDQPDAQDALGRDVLERYVLPAARPIADRVTAA

YRILTALGGTTGTE

209

6.2.3 Clonado de blaINQ-2 y blaINQ-3. Detección de actividad enzimática

Con la finalidad de determinar si el producto proteico de blaINQ-2 y blaINQ-3

participa en la actividad ß-lactamasa que se observa en I. limosus se procedió a

su clonado y expresión.

La identidad de las construcciones obtenidas se confirmó por secuenciación y

se procedió a la expresión de los productos génicos en E. coli BL21(DE3). Luego

de realizar la inducción de la expresión de estos genes post-agregado de IPTG,

y en forma previa a su purificación, se analizó la actividad ß-lactamasa en

ambos extractos proteicos totales.

Como era previsible, el extracto proteico total que contiene la proteína INQ-3

no mostró capacidad para hidrolizar ningún sustrato ß-lactámico en los ensayos

realizados por lo que no se prosiguió con su caracterización.

El extracto proteico total que contenía a INQ-2 demostró actividad ß-lactamasa

mediante la hidrólisis de NitTM, que luego fue confirmada por método

iodométrico al hidrolizar AMP, CEF, CAZ y CTX como sustratos.

Se observó una inducción proteica adecuada a las 7 h post-inducción a 37°C.

Se realizó la expresión proteica a gran escala de pET-INQ-2 para purificar la

enzima en estudio. Luego de la IMAC se obtuvo un eluato parcialmente

purificado, enriquecido en INQ-2 respecto de la proporción original de proteínas

totales (Figura 41). Esta fracción fue conservada y utilizada posteriormente para

la caracterización cinética de la enzima.

Además, se obtuvo la construcción de blaINQ-2 en el vector pK19 transformada

en E. coli TOP 10 F’, cuyo extracto proteico total hidrolizó en forma eficaz NitTM. El

resultado de la determinación de la CIM del transformante portador de blaINQ-2

en pK19 frente a distintos sustratos ß-lactámicos se muestra en la Tabla 14.

210

6.2.4 Caracterización cinética parcial de la ß-lactamasa INQ-2

Respecto de las determinaciones cinéticas realizadas sobre el extracto proteico

enriquecido en INQ-2, la AMP resultó ser el mejor sustrato ß-lactámico, con lo

que las determinaciones de vmáx relativa se realizaron respecto de este sustrato

(Tabla 14).

INQ-2 hidrolizó FOX, CAZ y CTX, de forma que experimentalmente pudiera

calcularse la KM aparente (Ki), y también hidrolizó otros sustratos como CEF, CFZ y

FUR, aunque muy lentamente para poder realizar determinaciones. No se

detectó hidrólisis de bencil-PEN, ATM, FEP ni IMI. Por el perfil de sustratos

hidrolizados, INQ-2 parece ser una serino-ß-lactamasa del grupo funcional 1e

[71], aunque por la baja velocidad hidrolítica que presentó no es posible

compararla con otras ß-lactamasas. Es posible que la expresión de esta ß-

lactamasa en E. coli no sea adecuada, y esto repercuta en su actividad

enzimática.

Figura 41. Perfiles proteicos de fracción

soluble, resueltos por SDS-PAGE al 12%,

para la estimación del grado de

purificación de INQ-2. Revelado con

azul brillante de Coomasie. Calle 1:

Marcador de peso molecular (MPM)

comercial pre-teñido (PageRuler

Prestained Protein Ladder, 10-260 kDa,

Fermentas). Se encuentra indicado el

PM de cada banda. 2: Extracto

proteico total de E. coli BL21-pET-INQ2,

previo a la inducción de la expresión

proteica con IPTG. 3: Extracto proteico

total de E. coli BL21-pET-INQ2 post-

inducción proteica (7 h, 37°C, 180

r.p.m). 4: Eluato proveniente de la

cromatografía de afinidad de metal

inmovilizado, parcialmente purificado,

enriquecido en INQ-2 (recuadro rojo).

211

La actividad ß-lactamasa de INQ-2 no pudo ser inactivada por ensayo directo

por ninguno de los agentes inactivantes empleados (CLA, SUL, BOR y NaCl). Al

pre-incubar a la enzima en presencia de CLA tampoco fue posible obtener su

inactivación (IC50 indirecta > 200 μM). Respecto de la presencia de BOR, acorde

a una serino-ß-lactamasa de clase C, INQ-2 mostró inhibición enzimática en

presencia de este inactivante pero solo a alta concentración (IC50 Indirecta = 50

μM). Llamativamente para una ß-lactamasa de clase C, se observó una

inactivación parcial de INQ-2 en presencia de SUL, en la que no fue posible

alcanzar una inhibición del 100% de su actividad enzimática empleando hasta

260 µM, y se estimó la IC50 indirecta cercana a 70 µM. Se descartó la actividad

hidrolítica de la enzima sobre SUL. Esta inusual susceptibilidad a SUL que

presentó INQ-2 ha sido reportada previamente, en forma excepcional, en la ß-

lactamasa de clase C de Laribacter hongkongensis, una Betaproteobacteria

[267].

Tabla 14. Determinación de CIM para I. limosus MP06 y los transformantes de E. coli, y

caracterización cinética preliminar de la ß-lactamasa INQ-2.

CIM (µg/ml) Parámetros cinéticos a

Compuesto I. limosus

MP06

E. coli b

pK-19

E. coli b

INQ-2

KM aparente c

(μM)

vmáx relativa

(%)

AMP > 1024 2 16 0,6 100

FOX 256 1 4 0,004 0,3

CAZ 128 0,25 4 1,5 10

CTX 256 0,06 2 0,01 0,5

a El desvío estandar fue menor al 15%. b E. coli Top 10F’ (Invitrogen) c Estos son valores de Ki (Sustrato reportador: Nitrocefin, KM= 22 μM)

Ambas enzimas, INQ-1 e INQ-2, resultan poco inhibibles por inactivadores

clásicos de serino-ß-lactamasas, lo cual justifica que no se pueda evidenciar la

presencia de estas enzimas en los ensayos de screening de ß-lactamasas en

212

medio sólido realizados en I. limosus, que frecuentemente se emplean en el

laboratorio de microbiología clínica.

Preliminarmente puede concluirse que I. limosus MP06 presenta al menos dos ß-

lactamasas.

Si bien los transformantes de E. coli productores de estas enzimas contribuyeron

al aumento general de la CIM no se alcanzaron los valores de resistencia

observados en la cepa de origen. No puede descartarse que sea deficiente la

expresión y conformación estructural de estas proteínas en un entorno genético

como lo es E. coli (la celula receptora), tan distinto al original. Es posible que

ocurran impedimentos transcripcionales y post-transcripcionales debido al

codón de inicio de la transcripción inusual y al alto contenido de G+C que

presentan sus secuencias codificantes.

La resistencia a ß-lactámicos que se observa en I. limosus parece deberse a que

simultáneamente se expresan distintos mecanismos como (al menos) las

bombas de eflujo detectadas y las 2 ß-lactamasas caracterizadas. Por lo que

sería esperable que la resistencia final encontrada fuese dependiente no solo

de la presencia de estas enzimas, sino que implique otros mecanismos de

resistencia o una situación de baja sensibilidad innata en los receptores que

participen del proceso.

213

7 ENFOQUES DE LA VIRULENCIA

7.1 Detección de determinantes génicos asociados a la virulencia y evasión

de la respuesta inmunitaria

Tal como se ha comentado previamente, la erradicación de I. limosus del

tracto respiratorio en los PFQ resulta dificultosa. En nuestro caso, los diferentes

aislamientos provienen de un mismo paciente que presenta una

colonización/infección crónica desde, al menos, el año 2006. Es por esto que

resulta necesario analizar los factores asociados a la virulencia e involucrados

en estrategias de evasión del sistema inmunitario que puedan estar presentes

en esta especie bacteriana. La búsqueda se realizó sobre la secuencia

genómica de I. limosus MP06.

Unos 160 genes de I. limosus MP06 podrían estar asociados a la virulencia y al

estilo de vida de virulencia. Según la anotación funcional se encontraron las

CDS de diversas peptidasas incluida una elastasa, elementos estructurales como

adhesinas fimbriadas y diversos asociados al camuflaje de los patrones

moleculares asociados a patógenos (PAMP, pathogen-associated molecular

patterns).

Si bien se encontraron algunos genes potencialmente relacionados con la

movilidad (motA y motB) y para la proteína reguladora de la respuesta

quimiotáctica CheY, no resultó sorpendente no encontrar todos los genes

necesarios para la movilidad, ya que el microorganismo es inmóvil.

El mayor número de los determinantes asociables a factores de virulencia se

hallaron vinculados a la evasión del sistema inmune adaptativo, y

principalmente a la sobrevida intracelular, como se describe a continuación.

Algunas CDS halladas parecen estar relacionadas con la formación de

cápsulas ricas en polisacáridos y ácido siálico.

214

Otro conjunto de secuencias codifica para las enzimas (y sus reguladores

transcripcionales) encargadas de la depuración de los productos intermediarios

reactivos del O2, como superóxido dismutasa, catalasa, ferroxidasa, ruberitrina,

que podrían evitar o retrasar la muerte I. limosus dentro del fagosoma al

prevenir el estallido respiratorio. Particularmente se encontraron 2 copias a lo

largo del genoma para la codificación de superóxido dismutasa y catalasa. La

funcionalidad de la enzima catalasa en este aislamiento se había evidenciado

previamente durante la realización de las pruebas bioquímicas.

Acorde a la actividad α-hemolítica que se había observado al cultivar I. limosus

MP06 en medio agar sangre, se encontraron determinantes asociados con la

síntesis y secreción de una hemolisina, que le permitiría eventualmente escapar

del fagosoma al provocar la ruptura enzimática de la membrana.

Además, se encontraron los genes codificantes para llevar a cabo el ciclo del

glioxilato (CdG), incluídos los codificantes para las enzimas clave de este ciclo,

isocitrato liasa (EC 4.1.3.1) y malato sintasa (EC 2.3.3.9). Esta vía metabólica

secundaria representa un bypass de las reacciones de decarboxilación del

ciclo de los ácidos tricarboxílicos o ciclo de Krebs (TCA). Mediante el CdG

(Figura 42), el isocitrato es convertido a glioxilato y succinato por la catálisis de

la enzima isocitrato liasa. Posteriormente, la enzima malato sintasa cataliza la

condensación del glioxilato formado en la primera reacción con el acetil-CoA

proveniente de los ácidos grasos, produciendo malato, el precursor inmediato

del oxalacetato del TCA. El CdG permite a las bacterias aerobias sobrevivir a

condiciones de estrés extremo mediante la utilización de ácidos grasos, y se

considera a los genes implicados como asociados al estilo de vida de virulencia

ya que los mismos se activan sólo en condiciones extremas o de stress, por

ejemplo, ante la presencia de sustancias antimicrobianas y de las especies

reactivas del oxígeno [268-270]. A su vez, este ciclo permite la continuidad del

TCA para generar los precursores de aminoácidos e incluso realizar

gluconeogénesis con los precursores hidrocarbonados obtenidos por el CdG.

215

Figura 42. Reconstrucción del metabolismo de dicarboxilatos y glioxilato. Las CDS

mapeadas de I. limosus MP06 se distinguen en color verde, y recuadradas en verde se

encuentran las vías metabólicas relacionadas que también presentaron reconstrucción

metabólica. Puede observarse el ciclo del glioxilato y la movilización de los precursores

formados hacia otras vías.

Otros determinantes génicos asociados a la virulencia hallados en I. limosus

MP06 codifican a proteínas asociadas con el secuestro de iones (sideróforos,

bacterioferritina) y sistemas de transporte de hierro como permeasas y

transportadores de tipo ABC, TonB-ExbB-ExbD y PitACD-like. También los arreglos

encontrados de las BE de la familia RND contribuir con la virulencia bacteriana

asociada a la formación de biofilms [2] que se discutirá en el siguiente ítem.

En general, los determinantes génicos analizados presentaron una mayor

similitud con secuencias depositadas (en ausencia de evidencia experimental),

correspondientes a microorganismos más cercanos en filogenia con el género

Metabolismo de dicarboxilatos y glioxilato

216

Inquilinus, como por ejemplo, otras Alphaproteobacteria cuya relevancia clínica

en humanos es menos evidente, y se encuentran estudiadas aquellas que están

relacionadas con células eucariotas vegetales. Sin embargo, algunas

secuencias presentaron una alta similitud con microorganismos no tan cercanos

en relación de filogenia. Los posibles productos génicos para los que se observó

esta particularidad se resumen en la Tabla 15.

Tabla 15. Productos génicos de I. limosus MP06 con alta similitud frente a bacterias con

distinta relación filogenética.

Producto génico Función Identidad*

(%) Microorganismo

Isocitrato liasa

EC 4.1.3.1

Obtención de energía

en ambiente hostil

Activación del ciclo del

glioxilato

Obtención de hidratos

de carbono a partir de

ácidos grasos

77

64-67

Brucella pinnipedialis,

Brucella abortus

Mycobacterium tuberculosis,

Mycobacterium spp.

Malato sintasa

EC 2.3.3.9

78 Rodospirillum sp.

Mycobacterium spp. 62

Sideróforos Quelantes de hierro 63-65 Complejo Burkholderia

cepacia

TonB-ExbB-ExbD

y

PitACD-like

Transporte de hierro al

interior de la célula

bacteriana

53

Bordetella parapertussis

Bordetella pertussis

Bordetella bronchiseptica

39 Rhizobium leguminosarum,

Sinorhizobium meliloti

Hemolisina

Ruptura de la

membrana del

fagosoma 40

Listeria monocytogenes

* Identidad de la secuencia traducida. Mejor hit en la base de datos de proteínas no

redundantes del NCBI, frente a todas las secuencias no redundantes depositadas, mediante la

herramienta informática BLAST, algoritmo BlastP.

Los géneros Brucella, Rhodospirillum, Rhizobium y Sinorhizobium pertenecen a la clase

Alphaproteobacteria. El género Mycobacterium pertenece a la clase Actinobacteria. Los

géneros Burkholderia y Bordetella pertenecen a la clase Betaproteobacteria. El género listeria

pertenece a la clase Bacilli.

217

Debido a que se asume que las bacterias patógenas oportunistas en contacto

con el hospedador no son el resultado evolutivo hacia una mayor capacidad

patogénica, se postula que el término de "agentes patógenos emergentes" no

ha sido adecuadamente empleado (históricamente) para la descripción de los

patógenos oportunistas [91]. Son numerosos los que provienen del medio

ambiente y parecen incapaces de producir infecciones en pacientes

inmunocompetentes [271-274]. Una de sus características más sobresalientes es

la alta resistencia intrínseca a una amplia gama de antibióticos [25]

permitiéndoles permanecer en el hospedador inmunocomprometido

(frecuentemente bajo tratamiento antimicrobiano), por lo que no requieren

necesariamente poseer determinantes de patogenicidad específicos contra los

seres humanos, pues las defensas naturales no están funcionando y solo es

suficiente la resistencia a antibióticos [91].

En algunos casos, los elementos con un papel en la virulencia pueden además

intervenir en la regulación de la resistencia a los antibióticos, así la privación de

hierro induce la expresión de las BE-RMD que además puede ser inducida por

salicilato, que a su vez es un intermediario en la síntesis de sideróforos y un

quelante de hierro en sí mismo en Pseudomonas spp. [98, 113, 114].

A lo largo del genoma de I. limosus detectamos un gran número de genes

asociables a factores de virulencia y al estilo de vida de virulencia, además de

los reguladores transcripcionales de muchos de estos genes, dedicados al

censo de las concentraciones séricas de calcio, hierro, pH, temperatura, y

ciertas moléculas, que disparan la expresión de factores de virulencia. Los

géneros bacterianos Brucella, Bartonella, Agrobacterium, Rhizobium,

Sinorhizobium y Mesorhizobium son miembros de la clase Alphaproteobacteria.

Todas estas bacterias habitan en las células eucariotas, y los estudios de

genómica comparativa indican que evolucionaron de un ancestro común [275,

276]. Existen paralelismos notables entre los mecanismos y productos de genes

utilizados por estas bacterias para establecer interacciones exitosas con sus

plantas y animales hospederos [277, 278]. Inquilinus limosus pertenece a esa

218

misma categoría taxonómica y aunque se desconoce su verdadero nicho

ecológico, se intuye que puede ser ambiental. Sin embargo, hasta el momento

solo se ha recuperado de muestras clínicas de pacientes humanos. Y aunque

no hay, hasta el momento, ninguna evidencia de que esta bacteria pudiera

internalizarse en las células del hospedador, su prolongada permanencia en un

mismo PFQ (en algunos casos con evidente deterioro de la función pulmonar),

podría deberse a alguna estrategia de persistencia intracelular con la finalidad

de evadir la respuesta inmunitaria.

Schmoldt y col. [40] demostraron que en los pacientes con FQ existe una

respuesta serológica de tipo IgG frente a varios antígenos específicos de I.

limosus, e incluso en un paciente se detectaron 1 año antes de que sus cultivos

de esputo resulten positivos. Sin embargo, la presencia de anticuerpos IgG

específicos anti-I. limosus no parece ser suficiente para erradicarlo de las vías

aéreas de estos pacientes. Esto podría deberse a la presencia de una estrategia

de evasión intracelular o de variación antigénica durante el transcurso de la

infección por I. limosus, lo cual también podría explicar la dificultosa

recuperación de este microorganismo a partir de la muestra respiratoria, a

pesar de no presentar exigencias nutricionales, atmosféricas o incluso en

ausencia de microorganismos acompañantes.

En este aspecto, el CdG, ausente en los mamíferos, se presenta como un

blanco anti-virulencia de interés. Numerosos estudios sobre M. tuberculosis

involucran el estudio de la enzima isocitrato liasa con el diseño de moléculas

que la inhiban específicamente para ser empleados como futuros fármacos

[268] debido a que resulta imprescindible para el mantenimiento del estado de

latencia intracelular [112, 279, 280]. La inhibición de la isocitrato liasa se presenta

como un tentador blanco “anti-virulencia” por ser específico de patógenos

intracelulares, puesto que la expresión de esta enzima es un rasgo común a

ellos, y algo a considerar si I. limosus expresa esta enzima en condiciones de

estrés.

219

Respecto del análisis bioinformático realizado, en el subsistema del RAST

denominado “Virulencia, enfermedad y defensa”, I. limosus MP06 sólo presentó

la anotación de 72 CDS, la gran mayoría en la categoría “Resistencia a

antimicrobianos y compuestos tóxicos”, referida a los arreglos génicos de

posibles BE-RMD, ß-lactamasas y transportadores de compuestos tóxicos.

Ninguna de las CDS comentadas en este apartado (a excepción de la breve

inclusión que se realizó sobre las BE de tipo RND) presentó una anotación

funcional dentro del subsistema de virulencia del RAST. Esta característica es

común a todas las plataformas de anotación automática disponibles hasta el

momento, que solo realizan la anotación automática de los denominados

“genes verdaderos de virulencia” como los que codifican para una exotoxina

bacteriana conocida, pero no pueden anotar genes asociados a la virulencia y

al estilo de vida de virulencia. Esto representa un problema para el análisis de

datos provenientes de la secuenciación masiva pues requiere una búsqueda

manual, especialmente en microorganismos poco descriptos como Inquilinus.

Debido a que muchos de los factores de virulencia (y sus elementos

reguladores) se pueden dividir en un número menor de grupos basados en la

conservación de mecanismos similares, de forma que muchos organismos

distintos comparten estrategias similares [106], es posible hipotetizar la

patogénesis de Inquilinus al emplear bases de datos de virulencia (basadas en

minería de datos) construidas específicamente para otros microorganismos

[121-123].

Se espera que el análisis bioinformático realizado sobre I. limosus permita

contribuir al desarrollo y crecimiento de los repositorios y algoritmos necesarios

para el análisis in silico de las estrategias de virulencia.

220

7.1.1 Determinantes génicos asociados a la formación del biofilm

A continuación se analizan algunos de los determinantes génicos que pueden

estar asociados a la virulencia implicados en la regulación de la formación del

biofilm en I. limosus MP06, quizás con regulación mediada a través del sistema

de señales dependiente de densidad bacteriana o quórum sensing (QS).

Se encontraron las CDS de distintos tipos de transportadores asociados a

moléculas moduladoras de la expresión génica que participan de la formación

y remodelación del biofilm como las AHL, ramnolípidos, y las pequeñas

moléculas autoinductoras (AI) como la AI-2. También, como se mencionó

anteriormente, se detectaron los arreglos génicos de las BE de la familia RND los

cuales estan implicados en el transporte de AHL [2]. Asimismo, se encontraron a

lo largo del genoma varias copias de la CDS para el receptor de señal de

quórum sensing (QS) de la familia LuxR [281]. Sin embargo, no se encontraron

genes que codifiquen para las sintasas de AHL y AI-2 (ni sus homólogos).

Al analizar en forma comparativa el genoma de I. limosus MP06 por sintenia

frente a los genomas completos de microorganismos modelos en la

organización de QS, como de Xanthomonas citri subsp. citri cepa A306 (Nro. de

acceso NZ_CP006857), Xanthomonas campestris pv. raphani cepa 756C (Nro.

de acceso NC_017271) y P. aeruginosa cepa PAO1 (Nro. de acceso NC_002516)

(Figura 43), no resultó coincidente con las regiones involucradas en la formación

de biofilm.

Si bien el sistema de QS se halla ampliamente distribuido en bacterias gram

negativas, no todas parecen sintetizar las moléculas autoinductoras (AHL y AI-2)

que permiten su regulación, como se observó por ejemplo en Escherichia coli y

Salmonella enterica [282]. Es posible que I. limosus no sea un microorganismo

productor de las moléculas implicadas en la señalización de QS, pero sí parece

poseer los receptores y transportadores necesarios para detectar las AHL y AI-2

secretadas por otras bacterias, que conducirían a la variación de la expresión

génica.

221

Los sistemas de QS no solo participan en la formación y establecimiento del

biofilm sino que también puede estar vinculado a la expresión de factores de

virulencia en otros microorganismos [283].

Figura 43. Genómica comparativa. Análisis por sintenia génica para establecer la

correspondencia de genes involucrados en la formación de biofilm. Los sectores en rojo

indican la coincidencia en el contexto entre pares de genes ortólogos según el

Translated BLAST (TBLASTX), en tanto que las coincidencias con inversiones o posibles

eventos de traslocación están representadas por los sectores azules. A. Sintenia

observada entre Xanthomonas citri subsp. citri cepa A306 (arriba) e I. limosus MP06

(abajo). B. Sintenia observada entre P. aeruginosa cepa PAO1 (arriba) e I. limosus MP06

(abajo). Las sintenias observadas no involucraron ortólogos descriptos como asociados

con la formación y regulación del establecimiento del biofilm.

B

A

222

223

8 ANÁLISIS DE LAS RELACIONES FILOGENÉTICAS DE I. limosus MP06

8.1 Evaluación de genes que podrían contribuir con la identificación molecular

La diferenciación entre especies de Inquilinus podría no ser suficiente

basándose únicamente en las secuencias del ARNr 16S y resulta necesario

considerar otros genes. En la actualidad el género Inquilinus cuenta con 2

especies claramente definidas (I. limosus e I. ginsengisoli) con más de 100

secuencias del ARNr16S depositadas en repositorios públicos. La secuencia

correspondiente a la cepa tipo de I. ginsengisoli Gsoil080T muestra una

identidad del 98,9% respecto de ambas cepas I. limosus AU476T e Inquilinus sp.

AU1979 [38], que a su vez presentan un 99,0% de identidad entre sí [1].

Actualmente, del género Inquilinus sólo se encuentran depositadas secuencias

correspondientes al gen ARNr16S, a excepción de los 2 únicos genomas

disponibles; los correspondientes a I. limosus MP06 e I. limosus AU476T. Por lo

tanto se analizó la posición taxonómica de I. limosus MP06 respecto de otros

microorganismos relacionados, y solo fue posible comparar esta posición

respecto de la cepa tipo I. limosus AU476T. La mayoría de los genes (alternativos

al ARNr16S) considerados para el estudio permite la resolución taxonómica en

otras especies [175].

Al comparar diversas secuencias génicas considerados tradicionalmente como

marcadores filogenéticos en distintas especies bacterianas, siempre se obtuvo

el mayor porcentaje de identidad entre I. limosus MP06 e I. limosus AU476T, lo

que confirmó la estrecha relación entre estos 2 microorganismos, con

variaciones intragénicas de hasta un 6,3 % (Tabla 16). Para todos los genes

estudiados se detectó un menor porcentaje de identidad génica que el

observado por comparación de las secuencias del ARNr 16S, lo cual remarca el

potencial discriminador que pueden presentar estos genes en Inquilinus.

224

Tabla 16. Porcentajes de identidad de secuencias génicas observados entre I. limosus

MP06 y AU476.

Nombre del gen a Identidad

(%)

gaps

(N°)

gaps

(%)

Bases

comparadas

(N°)

gyrB 93,7 6 0,2 2463

gyrA 93,9 24 0,9 2790

recA 94,0 10 0,9 1085

rpoD 94,2 13 0,7 1958

fusA 94,4 2 0,1 2077

parC 94,5 4 0,2 2219

dnaK 95,0 3 0,2 1920

groES 95,5 0 0 312

groEL 95,9 8 0,5 1654

rpoB 96,1 9 0,2 4194

ARNr 16S 98,7 10 0,7 1417

a Descripción del gen - gyrB: subunidad ß de la ADN girasa, gyrA: subunidad α de la ADN girasa,

recA: recombinasa A, rpoD: factor sigma de la ARN polimerasa, fusA: factor de elongación G,

parC: subunidad α de la topoisomerasa IV, dnaK: chaperona, groEL, groES:

chaperona/chaperonina/co-chaperonina, rpoB: subunidad ß de la ARN polimerasa dirigida por

ADN, ARNr 16S: ARN ribosomal 16S.

Los dendrogramas obtenidos basados en los genes gyrB, gyrA, recA, rpoD, fusA,

parC, dnaK, groEL, groES y rpoB presentaron topologías similares para I. limosus

MP06 y AU476 (Figura 44, A-J). Asimismo, el árbol filogenético obtenido a partir

de los genes rpoB, dnaK, parC, recA y gyrA concatenados, confirma la situación

taxonómica que se observó por análisis del gen ARNr 16S (Figura 44, K y L,

respectivamente).

También se estudiaron las secuencias de otros genes como los codificantes

para ciertas enzimas con diversas actividades metabólicas. Se observó que

dentro del orden Rhodospirillales, las reconstrucciones filogenéticas realizadas

sobre los genes codificantes de las enzimas isocitrato liasa (EC 4.1.3.1) y ornitina

decarboxilasa (EC 4.1.1.17) también presentaron una topología similar con la

ubicación taxonómica que indica el gen ARNr 16S (Figura 44, M y N). Estas

secuencias génicas exhibieron un porcentaje de identidad del 94,9 y 95,7,

respectivamente, entre las cepas MP06 y AU476.

225

Figura 44. Árboles filogenéticos construidos para I. limosus y especies relacionadas. Se

observa que la relación entre las cepas MP06 y AU476 es la más cercana y todos los

árboles presentan una topología similar lo cual confirma la situación taxonómica que

indica el análisis de la secuencia del ADNr 16S. Se incluyó un outgroup no

perteneciente a la familia Rhodospirillaceae. La barra de escala indica el número de

sustituciones por posición nucleotídica. Se indican los porcentajes de soporte

(bootstrap) de los puntos de ramificación que resultaron >70%. Los puntos en los nodos

indican las ramas que además fueron recuperadas mediante el algoritmo de máxima

parsimonia. Se menciona el número de acceso a la secuencia génica o al genoma

depositado en el repositorio DDBJ/EMBL/GenBank. Árboles filogenéticos construidos

con los genes: A: rpoB, B: gyrA, C: gyrB, D: parC, E: fusA, F: rpoD, G: dnaK, H: groEL, I:

groES, J: recA, K: concatenado de los genes rpoB, dnaK, parC, recA y gyrA, L: ARNr 16S

(se indican las categorías taxonómicas, no se señalan los valores de soporte de las

ramas), M: isocitrato liasa, N: ornitina decarboxilasa.

A B

C D

226

227

Continuación Figura 44.

E F

G

H I

228

229

Continuación Figura 44.

J

K

230

231

Continuación Figura 44.

L

232

233

Continuación Figura 44.

Por otro lado, se encontró que las secuencias codificantes para la enzima

superóxido dismutasa (EC 1.15.1.1) con ión hierro en su sitio activo (sod-Fe), las

codificantes para las subunidades que conforman la enzima nitrilo hidratasa o

nitrilasa (EC 4.2.1.84) (genes nit1, nit2, nit3) y la codificante para la enzima

metanol oxidasa (EC 1.1.3.13), presentes en I. limosus MP06 y la cepa AU476,

podrían ser, dentro de la familia Rhodospirillaceae, exclusivas del género

Inquilinus (a pesar del gran número de genomas secuenciados que se

encuentran en los repositorios públicos). En la Tabla 17 se muestran los

porcentajes de identidad entre las secuencias de I. limosus MP06 y la cepa

AU476 (que representa el primer microorganismo con el que encuentra similitud)

y el correspondiente a la especie microbiana inmediata siguiente.

La amplificación por PCR y secuenciación de fragmentos internos de genes

implicados en el metabolismo celular (genes housekeeping) es una técnica de

análisis molecular empleada con fines epidemiológicos denominada MultiLocus

Sequence Typing (MLTS) (o MultiLocus Sequence Analysis - MLSA - cuando su

finalidad no es epidemiológica). Aunque de utilización global y difundida, para

emplear esta metodología es necesario determinar para cada especie a

estudiar cuáles son los genes housekeeping que deben ser analizados [284]. El

M N

234

método de extracción del material genético, los genes seleccionados y los

protocolos para su amplificación, adaptados para cada especie de forma

individualizada, se describen y se encuentran accesibles en la página web

http://www.mlst.net/.

Tabla 17. Porcentajes de identidad de secuencias génicas observados entre I. limosus

MP06 y los dos microorganismos que corresponden al mayor hit en los repositorios

públicos (primer match: I. limosus AU476).

Nombre del gen codificante /

Microorganismos con mayor hit

Identidad

(%)

gaps

(N°)

Bases comparadas

(N°)

sod-Fe - superóxido dismutasa

I. limosus AU476 93,1 8 613

Gluconacetobacter diazotrophicus PAI5 76,5 70 628

nit1 - nitrilasa 1

I. limosus AU476 89,8 0 660

Mesorizobium ciceri WSM1271 72,9 6 663

nit2 - nitrilasa 2

I. limosus AU476 92 6 639

Methylobacterium nodulans ORS 2060 69,3 101 636

nit3 - nitrilasa 3

I. limosus AU476 83,8 20 382

Rhodopseudomonas palustris BisB5 48,5 40 375

metanol oxidasa

I. limosus AU476 83,3 47 844

Starkeya novella DSM 506 24,3 599 848

Para I. limosus aún no existe un estudio que desarrolle este tipo de análisis para

la tipificación molecular de esta especie bacteriana, y aunque existen en

repositorios públicos numerosas secuencias depositadas de este género, a

excepción de los genomas de MP06 y AU476, todas corresponden a la

secuencia del ARNr 16S. Si bien es necesario ampliar el estudio con un mayor

número de aislamientos de I. limosus, es posible que una combinación de los

genes estudiados como los concatenados de rpoB, dnaK, parC, recA y gyrA, así

como los codificantes para la superóxido dismutasa, nitrilasas y/o metanol

oxidasa, sean útiles para el análisis por MLST/MLSA.

235

CONCLUSIONES

Durante este trabajo de tesis se estudiaron las características más relevantes

presentes en aislamientos de I. limosus como patógeno emergente en los PFQ,

desde un abordaje bioquímico y molecular. Se caracterizaron los mecanismos

asociados a la resistencia de distintas familias de antimicrobianos. Se analizaron

combinaciones estratégicas de antimicrobianos a considerar como una

posibilidad terapéutica anti-Inquilinus. Se estudió la formación de biofilm y la

presencia de determinantes génicos asociados a estrategias de evasión de la

respuesta inmunitaria.

Los resultados obtenidos han ampliado y enriquecido los conocimientos sobre

esta especie. A continuación se detallan las conclusiones más relevantes de

este trabajo:

1. Acerca de la identificación, conservación y tipificación de aislamientos

clínicos provenientes de PFQ y no FQ:

No fue posible arribar a una identificación certera de los aislamientos clínicos

con denominación “MP” mediante pruebas bioquímicas convencionales de

laboratorio, pruebas bioquímicas de galería como el sistema API® o el empleo

de equipo automatizado de identificación tipo VITEK®. Su identificación como

pertenecientes a la especie I. limosus requirió de la combinación de distintas

metodologías: espectrometría de masa (MALDI-TOF, con extracción proteica

previa a su procesamiento) y la secuencia del gen codificante del ARNr 16S. Las

diferencias porcentuales observadas en el análisis de similitud de secuencias del

ARNr 16S respecto de cepas de Inquilinus previamente caracterizadas fueron

consistentes con la variación intraespecie reportada.

Se confirmó la relación clonal de los aislamientos MP al obtener pulsotipos

indistinguibles mediante XbaI-PFGE y BcuI-PFGE lo que sugirió que el paciente se

hallaba persistentemente colonizado con la misma cepa. Además, esta cepa

236

presentó dos variantes de expresión, una variante con fenotipo mucoso y otra

con fenotipo no mucoso, atípico, sólo ocasionalmente reportado.

Del mismo modo, el aislamiento 161-13 obtenido en el Htal. de Clínicas “José de

San Martín” fue identificado como I. limosus mediante el empleo de MALDI-TOF

y el análisis de la secuencia del ARNr 16S.

Se observó que los perfiles proteicos totales de los aislamientos “MP” y 161-13,

analizados por SDS-PAGE, resultaron indistinguible entre sí respecto del

presentado por la cepa tipo de I. limosus independientemente de la variante

(mucosa/no mucosa), y todos resultaron distinguibles del perfil observado para

Inquilinus sp. LMG 20953.

Se observó que el congelamiento de I. limosus a -20°C en caldo BHI con glicerol

20% (v/v) como agente crioprotector resultó ser un método adecuado para

períodos cortos de conservación (menos de 1 año). Mientras que la utilización

de leche descremada en polvo en concentración final 10 % (p/v) almacenados

a -20°C permitió la recuperación del microorganismo durante un periodo de 36

a 42 meses. El supercongelamiento a -196°C resultó ser el mejor método de

preservación, independientemente del crioprotector empleado [glicerol 20%

(v/v) o leche 10 % (p/v)], con un tiempo de preservación de, al menos, 66

meses.

2. Acerca de la caracterización de los mecanismos responsables de la

resistencia a los antibióticos ß-lactámicos y no ß-lactámicos:

Se observaron los perfiles de multiresistencia a antimicrobianos presentes en los

aislamientos estudiados.

Se demostró la presencia de 2 serino-ß-lactamasas, no descriptas previamente,

INQ-1 e INQ-2. La expresión de estas enzimas en E. coli mostró una disminución

en el perfil de sensibilidad frente a discos con CEF y AMP, respectivamente y

sinergia en presencia de BOR.

237

La enzima INQ-1 presentó capacidad de hidrolizar bencil-PEN, AMP, CEF, FOX,

en cambio no se detectó hidrólisis de CAZ, CRO e IMI en las condiciones

ensayadas.

INQ-2 hidrolizó eficazmente FOX, CAZ y CTX, y lentamente CEF, CFZ y FUR. No se

detectó hidrólisis de bencil-PEN, ATM, FEP ni IMI.

Se demostró que INQ-1 e INQ-2 son enzimas poco inhibidas por los inactivadores

clásicos de serino-ß-lactamasas. Ambas enzimas fueron caracterizadas como

serino-ß-lactamasas de tipo AmpC, de localización cromosómica,

pertenecientes a la clase molecular C.

Se observó una disminución de las CIM de CIP y RIF al emplear PAßN como

inhibidor de BE-RMD en I. limosus. En las condiciones ensayadas ningún IBE

modificó significativamente la CIM de los antibióticos ß-lactámicos y

aminoglucósidos. Por otro lado, al enfrentar I. limosus MP06 a los EBE como SAL y

DES, en ambos casos se incrementaron en, al menos, 16 veces la CIM de AMI y

AZI.

Los mecanismos asociados a la resistencia aquí mencionados representan la

única descripción confirmada en I. limosus, así como el primer reporte de la

presencia de ß-lactamasas en esta especie bacteriana.

Finalmente, se determinó la velocidad de muerte in vitro de I. limosus (cultivo

planctónico) en presencia de combinaciones estratégicas de antimicrobianos.

Se demostró que la combinación antimicrobiana IMI+CIP (0,25 y 1 µg/ml)

presentó sinergia antimicrobiana, a sólo 6 h de iniciado el ensayo y sin

detectarse recrecimiento a las 48h en las condiciones ensayadas. Por otro lado,

la presencia de AZI (2 µg/ml) ocasionó la pérdida del efecto bactericida que

IMI (0,25 µg/ml) había mostrado durante el estudio de letalidad.

238

3. Acerca de la presencia de biofilm y su implicancia clínica:

Al evaluar la formación de biofilm en los aislamientos de I. limosus se observó

que en ausencia de antimicrobiano, los aislamientos no mucosos resultaron

formar una biomasa entre 2 y 3 veces mayor al formado por los aislamientos

mucosos. Aunque la biomasa formada por los aislamientos no mucosos no fue

afectada por la presencia de concentraciones subinhibitorias de COL y TOB,

estos aislamientos formaron una biomasa mayor que los aislamientos mucosos.

Respecto de los aislamientos con fenotipo mucoso se detectó un aumento de

la formación del biofilm en presencia de concentraciones subinhibitorias de

COL y TOB.

Se demostró que el biofilm presenta una alta viabilidad remanente (CMR > 64

µg/ml) luego de ser sometido a elevadas concentraciones de AZI, IMI, TOB y

COL, independientemente del fenotipo que presente la variante. No fue posible

erradicar los biofilms in vitro formados por ambas variantes para ninguno de los

antimicrobianos ensayados (CMEB >2048 µg/ml). Por lo que la formación de

biofilm podría considerarse como un importante factor de virulencia para este

microorganismo.

El empleo de CIP no sólo afectó el desarrollo de la población planctónica

formada por la disrupción del biofilm, sino también la viabilidad del biofilm en

ambas variantes fenotípicas de I. limosus (CIM-b y CMR, ambas 1 µg/ml).

4. Acerca del genoma:

Se realizó la secuenciación del 99,8% del genoma de I. limosus MP06 con una

alta cobertura de lectura, estimada en 21 veces. Se efectuó la anotación

funcional y el depósito de la secuencia mediante un proyecto de WGS. Se

analizaron eficazmente las características generales más relevantes de este

genoma desde el aspecto bioinformático.

239

Respecto de los determinantes génicos asociados a la resistencia a

antimicrobianos, se logró detectar la presencia de, al menos, 2 genes

codificantes de serino-ß-lactamasas denominados blaINQ-1 y blaINQ-2, ambos con

actividad funcional demostrada en este trabajo. Se descartó la presencia de

genes reguladores de su expresión localizados corriente arriba. El análisis de la

secuencia traducida de blaINQ-1 indicó una importante divergencia respecto de

otras ß-lactamasas de clase C.

También se detectó la presencia de 1 arreglo génico del sistema de eflujo

MacA-B de la Superfamilia ABC (macA, macB, nodT) y 2 arreglos génicos

completos de BE-RMD pertenecientes a la familia RND: un operón CmeABC

(cmeA, cmeB, ATPase AAA Family) y un arreglo AcrA-B, NodT.

La minería de datos realizada permitió generar nuevas hipótesis acerca del

papel patogénico de Inquilinus como un microorganismo con múltiples

determinantes génicos vinculados a la evasión del sistema inmune adaptativo,

y principalmente a la sobrevida intracelular.

Se encontraron las CDS de transportadores de moléculas reguladoras de la

formación de biofilm (como transportadores de AHL, ramnolípidos y AI-2),

además de los arreglos génicos de las BE de la familia RND ya mencionados,

implicados en el transporte de AHL.

Se confirmó la ubicación taxonómica de I. limosus MP06 al obtener topologías

coincidentes en las reconstrucciones filogenéticas realizadas con genes

alternativos al ARNr 16S, como gyrB, gyrA, recA, rpoD, fusA, parC, dnaK, groEL,

groES y rpoB, y el concatenado génico de rpoB, dnaK, parC, recA y gyrA.

En este trabajo se encontró que las CDS para las enzimas superóxido dismutasa

(EC 1.15.1.1) (sod-Fe), subunidades de la enzima nitrilo hidratasa o nitrilasa (EC

4.2.1.84) (genes nit1, nit2, nit3) y metanol oxidasa (EC 1.1.3.13), presentes en I.

limosus MP06 y la cepa AU476, podrían ser, dentro de la familia

240

Rhodospirillaceae, exclusivas del género Inquilinus (ausentes en el gran número

de genomas secuenciados y depositados).

De este trabajo se desprende que los mecanismos asociados con la

multiresistencia a antimicrobianos y la capacidad para formar biofilms, le

permiten a I. limosus establecerse provocando la colonización/infección

recalcitrante al tratamiento antimicrobiano que conlleva a una situación de

difícil erradicación.

241

RESUMEN

La fibrosis quística (FQ) es una enfermedad hereditaria que provoca la

presencia de secreciones espesas, por ejemplo en las vías aéreas. Estas

obstrucciones favorecen la aparición de infecciones bacterianas pulmonares,

crónicas y recurrentes, que conducen a un rápido deterioro de la función

respiratoria y que representan la principal causa de morbi-mortalidad en estos

pacientes. La epidemiología asociada es cambiante y da lugar a la

emergencia de especies bacterianas oportunistas que no habían sido

previamente asociadas a la FQ, como Inquilinus limosus.

Luego que I. limosus se describiera en 2002, comenzaron a surgir reportes

mencionando colonizaciones/infecciones [especialmente pacientes con FQ

(PFQ)], observándose sistemáticamente la dificultad para recuperar e identificar

al microorganismo de las muestras respiratorias, la presencia de un perfil de

multirresistencia a antimicrobianos con pocas opciones terapéuticas y su difícil

erradicación que conduce a la persistencia en estos pacientes. En Inquilinus

existe un desconocimiento absoluto acerca de los mecanismos de resistencia

que pudieran estar asociados a la misma.

El objetivo general de este trabajo fue abordar estos interrogantes, aportar

información para caracterizar a I. limosus como patógeno oportunista

emergente en los PFQ y conocer su implicancia, al abordar el estudio

bioquímico y molecular con muestras procedentes del ámbito hospitalario.

Se arribó a la identificación certera de los aislamientos MP y 161-13,

combinando el análisis de la secuencia del ARN 16S y la espectrometría de

masa por MALDI-TOF.

Las reconstrucciones filogenéticas realizadas con genes alternativos al ARNr 16S

(como gyrB, gyrA, recA, rpoD, fusA, parC, dnaK, groEL, groES y rpoB)

confirmaron la situación taxonómica del aislamiento MP06. Otros genes (como

sod-Fe, nit1, nit2, nit3, etc.) podrían ser, dentro de la familia Rhodospirillaceae,

242

exclusivas del género Inquilinus. En su conjunto se presentan como una opción

de identificación molecular.

Mediante PFGE se confirmó que el PFQ del cual provenían aislamientos seriados

con denominación “MP” recuperados durante el período 2006-2013 se hallaba

persistentemente colonizado con la misma cepa, la cual presentó dos variantes

de expresión (mucoso y no mucosa - sólo ocasionalmente reportado-).

La secuenciación del 99,8% del genoma de I. limosus MP06 con una alta

cobertura de lectura (21X) permitió detectar la presencia de numerosos

determinantes génicos asociados a la resistencia a antimicrobianos.

Respecto a la resistencia mediada por enzimas, se hallaron los genes blaINQ-1 y

blaINQ-2 ambos con actividad funcional demostrada en este trabajo,

codificantes para 2 serino-ß-lactamasas, no descriptas previamente, INQ-1 e

INQ-2, respectivamente. Al estudiar su secuencia y los principales parámetros

cinéticos, ambas enzimas fueron caracterizadas como ß-lactamasas de tipo

AmpC cromosómicas pertenecientes a la clase molecular C, con diferentes

afinidades por los sustratos ß-lactámicos y sin genes reguladores de su expresión

localizados corriente arriba. Además, mostraron ser poco inhibidas por los

inactivadores clásicos de serino-ß-lactamasas.

Respecto de los mecanismos de resistencia asociados a bombas de eflujo de

resistencia a múltiples drogas (BE-RMD), se detectó la presencia de 1 arreglo

génico del sistema de eflujo MacA-B de la Superfamilia ABC (macA, macB,

nodT) y 2 arreglos génicos completos de BE pertenecientes a la familia RND: un

operón CmeABC (cmeA, cmeB, ATPase AAA Family) y un arreglo AcrA-B, NodT.

Aunque en las condiciones ensayadas ningún inhibidor de BE modificó

significativamente la CIM de los antibióticos ß-lactámicos y aminoglucósidos, se

registró que el PAßN provocaba una disminución de las CIM de CIP y RIF. Por

otro lado, en presencia de estimuladores de BE se observó un incremento de, al

menos, 16 veces la CIM de AMI y AZI.

243

La minería de datos realizada sobre la secuencia de MP06 permitió general

nuevas hipótesis acerca del papel patogénico de I. limosus como un

microorganismo con múltiples determinantes génicos vinculados a la evasión

del sistema inmune adaptativo, y principalmente a la sobrevida intracelular.

Respecto a la formación de biofilm se encontraron secuencias codificantes

para transportadores de moléculas reguladoras de la formación de biofilm por

quórum sensing, además de los arreglos génicos de las BE de la familia RND ya

mencionados. En ensayos in vitro se detectó un efecto agonista sobre la

formación en aislamientos mucosos en presencia de sub-CIM de COL y TOB. Por

otro lado, los aislamientos no mucosos resultaron formar una biomasa entre 2 y 3

veces mayor al formado por los aislamientos mucosos y el acumulo formado no

fue afectada por la presencia de sub-CIM de COL y TOB. Luego de ser sometido

a elevadas concentraciones de diversos antimicrobianos el biofilm presentó una

elevada viabilidad remanente y no fue posible erradicarlo con ninguno de los

antimicrobianos de uso frecuente en PFQ (CMEB >2048 µg/ml), por lo que podría

considerarse como un importante factor de virulencia para este

microorganismo.

Estudios realizados sobre la velocidad de muerte in vitro de I. limosus (cultivo

planctónico) frente a combinaciones estratégicas de antibióticos indicaron que

la combinación IMI+CIP (0,25 y 1 µg/ml) presentó sinergia antimicrobiana, a sólo

6 h de iniciado el ensayo y sin detectarse recrecimiento a las 48h. En forma

congruente, CIP afectó el desarrollo de la población planctónica formada por

la disrupción del biofilm y la viabilidad del biofilm en ambas variantes

fenotípicas de I. limosus (CIM-b y CMR, ambas 1 µg/ml).

Por sus mecanismos asociados con la resistencia a antimicrobianos, el aumento

de la formación de biofilm que parecen ejercer ciertos antimicrobianos

usualmente empleados en los PFQ y las pocas opciones terapéuticas útiles para

su erradicación, I. limosus, se presenta como un patógeno oportunista

244

emergente, capaz de afectar a pacientes con algún grado de

inmunosupresión.

245

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260

261

262

263

ANEXO I – Microorganismos y medios de cultivo utilizados

Tabla 18. Descripción y procedencia de los microorganismos utilizados

Aislamiento Descripción Referencia

MP06 Aislamiento clínico. Esputo (*). 2006. Htal. de Niños “Dr. O.

Alassia” -Sta. Fe

Esta tesis

MP10 Aislamiento clínico. Esputo (*). 2010. Htal. de Niños “Dr. O.

Alassia” -Sta. Fe

Esta tesis

MP12 Aislamiento clínico. Esputo (*). 2012. Htal. de Niños “Dr. O.

Alassia” -Sta. Fe

Esta tesis

MP13-M Aislamiento clínico. Esputo (*). 2013. Htal. de Niños “Dr. O.

Alassia” -Sta. Fe

Esta tesis

MP13-NM Aislamiento clínico. Esputo (*). 2013. Htal. de Niños “Dr. O.

Alassia” -Sta. Fe

Esta tesis

161-13 Desarrollo en hemocultivo. Se consideró contaminante.

Paciente No-FQ. Htal. de Clínicas “José de San Martín” -

CABA.

Esta tesis

I. limosus LMG 20952T Cepa tipo. Esputo. PFQ. EEUU. 1998. Nombre original: AU0476T.

Depositada en la Colección de Bacterias BCCM/LMG.

[1]

Inquilinus sp. LMG 20953 Cepa del género Inquilinus, pero no perteneciente a la

especie Inquilinus limosus. Esputo. PFQ. EEUU. Nombre original:

AU1979. Depositada en la Colección de Bacterias

BCCM/LMG.

[1]

E. coli ATCC 25922 Cepa control. Colección ATCC

E. coli ATCC 35218 Cepa control. Productora de TEM-1, ß-lactamasa de espectro

ampliado, no inducible.

Colección ATCC

E. faecalis ATCC 29212 Cepa control. Colección ATCC

S. aureus ATCC 25953 Cepa control. Colección ATCC

P. aeruginosa ATCC 27853 Cepa control. Colección ATCC

E. coli J53 Cepa control. Productora de SHV-2, ß-lactamasa de espectro

extendido

Cepario Cát.

Microbiología

E. coli 137 Cepa control. Productora de CMY-2, ß-lactamasa de

espectro extendido

Tesis doctoral de

Daniela Cejas

E. coli TOP 10 F- Cepa receptora para ensayos de transformación. Clonado

de fragmentos de ADN.

Invitrogen, EEUU

E. coli BL21(DE3) Cepa receptora para ensayos de transformación. Expresión

proteica.

Novagen, EEUU

(*): Aislamientos recuperados de un mismo paciente con fibrosis quística

Paciente No FQ: Paciente sin fibrosis quística

264

Medios de cultivo

1. Medio LB (Luria Bertani) Componente Cantidad

Tripteína (digerido pancreático de caseína) 10,0 g

Extracto de levadura 5,0 g

NaCl 5,0 g

NaOH 1 N 1,0 ml

Agua destilada: c.s.p. 1000 ml - pH final: 7,0

El medio sólido, agar LB (LBA) se preparó de la misma manera añadiendo 15 g/l

de agar-agar.

2. Medio 2XYT Componente Cantidad

Tripteína (digerido pancreático de caseína) 20,0 g

Extracto de levadura 10,0 g

NaCl 10,0 g

NaOH 1 N 1,0 ml

Agua destilada: c.s.p. 1000 ml - pH final: pH 7,0

3. Otros medios de cultivo utilizados

Los demás medios de cultivo empleados en este trabajo de tesis fueron

adquiridos en Laboratorios Britania SA. Su composición puede consultarse en el

portal web de la empresa http://www.britanialab.com/productos.php.

Proveedores comerciales de componentes:

NaCl (calidad analítica) e NaOH (lentejas): Anedra S.A., Bs. As. Argentina.

Tripteína y Extracto de levadura: Laboratorios Britania S.A.

265

ANEXO II – Tinciones

1 Tinción de Gram

1) Sobre un portaobjetos se distribuyó una ansada de cultivo. En el caso de que

el cultivo procediera de un medio sólido, el extendido se preparó distribuyendo

la ansada de cultivo con unas gotas de agua. Se dejó secar el extendido a

temperatura ambiente y posteriormente se procedió a fijarlo por calor utilizando

un mechero [136].

2) Se agregó una solución de cristal violeta o violeta de genciana y se esperó

durante 1 min. Se enjuagó con agua y se escurrió el excedente.

3) Se agregó una solución de lugol (el mordiente) y se dejó durante 1 min. Se

enjuagó con agua y se escurrió el excedente.

4) Se agregó una mezcla de alcohol: acetona (70:30 v/v) y se dejó durante 10 s.

Se enjuagó con agua y se escurrió el excedente.

5) Se agregó una solución de safranina como colorante de contraste y se

esperó durante 1 min. Se enjuagó con agua y se escurrió el excedente.

6) Se procedió a la observación del preparado con objetivo de 40x y

posteriormente con objetivo de inmersión. Las bacterias gram negativas se

observaron de color rosado-rojizo, en tanto las gram positivas se observaron

color violeta.

2 Tinción de Duguid (para cápsula)

1) Se colocó sobre un portaobjetos una ansada de tinta china y se procedió a

mezclarla con una ansada de cultivo puro del microorganismo. Luego se

colocó un cubreobjetos de vidrio la mezcla, de manera tal que sólo una parte

de la misma quede cubierta [136].

2) Se presionó firmemente hacia abajo el cubreobjetos, hasta observar que el

contenido es de color sepia.

3) Al examinar el preparado con el microscopio óptico se observó que las

cápsulas aparecen como zonas claras alrededor del organismo refractantes y

contra el fondo negro parduzco lleno de partículas de tinta china.

266

3 Tinción de Hiss (para cápsula)

1) Se colocó sobre un portaobjetos unas gotas de solución acuosa al 1% (p/v)

de cristal violeta y se procedió a mezclarla con una ansada de cultivo puro del

microorganismo desarrollado en leche descremada. Se dejó secar al aire

durante 2 min y posteriormente se aplicó solo un poco de calor con un mechero

(flameado brevemente 1 vez) [136].

2) Se lavó el cristal violeta con una solución acuosa al 20% (p/v) de sulfato de

cobre y se dejó secar.

3) Se examinó el preparado con el microscopio óptico utilizando el objetivo de

inmersión. Las cápsulas aparecen de color celeste y los organismos aparecen

de color rojizo oscuro.

267

ANEXO III – Protocolos experimentales

1 Preparación de geles de SDS- PAGE y buffers

Tabla 19. Mezcla de polimerización para SDS-PAGE (12%)

Reactivo

Gel de apilamiento

o stacking (6%)

Volumen (ml)

Gel separador o

running (12%)

Volumen (ml)

Acrilamida 29,2%/Bisacrilamida 0,8% [(p/v)] 2,0 6,0

Buffer separador o running (4X) - 5,0

Buffer de apilamiento o stacking (4X) 2,5 -

Agua destilada 5,3 8,8

Persulfato de amonio NH4S2O8 10% (p/v) 0,1 0,2

TEMED (N,N,N,N’-tetrametilendiamina) 0,01 0,02

Composición de buffers para realizar SDS-PAGE

● Buffer separador o running (4X): 1,5 M Tris-HCl, 0,4% SDS (p/v), pH 8,8

● Buffer de apilamiento o stacking (4X): 0,5 M Tris-HCl, 0,4% SDS (p/v), pH 6,8

● Buffer muestra: Tris-HCl 250 mM, pH 6,8, SDS 8% (p/v), 20% 2-ß-mercaptoetanol

(v/v), 0,008% azul de bromofenol (p/v), 40% glicerol (v/v).

2 Composición del buffer salino PBS para el lavado de los biofilms

Buffer PBS (20 mM, pH 7,4), NaCl 8 g/l; KCl 0,2 g/l; KH2PO4 0,2 g/l; Na2HPO4.H2O

2,9 g/l, agua destilada c.s.p. 1000 ml

3 Preparación del reactivo de Bradford para la cuantificación de proteínas

El reactivo de Bradford se preparó con 5 mg de azul brillante de Coomasie G-

250, 2,5 ml de etanol calidad analítica, 5,0 ml de ácido fosfórico calidad

analítica y agua destilada estéril en cantidad suficiente para 50 ml. Se esperó

hasta la disolución total y se filtró utilizando papel de filtro. El reactivo, de color

ámbar, se conservó refrigerado y protegido de la luz.

268

4 Extracción de ADN plasmídico por lisis alcalina (Birnboim y Doly

modificada)

a. Soluciones para extracción de ADN plasmídico (lisis alcalina)

● Solución de resuspensión; Glucosa-Tris-EDTA (buffer GTE): Glucosa 50 mM, TRIS-

HCl 25 mM, EDTA 10 mM, pH 8,0.

● Solución de lisis; NaOH 0.2N, SDS 1% Agua dest. 9,3 ml, SDS 20% 0,5 ml, NaOH

10N 0,2 ml.

● Solución de neutralización; acetato de potasio 3 M (pH 4,8) acetato de

potasio 5 M 60,0 ml, ác. acético glacial 11,5 ml, agua 28,5 ml. La solución final

es 3 M en potasio y 5 M en acetato.

b. Protocolo para la extracción de ADN plasmídico por lisis alcalina

1) Se inoculó 5 ml de caldo LB (en presencia del antibiótico ß-lactámico

apropiado). Se incubó durante 18 h a 37ºC.

2) Se centrifugó de 1,5 a 3,0 ml de cultivo en microcentrífuga a máxima

velocidad (~13000 r.p.m.), durante 1 min. Se removió el sobrenadante

completamente por aspiración con pipeta automática.

3) Se resuspendió completamente el sedimento celular en 100 l de buffer GTE

mediante un agitador tipo vórtex. Luego se dejó en reposo por 5 min a

temperatura ambiente.

4) Se agregaron 200 l de solución de lisis (NaOH 0,2 N - SDS 1%, se prepara en el

momento). Se mezcló por inversión y se dejó en hielo por 5 min. El SDS

desnaturaliza proteínas y el NaOH desnaturaliza ADN cromosomal y plasmídico.

NOTA: Esta solución no puede ser almacenada debido a la perdida de la alcalinidad, por lo

que debe prepararse en el momento de utilizarse o bien partir de una solución sobresaturada

de NaOH Sörensen ~ 19 N.

5) Se agregaron 150 l de solución de acetato de potasio 3 M o acetato de

amonio 5 M, pH 4,8 a cada tubo en hielo. En este paso se neutraliza la mezcla

de reacción y se favorece la renaturalización rápida del ADN plasmídico. Se

mezcló por inversión suavemente 10 veces. Se dejó en hielo por 5 min.

6) Se centrifugó durante 10 min como en el punto 1, para eliminar restos

celulares y ADN cromosomal.

7) Se colocó 0,7 volúmenes (aprox. 260 l) de isopropanol en un tubo limpio. Se

transfirió el sobrenadante (aprox. 380 l) al tubo conteniendo isopropanol

evitando todo grumo o parte del precipitado. Sin invertir, se dejó reposar a

temperatura ambiente durante 30 min.

269

8) Se centrifugó durante 10 min a máxima velocidad.

9) Se descartó el sobrenadante y se invirtió el tubo sobre papel absorbente. Se

secó el sedimento durante 15 min en desecador.

10) Se resuspendió el sedimento en 30 l de agua Milli Q estéril o buffer TE, pH

7,5.

11) La solución obtenida se resolvió electroforéticamente en geles de agarosa

al 0,8-1% frente a marcadores de tamaño molecular.

5 Extracción de plásmidos de alto tamaño molecular (megaplásmidos) y/o

bajo número de copias: técnica de Hansen-Olsen

1) Se inocularon 50 ml de caldo LB con 5 a 6 colonias de un cultivo puro de las

cepas correspondientes, suplementando con el antibiótico adecuado. Se

incubó a 35-37ºC durante overnight.

2) Las células se centrifugaron a 10.000 r.p.m. durante 30 min, a temperatura

ambiente (se utilizó un rotor Sorvall SS34).

3) Se descartó el sobrenadante y las células fueron resuspendidas en 10 ml de

buffer de fosfatos 10 mM, pH 7,0. Se centrifugó durante 20 min como en el paso

2.

4) Se descartó el sobrenadante y los sedimentos celulares fueron resuspendidos

en 1,35 ml de sacarosa 25% p/v previamente preparada con solución de Tris 50

mM, pH 8,0 a temperatura ambiente. La resuspensión se realizó utilizando un

agitador tipo vórtex a máxima velocidad.

5) Se agregaron 0,1 ml de lisozima (10 mg/ml previamente preparada en Tris 25

mM, pH 8,0). Se mezcló 5 veces por inversión suave y se colocó en hielo durante

5 min.

6) Se adicionaron 0,5 ml de solución de EDTA 25 mM, pH 8,0. Se invirtió

suavemente el tubo 5 veces y se incubó en baño de hielo durante 5 min.

7) Luego se añadió SDS al 20% p/v (preparado previamente en buffer TE: Tris 50

mM, EDTA 5 mM, pH 8,0) hasta alcanzar una concentración final de SDS de 4%.

Se incubó durante 15 s en baño de agua a 55ºC. Se retiró y se mezcló

suavemente por inversión durante 15 s (5 inversiones). Se repitió este

procedimiento siete veces más (ocho ciclos en total).

270

8) Se adicionaron 0,5 ml de NaOH 3 N y se mezcló de inmediato por inversión

durante 3 min (~ 20 inversiones /min).

9) Se agregó 1 ml de Tris 2 M, pH 7,0 en dos alícuotas. Agregar cada alícuota

luego de 30 s de inversión (~ 20 inversiones/min).

10) Para realizar la remoción de los complejos membrana – cromosoma se

añadió SDS al 20% p/v (preparada en buffer TE pH 8,0 como se indicó en el paso

“7” hasta concentración final de SDS de 4 %, seguido de la adición de NaCI 5 M

para alcanzar la concentración final de NaCI 1 M. Mezclar por inversión (~ 20

inversiones/min). Luego de mezclar los tubos, se colocaron en baño de hielo y

se refrigeraron a 4ºC durante un periodo de 6 h a 18 h.

8) Posteriormente, se centrifugó a 12.000 r.p.m. durante 30 min en centrifuga

refrigerada a 4ºC, con rotor Sorvall SS34. Se trasvasó el sobrenadante a tubos

cónicos pre-enfriados a 4º C. Se colocó en baño de hielo, y con el objetivo de

concentrar el ADN se agregó el volumen necesario de PEG 6000 al 42% p/v

(previamente preparado en buffer de fosfatos 10 mM, pH 7,0), para obtener

una solución de PEG al 10%. Se refrigeraron los tubos a 4º C durante un periodo

de 6 h a 18 h.

9) Se realizó una centrifugación a 8.000 r.p.m. durante 20 min en centrifuga

refrigerada a 4ºC, con rotor Sorvall SS34. Los sedimentos se resuspendieron en

150 µl de buffer TES previamente enfriado (Tris 50 mM, EDTA 5 mM, NaCI 50 mM,

pH 8,0). La solución obtenida se sometió a electroforesis en geles de agarosa

para evaluar la cantidad y calidad del ADN obtenido.

271

6 Vectores de clonado

Figura 45. Vectores empleados. Se observa en detalle los sitios de restricción que

presenta cada vector. A. Vector de clonado molecular pK19. B. Vector de clonado de

expresión pET-28b(+)

A

B

272

7 Protocolo de ligación

Los fragmentos de ADN (ADN genómico o amplicones de PCR, previamente

digeridos con endonucleasas de restricción) fueron clonados en los vectores

pK19 y pET-28b(+), respectivamente. Previamente estos vectores fueron

digeridos, defosforilados (para evitar su re-circularización y purificados. Para

realizar en forma enzimática esta unión de los fragmentos se utilizó la enzima T4

ADN ligasa (Roche, Fermentas), conforme a las sugerencias los fabricantes. La

mezcla de ligación detallada a continuación se incubó durante 1 h a 22°C, y

luego de inactivó durante 20 min a 65°C, para mejorar la eficiencia de

transformación. Mezcla de ligación para un volumen final de 20 μl (como

máximo):

Reactivo Volumen (μl)

Vector [pK19 o pET-28b(+)] – ADN exógeno Proporción 1:4 a 1:10

Buffer 10X para enzima ligasa (Roche, Fermentas) 2

T4 ADN Ligasa (Roche, Fermentas) 1

8 Protocolo de competencia celular y transformación

a. Soluciones para inducir el estado de competencia celular

● Solución de transformación 1 (ST1): MOPS (Genbiotech) 10 mM, KCl (Merck) 10

mM, pH 7,0 ajustado con NaOH 10 M

● Solución de transformación 2 (ST2): MOPS 100 mM, KCl 10 mM, CaCl2 (Merck)

50 mM, pH 6,5 ajustado con NaOH 10 M

Las soluciones de transformación se prepararon con agua destilada

previamente esterilizada por calor húmedo a una atmósfera de sobre presión.

En tanto, luego del agregado de las sales y de ajustar a pH final, estas

soluciones se esterilizaron mediante filtración esterilizante (no pueden ser

sometidas a calor). Posteriormente se separaron alícuotas en forma aséptica y

se refrigeraron hasta su uso.

b. Protocolo para obtener células en estado de competencia

1) A partir de un cultivo overnight de la cepa deseada se realizó una dilución

1/100 en caldo LB. Luego se incubó a 37ºC en baño de agitación hasta obtener

una DO550 = 0,4-0,6.

273

2) Se distribuyó 1 ml de este cultivo en tubos estériles (un tubo por

transformación incluyendo un tubo para el control positivo y uno para el control

de viabilidad).

3) Las células fueron cosechadas mediante centrifugación a 5.000 r.p.m.

durante 5 min a temperatura ambiente. Se descartó el sobrenadante por

aspiración cuidadosa con pipeta automática.

NOTA: Los sedimentos celulares que se obtienen a lo largo de este protocolo sedimentan a baja

velocidad de centrifugación por lo que debe aspirarse el sobrenadante cuidadosamente para

no resuspender las células ni romperlas accidentalmente, y disminuir así la eficacia de

transformación de este protocolo.

4) Las células se resuspendieron en 500 µl de ST1.

5) Se centrifugó durante 5 min a 5.000 r.p.m. a temperatura ambiente. Se

descartó el sobrenadante por aspiración cuidadosa con pipeta automática.

6) Las células se resuspendieron en 500 µl de ST2.

7) Se incubó al menos 15 min a 0ºC (en hielo).

8) Se centrifugó durante 5 min a 5.000 r.p.m. a temperatura ambiente. Se

descartó el sobrenadante por aspiración cuidadosa con pipeta automática.

9) Las células se resuspendieron en 100 µl de ST2.

c. Transformación de células competentes

1) Se agregó la mezcla de ligación (3 µl).

2) Se incubó 1 hora en hielo.

NOTA: No mover el recipiente que contiene los tubos durante esa hora y luego de cumplido el

tiempo. Mover los tubos cuidadosamente al retirarlos del hielo para realizar el siguiente paso.

3) El choque térmico se realizó durante 45 s a 42ºC.

NOTA: Otra posibilidad para favorecer la transformación es realizar el choque térmico a 37°C en

baño de agua durante 5 min, en vez del descripto en el paso 3.

4) Luego se agregó 1 ml de caldo LB y se incubó como mínimo durante 1 hora a

37ºC en agitación baño de agua.

5) Finalmente, se centrifugó 5 min a 4.200 r.p.m. a temperatura ambiente y se

eliminó 1 ml de sobrenadante.

274

6) Las células fueron resuspendidas en los 100 µl restantes y el volumen total fue

sembrado en placas con LB y el sistema de selección adecuado, distribuyendo

el contenido a sembrar mediante una espátula de Drigalsky. Posteriormente las

placas se incubaron a 37 C durante 16 a 20 h.

En cada transformación se realizó un control de negativo con células

competentes sin el agregado de ADN, que servirá para verificar además la

viabilidad y un control positivo, para verificar el grado de competencia

obtenido. Se utilizó como control positivo ADN plasmídico (vector pUC-18, en

una concentración final de 10 ng/µl), o construcciones covalentemente

cerradas de mayor tamaño.

9 Determinación del pI mediante IEFA

Tabla 20. Mezcla de polimerización para IEFA no desnaturalizante

10 Longitudes de onda y coeficientes molares de extinción correspondientes

de los sustratos utilizados para las determinaciones cinéticas.

Determinación experimental de los

Se preparó la solución de cada antibiótico a ensayar en una concentración 100

µM y luego se la separó en 2 alícuotas. A una de ellas se le agregó NaOH 1 M y

se la incubó a temperatura ambiente, mientras que la otra alícuota se reservó

en la oscuridad a 8 °C. Finalizado el tiempo de incubación (de 3 h a 16 h), se

realizó el barrido espectral (entre 200 y 700 nm) de ambas alícuotas. Estas

corresponden a las fracciones hidrolizadas y no hidrolizadas del antibiótico. Se

analizó el barrido para determinar los picos de máxima absorbancia, a fin de

determinar la longitud de onda (óptima) donde mejor absorbe. Posteriormente

se realizaron diluciones seriadas de cada especie, y se determinó la

absorbancia a la longitud de onda óptima de trabajo. Se graficó la

Reactivo Volumen (ml)

Acrilamida 29,2% (p/v)/ Bisacrilamida 0,8% (p/v) 4,0

Anfolitos 3-10 (Amersham) 1,5

Agua destilada 14,2

Persulfato de amonio NH4S2O8 10% (p/v) 0,125

TEMED (N,N,N,N’-tetrametilendiamina) 0,025

275

absorbancia en función de la concentración, según la ecuación de Lambert-

Beer, donde luego se despejó el , de la siguiente forma [77]:

Abs hidrolizado= hidrolizado. b . c hidrolizado

Abs no hidrolizado= no hidrolizado. b . c no hidrolizado

siendo que = hidrolizado - no hidrolizado

que se expresa (M-1.cm-1) para una determinada longitud de onda que se

corresponde con la de máxima absorbancia.

Abs (absorbancia), es el coeficiente de extinción molar que se busca

determinar, b corresponde al paso óptico de la cubeta (en este caso, 1 cm) y c

representa la concentración de antibiótico en las alícuotas hidrolizada y no

hidrolizada a partir de una solución madre de antibiótico exactamente pesado.

Tabla 21. Longitudes de onda y coeficientes molares de extinción correspondientes de

los antibióticos utilizados para las determinaciones cinéticas.

Sustrato

PM

(g/mol)

(nm)

(M-1.cm-1)

(M-1.cm-1)

Proveedor comercial

AMP 348 235 +1860 -820 Sigma Chemical (St. Louis, USA)

Bencil-PEN 333 235 +1200 -775 Sigma Chemical (St. Louis, USA)

CEF 305 273 +7200 -6300 Laboratorios Klonal (Bs. As., ARG)

CTX 454 260 +16000 -7500 Bristol-Myers Squibb (Paris, FR)

FOX 426 260 +8250 -6600 Laboratorios Klonal (Bs. As., ARG)

CAZ 534 260 +22000 -9000 Laboratorios Klonal (Bs. As., ARG)

CRO 510 255 +10700 -7700 Laboratorios Klonal (Bs. As., ARG)

FUR 423 260 +15000 -7600 Sigma Chemical (St. Louis, USA)

IMI 312 300 +9000 -9000 Bristol-Myers Squibb (Paris, FR)

NITTM 555 485 +17500 +15000 Oxoid Ltd. (Hampshire, UK)

276

277

ANEXO IV

Oligonucleótidos cebadores y amplificación de ADN por PCR

Tabla 22. Cebadores utilizados durante el desarrollo de este trabajo de tesis

Nombre del cebador Secuencia nucleotídica 5’-3’ Tm (°C) Observación Referencia

16S-27F AGAGTTTGATCMTGGCTCAG 50-52 Secuenciación del gen codificante del ARNr 16S [285, 286]

16S-1492R GYTACCTTGTTACGACTT 47 Secuenciación del gen codificante del ARNr 16S [285, 286]

M13(-21) Forw TGTAAAACGACGGCCAGT - Secuenciación de las construcciones pK-INQ-1a, pK-INQ-1b, pK-INQ-2 A

M13/pUCRev CAGGAAACAGCTATGACC - Secuenciación de las construcciones pK-INQ-1a, pK-INQ-1b, pK-INQ-2 A

41 FORW2 AACTTCCTGGCGACCGTG 62 Secuenciación de inserto pK-INQ-1ª B

41 REV2 TCAAGCGGGGAGACCAAG 62 Secuenciación de inserto pK-INQ-1ª B

41 FORW3 TCCTGGTCTATTCCTACTCG 60 Secuenciación de inserto pK-INQ-1ª B

41 REV3 AACGACTTCCCGATGGCG 58 Secuenciación de inserto pK-INQ-1ª B

41 FORW4 GCTACACTGCGGCGAACC 60 Secuenciación de inserto pK-INQ-1ª B

41 REV4 ACACGCTGTTCGACCTGG 58 Secuenciación de inserto pK-INQ-1ª B

41 REV5 ATCCAGGCGTTGCGGCG 58 Secuenciación de inserto pK-INQ-1ª B

41 FORW5 GACTTCTTCACCCTCGGC 58 Secuenciación de inserto pK-INQ-1ª B

41 REV6 GGACATCCTGGCCGCCTCGC 70 Secuenciación de inserto pK-INQ-1ª B

41 FORW6 CGAGCTGGAGCGGATCTGG 64 Secuenciación de inserto pK-INQ-1ª B

278

Continuación Tabla 22.

41 REV7 TCTTGGACAAGGTGCCG 55 Secuenciación de inserto pK-INQ-1ª B

41 FORW7 CCAGACCCTCAGCTACG 55 Secuenciación de inserto pK-INQ-1ª B

244-FORW-EcoRI GCGATGAATTCGGTGATGGCGCGG 58 Clonado de INQ-2 en pET-28b(+) B

26-FORW-EcoRI CCCGCGAATTCCGCGGACACACCG 61 Clonado de INQ-3 en pET-28b(+) B

244-REV-XhoI-CS CGTGGCTCGAGCTCATTCACTCCG 58 Clonado de INQ-2 en pET-28b(+), con stop B

26-REV-XhoI-CS TCGGGCTCGAGCCTATGGCCGGG 61 Clonado de INQ-3 en pET-28b(+), con stop B

T7terminator GCTAGTTATTGCTCAGCGG - Secuenciación de inserto pET-INQ-2 y pET-INQ-3 A

T7promoter TAATACGACTCACTATAGGG - Secuenciación de inserto pET-INQ-2 y pET-INQ-3 A

41 REV3 AACGACTTCCCGATGGCG 58 Utilizados para amplificar blaINQ-1 B

41-FORW-EcoRI CCCGCGAATTCAGGGGGACACCAT 68 Utilizados para amplificar blaINQ-1 B

A: cebadores universales disponibles en los servicios de secuenciación

B: cebadores diseñados específicamente para este trabajo de tesis,

279

1 Secuenciación de inserto pK-INQ-1a

Figura 46. Posiciones de los oligocebadores utilizados

a) Generalidades de la amplificación de fragmentos de ADN por PCR

La técnica de PCR consiste en la amplificación de una región específica de

ADN, de forma exponencial, mediante el uso de oligonucleótidos cebadores

específicos, a partir de los cuales una enzima ADN polimerasa adiciona

nucleótidos en sentido 5’ → 3’. Las enzimas ADN polimerasas requieren Mg2+

como cofactor enzimático que debe ser aportado en la mezcla de reacción.

Como toda enzima, es biológicamente activa a una temperatura óptima

(~72°C), en el caso de las ADN polimerasas termoestables que se utilizan para

PCR (Tabla 23).

La reacción en cadena de la polimerasa se basa en la repetición de un ciclo

formado por tres etapas [198]:

1. La desnaturalización del ADN doble cadena, molde para la reacción.

Esto se realiza a altas temperaturas (93~98ºC).

2. La hibridación de los oligonucleótidos cebadores a la zona 3’

complementarias que flanquean el fragmento que queremos amplificar.

280

Para esto se disminuye la temperatura disminuye a una cercana al Tm de

los cebadores (50~65º C). La disminución de la temperatura favorece la

renaturalización del ADN por complementariedad de bases.

3. La elongación de la simple cadena por acción de una enzima ADN

polimerasa que incorpora los desoxinucleótidos fosfato presentes en el

medio en dirección 5’ → 3’, según la secuencia de la cadena molde.

Algunas variantes de la convencional PCR que se realizaron

durante este trabajo de tesis son:

PCR con Hot Start: en algunos casos, para disminuir la formación de

amplicones inespecíficos durante la reacción se adicionó la enzima

polimerasa luego del primer paso de desnaturalización del ADN molde

[287].

Touchdown-PCR: la finalidad es favorecer en un principio la hibridación

de los cebadores al AND molde, para luego disminuir la formación de

secuencias no específicos, enriqueciendo el producto en el amplicón

deseado [199]. En la Tabla 24 se muestra un programa general de

amplificación de ADN por Touchdown-PCR.

Nested-PCR o PCR anidada: el producto de una amplificación es utilizado

como molde para realizar una segunda amplificación [200].

Tabla 23. Programa general para la amplificación de fragmentos de ADN por PCR

Etapa Temperatura (°C) Tiempo

(min)

Desnaturalización inicial 95 5

Ciclos consecutivos de:

1- desnaturalización del ADN molde

2- hibridación de los cebadores al ADN molde

3- elongación del amplicón

95

T =[(Tm – (3~5)°C] (a)

72 (b)

1

1

(c)

Extensión final 72 (b) 10

(a) La temperatura de hibridación de los cebadores en cada ciclo se determinó como 3- 5 °C

por debajo del menor Tm (melting temperature, o temperatura de fusión) del par de cebadores

utilizados excepto cuando en bibliografía se indicara otra temperatura como la recomendada.

(b) La temperatura de elongación del amplicón dependió del tipo de enzima polimerasa

utilizada y marca, utilizando la temperatura óptima recomendada por el fabricante.

(c) Los tiempos de elongación se determinaron de acuerdo a las diferentes velocidades de

avance de las enzimas polimerasas. Se utilizó la información provista en el inserto del proveedo

281

Tabla 24. Programa general de amplificación de fragmentos de ADN por Touchdown-

PCR

(a) La temperatura de hibridación de los cebadores en cada ciclo se determinó como + 5

~8°C alrededor del Tm de los cebadores utilizados. La reacción es más inespecífica en la primer

etapa, sin embargo efecto es deseado para favorecer la unión de los cebadores a la región

que se desea amplificar. El ejemplo [(63~59)°C ] - 0,28 °C por ciclo], indica que las etapas de

hibridación comenzarán con 63°C, y que a cada ciclo la temperatura de hibridación disminuirá

en 0,28 °C, de forma tal de llegar en 14 ciclos a una tempratura de hibridación de 59°C. (b) La

temperatura de elongación del amplicón dependió del tipo de enzima polimerasa utilizada y

marca, utilizando la temperatura óptima recomendada por el fabricante. (c) Los tiempos de

elongación se determinaron de acuerdo a las diferentes velocidades de avance de las enzimas

polimerasas. Se utilizó la información provista en el inserto del proveedor. (d) La temperatura de

hibridación de los cebadores en este programa debe ser ajustada para que no ocurra reacción

inespecífica en esta segunda etapa, y enriquecer el producto de PCR en el amplicón deseado.

Por lo general, en estas reacciones de PCR se utilizan 2 pares de cebadores (no

necesariamente).

Etapa Temperatura (°C) Tiempo

(min)

Desnaturalización inicial 95 5

ETAPA 1

Aprox. 14 ciclos consecutivos de:

1-desnaturalización del ADN molde

2-hibridación de los cebadores al ADN

molde

3-elongación del amplicón

95

[(63~59)°C ] - 0,28 °C por ciclo] (a)

72 (b)

1

1

1(c)

ETAPA 2

Aprox. 30 ciclos consecutivos de:

1-desnaturalización del ADN molde

2-hibridación de los cebadores al ADN

molde

3-elongación del amplicón

95

56 (d)

72 (b)

1

1

1(c)

Extensión final 72 (b) 10

282

b) Amplificación del gen ARNr 16S de los aislamientos estudiados por PCR

Tabla 25. Mezcla de reacción para la amplificación del gen ARNr 16S por PCR

(volumen final = 25 µl)

Tabla 26. Programa de ciclado para la amplificación del gen ARNr 16S por PCR

Reactivo Volúmen (l)

Agua Milli Q 5,1

Buffer 10X (Invitrogen) 2,5

MgCl2 (50 mM) (Invitrogen) 1,2

16S-27F (10μM) (Invitrogen) 2,5

16S-1492R (10μM) (Invitrogen) 2,5

Deoxinucleótidos trifosfato (10 mM) (Invitrogen) 1,0

ADN genómico (lisis de colonia) 10,0

Con hot start - Taq polimerasa 5 U/ml (Invitrogen) 0,2

N° paso T (°C) Tiempo

1 98 5 min

2 54 15 min agregar enzima Taq polimerasa a los 6 min

3 72 6 min

4 94 45 s

5 54 45 s

6 72 1 min 30 s repetir desde el paso 4 por 34 veces

7 72 20 min

283

c) Amplificación de los genes blaINQ-2 y blaINQ-3

Tabla 27. Mezcla de reacción para la amplificación de blaINQ-2 y blaINQ-3 (v. final = 50 µl)

Reactivo

Volúmen (l)

blaINQ-2

Volúmen (l)

blaINQ-3

Agua Milli Q 9,2 26,8

Buffer de reacción 10 X con MgCl2 (Inbio Highway) 5,0 5,0

Solución Enhancer 5 X (Inbio Highway) 20,0 2,5

F (10μM) (Invitrogen) 5,0 5,0

R (10μM) (Invitrogen) 5,0 5,0

Deoxinucleótidos trifosfato (10 mM) (Invitrogen) 3,0 3,0

ADN molde (*) 2,0 2,0

Con hot start –polimerasa LHF (2500 U/ml) (Inbio Highway) 0,8 0,8

La solución enhancer 5 X se utiliza como adyuvante de reacción para amplificar ADN con alto

porcentaje GC o estructura compleja.

Para amplificar blaINQ-2 y para realizar el Programa 1 para la amplificación de blaINQ-3: (*) ADN

genómico extracción de kit - dilución 1/10.

Para realizar el Programa 2 para la amplificación de blaINQ-3: (*) banda amplificada con el

programa 1 se purificó desde el gel de agarosa.

Tabla 28. Programa Touchdown-PCR utilizado para la amplificación del gen blaINQ-2

N° paso T (°C) Tiempo

1 98 5 min

2 95 1 min 30 s Agregar la enzima ADN polimerasa

3 67 1 min (-0,42°C/ciclo)

4 72 45 s Repetir desde el paso 2, 19 veces

5 95 1 min 30 s

6 62 1 min

7

8

72

72

45 s

10 min

Repetir desde el paso 5 por 15 veces

284

Tabla 29. Programas 1 y 2 de Nested-PCR para la amplificación del gen blaINQ-3

Programa 1

N° paso T (°C) Tiempo

1 98 5 min

2 95 1 min Agregar la enzima ADN polimerasa

3 65 45 s

4 72 45 s Repetir desde el paso 2 por 35 veces

5 72 10 min

Se purificó desde el gel de agarosa el amplicón obtenido y se lo utilizó como molde

para el próximo programa de ciclado.

Programa 2 (Nested)

N° paso T (°C) Tiempo

1 98 5 min

2 95 1 min 30 s Agregar la enzima ADN polimerasa

3 65 1 min

4 72 45 s Repetir desde el paso 2 por 35 veces

5 72 10 min

285

ANEXO V - Producción científica

La mayor parte de los resultados obtenidos acerca de I. limosus se han

presentado en distintos congresos dando lugar a la siguiente producción

científica.

PUBLICACIONES

INQ-1, a chromosome-encoded AmpC ß-lactamase from Inquilinus limosus. M. Pino, P. Power,

G. Gutkind, J. Di Conza. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, Febrero 2014, p. 560-562, Vol.

69, No. 2.

Draft genome sequence of Inquilinus limosus strain MP06, a multidrug-resistant clinical isolate. M.

Pino, J. Di Conza, G. Gutkind. Aceptado en Julio 2015 para su publicación en el Brazilian Journal

of Microbiology, Vol. 46, No. 4.

PRESENTACIONES A CONGRESOS NACIONALES e INTERNACIONALES

1. Inquilinus limosus: Biofilm formation in presence of sub-minimal inhibitory concentration of

antibiotics - M. Pino, M. Baroni, F. Meneghetti, G. Gutkind, J. Di Conza - 54to. ICAAC -

Interscience Conference on Antimicrobial Agents and Chemotherapy. Organizado por la

American Society of Microbiology. Washington, DC, USA. 5 al 9 de Septiembre 2014. Formato

gráfico.

2. Efecto de los antibacterianos sobre la formación de biopelícula en un aislamiento clínico

de Inquilinus limosus - M. Pino, M. Baroni, F. Meneghetti, G. Gutkind, J. Di Conza - XIII

Congreso Argentino de Microbiología (CAM)- Organizado por la Asociación Argentina de

Microbiología, 23 al 26 de Septiembre del 2013. Formato gráfico.

3. Exploración de bombas de eflujo en un aislamiento clínico de Inquilinus limosus- M. Pino,

J. Di Conza, G. Gutkind - XIII CAM - CABA del 23 al 26 de Septiembre del 2013. Formato

gráfico.

4. A novel chromosomal class C ß-lactamase in Inquilinus limosus - M. Pino, J. Di Conza, G.

Gutkind - 53er. ICAAC - Denver, CO, USA. 10 al 13 de Septiembre 2013. Formato gráfico.

5. Identification of penicillin-binding proteins (PBPs) in Inquilinus limosus - J. Di Conza, M.

Pino, G. Gutkind, J. Ayala Serrano - 5th Congress of European Microbiologists. Organizado

por la Federation of European Microbiological Societies (FEMS). Leipzig, Germany, 21 al 25 de

Julio 2013. Formato gráfico.

6. INQ-1: Preliminary Characterization of a ß-lactamase from Inquilinus limosus - M. Pino, P.

Power, M. Ruggiero, J. Di Conza, G. Gutkind.-52do. ICAAC - San Francisco, CA, USA. 9 al 12

de Septiembre 2012. Formato: Presentación oral. Realicé la presentación oral bajo la

supervision del Dr. Gutkind.

7. Putative Mechanism of Resistance Detection of Inquilinus limosus by a Full Genome

Sequencing Approach - M. Pino, J. Di Conza, S. Revale, G. Gutkind - 52do. ICAAC - San

Francisco, CA, USA. 9 al 12 de Septiembre 2012. Formato gráfico.

8. Identification of a supossed Inquilinus limosus ß-lactamase - M. Pino, G. Gutkind, J. Di

Conza - 50mo. ICAAC - Boston, MA, USA. Septiembre 2010. Formato: Presentación oral.