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INDICE

INDICE 1 1. INTRODUZIONE 2 1.1 LA POLIDIPSIA PSICOTICA 2 PARTE PRIMA 5 2. POLIDIPSIA SPERIMENTALE 6 3. POLIDIPSIA E DISTRUZIONE DELLA PREPULSE INHIBITION: BASI NEUROBIOLOGICHE E CORRELATI BIOCHIMICI 7 4. RISULTATI 10 4.1 Esperimento 1: Interazione farmacologica di aloperidolo e clozapina sulla polidipsia indotta da QNP 10 4.2 Esperimento 2a: Distruzione della prepulse inhibition indotta dal QNP 13 4.3 Esperimento 2b: Effetto della clozapina sulla polidipsia e sulla distruzione della prepulse inhibition indotte da QNP 15 4.4 Esperimento 2c: Effetto del QNP e della clozapina sull’espressione genica di c-Fos, BDNF e recettori D2 19 5. DISCUSSIONE 22 PARTE SECONDA 27 6. POLIDIPSIA E COMPONENTE COMPULSIVA 28 7. RUOLI OPPOSTI DEI SISTEMI DOPAMINERGICO ED ORESSINERGICO 30 8. RISULTATI 32 8.1 Esperimento 1a: L’aloperidolo previene la polidipsia indotta da QNP 32 8.2 Esperimento 1b: Gli animali polidipsici esibiscono un comportamento dissipativo nel contesto operante 35 8.3 Esperimento 1c: Effetto dell’interazione aloperidolo/QNP sull’accesso operante all’acqua 36 8.4 Esperimento 1d: Effetto dell’interazione aloperidolo/QNP sull’attività locomotoria 39 8.5 Esperimento 2: Il trattamento ripetuto con QNP aumenta l’espressione di OxA nella corteccia 42 8.6 Esperimento 3: L’SB-334867 potenzia la polidipsia indotta da QNP 45 9. DISCUSSIONE 46 PARTE TERZA 54 10. CONTRAFREELOADING INDOTTO DA QNP: MODELLO SPERIMENTALE DI COMPORTAMENTO COMPULSIVO 55 11. RISULTATI 58 11.1 Interazione tra aloperidolo e QNP 58 11.2 Interazione tra aripiprazolo e QNP 63 11.3 Interazione tra clomipramina e QNP 66 12. DISCUSSIONE 69 PARTE QUARTA 77 13. RECETTORI D3 E 5HT2c: RUOLO NELLA POLIDIPSIA E NEL CONTRAFREELOADING 78 14. RISULTATI 81 14.1 Esperimento 1: Effetti del PPX sulla polidipsia 81 14.2 Esperimento 2: Effetti del PPX sul contrafreeloading 83 14.3 Esperimento 3: Effetti della CIM sul contrafreeloading indotto da PPX 87 14.4 Esperimento 4: Effetti dell’SB-242084 sul contrafreeloading indotto da PPX 91 15. DISCUSSIONE 94 16. CONCLUSIONI 100 17. APPENDICE 104 18. BIBLIOGRAFIA 122

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1. INTRODUZIONE

1.1 LA POLIDIPSIA PSICOTICA

La polidipsia consiste nell’ingestione di una quantità di liquidi (superiore ai 3

litri/giorno) in eccesso rispetto alle necessità idrosaline dell’organismo e, quando

compare in assenza di patologie organiche, è definita psicogena (Illowsky and Kirch,

1988; Rubenstein et al. 1990; Bremmer and Regan, 1991). Di tale fenomeno si hanno

segnalazioni fin dal 1935, in particolare in soggetti con diagnosi di schizofrenia

(Sleeper) e, in effetti, l’incidenza della polidipsia si aggira attorno al 20% tra tali

pazienti (Bremmer and Regan, 1991; Riggs et al. 1991; De Leon et al. 1996; Mercier-

Guidez et al. 2000). Particolarmente vulnerabili a sviluppare polidipsia appaiono i

pazienti cronici con più estesa durata di ospedalizzazione (De Leon et al. 1994). In

accordo con un recente studio retrospettivo, i pazienti schizofrenici polidipsici hanno

un aumento del 75% di probabilità di decesso rispetto ai pazienti non-polidipsici

(Hawken et al. 2009), soprattutto a causa dell’intossicazione da acqua e

dell’iponatremia (De Leon et al. 1994; Verghese et al. 1996; Brookes and Ahmed

2006).

I primi episodi del disturbo si manifestano tipicamente tra i 5 e i 15 anni successivi

alla diagnosi iniziale di schizofrenia e, inoltre, un sottogruppo di questi pazienti

sviluppa iponatremia nel decennio successivo la comparsa del disturbo stesso

(Vieweg et al. 1984a,b). I pazienti iponatremici sono più suscettibili a incorrere

nell’intossicazione da acqua, caratterizzata dall’insorgenza di un quadro neurologico

severo (atassia, nausea, vomito, convulsioni, coma) con sviluppo di edema cerebrale

potenzialmente letale (De Leon et al. 1994; Ligtenberg et al. 1998).

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In assenza di studi neurofisiopatologici sistematici, le ipotesi circa la patogenesi del

disturbo si sono incentrate su due possibili fattori. Il primo, di natura iatrogena,

attribuisce la polidipsia ad una protratta terapia con neurolettici, in effetti plausibile in

pazienti con alle spalle una lunga storia naturale della malattia (Sandifer, 1983;

Glusac et al. 1990). A tale ipotesi si oppone tuttavia il fatto che non solo la polidipsia

era stata osservata già in era pre-neurolettica (Sleeper et al. 1935), ma anche che essa

insorge in pazienti non medicati (Illowsky and Kirch, 1988).

La seconda ipotesi, di natura genetica, si basa sulla osservazione che la polidipsia

coinvolge sovente anche i parenti di primo grado dei pazienti schizofrenici polidipsici

rispetto ai non polidipsici (Shinkai et al. 2003). E’ stato indagato in proposito il ruolo

dei polimorfismi dei geni per i citocromi CYP2D6 e CYP1A2, implicati nella

farmacocinetica degli antipsicotici, ma non è stata trovata alcuna associazione con il

disturbo (Matsumoto et al. 2006). Nello stesso ambito la polidipsia psicotica è stata

associata anche ai polimorfismi a carico di recettori quali il D2 dopaminergico

(Matsumoto et al. 2005), l’Ox1 oressinico (Meerabux et al. 2005), e l’α2A

adrenergico (Yamaguchi et al. 2009).

In linea generale, l’elevata incidenza della polidipsia tra i soggetti affetti da

schizofrenia ha spinto gli studiosi a considerare, nell’eziologia del disturbo, il

coinvolgimento della disfunzione centrale dopaminergica che caratterizza questa

patologia (Raskind et al. 1975; Smith and Clark, 1980; Shen and Sata 1983). Tale

ipotesi ha ottenuto il conforto del dato empirico che la somministrazione di

metilfenidato, composto anfetamino-simile capace di indurre rilascio di dopamina,

scatena l’impulso al bere nei soggetti schizofrenici polidipsici (Goldman et al. 1997)

D’altra parte è ben noto che sono gli antipsicotici, potenti antagonisti dei recettori

dopaminergici, i farmaci di scelta nel controllo della polidipsia psicotica (De Leon et

4

al. 1994; Spears et al. 1996; Canuso and Goldman, 1997; Zink et al. 2004; Bersani et

al. 2007).

L’alterata attività dopaminergica tipica della schizofrenia potrebbe quindi

rappresentare l’anello di congiunzione tra psicosi e polidipsia, contribuendo tra l’altro

alla dissociazione tra livelli di vasopressina, eccessivamente elevati, e iponatremia,

che caratterizza questi pazienti (Goldman et al. 1988). Meno chiaro è invece il ruolo

dell’alterazione dopaminergica nel diminuito feedback negativo dei glucocorticoidi

(Goldman et al. 2007a), che è stato riscontrato nei pazienti polidipsici e che appare

connesso ad una riduzione volumetrica dell’ippocampo anteriore (Goldman et al.

2007b). E’ tuttavia ancora poco chiaro se questi deficits neuroendocrini siano da

considerare probabili cause della polidipsia o conseguenze di essa.

Dopo avere a lungo segnato il passo, le conoscenze neurofisiopatologiche della

polidipsia psicotica stanno progredendo beneficiando dell’utilizzo di due distinti

modelli sperimentali. Il primo è quello della cosiddetta “schedule-induced polydipsia”

sviluppata da Falk (1966) dove il ratto è addestrato ad ottenere cibo premendo una

leva secondo una “fixed-interval-schedule of reinforcement”: la presenza di una

risorsa idrica nella gabbia fa sì che l’animale sia spinto ad occupare il tempo tra un

rilascio e l’altro di cibo bevendo in maniera compulsiva (Moreno e Flores 2012).

Il secondo modello è quello della polidipsia indotta dalla somministrazione ripetuta di

farmaci dopaminergici indiretti (Catinone e anfetamina) o agonisti D2/D3 (Nencini,

1988; Nencini ,1988a, 1988b; Nencini e Fraioli, 1994; Fraioli et al. 1997; Cioli et al.

2000).

Questa dissertazione raccoglie i risultati di una serie di esperimenti condotti con il

modello di polidipsia indotta dagli agonisti D2/D3 quinpirolo e pramipexolo.

5

PARTE PRIMA

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2. POLIDIPSIA SPERIMENTALE

E’ stato dimostrato che la somministrazione ripetuta di anfetamina in animali di

laboratorio determina un progressivo incremento della risposta comportamentale

(sensibilizzazione comportamentale) che costituisce un modello animale di psicosi

(Robinson et al. 1986). Questo fenomeno di sensibilizzazione può anche esprimersi

come eccessiva ingestione di liquidi, o polidipsia, rispetto al fabbisogno idrico

(Rowland et al. 1981; Nencini et al 1988a,b), costituendo quindi un possibile modello

di polidipsia psicotica.

In accordo con quanto descritto in precedenza da Nencini e collaboratori, ratti trattati

giornalmente con dosi moderate di agonisti dopaminergici indiretti, quali anfetamina

o catinone, manifestano un’aumentata introduzione di acqua, con il picco tra le 2 e le

5 ore successive all’iniezione del farmaco (Nencini et al, 1988a; Nencini 1988b;

Nencini e Fraioli, 1994) e tale riposta iperdipsica si mantiene anche in assenza di

cibo, evidenza questa che esclude l’ipotesi di un effetto prandiale (Nencini 1988).

Poiché sia l’anfetamina che il catinone sono in grado di aumentare il rilascio di

noradrenalina, oltre che di dopamina, l’evidenza più importante dell’implicazione del

sistema dopaminergico nel fenomeno è data dall’osservazione che, nell’animale

sperimentale, la somministrazione giornaliera dell’agonista D2/D3 quinpirolo (QNP)

induce una progressiva risposta iperdipsica apparentemente analoga alla polidipsia

propria della schizofrenia (Fraioli et al. 1997; Cioli et al. 2000). L’effetto raggiunge il

suo massimo a cinque ore dalla somministrazione e si manifesta generalmente dopo

2-3 giorni dall’inizio del trattamento.

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3. POLIDIPSIA E DISTRUZIONE DELLA PREPULSE INHIBITION: BASI

NEUROBIOLOGICHE E CORRELATI BIOCHIMICI

Per poter meglio comprendere le basi neurobiologiche della polidipsia psicotica,

abbiamo messo a punto un primo studio per confermare la nostra ipotesi che il

comportamento di bevuta non-regolatoria indotto da QNP nell’animale possa

rappresentare un valido modello sperimentale di questa sindrome.

Amato e collaboratori hanno inizialmente testato l’efficacia di una serie di farmaci

antipsicotici tipici e atipici nel prevenire e/o revertire questo fenomeno nel ratto

(2008). Come atteso, l’effetto polidipsico del QNP era inibito dagli antipsicotici in

maniera direttamente proporzionale all’affinità delle singole molecole per i recettori

D2, essendo massima per l’antipsicotico tipico aloperidolo e minima per l’atipico

clozapina. Poiché in questi esperimenti era stato osservato che la clozapina non era in

grado di revertire di per sé la iperdipsia indotta da QNP, abbiamo deciso di indagare

se, nello stesso animale, una preventiva esposizione al neurolettico aloperidolo

rendesse la clozapina efficace nell’inibire gli effetti prodotti dal D2/D3 agonista. Tale

predizione si basava sull’assunto che, essendo la polidipsia una complicazione tardiva

della schizofrenia, essa si sviluppa in pazienti che sono stati preventivamente esposti a

trattamenti prolungati con neurolettici convenzionali (Seeman et al. 2005). E’ noto

inoltre che la clozapina rappresenta il farmaco di prima scelta in pazienti “resistenti”

ai neurolettici convenzionali nel trattamento della schizofrenia.

Nello stesso studio, abbiamo verificato l’ipotesi che la iperdipsia da QNP evolva di

pari passo con la distruzione della Prepulse Inhibition (PPI), e cioè dell’inibizione del

riflesso di trasalimento che si osserva quando uno stimolo più debole (prepulse) è

presentato immediatamente prima di uno stimolo successivo (pulse) di maggiore

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intensità che induce appunto trasalimento (Braff et al. 1978). La riduzione

dell’ampiezza del riflesso di trasalimento riflette l’abilità del sistema nervoso di

adattarsi temporaneamente ad un forte stimolo sensoriale quando questo è preceduto

da un segnale di più debole intensità. Misurare la PPI significa, quindi, quantificare

l’accomodamento che il riflesso di trasalimento subisce in presenza di un una

sequenza di “prepulse + pulse” (Swerdlow and Geyer, 1998). I deficits della PPI si

manifestano nell’incapacità di eliminare informazioni “non necessarie” e sono stati

collegati alle alterazioni del gating motosensoriale, in particolare in pazienti affetti da

schizofrenia, morbo di Alzheimer, attacchi di panico (Ludewig et al. 2005), disturbi

della personalità schizotipica (Cadenhead et al. 1993), disturbi ossessivo-compulsivi

(Swerdlow et al., 1993), malattia di Huntington (Swerdlow et al. 1995), disturbo di

deficit dell’attenzione (Ornitz et al. 1992), e sindrome di Tourette (Swerdlow 1998;

Castellanos et al. 1996). In questo scenario, il modello animale di PPI ha permesso di

stabilire che è proprio la dopamina a regolare il gating motosensoriale (Mansbach et

al. 1988; Swerdlow et al. 1991), facendo collimare tali osservazioni con l’ipotesi

dopaminergica della schizofrenia.

Tenuto conto di queste considerazioni, parallelamente alla valutazione

dell’interazione farmacologica di più antipsicotici in antagonismo con gli effetti

indotti dal QNP sulla polidipsia, abbiamo indagato negli stessi animali, l’effetto della

clozapina nel prevenire la distruzione della PPI anch’essa prodotta dal QNP, dal

momento che questa sostanza è in grado di ripristinare la PPI in maniera più efficace

dei neurolettici classici (Geyer, 2006).

Inoltre, per fornire correlati neurobiologici comuni ai due fenomeni di polidipsia e

distruzione della PPI, giacché provocate dalla stessa sostanza, abbiamo determinato

l’espressione dei geni codificanti per, rispettivamente, il recettore dopaminergico D2,

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il fattore neurotrofico di derivazione cerebrale (brain-derived neurotrofic factor,

BDNF), la proteina del proto-oncogene appartenente alla famiglia dei fattori di

trascrizione “immediately early genes”, c-Fos, in corteccia prefrontale (PFC), striato

(ST) e ippocampo (HIP). Il motivo di questa scelta è derivato dall’assunto che le

alterazioni dell’espressione del BDNF sono implicate nella storia naturale della

schizofrenia, nella misura in cui incidono sui meccanismi di neuroplasticità

modificando la normale neurotrasmissione (Chlan-Fourney et al. 2002; Chen et al.

2009; Jindal et al. 2010). Queste alterazioni nell’espressione del BDNF e di c-Fos

possono essere revertite almeno in parte dal trattamento con antipsicotici appropriati

come la clozapina (Durany and Thome 2004). Inoltre, la modulazione di questi geni

costituisce un marker dell’attività di sostanze antipsicotiche (Liesbeth et al. 2009) e

pertanto rappresenta un correlato della loro efficacia terapeutica (Robbins et al. 2008).

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4. RISULTATI

4.1 Esperimento 1:Interazione farmacologica di aloperidolo e clozapina sulla

polidipsia indotta da QNP

Durante l’esperimento, gli animali sono rimasti in buona salute, sebbene quelli trattati

con QNP abbiano mostrato una lieve riduzione del fisiologico incremento del peso

corporeo rispetto ai controlli (+1.5% vs. +5% dal giorno 8 al giorno 12).

Come atteso, il QNP ha provocato l’incremento del consumo d’acqua durante tutto il

corso dell’esperimento, con un effetto significativo visibile dal 3° giorno in poi

(p<.001). Due giorni di sospensione del trattamento (giorni 6 e 7) non hanno abolito

gli effetti del QNP, ma anzi, nel giorno 8, il consumo di acqua degli animali trattati

con QNP è risultato significativamente superiore a quello dai controlli (p<.001,

Figura 1a). L’aloperidolo (Figure 1 e 2) ha prevenuto l’iperdipsia durante tutto

l’esperimento. Quando al giorno 8, la clozapina ha sostituito il pretrattamento con

l’aloperidolo, solo la dose maggiore (40 mg/kg i.p.) ha mantenuto l’inibizione

dell’iperdipsia provocata dall’aloperidolo (p<.001, Figura 2). Quando somministrata

come unico pretrattamento (cioè senza la preventiva esposizione all’aloperidolo), la

clozapina, ad entrambe le dosi, è risultata efficace nel bloccare gli effetti del QNP

(p<.001, Figura 2, istogrammi neri). Inoltre è apparso che l’aloperidolo ha ridotto le

capacità inibenti della clozapina verso la polidipsia QNP–indotta (p<.001, Figura 2,

istogrammi grigi).

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Figura 1

a Media±ESM dei grammi di acqua consumati, misurati 5 ore dopo l’iniezione i.p. di QNP (0.5 mg/kg) da solo o in combinazione con aloperidolo (0.4 mg/kg) dato p.o. un’ora prima del QNP. b Mediana, 25° e 75° percentile dell’area sotto la curva (AUC) del consumo di acqua dal giorno 1 al giorno 5 (n=30/gruppo). Kruskal-Wallis one-way ANOVA: H=68.834, df=3 and p<.001. c Come in b ma dal giorno 8 al giorno 12 (n=10/gruppo). Kruskal-Wallis one-way ANOVA: H=24.000, df=3 and p<.001. Post-hoc Tuckey test: *p<.05 vs veh+sal.

Experiment 2a

As expected, QNP also caused PPI disruption from the veryfirst day of treatment and this effect remained stable acrossdays 5, 8, and 12 (Fig. 3a). PPI procedure did not interferewith drinking response to QNP and, as expected, waterintake progressively increased leveling off on day 3(Fig. 3b). Note that the intensity of the QNP effect on PPIand water intake did not correlate, with the exception of day 8(Pearson's product moment correlation test on day 1 r=0.600and P=0.066; day 5 r=!0.588 and P=0.066; day 8: r=!0.682and P=0.029; day 12: r=!0.102 and P=0.778).

Experiment 2b

Confirming the results of the experiment 2a, QNP caused asignificant disruption of PPI at both days 1 and 5 (Fig. 4,panel a, b). At the dose of 10 mg/kg, clozapine did notinterfere with this QNP effect, whereas 40 mg/kg signifi-

a

b c

Fig. 1 a Mean (±SEM) grams of water intake measured 5 h after the i.p.injection of QNP 0.5 mg/kg alone or in combination with 0.4 mg/kghaloperidol (Hal) given p.o., 1 h before. b Median, 25th and 75thpercentiles of the area under curve (AUC) of water intake from days1 to 5 (n=30/group). Kruskal–Wallis one-way ANOVA: H=68.834,df=3 and P<0.001. c As in b but from days 8 to 12 (n=10/group).Kruskal–Wallis one-way ANOVA: H=24.000, df=3 and P<0.001.Post-hoc Tukey's test: *P<0.05 vs veh+sal

Fig. 2 Cumulative 5 h water intake from days 9 to 12. Values areexpressed as mean grams (±SEM). Clozapine (clo), haloperidol (Hal),or vehicle (veh) were administered p.o. 60 min before QNP or saline(sal) i.p. injection. One-way ANOVA: F6,21=73.98, P<0.001. Tukey'stest: *P<0.001 vs veh, #P<0.001 vs QNP, °P<0.001 vs clo(10)

a

b

Fig. 3 a Bars represent %PPI (±SEM) obtained averaging the resultsof the prepulses adopted (73, 76, and 82 db). One-way ANOVA forrepeatedmeasures: F7,14=50.60 and P<0.001. Tukey's test, *P<0.001vssal. b A 5-h water intake expressed as mean grams (±SEM) in the sameanimals of a. One-way ANOVA for repeated measures: F5,45=12.78and P<0.001. Open circles indicate values of QNP-treated rats that donot differ from sal group (open triangles) whereas closed circlesindicate a significant difference vs sal group in the respective day oftreatment (Tukey's test: P<0.001 vs sal)

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Figura 2

Il grafico rappresenta il consumo d’acqua (in grammi) dal giorno 9 al giorno 12. I valori sono espressi come media±ESM. Clozapina (clo), aloperidolo (Hal) o veicolo (veh) sono stati somministrati p.o., 60 min prima dell’iniezione i.p. con QNP o salina. ANOVA a una via: F6,21=73.98, p<.001. Tuckey test: *p<.001 vs. veh, #p<.001 vs. QNP, °p<.001 vs. clo(10).

Experiment 2a


Experiment 2b


a

b c



a

b



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4.2 Esperimento 2a: Distruzione della PPI indotta da QNP

Il trattamento con QNP ha ridotto significativamente la PPI dal giorno 1 (p<.001,

Figura 3a) e quest’effetto è rimasto stabile nei giorni 5, 8 e 12 (p<.001, Figura 3a).

Sorprendentemente, l’esposizione degli animali al test della PPI non ha in alcun modo

interferito con il consumo di acqua sia nei controlli che nei trattati con QNP e, come

atteso, in questi ultimi ha raggiunto i livelli di significatività già al giorno 3 (p<.001,

Figura 3b). Inoltre, non è stata riscontrata alcuna importante correlazione tra la

inibizione della PPI e l’iperdipsia, entrambe indotte dal QNP, ad eccezione del giorno

8 (Correlazione di Pearson giorno 1 r=0.600 e p=.066; giorno 5 r=-0.588 e p=.066;

giorno 8 r=-0.682 e p=.029; giorno 12 r=0.102 e p=.778).

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Figura 3

a Le barre rappresentano la %PPI (±ESM) ottenuta mediando i risultati dei tre rispettivi prepulse (73, 76 e 82 dB). ANOVA a una via per misure ripetute: F7,14=50.60 e p<.001. Tuckey test, *p<.001 vs. sal. b Sono rappresentati i valori del consumo di acqua (in grammi) espressi come media (±ESM) negli stessi animali di a. ANOVA ad una via per misure ripetute: F5,45=12.78 e p<.001. I cerchi bianchi sono riferiti ai dati ottenuti dal gruppo dei QNP che non differiscono dai controlli (triangoli bianchi); i cerchi neri indicano la differenza significativa verso i controlli nei rispettivi giorni di trattamento (Tuckey test: p<.001 vs. sal).

Experiment 2a


Experiment 2b


a

b c



a

b



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4.3 Esperimento 2b: Effetto della clozapina sulla polidipsia e sulla distruzione

della PPI indotte da QNP

A conferma di quanto osservato nell’esperimento 2a, il QNP ha prodotto una

significativa inibizione della PPI nei giorni 1 e 5 (p<.001, Figura 4, pannello a,b).

Alla dose di 10 mg/kg, la clozapina non ha interferito con gli effetti del QNP, mentre

la dose di 40 mg/kg ha significativamente prevenuto l’inibizione della PPI indotta da

QNP nel giorno 5 (p<.05). Gli animali trattati con QNP hanno inoltre manifestato una

significativa diminuzione nell’ampiezza del trasalimento (p<.001 nel giorno 1 e

p<.001 nel giorno 5) e un significativo aumento dell’attività motoria basale

(NOSTIM, p<.001 nel giorno 1 e p<.01 nel giorno 5), effetti questi non prevenuti dal

pretrattamento con clozapina (Figura 5a,b).

La tabella 2 mostra che, negli stessi animali, il QNP ha indotto l’atteso aumento

significativo del consumo d’acqua nel giorno 5 (p<.05) e che questo effetto è stato

antagonizzato solo dalla dose più elevata di clozapina (p<.05).

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Figura 4

a L’istogramma rappresenta la %PPI (±ESM) del giorno 1 di trattamento. Il controllo (veh) o la clozapina (clo) alle dosi di 10 o 40 mg/kg sono state somministrate p.o., 1 ora prima dell’iniezione i.p. di salina (sal) o QNP. Il test è stato effettuato 10 min dopo la somministrazione di salina o QNP. ANOVA a due vie: 73 dB, F1,54=17.60, p<.001 per il trattamento; 76 dB, F1,54=12.99, p<.001 per il trattamento; 82 dB, F2,54=11.15, p<.01 per il trattamento. b %PPI nel giorno 5. ANOVA a due vie: 73 dB, F1,54=8.97, p<.01 per il trattamento; 76 dB, F2,54=4.63, p<.05 per il pretrattamento; F1,54=8.85, p<.001 per il trattamento; F2,54=6.10, p<.01 per l’interazione; 82 dB, F1,54=11.62 p<.001 per il trattamento; F2,54=3.92, p<.05 per l’interazione. Tuckey test: *p<.05 e **p<.01 vs. veh+sal; #p<.05 e ##p<.01 vs, clo(10)+sal; °p<.05 e °°p<.01 vs. veh+QNP.

cantly prevented PPI disruption on day 5. QNP-treated ratsalso exhibited a significant decrease in the startle magnitudeand a likewise significant increment of gross motor activity(NOSTIM), effects that were not prevented by clozapinepretreatment (Fig. 5). Table 2 shows that in the sameexperiment water intake was significantly increased byQNP on day 5 and that this effect was antagonized byclozapine at 40 mg/kg but not at 10 mg/kg.

Effects of drugs on c-Fos, BDNF, and D2R genesexpression

As shown in Fig. 6 (upper panel), five daily treatments withQNP lead to a significant upregulation of c-Fos expressionin PFC, an effect that was abolished by clozapine 40 mg/kg.By itself, clozapine induced a significant decrease of c-Fosexpression in HIP, an effect that disappeared in the group

a

b

Fig. 4 a Bars represent %PPI(±SEM) on the first day oftreatment. Vehicle or clozapine(clo) 10 or 40 mg/kg were givenp.o., 1 h before i.p. injection ofsaline (sal), or QNP. The testwas performed 10 min after theQNP or saline administration.Two-way ANOVA: 73 db,F1,54=17.60, P<0.001 fortreatment; 76 db, F1,54=12.99,P<0.001 for treatment; 82 db,F2,54=11.15, P<0.01 for treat-ment. b %PPI on day 5 oftreatment. Two-way ANOVA:73 db, F1,54=8.97, P<0.01 fortreatment; 76 db, F2,54=4.63,P<0.05 for pretreatment;F1,54=8.85, P<0.01 fortreatment; F2,54=6.10, P<0.01for interaction; 82 db;F1,54=11.62, P<0.001 fortreatment; F2,54=3.92, P<0.05for interaction. Tukey's test:*P<0.05 and **P<0.01vs veh+sal; #P<0.05 and ##P<0.01 vsclo (10)+sal; °P<0.05; and°°P<0.01 vs veh+QNP

110 Psychopharmacology (2010) 212:105–115

17

Figura 5 L’istogramma in a rappresenta le reazioni si trasalimento al pulse singolo (P-alone). I dati sono espressi come media±ESM (in millivolts) di 10 animali/gruppo. Veicolo (veh) o clozapina (clo) 10 o 40 mg/kg sono state somministrate p.o., 1 ora prima dell’iniezione i.p. di salina (sal) o QNP. ANOVA a due vie: giorno 1, F2,54=4.90, p<.05 per il pretrattamento; F1.54=11.57, p<.001 per il trattamento; F2.54=0.89, p=.41 per l’interazione; giorno 5, F2,54=5.09, p<.05 per il pretrattamento; F1.54=13.29, p<.001 per il trattamento; F2.54=0.89, p=.23 per l’interazione. I valori in b rappresentano l’attività motoria in presenza del solo rumore di fondo (NOSTIM). Come in a, i dati rappresentano la media±ESM espressa in millivolts; giorno 1, F2,54=1.30, p=.27 per il pretrattamento; F1.54=26.61, p<.001 per il trattamento; F2.54=2.54, p=.11 per l’interazione; giorno 5, F2,54=1.84, p=.16 per il pretrattamento; F1.54=8.11, p<.001 per il trattamento; F2.54=1.02, p=.36 per l’interazione. Tuckey test: *p<.05 vs. veh+sal.

treated with both clozapine and QNP. No changes acrossthe groups occurred in the expression of c-Fos in thestriatum. Taking into consideration only rats whose PPI wasdisrupted (i.e., below 56%), c-Fos expression in PFCresulted highly correlated with the level of PPI (Fig. 7).

QNP produced a significant down-regulation of BDNFgene expression in HIP. This response was abolished whenclozapine was given as pretreatment. By itself, clozapinecaused a significant inhibition of BDNF expression in both

a

b

Fig 5 a Bars represent startle reactions to a single pulse. Data areexpressed as mean millivolts (±SEM; of ten animals/group). Vehicle(veh) or clozapine (clo) 10 or 40 mg/kg were given p.o., 1 h before i.p.injection of saline (sal) or QNP 0.5 mg/kg. Two-way ANOVA: day 1:F2,54=4.90, P<0.05 for pretreatment; F1,54=11.57, P<0.001 for treatment;F2,54=0.89, P=0.41 for interaction. Day 5: F2,54=5.09, P<0.05 forpretreatment; F1,54=13.29, P<0.001 for treatment; F2,54=0.89, P=0.23 forinteraction. b Motor activity when only the background was presented(NOSTIM trials). As in a, data are expressed as mean millivolts(±SEM). Day 1: F2,54=1.30, P=0.27 for pretreatment; F1,54=26.61,P<0.001 for treatment; F2,54=2.54, P=0.11 for interaction. Day 5:F2,54=1.84, P=0.16 for pretreatment; F1,54=8.11, P<0.01 for treatment;F2,54=1.02, P=0.36 for interaction. Tukey's test: *P<0.05 vs veh+sal

Table 2 Effect of clozapine on QNP-induced polydipsia

Groups (mg/kg) Days of treatment

1 5

veh+sal 0.5 (0.5–1.2) 1.6 (0.9–2.2)

veh+QNP 1.3 (0.1–3.0) 7.5 (5.0–10.1)*

clo(10)+sal 0.7 (0.3–1.5) 1.2 (0.5–2.0)

clo(10)+QNP 0.2 (0.8–0.3) 4.8 (2.1–5.5)

clo(40)+sal 0.3 (0.2–0.5) 1.0 (0.3–3.3)

clo(40)+QNP 0.1 (0.4–0.1) 0.6 (0.2–3.9)**

Five-hour water intake, represented as median grams (25th and75th percentiles in brackets), on the first and the last of 5 days oftreatment. Same groups as in Fig. 4. Kruskal–Wallis one-wayANOVA: day 5, H=17.76, df=5, P=0.003.

*P<0.05 vs veh+sal; **P<0.05 vs veh+QNP (Tukey's test)

Fig. 6 Values represent the fold induction (with respect to veh+sal ascontrol group) of each target gene in hippocampus (HIP), prefrontalcortex (PFC), and striatum (ST) brain areas. Same groups as in Fig. 4.Two-way ANOVA for c-Fos: HIP, F1,30=4.66, P=0.039 for pretreat-ment; F1,33=5.14, P=0.031 for interaction. PFC F1,31=8.03, P=0.008for treatment. For BDNF: HIP F1,30=6.67, P=0.01 for treatment;F1,33=8.96, P=0.005 for interaction; PFC F1,31=19.45, P<0.001 forpretreatment; ST F1,33=8.01, P=0.008 for pretreatment. For D2R:PFC F1,30=9.78, P=0.004 for pretreatment; ST F1,32=190.46, P<0.001for pretreatment. Tukey's test: *P<0.05 and **P<0.01vs respective veh+sal; #P<0.05 and ##P<0.01 vs respective veh+QNP


18

Tabella 2

I valori rappresentano il consumo di acqua in grammi, espressi come mediana (25° e 75° percentile tra parentesi), nei giorni 1 e 5 di trattamento. Gli animali sono gli stessi della Figura 4. Kruskal-Wallis: giorno 5, h=17.76, df=5, p=.003. Tuckey test: *p<.05 vs. veh+sal; **p<.05 vs. veh+QNP.



a

b




1 5

veh+sal 0.5 (0.5–1.2) 1.6 (0.9–2.2)

veh+QNP 1.3 (0.1–3.0) 7.5 (5.0–10.1)*

clo(10)+sal 0.7 (0.3–1.5) 1.2 (0.5–2.0)

clo(10)+QNP 0.2 (0.8–0.3) 4.8 (2.1–5.5)

clo(40)+sal 0.3 (0.2–0.5) 1.0 (0.3–3.3)

clo(40)+QNP 0.1 (0.4–0.1) 0.6 (0.2–3.9)**





19

4.4 Esperimento 2c: effetto del QNP e della clozapina sull’espressione genica

di c-Fos, BDNF e recettori D2

Come mostrato dalla figura 6 (pannello superiore), cinque giorni di trattamento con

QNP hanno prodotto una significativa sovraregolazione dell’espressione del c-Fos in

corteccia prefrontale (PFC) (p<.01), effetto che è stato abolito dalla dose maggiore di

clozapina. Di per sé la clozapina ha indotto una significativa diminuzione

dell’espressione del c-Fos in ippocampo (HIP) (p<.05), che però è scomparsa nel

gruppo di trattamento clozapina+QNP. Nessuna differenza tra i gruppi è emersa

nell’espressione del c-Fos nello striato (ST). Prendendo in considerazione solo gli

animali con PPI inibita (generalmente si considerano livelli di inibizione di almeno il

56%), l’espressione di c-Fos in PFC è risultata altamente correlata con i livelli di PPI

(Figura 7, p<.001).

Il QNP ha inoltre provocato una significativa sottoregolazione dell’espressione del

BDNF in HIP (p<.01). Questo effetto è stato abolito dal pretrattamento con clozapina

(p<.01 per l’interazione). Di per sé quest’ultima ha prodotto una significativa

inibizione dell’espressione di BDNF sia in PFC che in ST (p<.001), non revertita dal

trattamento con QNP (Figura 6, pannello centrale). L’espressione genica del recettore

D2 è stata significativamente sottoregolata in PFC e ST degli animali trattati con

clozapina (p<.01 e p<.001 nelle due aree, rispettivamente) ed il concomitante

trattamento con QNP non ha revertito questo effetto (Figura 6, pannello inferiore).

20

Figura 6

Gli istogrammi rappresentano la fold induction (rispetto al gruppo di controllo veh+sal) di ogni gene, rispettivamente nelle aree cerebrali di ippocampo (HIP), corteccia prefrontale (PFC) e striato (ST). Gli animali sono gli stessi della Figura 4. ANOVA a due vie per c-Fos: HIP, F1.30=4.66, p=.039 per il pretrattamento; F1.33=5.14, p=.031 per l’interazione; PFC, F1.31=8.03, p=.008 per il trattamento. Per BDNF: HIP, F1.30=6.67, p=.01 per il trattamento; F1.33=8.96, p=.005 per l’interazione; PFC, F1.31=19.45, p<.001 per il pretrattamento; ST F1,33=8.01, p=.008 per il pretrattamento. Per D2R: PFC, F1.30=9.78, p=.004 per il pretrattamento; ST F1,32=190.46, p<.001 per il pretrattamento. Tuckey test: *p<.05 e **p<.01 vs veh+sal; #p<.05 e ##p<.01 vs. veh+QNP.



a

b




1 5

veh+sal 0.5 (0.5–1.2) 1.6 (0.9–2.2)

veh+QNP 1.3 (0.1–3.0) 7.5 (5.0–10.1)*

clo(10)+sal 0.7 (0.3–1.5) 1.2 (0.5–2.0)

clo(10)+QNP 0.2 (0.8–0.3) 4.8 (2.1–5.5)

clo(40)+sal 0.3 (0.2–0.5) 1.0 (0.3–3.3)

clo(40)+QNP 0.1 (0.4–0.1) 0.6 (0.2–3.9)**





21

Figura 7

Grafico di correlazione tra l’espressione di c-Fos (espresso come valori di ∆CT) e i valori di %PPI in PFC, nei ratti che hanno mostrato una distruzione della PPI almeno sotto il 56%. r2=0.7659 e p=.0004. PFC and striatum, an effect that was not reversed by QNPtreatment (Fig. 6 middle panel).

The gene expression of D2R was significantly down-regulated in both PFC and striatum of clozapine-treatedrats, and concomitant treatment with QNP did not reversethis effect (Fig. 6, lower panel).

Discussion

The present study provides three main findings. Firstly, inthe same animals it was possible to induce throughquinpirole administration both non-regulatory drinkingand PPI disruption, two effects that model importantaspects of schizophrenia, such as polydipsia and sensori-motor gating deficit. Secondly, contingently to behavioraleffects, QNP changed the expression of the early genes c-Fos and BDNF in PFC and HIP, brain regions that areinvolved in both polydipsia and sensorimotor gating deficit.Thirdly, the inhibition of QNP behavioral effects byclozapine was associated with a remarkable down-regulation of both dopaminergic D2 receptors and BDNFexpression in the striatum and in the PFC.

In absence of properly designed studies, empiricalclinical observations converge in considering clozapine abetter option than conventional neuroleptics in the pharma-cotherapy of schizophrenic polydipsia. Since chronic D2blockade was considered instrumental for the supposedfacilitation of polydipsia by neuroleptics, it appeared plausiblethat the efficacy of clozapine in controlling schizophrenicpolydipsia is due to the wide array of non-dopaminergic D2mechanisms owned by this drug (Verghese et al. 1993).Moreover, since clozapine efficacy was mainly detected inpatients repeatedly exposed to neuroleptics, it is conceivableto think that chronic exposure to neuroleptics makespolydipsia sensitive to the inhibiting effect of clozapine.Here, we found that daily administration of clozapine reverts

non-regulatory drinking induced by the D2/D3 dopaminergicagonist QNP. In addition, we found that when clozapine wassubstituted for the prototypical D2 antagonist haloperidol,the inhibitory effect of 10 mg/kg was lost but preserved with40mg/kg. Since clozapine is a weak antagonist at dopaminergicD2 receptors (Schotte et al. 1993; Chlan-Fourney et al. 2002),we may reason that the reduced capability of clozapine torevert QNP-induced non-regulatory drinking in haloperidol-pretreated rats is due to cross-tolerance at D2 receptors. On thebasis of this finding, we can reject the hypothesis that theeffectiveness of clozapine in reverting QNP-induced non-regulatory drinking depends on dopaminergic sensitizationcaused by prior neuroleptic treatment. Although mitigated bythe preferential affinity of haloperidol for the D2 receptor, wecannot instead exclude the possibility that dopaminergic D3receptors are also involved in the inhibitory effect of clozapinebecause the drug has roughly the same affinity for D2 and D3receptors (Malmberg et al. 1993).

The respective roles of dopaminergic D2 and D3 receptorsin the clozapine effect on QNP-induced non-regulatorydrinking are not completely explained by results obtainedwhen animals repeatedly treated with QNP alone or incombination with clozapine were tested for both PPI andwater intake. PPI is in fact a model of sensorimotor gatingsensitive to the disruptive effects of dopaminergic agents activeat either D2 or D3 receptors (Geyer et al. 2001; Swerdlow etal. 2001a, b, 2009; Vollenweider and Geyer 2001). In anycase, here we confirmed that QNP disrupts PPI and inaddition we found that this effect was independent fromprepulse intensity and remained stable across 12 days oftreatment. Although this finding apparently contrast with theresults reported by Culm and Hammer (2004) and Culm et al.(2003, 2004), it is important to note that they observed a fullrecovery of PPI with the dose 0.1 mg/kg and after 28 days oftreatment. We may argue that differences in the schedule ofQNP administration account for the deviation of our resultsfrom those reported by these authors.

Non-regulatory drinking clearly differed from PPIdisruption in that it required several QNP administrationsto level off. Moreover, we only found a correlation betweenthe intensity of the two QNP effects across rats (on day 8).Both QNP effects were sensitive to clozapine in a closesimilar extent, in that on day 5 at the dose of 40 mg/kgclozapine completely blocked both non-regulatory drinkingand PPI disruption caused by QNP, whereas the lower doseof 10 mg/kg was ineffective. It is worth noting that the lackof inhibitory effects of clozapine on QNP-induced PPIdisruption observed on the first day of treatment adds to therather inconsistent results obtained upon acute administrationof the drug in this experimental model (Swerdlow et al. 1998;Russig et al. 2004). The need of a prolonged exposure toclozapine in order to obtain a significant activity in ourexperimental model may account for the lack of inhibition of

Fig. 7 Correlations between c-Fos expression (express as !CTvalues) and corresponding PPI score (expressed as percentage) in ratsthat showed a PPI value below 56%. Quantitative linear relation inPFC with r2=0.7659 and P=0.0004


22

5. DISCUSSIONE

Questa prima parte di esperimenti hanno prodotto tre risultati principali. In primo

luogo, nello stesso animale è possibile indurre, attraverso la somministrazione di

QNP, l’iperdipsia e la inibizione della PPI, due effetti che riproducono aspetti

importanti della schizofrenia, come la polidipsia e il deficit del gating motosensoriale.

Inoltre, parallelamente agli effetti comportamentali, il QNP è in grado di modulare

l’espressione genica di c-Fos e BDNF nella corteccia prefrontale e nell’ippocampo,

regioni cerebrali strettamente coinvolte nello sviluppo di entrambi i fenomeni. Terzo

punto, l’inibizione degli effetti comportamentali indotti dal QNP, tramite la

somministrazione preventiva di clozapina, è risultata associabile ad una significativa

sottoregolazione dell’espressione genica dei recettori dopaminergici D2 e del BDNF

in corteccia prefrontale e nello striato.

Nonostante la mancanza di studi appositamente mirati, le attuali osservazioni cliniche

convergono nel considerare la clozapina la migliore opzione rispetto ai neurolettici

convenzionali nella farmacoterapia della polidipsia schizofrenica. Nello specifico,

poichè è stato ipotizzato che il blocco dei recettori dopaminergici D2 sia responsabile

della induzione della polidipsia schizofrenica (come già detto, la polidipsia, essendo

una complicazione tardiva della schizofrenia, si sviluppa in pazienti preventivamente

esposti a trattamenti prolungati con neurolettici convenzionali), ne dovrebbe

conseguire che l’efficacia della clozapina sia dovuta al suo ampio spettro di

meccanismi non-D2 dopaminergici (Verghese et al. 1993). Inoltre, essendo gli effetti

positivi di questo farmaco maggiormente riscontrati nei pazienti “resistenti” ai

neurolettici nel trattamento della schizofrenia, è plausibile che l’assunzione cronica di

23

questi ultimi farmaci renda la polidipsia più sensibile agli effetti inibitori della

clozapina.

Con il nostro studio, abbiamo osservato che somministrazioni giornaliere

dell’antipsicotico atipico revertono l’iperdipsia indotta dal quinpirolo. Inoltre, quando

la clozapina viene sostituita all’aloperidolo, l’effetto inibitorio è perso solo dalla dose

bassa e mantenuto invece dalla dose di 40 mg/kg. Essendo la clozapina un debole

antagonista ai recettori dopaminergici D2 (Schotte et al. 1993; Chlan-Fourney et al.

2002), possiamo ragionevolmente pensare che la sua ridotta capacità di revertire

l’iperdipsia da quinpirolo, negli animali pretrattati con aloperidolo, sia dovuta ad un

fenomeno di tolleranza crociata ai recettori D2. Alla luce di questi risultati, possiamo

scartare l’ipotesi che l’efficacia della clozapina dipenda solo da una sensibilizzazione

dopaminergica dovuta al pretrattamento neurolettico, ma non possiamo altrettanto

escludere la possibilità che anche i recettori dopaminergici D3 possano essere

coinvolti negli effetti inibitori della clozapina, data la sua pari affinità per entrambi i

sottotipi (Malmberg et al. 1993).

In effetti, il nostro studio non chiarisce il rispettivo ruolo dei recettori D2 e D3. La

PPI, infatti, è un modello di inibizione motosensoriale sensibile agli effetti degli

agenti dopaminergici attivi sia sui recettori D2 che D3 (Geyer et al. 2001; Swerdlow

et al. 2001a, b, 2009; Vollenweider e Geyer 2001). In ogni caso, abbiamo potuto

confermare che il QNP, D2/D3 agonista, inibisce la PPI in maniera stabile nei 12

giorni di trattamento ed indipendentemente dall’intensità dello stimolo applicato (73,

76 o 82 dB). Sebbene questi risultati contrastino apparentemente con quelli riportati

nei lavori di Culm e Hammer (2004) e di Culm e collaboratori (2003, 2004), è

importante evidenziare che in questi ultimi studi è stato osservato un totale recupero

della PPI con una minima dose di quinpirolo di 0.1 mg/kg e dopo 28 giorni di

24

trattamento. Possiamo pertanto argomentare che le differenze sperimentali

giustifichino la deviazione dei nostri risultati da quelli riportati dai questi autori.

Un altro aspetto importante emerso dai nostri dati è che l’iperdipsia differisce

chiaramente dalla inibizione della PPI in quanto la prima richiede più

somministrazioni di QNP (almeno 2-3 giorni) per arrivare ai livelli di consumo

d’acqua significativamente dai superiori a quelli dei controlli. In più, l’unica

correlazione che abbiamo trovato significativa tra i due fenomeni è limitata al solo

giono 8.

Ancora, abbiamo potuto osservare che sia l’iperdipsia sia la inibizione della PPI da

QNP sono similmente sensibili alla clozapina, dal momento che nel giorno 5, la dose

di 40 mg/kg ha bloccato completamente entrambi i fenomeni, mentre la dose di 10 è

risultata inefficace. La necessità di una più prolungata esposizione alla clozapina, al

fine di poter osservare un’attività significativa nel nostro modello, giustifica anche la

mancata inibizione dell’iperdipsia QNP-indotta, quando il farmaco veniva

somministrato negli ultimi 2 giorni dei 5 di esposizione ripetuta al QNP (Amato et al.

2008).

Il dato saliente che gli effetti della clozapina, nel nostro modello sperimentale, siano

mediati dai recettori dopaminergici D2 è fortemente sostenuto dall’osservazione che,

negli animali trattati con clozapina da sola o in combinazione con quinpirolo,

l’espressione recettoriale D2 è stata sottoregolata in corteccia prefrontale, e, in

maniera più marcata, nello striato. Secondo i nostri dati, infatti, la clozapina non ha

antagonizzato gli effetti del quinpirolo competendo per il legame al recettore D2, ma

inducendo la sua sottoregolazione. Questo risultato è in accordo con studi precedenti

secondo i quali somministrazioni ripetute di clozapina, ma non di aloperidolo,

riducono i livelli di mRNA per il recettore D2 nello striato del ratto (Damask et al.

25

1996). Un altro studio, oltre a confermare la sottoregolazione D2, mostra anche che

questo effetto è aumentato dall’agente dopaminergico bromocriptina (Stonehouse e

Jones 2005). Ora, se il processo di sottoregolazione recettoriale è responsabile della

reversione dell’iperdipsia e del ripristino della PPI, entrambe indotte dal quinpirolo,

risulta comprensibile che la dose più bassa di clozapina non sia stata efficace nel

prevenire la distruzione della PPI. In questo studio non abbiamo esplorato i

meccanismi molecolari alla base di questa modulazione recettoriale, ma è stato

suggerito in proposito che la trasmissione corticale glutammatergica giocherebbe un

ruolo importante nella riduzione dell’attività dopaminergica striatale indotta dalla

clozapina (Millan 2005).

Un altro dato interessante è che l’espressione genica del BDNF, in corteccia

prefrontale e nello striato, corrisponde a quella che abbiamo osservato per i recettori

D2, in quanto analogamente inibita dalla clozapina, somministrata da sola o in

combinazione con il quinpirolo. Questo effetto similare non era poi così inatteso, dal

momento che l’attivazione degli eteromeri D1-D2 dopaminergici provoca un aumento

della sintesi di BDNF striatale attraverso il signaling della cascata del calcio (Hasbi et

al. 2009). Secondo questo meccanismo, la sintesi di BDNF è bloccata dal D2

antagonista raclopride, ma non è attivata dal quinpirolo alle concentrazioni selettive

per i recettori D2. Quest’evidenza spiegherebbe perché, nel nostro esperimento, non

abbiamo osservato un aumento nell’espressione di BDNF sia in corteccia che nello

striato, quando gli animali venivano trattati con quinpirolo da solo. D’altra parte, è

stato ripetutamente osservato che la co-attivazione dei recettori D1 aumenta le

risposte farmacologiche al quinpirolo, inclusa l’iperdipsia (Fraioli et al. 1997).

E’ stato osservato che l’ippocampo ventrale regola la PPI nel ratto (Swerdlow et al.

2004), mentre la sua porzione anteriore risulta ridotta nei polidipsici e negli

26

schizofrenici iponatremici (Goldman et al. 2007b). Nel nostro esperimento, la

somministrazione ripetuta (5 giorni) di quinpirolo ha provocato la riduzione

dell’espressione del BDNF nell’ippocampo ed ha incrementato quella del gene c-Fos

in corteccia prefrontale; entrambi questi effetti sono stati annullati dalla preventiva

co-somministrazione di clozapina, come già osservato in studi precedenti (Deutch e

Duman 1996; Fumagalli et al. 2001). E’ importante notare che le lesioni

dell’ippocampo ventrale aumentano la capacità dell’apomorfina di inibire la PPI

(Swerdlow et al. 2004). Inoltre, nucleus accumbens e corteccia prefrontale mediale

sono considerati responsabili per l’aumentata sensibilità alla distruzione della PPI

indotta dalla lesione ippocampale (Swerdlow et al. 2004). Anche l’aumento

dell’espressione del c-Fos in corteccia è risultato altamente correlato all’intensità di

inibizione della PPI indotta dal quinpirolo. Possiamo concludere quindi che questi

effetti robusti del quinpirolo nella corteccia siano una probabile conseguenza di una

ipofunzionalità dell’ippocampo, come confermato dalla ridotta espressione di BDNF.

In conclusione, il nostro studio sostiene ulteriormente l’ipotesi che l’iperdipsia indotta

dal quinpirolo nel ratto sia un effetto farmacologico robusto, in grado di riprodurre la

polidipsia psicotica. In particolare, il fatto che siano comparabili, negli stessi animali,

il drinking non-regolatorio e la distruzione della PPI, permette di chiarirne in maniera

più completa le basi neurobiologiche. Con questo studio abbiamo dimostrato infatti

che gli effetti del quinpirolo sono associati a modulazioni nell’espressione di early

genes in quelle regioni del cervello coinvolte nella manifestazione della schizofrenia e

presumibilmente della polidipsia psicotica.

27

PARTE SECONDA

28

6. POLIDIPSIA E COMPONENTE COMPULSIVA

Considerando che un disturbo viene generalmente definito come “psicogeno” quando

se ne attribuisce la responsabilità a fattori psichici piuttosto che organici (APA, 1980),

possiamo ragionevolmente assumere che l’incontrollata assunzione di liquidi, sia

nell’uomo sia negli animali di laboratorio, possa essere definita come “polidipsia

psicogena”. Un aspetto della polidipsia psicogena da tenere in considerazione è la sua

natura perseverativa. In proposito, uno studio dettagliato del pattern d’ingestione di

liquidi in pazienti polidipsici suggerisce che un tipico episodio di bevuta viene

ripetuto in eccesso (Shutty et al. 1997), confermando così l’idea che la polidipsia sia

un comportamento stereotipato (Tracy et al. 1996) piuttosto che la manifestazione di

una sregolazione del bilancio idro-salino.

Partendo dunque dall’assunto che il QNP ha la capacità di spingere gli animali a

perseverare in uno specifico comportamento mirato al bere, anche quando questo

risulti inutilmente costoso (vedi Parte terza di questa trattazione), è lecito supporre

che un eccessivo consumo d’acqua in condizioni di accesso libero alla risorsa

rappresenti la manifestazione di una condotta ripetitiva che va ben oltre i bisogni

fisiologici. E’ importante sottolineare che l’esposizione ripetuta al QNP produce un

ventaglio di effetti comportamentali definibili come “eccessivi”. Szechtman e

collaboratori (1998; 2001), per esempio, includono in questo ambito il perseverare su

un determinato percorso e l’insistenza nel “checking” di un oggetto non familiare da

parte degli animali. Tale comportamento di “repetitive checking” o controllo

ripetitivo, appartiene allo spettro delle manifestazioni del Disturbo Ossessivo

Compulsivo (OCD). Quello che infatti si osserva nei pazienti con OCD consiste

29

proprio nella ripetizione di determinati rituali di controllo che rappresentano una

estremizzazione patologica di un comportamento altrimenti naturale di verifica delle

condizioni di sicurezza. Il “repetitive checking” osservato nei ratti trattati con QNP

soddisfa tutti i criteri stabiliti per definirlo come un comportamento di tipo

compulsivo: presenza di un pattern motorio ripetuto, estrema difficoltà a distaccarsi

dall’oggetto del rituale, modulazione ambientale del comportamento, e

estremizzazione di un comportamento normale (Szechtman et al. 1998). Inoltre, gli

stessi autori hanno osservato come il controllo ripetitivo possa essere sospeso, quando

venga inserito nell’ambiente un elemento distraente, formulando quindi un’ulteriore

analogia con la patologia compulsiva dell’uomo (Szechtman et al. 2001). Questi

pazienti percepiscono infatti la compulsione come “ego distonica” cioè disturbante e

dunque, se ne hanno la possibilità, tentano di rivolgere l’attenzione verso uno stimolo

diverso, appunto distraente. In merito a quest’ultima caratteristica, è interessante

rilevare come nella pratica clinica il comportamento polidipsico venga spesso riferito

come un bere compulsivo, che porta sollievo in una condizione di ansia legata ad una

idea pervasiva (ossessione).

30

7. RUOLI OPPOSTI DEI SISTEMI DOPAMINERGICO ED

ORESSINERGICO

Al fine di evidenziare la presenza di una componente compulsiva alla base del

drinking non-regolatorio, abbiamo apportato delle modifiche al nostro modello di

polidipsia indotto da QNP, agendo sul contesto sperimentale (setting). Abbiamo

pertanto testato, nello stesso arco temporale in cui la polidipsia si manifesta (cioè tra 2

e 5 ore dal trattamento con QNP), gli animali in due differenti condizioni di accesso

alla risorsa idrica: libera (HOME setting) e operante (OPERANT setting). In questo

modo abbiamo potuto valutare gli eventuali cambiamenti della risposta polidipsica al

QNP nel passaggio da una condizione (libero accesso) all’altra (accesso operante).

Nello specifico, se la polidipsia indotta dall’agonista dopaminergico in condizioni di

libero accesso è mantenuta anche in un contesto operante, essa risulterebbe finalizzata

solo all’ottenimento della risorsa, indipendentemente dal contesto in cui essa si è

sviluppata. Al contrario, se gli animali divenuti polidipsici nel contesto familiare

(HOME) non mantengono il comportamento eccessivo di bevuta una volta spostati

nelle gabbie operanti (OPERANT), ma piuttosto manifestano una dissociazione tra la

componente appetitiva e consumatoria del bere, come descritto nel modello di

contrafreeloading (CFL) (Cioli et al. 2000; Amato et al. 2006), è lecito ipotizzare che

essi siano guidati dalla componente compulsiva del comportamento potomanico.

Abbiamo inoltre ipotizzato che il trattamento concomitante con l’aloperidolo potesse

avere effetti distinti nelle due condizioni di accesso alla risorsa, in accordo con

l’evidenza che il trattamento con i D2 antagonisti inibisce l’accesso operante in favore

di quello libero ad una risorsa alimentare (Salamone et al. 1991).

31

Il secondo obiettivo di questa parte dello studio è consistito nell’esplorare i

meccanismi molecolari alla base della polidipsia da QNP, partendo dall’assunto che

altri neurotrasmettitori, oltre la dopamina, partecipino all’induzione di questo

fenomeno. In proposito, abbiamo focalizzato la nostra attenzione sull’oressina A

(OxA), un peptide ipotalamico coinvolto nella regolazione del comportamento

alimentare (Sakurai 2007). Come già accennato, un polimorfismo del gene per il

recettore oressinico di tipo 1 è stato osservato in soggetti polidipsici (Meerabux et al.

2005). Un signaling oressinergico anomalo potrebbe pertanto contribuire al rischio di

sviluppare la polidipsia in quei soggetti già affetti da disfunzioni dopaminergiche

centrali. In particolare è stato precedentemente osservato che il modafinil, farmaco

attivatore del sistema oressinergico, migliora le performance cognitive nei pazienti

psicotici (Minzenberg e Carte 2008), probabilmente attraverso l’attivazione della

corteccia prefrontale dorsolaterale (Hunter et al. 2006). Ancora, una serie di studi

riporta che la via ascendente talamo-corticale, coinvolta nell’attenzione e nella

working memory e che è stimolata dai peptidi oressinici (Lambe et al. 2005), è ridotta

in volume (Lang et al. 2006) e connettività (Lewis et al. 2001) nei soggetti

schizofrenici. Nel loro insieme, questi dati suggeriscono il coinvolgimento di una

alterata trasmissione oressinergica nella patogenesi della schizofrenia.

Alla luce di queste considerazioni, abbiamo indagato, con i nostri esperimenti, se gli

animali trattati con QNP mostrassero livelli alterati di espressione della proteina

oressinica OxA, sia nell’ipotalamo che nella corteccia cerebrale. Inoltre, per meglio

caratterizzare il possibile ruolo dell’oressina nelle nostre condizioni sperimentali,

abbiamo studiato gli effetti del QNP in co-somministrazione con dosi differenti di

SB-334867, antagonista del recettore oressinico 1.

32

8. RISULTATI

8.1 Esperimento 1a: L’aloperidolo previene la polidipsia indotta da QNP

La figura 1 mostra il consumo d’acqua negli ultimi 5 giorni di trattamento, per gli

animali in HOME (A) e HOME+OPERANT (B), misurato negli intervalli tra 0-4 ore

(pannello di sinistra) e 4-5 ore (pannello di destra) dall’iniezione di QNP. Nel primo

intervallo (0-4 ore), l’ANOVA a tre vie ha evidenziato un effetto significativo del

gruppo (i.e. HOME e HOME+OPERANT) [F1,79=8.2 e p<.01], del trattamento con

QNP [F1,79=21.4 e p<.001], del pretrattamento con Hal [F2,79=7.0 e p<.01], e

dell’interazione Hal-QNP [F2,79=5.8 e p<.01]. Non è stato evidenziato alcun effetto di

interazione tra gruppo e trattamento. L’analisi mostra chiaramente che gli animali

appartenenti al gruppo HOME+OPERANT, moderatamente assetati durante la fase di

addestramento, hanno bevuto significativamente di più rispetto al gruppo HOME.

Ciononostante, l’analisi post hoc ha confermato che il trattamento con QNP da solo

ha aumentato significativamente la quantità di acqua ingerita rispetto ai controlli,

indipendentemente dal gruppo (p<.01 e p<.05 verso i controlli, rispettivamente per

HOME e HOME+OPERANT). Solo il pretrattamento con la dose maggiore di Hal

(0.2 mg/kg) ha inibito lo sviluppo della polidipsia da QNP in entrambi i gruppi (p<.05

e p<.01 verso i controlli trattati con QNP), mentre la dose minore è risultata

inefficace. Nell’ultima ora di osservazione (cioè tra la 4a e la 5a ora), i ratti HOME

sono stati lasciati nelle loro gabbie con libero accesso all’acqua, mentre gli

HOME+OPERANT sono stati spostati nelle gabbie operanti con l’accesso all’acqua

solo tramite la pressione della leva. L’ANOVA a tre vie per quest’ultimo intervallo

temporale ha evidenziato un effetto significativo per il solo setting [F1,79=21.0 e

33

p<.001], né il pretrattamento con Hal [F2,79=2.3], né il trattamento con QNP

[F1,79=0.6] essendosi rivelati efficaci. Questi dati hanno mostrato dunque che il

passaggio dall’accesso libero a quello operante tra la 4a e la 5a ora abolisce la risposta

polidipsica al QNP.

34

Figura 1

Gli istogrammi rappresentano i grammi di acqua ingerita dagli animali appartenenti al gruppo HOME (n=6-10) in a, e HOME+OPERANT (n=6-11) in b, tra le prime 4 ore (pannello di sinistra) e l’tra la 4a e la 5a ora (pannello di destra). Gli animali appartenenti al gruppo HOME+OPERANT sono stati spostati, tra la la 4a e la 5a ora, nelle gabbie operanti in cui l’acqua era disponibile solo attraverso la pressione della leva. I valori sono espressi come media±ESM della media della quantità di acqua ingerita negli ultimi 5 giorni di trattamento. *p<.01 e **p<.001 verso veh (veicolo).

[F(1,79)=21.0, p<0.001], while neither Hal pretreatment[F(2,79)=2.3] nor QNP [F(1,79)=0.6] were effective.These data showed that polydipsic response to QNP wasnot maintained when switching rats from free access tooperant access to water in the 4–5 h time frame.

Polydipsic rats exhibit dissipative behavior in operantsetting

Yet, Fig. 2a shows that there was a robust inversecorrelation (r=!0.84, p<0.001) between free water intake(g) measured at 0–4 h and % consumption measured in thelast hour among QNP-treated rats that received vehicle aspretreatment (black triangles). The correlation persistedwhen controlling for number of reinforcers gained (r=!0.87, p<0.001). Hal pretreatment at both doses waseffective in increasing the fraction of QNP-treated ratsdisplaying % consumption values in the CI range ofcontrols (83.4–94.2%) [Fisher exact probability test: p<0.05 and p<0.01, respectively, for Hal 0.1 and Hal 0.2 (sixout of eight and six out of seven rats, respectively) vsvehicle pretreatment (3 out of 11 rats)]. Number ofreinforcers earned, inactive lever presses, and extra leverpresses (presses emitted during reinforcer delivery) werenot significantly different between treatment groups(Fig. 2b, c, and d). Control groups did not showcorrelation between water intake at 0–4 h and %consumption in the 4–5 h interval (data not shown). Thesedata demonstrate that the polydipsic effect of QNP is

Fig. 1 Water intake in a HOME group (n=6–10) and in b HOME +OPERANT group (n=6–11) in the 0–4 h (left panels) and 4–5 h timeinterval (right panels). Note that rats in the HOME + OPERANTgroup were moved to operant conditioning chambers for the 4–5 htime interval where water was available only through lever pressing.Values are expressed as mean ± SEM of the average water intake forthe last 5 days of treatment. *p<0.01 vs veh, **p<0.001 vs veh; vehvehicle

Fig. 2 a Correlation between free water intake measured 0–4 h aftertreatment and % consumption of water relative to the following 4–5 htime interval spent in operant chambers (expressed as percentage ofwater consumed over water gained through lever pressing at FR3schedule of reinforcement) for rats in the HOME + OPERANT group.Data are the mean of the last 5 days of testing. Control rats are notshown as symbols, but virtually fall in the area delimited by the

dashed lines, which represent the upper bound of CI for 0–4 h freewater-intake (horizontal line) and the lower bound of 95% confidenceinterval (CI) for % consumption (vertical line), measured in control rats.Solid line shows the correlation (r=!0.84; p<0.001) in QNP-treated ratsthat received vehicle as pretreatment (filled triangles). Additionalbehavioral parameters measured in the HOME + OPERANT groupare presented in panels b, c, and d


35

8.2 Esperimento 1b: Gli animali polidipsici esibiscono un comportamento

dissipativo nel contesto operante

La Figura 2a mostra una robusta correlazione inversa (r=-0.84, p<.001) tra il bere

libero (in grammi), misurato nel primo intervallo (0-4 ore), e la percentuale di

consumo misurata nell’ultima ora negli animali che hanno ricevuto il veicolo come

pretrattamento. La correlazione si è mantenuta anche nel numero di rinforzi

guadagnati (r=-0.87 e p<.001). Entrambe le dosi di Hal hanno aumentato il numero di

animali trattati con QNP che hanno mostrato valori di percentuale di consumo

all’interno dell’intervallo di confidenza (CI) dei controlli (83.4-94.2%) [test di Fisher

della probabilità esatta: p<.05 e p<.01, rispettivamente, per Hal 0.1 e 0.2 verso il

pretrattamento con veicolo]. Il numero di rinforzi, le pressioni sulla leva inattiva e le

pressioni extra (pressioni effettuate durante il rilascio del rinforzo) non hanno subito

variazioni tra i gruppi di trattamento (Figura 2b, c e d). Non si è evidenziata alcuna

correlazione tra la bevuta a 0-4 ore e la percentuale di consumo nell’ultima ora, negli

animali di controllo (dati non mostrati).

Questi risultati dimostrano che, nel contesto operante, l’effetto polidipsico del QNP è

correlato ad un comportamento dissipativo in cui gli animali consumano solo una

porzione dei rinforzi guadagnati. Nonostante l’inefficacia nel contrastare la polidipsia,

la dose bassa di Hal (0.1 mg/kg) ha abolito tale dissociazione.

36

Figura 2

a Correlazione tra l’acqua ingerita nell’intervallo tra 0-4 ore dal trattamento e la percentuale (%) di consumo relativa all’intervallo 4-5 ora speso nelle gabbie operanti (espresso come percentuale di acqua consumata sull’acqua ottenuta attraverso la pressione della leva, al costo di FR3) per i ratti appartenenti al gruppo HOME+OPERANT. I valori sono la media degli ultimi 5 giorni di test. I controlli non sono mostrati con simboli, ma virtualmente si trovano nell’area delimitata dalle linee tratteggiate, che rappresentano rispettivamente il limite massimo dell’intervallo fiduciale (CI) per 0-4 ore (linea tratteggiata orizzontale) e quello minimo del 95% del CI per la percentuale di consumo (linea tratteggiata verticale) dei controlli. La linea continua mostra la correlazione (r=-0.84; p<.001) nei ratti trattati con QNP che hanno ricevuto il veicolo come pretrattamento (triangoli neri). Altri parametri comportamentali misurati nel gruppo HOME+OPERANT sono rappresentati nei pannelli b, c e d.

[F(1,79)=21.0, p<0.001], while neither Hal pretreatment[F(2,79)=2.3] nor QNP [F(1,79)=0.6] were effective.These data showed that polydipsic response to QNP wasnot maintained when switching rats from free access tooperant access to water in the 4–5 h time frame.

Polydipsic rats exhibit dissipative behavior in operantsetting

Yet, Fig. 2a shows that there was a robust inversecorrelation (r=!0.84, p<0.001) between free water intake(g) measured at 0–4 h and % consumption measured in thelast hour among QNP-treated rats that received vehicle aspretreatment (black triangles). The correlation persistedwhen controlling for number of reinforcers gained (r=!0.87, p<0.001). Hal pretreatment at both doses waseffective in increasing the fraction of QNP-treated ratsdisplaying % consumption values in the CI range ofcontrols (83.4–94.2%) [Fisher exact probability test: p<0.05 and p<0.01, respectively, for Hal 0.1 and Hal 0.2 (sixout of eight and six out of seven rats, respectively) vsvehicle pretreatment (3 out of 11 rats)]. Number ofreinforcers earned, inactive lever presses, and extra leverpresses (presses emitted during reinforcer delivery) werenot significantly different between treatment groups(Fig. 2b, c, and d). Control groups did not showcorrelation between water intake at 0–4 h and %consumption in the 4–5 h interval (data not shown). Thesedata demonstrate that the polydipsic effect of QNP is

Fig. 1 Water intake in a HOME group (n=6–10) and in b HOME +OPERANT group (n=6–11) in the 0–4 h (left panels) and 4–5 h timeinterval (right panels). Note that rats in the HOME + OPERANTgroup were moved to operant conditioning chambers for the 4–5 htime interval where water was available only through lever pressing.Values are expressed as mean ± SEM of the average water intake forthe last 5 days of treatment. *p<0.01 vs veh, **p<0.001 vs veh; vehvehicle

Fig. 2 a Correlation between free water intake measured 0–4 h aftertreatment and % consumption of water relative to the following 4–5 htime interval spent in operant chambers (expressed as percentage ofwater consumed over water gained through lever pressing at FR3schedule of reinforcement) for rats in the HOME + OPERANT group.Data are the mean of the last 5 days of testing. Control rats are notshown as symbols, but virtually fall in the area delimited by the

dashed lines, which represent the upper bound of CI for 0–4 h freewater-intake (horizontal line) and the lower bound of 95% confidenceinterval (CI) for % consumption (vertical line), measured in control rats.Solid line shows the correlation (r=!0.84; p<0.001) in QNP-treated ratsthat received vehicle as pretreatment (filled triangles). Additionalbehavioral parameters measured in the HOME + OPERANT groupare presented in panels b, c, and d


37

8.3 Esperimento 1c: Effetto dell’interazione aloperidolo/QNP sull’accesso

operante all’acqua

Al fine di valutare la possibilità che gli effetti di Hal e QNP sulla percentuale di

consumo fossero in relazione con il loro stato di idratazione, abbiamo utilizzato

animali semi-deprivati di acqua durante tutto l’esperimento e con solo accesso

operante all’acqua per 1 ora (0-60 min). E’ stato così evidenziato un effetto

significativo del pretrattamento, del trattamento e dell’interazione, sia nei rinforzi

guadagnati che nella bevuta [rinforzi: F1,53 = 4.5, p < .05; Hal, F2,53 = 16.3; Hal ×

QNP, F2,53 = 11.9, p < .001; bevuta: QNP, F1,53 = 44.2; Hal, F2,53 = 26.0; Hal × QNP,

F2,53 = 30.6; tutti p<.001] (Figura 3a, b). L’Hal ha avuto un effetto significativo anche

sul numero di pressioni extra [F2,53 = 3.3 e p<.05] (Figura 3c). Per quanto riguarda la

percentuale di consumo d’acqua, l’ANOVA ha evidenziato un effetto significativo del

QNP [F2,53=23.0 e p<.001] e dell’interazione Hal × QNP [F2,53=14.6 e p<.001]

(Figura 3d). Il test post hoc di Bonferroni ha ultreriormente confermato l’efficacia

delle due dosi di Hal nell’aumentare la percentuale di consumo d’acqua, prevenendo

la dissociazione indotta dal QNP (p<.05 verso i vehicle-QNP).

38

Figura 3

Effetto di Hal e QNP sul comportamento operante per l’acqua tra 0 e 60 min. a Numero di rinforzi guadagnati attraverso la pressione della leva. b Acqua consumata in grammi (g). c Numero di pressioni extra della leva (pressioni emesse in più quando il rinforzo è già rilasciato). d Percentuale di consumo (%), espressa come rapporto tra l’acqua consumata (g) su l’acqua guadagnata attraverso la pressione della leva; n=9. I valori sono espressicome media±ESM della media di 6 giorni di trattamento. *p<.01; **p<.001 within group.

correlated to a dissipative behavior in the operant setting,where animals consume only a portion of the reinforcerscollected. Although ineffective in contrasting polydipsia,Hal 0.1 mg/kg pretreatment abolished this dissociation.

Operant only group (0–60 min)

As previously explained, we checked whether Hal and QNPeffect on % consumption was unrelated to the hydrationstatus of the rats by examining separate groups of subjectswho were semi-deprived of water throughout the experi-ment and tested for 1 h (0–60 min) in the operant settingonly. A significant effect of QNP, Hal, as well as asignificant interaction between treatments, was found onboth reinforcers earned and water intake [reinforcers: QNP,F(1,53)=4.5, p<0.05; Hal, F(2,53)=16.3; Hal!QNP, F(2,53)=11.9, p<0.001; water intake: QNP, F(1,53)=44.2;Hal, F(2,53)=26.0; Hal ! QNP, F(2,53)=30.6; all p<0.001](Fig. 3a, b). Hal had a significant impact also on thenumber of extra lever presses [F(2,53)=3.3, p<0.05](Fig. 3c). Importantly, ANOVA showed a significant effectof QNP [F(2,53)=23.0, p<0.001] and a significant Hal !QNP interaction effect [F(2,53)=14.6, p<0.001] on %consumption of water (Fig. 3d). Bonferroni post hoc testconfirmed that both doses of Hal were effective inaugmenting the % consumption of water, thus preventingthe dissociation induced by QNP (p<0.05 vs vehicle-QNP).

Locomotor activity

In order to exclude that the interaction between QNP andHal on drinking behavior was the result of a generalizedbehavioral impairment, we conducted two experimentsthat matched the two previous experiments but whereinlocomotion was measured instead of drinking (seeSupplementary Material for description of methods andFigs. 1S and 2S). Hal 0.2 mg/kg alone did not affectlocomotor activity in any of the conditions tested, whileanimals that received both Hal and QNP showed anoverall poorer performance compared to controls inconditions of water deprivation.

Experiment 2

Chronic QNP treatment induces overexpression of OxAin the cortex

In experiment 2, we tested whether acute and repeatedQNP treatment would alter hypothalamic and corticalexpression of OxA. As shown in Fig. 4, 9 days ofrepeated QNP treatment, but not acute treatment, resultedin (A) increased water intake [two-way ANOVA, QNPtreatment: F(1,12)=32.8, p<0.001] and in (B) enhancedexpression of OxA levels in SI (Kruskal–Wallis one-wayanalysis: H=19.08, df=4, p<0.001; p<0.01 vs vehicle; p<0.01 vs acute QNP at Mann–Whitney post hoc test; seeFig. 5 for photomicrographs). Pretreatment with Hal0.2 mg/kg reduced both water intake [two-way ANOVA,treatment interaction Hal!QNP: F(1,12)=26.8, p<0.001]and OxA optical density to control levels (p<0.01 vschronic QNP). Acute injection of QNP did not modifywater intake [t(10)=0.55]. No changes in OxA expressionwere observed in the hypothalamus (C; Kruskal–Wallisone-way analysis: H=5.1, df=4, p=0.27] and in otherareas of investigation (data not shown).

As far as blood corticosterone levels are concerned, onlyacute QNP treatment produced a significant reduction inlevels measured 5 h after treatment (Kruskal–Wallis one-way analysis: H=11.1, df=4, p<0.05; p<0.01 vs controls atpost hoc), as shown in panel D of Fig. 4.

Experiment 3

SB-334867 potentiates QNP-induced polydipsia

In experiment 3, we tested the hypothesis that pretreat-ment with the orexin-1 receptor antagonist SB-334867would strengthen QNP effect on water intake. Becausecombined treatment with SB-334867 and QNP deter-mined a significant reduction in weight gain oversessions compared to controls [session!group ANOVA:

Fig. 3 Effect of Hal and QNP on operant behavior for water in the 0–60 min time frame. a Number of reinforcers gained through leverpressing. b Water intake (g). c Number of extra lever presses (pressesemitted while the reinforcer is delivered). d % consumption, expressedas water consumed (g) over water gained through lever pressing; n=9.Values are expressed as mean ± SEM of the average for the 6 days oftreatment. *p<0.01; **p<0.001 within group


39

8.4 Esperimento 1d: Effetto dell’interazione aloperidolo/QNP sull’attività

locomotoria

Al fine di poter escludere che l’effetto dell’interazione tra QNP e Hal sul

comportamento ingestivo fosse il risultato di una alterazione generalizzata del

comportamento, abbiamo condotto due esperimenti analoghi ai precedenti con la

differenza di aver misurato l’attività locomotoria invece della bevuta (Figura 4 e 5). In

condizioni di deprivazione di acqua, la dose maggiore di Hal (0.2 mg/kg), da sola,

non ha influenzato la locomozione in alcuna delle condizioni testate, mentre gli

animali che hanno ricevuto Hal e QNP in co-somministrazione hanno mostrato una

minor performance rispetto a quella dei controlli.

40

A

B

Figura 4

Attività locomotoria verticale (A) e orizzontale (B) misurata 4 ore dopo il trattamento con QNP, nei giorni 1 e 9. I valori sono espressi come media±ESM (n=6/gruppo) ; *p<.05 verso i vontrolli (veh-sal).

veh-sal veh-QNP hal-sal hal-QNP0

50

100

150

200

250day 1

day 9


500

1000

1500

2000

*

*

41

A

B

Figura 5

Attività locomotoria verticale (A) e orizzontale (B) misurata 15 min dopo il trattamento con QNP, in animali deprivati (n=6/gruppo), nei giorni 1 e 6. I valori sono espressi come media±ESM; *p<.05 e **p<.001 verso i vontrolli (veh-sal).


50

100

150

200day 1

day 6

**

**

**

*


500

1000

1500

2000

2500

3000

* *

*

42

8.5 Esperimento 2: Il trattamento ripetuto con QNP aumenta l’espressione di

OxA nella corteccia

Nel secondo esperimento, abbiamo verificato se la somministrazione acuta o ripetuta

di QNP fosse in grado di modificare l’espressione ipotalamica e corticale di OxA.

Come mostrato nella Figura 6, nove giorni di trattamento con QNP, ma non la

somministrazione acuta del farmaco, hanno provocato (A) un aumento della bevuta

[ANOVA a due vie, F1,12=32.8 e p<.001 per il trattamento con QNP] e (B)

dell’espressione di OxA nella corteccia [Kruskal-Wallis: H=19.08, df=4 e p<.001; al

test post hoc di Mann-Whitney: p<.01 verso i veicoli; p<.01 vs QNP in acuto] (Figura

7). Il pretrattamento con 0.2 mg/kg di Hal ha ridotto sia la bevuta [ANOVA a due vie:

F(1,12) = 26.8, p < 0.001 per l’interazione Hal×QNP] che la densità ottica di OxA ai

livelli dei controlli (p<.01 verso il QNP ripetuto). La somministrazione acuta di QNP

non ha invece modificato la quantità d’acqua bevuta [t(10)=0.55] né nell’ipotalamo

sono stati osservati cambiamenti a carico dell’espressione di OxA (Figura 6, pannello

C, Kruskal-Wallis: H=5.1, df=4 e p=0.27).

Come mostrato nel pannello D della Figura 6, dall’analisi dei livelli di corticosterone

nel sangue è risultato che solo la somministrazione acuta di QNP ha prodotto una

significativa riduzione della concentrazione ematica dell’ormone a 5 ore dal

trattamento (Kruskal-Wallis: H=11.1, df=4, p<.05; p<.01 verso i controlli al post

hoc).

43

Figura 6

I dati rappresentano l’acqua consumata e l’espressione dell’oressina A (OxA) nella corteccia dei ratti (n=4-8) sotto trattamento ripetuto di QNP. a Quantità di acqua consumata dopo 5 ore dal trattamento (p<.001 QNP verso tutti gli altri gruppi). b Densità ottica (O.D.) dell’OxA nell’area somatosensoriale (*p<.01 verso tutti gli altri gruppi). c O.D. di OxA nell’ipotalamo. d Livelli di corticosterone plasmatico espressi in microgrammi/100 ml (*p<.01 verso veh = controlli).

F(8.1,73.2)=6.2, p<0.0001; p<0.05 vs controls at posthoc test], we analyzed water intake as water (g)/kg of bodyweight.

Pretreatment with SB-334867 at the higher dose(4 mg/kg) augmented the polydipsic response to QNP,specifically potentiating water intake in the first days oftesting (Fig. 6a). Two-way repeated measures ANOVAdemonstrated a significant effect of QNP [F(1,37)=40.4,p<0.0001], but no effect of SB-334867 [F(2,37)=1.0], nora SB-334867!QNP interaction [F(2,37)=0.5]. Based onour a priori hypothesis, we analyzed the effect of treatmentcombinations using planned comparisons. As expected,we found that pretreatment with SB-334867 4 mg/kg i.p.significantly increased the polydipsic response to QNP(p<0.05) at the time interval of days 2–3 (Fig. 6c), whilethe lower dose (2 mg/kg), although showing a trendtowards increase at each time point, did not. Moreover,SB-334867 pretreatment linearly increased the percentageof QNP-treated rats already polydipsic on day 1 from 25%(vehicle) to 50% (2 mg/kg) to 71.4% (4 mg/kg; Fig. 6b).Number of polydipsic rats per group and number of testdays in which rats displayed polydipsia were not influ-enced by pretreatment [Fisher exact probability test: p=1.0and one-way ANOVA: F(2,22)=1.7, respectively]. SB-334867 did not alter water intake in controls at any timepoint.

Discussion

In this study, we further investigated behavioral, phar-macological, and neurotransmitter mechanisms underpin-ning QNP-induced non-regulatory drinking in the rat, aputative model of psychotic polydipsia. Three majorfindings were provided. First, the dissociation betweenappetitive and consummatory components of drinkingbehavior, displayed in the operant conditioning setting,was here robustly correlated with the intensity ofprevious polydipsic response in the presence of freelyavailable water, suggesting a compulsive component inthis experimental model of polydipsia. Second, in testingthe sensitivity of QNP effects to Hal pretreatment wefound a gradient of activity of the antipsychotic drug,with the higher dose (0.2 mg/kg) completely preventingboth the development of polydipsia and the dissociationbetween appetitive and consummatory components, whilethe 0.1 mg/kg dose was only effective in abolishing thedissociation. The third major finding of this study is theamplified OxA expression in the cortex of QNP-treatedrats. The possibility that this effect mirrored the expres-sion of an altered cortical control over drinking behaviorwas then supported by the augmentation of QNP-inducedpolydipsia when administering the orexin-1 receptorantagonist SB-334867.

Fig. 4 Water intake and orexinA (OxA) expression in thecortex of rats (n=4–8) underchronic QNP treatment. a Freewater intake measured 5 h aftertreatment (p<0.001 QNP vs allother groups). b Optical density(O.D.) of OxA in the somato-sensory area (*p<0.01 vs allother groups). c O.D. of OxA inthe hypothalamus. d Plasmacorticosterone levels expressedin micrograms/100 ml (*p<0.01vs vehicle controls)


44

Figura 7

I fotomicrografici illustrano l’espressione di OxA immunoreattiva nell’area somatosensoriale. a veh+veh (controlli). b, f veh+QNP. c veh+QNP acuto. d Hal+veh. e Hal+QNP. g Rappresentazione grafica della regione corticale in cui è stata effettuata l’analisi della O.D. di OxA; n=4-8. Distanza dal bregma +1.20 mm; scale bar, 250 µm per a-e, 50 µm per f.

In our animal model, polydipsia develops between the2nd and 5th hour following repeated daily treatment withthe dopaminergic agonist QNP in rats (Fraioli et al. 1997).Here we further characterized the model by switchingcondition of access to water in the last experimental hourfrom free to operant. As shown, rats under QNP, while stillmaintaining a fluid intake similar to controls, displayed adissipative behavior in the operant setting, consuming onlya fraction (about 60% mean) of the water earned at FR3schedule of reinforcement. Thus animals did not adaptresponding to their hydric needs, confirming the dissocia-tion between appetitive (expressed by lever pressing) andconsummatory (licking water from the dipper) componentsof drinking that we have already observed with QNP in thecontrafreeloading model (Milella et al. 2008). This behaviorwas not related to an increased number of presses emittedwhile the reinforcer was delivered (extra lever pressing).We can thus exclude that animals were ingesting only partof the water earned because incapable to stop lever pressingin order to consume the reinforcer. Most remarkably, we

here show that the % consumption, which was our measurefor the dissociation in the operant setting, was an inversefunction of the amount of water ingested in the first 4 h offree water intake. In other words, the level of polydipsiadeveloped in the HOME phase predicted the level ofdissociation shown in the subsequent OPERANT condition.Taken together, the present data suggest that behavioralrigidity elicited by the drug concurs to the development ofQNP-induced polydipsia. Taking into account that polydip-sia normally does not develop in all the QNP-treated rats, itis worth noting that the non-polydipsic rats, which havestable drinking levels identical to controls, do not presentdissociation of appetitive and consummatory componentswhen moved to the operant setting (Fig. 2, filled triangleson the bottom right). Moreover, Hal pretreatment thatblocks the development of polydipsia in the home setting(0.2 mg/kg) also blocks the expression of the dissociation inthe operant setting (Fig. 2, open squares). We thereforepropose that the excessive QNP-induced water intake is atleast in part mediated by a compulsive approach to the

Fig. 5 Photomicrographs illustrating OxA immunoreactive expres-sion in the somatosensory area. a veh + veh. b, f veh + QNP. c veh +QNP acute. d Hal + veh. e Hal + QNP. g Graphical representation of

the cortical region within which OxA O.D. analysis was assessed; n=4–8. Distance from bregma +1.20 mm; scale bar, 250 µm for a–e,50 µm for f


45

8.6 Esperimento 3: L’SB-334867 potenzia la polidipsia indotta da QNP

Nel terzo esperimento abbiamo verificato l’ipotesi che il pretrattamento con

l’antagonista del recettore oressinico 1, SB-334867, rafforzasse gli effetti del QNP sul

bere.

Dal momento che la co-somministrazione di QNP ed SB-334867 ha prodotto una

significativa riduzione del peso corporeo degli animali trattati rispetto ai controlli

[ANOVA sessione x gruppo: F(8.1,73.2) = 6.2, p <.0001; p < .05 verso i controlli al

test post hoc], abbiamo analizzato il comportamento di bevuta in termini di grammi

d’acqua per kg di peso corporeo. Il pretrattamento con la dose più alta di SB-334867

(4 mg/kg) ha aumentato la risposta polidipsica al QNP, potenziando la bevuta nei

primi giorni del test (Figura 8a). Sebbene l’ANOVA a due vie per misure ripetute

avesse mostrato un effetto significativo del QNP [F1,37=40.4 e p<.001], ma non

dell’SB-334867 [F2,37=1.0], né dell’interazione SB-334867xQNP [F2,37=0.5], sulla

base delle nostre ipotesi a priori, abbiamo analizzato gli effetti dei trattamenti tramite

confronti pianificati. Come atteso, il pretrattamento con la dose alta di SB-334867 (4

mg/kg) ha aumentato significativamente la risposta polidipsica al QNP (p<.05)

nell’intervallo di tempo tra i giorni 2 e 3 (Figura 8c), a differenza della dose minore (2

mg/kg) che ha mostrato solo una tendenza non significativo di aumento ad ogni

intervallo di tempo considerato. Inoltre nel giorno 1, il pretrattamento con SB-334867

ha incrementato linearmente la percentuale di animali trattati con QNP polidipsici, dal

25% (veicolo), al 50% (per la dose di 2 mg/kg) fino al 71.4% (per la dose di 4 mg/kg;

Figura 8b). Di per sé la somministrazione di SB-334867 non ha influenzato la bevuta

nei controlli.

46

Figura 8

a Effetto dell’antagonista del recettore oressinico 1 SB-334867 (SB) sull’acqua bevuta, in combinazione con QNP (n=6-8). SB2 e SB4 identificano le due dosi utilizzate nello studio, rispettivamente 2 e 4 mg/kg. b Percentuale dei ratti polidipsici al primo giorno di trattamento. c I valori sull’acqua bevuta mostrano l’effetto significativo dell’SB sulla polidipsia nella sua prima fase di sviluppo (giorni 2-3). Il giorno 1 è stato rappresentato separatamente per confermare che il QNP non ha avuto effetto sul giorno 1 di trattamento. I dati sono espressi come media±ESM. Solo i ratti considerati polidipsici (vedere Appendice, Materiali e metodi) sono stati inclusi nell’analisi. *p<.05 verso il gruppo veh+QNP.

water resource, and therefore should not be interpreted as afull goal-directed behavior towards water. Indeed D2/D3receptors stimulation has been associated with a variety ofcompulsive-like behaviors: among others, the compulsivechecking of specific places (Szechtman et al. 1998) and theenhancement of responding in the signal-attenuation model(Joel et al. 2001). It is worth noting that clinical reportshave repeatedly described polydipsia in terms of “compul-sive water drinking,” often highlighting the intrusivethought, the obsession, for the relief of which the behavioris performed (Rendell et al. 1978; Deas-Nesmith andBrewerton 1992). It has also been suggested that psychoticpolydipsia may belong to the realm of ritualistic orstereotyped (Shutty et al. 1995) conducts, based uponobservation of “set of actions” or association with repetitivemotor behaviors, such as pacing, grooming, or cigarettesmoking. Besides, obsessive-compulsive disorder (OCD)and schizophrenia co-diagnosis is well-known, with afrequency ranging from 3.5% to 25% of presence ofcompulsive symptoms in schizophrenic patients (Fentonand McGlashan 1986; Eisen et al. 1997), similar to whathas been reported for polydipsia.

It is important to note that QNP-induced behavioralrigidity in responding is more sensitive to D2 blockade thanpolydipsia. In fact, the lower Hal dose (0.1 mg/kg) blockedthe dissociation by raising the % consumption measured inthe operant setting to control levels (Fig. 2, open circles),

although it did not prevent, in the same animals, thedevelopment of polydipsia in the home setting. Neverthe-less, it drastically compressed the variability within thegroup in terms of water intake. In addition, QNP-induceddissociation and its sensitivity to Hal was also present whentesting a separate group of semi-deprived rats immediatelyin the operant conditioning chambers, indicating that thisphenomenon stands out independently and is not affectedby manipulation of experimental conditions such ashydration status and time course of testing (Fig. 3). Haland QNP effects on locomotor activity clearly show(Figs. 1S and 2S) that they cannot be directly responsiblefor the effects seen on water-reinforced behavior, ratherthey confirm that the reduction in % consumption of wateris a peculiar QNP-induced effect which stands on its own.

In conclusion, behavioral rigidity in responding appearsas a primary pharmacological effect of QNP that contrib-utes to the development of polydipsia. Yet it probably doesnot fully account for non-regulatory drinking induced bythe drug. There is no doubt that neuroendocrine defectsdevelop during psychotic polydipsia. When polydipsia isassociated with chronic hyponatremia, inappropriately highlevels of vasopressin (Goldman et al. 1988) and diminishedglucocorticoid negative feedback (Goldman et al. 2007a)have been found, and it has been suggested that they areconnected with the reduced volume of anterior hippocam-pus observed in these patients (Goldman et al. 2007b). In

Fig. 6 a Effect of orexin-1receptor antagonist SB-334867(SB) on free water intake incombination with QNP treat-ment (n=6–8). SB 2 andSB 4 stand for the two drugdoses used in the study, 2 and4 mg/kg, respectively. b Per-centage of rats which developedpolydipsia on the first day oftreatment. c Data on water in-take shown as dose–effectcurves by groups of 2 days oftreatment to show the significanteffect of SB on polydipsia in theearly phase of development(days 2–3). Day 1 was presentedseparately to confirm that QNPdoes not affect water intake onfirst day of treatment. Data areexpressed as mean ± SEM. Onlyrats that were considered poly-dipsic (see the “Methods andmaterials” section) were includ-ed in the analysis. *p<0.05compared with the vehicle-QNPtreatment group


47

9. DISCUSSIONE

Con questa serie di esperimenti abbiamo dimostrato che, (1) nel contesto di

condizionamento operante, la dissociazione tra la componente appetitiva e

consumatoria del comportamento ingestivo è strettamente correlata all’intensità della

risposta polidipsica instauratasi in condizione di libero accesso all’acqua. Inoltre, (2)

nel testare la sensibilità degli effetti del QNP al pretrattamento con l’aloperidolo,

abbiamo evidenziato un gradiente di attività dell’antipsicotico, in cui la dose

maggiore (0.2 mg/kg) ha abolito completamente sia la polidipsia che la dissociazione

tra componente appetitiva e consumatoria, mentre la dose minore (0.1 mg/kg) ha

abolito solo la dissociazione. Il terzo, e più interessante dato (3) è consistito

nell’aumentata espressione di OxA nella corteccia degli animali trattati con QNP. La

possibilità che questo effetto sia il riflesso di un alterato controllo corticale sul

comportamento del bere è stato ulteriormente documentato dall’incremento della

polidipsia da QNP provocato dalla somministrazione dell’SB-334867, antagonista del

recettore oressinico 1.

Come ripetutamente dimostrato, la la risposta iperdipsica compare tra la 2a e la 5a ora,

per somministrazione giornaliera di QNP nel ratto (Fraioli et al. 1997, Cioli et al.

2000, Amato et al. 2008). Con i nostri esperimenti abbiamo ulteriormente

caratterizzato il modello modificando le condizioni di accesso all’acqua che,

nell’ultima ora di osservazione, da libere sono divenute operanti. Dai nostri dati è

risultato che, nel contesto operante (FR3, cioè 3 pressioni sulla leva attiva per ottenere

un rinforzo), i ratti trattati con QNP, pur mantenendo la bevuta simile a quella dei

controlli, hanno adottato un comportamento dissipativo, consumando solo una

48

frazione (intorno al 60%) dell’acqua guadagnata. In questo modo gli animali non

hanno adattato il comportamento operante al loro fabbisogno idrico, confermando

così la dissociazione tra la componente appetitiva (espressa dalle pressioni sulla leva

attiva) e quella consumatoria del bere (leccare l’acqua dal dispenser), osservata già

nel modello di CFL (Milella et al. 2008). Questo comportamento non era dovuto ad

un possibile aumento del numero di pressioni effettuate durante il rilascio del rinforzo

(pressioni extra). Infatti, abbiamo potuto escludere che gli animali ingerissero solo

una porzione dell’acqua guadagnata in quanto incapaci di interrompere le pressioni

sulla leva per consumare il rinforzo. Interessante è il dato ulteriore che la percentuale

di consumo (vera misura della dissociazione nel contesto operante) era inversamente

proporzionale alla quantità di acqua ingerita nelle prime 4 ore di libero accesso alla

risorsa. In altre parole, il livello di polidipsia sviluppato nella fase HOME ha predetto

il livello di dissociazione nella condizione OPERANT. Nel loro insieme, questi dati

suggeriscono che la rigidità comportamentale accentuata dall’agonista dopaminergico

contribuisce allo sviluppo della polidipsia da QNP. Il fatto che i ratti cosiddetti “non

responders” al QNP, cioè coloro i quali non sviluppano la risposta polidipsica (Amato

et al. 2008), non hanno mostrato questa dissociazione nel contesto operante, dimostra

che questi fenomeni sono espressione di una risposta comune al QNP. Ancora, il

pretrattamento con aloperidolo che nel contesto HOME blocca lo sviluppo della

polidipsia (alla dose di 0.2 mg/kg), impedisce anche la dissociazione nel contesto

operante. Per queste ragioni possiamo suggerire che l’ingestione eccessiva di acqua

indotta dal QNP sia almeno in parte mediata dall’approccio compulsivo alla risorsa

stessa, e non interpretabile quindi come un comportamento mirato all’ottenimento di

essa, al fine di soddisfare un fabbisogno fisiologico. In proposito, la stimolazione dei

recettori D2/D3 è stata associata ad un’ampia gamma di comportamenti compulsivi,

49

tra i quali il checking ripetitivo di punti specifici (Szechtman et al. 1998) e l’aumento

del responding nel modello di signal-attenuation (Joel et al. 2001). In merito a queste

caratteristiche, è interessante rilevare come nella pratica clinica il comportamento

polidipsico venga spesso riferito come un bere compulsivo, che porta sollievo in una

condizione di ansia legata ad un’idea pervasiva (ossessione) (Rendell et al. 1978;

Deas-Nesmith e Brewerton 1992). E’ stato anche suggerito che la polidpsia psicotica

appartenga a quel tipo di condotte ritualistiche o stereotipate (Shutty et al. 1995), in

base all’osservazione di “set di azioni” caratterizzate da comportamenti motori

ripetitivi come il grooming o il fumo di sigarette. Nell’ambito dei pazienti

schizofrenici, esiste un sottogruppo di pazienti che presentano i sintomi del disturbo

ossessivo compulsivo, fino a quadri di franca sovrapposizione tra i due disturbi.

Questo sottogruppo ha la stessa prevalenza, compresa tra il 3.5 e il 26% (Fenton e

McGlashan 1986; Eisen et al. 1997), che si osserva per i pazienti polidipsici, e i suoi

membri presentano, come i polidipsici, un ridotto funzionamento cognitivo rispetto

agli schizofrenici non compulsivi (Lysaker et al. 2009).

E’ importante notare che la rigidità comportamentale indotta dal QNP nel premere la

leva in condizioni operanti, è più sensibile al blocco D2 rispetto alla polidipsia stessa.

La dose minore di Hal (0.1 mg/kg), infatti, ha bloccato la dissociazione producendo

un aumento della percentuale di consumo, misurata nel contesto operante, ai livelli

dei controlli (Figura 2, cerchi bianchi), seppur non prevenendo, negli stessi animali, la

polidipsia in condizione di libero accesso (HOME). Inoltre, la dissociazione indotta

dal QNP e la sua sensibilità all’Hal, si sono manifestate anche nel gruppo, testato a

parte, degli animali semi-deprivati e posti immediatamente nelle gabbie operanti. Ciò

indica che questo fenomeno non è influenzato dalla manipolazione delle condizioni

sperimentali come lo stato di idratazione e il time course dell’esperimento (Figura 3).

50

Inoltre, gli effetti di QNP e Hal sull’attività locomotoria mostrano chiaramente

(Figura 4 e 5) di non essere direttamente responsabili degli effetti osservati nel

comportamento operante, ma piuttosto confermano che la riduzione della percentuale

di consumo d’acqua è un effetto peculiare del QNP. In conclusione, la rigidità

comportamentale appare come un effetto farmacologico diretto del QNP, che

contribuisce allo sviluppo della polidipsia.

Il trattamento ripetuto con QNP, oltre ad aumentare il consumo d’acqua, induce un

incremento nell’espressione dell’oressina nella corteccia somatosensoriale,

evidenziata dall’immunoistochimica (Figura 5). Il pretrattamento con la dose

maggiore di Hal (0.2 mg/kg) blocca il fenomeno senza, come detto, alterare il

comportamento generale dei controlli. L’espressione della proteina nell’ipotalamo

non risulta invece modificata né in seguito al trattamento con QNP né all’Hal.

Il significato dell’incremento di OxA in corteccia è da chiarire, a maggior ragione

considerato che non sappiamo se l’OxA si accumuli all’interno delle fibre oppure

nello spazio extracellulare. L’OxA potrebbe accumularsi o per un’iperproduzione

secondaria ad un suo deficit a livello corticale, oppure per un deficit di secrezione.

Sebbene nel nostro studio non abbiamo accertato una diretta interazione del QNP con

le cellule produttrici di OxA, tuttavia è ben conosciuta l’esistenza di una modulazione

bidirezionale tra sistema oressinergico e dopaminergico che si esplica a livello

presinaptico. Alte dosi di dopamina hanno infatti un effetto inibente sulla produzione

di OxA, effetto mediato dai recettori D2 e dunque stimolato dal QNP, mentre basse

dosi, agendo sui recettori D1, incrementano il tono oressinergico (Alberto et al. 2006;

Yamanaka et al. 2006). Partendo da questa evidenza, la nostra ipotesi è che la

stimolazione ripetuta dei recettori D2 ottenuta in trattamento con QNP, inibisca il

tono oressinergico e blocchi il rilascio di OxA a livello corticale, causandone quindi

51

l’accumulo nella terminazioni. La conseguenza consiste quindi in una riduzione del

segnale oressinico a livello corticale. I nostri risultati sembrano essere in accordo con

i precedenti studi di genetica sui soggetti polidipsici (Meerabux et al. 2005), secondo i

quali la mutazione a carico del recettore oressinico 1 produrrebbe un recettore non

funzionale, sebbene ulteriori analisi siano ancora necessarie a conferma di questi dati.

Nel nostro studio sono state investigate anche altre aree come l’insula, la corteccia

prefrontale e lo striato, in quanto coinvolte nei comportamenti motivati e nella

codifica delle risposte motorie (Graybiel 1998; Critchley et al. 2001; Cardinal et al.

2002). Ciononostante, non abbiamo riscontrato alcuna alterazione nell’espressione

della proteina in queste aree.

Al momento possiamo ipotizzare che la ridotta trasmissione oressinergica nella

corteccia somatosensoriale possa essere indicativa di un “difetto” a livello delle prime

fasi di elaborazione di uno stimolo (Romo e Salinas 1999) che a sua volta influenza il

flusso di informazione diretto alla corteccia prefrontale e motoria, agendo di

conseguenza sulla motivazione ed il decision making. I movimenti ritmici, come la

masticazione e l’intera gamma di movimenti orali in generale, si manifestano in

risposta ad input che hanno origine dalle regioni intra- e periorali, e sono processati a

livello somatosensoriale (Yamamoto et al. 1988). In proposito è stato evidenziato che

la stimolazione diretta della corteccia somatosensoriale può inibire in riflesso evocato

di jaw-opening nel ratto (Chiang et al. 1990). Dal momento che i peptidi oressinici

sono importanti mediatori nel risveglio e nell’elaborazione del rinforzo, è possibile

che l’alterazione di questo sistema prodotta dal QNP possa aver bloccato il feedback

sensoriale richiesto dall’azione stessa del bere, contribuendo così alla generazione del

pattern ripetitivo del comportamento. Tale ipotesi è supportata dalla presenza di

recettori oressinici 1 nella neocorteccia (Marcus et al. 2001) e specificamente in

52

quella somatosensoriale, dove sarebbero coinvolti nel riconoscimento del rinforzo

nicotinico (Hollander et al. 2008).

Dato che il sistema oressinergico partecipa anche alla genesi della risposta allo stress

(Tsujino e Sakurai 2009), abbiamo voluto verificare se le nostre condizioni

sperimentali fossero stressanti e quindi se l’aumento di oressina fosse parte di questa

risposta. Il dosaggio di corticosterone plasmatico ha però escluso questa possibilità,

dato che i livelli negli animali trattati con QNP rientravano nella norma (Figura 5d).

In ultima analisi, le nostre osservazioni mostrano che il pretrattamento con SB-

334867 (4 mg/kg) aggrava complessivamente il quadro della polidipsia indotta da

QNP, che risulta sia accelerata, con un maggior numero di ratti già polidipsici al

primo giorno, sia potenziata, con un aumento dei livelli medi di consumo d’acqua

rispetto ai relativi controlli. La dose minore di SB-334867 (2 mg/kg), sebbene

inefficace, ha comunque mostrato un trend di azione simile. E’ importante

sottolineare che le dosi dell’antagonista oressinico utilizzate nel nostro esperimento

sono molto al di sotto di quelle che influenzano il comportamento di alimentazione ed

il ciclo sonno/veglia nel ratto (Haynes et al. 2000). Questo esclude che l’aumento

della polidipsia da QNP prodotto dall’SB-334867 sia il risultato di una attivazione

comportamentale generalizzata. La combinazione di QNP e SB-334867 suggerisce

che l’inibizione disfunzionale del sistema oressinergico corticale riveste un ruolo di

grande importanza nell’espressione e nella modulazione del comportamento

polidipsico dopaminergico.

Nel loro insieme i nostri dati dimostrano che la polidipsia indotta da QNP è un

fenomeno caratterizzato da una componente compulsiva, soggetto a modulazione da

parte dei sistemi che presiedono al controllo cognitivo. Su questa base, la polidipsia

53

potrebbe costituire un utile modello per comprendere aspetti importanti della

psicopatologia della schizofrenia.

54

PARTE TERZA

55

10. CONTRAFREELOADING INDOTTO DA QNP: MODELLO

SPERIMENTALE DI COMPORTAMENTO COMPULSIVO

La possibilità che un disturbo ripetitivo del comportamento sia alla base della

polidipsia indotta dal QNP merita di essere considerata poiché in ratti semi-deprivati

d’acqua, addestrati ad accedere ad un beverino premendo la leva, la somministrazione

cronica di QNP produce un importante aumento del numero di pressioni sulla leva per

ottenere la risorsa idrica, sebbene quest’ultima sia anche immediatamente disponibile

all’interno della gabbia di Skinner (Cioli et al. 2000).

Questo comportamento, palesemente “antieconomico”, viene definito

contrafreeloading (CFL): animali addestrati a mettere in atto una specifica condotta

strumentale allo scopo di ottenere cibo o acqua (attraverso la pressione di una leva per

ottenere la risorsa), continuano a lavorare anche quando la stessa risorsa può essere

ottenuta senza alcuno sforzo (Inglis et al. 1997). Il CFL è un fenomeno che è stato

rilevato in numerose specie viventi (McGowan et al. 2010), uomo incluso (Inglis et al.

1997). La serie di studi condotti nel nostro Laboratorio rappresenta il primo esempio

di manipolazione farmacologica del CFL ed evidenzia come il trattamento ripetuto

con il QNP induca negli animali una rigidità comportamentale che non permette loro

di adattarsi alle differenti condizioni di accesso all’acqua (Cioli et al, 2000; Amato et

al. 2006; Milella et al. 2008).

In definitiva, il QNP mette in risalto un comportamento antieconomico che spinge i

ratti a scegliere la via più dispendiosa per ottenere una risorsa (premere la leva, pur

con la risorsa disponibile ad libitum) e, ancora più sorprendentemente, a dissipare

parte di quella guadagnata (gli animali trattati con QNP non consumano tutto quello

56

che guadagnano), suggerendo in ultima analisi, l’esistenza di una netta dissociazione

tra componente appetitiva e consumatoria del comportamento operante del bere

(Amato et al. 2006, 2007).

Sulla base di queste considerazioni, è lecito associare il comportamento

antieconomico indotto dal QNP a quello di tipo compulsivo che lo sottende.

Il CFL per la risorsa idrica indotto dal QNP risulta un comportamento “rigido”,

rimanendo inalterato anche dopo la manipolazione del costo operante (cambiamenti

nel numero di pressioni necessarie per ottenere la risorsa) (Milella et al. 2008),

“perseverativo”, “dispendioso” ed “eccessivo”, caratteristiche queste del tutto evidenti

nel nostro modello e termini oltretutto ricorrenti nella letteratura attinente il disturbo

ossessivo compulsivo (OCD). In questo senso, il QNP può essere considerato un

ottimo strumento farmacologico per studiare e validare modelli animali di OCD.

Per conferire validità predittiva al nostro modello di CFL, nella terza parte di questo

studio, abbiamo ipotizzato che l’aggravamento del CFL prodotto dalla

somministrazione ripetuta con QNP, potesse essere sensibile a quelle sostanze che

migliorano la sintomatologia nei pazienti affetti da OCD. Pertanto, abbiamo indagato

gli effetti di tre differenti farmaci impiegati nella pratica clinica, ognuno con

caratteristiche farmacologiche diverse, al fine di valutare le possibili modalità di

interazione con i substrati psicobiologici alla base del comportamento compulsivo.

Abbiamo messo a confronto gli effetti dell’antagonista dopaminergico D2-selettivo

aloperidolo (HAL) con quelli prodotti dall’aripiprazolo (ARI), antipsicotico di nuova

generazione classificato come stabilizzatore dopaminergico, in quanto in grado di

inibire l’iperdopaminergia senza indurre ipodopaminergia, agonista parziale del

recettore serotoninergico 5HT1a ed antagonista verso i recettori 5HT2a e 5HT2c

(Shapiro et al. 2003).

57

La scelta di utilizzare un farmaco come l’ARI è derivata dalla costatazione che questa

molecola è risultata efficace in modelli animali della sintomatologia positiva della

schizofrenia (Nordquist et al. 2008). Diversi studi hanno infatti mostrato come l’ARI

sia in grado di inibire il comportamento del “marble-buring” (Egashira et al. 2008), le

stereotipie associate alla dopamina (Hirose et al. 2004; Koener et al. 2010), e l’attività

locomotoria indotta da D-amfetamina (Bäckström et al. 2011).

Abbiamo inoltre testato la sensibilità del nostro modello di CFL all’antidepressivo

triciclico clomipramina (CIM), noto per l’attenuazione dei sintomi di OCD nell’uomo

(Dell’Osso et al. 2006), del “checking” compulsivo nel ratto (Eilam e Szechtman

2005), nonché per il suo effetto di prevenire, ma non di revertire, lo sviluppo della

polidipsia indotta da QNP (Amato et al. 2008). La CIM agisce attraverso un

meccanismo di inibizione del reuptake neuronale della noradrenalina e della

serotonina, effetto quest’ultimo da annoverare tra le possibili cause del suo effetto

farmacologico nell’OCD (Micallef e Blin 2001; Dell’Osso et al. 2006).

58

11. RISULTATI

Le figure 1, 2 e 3 riassumono i risultati dei 3 esperimenti condotti in questa parte dello

studio, che mostrano il comportamento degli animali rispettivamente nelle fasi

operante e di scelta. Per quest’ultima, i dati sono rappresentati come istogrammi alla

destra di ogni grafico, e indicano i valori cumulativi di 9 giorni di esperimento,

espressi in media±ESM.

Tutti gli animali si sono mantenuti in buona salute, sebbene il trattamento ripetuto con

QNP abbia prodotto un minor incremento di peso corporeo rispetto ai veicoli

(veh+veh) [Esp 1, +16.1±3.0 vs. +56.2±5.5; esp 2, +3.0±3.3 vs. +48.3±4.4; esp 3,

+8±19 vs. +86±10 (grammi±ESM)]. Anche il pretrattamento con Hal (0.2 mg/kg) ha

causato una riduzione dell’incremento di peso corporeo [+21.5±2.7 vs. +56.2±5.5

(grammi±ESM)] rispetto ai controlli.

11.1 Interazione tra aloperidolo e QNP

Come mostrato nella Figura 1, in condizioni di accesso attraverso la pressione della

leva, (giorni 1-6) le somministrazioni di Hal e QNP hanno prodotto un effetto

inibitorio significativo sul numero di rinforzi guadagnati (grafico in alto a sin)

[ANOVA a due vie per misure ripetute: pretrattamento con Hal, F2,48 = 16.3, p <.001]

e sull’assunzione di acqua dal dispenser (grafico in alto a dx) [Hal, F2,48 = 26.0, p

<.001]. Nel dettaglio, la dose maggiore di Hal (0.2 mg/kg) di per sé ha soppresso il

comportamento operante e la quantità di acqua ingerita, rispetto ai controlli (p<.001

verso i veicoli al test post hoc). L’Hal in co-somministrazione con il QNP ha

significativamente ridotto il numero di rinforzi guadagnati [ANOVA a due vie per i

59

rinforzi: interazione HAL × QNP F2, 48= 11.9, p <.001]. Anche la dose minore di Hal

(0.1 mg/kg), seppur non significativamente, ha diminuito il responding e di

conseguenza anche la quantità di acqua ingerita per questo gruppo (p<.001 verso i

controlli). Il trattamento con QNP ha modificato significativamente la performance

degli animali [ANOVA a due vie per misure ripetute: F1, 48 = 4.5, p <.05

per i rinforzi; F1,48 = 44.2, p <.001 per l’acqua ingerita]. Come osservato nei nostri

studi precedenti, la prima somministrazione di QNP ha provocato una robusta

inibizione del comportamento operante e di conseguenza del bere, recuperate poi nei

giorni a seguire [sessione × QNP, F4,196.2 = 3.4, p <.01 per i rinforzi; F4.1,197. 5= 3. 4, p

<.01 per l’acqua ingerita]. Con la dose 0.1 mg/kg di Hal come pretrattamento, il

numero di pressioni sulla leva, negli animali sotto QNP, è stato rapidamente

ripristinato nel tempo, fino a tornare ai livelli dei controlli nel giorno 6. Di contro, la

somministrazione di QNP ha attenuato l’effetto soppressivo dell’Hal 0.2 mg/kg sul

responding. Ancora, la quantità di acqua ingerita negli animali trattati con QNP, non

ha mai raggiunto i livelli dei controlli, dal momento che essi hanno consumato solo

una frazione dell’acqua guadagnata (circa il 50%) ed il pretrattamento con Hal ha solo

in parte ripristinato questa percentuale di consumo [ANOVA a due vie per la % di

consumo: trattamento con QNP, F2,53= 23.0, p <.001; interazione HAL×QNP, F2,53=

14.6, p <.001] (Figura 2).

Nella fase di scelta (giorni 7-15), quando le bottiglie all’interno delle gabbie operanti

sono state riempite con l’acqua, gli animali hanno avuto due accessi simultanei alla

risorsa idrica. Come atteso, i controlli hanno smesso di premere la leva per tornare

alla risorsa libera (Figura 1, grafico centrale a sin). Questo comportamento ha causato,

nel tempo, una caduta rapida del responding e della quantità di acqua ottenibile dal

dispenser (Figura 1, grafico in alto a sin e dx rispettivamente). Come risultato, il CFL

60

dei controlli è stato solo del 5-10% (Figura 1, grafico in basso a sin). Al contrario, gli

animali trattati con QNP hanno espresso la preferenza per la bottiglia solo durante i

primi due giorni della fase di scelta, per poi ridursi progressivamente (Figura 1,

grafico centrale a sin) [ANOVA a due vie per misure ripetute: trattamento con QNP,

F1,48=34.8 e p<.001; sessione×QNP, F8,384=9.6 e p<.001]. Di conseguenza, il

responding sulla leva è gradualmente aumentato fino a che il numero dei rinforzi non

ha raggiunto gli stessi livelli ottenuti nell’ultimo giorno di fase operante (giorno 6,

Figura 1, grafico in alto a sin) [ANOVA a due vie per misure ripetute: trattamento con

QNP, F1,48=15.8 e p<.001]. Il CFL è quindi progressivamente aumentato fino a valori

del 50% [ANOVA a due vie per misure ripetute: trattamento con QNP, F1,48=23.6 e

p<.001; sessione×QNP, F8,384=5,3 e p<.001]. Di per sé, l’Hal non ha prodotto alcun

effetto durante la fase di scelta. Quando somministrato in combinazione con il QNP,

l’Hal ha causato una diminuzione dose-relata del numero dei rinforzi e della quantità

di acqua ottenuta dal dispenser (Figura 1, istogrammi in alto a sin e dx

rispettivamente). L’ANOVA degli ultimi 3 giorni di fase di scelta ha evidenziato che

la dose maggiore di Hal (0.2 mg/kg) ha ridotto significativamente il numero dei

rinforzi ottenuti [ANOVA a due vie per misure ripetute: F2,48=3.3 e p<.05; p<.05

verso i controlli al test post hoc di Bonferroni]. Di conseguenza, questa dose di Hal ha

riportato il CFL degli animali trattati con QNP ai livelli dei controlli [ANOVA a due

vie per misure ripetute: F2,48=3.6 e p<.05; p<.05 verso i controlli al test post hoc di

Bonferroni] (Figura 1, istogrammmi in basso a sin). Mentre i controlli hanno

mantenuto un livello stabile di bevuta durante tutta la fase sperimentale, i ratti trattati

con QNP hanno mostrato un ridotto quantitativo di acqua totale ingerita [ANOVA a

due vie per misure ripetute: F1,48=24.9 e p<.001], a prescindere dal pretrattamento con

Hal (istogrammi centrali a dx).

61

Figura 1

I grafici rappresentano i valori (espressi come media±ESM) ottenuti iniettando gli animali con salina (veh) o QNP (0.5 mg/kg) da solo o in combinazione con Hal (0.1 o 0.2 mg/kg). Gli istogrammi (bianchi per i controlli e neri per i QNP) rappresentano la media±ESM della media degli ultimi 9 giorni (fase di scelta = choice phase). Bonferroni post hoc test, *p<.05 verso veh+veh e #p<.05 verso veh+QNP.

repeated measures, QNP treatment, F(1,48)=23.6, p<0.001; session ! QNP, F(8,384)=5.3, p<0.001]. By itself,HAL had no behavioral effects during the choice phase.Yet, its pretreatment produced a dose-related decrease inthe number of reinforcers earned and in the amount ofwater consumed from the dipper in QNP-treated animals(as shown in the histograms on the side of each graph inFig. 1). In particular, HAL 0.2 mg/kg significantly reducedthe number of reinforcers earned by QNP-treated ratswhen considering only the last 3 days of testing [two-way ANOVA for repeated measures, F(2,48)=3.3, p<0.05; p<0.05 vs. vehicle-QNP at Bonferroni post hoctest]. Therefore, the higher HAL dose brought CFL inQNP-treated animals back to control levels [two-wayANOVA for repeated measures, F(2,48)=3.6, p<0.05;p<0.05 vs. vehicle-QNP at Bonferroni post hoc test] (seehistogram related to percent of CFL in Fig. 1). While

control rats exhibited stable levels of water intake acrossdays, in rats under QNP, the total amount of water intakewas reduced [two-way ANOVA for repeated measures,F(1,48)=24.9, p<0.001], in a way that was not affected byHAL pretreatment.

Experiment 2

As expected, repeated QNP treatment caused a stronginhibition of operant responding for water, as expressed bya significant decrease in lever pressing and consequently inthe number of reinforcers earned [two-way ANOVA forrepeated measures QNP treatment, F(1,30)=51.7, p<0.001].Water intake from the dipper was therefore reduced as well[QNP treatment F(1,30)=168.6, p<0.001]. ARI pretreatmentdid not show any significant effect either per se or incombination with QNP treatment.

Fig. 1 Graphs represent data (expressed as mean±SEM) obtainedinjecting animals with saline or QNP (0.5 mg/kg) alone or incombination with HAL (0.1 or 0.2 mg/kg). Bars (white for controls

and black for QNP) represent the mean±SEM of the average of the last9 days (choice phase). Post-hoc Bonferroni test, *P<0.05 vs veh +veh and #P<0.05 vs veh + QNP


62

Figura 2

Effetto del QNP 0.5 mg/kg da solo o in combinazione con HAL 0.1 o 0.2 mg/kg (grafici in alto), ARI 0.3 o 1 mg/kg (grafici centrali) e CIM 5 o 10 mg/kg (grafici in basso) sulla percentuale di acqua consumata/acqua guadagnata dal dispenser attraverso la pressione della leva nella fase operante (lato sinistro) e di scelta (lato destro). I valori sono espressi come media±ESM di 6 e 9 giorni cumulativi di trattamento per la fase operante e di scelta, rispettivamente. Al Bonferroni post-hoc test, *P<.05 vs. veh + veh and #P<.05 vs. veh + QNP.

!

63

11.2 Interazione tra aripiprazolo e QNP

Come nell’esperimento 1, anche in questo caso il trattamento con QNP ha fortemente

inibito il comportamento operante in termini di pressioni sulla leva attiva e di

conseguenza in numero di rinforzi ottenuti [ANOVA a due vie per misure ripetute:

trattamento con QNP, F1,30=51.7 e p<.001] (Figura 3, grafico in alto a sin). La

quantità di acqua ingerita è risultata pertanto ridotta [trattamento con QNP,

F1,30=168.6 e p<.001] (Figura 3, grafico in alto a dx). Il pretrattamento con ARI non

ha mostrato alcun effetto né da solo né in co-somministrazione con il QNP.

Anche in questo esperimento, nella fase di scelta gli animali trattati con QNP hanno

manifestato la preferenza per la pressione della leva [ANOVA a due vie per misure

ripetute: trattamento con QNP, F1,30=22.9 e p<.001 per i rinforzi] e una significativa

differenza in termini di acqua ingerita rispetto ai controlli [F1,30=12.5 e p<.001]

(Figura 3, istogrammi in alto a sin e dx rispettivamente). Analogamente, la quantità di

acqua bevuta dalla bottiglia, e di conseguenza il valore di acqua totale ingerita, è

significativamente diminuita negli animali trattati con QNP [F1,30=71.3 e p<.001, per

la bottiglia; F1,30=49.7 e p<.001, per l’acqua totale] (Figura 3, grafici centrali a sin e

dx rispettivamente). Come risultato, la percentuale di CFL è marcatamente aumentata

[F1,30=54.4 e p<.001] (Figura 3, grafico in basso a sin), raggiungendo livelli del 70%.

Nella fase di scelta, l’ARI ha aumentato il responding indotto dal QNP (Figura 3,

istogramma in alto a sin). Nonostante l’interazione tra il QNP e l’ARI non risulti

significativa all’ANOVA, l’analisi post hoc del responding cumulativo ha evidenziato

che la dose di ARI 0.3 mg/kg ha aumentato significativamente il numero dei rinforzi

ottenuti dai ratti trattati con QNP (p<.05 al test di Bonferroni, Figura 3, istogramma in

alto a sin). Ancora, la dose maggiore di ARI, 1 mg/kg, ha incrementato il CFL indotto

64

dal QNP, sebbene l’ANOVA non abbia mostrato effetti significativi [ANOVA a due

vie per misure ripetute: pretrattamento con ARI, F2,30=1.2 e p=.38; ARI×QNP,

F2,30=1.8 e p=.181].

65

Figura 3

I grafici rappresentano i valori (espressi come media±ESM) ottenuti iniettando gli animali con salina (veh) o QNP (0.5 mg/kg) da solo o in combinazione con ARI (0.3 o 1.0 mg/kg). Gli istogrammi (bianchi per i controlli e neri per i QNP) rappresentano la media±ESM della media degli ultimi 9 giorni (fase di scelta = choice phase). Bonferroni post hoc test, *p<.05 verso veh+veh.

As occurred in the first experiment, QNP-treated ratsshowed a preference for lever pressing [two-way ANOVAfor repeated measures, QNP treatment, F(1,30)=22.9, p<0.001 for reinforcers] and thus their water intake from thedipper significantly differed from that shown by controls[F(1,30)=12.5, p<0.001]. Analogously, water intake fromthe bottle and consequently total water intake weresignificantly lowered by QNP treatment [F(1,30)=71.3,p<0.001 for bottle; F(1,30)=49.7, p<0.001 for total waterintake]. As a result, the percentage of CFL was remarkablyincreased [F(1,30)=54.4, p<0.001] reaching almost 70%.

ARI per se did not exert any effect on rat's performancein any of the parameters measured. In the phase of choice,however, ARI further enhanced responding induced byQNP. Although ANOVA did not disclose a significantinteraction between QNP and ARI, post hoc analysisperformed on the cumulative responding showed that

0.3 mg/kg dose of ARI enhanced the number of reinforcersgained by QNP-treated rats [p<0.05 vs. Ari 0.3-vehicle atBonferroni post hoc test]. Moreover, the higher dose of ARIboosted the QNP effects on percent CFL, although nostatistically significant differences were detected [two-wayANOVA for repeated measures ARI pretreatment,F(2,30)=1.2, p=0.318; Ari ! QNP interaction,F(2,30)=1.8, p=0.181].

Experiment 3

Repeated treatments with QNP, in the operant phase,produced the same effect as in experiments 1 and 2, thatis a strong behavioral inhibition on day 1 followed by agradual recovery of responding [two-way ANOVA forrepeated measures, session ! QNP, F(5,150)=3.4, p<0.01;QNP treatment, F(1,30)=40.6, p<0.001]. Water intake fromthe dipper was therefore reduced as well, although a certain

Fig. 2 Graphs represent data (expressed as mean±SEM) obtainedinjecting animals with saline or QNP (0.5 mg/kg) alone or in combinationwith ARI 0.3 or 1 mg/kg. Bars (white for controls and black for QNP)

represent the mean±SEM of the average of the last 9 days (choicephase). Post-hoc Bonferroni test, *P<0.05 vs. veh + veh


66

11.3 Interazione tra clomipramina e QNP

Il trattamento ripetuto con QNP, nella fase operante, ha prodotto gli stessi risultati

degli esperimenti 1 e 2, cioè una forte inibizione del responding nel giorno 1, seguita

da un suo graduale recupero nel tempo [ANOVA a due vie per misure ripetute:

trattamento con QNP, F1,30=40.6 e p<.001; sessione×QNP, F5,150=3.4 e p<.01] (Figura

4, grafico in alto a sin). La quantità di acqua è stata conseguentemente ridotta,

sebbene si sia osservato un certo recupero intorno al giorno 5 [trattamento con QNP,

F1,30=153.8 e p<.001; sessione×QNP, F5,150=2.3 e p<.05] (Figura 4, grafico in alto a

dx). La CIM non ha avuto alcun effetto su entrambi i parametri di responding e

ingestione d’acqua nella fase operante.

Analogamente a quanto ottenuto negli esperimenti 1 e 2, gli animali trattati con QNP,

dopo un iniziale interesse alla bottiglia introdotta nella fase di scelta (giorni 7 e 8),

hanno mostrato un progressivo incremento delle pressioni sulla leva attiva per il resto

delle sessioni (fino al giorno 15), con un effetto significativo sul numero di rinforzi

ottenuti [F1,30=20.1 e p<.001] e sulla quantità di acqua ingerita [F1,30=9.0 e p<.01]

(Figura 4, grafici in alto a sin e dx rispettivamente). Questi effetti hanno prodotto un

significativo aumento della percentuale di CFL [trattamento con QNP, F1,30=13.6 e

p<.001; sessione×QNP, F8,240=6.1 e p<.001] fino al 60% (Figura 4, grafico in basso a

sin). Il pretrattamento con la CIM ha modificato significativamente il comportamento

del bere [ANOVA a due vie per misure ripetute: F2,30=4.4 e p<.05; F2,30=3.5 e p<.05

rispettivamente per i rinforzi e la quantità di acqua ingerita] (Figura 4, istogrammi in

alto a sin e dx). La dose più alta di CIM, 10 mg/kg, ha ridotto il numero di rinforzi

ottenuti dagli animali trattati con QNP rispetto ai controlli (p<.05 al test post hoc di

Bonferroni (Figura 4, istogramma in alto a sin). La riduzione del consumo d’acqua

non è stata statisticamente confermata dall’analisi statistica post hoc, anche se i valori

67

sono risultati nettamente inferiori rispetto a quelli osservati nel gruppo dei trattati con

solo QNP [ANOVA a due vie per misure ripetute: F2,30=3.5 e p<.05 per il

pretrattamento con CIM, Figura 4, istogrammi in alto a dx]. Ancora, questi animali

hanno anche mostrato una percentuale di consumo quasi identica a quella dei controlli

(Figura 2).

L’effetto comportamentale della CIM somministrata in combinazione con il QNP è

stato accompagnato da una modulazione significativa sulla bevuta dalla bottiglia

[ANOVA a due vie per misure ripetute: pretrattamento con CIM, F2,30=4.2 e p<.05;

interazione CIM×QNP, F2,30=3.9 e p<.05]. Infatti, negli animali trattati con QNP,

entrambe le dosi di CIM hanno aumentato la quantità di acqua ottenuta dalla bottiglia,

riavvicinando i livelli di bevuta a quelli dei controlli (Figura 4, istogramma centrale a

sin). Di conseguenza, il CFL degli animali trattati con QNP è stato fortemente

influenzato dal pretrattamento con CIM [pretrattamento con CIM, F2,30=6.6 e p<.01;

interazione CIM×QNP, F2,30=4.1 e p<.05]. L’incremento, infatti, della percentuale di

CFL indotta dal QNP [F1,30=16.6 e p<.001] è stato abolito dalla CIM in maniera dose-

dipendente, risultando la dose 10 mg/kg totalmente efficace nel bloccare il CFL ai

livelli dei controlli (p<.01 verso i QNP al post hoc, Figura 4, istogramma in basso a

sin). Infine, i ratti trattati con la combinazione QNP+CIM hanno mostrato uguali

livelli di acqua totale ingerita [pretrattamento con CIM, F2,30=4.7 e p<.05; trattamento

con QNP, F1,30=13.4 e p<.01 interazione CIM×QNP, F2,30=3.6 e p<.05] (Figura 4,

istogramma centrale a dx).

68

Figura 4

I grafici rappresentano i valori (espressi come media±ESM) ottenuti iniettando gli animali con salina (veh) o QNP (0.5 mg/kg) da solo o in combinazione con CIM (5 o 10 mg/kg). Gli istogrammi (bianchi per i controlli e neri per i QNP) rappresentano la media±ESM della media degli ultimi 9 giorni (fase di scelta = choice phase). Bonferroni post hoc test, *p<.05 verso veh+veh e #p<.05 verso veh+QNP.

degree of recovery over days was present [session ! QNP,F(5,150)=2.3, p<0.05; QNP treatment, F(1,30)=153.8, p<0.001]. Both the number of reinforcers gained and theamount of water drunk in the operant phase were notinfluenced by pretreatment with CIM at any of the dosesused, and statistically significant interactions betweentreatments were not found.

Consistently with results obtained in the experiments 1and 2, QNP-treated animals, after an initial switch towardthe bottle in the first 2 days of choice, showed a progressiveincrease in lever pressing for water. At the two-way ANOVAfor repeated measures, the effect of QNP was statisticallysignificant for both reinforcers earned [F(1,30)=20.1, p<0.001] and water intake from the dipper [F(1,30)=9.0, p<0.01]. These effects brought to a remarkable increase in thepercent of CFL [session ! QNP, F(8,240)=6.1, p<0.001;QNP treatment, F(1,30)=13.6, p<0.001], which reachedlevels around 60%. Pretreatment with CIM influenced the

drinking strategy in a significant way [two-way ANOVA forrepeated measures, F(2,30)=4.4; F(2,30)=3.5, p<0.05 forreinforcers and water intake, respectively]. The higher CIMdose (10 mg/kg) effectively lowered, in QNP-treatedanimals, the number of reinforcers earned with respect tocontrols (p<0.05 at Bonferroni post hoc test, see histogramon the right side of the reinforcer's graph in Fig. 3).Reduction of water intake from the dipper was notstatistically confirmed by post hoc test, although it was morethan halved by CIM 10 mg/kg as pretreatment with respectto QNP only [two-way ANOVA for repeated measures CIMpretreatment (F 2,30)=3.5, p<0.05]. Importantly, theseanimals also showed a percent consumption nearly identicalto controls, indicating that CIM improved behavioralefficiency (see Fig. S1 in Supplement 1). Although amoderate decrease in operant behavior was indeed presentunder CIM also in control rats, post hoc tests failed to detectany significant difference.

Fig. 3 Graphs represent data (expressed as mean±SEM) obtainedinjecting animals with saline or QNP (0.5 mg/kg) alone or incombination with CIM 5 or 10 mg/kg. Bars (white for controls and

black for QNP) represent the mean±SEM of the average of the last9 days (choice phase). Post-hoc Bonferroni test, *P<0.05 vs. veh +veh and #P<0.05 vs. veh + QNP


69

12. DISCUSSIONE

Con questi esperimenti abbiamo ulteriormente elaborato la nozione secondo la quale

somministrazioni ripetute di QNP aggravano il comportamento antieconomico del

CFL. Ancora una volta abbiamo confermato che in condizioni di scelta tra l’accesso

operante e quello libero alla risorsa idrica, il QNP produce un aumento della frazione

(espressa dalla percentuale di CFL) di acqua ottenuta attraverso le pressioni sulla leva

attiva, riducendone allo stesso tempo la quantità di acqua totale bevuta. In queste

condizioni, l’antidepressivo CIM è in grado di prevenire lo sviluppo del CFL e

l’ipodipsia prodotte dal QNP. Differentemente, l’antipsicotico Hal è in grado di

prevenire solo il CFL QNP-indotto ma non l’ipodipsia, mentre l’ARI non produce

alcun effetto in entrambi i fenomeni. Da questi risultati possiamo dedurre che gli

effetti prodotti dal QNP sono stati maggiormente influenzati e modulati dall’azione

serotoninergica della CIM, piuttosto che dall’inibizione o modulazione del tono

dopaminergico dell’Hal e dell’ARI.

Questi risultati sono in accordo con l’ipotesi che il CFL indotto da QNP riproduca

diversi aspetti del comportamento compulsivo. Infatti, il CFL da QNP è

intrinsecamente dissipativo perché (1) produce alti livelli di responding a discapito del

libero accesso alla risorsa idrica, e (2) gli animali bevono solo una frazione dell’acqua

ottenuta attraverso le pressioni sulla leva attiva; (3) il trattamento con QNP conferisce

rigidità al comportamento del bere, impedendo agli animali di adattarsi perfino ai

cambiamenti del costo operante (da FR1 a FR10, Milella et al. 2008). Nel loro

insieme, questi effetti rendono il CFL indotto da QNP un comportamento “eccessivo”

70

ed “inappropriato”, caratteristiche che soddisfano due importanti criteri del

comportamento compulsivo (American Psychiatric Association, DSM IV, 2000).

In proposito sono stati sviluppati diversi modelli sperimentali di compulsività basati

sul comportamento operante. Ad esempio, il premere la leva in maniera eccessiva ed

inutile (priva cioè di uno scopo determinato) è una peculiarità del modello di signal

attenuation in cui, l’attenuazione delle proprietà del segnale di uno stimolo

condizionato è prodotta dalla presentazione ripetuta del segnale stesso senza la

comparsa del rinforzo (in questo caso il cibo). Questa condizione produce un aumento

del responding che non è seguito, nello specifico, dall’ingresso dell’animale nella

camera di foraggiamento per ottenere e consumare il rinforzo (Joel e Avisar 2001).

Questo modello suggerisce che la compulsività emerge quando il comportamento

stesso riceve un feedback di risposta appunto “attenuato”, cosicché la sequenza

operante non viene appunto completata. Nel modello di CFL, il QNP sembra produrre

gli stessi effetti del signal attenuation poiché l’aumento del responding non è seguito

dal consumo della risorsa idrica. La possibilità che il QNP provochi un

comportamento perseverativo è sostenuta dalla nozione che questa sostanza aggrava il

responding eccessivo e senza scopo nel modello di attenuazione del segnale così

come nel modello comportamentale del “five choice serial reaction time”, in cui gli

animali sono impegnati in un attività di nose-poke durante l’intervallo tra le sessioni

anche se tale comportamento non comporta il rilascio di alcun rinforzo (Eagle e

Baunez 2010). Anche il modello di checking compulsivo sostiene fortemente questa

caratteristica peculiare del QNP. Secondo questo modello infatti, i rituali motori,

simili a quelli umani nell’ OCD, sono riprodotti da somministrazioni ripetute di QNP

(Eilam e Szechtman 2005).

71

In questo scenario, il nostro modello di CFL indotto da QNP acquista in originalità

poiché non solo mette in luce l’esagerazione di un comportamento spontaneo che in

teoria sarebbe orientato alla pura strategia di foraggiamento, ma anche perché

introduce una variabile economica, in quanto gli animali sotto QNP ignorano quasi

del tutto la risorsa liberamente accessibile dalla bottiglia.

L’azione selettiva del QNP sui recettori dopaminergici D2/D3 suggerisce che i

comportamenti perseverativi indotti dalle sue somministrazioni ripetute siano mediati

da un’alterata trasmissione dopaminergica in quelle aree cerebrali coinvolte nella

manifestazione dei comportamenti strumentali orientati verso uno specifico obiettivo.

In accordo, è stato osservato che le iniezioni intrastriatali di QNP aumentano le

risposte perseverative non rinforzate (Faure et al. 2010), mentre le iniezioni intra-

accumbens provocano un’alterazione generale della flessibilità nel compito di

reversal learning (Haluk e Floresco 2009).

Da queste considerazioni, ci saremmo aspettati che gli inibitori dei recettori

dopaminergici D2 prevenissero lo sviluppo degli effetti del QNP nel comportamento

di CFL. I risultati che abbiamo ottenuto con L’Hal e l’ARI dimostrano che non è

questo il caso. Nello specifico, l’interazione tra Hal e QNP è risultata particolarmente

complessa, in quanto in un certo senso “mascherata” dagli effetti intrinseci dell’Hal

sul comportamento operante. Nella prima parte del primo esperimento, quando nelle

gabbie l’accesso all’acqua era solo strumentale, l’Hal ha avuto un effetto sia sul

responding che sulla bevuta. Alla dose minore (0.1 mg/kg) ha prodotto un rapido

recupero delle pressioni sulla leva, inizialmente inibite dal QNP, ed ha aumentato la

frazione di acqua guadagnata dagli stessi animali. In condizioni di scelta, poi,

l’inibizione del CFL indotto dal QNP è risultata di fatto solo apparente, in quanto

dovuta soprattutto all’inibizione del responding, e non al ripristino della quantità di

72

acqua ottenibile dalla bottiglia. Di conseguenza, l’effetto ipodipsico del QNP non è

stato attenuato dall’Hal. Nel loro insieme, questi risultati convergono nell’identificare

come effetto principale dell’Hal, in questo modello, quello dell’azione inibitoria della

risposta operante. Questa conclusione è in accordo con i lavori precedenti di

Salamone et al. (1994, 2007) e Salamone e Correa (2002) che dimostrano che la

dopamina è implicata nella regolazione dell’output delle risposte strumentali e nei

comportamenti che richiedono uno sforzo in condizioni di scelta. In particolare, è

stato suggerito che nel contesto di ricerca del cibo, la dopamina sarebbe coinvolta nel

processo di valutazione del costo di un compito, in termini di numero di pressioni da

effettuare (Salamone et al. 2003; Ishiwari et al. 2004). In accordo, gli animali trattati

con Hal (0.2 mg/kg) sono meno inclini a compiere uno sforzo maggiore per ottenere

un rinforzo più consistente nel paradigma costo-beneficio (Denk et al. 2005). E’

probabile che l’effetto inibente il responding dell’Hal non sia l’unica ragione per cui

esso sembra interferire in maniera aspecifica con le varie componenti del CFL indotto

da QNP. Haluk e Floresco (2009) hanno specificato in proposito che “la stimolazione

farmacologica non riproduce il pattern preciso di attivazione recettoriale D2

attraverso la trasmissione tonica e fasica della dopamina che si sviluppa in condizioni

normali”. In particolare, gli autori suggeriscono che “la saturazione dei recettori D2

può alterare la capacità neuronale della dopamina di modularsi in conseguenza di

eventi con stimoli non rinforzati, inducendo un significato potenzialmente aberrante al

segnale del rinforzo che andrebbe ad interferire con la capacità di adattare il

comportamento in risposta a cambiamenti in contingenze di questo tipo” (p.2050).

I risultati ottenuti con l’ARI, hanno differito chiaramente da quelli osservati per l’Hal,

poichè l’ARI, di per sé, non ha prodotto effetti né sul responding né sulla bevuta, in

entrambe le condizioni sperimentali di accesso all’acqua. Nella fase di scelta, l’ARI

73

ha incrementato il numero dei rinforzi ottenuti dai ratti trattati con QNP. E’

interessante osservare che, alle stesse dosi impiegate nel nostro studio, l’ARI ha

prodotto un aumento del numero di infusioni di anfetamina senza modificare

l’accesso a compresse di saccarosio, nelle nostre stesse condizioni di costo operante

(FR3) (Bäckström et al. 2011). E’ da notare anche che, sempre alle stesse dosi, l’ARI

ha revertito l’iperlocomozione indotta da psicostimolanti (Leite et al. 2008; Jerlhag

2008; Nordquist et al. 2008), la distruzione della PPI indotta da anfetamina

(Nordquist et al. 2008) e le stereotipie indotte da apomorfina (Hirose et al. 2004).

Queste nette differenze nei meccanismi d’azione tra l’ARI e l’Hal rendono conto del

loro diverso impatto sul comportamento operante stimolato dal QNP. Anche se è

ancora poco chiaro l’intero spettro delle attività dell’ARI a livello dei recettori D2 e

D3, il farmaco agisce come agonista parziale o antagonista su questi recettori, in

funzione della loro “riserva” neurotrasmettitoriale (Burris et al. 2002),

dell’amplificazione recettore-ligando (Strange 2008), della posizione pre- o post-

sinaptica del recettore (Kikuchi et al. 1995), e dello stato funzionale del sistema

(Kenakin 2007). In accordo, studi di elettrofisiologia indicano che l’ARI sopprime il

firing dopaminergico nel VTA (Dahan et al. 2009) attraverso un parziale agonismo

agli autorecettori D2 (Etievant et al. 2009). In questo senso, L’ARI è considerato uno

stabilizzatore dopaminergico che rappresenta infatti la nuova generazione degli

antipsicotici atipici.

Riassumendo, dal confronto degli effetti di Hal e ARI osservati sul CFL indotto da

QNP, possiamo dedurre due principali conclusioni. (1) L’antagonismo completo sui

recettori dopaminergici D2, come quello prodotto dall’Hal, è essenziale per inibire

l’incremento del comportamento operante indotto dal QNP nella fase di scelta. (2) Né

il blocco, né la “stabilizzazione” dei recettori D2 previene lo spostamento

74

dall’accesso libero a quello operante causato dal QNP. In altre parole, sia l’Hal che

l’ARI modulano il comportamento operante senza ripristinare la bevuta dalla

bottiglia. Di conseguenza, l’effetto ipodipsico netto del QNP non è influenzato da

entrambi questi antipsicotici. Nel loro insieme questi risultati si sono rivelati in totale

contrapposizione con quelli ottenuti in seguito con la CIM.

Differentemente dall’Hal, l’antidepressivo triciclico CIM non ha mostrato alcun

effetto sul comportamento operante, e in particolare, non ha influenzato la bevuta dal

dispenser né quando somministrata da sola, né in associazione con il QNP. Nella fase

di scelta però, la CIM ha modificato la modalità di accesso all’acqua, dal dispenser

alla bottiglia, producendo così una riduzione dose-relata del CFL. E’ importante

notare che, sempre a differenza di quanto osservato per l’Hal, la CIM non solo ha

contrastato il CFL indotto dal QNP, ma ha anche contrastato l’azione ipodipsica del

QNP. Dal momento che la CIM è dotata di una debole affinità per entrambi i recettori

D2 e D3 (Millan et al. 2001), le differenze tra l’Hal e la CIM potrebbero dipendere

dagli effetti bloccanti di quest’ultima sui trasportatori della serotonina e/o della

noradrenalina. Prendendo in considerazione che la desipramina, un inibitore piuttosto

selettivo del trasportatore della noradrenalina, non è efficace nel prevenire lo sviluppo

del comportamento compulsivo, è plausibile che gli effetti della CIM sul CFL

possano dipendere più che altro dalla sua attività serotoninergica.

In accordo con la nozione che l’inibizione del trasportatore della serotonina, ma non

di quello della noradrenalina, sia responsabile dell’efficacia della CIM sui sintomi di

OCD, tale antidepressivo si è rivelato in grado di prevenire il comportamento

perseverativo indotto dalla deplezione di serotonina (Fernandez-Guasti et al. 2003).

La sensibilità agli antidepressivi serotoninercici è infatti considerata un criterio di

valutazione nei modelli sperimentali di comportamento compulsivo (Joel 2006;

75

Boulougouris et al. 2009). Pertanto, i nostri risultati sollevano la domanda su quali

siano i rispettivi ruoli dei sistemi dopaminergico e serotoninergico, nonché le loro

reciproche interazioni, nel CFL. E’ plausibile supporre che uno sbilanciamento

nell’interazione tra questi sistemi sia responsabile del CFL indotto dal QNP,

considerando che il sistema serotoninergico antagonizza il comportamento di

checking compulsivo indotto dalla stimolazione dopaminergica (Szechtman e Woody

2004) e che la deplezione serotoninergica comporta un incremento del rilascio di

dopamina (Goodman et al. 1990 a,b; Micallef e Blin 2001). In questo scenario, il

decision making può essere considerato un target di questo sbilanciamento.

Precedentemente abbiamo suggerito che, nel caso del CFL da QNP, la perseverazione

sulla leva e l’inflessibilità comportamentale sono aspetti di una generale alterazione

del decision making in conseguenza della quale l’animale non è in grado di compiere

la scelta più vantaggiosa (Milella et al. 2008). Il decision making è strettamente

connesso con l’integrità del circuito neurale che coinvolge la corteccia orbito-frontale

(OFC) e la porzione ventrale dello striato, come dimostrato dal dato che, nel compito

di reversal learning, le lesioni della OFC causano carenze nella associazione stimolo-

rinforzo, portando gli animali ad un responding perseverativo nei confronti di uno

stimolo precedentemente rinforzato (Fellows e Farah 2003). Il normale

funzionamento di questo circuito frontostriatale è fortemente dipendente dalla

normale trasmissione serotoninergica, dal momento che la riduzione acuta dell’attività

serotoninergica centrale nei volontari sani o la sua deplezione secondaria all’uso

cronico di psicostimolanti, producono dei deficit nelle capacità di decision making

simili a quelli osservati dopo il danno alla OFC (Rogers et al. 1999, 2003; Ersche et

al. 2008). Uno studio di neuroimmagine ha riportato che nei pazienti OCD, questo

circuito frontostriatale risulta significativamente ipoattivo durante l’elaborazione del

76

rinforzo (Remijnse et al. 2006). Questi dati forniscono i correlati neuroanatomici della

incapacità, osservata nel disturbo compulsivo, di modificare le risposte

comportamentali al modificarsi dl contesto. E’ stato osservato infatti che, i pazienti

con OCD che rispondono meglio agli inibitori della ricaptazione della serotonina,

come la CIM, ottengono un punteggio più alto nel Bechara Gambling task, utilizzato

per testare le disfunzioni frontostriatali (Cavedini et al. 2002).

In conclusione, le nostre osservazioni che la CIM sia più efficace dell’Hal e dell’ARI

nel prevenire il CFL da QNP, forniscono un ulteriore supporto all’ipotesi che questo

comportamento eccessivo sia il risultato di un disordine a carico dei processi di

decision making, secondario all’incapacità del sistema serotoninergico di esercitare il

controllo sul tono dopaminergico striatale sovrastimolato dal QNP.

77

PARTE QUARTA

78

13. RECETTORI D3 E 5HT2c: RUOLO NELLA POLIDIPSIA E NEL

CONTRAFREELOADING

La quarta parte di questo studio è stata dedicata al ruolo dei recettori dopaminergici

D3 e serotoninergici 5HT2c nei nostri modelli sperimentali di polidipsia e CFL.

L’esigenza è derivata dall’assunto che sostanze antipsicotiche con meccanismo

d’azione diverso dalla selettività D2, sono in grado sia di bloccare lo sviluppo della

polidipsia indotta da QNP (Amato et al. 2008; De Carolis et al. 2010), sia di inibire il

CFL, non solo in termini di “responding” come nel caso dell’aloperidolo, ma anche di

ripristinare un pattern normale di bevuta, come osservato con la clomipramina (De

Carolis et al. 2011).

Quest’ultimo dato suggerisce che il CFL è solo parzialmente sotto il controllo dei

recettori D2 dopaminergici e che probabilmente le espressioni dei due fenomeni di

polidipsia e CFL coinvolgono percorsi molecolari differenti. Essendo il QNP un

agonista per i recettori D2/D3, abbiamo indagato se anche la stimolazione selettiva

dei recettori dopaminergici D3 provocasse o meno gli stessi effetti osservati con il

QNP. A tal proposito abbiamo scelto il pramipexolo (PPX), un agonista preferenziale

per i recettori D3 (Mierau et al. 1995), considerato trattamento di prima linea per i

disturbi motori della malattia di Parkinson (Antonini et al. 2010, Fox et al. 2011) e

indicato nella sindrome delle “gambe senza riposo” (Comella et al. 2002, Manconi et

al. 2011). Numerosi studi hanno evidenziato anche che pazienti in trattamento con

PPX mostrano una serie di effetti collaterali allocabili nello spettro dei disturbi

compulsivi, come lo shopping compulsivo, l’ipersessualità, la ipermedicazione ed il

gioco d’azzardo irrefrenabile (Dodd et al. 2005, Niremberg et al. 2006, Bienfait et al.

79

2007, Kolla et al. 2010, Ahlskog et al. 2011, Hassan et al. 2011). Questi dati clinici

sono in accordo con la descritta localizzazione preferenziale dei recettori D3 nelle

aree cerebrali deputate alla valutazione del rinforzo (Bouthenet et al. 1991, Levesque

et al. 1992, Diaz et al. 1995). E’ importante sottolineare anche che il recettore

dopaminergico D3 è stato studiato come target ipotetico per le nuove farmacoterapie

di disturbi neuropsichiatrici come la schizofrenia, la sindrome di Tourette e la

farmacodipendenza (Sokoloff et al. 2006; Weber et al. 2009a,b), nonché utilizzato in

modelli animali di malattie neuropsichiatriche per le misure comportamentali di

fenomeni come la già menzionata PPI e l’esplorazione locomotoria in campo aperto

(Chang et al. 2011). Dagli studi sperimentali è risultato che il PPX ad alte dosi stimola

iperlocomozione e provoca la distruzione della PPI (Chang et al. 2011, 2012).

Va da sé che la scelta di indagare una molecola come il PPX si basa anche

sull’analogia dei suoi effetti comportamentali con quelli da noi osservati in

precedenza con il QNP.

Parallelamente alla valutazione, nel nostro modello sperimentale, della stimolazione

D3 selettiva, ci siamo anche riproposti di far luce sul meccanismo dell’attivazione

serotoninergica coinvolto nel miglioramento, causato dalla somministrazione di CIM,

della compulsività osservato nel CFL indotto da QNP (De Carolis et al. 2011).

Utilizzando come comparatore di una generica attività serotoninergica la CIM,

abbiamo focalizzato l’attenzione sul recettore 5HT2c, poiché esso sembra avere un

ruolo inibitorio nello sviluppo dei comportamenti compulsivi nel ratto. E’ stato infatti

osservato che microinfusioni del 5HT2c antagonista SB-242084, nella corteccia

orbito-frontale (OFC), migliorano la performance dei ratti nel compito di “reversal

learning”, attraverso la riduzione degli errori perseverativi (Boulouguris et al. 2008,

80

2010). Un altro antagonista 5HT2c selettivo, l’RS-02221, è in grado di ridurre le

pressioni sulla leva nel modello di “signal attenuation” di OCD, effetto questo che si

sviluppa anche dopo somministrazioni intra-OFC della stessa sostanza (Fleisher-

Grinberg, 2008).

Sulla base di queste considerazioni, abbiamo ipotizzato che il blocco selettivo dei

recettori 5HT2c potrebbe contrastare lo sviluppo della pressione compulsiva della

leva, modificando la performance degli animali a favore di una strategia di

foraggiamento meno dispendiosa e più mirata.

81

14. RISULTATI

14.1 Esperimento 1: Effetti del PPX sulla polidipsia

Gli animali si sono mantenuti in buona salute durante tutto l’esperimento ed il

fisiologico incremento del peso corporeo dei trattati non è differito rispetto ai controlli

(ANOVA ad una via per misure ripetute, PPX: F3,8=2.4, p=.11).

Come mostrato dalla Figura 1, la somministrazione giornaliera di PPX (alle dosi di

0.1, 0.5 e 1.0 mg/kg) non ha prodotto alcun effetto sulla bevuta né a 2 (ANOVA ad

una via per misure ripetute, PPX: F3,18=0.9, p=.45) né a 5 ore dal trattamento

(ANOVA ad una via per misure ripetute, PPX: F3,18=1.2, p=.32).

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Figura 1

Effetto del PPX 0, 0.1, 0.5 e 1.0 mg/kg sulla bevuta a 2 e 5 ore dal trattamento. I dati sono espressi come media±ESM.

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14.2 Esperimento 2: Effetti del PPX sul CFL

Come mostrato in Figura 2, il gruppo di controllo ha mantenuto livelli di responding e

di bevuta più o meno stabili durante i sei giorni di fase operante. Il trattamento con

PPX, durante il primo giorno, ha nettamente ridotto il numero di rinforzi guadagnati

[ANOVA ad una via: F4,36=5.4, p<.01; p<.05 per PPX 0.5 e 1.5 mg/kg verso i veicoli,

al Bonferroni post-hoc test]; nei giorni a seguire tutti i gruppi di trattamento hanno

riguadagnato i livelli di responding dei controlli (Figura 2, grafico reinforcers). Stesso

andamento si è osservato per la quantità di acqua bevuta, ovvero ad un iniziale

decremento dei PPX è seguito un graduale recupero verso i valori di controllo

[ANOVA ad una via per misure ripetute, PPX: F4,36=10.1, p<.001; interazione PPX x

sessioni: F16,124=1.8, p<.05] (Figura 2, grafico dipper water intake). Gli animali

trattati con PPX non hanno però bevuto tutta l’acqua guadagnata, per cui la

percentuale di consumo è stata significativamente ridotta [ANOVA ad una via per

misure ripetute, PPX: F4,36=7.9, p<.001; interazione PPX x sessioni: F16,124=0.2,

p=.99]. Il test post hoc ha rivelato che quest’effetto è stato prodotto da tutte le dosi di

PPX, eccetto la più bassa (0.1 mg/kg) (Figura 3, istogramma in alto a sin).

Nella fase di scelta, tutti i gruppi trattati con PPX, ad eccezione degli animali trattati

con la dose 0.1 mg/kg, hanno mostrato una preferenza dose-relata per l’accesso

operante che è progressivamente aumentato nel tempo [ANOVA ad una via per


p<.001; p<.05 per le dosi di PPX 0.5, 1.0 e 1.5 mg/kg verso i veicoli al Bonferroni

post hoc test] (Figura 2, istogramma a dx, reinforcers). Allo stesso tempo è aumentata

la quantità di acqua ottenuta dal dispenser [ANOVA ad una via per misure ripetute,

PPX: F4,36=11.4, p<.001; interazione PPX x sessioni: F32,248=2.6, p<.001; p<.05 per le

84

dosi di PPX 0.5, 1.0 e 1.5 mg/kg verso i veicoli al Bonferroni post hoc test] (Figura 2,

istogramma a dx, dipper water intake).

La percentuale di consumo ha subito una riduzione durante tutte le sessioni [ANOVA

ad una via per misure ripetute, PPX: F4,36=5.9, p<.001; p<.05 per le dosi di PPX 1.0 e

1.5 mg/kg verso i veicoli al Bonferroni post hoc test] (Figura 3, istogramma in alto a

dx). Mentre i controlli e la dose di PPX 0.1 mg/kg hanno mostrato la preferenza

significativa per la bottiglia, gli animali trattati con le altre 3 dosi di PPX hanno

progressivamente ridotto il consumo di acqua dalla bottiglia [ANOVA ad una via per



post hoc test] (Figura 2, grafico ed istogramma bottle water intake), nonché la

quantità di acqua totale ingerita durante l’esperimento [ANOVA ad una via per



post hoc test] (Figura 2, grafico ed istogramma total water intake). Dal momento che

questi animali (PPX 0.5, 1.0 e 1.5 mg/kg) hanno ottenuto la risorsa prevalentemente

attraverso l’accesso operante, la percentuale di CFL è risultata drasticamente

aumentata [ANOVA ad una via per misure ripetute, PPX: F4,36=25.5, p<.001;

interazione PPX x sessioni: F32,248=8.9, p<.001; p<.05 per le dosi di PPX 0.5, 1.0 e 1.5

mg/kg verso i veicoli al Bonferroni post hoc test] (Figura 2, grafico ed istogramma

CFL%).

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Figura 2

I grafici rappresentano i valori (espressi come media±ESM) ottenuti iniettando gli animali con salina (veh) o PPX (0.1, 0.5, 1.0 e 1.5 mg/kg). Gli istogrammi rappresentano la media±ESM della media degli ultimi 9 giorni (fase di scelta = choice phase). Bonferroni post hoc test: *p<.05 verso veh.

Fig. 2 Graphs on the leftcolumn show the effects of i.p.injections of saline or PPX0.1 mg/kg (n07), 0.5 mg/kg(n06), 1.0 mg/kg (n09), and1.5 mg/kg (n05) for each dayof the operant (days 1 to 6) andchoice (days 7 to 15) phases.Data are expressed as mean ±SEM. Bars on the right columnrepresent the average of the last9 days of the experiment(choice phase). a The numberof reinforcers gained throughlever pressing; b waterconsumed from the dipper(response-contingent access); cwater consumed from the bottle(noncontingent access); d thetotal amountof water consumed acrossthe session (bottle + dipper);e the CFL rate, dipper waterintake/total water intake.Post hoc Bonferroni’s test,*p<0.05 vs veh

PsychopharmacologyFig. 2 Graphs on the leftcolumn show the effects of i.p.injections of saline or PPX0.1 mg/kg (n07), 0.5 mg/kg(n06), 1.0 mg/kg (n09), and1.5 mg/kg (n05) for each dayof the operant (days 1 to 6) andchoice (days 7 to 15) phases.Data are expressed as mean ±SEM. Bars on the right columnrepresent the average of the last9 days of the experiment(choice phase). a The numberof reinforcers gained throughlever pressing; b waterconsumed from the dipper(response-contingent access); cwater consumed from the bottle(noncontingent access); d thetotal amountof water consumed acrossthe session (bottle + dipper);e the CFL rate, dipper waterintake/total water intake.Post hoc Bonferroni’s test,*p<0.05 vs veh




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Figura 3

Effetto del PPX 0.1, 0.5, 1.0 e 1.5 mg/kg da solo (istogrammi in alto), effetto del PPX 0.5 mg/kg da solo o in combinazione con CIM (istogrammi centrali) o SB-242084 (istogrammi in basso) sulla percentuale di consumo/acqua guadagnata attraverso la pressione della leva nella fase operante (lato sinistro) e nella fase di scelta (lato destro). I dati sono espressi come media±ESM di 6 e 9 giorni, perle fasi operante e di scelta rispettivamente.

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14.3 Esperimento 3: Effetti della CIM sul CFL indotto da PPX

Per testare la sensibilità del CFL indotto dal PPX alla CIM, abbiamo scelto la minima

dose (0.5 mg/kg), tra le tre di PPX utilizzate negli esperimenti precedenti, che ha

prodotto un effetto significativo nel nostro modello.

Come mostrato in Figura 4 (grafico reinforcers), il PPX non ha ridotto il responding

durante la fase operante, mentre la CIM di per sè ha diminuito significativamente il

numero di rinforzi ottenuti [ANOVA a due vie per misure ripetute, CIM: F2,36=4.3,

p<.05; p<.05 per CIM10+veh verso i veicoli al Bonferroni post hoc test]. Sia il PPX

che la CIM hanno ridotto, di per sè, la quantità di acqua ottenuta dal dispenser

[ANOVA a due vie per misure ripetute, CIM: F2,36=7.8, p<.01; PPX: F1,36=38.3 e

p<.001], senza però avere alcun effetto quando co-somministrati (Figura 4, dipper

water-intake). Come osservato nell’esperimento 2, la percentuale di acqua consumata

è stata significativamente ridotta dal PPX [ANOVA a due vie per misure ripetute,

PPX: F1,36=53.4, p<.001] ma il test post hoc ha confermato questo effetto solo per i

gruppi pretrattati con CIM [p<.05 per CIM10+PPX e CIM5+PPX verso i veicoli]

(Figura 3, istogramma centrale a sin). In ogni caso bisogna considerare che la

diminuzione della percentuale di consumo non può essere attribuita alla CIM poiché

essa, di per sé, non ha prodotto alcun effetto significativo.

In condizioni di scelta, il PPX, ma non la CIM, ha significativamente incrementato il

numero di rinforzi [ANOVA a due vie per misure ripetute, CIM: F2,36=2.9, p=.06;

PPX: F1,36=27.5, p<.001; interazione CIM x PPX: F2,36=2.9, p=.06] (Figura 4,

istogrammi reinforcers). E’ da notare che la dose di CIM 5 mg/kg ha anticipato al 4°

giorno della fase di scelta (giorno 10 dell’esperimento) l’aumento progressivo dei

rinforzi ottenuti sotto trattamento con PPX [p<.05 per CIM5+PPX verso i veicoli al

Bonferroni post hoc test], mentre l’effetto del solo PPX è apparso in sesta giornata

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(ovvero giorno 12 nella fase di scelta) [p<0.5 per veh+PPX verso i veicoli al

Bonferroni post hoc test] (Figura 4, grafico reinforcers). La quantità di acqua ottenuta

dal dispenser ha pienamente mimato l’effetto osservato sui rinforzi, per gli animali

appartenenti al gruppo di CIM5+ [ANOVA a due vie per misure ripetute, PPX:

F(1,36)=26.46, p<.001; p<.05 per CIM5+PPX verso i veicoli al Bonferroni post hoc

test], mentre, di per sé, la CIM non ha prodotto alcuna modifica di questo parametro

[ANOVA a due vie per misure ripetute, CIM: F2,36=2.8, p=.07]. Ancora, la dose di 10

mg/kg della CIM ha prevenuto l’effetto del PPX [p<.05 per il gruppo CIM10+PPX

verso veh+PPX, al Bonferroni post hoc test] (Figura 4, grafico water-intake dipper).

Non tutta l’acqua ottenuta attraverso l’accesso operante è stata consumata dagli

animali trattati con PPX, risultando quindi la percentuale di consumo diminuita

rispetto ai controlli, anche se l’analisi post hoc ha rivelato la significatività solo per il

gruppo pretrattato con CIM 5 mg/kg [ANOVA a due vie per misure ripetute, PPX:

F1,36=11.7, p<.01; CIM: F2,36=0.8, p=.4; interazione PPX x CIM: F2,36=1.2, p=.2;

p<.05 per CIM5+PPX verso i veicoli al Bonferroni post hoc test] (Figura 3,

istogramma centrale a dx).

L’accesso alla bottiglia è stato, come atteso, progressivamente ridotto dal trattamento

con PPX, ma attenuato, seppur non significativamente, dalla CIM [ANOVA a due vie

per misure ripetute, PPX: F1,36=16.77, p<.001; CIM: 2,36=1,8, p=.17; interazione CIM

x PPX: F2,36=1.4, p=.26] (Figura 4, istogramma bottle water-intake). Anche in questo

caso, l’acqua totale è stata diminuita dal PPX ma solo tendenzialmente questo effetto

è stato attenuato dalla CIM [ANOVA a due vie per misure ripetute, PPX: F1,36=9.6,

p<.01; CIM: 2,36=0,8, p=.44; interazione CIM x PPX: F2,36=1.6, p=.20] (Figura 4,

istogramma total water-intake). Al diminuire dell’acqua totale provocata dal PPX, la

percentuale di CFL è gradualmente aumentata [ANOVA a due vie per misure ripetute,

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PPX: F1,36=28.0, p<.001; CIM: 2,36=1,4, p=.24; interazione CIM x PPX: F2,36=1.2,

p=.31], ma l’analisi post hoc ha rivelato la significatività di questo incremento solo al

giorno 12 [p<.001 per il gruppo veh+PPX verso i veicoli], un effetto inibito dalla CIM

alla dose di 10 mg/kg [p<.05 per il gruppo CIM10+PPX verso veh+PPX al Bonferroni

post hoc test], mentre la dose di CIM 5 mg/kg è risultata inefficace (Figura 4,

istogramma CFL%).

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Figura 4 I grafici rappresentano le medie±ESM dei salina (veh) o PPX (0.5 mg/kg) da solo o in combinazione con CIM (5 o 10 mg/kg). Gli istogrammi rappresentano la media±ESM della media degli ultimi 9 giorni (fase di scelta = choice phase). Bonferroni post hoc test: *p<.05 verso veh+veh.

Fig. 3 On the left column, dataare expressed as the groupmean ± SEM of rats treatedwith saline or PPX alone or incombination with 5 or 10 mg/kgCIM administered 60 minbefore treatment on a thenumber of reinforcers gained, bwater intake from the dipper, cwater intake from the bottle, dthe total amount of waterintake, and e the CFL rate. Onthe right column, bars (whitefor controls and black for PPX)represent the mean ± SEM ofthe average of the last 9 days ofthe experiment (choice phase).Post hoc Bonferroni’s test,*p<0.05 vs veh + veh

PsychopharmacologyFig. 3 On the left column, dataare expressed as the groupmean ± SEM of rats treatedwith saline or PPX alone or incombination with 5 or 10 mg/kgCIM administered 60 minbefore treatment on a thenumber of reinforcers gained, bwater intake from the dipper, cwater intake from the bottle, dthe total amount of waterintake, and e the CFL rate. Onthe right column, bars (whitefor controls and black for PPX)represent the mean ± SEM ofthe average of the last 9 days ofthe experiment (choice phase).Post hoc Bonferroni’s test,*p<0.05 vs veh + veh



Psychopharmacology

Fig. 3 On the left column, dataare expressed as the groupmean ± SEM of rats treatedwith saline or PPX alone or incombination with 5 or 10 mg/kgCIM administered 60 minbefore treatment on a thenumber of reinforcers gained, bwater intake from the dipper, cwater intake from the bottle, dthe total amount of waterintake, and e the CFL rate. Onthe right column, bars (whitefor controls and black for PPX)represent the mean ± SEM ofthe average of the last 9 days ofthe experiment (choice phase).Post hoc Bonferroni’s test,*p<0.05 vs veh + veh

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14.4 Esperimento 4: Effetti dell’SB-242084 sul CFL indotto dal PPX

Anche in questo esperimento, il PPX ha ridotto il numero di rinforzi acquisiti nel

giorno 1 di trattamento (fase operante), ma quest’effetto è stato contrastato dall’ SB-

242084 [ANOVA a due vie per misure ripetute, SB-242084: F2,36=7.1, p<.01; PPX:

F1,36=0.4, p=.52; interazione SB-242084 x PPX: F2,36=3.0, p=.06] (Figura 5, grafico

reinforcers). Il PPX ha fortemente inibito, durante tutta la fase operante, la quantità di

acqua ottenuta dal dispenser, mentre il pretrattamento con l’SB-242084 ha

completamente bloccato questo effetto [ANOVA a due vie per misure ripetute, SB-

242084: F2,36=9.2, p<.01; PPX: F1,36=32.9, p<.001; interazione SB-242084 x PPX:

F2,36=3.9, p<.05] ad entrambe le dosi, ripristinando i normali livelli di bevuta [p<.01

per i veh+PPX verso SB03+PPX e SB1+PPX al Bonferroni post hoc test] (Figura 5,

grafico water-intake dipper). Sempre in questa fase operante, la percentuale di

consumo è stata significativamente abbattuta dal PPX [ANOVA a due vie per misure

ripetute, SB-242084: F2,36=1.2, p=.31; PPX: F1,36=18.6, p<.001; interazione SB-

242084 x PPX: F2,36=1.7, p=.19; p<.05 per il gruppo veh+PPX verso i controlli al

Bonferroni post hoc test], effetto prevenuto, seppur non significativamente, dall’SB-

242084 (Figura 3, istogramma in basso a sin).

In condizioni di scelta, l’SB-242084, somministrato da solo, non ha modificato il

numero di rinforzi acquisiti, ma ha prevenuto significativamente la preferenza per

l’accesso operante stimolato dal PPX [ANOVA a due vie per misure ripetute, SB-

242084: F2,36=2.9, p=.066; PPX: F1,36=24.0, p<.001; interazione SB-242084 x PPX:

F2,36=4.2, p<.05]. L’analisi statistica post hoc ha evidenziato un effetto di prevenzione

da parte della dose più alta di SB-242084 [p<.05 per il gruppo veh+PPX verso

SB1.0+PPX] (Figura 5, istogramma reinforcers). Stesso discorso per la quantità di

acqua ingerita: l’SB-242084 ha prevenuto l’aumento dell’assunzione dal dispenser

92

indotto dal PPX [ANOVA a due vie per misure ripetute, SB-242084: F2,36=2.6, p=.08;

PPX: F1,36=20.2, p<.001; interazione SB-242084 x PPX: F2,36=4.5, p<.05]. Anche in

questo caso l’analisi post hoc ha evidenziato che solo la dose più alta di SB-242084

ha contrastato significativamente l’effetto del PPX [p<.05 per il gruppo SB1.0+PPX

verso i veicoli] (Figura 5, istogramma water-intake dipper). L’accesso alla bottiglia è

progressivamente diminuito negli animali trattati con PPX [ANOVA a due vie per

misure ripetute, SB-242084: F2,36=0.8, p=.45; PPX: F1,36=9.6, p<.01; p<.05 verso i

veicoli al Bonferroni post hoc test]. L’SB-242084 ha mostrato solo una tendenza

verso la prevenzione di quest’effetto [interazione SB x PPX: F2,36=1.9, p=.15]

(Figura 5, istogramma bottle water-intake). L’acqua totale non ha subito variazioni tra

i gruppi [ANOVA a due vie per misure ripetute, SB-242084: F2,36=0.5, p=59; PPX:

F1,36=1.4, p=.23] (Figura 5, istogramma total water-intake).

Dal momento che la maggior parte dell’acqua ingerita dagli animali trattati con PPX

non è stata consumata nell’accesso operante, il CFL è risultato significativamente

aumentato e quest’effetto è stato inibito dal pretrattamento con l’SB-242084

[ANOVA a due vie per misure ripetute, SB-242084: F2,36=2.7, p=.08; PPX:

F1,36=13.4, p<.01; interazione SB-242084 x PPX: F2,36=4.1, p<.05]. In particolare, la

dose maggiore di SB-242084 (1.0 mg/kg) ha riportato la percentuale di CFL a livello

dei controlli [p<.05 per il gruppo SB1.0+PPX verso i veh+PPX al Bonferroni post hoc

test] (Figura 5, istogramma CFL%).

93

Figura 5

I grafici rappresentano le medie±ESM ottenute iniettando gli animali con salina (veh) o PPX (0.5 mg/kg) da solo o in combinazione con SB-242084 (0.3 o 1.0 mg/kg). Gli istogrammi rappresentano la media±ESM della media degli ultimi 9 giorni (fase di scelta = choice phase). Bonferroni post hoc test: *p<.05 verso veh+veh e #p<.05 verso veh+QNP.

Fig. 4 Graphs on the leftcolumn represent data(expressed as mean ± SEM)obtained by injecting rats dailywith PPX 0.5 mg/kg or salinealone or in combination withSB242084 (0.3 or 1.0 mg/kg)for 15 consecutive days(operant phase, days 1 to 6;choice phase, days 7 to 15). aThe number of reinforcersgained, b water intake from thedipper, c water intake from thebottle, d the total amount ofwater intake, and e the CFLrate. Bars (white for controlsand black for PPX) representthe mean ± SEM of the averageof the last 9 days of theexperiment (choice phase).Post hoc Bonferroni’s test,*p<0.05 vs veh + veh and#p<0.05 vs veh + PPX

PsychopharmacologyFig. 4 Graphs on the leftcolumn represent data(expressed as mean ± SEM)obtained by injecting rats dailywith PPX 0.5 mg/kg or salinealone or in combination withSB242084 (0.3 or 1.0 mg/kg)for 15 consecutive days(operant phase, days 1 to 6;choice phase, days 7 to 15). aThe number of reinforcersgained, b water intake from thedipper, c water intake from thebottle, d the total amount ofwater intake, and e the CFLrate. Bars (white for controlsand black for PPX) representthe mean ± SEM of the averageof the last 9 days of theexperiment (choice phase).Post hoc Bonferroni’s test,*p<0.05 vs veh + veh and#p<0.05 vs veh + PPX




Psychopharmacology

94

15. DISCUSSIONE

In quest’ultima parte dello studio abbiamo dimostrato che la stimolazione ripetuta dei

recettori dopaminergici D3 non induce il bere non-regolatorio ma aggrava fortemente

il CFL per la risorsa idrica. Inoltre, nelle nostre condizioni sperimentali, l’aumento del

CFL è stato riportato ai livelli normali attraverso il blocco dei recettori 5HT2c.

Il PPX agisce preferenzialmente, sia in vitro che in vivo, a livello dei recettori D3

(Millan et al. 2002; Collins et al. 2007) e l’assenza di effetti evidenziata sul nostro

modello di polidipsia indica, appunto, che la stimolazione D3 non è sufficiente, da

sola, ad innescare il comportamento del bere non regolatorio. Questi risultati

rafforzano la nozione che l’effetto dipsogeno dell’agonista non selettivo D2/D3 QNP

dipende essenzialmente dall’attivazione delle vie dopaminergiche D2-dipendenti,

come precedentemente suggerito dall’osservazione che l’antagonista D2 selettivo

aloperidolo, oltre la clozapina, previene lo sviluppo della polidipsia da QNP (Amato

et al. 2008; De Carolis et al. 2010).

Al contrario, nel modello di CFL, il PPX riproduce completamente gli effetti

compulsivi osservati con il QNP. In particolare, abbiamo osservato che il PPX agisce

in maniera analoga al QNP a partire dall’inizio dell’esperimento, quando l’accesso

all’acqua è solo operante, producendo un responding sulla leva non connesso con il

consumo della risorsa, per cui gli animali bevono solo una parte dell’acqua

effettivamente guadagnata. Di conseguenza, così come osservato con il QNP, anche

negli animali trattati con PPX la risposta strumentale diventa indipendente dal

rinforzo, evolvendo in una sequenza comportamentale di tipo compulsivo.

95

Nella scelta tra l’ottenimento della risorsa libera e quello attraverso l’accesso

operante, il PPX porta progressivamente gli animali a preferire l’accesso strumentale,

aggravando così il CFL in maniera ancora più marcata rispetto a quanto finora

osservato con il QNP (Cioli et al. 2000; Amato et al. 2006; Milella et al. 2008; De

Carolis et al. 2010). E’ importante sottolineare che, poiché all’inizio della fase di

scelta, tutti gli animali iniziano a bere dalla bottiglia, lo spostamento verso la leva che

si osserva poi nel gruppo dei PPX è chiaramente espressione di una scelta tra due

opzioni che l’animale ha già acquisito.

La capacità del PPX di influenzare il processo decisionale è stata associata allo

sviluppo del gioco d’azzardo patologico (Ahlskog et al. 2011; d’Orsi et al. 2011;

Hassan et al. 2011; Lader 2008; Gallagher et al. 2007). In questo tipo di soggetti, il

valore soggettivo della scommessa eccede la valutazione oggettiva delle perdite al

gioco, inducendo così delle scelte maladattative. La definizione del gioco d’azzardo

patologico secondo il DSM IV evidenzia l’aspetto della compulsività intendendo il

gambling come “una via di fuga dai problemi o un modo per rivivere uno stato di

disforia”, e il giocatore come “colui che compie sforzi inutili ed infruttuosi per

controllare il gioco” (American Psychiatric Association, 2000). Inoltre il gioco

d’azzardo è per natura ripetitivo ed i giocatori riportano di compiere dei veri e propri

rituali in questo contesto (Grant e Potenza 2006). Queste analogie tra il gambling

patologico e lo spettro dei disordini compulsivi evidenziano un aspetto comune che è

quello della mancanza di flessibilità comportamentale e del controllo inibitorio. Il

comportamento flessibile richiede l’integrità di circuiti corticostriatali, coinvolgendo

anche al corteccia orbitofrontale (OFC), che permette di effettuare il confronto tra gli

eventi in corso e guida la strategia basata sull’errore che viene poi rielaborata

nell’amigdala (Shoembaum et al. 2009). Le lesioni della OFC interrompono questo

96

meccanismo, danneggiando la strategia dello switching, cioè la capacità strategica di

adattarsi ad un cambiamento, come mostrato nel compito di reversal learning

(Chudasama e Robbins 2003) e nel responding perseverativo (Chudasama et al.

2003).

Il PPX, attivando i recettori D3, potrebbe quindi interferire con la regolazione di

questo circuito sia a livello corticale che subcorticale (Black et al. 2002). In accordo,

il PPX riduce il BOLD signal che riflette il reward prediction error nella OFC (van

Eimeren et al. 2009) e sopprime l’attività dei neuroni dopaminergici nel VTA

(Chernoloz et al. 2008), provocando una disfunzione nell’elaborazione del rinforzo.

Inoltre, il PPX, agendo sui recettori D3 localizzati nei medium spiny neurons,

iperattiva il nucleus accumbens (Nacc) e soprattutto, rafforza la connessione del Nacc

con l’Insula, che produrrebbe risposte incentivanti esagerate e quindi scelte non

ottimali (Ye et al. 2011). In questo scenario, l’azione del PPX a vari livelli del circuito

che governa il decision making, risulta in una disconnessione tra la valutazione del

rinforzo e la risultante azione comportamentale, e probabilmente in una

iperattivazione delle risposte incentivanti. Con il nostro modello, suggeriamo che

queste disfunzioni si manifestano con la ripetizione di risposte strumentali inutili che

distolgono gli animali dal consumare di fatto il rinforzo guadagnato.

Nei nostri studi, abbiamo dimostrato che la stimolazione della trasmissione

serotoninergica attraverso l’antidepressivo CIM previene l’aggravarsi del CFL e

ripristina il normale comportamento di bevuta negli animali trattati con QNP (De

Carolis et al. 2010). Poiché le disfunzioni serotoninergiche sono coinvolte nella

patogenesi dell’OCD (Micallef e Blin 2001; Westenberg et al. 2007; Nikolaus et al.

2010) e gli antidepressivi migliorano i sintomi compulsivi (Blier and de Montigny

97

2008, Simpson 2010, Fineberg et al. 2012), possiamo sostenere che i risultati ottenuti

co-somministrando la CIM con il QNP conferiscono validità predittiva al CFL come

modello di OCD (De Carolis et al. 2011). Dal momento che l’azione del PPX riflette

quella del QNP, ci saremmo aspettati quindi che la CIM prevenisse il CFL indotto

anche dal PPX, sostenendo ulteriormente la natura compulsiva dell’effetto del PPX.

Infatti, alla dose maggiore, la CIM blocca sia l’aumento del responding che la

riduzione della quantità di acqua ottenibile dalla bottiglia, migliorando così il

comportamento del bere dei PPX. Come del resto già dimostrato per il QNP

(Szechtman and Woody 2004, De Carolis et al. 2011), l’attivazione del sistema

serotoninergico contrasta l’effetto del comportamento mediato dalla stimolazione

dopaminergica.

L’altro obiettivo che ci siamo proposti di indagare con questi ultimi esperimenti è

stato quello di individuare quale recettore serotoninergico fosse cruciale per gli effetti

modulatori della serotonina sul CFL. Pertanto, abbiamo focalizzato la nostra

attenzione sul recettore 5HT2c, poiché, nella OFC, sarebbe coinvolto nell’espressione

dei comportamenti flessibili. Come atteso, abbiamo osservato che il pretrattamento

con l’antagonista dei recettori 5HT2c, SB-242084, ha completamente soppresso il

CFL, sia inibendo il responding sia favorendo la preferenza verso la bottiglia.

Nel compito di reversal learning, l’SB-242084 diminuisce gli errori perseverativi

(Boulouguris et al. 2008) ed è stato dimostrato che questo effetto è

neuroanatomicamente specifico, poiché la sua somministrazione intra-OFC riproduce

gli effetti osservati dopo somministrazioni sistemiche (Boulouguris et al. 2010). E’

stato osservato che, nel modello di OCD di signal attenuation, anche un altro

antagonista 5HT2c selettivo, l’RS-10221, è in grado di inibire il lever pressing

98

compulsivo (Fleischer-Grinberg et al. 2008), che è aggravato dalle lesioni dell’OFC

(Schilman et al. 2010).

E’ stato suggerito che la ipersensibilizzazione 5HT2c è una caratteristica dei pazienti

OCD (de Leew e Westenberg 2008) e che l’efficacia degli inibitori della ricaptazione

della serotonina sia proprio correlata alla desensibilizzazione di questi recettori

(Yamaguchi et al. 2004). Più in generale, gli antagonisti 5HT2c aumentano il

signaling serotoninergico attraverso il blocco degli intrerneuroni GABAergici nel

raphe dorsale sia direttamente (Boothman et al. 2006), che indirettamente attraverso i

recettori postsinaptici presenti sulle fibre glutammatergiche prefrontali (Sotty et al.

2009). I recettori 5HT2c svolgono anche un ruolo critico nella regolazione

dell’efflusso dopaminergico nel sistema mesolimbico. Come descritto, l’SB-242084

provoca una modulazione bidirezionale dose-dipendente dell’efflusso di dopamina

indotto dalla cocaina nell’Nacc, senza modificare il rilascio di dopamina dai neuroni

del VTA. Inoltre, l’SB-242084 non altera il livello basale di dopamina né in Nacc né

in VTA (Navailles et al. 2008). Piazza e collaboratori hanno dimostrato che i recettori

5HT2c sono costitutivamente attivati nella PFC, dove partecipano alla regolazione del

deflusso di dopamina dall’accumbens, provocato dalla somministrazione di cocaina

(Leggio et al. 2009). Pertanto, i recettori 5HT2c sembrano essere criticamente

coinvolti quando il sistema dopaminergico viene attivato da agenti dopaminergici

diretti o indiretti.

In conclusione, con questi esperimenti abbiamo dimostrato che esiste una chiara

dissociazione farmacologica tra la polidipsia e il CFL, dal momento che solo

quest’ultimo risulta sensibile all’attivazione D3. Abbiamo ulteriormente caratterizzato

il modello del CFL mostrando che questo comportamento può essere peggiorato dalla

99

somministrazione dell’agonista D3 PPX, farmaco questo, che può interferire con i

processi di decision making orientando l’animale verso una selezione di scelte sub-

ottimali di carattere compulsivo. Inoltre, abbiamo meglio definito il coinvolgimento

del sistema serotoninergico nel CFL da PPX, suggerendo che il recettore 5HT2c

giochi un ruolo critico nell’espressione e nel mantenimento di questo comportamento

complesso.

100

16. CONCLUSIONI

Gli studi condotti durante il dottorato e illustrati in questa dissertazione propongono

un modello farmacologico di polidipsia psicotica e forniscono elementi utili ad una

migliore definizione del processo fisiopatologico alla base di questo disturbo.

Partendo dall’evidenza che il D2-agonista QNP, come l’anfetamina, se somministrato

ripetutamente, induce nei ratti un eccessivo comportamento di bevuta, abbiamo voluto

descrivere più dettagliatamente tale comportamento attraverso una sistematica

manipolazione delle condizioni sperimentali. In particolare, (1) il fatto che sia stato

possibile mettere a confronto, negli stessi animali, il bere non regolatorio e la

distruzione della PPI, candida l’iperdipsia da QNP come modello sperimentale di

polidipsia psicotica dotato di validità fenomenologica (face validity) e predittiva

(predictive validity) rispettivamente per due motivi: (a) essa va di pari passo con la

distruzione della PPI che rappresenta un modello validato del deficit del gating

motosensoriale osservato nei pazienti con schizofrenia; (b) l’iperdipsia da QNP è

bloccata dall’antagonista D2 selettivo aloperidolo e revertita dall’antipsicotico

clozapina, considerato quest’ultimo l’opzione migliore, rispetto ai neurolettici

convenzionali, nella farmacoterapia della polidipsia schizofrenica (predictive

validity). In aggiunta, il trattamento con QNP è associato a modifiche nell’espressione

di early genes (c-Fos e BDNF), in quelle regioni del cervello presuntivamente

coinvolte nella fisiopatologia della schizofrenia e presumibilmente della polidipsia

psicotica.

(2) In secondo luogo, utilizzando un protocollo che prevedeva l’accesso libero

all’acqua seguito da quello operante, abbiamo rilevato che in quest’ultima condizione

101

gli animali trattati con QNP non bevono tutta l’acqua che guadagnano, suggerendo

che nell’iperdipsia da QNP vi è una componente compulsiva individuabile nella

dissociazione tra comportamento appetitivo e consummatorio. Parallelamente,

studiando nella corteccia cerebrale anche l’espressione dell’oressina indotta da QNP,

abbiamo osservato che il trattamento ripetuto, e non acuto, con il D2 agonista induce

un incremento nell’espressione del peptide oressina A in corteccia, e l’aloperidolo si

mostra capace di prevenire questo fenomeno. Inoltre, la somministrazione

dell’antagonista del recettore oressinico Ox1 potenzia ed accelera la risposta

polidipsica. Alla luce di queste evidenze, la presunta componente compulsiva

dell’iperdipsia da QNP potrebbe essere legata al venir meno dell’equilibrio tra sistema

dopaminergico D2 e oressinergico Ox1.

(3) Attraverso gli esperimenti della terza parte dello studio abbiamo voluto valutare il

fenomeno del CFL QNP-indotto nei confronti dell’acqua, attraverso il quale è

possibile aggiungere al contesto operante, la variabile della “scelta”. Nel CFL infatti,

acronimo per “contrafreeloading”, gli animali continuano a rispondere per ottenere un

rinforzo premendo la leva anche quando il medesimo rinforzo diventa disponibile

senza sforzo. Con i risultati ottenuti abbiamo ampiamente dimostrato che il CFL da

QNP è un comportamento rigido, rimanendo inalterato anche dopo la manipolazione

del costo operante (Milella et al. 2008), e che la perseverazione, l’eccessività e la

dispendiosità del comportamento, termini ricorrenti nella letteratura del disturbo

ossessivo-compulsivo (OCD), sono caratteristiche del tutto evidenti nel nostro

modello. Pertanto, abbiamo potuto attribuire ulteriore predittività al CFL da QNP,

valutando la sensibilità di questo comportamento a quei farmaci (aloperidolo,

aripiprazolo e clomipramina) che migliorano la sintomatologia nei pazienti OCD. In

accordo con l’ipotesi che la perseverazione sulla leva e l’inflessibilità

102

comportamentale potrebbero essere le conseguenze di una probabile disfunzione dei

processi di decision making, per cui gli animali sotto QNP non sono in grado di

compiere la scelta più vantaggiosa per la risorsa, abbiamo concluso che il CFL da

QNP è un fenomeno che modella il disturbo ossessivo-compulsivo. L’evidenza che

l’antidepressivo clomipramina è risultata più efficace dell’aloperidolo e

dell’aripiprazolo nel prevenire il CFL da QNP fornisce, come predetto, ulteriore

supporto all’ipotesi che questo comportamento è il risultato di un meccanismo

disfunzionale del decision making secondario all’incapacità del sistema

serotoninergico di controllare l’ipertono dopaminergico striatale stimolato dal QNP.

(4) In ultima analisi, attraverso gli esperimenti della quarta parte del lavoro, abbiamo

dimostrato che la stimolazione dei recettori dopaminergici D3 aggrava il CFL ma non

induce la polidipsia. Essendo noto dalla letteratura che anche la PPI sembra sensibile

agli agonisti D3, come il pramipexolo, (Swerdlow et al. 2009; Chan et al. 2012). in

analogia (per la distruzione della PPI) ed in contrasto (per l’iperdipsia) con quanto

osservato con il QNP, abbiamo potuto avvalorare l’evidenza che l’iperdipsia

sperimentale indotta da agonisti dopaminergici potrebbe essere influenzata

prevalentemente dalla stimolazione D2 piuttosto che D3. Inoltre, poiché con la

somministrazione di pramipexolo si osserva lo sviluppo di comportamenti compulsivi

(CFL, dai nostri esperimenti) e di deficit di decision making (il gioco d’azzardo

compulsivo, dalla letteratura), abbiamo potuto concludere che, pur essendo sia la

polidipsia che il CFL comportamenti accomunati da un substrato di tipo compulsivo,

sembrano essere controllati da due via dopaminergiche distinte. Inoltre, abbiamo

meglio definito il ruolo del sistema serotoninergico nei confronti di quello

dopaminergico, suggerendo che i recettori 5HT2c potrebbero essere un target più

103

specifico per valutare il disequilibrio dei processi decisionali, profondamente connessi

con il circuito fronto-striatale, ed ipoattivi nei pazienti OCD.

104

17. APPENDICE

17.1 MATERIALI E METODI PARTE PRIMA: POLIDIPSIA, PPI E CORRELATI

BIOCHIMICI

17.1.1 Animali

Ratti maschi Sprague-Dawley (Harlan Italy Spa, San Pietro al Natisone, Italia) del

peso di 200-225 g, sono stati sistemati all’arrivo, a coppie, all’interno di cabbie in

policarbonato (42.5 × 26.6 × 18.5, Tecniplast Gazzada) e mantenuti in ambiente

controllato con un ciclo di 12 ore luce/buio (luce attiva alle 7 a.m.), alla temperatura

di 22±2° C (umidità relativa 55±10%), con libero accesso a pellets di cibo (standard

rat diet, GLP4RF21, Mucedola S.r.l., Settimo Milanese, Italia) e acqua.

Tre giorni prima di iniziare l’esperimento, i ratti sono stati allocati singolarmente e

manipolati, una volta al giorno, per minimizzare lo stress. All’inizio dell’esperimento,

i ratti sono stati randomizzati ed assegnati ai vari gruppi sperimentali di trattamento.

Tutte le sessioni sperimentali sono state effettuate tra le 9:00 e le 17:00.

17.1.2 Misurazione del riflesso acustico di trasalimento e prepulse inhibition

La PPI è stata misurata utilizzando due camere (SR-LAB stabilimeter chambers, San

Diego Instruments, San Diego, CA), che permettono di misurare la latenza della

risposta di trasalimento provocata da uno stimolo acustico (Lombardo et al. 2009).

Dopo l’applicazione dello stimolo, il movimento del ratto veniva registrato e

trasformato in un segnale elettrico.

Nel giorno zero, gli animali venivano sottoposti ad una sessione di baseline per

abituarli alla procedura sperimentale: uno alla volta, essi erano inseriti nella camera di

105

trasalimento e sottoposti ad un rumore di fondo di 70 dB per 5 min (acclimatazione).

Dopo l’adattamento a questa condizione, ogni animale veniva esposto a sequenze di

18 stimolazioni acustiche singole (P-alone) dell’ampiezza di 120 dB (stimolo di

trasalimento) e della durata di 40 ms ognuna. L’intervallo tra una pulsazione e l’altra

(intertrial interval, ITI) veniva variato da 2 a 23 secondi per minimizzare l’abituazione

alla sequenza degli stimoli. Due giorni dopo, aveva inizio il test. L’animale era

trattato con un’iniezione intraperitoneale della sostanza e posto nella camera di

trasalimento: venivano così presentati 58 trials che consistevano di 18 P-alone (i primi

e gli ultimi 4 presentati random), 40 sequenze di prepulse+pulse (PP100P) a 73, 76 o

82 dB (prepulse) presentati 100 msec prima dello stimolo di trasalimento (120 dB per

40 msec), e 2 trials di 100 msec per valutare il movimento corporeo basale in

presenza del solo rumore di fondo (NOSTIM trials). Tra un trial e l’altro, veniva

presentato un ITI variabile.

I valori venivano registrati da un software (NI-DAQ) alla fine di ogni trial e

rappresentati come il voltaggio medio (mV) dell’intera finestra di risposta (calcolati

come la somma dei voltaggi registrati in ogni msec divisa per 250 msec). Per ogni

ratto, l’ampiezza di trasalimento veniva calcolata come la media della media del

voltaggio ottenuto con i trials di P-alone, e la PPI calcolata secondo la seguente

equazione: %PPI = 100 – (PPI aplitude/startle magnitude*100).

17.1.3 Estrazione e purificazione dell’RNA

Immediatamente dopo il sacrificio, venivano prelevate dal cervello di ogni ratto le

aree di corteccia prefrontale, striato e ippocampo ed estratto l’RNA da ogni campione

di tessuto fresco (Chomczynski and Sacchi 1987) con Tryzol (Invitrogen, Cat.

15596). Tutti i campioni di RNA ottenuti erano trattati con Rnase-free Dnase (Takara,

106

Cat. TAK2220A) per eliminare l’eventuale contaminazione di DNA genomico, infine

aliquotati e stoccati a -80°C.

17.1.4 Sintesi di cDNA

Ogni aliquota di campione di RNA (ca. 5 µg) veniva processata per sintetizzare

cDNA per trascrittasi inversa, utilizzando l’enzima murino Moloney Leukemia Virus

Superscript III (Invitrogen, Cat. 11735-032). I campioni di cDNA risultante venivano

poi stoccati nuovamente a -80°C.

17.1.5 Real-time PCR

La reazione a catena in tempo reale della trascrizione inversa della polimerasi (Real-

time reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR) è stata effettuata con

l’apparato BioRad (IQ5 Cycler machine, BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA)

su campioni di almeno 5 animali per gruppo, per valutare l’espressione dei geni

codificanti il recettore D2, la proteina c-Fos e il BDNF. Per la normalizzazione dei

dati è stato impiegato il gene housekeeping della ß-actina. Per ogni gene sono stati

disegnati i primers con l’aiuto del software OLIGO (Molecular Biology Insights, Inc)

e MFOLD (http://mfold.bioinfo.rpi.edu/), sintetizzati e purificati con Genosys-

SIGMA Life Sciences (Milan, Italy). Con una aliquota di cDNA di ogni animale è

stato costituito un pool per ognuno dei 3 tessuti; questi pools sono serviti per settare le

condizioni ottimali di RT-PCR, per determinare sperimentalmente, per ogni gene, la

temperatura ottimale di annealing e i valori della curva standard di threshold cycle

(CT) contro la concentrazione originale di RNA. Le reazioni di amplificazione sono

state effettuate per 40 cicli, attraverso l’uso del kit “Platinum Two-step qRT-PCR

fluorescent reaction mix” (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA; Cat. No. 11735-032) con

107

il detector fluorescente SubrGreen. La curva standard per ogni gene è stata generata

con campioni di cDNA compresi tra 0.25 e 64 ng per reazione, e graficati contro i

valori di CT. L’espressione dell’RNAper ogni gene è stato infine rappresentato come

media rispetto agli animali controllo, normalizzata verso la ß-actina nello stesso

animale, secondo la procedura pubblicata nel lavoro di Livak e Schmittgen 2001.

17.1.6 Disegno dello studio

Esperimento 1

Per studiare l’effetto del pretrattamento sub-acuto con aloperidolo seguito dal

pretrattamento con clozapina nel prevenire l’iperdipsia indotta da QNP, 4 gruppi di

ratti (30 animali/gruppo) sono stati pretrattati ogni giorno con veicolo (1ml/kg) o

aloperidolo (0.4 mg/kg) e poi con QNP (0.5 mg/kg) o salina (giorno 1-5). Dopo 2

giorni di washout, ogni gruppo è stato suddiviso in 3 sottogruppi (10 animali/gruppo):

gli animali preventivamente trattati con aloperidolo hanno ricevuto poi dal giorno 8 al

giorno 12, un pretrattamento giornaliero con clozapina (10 o 40 mg/kg) da sola o in

combinazione con QNP o salina (vedere Tabella 1). Cinque ore dopo ogni trattamento

giornaliero, veniva misurato il consumo d’acqua, pesando le bottiglie di ogni

rispettivo animale.

108

Tabella 1. Gruppi di trattamento nell’esperimento 1: aloperidolo (Hal) 0.4 mg/kg, clozapina (clo) 10 o 40 mg/kg (dosi tra parentesi) o veicolo (veh) somministrati per os 60 min prima dell’iniezione intraperitoneale di QNP (0.5 mg/kg) o salina.

drinking and PPI. In the first study, which was aimed todetermine the time window of QNP-induced PPI disrup-tion, five groups of rats (seven animals/group) receivedQNP (0.5 mg/kgi.p.) or saline, 5, 10, 15, and 30 minbefore undergoing the startle test. On the basis of theresults of this pilot study, we determined that 10 min wasthe latency from QNP administration that provided thebest linear trend of PPI disruption across the threeprepulse stimuli (i.e., 73, 76 or 82 dB). Moreover, toinvestigate the relative time course of QNP-induced non-regulatory drinking and PPI disruption, two groups ofrats (ten animals/group) treated with saline or QNP(0.5 mg/kgi.p.) underwent PPI on day 1, 5, 8, and 12and 5 h water intake was daily measured.

Experiment 2b

To study the effects of clozapine on both QNP-inducedexcessive drinking and PPI disruption, as well as changes inthe expression of c-Fos, BDNF, and D2 receptor genes, sixgroups of rats were pretreated once daily for 5 days with vehicleor clozapine (10 or 40 mg/kg), before QNP (0.5 mg/kg) orsaline. Drinking was measured everyday; whereas, PPI wastested on days 1 and 5. Five rats that did not perform any testnor received any treatment represented the naïve control group.On day 5, immediately after the last water intake measure, ratswere killed by decapitation and gene expression determined asdescribed above.

Drugs

(-)-Quinpirole HCl (Sigma-Aldrich, Milan, Italy) was dissolvedin saline. Haloperidol (Sigma-Aldrich, Milan, Italy) was

dissolved in glacial acetic acid +0.5% carboxymethylcellulose(CMC), whereas clozapine (100 mg Leponex 100 tablets,Novartis Farma, Naples, Italy) in 1 M HCl+0.5% CMC.Haloperidol, clozapine and their respective vehicles wereadministered orally (p.o., 10 ml/kg), 60 min before quinpiroleor saline intraperitoneal injection (i.p., 1 ml/kg). Doses,calculated as salt, and pretreatment times were chosen basedon our previous experience (Amato et al. 2008).

Statistical analysis

The animals within each experimental group were random-ized by using GraphPad Stat Mate.

Data concerning water intake were processed with one-way analysis of variance (ANOVA) or Kruskal–Wallis one-way ANOVA, using the statistical SigmaStat program. Dataconcerning%PPI were represented as mean±SEM and ana-lyzed by one-way ANOVA for repeated measures or two-wayANOVA when appropriate. Pearson's correlation test wasadopted to assess the relationship between PPI andpolydipsia in the experiment 2a. Data concerning theexpression of c-Fos, BDNF, and D2R receptor genes wereevaluated using two-way ANOVA. Each data analysis wasfollowed by Tukey's post-hoc test for appropriate sets ofcomparisons.

Results

Experiment 1

The animals remained healthy throughout the experimentalthough QNP-treated rats showed a slower increase ofbody weight with respect to controls (+1.5% vs. +5% fromdays 8 to 12, respectively).

As expected, QNP elicited a steady increase of waterintake across the study (Fig. 1a) and a statisticallysignificant effect of the drug was found from day 3 on.Interestingly, 2 days of no drug did not completely reset theeffect of QNP, and on day 8, water intake in the group ofQNP already approached statistical significance withrespect to the control group. Haloperidol (Figs. 1 and 2)prevented QNP-induced water intake throughout the exper-iment, at a dose that reduced basal drinking only during thefirst 5 days of the experiment (Fig. 1b). When on day 8,clozapine was substituted for haloperidol, 40 mg/kg, butnot 10 mg/kg, maintained the inhibition of QNP-induceddrinking (Fig. 2). When given as a novel pretreatment,both clozapine doses were instead effective in blockingQNP effect. Therefore, haloperidol appeared to reducethe capability of clozapine to inhibit QNP-inducedpolydipsia. None of clozapine doses reduced the basalwater intake.

Table 1 Treatment groups in experiment1

Day 1–5 [n=30/group] Day 8–12 [n=10/group]

veh+sal veh+sal

clo(10)+sal

clo(40)+sal

veh+QNP veh+QNP

clo(10)+QNP

clo(40)+QNP

Hal+sal Hal+sal

clo(10)+sal

clo(40)+sal

Hal+QNP Hal+QNP

clo(10)+QNP

clo(40)+QNP

Haloperidol 0.4 mg/kg (Hal), clozapine (clo, doses of 10 or 40 mg/kgin brackets), or vehicle (veh) were administered p.o. 60 min beforequinpirole (QNP) or saline (sal) i.p. injection


109

Esperimento 2a

Due studi pilota sono stati messi a punto per testare l’interazione clozapina-QNP

sull’iperdipsia e la PPI. Nel primo, mirato a determinare la finestra temporale della

distruzione della PPI indotta da QNP, 5 gruppi di animali (7 ratti/gruppo) hanno

ricevuto QNP o salina i.p., 5, 10, 15 e 30 min prima di essere sottoposti al test. Dai

risultati ottenuti da questo pilota, abbiamo ricavato che 10 min era il tempo ottimale

dalla somministrazione di QNP, per ottenere il miglior trend lineare di distruzione di

PPI attraverso i tre stimoli di prepulse (73, 76 e 81 dB).

Nel secondo studio pilota, per investigare il time-course relativo allo sviluppo

dell’iperdipsia e della PPI QNP-indotte, altri due gruppi di animali (10 ratti/gruppo)

trattati con QNP o salina i.p. sono stati sottoposti alla PPI nei giorni 1, 5, 8 e 12 e

dopo 5 ore, in ognuno di questi giorni, misurato il consumo di acqua.

Esperimento 2b

Per studiare l’effetto del pretrattamento con clozapina sull’iperdipsia e la distruzione

della PPI QNP-indotte, nonché i cambiamenti nell’espressione dei geni del recettore

D2, della proteina del c-Fos e del BDNF, sei gruppi di animali sono stati pretrattati

una volta al giorno, per 5 giorni, con veicolo o clozapina (10 o 40 mg/kg), e poi con

QNP o salina. Il consumo di acqua misurato ogni giorno mentre la PPI è stata testata

nei giorni 1 e 5. Cinque ratti che non sono stati sottoposti ad alcun test né hanno

ricevuto alcun trattamento hanno costituito il gruppo naive di controllo. Nel giorno 5,

immediatamente dopo l’ultima misurazione del consumo d’acqua, gli animali sono

stati sacrificati per decapitazione e l’espressione genica determinata.

110

17.1.7 Sostanze

Il (-)-quinpirolo HCl (Sigma-Aldrich, Milano, Italia) è stato dissolto in salina.

L’aloperidolo in polvere (Sigma-Aldrich, Milano, Italia) è stato dissolto in acido

acetico glaciale con l’aggiunta di carbossimetilcellulosa 0.5% (CMC); la clozapina

(100 mg Leponex, 100 tavolette, Novartis Farma, Napoli, Italia) è stata sospesa in

HCl 1M più CMC 0.5%. Aloperidolo, clozapina e rispettivi veicoli sono stati

somministrati per via orale (p.o., 10 ml/kg), 60 min prima della somministrazione

intraperitoneale di QNP o salina (i.p., 1 ml/kg). Le dosi, calcolate come sali, e i tempi

di pretrattamento sono stati scelti sulla base di esperimenti precedenti (Amato et al.

2008).

17.1.8 Analisi statistica

In ogni esperimento gli animali sono stati randomizzati con l’ausilio del programma

GraphPad Stat Mate. I dati relativi al consumo d’acqua sono stati analizzati con

l’analisi della varianza ad una via (One-way ANOVA) o con il Kruskal-Wallis,

utilizzando il programma SigmaStat. I dati relativi alla %PPI sono stati rappresentati

come media±ESM ed analizzati con una anova ad una via per misure ripetute o con

una ANOVA a due vie quando ritenuto opportuno. La correlazione di Pearson è stata

adottata per valutare la relazione tra la distruzione della PPI e la polidipsia

nell’esperimento 2a. I dati realtivi alle espressioni geniche sono stati valutati con

ANOVA a due vie. Ogni analisi è stata seguita dal test post hoc di Tuckey per gli

appropriati confronti fra gruppi.

111

17.2 MATERIALI E METODI PARTE SECONDA: DOMPAMINA E ORESSINA

17.2.1 Animali

Ratti maschi Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Italia) del peso di 175-200

g all’arrivo, sono stati stabulati individualmente alla temperatura di 22°C, 12 ore di

ciclo luce/buoi (luce accesa alle 8:00 a.m.). Nella prima settimana, gli animali sono

stati manipolati giornalmente per 2 min ciascuno ed hanno avuto accesso libero ad

acqua e cibo (pellets standard rat diet, Harlan, Italia).

17.2.2 Sostanze

Il (-)-quinpirolo HCl (Sigma-Aldrich Inc.) e l’aloperidolo (Serenase, Lusofarmaco,

Italia) sono stati sciolti in soluzione salina (NaCl 0.9%) al volume finale di 1 ml/kg.

L’SB-334867 [N-(2-Metil-6-benzoossazolil)-N’-1,5-naftiridin-4-il urea] (Tocris

Bioscience, Bristol, UK) è stato sciolto in una soluzione di DMSO/salina 10:90 (v/v)

e somministrato al volume di 1 ml/kg.

17.2.3 Esperimento 1: effetto del blocco D2 sul comportamento libero e

operante indotti dal QNP

Dopo 1 settimana di abituazione, i ratti sono stati assegnati a due gruppi sperimentali,

HOME (n=45) e HOME+OPERANT (n=46). Nel gruppo HOME, gli animali hanno

avuto accesso libero all’acqua direttamente nelle loro gabbie di stabulazione,

attraverso una bottiglia di plastica da 200 ml dotata di beccuccio metallico. Le

bottiglie, una volta riempite, sono state pesate giornalmente, prima dell’esperimento e

alla 4a e 5a ora dal trattamento. I ratti del gruppo HOME+OPERANT sono stati

inizialmente addestrati nelle camere di condizionamento operante per l’accesso

all’acqua attraverso una leva attiva da premere 3 volte per ottenere un rinforzo (FR3=

112

fixed ratio 3). Le gabbie per il condizionamento operante sono di Plexiglas e acciao

inossidabile (28.5 cm lungh x 27 cm largh x 28 cm alt) e dotate di un dispenser a cui

gli animali possono accedere attraverso un’apertura della parete di sinistra della

gabbie. Il dispenser è costituito da una vaschetta riempita d’acqua posta all’esterno, in

cui pesca un cucchiaino retraibile che rende disponibile 0.1 g di acqua per 2 secondi

alla pressione della leva. Alla destra e alla sinistra dell’apertura verso il cucchiaino,

sono montate 2 leve, a 9 cm dal pavimento della gabbia operante. La leva dichiarata

attiva (di destra o di sinistra) è stata controbilanciata tra gli animali.

Le sessioni di addestramento sono state condotte giornalmente durante la fase di luce,

per 1 settimana e sono durate 20 min ciascuna. Gli animali sono stati prelevati dalla

loro gabbia di stabulazione e inseriti nelle gabbie operanti per l’addestramento e alla

fine, riposti nelle gabbie di stabulazione.

Per indurre uno stato motivazionale nei confronti dell’acqua, ai ratti è stato ristretto

l’accesso alla risorsa solo 5 min al giorno, la sera, all’interno delle loro gabbie.

L’addestramento è stato terminato una volta raggiunto il criterio standard di

performance (la minore variabilità inter-sessioni, per FR3) da tutti gli animali. Al

termine dell’addestramento l’acqua è tornata ad essere disponibile nelle gabbie di

stabulazione per tutto l’esperimento, in modo che gli animali non venissero

ulteriormente deprivati durante il test.

Nel test, il consumo di acqua per il gruppo HOME+OPERANT nelle gabbie di

stabulazione, è stato misurato 4 ore dopo il trattamento, poi gli animali sono stati

spostati nelle gabbie operanti per un’altra ora (4-5). In questo frangente, sono stati

misurati il numero di pressioni sulla leva attiva e inattiva, il numero di rinforzi

guadagnati, la quantità di acqua consumata e la latenza a premere la leva.

113

Abbiamo introdotto anche la variabile della “% di consumo”, definita come la

percentuale di acqua consumata sull’acqua guadagnata attraverso la pressione della

leva, per quantificare la dissociazione tra la componente appetitiva e quella

consumatoria del bere. Per ogni sessione, il numero di rinforzi è stato moltiplicato per

0.1 (che è la quantità di acqua in ml o g ottenibile dal cucchiaino) per ottenere la

quantità di acqua guadagnata in ogni sessione. Durante il test, il cibo è rimasto

disponibile solo nelle gabbie di stabulazione e non in quelle operanti. L’Hal 0.1 o 0.2

mg/kg o il veicolo è stato somministrato per via i.p., 60 min prima del trattamento con

QNP 0.5 mg/kg o veicolo. Il test è stato condotto ogni giorno, per 9 giorni, durante la

fase di luce.

Gruppo operante da solo (0-60 min)

Per escludere che gli effetti del QNP e dell’Hal sulla % di consumo nella fase

operante fossero stati influenzati dal rifornimento di acqua nelle prime 4 ore di bevuta

libera, un set a parte di ratti (n=54), addestrato a premere la leva secondo il costo FR3

(stessa procedura descritta sopra), è stato utilizzato solo per il comportamento

operante. I ratti sono stati deprivati sia nella fase di addestramento che durante il test,

con l’accesso all’acqua limitato a 5 min la sera. Il cibo è stato continuamente

disponibile solo nelle gabbie di stabulazione. La performance nelle gabbie operanti è

stata registrata nei 60 min successivi al trattamento come sopra, per 6 giorni

consecutivi.

114

17.2.4 Esperimento 2: Effetto del QNP acuto e ripetuto sull’espressione

cerebrale di OxA

Venticinque ratti, dopo 1 settimana di abituazione e nelle condizioni sperimentali

identiche a quelle del gruppo HOME dell’esperimento precedente, sono stati

pretrattati con Hal 0.2 mg/kg o veicolo, 1 ora prima di ricevere QNP 0.5 mg/kg o

veicolo, per 9 giorni consecutivi. Un gruppo separato di ratti ha ricevuto una singola

iniezione di QNP al giorno 9 (acuto). Il consumo libero di acqua è stato misurato ogni

giorno di test, alla 5a ora, pesando le bottiglie immediatamente prima e dopo 5 ore

rispetto al trattamento con QNP. Al termine dell’ultima sessione (alle 3:00 p.m. fase

di luce) i ratti sono stati sacrificati per decapitazione. Sono così stati prelevati i

cervelli e il plasma per la determinazione dell’espressione cerebrale di OxA e dei

livelli di corticosterone circolante.

Imunoistochimica delle sezioni cerebrali

La rilevazione istochimica della proteina di OxA nel cervello è stata effettuata con un

anticorpo monoclonale disponibile in commercio (Phoenix Pharmaceutical, Inc. –

Burlingame, CA, USA). Sulla base del razionale dello studio, le regioni considerate di

interesse sono state l’ipotalamo, lo striato dorsale e le aree della neocrteccia

prefrontale, insulare e somatosensoriale. (vedere i materiali supplementari di Milella

et al. 2010, per una descrizione dettagliata delle tecniche di immunoistochimica e

delle procedure di analisi densitometrica).

Determinazione del corticosterone plasmatico

Il sangue è stato prelevato e raccolto in tubi contenenti 0.13M di EDTA. Dopo

centrifugazione a 1900xg a 4°C per 15 min, i campioni di plasma sono stati aliquotati

115

e stoccati a -20°C. Le concentrazioni di corticosterone plasmatico sono state

determinate con il RIA. La reattività crociata tra l’antisiero policlonale per il

corticosterone (MP Biomedicals, USA) e le relative sostanze è stato trascurabile. I

coefficienti di variazione inter- e intra-assay sono stati rispettivamente di 8% e 3%,

con un limite di rilevabilità di 0.0125 ng/tubo. I campioni di plasma sono stati diluiti

secondo il rapporto 1:100 con Steroid Diluent (MP Biomedicals, USA). Tutte le

misurazioni sono rientrate nel range lineare della curva standard (0.0125-3.0 ng/tubo).

17.2.5. Esperimento 3: Effetto dell’SB-334867 sulla polidipsia indotta da QNP

Nell’esperimento 2, abbiamo visto che il trattamento ripetuto con QNP è associato

con una over-espressione di OxA nella corteccia cerebrale. Per testare se la

trasmissione oressinergica è coinvolta nell’effetto comportamentale indotto dal QNP,

abbiamo indagato in questo esperimento l’effetto dell’antagonista del recettore

oressinico 1, l’ SB-334867, sul comportamento del bere in 51 ratti, con la previsione

che il blocco dell’oressina potenziasse la polidipsia indotta da QNP. Le condizioni

sperimentali sono state le stesse utilizzate per gli animali HOME nell’esperimento 1,

con la differenza che l’SB-334867 (2 o 4 mg/kg) ha sostituito l’Hal, ed che è stato

iniettato i.p. 30 min prima della somministrazione i.p. di QNP 0.5 mg/kg o del

veicolo. L’acqua bevuta è stata misurata 5 ore dopo il trattamento con QNP.


Nell’esperimento 1, le misure comportamentali sono state analizzate dall’analisi della

varianza (ANOVA) a tre vie con il pretrattamento, il trattamento con QNP e il gruppo

come fattori between-subjects. Gli effetti significativi (p<.05) sono stati seguiti dal

test post hoc di Bonferroni. I dati per l’immunoistochimica dell’esperimento 2 sono

116

stati sottoposti al test di Kolmogorov-Smirnov per verificarne la distribuzione

normale e quindi analizzati con il test di Kruskal-Wallis seguito dal post hoc di Mann-

Whitney per il confronto fra i gruppi. La variabile della “% di consumo” nel

comportamento operante è stata calcolata nel seguente modo: acqua bevuta (g)/(n

rinforzi x 0.1 g) x 100. Nell’esperimento 3 è stato calcolato il 95% dell’intervallo

fiduciale (CI) dell’acqua bevuta dai controlli nei primi 5 giorni e i soggetti considerati

polidipsici sono stati quelli che hanno mostrato livelli di bevuta superiori al limite

maggiore del CI dei controlli, per almeno 2 giorni consecutivi. La determinazione

degli effetti significativi con il pretrattamento e il trattamento con QNP come fattori

between-subjects è stata effettuata con l’ANOVA a due vie, seguita da confronti

pianificati post hoc in accordo con la nostra ipotesi sperimentale. Tutti i dati sono stati

espressi come medis±ESM.

17.3 MATERIALI E METODI PARTE TERZA: ALOPERIDOLO, ARIPIPRAZOLO E

CLOMIPRAMINA

17.3.1 Animali

Gli esperimenti sono stati condotti utilizzando 126 ratti maschi Sprague-Dawley

(Charles River Laboratories, Italia), del peso di 175-200 g. All’arrivo gli animali sono

stati stabulati 2 per gabbia, in gabbie di Plexiglas (42.5 × 26.6 × 18.5, Tecniplast

Gazzada) e manipolati giornalmente (5 giorni) per 2 min per minimizzare lo stress.

Nei 2 giorni seguenti i ratti sono stati collocati nelle gabbie singolarmente, mantenuti

nello stabulario alla temperatura di 22±1°C con 12 ore di ciclo luce/buio (luce accesa

alle 7:00 a.m.), e con accesso libero ad acqua e cibo (pellets di standard rat diet,

Harlan, Italy).

117

17.3.2 Disegno sperimentale

Animali diversi sono stati utilizzati per gli esperimenti 1, 2 e 3 rispettivamente. Per

indurre uno stato motivazionale verso la risorsa idrica, gli animali sono stati deprivati,

concedendo loro l’accesso all’acqua per soli 5 min al giorno, la sera, nelle loro gabbie

di stabulazione. Come descritto da Cioli et al (2000), i ratti sono stati spostati ogni

giorno nelle gabbie di Skinner per il condizionamento operante. All’inizio, essi sono

stati addestrati a premere la leva per ottenere 0.1 ml di acqua secondo un fixed ratio

pari a 1 (FR1) e poi portati ad FR3 una volta al giorno, per 7 giorni. Ogni sessione è

durata 60 min, preceduta da 1 min di pre-sessione con la luce all’interno della gabbia

spenta, e condotta tra le 9:00 a.m. e le 3:00 p.m. Questa fase di addestramento è stata

considerata finita quando la minima variabilità tra le sessioni è stata raggiunta da tutti

gli animali.

I ratti hanno effettuato 2 giorni consecutivi di sessione baseline in cui hanno ricevuto

2 iniezioni i.p. di salina (una per giorno, prima di entrare nelle gabbie operanti).

Nell’esperimento 1, gli animali sono stati assegnati ai gruppi di trattamento, ricevendo

un pretrattamento i.p. di Hal (0.1 o 0.2 mg/kg), 60 min prima dell’iniezione i.p. di

QNP (0.5 mg/kg) o del rispettivo veicolo. Nell’esperimento 2 e 3, l’ARI (0.3 o 1

mg/kg) e la CIM (5 0 10 mg/kg) hanno rispettivamente sostituito l’Hal. Le dosi di

Hal, ARI e CIM sono state scelte sulla base degli studi precedenti (Amato et al. 2008;

Egashira et al. 2008; Milella et al. 2010).

Nei giorni 1-6 (fase di condizionamento operante), l’acqua è stata disponibile solo

attraverso la pressione della leva, con la bottiglia inserita nella gabbia ma vuota. Nei

giorni 7-15 (fase di scelta), la bottiglia è stata riempita d’acqua, divenendo così la

risorsa disponibile sia attraverso la pressione della leva che liberamente dalla bottiglia

118

senza alcun costo comportamentale. I parametri registrati sono stati rispettivamente il

numero delle pressioni sulla leva attiva e inattiva, il numero dei rinforzi guadagnati e

la latenza a premere la leva. La quantità di acqua ingerita è stata misurata pesando il

ricettacolo e la bottiglia, prima e al termine di ogni sessione. In alcuni casi, la quantità

di acqua bevuta dai controlli ha ecceduto il volume derivato dal numero di rinforzi

moltiplicato per 0.1 ml. Questo eccesso, solitamente al di sotto del 20%, è stato

causato dal volume extra di acqua (approssimativamente di 0.03 ml) che veniva

trascinato dal cucchiaino ad ogni rilascio e quindi avidamente leccato dagli animali

assetati.

17.3.3 Sostanze

L’ARI (polvere, Bristol-Myers Squibb) è stato sospeso in un veicolo costituito da

Tween 5% in salina (NaCl 0.5%) e acqua. L’Hal (Serenase®, Lusofarmaco, Milano,

Italia) è stato diluito con salina. Il (-)-quinpirolo HCl e la clomipramina cloridrato

(Sigma-Aldrich, Milano, Italia) sono stati sciolti in salina. Le soluzioni sono state

preparate immediatamente prima dell’uso e iniettate i.p. al volume di 1 ml/kg.


I dati sono stati analizzati con l’ANOVA a due vie per misure ripetute, con 2 fattori

between-subjects (pretrattamento e trattamento) e uno within-subjects (giorni di

trattamento o sessioni). Gli effetti significativi (p<.05) sono stati valutati attraverso il

test post hoc di Bonferroni. I valori di CFL sono stati espressi come la frazione

dell’acqua totale ingerita (i.e. acqua dal dispenser (g)/acqua totale (g) x 100) e la

variabile della “% di consumo” calcolata secondo l’espressione: acqua dal dispenser

(g)/(numero di rinforzi x 0.1 g) x 100.

119

17.4 MATERIALI E METODI PARTE QUARTA: PRAMIPEXOLO ED SB-242084

17.4.1 Animali

Gli esperimenti sono stati condotti utilizzando 126 ratti maschi Sprague-Dawley

(Charles River Laboratories, Italia), del peso di 175-200 g. All’arrivo gli animali sono

stati stabulati 2 per gabbia, in gabbie di Plexiglas (42.5 × 26.6 × 18.5, Tecniplast

Gazzada) e manipolati giornalmente (5 giorni) per 2 min per minimizzare lo stress.

Nei 2 giorni seguenti i ratti sono stati collocati nelle gabbie singolarmente, mantenuti

nello stabulario alla temperatura di 22±1°C con 12 ore di ciclo luce/buio (luce accesa

alle 7:00 a.m.), e con accesso libero ad acqua e cibo (pellets di standard rat diet,

Harlan, Italy).

17.4.2 Esperimento 1: Effetto del PPX sul bere

Dopo 1 settimana di ambientamento, 16 ratti sono stati assegnati casualmente a 4

gruppi di trattamento, ricevendo iniezioni giornaliere di salina o PPX (0.1, 0.5 o 1.0

mg/kg). L’accesso libero all’acqua è stato reso possibile attraverso bottiglie di plastica

da 200 ml dotate di beccuccio metallico. Le bottiglie sono state pesate ogni giorno, al

tempo 0, a 2 e a 5 ore dal trattamento, per 8 giorni consecutivi. Le sessioni

sperimentali sono state condotte durante la fase di luce del giorno.

120

17.4.3 Esperimento 2: Effetto del PPX sul CFL

Trentasei ratti sono stati utilizzati per testare l’effetto del PPX sul CFL, secondo la

procedura descritta da Cioli et al. (2000) e nella sezione dei materiali e metodi parte

terza di questa trattazione. Le dosi di PPX utilizzate in questo esperimento sono state

rispettivamente 0.1, 0.5, 1.0 e 1.5 mg/kg.

17.4.4 Esperimento 3: Effetto della CIM sul CFL indotto da PPX

Trentasei ratti sono stati addestrati come già descritto, e randomizzati per i gruppi di

trattamento, ricevendo CIM (0, 5 o 10 mg/kg), 60 min prima del trattamento con PPX

(0 o 0.5 mg/kg). Le condizioni sperimentali sono state le stesse dell’esperimento 2.

17.4.5 Esperimento 4: Effetto dell’SB-242084 sul CFL indotta da PPX

L’esperimento 4 è stato identico all’esperimento 3 con la differenza che l’SB-242084

(0.3 o 1.0 mg/kg) ha sostituito la CIM. L’SB-242084 è stato somministrato 30 min

prima del trattamento con PPX.

17.4.6 Sostanze

Il pramipexolo HCl (polvere, Tocris Bioscience, Bristol, UK), la clomipramina

cloridrato (Sigma-Aldrich, Milano, Italia) e l’SB-242084 (Rocris Bioscience, Bristol,

UK) sono stati sciolti in salina (NaCl 0.9%). Tutte le sostanze sono state iniettate i.p.

al volume di 1 ml/kg.


I dati degli esperimenti 1 e 2 sono stati analizzati utilizzando l’ANOVA ad una via,

con il trattamento come fattore between-subjects ed i giorni di trattamento (sessioni)

121

come fattore within-subject. Dove l’ANOVA ha rilevato valori statisticamente

significativi (p<.05) sono stati effettuati i confronti post hoc con il test di Bonferroni.

I dati degli esperimenti 3 e 4 sono stati analizzati con l’ANOVA a due vie, con il

pretrattamento ed il trattamento come fattori between-subjects e le sessioni come

within-subject. Anche in questo caso, i valori di ANOVA significativi sono stati

sottoposti al test post hoc di Bonferroni per il confronto fra i gruppi. La variabile “%

di consumo” è stata calcolata nel seguente modo: acqua bevuta (g)/(numero di rinforzi

x 0.1) x 100. il CFL è stato espresso come la frazione di acqua consumata dal

dispenser sull’acqua totale (data dalla somma dell’acqua bevuta dalla bottiglia+quella

ottenuta dal dispenser).

122

18. BIBLIOGRAFIA

Alberto CO, Trask RB, Quinlan ME, Hirasawa M (2006). Bidirectional dopaminergic modulation of excitatory synaptic transmission in orexin neurons. J Neurosci 26:10043–10050

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Tutti i dati presentati in questa trattazione sono oggetto delle seguenti pubblicazioni: • Schepisi C, De Carolis L, Nencini P (2012). Effects of the 5HT2C antagonist

SB242084 on the pramipexole-induced potentiation of water contrafreeloading, a putative animal model of compulsive behavior. Psychopharmacology (Berl). [Epub ahead of print]

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