infecção por micoplasmas do trato urogenital e micoplasmas emergentes em indivíduos com hiv/aids...

Ilíada Rainha de Souza - UFSC

Secretaria de Estado da SaúdeSecretaria de Estado do Desenvolvimento Econômico

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Infecção por micoplasmas do trato urogenital e micoplasmas emergentes em

indivíduos com HIV/AIDS

Caio M. M. de Cordova

Universidade Regional de Blumenau - FURB



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Histórico• 1967:– Classe Mollicutes

– Ordem Mycoplasmatales

– Denominação genérica• Molicutes

• Hoje– 4 ordens, 5 famílias

– 8 gêneros

– > 200 espécies conhecidas • Mais recente: M. amorphiforme (2003)



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Características• Os microrganismos auto-replicativos com o menor

genoma

• Habilidades biosintéticas limitadas

• Ausência de parede celular

• Pleomorfismo celular

• Requerem esteróides nos meios de cultura



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Possíveis co-fatores do HIV• Micoplasmas

• Micobactérias

• Salmonela

• Leishmania

• Toxoplasma

• Citomegalovírus

• Herpesvírus

• Epstein-Barr vírus

• HTLV-12

• outros retrovírus Montagnier e Blanchard. Clin Infect Dis 17:S309-15, 1993.



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Objetivos

Objetivo GeralInvestigar a infecção por espécies de micoplasmas do

trato urogenital e espécies emergentes de micoplasmas em indivíduos com HIV/AIDS, assim como a incidência da resistência aos antibióticos comumente utilizados no tratamento, e implantar estes testes no Laboratório de Análises Clínicas de nossa universidade, para o atendimento a população no âmbito do SUS.



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ObjetivosObjetivos Específicos • Investigar a incidência de infecção por Mycoplasma hominis, Ureaplasma urealyticum e U. parvum no trato urogenital de indivíduos com HIV/AIDS;• Investigar a incidência de infecção por Mycoplasma genitalium, M. fermentans e M. penetrans no trato urogenital de indivíduos com HIV/AIDS;• Avaliar a eficiência da detecção da infecção por micoplasmas por métodos moleculares (PCR) em relação a cultura; • Avaliar a resistência dos micoplasmas aos principais antibióticos utilizados no tratamento;• Investigar uma eventual correlação entre infecção por micoplasmas e o desenvolvimento da imunossupressão durante a infecção pelo HIV;• Implantar o teste para a determinação da resistência dos micoplasmas aos antibióticos no Laboratório de Análises Clínicas de nossa instituição, no âmbito do SUS;• Implantar os testes de PCR para a detecção de espécies emergentes de micoplasmas no Laboratório de Análises Clínicas de nossa instituição, no âmbito do SUS.



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Metodologia Aplicada

Pacientes e Amostras: amostras de primeiro jato de urina (cerca de 20 mL) de homens infectados pelo HIV, após consentimento livre e esclarecido.

Serão coletadas amostras de cerca de 100 indivíduos, nos diferentes estágios da infecção pelo HIV.

Serão avaliados também os dados sobre os níveis de imunodepressão (linfócitos CD4 e CD8), carga viral do HIV, e cinética de progressão da doença.



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Cultura de micoplasmas: As amostras obtidas são cultivadas em meio sólido A7, meio líquido de uréia (U10), meio SP4 liquido e sólido e o meio líquido de Arginina (MLA), com incubação em condições de 2-3% de CO2 por no mínimo 48 horas a 37 ºC.

As amostras são quantificadas pelo método de microtitulação, em seus respectivos meios líquidos. As culturas que não apresentarem crescimento em após 7 dias de cultivo são consideradas negativas

• Cultura para M. hominis e U. urealyticum / U. parvum

Meio de transporte (A3Xb)

Meio de Arginina

Meio uréia (U10)

Meio sólido (A7)

M. hominis

U. urealyticum /

U. parvum

titulação

• Cultura para M. penetrans, M. genitalium e M. fermentas

Meio de transporte (A3Xb)

Meio de glicose (SP4)

Meio sólido (SP4)

?



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Resistência dos micoplasmas aos antimicrobianos: as cepas isoladas das amostras clínicas serão testadas pelo método de Concentração Inibitória Mínima (MIC) por microdiluição em caldo, para os antibióticos mais utilizados no tratamento: azitromicina, claritromicina, doxiciclina, eritromicina, levofloxacin e ofloxacin



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diluição



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Detecção de micoplasmas por PCR: alíquotas de 10 mL das amostras de urina serão centrifugadas, e o DNA do sedimento será extraído com fenol/clorofórmio/álcool isoamílico, após lise com proteinase K em tampão contendo Triton X-100. O DNA das amostras será amplificado com oligonucleotídeos específicos para M. hominis, U. urealyticum e U. parvum, e também com oligonucleotídeos específicos para M. genitalium, M. fermentans e M. penetrans. Os produtos de PCR serão analisados por eletroforese em gel de agarose a 1%.



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• PCR para M. genitalium

• PCR para M. penetrans

• PCR para M. fermentans

410 bp

100 bp 1 2 3 4 5 6

Detecção dos produtos da PCR para Mycoplasma penetrans nas amostras clínicas em gel de agarose a 0,8%, corado com brometo de etídio, sob luz U.V. Marcador de peso molecular: 100 bp DNA Ladder, Linhas 1:

controle positivo; 2: controle de reação; 3 e 4: amostras positivas; 5 e 6: amostras negativas.



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Resultados e ComentáriosPacientes e Amostras: em andamento, cerca de 25 amostras coletadas com consentimento.

Cultura de micoplasmas:



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Resultados e ComentáriosInstalação do laboratório:



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Impactos do Projeto

•Esperamos poder determinar a incidência da resistência dos micoplasmas aos antibióticos utilizados no tratamento em nossa população.

•Esperamos também determinar qual o melhor método para a pesquisa das diferentes espécies de micoplasmas na população de indivíduos infectados pelo HIV, alem de determinar uma eventual relação entre a infecção por espécies emergentes de micoplasmas e a progressão da AIDS.



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Aplicabilidade para o SUS

Comprovada a utilidade da implantação dos testes de resistência dos micoplasmas aos antibióticos, no âmbito do SUS, possibilita-se promover o uso racional destes medicamentos.

A implantação das metodologias de pesquisa de micoplasmas, no âmbito do SUS, através de nosso laboratório universitário, pode de grande contribuição na compreensão da infecção pelo HIV e suas infecções relacionadas, reduzindo a morbidade, e promovendo uma melhora na qualidade de vida destes indivíduos



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Equipe:

Prof. Dr. Caio M. M. de Cordova – [email protected]

Prof. MSc. Eduardo M. Dalmarco

Prof. Alessandro Conrado Silveira

Nayara Kelly Benenuti

Camila Simões Benfatti

Samuel M. de Cordova

Laynara K. Grutzmacher

Gabriele Zateli

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