influencia de aislados bacterianos endfitos sobre el

Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas Centro de Investigaciones Agropecuarias

Tesis en opción al Titulo Académico de Master en Agricultura Sostenible.

Influencia de aislados bacterianos endófitos sobre el desarrollo del cultivo del sorgo

(Sorghum bicolor (L.) Moench) en condiciones controladas.

Maestrante: Ing. Francisco Raymundo Pérez Tutores: Dr. C. Roldán Torres Gutiérrez

MsC. Bladimir A. Díaz Martín

2011 “Año 53 de la Revolución”

_____________________________________________________________________________Pensamiento

i

La Naturaleza inspira, cura, consuela,

Fortalece y prepara para la amistad al hombre

José Martí

______________________________________________________________________________Dedicatoria

ii

A Dios y a toda mi familia.

Mis padres: Domingo Raymundo y Feliciana Pérez.

A mis hermanos: Pedro, Salomón, Juan, Roberto, Alfonso, Juana, Martha y a dos

fallecidos que los quiero con todo mi corazón: Jorge y Domingo.

__________________________________________________________________________Agradecimientos

iii

A mis padres y hermanos que se sacrificaron y confiaron en mí para seguir mis

estudios, mil gracias por su ayuda incondicional.

A mis tutores Dr C. Roldán Torres Gutiérrez y MsC. Bladimir Díaz Martín por sus

apoyos y los valiosos conocimientos que me han transmitido.

A Rene Cupull Santana que me ayudó en todo lo que fue necesario realizar en el

laboratorio de microbiología.

A los trabajadores de la casa de cultivos del IBP y los del CIAP en ayudarme

hacer los análisis de suelo, proteína etc.

A todos los amigos en general especialmente a Cándido Reyes Argueta, Blasa y

Flores y a los hermanos españoles que de una forma u otra me han brindado la

mano para que este proyecto terminara satisfactoriamente.

Al claustro de profesores de la carrera de Agronomía y de posgrado que durante

todos estos años de mi estancia en Cuba me transmitieron sus enseñanzas.

A la Revolución Cubana a la Universidad Central “Marta Abreu” de las Villas y en

especial a la Facultad de Ciencias Agropecuarias, por darme la oportunidad de

seguir mis estudios.

A todos gracias

________________________________________________________________________________Resumen

Influencia de aislados bacterianos endófitos sobre el desarrollo del cultivo del sorgo (Sorghum biocolor) iv

RESUMEN

El presente trabajo tuvo como objetivo determinar el efecto de aislados

bacterianos endófitos sobre el desarrollo del cultivo del sorgo (Sorghum bicolor (L.)

Moench) var. UDG 110 en condiciones controladas, así como dilucidar algunos de

sus posibles mecanismos de acción para la estimulación. Se aplicaron técnicas

microbiológicas para el aislamiento en diferentes fases fenológicas del cultivo, los

cuales fueron caracterizados morfológicamente teniendo en cuenta su crecimiento,

color, mucosidad, bordes, elevación y respuesta de las células bacterianas a la

tinción de Gram de las colonias. La producción de auxinas (acido indol-3-acético,

AIA) se determinó por el método de Salkowski el cual es un mecanismos de

acción de las rizobacterias para la estimulación del crecimiento de los cultivos.

Mediante un experimento en condiciones controladas se pudo dilucidar el efecto

de los aislados sobre parámetros de crecimiento del cultivo, la biomasa y el

contenido de nitrógeno (N) total de las plantas. Los resultados demostraron la

efectividad de las técnicas empleadas para el aislamiento y caracterización de los

endófitos y se obtuvieron 37 diferentes aislados de las fases fenológicas

evaluadas. La obtención de varios aislados productores de AIA resultó de gran

importancia para determinar el mecanismo de estimulación de los mismos; se

destacó la cepa 22 como la más prominente en este parámetro. Los resultados en

condiciones controladas evidenciaron la capacidad de varios endófitos de

estimular significativamente el masa fresca y seca del follaje y la raíz, así como el

largo de la raíz y el contenido de N total de las plantas, se destacaron los aislados

5, 8 (aislados a los 7 días), 22 (aislado a los 60 días) y el 36 (aislado de las

semillas). Estos resultados demuestran la efectividad de la aplicación de

microorganismos endofíticos para lograr incrementos en los parámetros de

crecimiento de este importante grano, así como para la ulterior producción de

inoculantes a base de cepas nativas eficientes.

_________________________________________________________________________________Abstract

Influencia de aislados bacterianos endófitos sobre el desarrollo del cultivo del sorgo (Sorghum biocolor) v

ABSTRACT

This study aims to determine the effect of endophytic bacterial isolates on the

development of sorghum (Sorghum bicolor (L.) Moench) var. UDG 110 in

controlled conditions, besides to elucidate some possible action mechanisms for

the stimulation. Microbiological techniques were used for isolation in different

phenological phases of the cultivation, which were morphologically characterized

considering their growth, color, mucus, borders, elevation and the Gram stain of

the colonies. The auxin (indole-3-acetic acid, IAA) production was studied by

Salkowski method, which is an action mechanism of the rhizobacteria for the crop

stimulation. By an experiment in controlled conditions could elucidate the effect of

isolates on crop growth parameters, plant biomass and total nitrogen (N) content in

plants. The results demonstrated the effectiveness of the techniques used for the

isolation and characterization of endophytes, obtaining 37 different isolates on the

phenological stages evaluated. The obtaining of several isolates producing IAA

was very significant to determine their stimulation mechanism, whereas the isolate

22 was the most prominent in this parameter. The results in controlled conditions

showed the ability of several endophytes to stimulate significantly the fresh and dry

shoot and roots weight, the root length and total N content of plants, resulting the

most relevant the isolates the 5, 8 (isolated at 7 days), 22 (isolated at 60 days) and

36 (isolated from the seeds). These results demonstrate the effectiveness of the

implementation of endophytic microorganisms to achieve increases in growth

parameters of this important grain and for the further production of inoculants

based on efficient native strains.

___________________________________________________________________________________Índice

Influencia de aislados bacterianos endófitos sobre el desarrollo del cultivo del sorgo (Sorghum biocolor) vi

Páginas

Pensamiento………………………………………………………………………………….. i

Dedicatoria……………………………………………………………………………………... ii

Agradecimientos…………………………………………………………………………….... iii

Resumen………………………………………………………………………………………... iv

Abstract……………………………………………………………………………………….... v

Índice……………………………………………………………………………………………. vi

1 INTRODUCCIÓN………………..…………………………………………………..….……. 1

HIPÓTESIS………………………..………………………………………………………….. 3

OBJETIVOS……………………….……………….…………………………………………. 3 Objetivo general……………...…………………….……….……………………………...… 3

Objetivos específicos…………………………………….….…………………….……...….. 3

2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA……………………………….…...…………….….…...…… 4 2.1 El cultivo del sorgo…………………………………………………………………...… 4

2.1.1 Descripción de la variedad UDG-110………………………….……………… 5

2.2 Aspectos nutricionales y fitotécnicos del cultivo……………………..……………… 7

2.3 Interacciones de microorganismos con la planta hospedera …..………………… 8

2.4 Microorganismos endófitos y rizosféricos……………………...……………………. 8

2.4.1 Métodos actuales para el estudio de los endófitos…………………………. 10

2.4.2 Vías de entrada de endófitos en la planta y su localización……………… 10

2.4.3 Nivel de población de endófitos dentro de la planta………………………. 13

2.5 Habilidad para colonizar la planta hospedera y especificidad de los endófitos… 14

2.6 Estimulación del desarrollo de las plantas mediante bacterias endófitas……… 15

2.6.1 Bacterias filosféricas…………………………………………………...………. 16

2.6.2 Bacterias rizosféricas………………………………………………...………… 17

2.7 Inoculación de endófitos en plantas…………………………………….…………… 18

2.8 Colonización de plantas vs fertilización……………………………………………… 19

3 MATERIALES Y MÉTODOS.…………….………………………………...……………… 20 3.1 Características del suelo para el aislamiento de bacterias endófitas y toma de muestras………………………………………………………………….…………………..

20

___________________________________________________________________________________Índice

Influencia de aislados bacterianos endófitos sobre el desarrollo del cultivo del sorgo (Sorghum biocolor) vii

3.2. Obtención de aislados endófitos y parámetros morfológicos de las colonias…... 21

Procedimientos para la obtención de aislados endofíticos…………..…….…..…. 21

3.3 Determinación de la producción de auxinas (ácido indol-3-acético) por los aislados……………………………………………………………………………………….

22

3.4 Efecto de los aislados bacterianos sobre parámetros de crecimiento y biomasa del cultivo de sorgo en condiciones controladas…………………………………………

23

Preparación del inóculo, inoculación y montaje del experimento……………...… 24

Condiciones de crecimiento y evaluaciones………………………………………... 24

Análisis estadístico……………………………………….………………………….. 26

4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN..………….………………………………………………… 27 4.1 Características del suelo para el aislamiento de bacterias endófitas toma de muestras…….……………………………………..…………………………………………

27

4.2 Obtención de aislados endófitos y parámetros morfológicos de las colonias….………………………………………..…………………………………..………

27

4.2.1 Aislados bacterianos endófitos por grupos de procedencia………..……. 29

4.3 Determinación de la producción de auxinas (ácido indol-3-acetco) por los aislados……………………………………………………………………………………….

31

4.4 Efecto de endófitos bacterianos sobre la brotación, parámetros de crecimiento y biomasa de plantas de sorgo en condiciones controladas….………………………..…

32

4.4.1 Influencia de aislados endófitos sobre la brotación de plántulas de sorgo………………………………………………………………………………..……

32

4.4.2 Influencia de aislados endófitos sobre el crecimiento y biomasa de plántulas de sorgo ……………………………………………………………….……

34

4.4.3 Correlaciones de los parámetros de crecimiento, biomasa y producción de AIA…………….…………………………………………………..…………….……

39

4.5 Fijación de nitrógeno en plantas de sorgo………….……………..……….……… 41

5 CONCLUSIONES…………………………………………………………………….…….... 43

6 RECOMENDACIONES..….………………………………………………………….……... 44

7 BIBLIOGRAFÍA

__________________________________________________________Hipótesis y Objetivos

Influencia de aislados bacterianos endófitos sobre el desarrollo del cultivo del sorgo (Sorghum biocolor) 1

1 INTRODUCCIÓN

El sorgo (Sorghum bicolor (L.) Moench) es el quinto cereal de importancia en el

mundo después del trigo, el maíz, el arroz y la cebada (FAO, 2008). A nivel de

planeta más del 35% del sorgo es cultivado para el consumo humano, el resto se

utiliza principalmente para la alimentación animal, producción de alcohol y

productos industriales (FAO, 1995; Awika y Rooney, 2004). Se cultivan más de 40

millones de hectáreas, sobre todo, en China, India, Brasil y África.

Este cultivo tiene a escala mundial gran importancia en la actualidad, pues está

comprobado que puede sustituir a cereales como el trigo y el maíz en la mayoría

de los usos que estos presentan, tanto en la alimentación humana, como en la

producción de forrajes o granos para la ceba de animales y por su diverso uso

industrial. A su vez posee un alto potencial de producción de granos y buenas

perspectivas de contribución al desarrollo de la agricultura.

En Cuba a pesar de que no existe tradición de cultivo de este cereal se han dado

pasos importantes en la extensión del mismo en el país ya que constituye una

alternativa viable y factible. La necesidad de reducir importaciones, debido a los

altos precios del trigo y otros cereales a nivel internacional, ocasionado en buena

medida por las dificultades para su adquisición a su vez motivadas por el férreo

bloqueo impuesto a Cuba por EE.UU., recomiendan el sorgo para la producción de

granos destinados a la elaboración de productos para la alimentación humana.

Por otro lado, el desarrollo que es necesario alcanzar en la cría de aves y cerdos

para garantizar los planes alimentarios del país está motivando a los productores a

la siembra de sorgo y otros granos para producir alimento para los animales de

cría. Además de lo anterior, la intensa sequía y las altas temperaturas presentes

en Cuba en los últimos años, asociados según expertos a un cambio climático

global, han constituido dos de los factores que mayores daños han provocado en

muchos cultivos, resultando ser el sorgo más tolerante que otros cereales a dichas

condiciones, cuestión que apoya la conveniencia de su cultivo extensivo.

La variedad de sorgo UDG-110 de grano beige, es un cereal obtenido y

seleccionado por el grupo de Mejoramiento Genético y Producción de Semillas de



la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, a partir de su introducción en el

país procedente de la Facultad de Agronomía de la Universidad de Guadalajara,

México, a finales de 1990. Actualmente esta variedad se encuentra extendida en

12 de las 14 provincias del país y se utiliza para la alimentación humana y animal,

además de ser utilizado su grano y como forraje (Saucedo et al., 2005).

La disponibilidad de nutrientes para el cultivo depende de distintos factores, entre

los que se incluyen los tipos de suelos, la rotación, el cultivo antecesor, los

sistemas de labranza y las condiciones ambientales. En Cuba en la actualidad no

existe disponibilidad de fertilizante químico para este cultivo y se hace necesario el

desarrollo del mismo bajo condiciones de sostenibilidad con muy bajos insumos.

Las bacterias endófitas, o sea, aquellas que viven dentro de los tejidos de la planta

sin causarle daños a la misma pudieran representar una alternativa ante la

carencia de fertilizantes químicos en este cultivo, ya que los estos ejercen un

marcado efecto sobre el crecimiento y desarrollo de las plantas y a las vez para

aumentar los rendimientos de los cultivos, eliminar contaminantes, inhibir

patógenos, fijar nitrógeno y producir substancias que estimulen el desarrollo

vegetal (Dobbelaere, 2002).La diversidad de efectos y funciones que estas

bacterias pueden causar en las plantas ha sido ampliamente estudiada, sin

embargo, en nuestro país no se han llevado a cabo investigaciones enfocadas a la

utilización de endófitos en el cultivo del sorgo, ni tampoco sobre el modo de acción

por el cual establecen la estimulación. El desafío y la meta es poder manejar las

comunidades microbianas para favorecer la colonización de la planta por las

bacterias beneficiosas. Las contribuciones en este campo de la investigación

pueden tener notables impactos económicos y medioambientales.

Teniendo en cuenta la importancia de este cultivo para las condiciones cubanas y

en especial para la región central, por ser diseminadores de este grano a nivel

nacional, así como por la necesidad de contar con alternativas para lograr una

adecuada nutrición y protección de las plantas basadas en técnicas sostenibles,

nos planteamos la siguiente hipótesis y objetivos en nuestra investigación:



HIPÓTESIS

El aislamiento y la aplicación selectiva de bacterias endófitas asociadas al cultivo

del sorgo pueden provocar aumentos en el desarrollo vegetativo del cultivo en sus

primeras etapas fenológicas, lo cual puede estar asociado al incremento del

rendimiento y la producción sostenible de este grano.

OBJETIVOS

Objetivo general:

Determinar el efecto de aislados bacterianos endófitos sobre el desarrollo del

cultivo del sorgo en condiciones controladas, además de dilucidar algunos de sus

posibles mecanismos de acción.

Objetivos específicos:

1 Aislar y caracterizar morfológicamente bacterias endófitas asociadas a las

semillas y raíces del cultivo del sorgo var. UDG-110 en diferentes etapas

fenológicas del mismo.

2 Determinar la capacidad de producción de acido indol-3-acético (AIA) de los

aislados bacterianos.

3 Determinar el efecto de diferentes aislados sobre parámetros de

crecimiento y biomasa del cultivo del sorgo en condiciones controladas.

__________________________________________________________Revisión Bibliográfica


2 REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

2.1 El cultivo del sorgo

El sorgo (Sorghum bicolor (L.) Moench) es un cereal cuyos granos han sido

utilizados por el hombre durante siglos a partir de los tiempos primitivos, primero

como alimento y posteriormente en diversas formas. En la actualidad este grano

constituye el cuarto cereal en importancia en el mundo después del trigo, el arroz y

el maíz (Martin, 2002; FAO, 2001). A nivel de planeta más del 35% del sorgo es

cultivado para el consumo humano, el resto se utiliza principalmente para la

alimentación animal, producción de alcohol y productos industriales (FAO, 2000

Awika y Rooney, 2004). Se cultivan más de 40 millones de hectáreas, sobre todo,

en China, India, Brasil y África.

Este cultivo tiene a escala mundial gran importancia en la actualidad, pues está

comprobado que puede sustituir a cereales como el trigo y el maíz en la mayoría

de los usos que los mismos presentan, tanto en la alimentación humana, como en

la producción de forrajes o granos para la ceba de animales y por su diverso uso

industrial (FAO, 2000). A su vez posee un alto potencial de producción de granos

y buenas perspectivas de contribución al desarrollo de la agricultura.

El sorgo se conoce bajo varios nombres: sorgo, mijo grande, adaza, maíz de

Guinea, kafir, dura, zahina, mtama, iowar, shallu, alcandia, kaoliang, milo, milo-

maíz, panizo moruno, teterita, sorgo de escoba, maicillo, masambara, aroza mijo

grande y maíz de Guinea en África occidental, Kafir en África austral, duró en el

Sudan, Mtama en África oriental, Iowar en la India y Kaoliang en China (FAO,

1995). En los Estados Unidos se suele denominar milo o milo maíz. El género

Sorghum se caracteriza por espiguillas que nacen en pares. Esta especie se trata

como planta anual, aunque es hierba perenne y en los trópicos puede cosecharse

varias veces al año.

En Cuba a pesar de que no existe tradición de cultivo de este cereal se han dado

pasos importantes en la extensión del mismo en el país ya que constituye una

alternativa viable y factible (Saucedo et al., 2005). La necesidad de reducir



importaciones, debido a los altos precios del trigo y otros cereales a nivel

internacional, ocasionado en buena medida por las dificultades para su adquisición

a su vez motivadas por el férreo bloqueo impuesto a Cuba por EE.UU.,

recomiendan el sorgo para la producción de granos destinados a la elaboración de

productos para la alimentación humana. Por otro lado, el desarrollo que es

necesario alcanzar en la cría de aves y cerdos para garantizar los planes

alimentarios del país está motivando a los productores a la siembra de sorgo y

otros granos para producir alimento para los animales de cría (Pons, 2005).

Además de lo anterior, la intensa sequía y las altas temperaturas presentes en

Cuba en los últimos años, asociados según expertos a un cambio climático global,

han constituido dos de los factores que mayores daños han provocado en muchos

cultivos, resultando ser el sorgo más tolerante que otros cereales a dichas

condiciones, cuestión que apoya la conveniencia de su cultivo extensivo (Cargil,

2005).

2.1.1 Descripción de la variedad UDG-110

La Facultad de Agronomía de la Universidad de Guadalajara, México, liberó en el

año 1989 la variedad UDG-110 de polinización libre, la cual fue introducida y

seleccionada en la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas a finales de

1990.

Figura 4.1 Imágenes de diversificación de variedades de sorgo, incluida la variedad UDG-

110.

El periodo comprendido entre la siembra y germinación varía de 3 a 5 días. A

partir de la misma y hasta la diferenciación floral transcurren de 35 a 45 días, en

esta etapa la planta tiene una altura de 45 a 55 cm. Posteriormente a los 25 a 30



días se observa el embuchamiento (estado de buche), el cual ocurre cuando la

planta tiene de 95 a 120 cm, presentando el número total de nudos (Saucedo et al.

2005). Según este autor, el tiempo transcurrido entre el estado de buche y el inicio

de la emergencia de la panícula es de 7 a 8 días.

La floración o antesis es de 6 a 8 días. En ésta fenofase la planta alcanza su

máxima área foliar y su altura fluctúa entre 122 y 142 cm (Saucedo et al. 2005). En

la estación de seca, posteriormente de 18 a 20 días el grano presenta el estado

lechoso y la planta presenta su porte total. El grano pasa de estado lechoso a

estado mazoso a los 10 a 12 días y posteriormente de 13 a 15 días aparece el hilo

o capa negra indicadora de que la planta alcanzó la madurez fisiológica. Sin

embargo, la madurez total (comercial) se alcanza cuando el grano contiene de 16

a 18% de humedad, lo cual ocurre entre 114 a 138 días a partir de la germinación

en dependencia de la época de siembra. Presenta ligera fotosensibilidad,

alargando su ciclo y longitud de la planta en siembras realizadas en el período

marzo–agosto.

Las plantas de la variedad UDG-110 se caracteriza porque su tallo alcanza una

longitud medida de la base de la planta a la base de la panícula de 95 a 140 cm.

en condiciones desfavorables y hasta 175 cm en ambientes idóneos en siembras

realizadas en el periodo septiembre-diciembre. En siembra desde marzo-agosto

alcanza una longitud del tallo de 150 a 200 cm. El tallo es poco fibroso de sabor

semi dulce durante el llenado del grano. El tallo presenta de 9 a12 nudos en el

periodo de siembra de septiembre a diciembre y de 14 a 17 nudos entre marzo y

agosto, se observa que el número de nudos se corresponde con el número de

hojas para las siembras realizadas. Su índice de área foliar (IAF) oscila de 4,11

en marcos de siembra de 0,90 x 0,10 m hasta 8,20 a distancias de 0,70 x 0,5 m

(Saucedo et al. 2005).

Las hojas son de color verde pálido en los primeros estadios después de la

fenofase de formación de la hoja bandera su color es más intenso alcanzando a

verdes tonalidades oscuras con presencia de alguna cera, se implantan con una

angulación aproximadamente de 45º, presentando de un 30 a 35% de ondulación



marginal en el tercio superior de la planta y su nervadura central es blanca.

Además se observa presencia de cera en las vainas de las hojas. Posee

resistencia a la senescencia aun después de ser cosechada la panícula. La última

hoja denominada bandera es más corta, semi erecta y ondulada. La panícula es

semi compacta con un grosor de 6 a 10 cm y de largo mide de 26 a 31 cm la

excursión de la panícula mide de 12 cm. Cuando se cosecha muy pasado de

madurez el aspecto de la panícula es abierto. Las semillas son redondas, lisas y

de color beige en el pericarpio, en tanto que el endospermo es semi cristalino y

blanco, el número de granos por panícula varia de 1290 a 2000, la masa de 1000

granos al 14% de humedad es de 34 a 37 gramos. El peso de los granos de una

panícula varía en un rango de 44 a 110 gramos.

2.2 Aspectos nutricionales y fitotécnicos del cultivo

El grano de la variedad UDG-110 es de buena calidad, contiene de 9,56 a 9,64%

de proteína, con un contenido de taninos de 0,25 a 0,35%, el cual se presenta en

bajos valores y la cantidad de polifenoles es inferior a 0,004 mg/g de muestra. Los

aminoácidos esenciales lisina y triptófano se encuentran deficientes en el grano.

Esta variedad presenta en algunos casos ahijamientos, donde se observan entre 1

a 3 hijos basales, los cuales son de menor longitud que la planta madre en

condiciones de cultivos normales. En algunas ocasiones emite hijos axilares

(aéreos). Posee un sistema radical fibroso y profundo y a pesar de que la altura de

la planta es de intermedio a alto en dependencia de la época de siembra, presenta

resistencia al acame. La capacidad de rebrote se evalúa de buena, emitiendo de 2

a 3 tallos después de ser cortados basalmente. Su rendimiento en el segundo

corte es de 50 a 60% de lo obtenido en grano en la primera cosecha. En el

segundo corte el ciclo se acorta respecto al anterior, independientemente de

época en que se siembre. El aspecto general de la planta en siembra de marzo

hasta septiembre es muy semejante a la de maíz y puede dar de 20 a 55 t ha-1 de

masa verde. El rango de adaptación agroclimático de esta variedad es amplio,

comportándose adecuadamente en localidades situadas en alturas inferiores a

1600 m. sobre el nivel del mar (Saucedo et al. 2005). En condiciones de secano o



con tres riegos de auxilio, la variedad UDG-110 tiene un rendimiento similar al de

híbridos comerciales empleados como testigos y en muchos casos supera a los

mismos, su rendimiento en condiciones experimentales es de 11,1 a 12,2 t ha-1.

En siembras semi comerciales su rendimiento varía de 3 a 5 t ha-1 (Saucedo et al.,

2005).

La variedad UDG-110 se ha sembrado sobre suelos pardos con diferenciación de

carbonatos, suelos de transición con fuerte influencia de aluviales, suelos

ferralíticos rojos, arenosos y vertisuelos, obteniéndose resultados sobresalientes a

nivel experimental y a escala semi comercial.

Esta variedad al igual que la generalidad de los cultivares e híbridos de sorgo no

es exigente a las condiciones de suelo, por ello, puede cultivarse en la mayoría de

estos, solo requiere aceptable drenaje, pues esta especie no tolera el

sobrehumedecimiento prolongado, soporta ciertas cantidades de sales solubles en

el suelo que limitan el desarrollo de otros cultivos.

2.3 Interacciones de los microorganismos con la planta hospedera

Las plantas constituyen nichos amplios y diversos para los organismos endófitos.

Se han aislado endófitos bacterianos Gram positivos y negativos de varios tipos de

tejidos en numerosas especies de plantas. Además, se han aislado varias

especies bacterianas diferentes de una sola planta (Kobayashi y Palumbo, 2000;

Sturz et al. 2000).

Son muchas las plantas documentadas como hospedantes de endófitos, aunque

no existe una sola especie de planta probablemente desprovista de endófitos. Los

pocos ejemplos de aparente ausencia de poblaciones internas pueden ser porque

algunos microorganismos no se aíslan o cultivan fácilmente.

2.4 Microorganismos endófitos y rizosféricos

La palabra endófito en inglés “endophyte” se deriva del griego “endon” (dentro) y

“phyte” (planta). Las bacterias endofíticas son bacterias que viven en los tejidos de

las plantas sin hacer daño substantivo u otro beneficio que no sea su residencia



(Kado et al. 1992; Kobayashi y Palumbo. 2000). Los endófitos bacterianos pueden

ser aislados de los tejidos de la planta desinfectados superficialmente o pueden

extraerse del tejido interno de la planta (Hallmann et al. 1997). El criterio para

reconocer una “verdadera” bacteria endófita ha sido publicado por Reinhold-Hurek

y Hurek (1998a) y esto no sólo requiere del aislamiento de los tejidos

superficialmente desinfectados sino también la evidencia microscópica para

visualizar las bacterias dentro de los tejidos de la planta. El último criterio no

siempre se cumple. El uso del término endófitos putativos se ha recomendado

para aquéllos no validados microscópicamente. Los verdaderos endófitos también

pueden ser reconocidos por su capacidad de reinfectar plántulas desinfectadas.

Las bacterias endofíticas se encuentran en las raíces, tallos, hojas, semillas,

frutas, tubérculos y también dentro de los nódulos de las leguminosas (Benhizia et

al. 2004; Hallmann et al. 1997; Sturz et al. 1997). En la mayoría de las plantas, las

raíces tienen los números más altos de endófitos comparado con los tejidos sobre

el suelo (Rosenblueth y Martínez-Romero, 2004).

Las bacterias en las raíces y en la rizosfera se benefician de los exudados de la

raíz, pero algunas bacterias y hongos son capaces de entrar en la planta como

endófitos que no causan daños y podrían establecer una asociación mutualista

(Azevedo et al. 2000).

Germida et al. (1998) encontraron que la población de endófitos fue menos diversa

que la población de la superficie de la raíz y los endófitos parecían originarse de

esta última.

Parece que las bacterias mejor adaptadas para vivir dentro de las plantas son

seleccionadas naturalmente. Los endófitos son tomados de una concentración

grande de suelo o especies rizosféricas y replicados (Martínez-Romero. 2003).

No ha estado determinado si las plantas se benefician más de una bacteria

endófita que de una rizosférica o si es más ventajoso para las bacterias volverse

endófitas comparadas con las rizosfericas. Todavía no está claro qué población de

microorganismos (endófitos o bacterias rizosféricas) promueven el crecimiento de



la planta; no obstante, se reconocen bien los beneficios conferidos por los

endófitos (Martínez-Romero, 2003)

Las poblaciones de endófitos así como las poblaciones rizosféricas, están

condicionadas por factores bióticos y abióticos (Fuentes Ramírez et al. 1999;

Hallmann et al. 1997, 1999; Seghers et al. 2004), pero las bacterias endófitas

podrían protegerse mejor del estrés bióticos y abióticos que las bacterias

rizosféricas (Hallmann et al. 1997).

2.4.1 Métodos actuales para el estudio de los endófitos

Las bacterias endófitas han sido estudiadas fundamentalmente después de

cultivarlas en medios de cultivo en el laboratorio, pero un esquema más completo

está surgiendo, usando métodos que no exigen cultivar las bacterias y que hace

uso del análisis de secuencias de genes bacterianos obtenidos de CADN aislados

de los tejidos interiores de la planta (Chelius y Triplett 2000a; Engelhard et al.

2000; Miyamoto et al. 2004; Reiter et al. 2003; Sessitsch et al. 2002b). Un estudio

molecular de los endófitos de trigo (Triptucum eastivum) en Australia reveló una

diversidad más grande de actinobacterias que la obtenida por el cultivo de

endófitos (Conn y Franco, 2004).

Evidencia de que existen bacterias endófitas que no han sido todavía cultivadas

provienen del estudio de los endófitos de cítrico (Citrus) por electroforesis de 16S

de fragmentos de genes de rRNA amplificados del CADN total de la planta.

Algunas bandas no coincidieron con ninguno de los aislados de bacterias crecidos

en los medios de cultivos (Araujo et al. 2002). En contraste, ninguna diferencia se

obtuvo cultivando o por métodos culturales independientes y los dos revelaron

bacterias similares al género Pseudomonas y Rahnella en Noruega en semillas de

abetos (Cankar et al. 2005).

2.4.2 Vías de entrada de endófitos en la planta y su localización

Los endófitos entran en el tejido de la planta principalmente a través de la zona de

la raíz; sin embargo, porciones aéreas de la planta, como las flores, los tallos, y los



cotiledones, pueden ser también utilizados para su entrada (Kobayashi y Palumbo.

2000). Específicamente, las bacterias entran en los tejidos vía radículas brotadas

(Gagne et al. 1987), las raíces secundarias (Agarwal y Shende, 1987), estomas

(Roos y Hattingh, 1983), o como resultado de un daño foliar Leben et al. (1968).

Los endófitos dentro de una planta pueden localizarse en el punto de entrada o

pueden propagarse a lo largo de la planta (Hallmann et al. 1997). Estos

microorganismos pueden residir dentro de las células (Jacobs et al. 1985), en los

espacios intercelulares, o en el sistema vascular Bell et al. (1995).

Los espacios intercelulares y los vasos del xilema son las localizaciones más

comúnmente referidas para las bacterias endofíticas (Reinhold-Hurek y Hurek

1998a; Sprent y James 1995). Se ha referido una cepa de Burkholderia sp. en los

vasos del xilema y en las cámaras subestomáticas en las plantas de Vitis vinifera

(Compant et al. 2005). Por habitar nichos similares a los patógenos vasculares, los

endófitos pueden utilizarse como bacterias competidoras para el control de

enfermedades (Hallmann et al. 1997).

Para colonizar la planta, algunas bacterias deben encontrar su modo de hacerlo a

través de grietas formadas por la emergencia de raíces laterales o en la zona de

alargamiento y diferenciación de la raíz. Dong y otros (2003) mostraron que las

células de Klebsiella sp cepa Kp342 se agregan a las uniones de las raíces

laterales del trigo (Triptucum eastivum) y la alfalfa (Medicago sativa). De forma

similar, Gluconacetobacter diazotrophicus y Herbaspirillum seropedicae también

colonizan las uniones de las raíces laterales en gran número (James y Olivares,

1997).

La posible infección y los sitios de colonización han sido ilustrados por Reinhold-

Hurek y Hurek (1998b). Se ha propuesto que las enzimas celulolíticas y

pectinolíticas producidas por los endófitos están involucradas en el proceso de

infección (Hallmann et al. 1997), como en las cepas de Klebsiella, la pectato-lyasa

ha sido involucrada de participar durante la colonización de la planta (Kovtunovych

et al. 1999). En la pared celular parecen ser requeridas las enzimas degradantes



endogluconasa y polygalacturonasa necesarias para la infección de Vitis vinifera

por Burkholderia sp. (Compant et al. 2005).

En algunos ensayos, la colonización endofítica temprana difirió de un cultivar a

otro, pero más tarde se recuperaron los endófitos aproximadamente en números

similares en cultivares diferentes (Pillay y Nowak, 1997). Por otro lado, la

colonización fúngica podría afectar la colonización por las bacterias endofíticas

(Araujo et al. 2001) o viceversa.

Se ha encontrado variación de cepa a cepa en las capacidades de colonización

entre cepas de Rhizobium etli (Rosenblueth y Martínez-Romero, 2004), y éstas

pueden relacionarse con diferencias en el contenido genómico. En general, los

aislados endófitos fueron capaces de la colonización o recolonización de los

tejidos internos de la planta en números más altos que los aislados de la superficie

de la raíz (van Peer et al. 1990; Rosenblueth y Martínez-Romero, 2004).

Después de un día de exposición de ciertas raíces de la planta a las bacterias,

ellas pueden encontrarse en las partes aéreas de la planta. Guo et al. (2002)

inocularon las raíces de plantas de tomate (Lycopercicum esculentum.) cultivadas

hidropónicamente con 4.55 log UFC-1 ml-1 de Salmonellae y al día siguiente

encontraron que los hipocotilos, los cotiledones, y los tallos tuvieron alrededor de 3

log g-1 de UFC. La sistemática propagación de una cepa de Burkholderia endófita

a las partes aéreas de Vitis vinifera parece ser a través del flujo de transpiración

(Compant et al. 2005).

Los endófitos también pueden jugar un papel activo en la colonización. Azoarcus

sp. tipo IV pili está involucrado en la adhesión a la superficie de la planta, un paso

esencial hacia la colonización endófita (Dörr et al. 1998). Dos cepas de Klebsiella

difieren significativamente en su capacidad de invasión en diferentes plantas

hospedantes (Medicago sativa, Medicago truncatula, Arabidopsis thaliana, Triticum

aestivum, y Oryza sativa). Una de ellas (Kp342) fue un buen colonizador en todos

los hospedantes y sólo necesitó una sola célula para colonizar las plantas

substancialmente unos días después de la inoculación (Dong et al. 2003). Las

plantas hospedantes también difirieron en su habilidad para ser colonizadas



endófitamente por la misma bacteria, lo cual sugiere un activo papel del

hospedante en el proceso de colonización.

Algunas bacterias rizosféricas pueden colonizar el interior de raíces y tallos,

mostrando que estas bacterias son una fuente de endófitos (Germaine et al.

2004), pero también las bacterias de la filosfera pueden ser una fuente de

endófitos (Hallmann et al. 1997).

2.4.3 Nivel de población de endófitos dentro de la planta

Se han informado variaciones significativas en las poblaciones de endófitos

nativos e introducidos. Estas variaciones se atribuyen al origen de la planta, la

edad de la planta, el tipo de tejido, tiempo de muestreo, y el ambiente.

Generalmente, las poblaciones bacterianas son más grandes en las raíces y

disminuyen en los tallos y hojas (Lamb et al., 1996).

En general las bacterias endófitas están a más bajas densidades de población que

las bacterias rizosféricas o patógenos bacterianos (Hallmann et al. 1997;

Rosenblueth y Martínez-Romero, 2004).

Las concentraciones naturales de endófitos pueden variar entre 2.0 y 6.0 log10

UFC g-1 para la alfalfa (Medicago sativa), maíz (Zea mays), remolacha (Beta

vulgaris), calabaza (Cucurbita pepo), algodón (Gossypium hirsutum) y papa

(Solanum tuberosum), según lo descrito por Kobayashi y Palumbo (2000).

Resultados similares se obtuvieron para bacterias endófitas inoculadas a la raíz o

impregnando la semilla con niveles de población que alcanzan entre 3.0 y 5.0 log10

UFC/g de tejido de la planta para el tomate y la papa. Los niveles de colonización

por endófitos no patogénicos tienden a ser mucho menores que los niveles de

colonización por bacterias patogénicas; las concentraciones de estos últimos

organismos van desde 7.0 a 10.0 log10 UFC/g (peso fresco) de tejido en las

plantas infectadas susceptibles (Grimault y Prior. 1994; Tsiantos y Stevens. 1986).

Muchas semillas llevan consigo una diversidad de endófitos (Coombs y Franco

2003b; Hallmann et al. 1997). Así los endófitos aseguran su presencia en las

nuevas plantas al germinar las semillas. Las plantas que se propagan



vegetativamente (como Solanum tuberosum y Saccharum officinarum) pueden

transmitir sus endófitos a la próxima generación y no requeriría el proceso de

infección. Algunos patógenos también se encuentran dentro de las semillas (Berg

et al. 2005b; Schaad et al. 1995).

2.5 Habilidad para colonizar la planta hospedera y especificidad de los endófitos

Experimentos de competitividad con endófitos han mostrado que algunos son

colonizadores más agresivos y desplazan a otros. Esto se observó con Pantoea sp

compitiendo con Ochrobactrum sp. en arroz (Verma et al. 2004) y con diferentes

cepas de Rhizobium etli en el maíz (Rosenblueth y Martínez-Romero, 2004). Sin

embargo, cuando el rango de hospedante de una gran diversidad de endófitos fue

analizado, al parecer fue observada una falta de especificidad estricta (Zinniel et

al. 2002).

En la rizosfera hay una selección de los microorganismos que pueden sobrevivir

en los exudados de la raíz y competir con otros. Rosenblueth y Martínez-Romero

(2004) encontraron cepas que eran igualmente competitivas para colonizar la

rizosfera y dentro de los tejidos de la raíz.

La presencia de diferentes especies endófitas en soja (Glycine max) dependió del

genotipo de la planta, la edad de la planta, del tejido muestreado, y también de la

época de aislamiento (Kuklinsky-Sobral et al. 2004). El tipo de suelo determinó en

gran magnitud la población de endófitos en el trigo (Conn y Franco, 2004).

Se observaron correlaciones en la promoción del crecimiento de plantas de tomate

(Lycopercicum esculentum.) con niveles de inóculo que promovieron las

poblaciones de endófitos pero no las poblaciones rizosféricas (Pillay y Nowak

1997). Por otro lado, el género Azospirillum, una de las bacterias promotoras del

crecimiento mejor caracterizadas, ejerce sus beneficios principalmente en la

rizosfera (Somers et al. 2004) y raramente coloniza los tejidos corticales internos

de la planta (Schloter y Hartmann 1998; Weber et al. 1999).



La densidad de la población de endófitos es muy inconstante, dependiendo

principalmente de las especies bacterianas y del genotipo del hospedante pero

también de la fase de desarrollo del hospedante, la densidad del inóculo, y las

condiciones medioambientales (Pillay y Nowak 1997; Tan et al. 2003). Algunos

endófitos son muy escasos o ausentes en el suelo (Reinhold-Hurek y Hurek

1998a).

2.6 Estimulación del desarrollo de las plantas mediante bacterias endófitas

Las bacterias endófitas fijadoras de N2 parecen constituir sólo una pequeña

proporción del total de bacterias endófitas (Barraquio et al. 1997; Ladha et al.

1983; Martínez et al. 2003), y el incremento de las poblaciones fijadoras de N2 en

las plantas ha sido considerado como una posibilidad de aumentar la fijación de

nitrógeno. Se identificaron bacterias fijadoras de nitrógeno en batata (Ipomea

batatas) en suelos pobres en nitrógeno con un análisis que consistió en amplificar

los genes (nifH) de la nitrogenasa por la reacción en cadena de la polimerasa

(Reiter et al. 2003). Las sucesiones resultantes, probablemente derivadas de los

endófitos, se parecieron a los del rhizobio, incluyendo Sinorhizobium meliloti,

Sinorhizobium sp. cepa NGR234, y Rhizobium etli. Otras bacterias detectadas

fueron Klebsiella spp. y Paenibacillus odorifer (Reiter et al. 2003). Es interesante

que, en este caso y quizás respecto a la metodología utilizada, se observó un

dominio de los rhizobios, considerado para alrededor del 50% de las secuencias

obtenidas. En los estudios dependientes de cultivos, parece que el rápido

crecimiento de γ-Proteobacteria fuera por encima de las que crecen lento α-

Proteobacteria como el rhizobio.

La estimulación del crecimiento por los microorganismos puede ser una

consecuencia de la fijación de nitrógeno (Hurek et al. 2002; Iniguez et al. 2004;

Sevilla et al. 2001) o la producción de fitohormonas, biocontrol de fitopatógenos en

la zona de la raíz (a través de la producción de agentes antifúngicos o

antibacterianos, la producción de sideróforos, la competencia por nutrientes e

inducción de resistencia sistémica adquirida por el hospedante, o inmunidad) o



mejorando la disponibilidad de minerales (Sessitsch et al. 2002a; Sturz et al.

2000).

La caña de azúcar (Saccharum officinarum) en Brasil ha sido cultivada durante

muchos años con cantidades pequeñas de fertilizante sin mostrar síntomas de

deficiencias de nitrógeno. Fuera de muchos fijadores de N2 endófitos aislados de

la caña de azúcar, no se ha definido claramente cual es responsable de la fijación

de N dentro de la planta. Sin embargo, existe controversia, en el nivel de N fijado

por los endófitos y la proporción contribuida a la planta (Giller y Merckx, 2003).

Estas estimaciones varían ampliamente en diferentes informes y van desde 30 a

80 kg N ha-1 año-1 (Boddey et al. 1995). Bajo condiciones óptimas, algunos

genotipos de plantas parecen obtener parte de sus requisitos de nitrógeno de la

propia fijación de este elemento.

El pasto Kallar (Leptochloa fusca) crece en las suelos pobres en nitrógeno en

Pakistán y una gran diversidad de Azoarcus spp. se han recuperado de él

(Reinhold-Hurek et al. 1993). Dentro del trigo, Klebsiella sp. cepa Kp342 fija N2

(Iniguez et al. 2004), y se ha reportado que aumenta el rendimiento de maíz (Zea

Mays) en el campo (Riggs et al. 2001). En este sentido, los endófitos fijadores de

nitrógeno parecen remediar las deficiencias de N de la batata en los suelos pobres

en N (Reiter et al. 2003).

Los pastos que crecen en las dunas de arena pobres en nutrientes contienen

miembros de los géneros Pseudomonas, Stenotrophomonas así como

Burkholderia. Parece que los endófitos de Burkholderia pudieran contribuir con

nitrógeno a los pastos, porque se detectó la nitrogenasa con anticuerpos en las

raíces dentro de las paredes celulares de la planta, los tallos y los rizomas (Dalton

et al. 2004).

2.6.1 Bacterias filosféricas

Varias bacterias fijadoras de N pueden colonizar la filosfera de las plantas, término

usado por algunos investigadores para referirse a la superficie adaxial y abaxial de

la hoja, y por otros a la hoja completa, incluyendo el ambiente interno (endófitos)



(Sundin y Jacobs, 1999). Se ha observado que las bacterias más abundantes en

las hojas son las pigmentadas (Methylobacterium spp.), a las cuales se les ha

atribuido una mejor adaptación a los rayos solares (Hirano y Upper, 2000). Las

especies de Beijerinckia son comúnmente encontradas en cultivos; y se ha

referido su efecto benéfico en el crecimiento de las plantas (Ching-Hong, 2001;

Lindow y Brandl, 2003). Sin embargo, no está clara la forma en que las plantas se

benefician y posiblemente se ha atribuido el beneficio a la absorción radical de

compuestos nitrogenados, los cuales una vez excretados por las bacterias en las

hojas, llegan a la raíz por lavado (Mayz-Figueroa, 2004).

2.6.2 Bacterias rizosféricas

Hiltner en 1904 observó por primera vez la acumulación de microorganismos en la

zona radical y propuso el término “rizosfera”. Los exudados radicales,

conformados por substancias diversas crean alrededor de las raíces (rizosfera) un

ambiente nutricional enriquecido que favorece el crecimiento bacteriano. Smith

(1976) y Martin y Kemp (1980) destacan la presencia de carbohidratos y

aminoácidos en exudados radicales y señalan que la composición y cantidad de

exudados varía con la especie de microorganismo presente y las condiciones

abióticas, especialmente agua y temperatura. La relación que se establece entre

las bacterias y las plantas puede ser favorable, perjudicial o neutra. Dentro de las

relaciones favorables se encuentra la asociación con bacterias fijadoras de N;

entre estas, especies de Azospirillum, Herbaspirillum, Gluconoacetobacter,

Burkholderia, Paenibacillus, entre otras (Estrada et al., 2001). Las bacterias

fijadoras de N pueden ser categorizadas dentro del grupo de las rizobacterias

promotoras del crecimiento (PGPR, por sus siglas en inglés), al ejercer un efecto

benéfico sobre el crecimiento de las plantas (Okon y Vaderleyden, 1997). Por

muchos años se consideró que el efecto benéfico de las bacterias fijadoras de

nitrógeno sólo provenía de la utilización por las plantas del amonio excretado; así

existen numerosas publicaciones que prueban tal efecto (Mirza et al., 2001;

Becker et al., 2002); sin embargo, se ha encontrado que estas bacterias también

producen fitohormonas (auxinas, giberelinas y citoquininas) que afectan



favorablemente el desarrollo de las plantas, particularmente de la raíz (Persello-

Cartieaux et al., 2003). Más recientemente se ha publicado que las bacterias

fijadoras de N incrementan la capacidad radical de absorción de nitrato,

indirectamente como una consecuencia de la estimulación del desarrollo radical y

directamente por estimulación del sistema transportador del compuesto (Mantelin

y Touraine, 2004).

4.7 Inoculación de endófitos en plantas

Para revelar los efectos de los endófitos, se han realizado experimentos de

inoculación, pero ha sido un problema eliminar los endófitos residentes o nativos

de las plantas para tener plantas o semillas libres de bacterias. La redundancia

funcional de endófito residente y el inóculo añadido puede limitar los efectos

observados de la inoculación. La interacción muy compleja de la comunidad

microbiana y la planta, la pobre competencia de la rizosfera con los

microorganismos endógenos (Sturz et al. 2000), y las fluctuaciones bacterianas

con las condiciones medioambientales también pueden limitar la aplicabilidad de la

inoculación del endófito en el campo (Sturz y Nowak, 2000). Además, en el

campo, la gran abundancia y diversidad de bacterias del suelo pueden ser una

fuente rica de endófitos, y por ello no pueden observarse bien los efectos de la

inoculación.

Desde que la desinfección de la superficie no elimina los endófitos, se han

ensayado procedimientos como calentar y secar las semillas para disminuir las

poblaciones bacterianas internas (Holland y Polacco, 1994). El cultivo de tejidos

también ha sido utilizado para eliminar o reducir los endófitos (Holland y Polacco,

1994; Leifert et al. 1994). Los inoculantes parecen ser exitosos en las plantas

micropropagadas, puesto que allí hay pocos o ningún otro microorganismo con el

cual competir. Podrían obtenerse enormes beneficios a través de la inoculación

con microorganismos en mezclas de menos suelo en el cual las plantas se

trasplantan en una fase temprana de su crecimiento. En estos casos, cuando las

plántulas fueron inoculadas, se mostraron más vigorosas y aumentaron su

resistencia a la sequía, a los patógenos, y disminuyeron el estrés al transplante, y



la mortalidad fue más baja (Barka et al. 2000; Martínez et al. 2003; Sahay y Varma

1999).

4.8 Colonización de la planta vs fertilización

Los cambios en la fisiología de la planta pueden llevar al desarrollo de una

población endófita distinta (Hallmann et al. 1997). Se observó una disminución de

la colonización de caña de azúcar por Gluconacetobacter diazotrophicus en

plantas bajo un régimen alto de fertilización nitrogenada y lo opuesto con una baja

fertilización de nitrógeno. Parece que el suministro de nitrógeno a las plantas

altera su fisiología y puede causar una disminución en sacarosa que parece ser

utilizada para el crecimiento endófito (Fuentes-Ramírez et al. 1999). Los efectos

del fertilizante sobre las poblaciones endófitas fueron además confirmados.

En arroz (Oryza sativa), se observó un cambio rápido de la población fijadora de

nitrógeno dentro de 15 días después de la fertilización nitrogenada (Tan et al.

2003). Las enmiendas orgánicas a las plantas también influyen en las poblaciones

endófitas (Hallmann et al. 1997).

__________________________________________________________Materiales y Métodos


3 MATERIALES Y MÉTODOS

3.1 Características del suelo para el aislamiento de bacterias endófitas y toma de muestras

Para la obtención de los aislados bacterianos endófitos provenientes de raíces de

plantas de sorgo, se sembraron semillas de la variedad UDG-110 en marzo de

2009 en un área de 800m2 perteneciente al campo 4 de la Estación Experimental

Agrícola “Álvaro Barba Machado” (Figura 3.1). La siembra de las semillas se

realizó de forma manual teniendo un marco de plantación de 70 * 25 cm. La

clasificación del suelo en esta localidad responde a un suelo Pardo Mullido

Medianamente Lavado (Hernández et al., 2004).

Figura 3.1 Geolocalización del área experimental donde se sembraron las semillas de la

variedad de sorgo UDG-110 para la realización de los aislamientos de bacterias

endofíticas.

CCaammppoo 44 Zonas de muestreos

Campo 4



La toma de muestras se realizo según la metodología propuesta por (Díaz et al.,

2005), la cual se realizó en diagonal con profundidad de 0-20 cm, tomando 5

muestras independientes para formar muestras compuestas con un total de 4

replicaciones. se analizó el contenido de materia orgánica (barkley y black), pH en

KCl (método potenciométrico), P2O5 (oniani) y K2O (espectrofotometría de

llamas).

La toma de muestras para el aislamiento de las bacterias endófitas se realizó a los

7, 30 y 60 días a partir de la brotación del cultivo. Las muestras iniciales

consistieron en la obtención del sistema radicular de varias plantas de sorgo

tomadas aleatoriamente.

Para el procesamiento de las muestras se siguió la metodología propuesta por

Remans et al. (2007), ligeramente modificada para este cultivo. Se realizó un corte

en la parte inferior del cuello de las plantas para la obtención del sistema radicular.

El sistema fasciculado de todas las plantas se lavó con agua común para la

eliminación de restos de suelo y algún otro material contaminante. Todas las

raíces fueron desinfectadas durante 1 min en etanol (70%) y posteriormente

sumergidas en bicloruro de mercurio (HgCl2) durante 2 min. Luego de la

desinfección de las raíces se procedió al lavado intenso de las mismas (hasta 10

veces) con agua destilada estéril.

Del agua utilizada en el último lavado se tomaron 100 µl y se depositaron en

cuatro placas Petri con medio de cultivo Agar Triptona Soya (BIOCEN) para

determinar la efectividad del método de desinfección, ya que las bacterias crecidas

en este medio mediante esta metodología son provenientes del rizoplano y no de

los tejidos vegetales. Estas placas se incubaron a 30ºC durante 72 horas y el

medio contaba con la siguiente composición química: hidrolizado enzimático de

caseína 15g, peptona de soya 5g, cloruro de sodio 5g, agar 15g y pH 7.3 ±0.2

3.2 Obtención de aislados endofíticos y parámetros morfológicos de las colonias



Luego del lavado intenso de las raíces se trozaron en pequeños tamaños,

mezclándose todas y tomándose finalmente 2 gramos de estas para proceder al

macerado en mortero previamente esterilizado. Las raíces maceradas se

depositaron en 10 ml de H2O destilada estéril para la realización de diluciones

seriadas (10-1 y 10-2) y la siembra en placas Petri (Mayea et al., 1998) para la

obtención de aislados endofíticos (Figura 3.2).

Fig. 3.2 Esquema de diluciones seriadas y siembra en placas Petri para la obtención de

aislados endofíticos.

Posteriormente a la siembra de las placas Petri conteniendo medio de cultivo Agar

Triptona Soya (BIOCEN), estas se incubaron a 30 ºC durante 72 h. De igual

forma se procedió para aislar las bacterias endófitas de semillas de la variedad

UDG-110 cosechadas en la propia Estación Experimental Agrícola.

Luego del periodo de incubación de las placas se analizaron todas las colonias

crecidas para determinar diferencias en cuanto a: morfología, crecimiento, color,

consistencia, bordes, elevación y respuesta de las células bacterianas a la tinción

de Gram (Torres, 2008).

3.3. Determinación de la producción de auxinas (ácidoindol-3-acético) por los aislados

Todas las bacterianas endófitas previamente aisladas y que contaban con al

menos un parámetro diferente en el análisis morfológico se inocularon en medio

1/10 1/101 1/102

0.1 ml 0.1 ml

Muestra (2 g)

1 ml 1 ml

0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml



líquido Agar Triptona Soya e incubadas a 30 ºC durante 48 h para la

determinación de la producción de auxinas (AIA) por las mismas, la cual se realizó

mediante colorimetría y usándose el reactivo de Salkowski (Spaepen, 2008).

El reactivo de Salkowski consistió en la disolución de 12 g de FeCl3 en 7.9 M de

H2SO4 (Glickmann and Dessaux, 1995) para 1 L de agua destilada estéril. Luego

de la reacción exotérmica, el frasco donde se realizó el reactivo se le aplicó una

envoltura de papel lumínico para impedir que este se expusiera a la luz por ser

fotosensible.

Para la medición de las proporciones de AIA producidas por los aislados se

tomaron tubos eppendorf de 1.5 ml, en los cuales se añadió 750 µl de cada uno de

los cultivos bacterianos y se centrifugaron por 5 minutos a 6000 rpm.

Posteriormente se trasladó el sobrenadante para un nuevo tubo eppendorf y se le

agregó 750 µl de reactivo Salkowski. La reacción se mantuvo a la oscuridad por

30 minutos y posteriormente se midió la absorbancia (DO530nm) por

espectrofotometría a 530 nm. Las concentraciones de AIA se estimaron usándose

una curva estándar. Para el ploteo de la curva se realizaron diluciones seriadas de

auxinas sintéticas a diferentes concentraciones, a las cuales se les añadió el

reactivo Salkowski y se incubó por 30 minutos, midiéndose posteriormente la

DO530nm. En la curva se plotearon las densidades ópticas contra las

concentraciones de auxinas sintéticas ácido-3-indol acético que comercializa

invitrogen.

.

3.4 Efecto de los aislados bacterianos sobre parámetros de crecimiento y

biomasa del cultivo de sorgo en condiciones controladas

El experimento en condiciones controladas se realizó en casa de cultivo del

Instituto de Biotecnología de las Plantas (IBP) de la Universidad Central “Marta

Abreu” de Las Villas en el periodo comprendido entre los meses de octubre y

noviembre de 2009. En este experimento se analizaron todos los aislados

previamente caracterizados morfológicamente para determinar el efecto de estos



sobre parámetros morfológicos y fisiológicos del cultivo del sorgo variedad UDG-

110.

Se utilizaron bolsas de polietileno de 1 kg, las que contenían como sustrato

compost a partir de cachaza mezclado con zeolita en proporción 80% (compost) /

20% (zeolita) respectivamente con un contenido de materia orgánica total de

11.4%. La zeolita utilizada no se encontraba cargada y contó con una

granulometría de 1-3 mm.

Se realizó un análisis microbiológico al sustrato utilizado, para conocer las

proporciones de hongos, bacterias y actinomicetos presentes en el mismo.

Se utilizó la metodología propuesta por mayea et al. (1998), la cual se basa en

diluciones cuantitativas y siembra en placas, utilizándose las diluciones de 103, 104

y 105 para el conteo de hongos bacterias y actinomicetos respectivamente.

Preparación del inóculo, inoculación y montaje del experimento

El crecimiento de las cepas se realizó en el Laboratorio de Microbiología de la

Facultad de Ciencias Agropecuarias. Todos los aislados procedentes de los

tiempos de muestreos se sembraron en medio caldo nutriente (UNI-CHEM) con la

siguiente composición: peptona 10g, extracto de carne 3g, cloruro de sodio 5g y

pH 7.4 ±0.2.

Los cultivos bacterianos se mantuvieron en agitación continua durante 24 horas en

una zaranda orbital marca GERHARDT a 130 rpm a una temperatura de 30°C.

Luego de la incubación se realizó un conteo de células viables para disponer con

títulos en cada uno de los cultivos de 108 a 109 ufc ml-1. El conteo se realizó en

cámara de Neubauer, colocando 1 µl (0.1 mm3) de cultivo en dicha cámara y

realizando el conteo de células mediante la observación en microscopio óptico por

cada muestra.

Cada aislado utilizado fue un tratamiento el experimento en condiciones

controladas. La inoculación se realizó aplicando 2 ml del cultivo de cada aislado



por punto de siembra de las semillas en la bolsa. En el tratamiento control se

añadieron 2 ml de agua común.

Se dispuso de un diseño experimental totalmente aleatorizado con 4 réplicas.

Antes de plantadas e inoculadas las semillas, estas se desinfectaron durante 1

minuto en etanol 100% y lavadas intensamente (más de seis veces) con agua

destilada estéril. Se sembraron un total de cuatro plantas por cada bolsa, lo que

condujo a un total de 16 plantas por tratamiento. A la semana posterior a la

brotación se realizó el raleo dejando 1 planta por punto de siembra, o sea, dos

plantas por bolsa.

Condiciones de crecimiento y evaluaciones

Las bolsas se depositaron en la cámara 1 de la fase de aclimatización del IBP,

donde contaron con adecuada iluminación y humedad. El riego fue de manera

automatizada dos veces al día, 10:00 am y 3:00 pm durante 5 minutos con una

norma de riego 0.375 m3/ha x aspersor por cada riego. No se detectaron plagas,

enfermedades ni malezas en todo el ciclo del experimento.

A los 7 días después de sembrado el experimento comenzaron las evaluaciones,

analizándose en esa etapa el número de semillas brotadas en los diferentes

tratamientos. A los 45 días después de la siembra se cosechó el experimento,

realizándose las siguientes evaluaciones para determinar el efecto de los endófitos

sobre los parámetros de crecimiento y la biomasa de las plántulas de sorgo:

· Altura de las plantas (cm) medido desde la base de la planta hasta la punta de la hoja 0 con una regla graduada.

· Ancho de las hojas (cm)

· Diámetro del tallo (mm)

· Largo de la raíz (cm)

· Masa fresca del follaje (g)

· Masa seca del follaje (g)



· Masa fresca de la raíz (g)

· Masa seca de la raíz (g)

Luego del análisis de la biomasa de las plantas, se precedió a determinar el

porcentaje de nitrógeno (%N) y el contenido de proteína bruta (P.B) en el follaje de

las plantas, tomando 2 réplicas como muestra. Para esta determinación se utilizó

el método Kjeldahl (1980), el cual se basa en la transformación del N contenido en

la muestra en sulfato de amonio (Na2SO4) mediante la digestión con acido

sulfúrico H2SO4 en presencia de selenio (Se) como catalizador (Se 5g /1 L de

H2SO4). El ion amonio (NH4+) obtenido se transforma en medio básico (NaOH) al

32%) en amonio (NH4) que se destila y valora con una solución de acido patrón

(HCl 0.1 % N).

El cálculo del % N total se efectúa por la siguiente formula:

14,0*%PM

VBVmN -=

Donde:

%N= porcentaje de N total de la muestra

Vm= volumen de la muestra

VB= volumen del blanco (H2SO4 sin muestra)

PM= peso de la muestra

Análisis estadístico

El análisis estadístico se realizó utilizándose el paquete STATGRAPHIC Centurión

XV para el sistema operativo Windows. Cada análisis se realizó teniendo en

cuenta la normalidad de los datos a procesar.

Debido al elevado número de muestras a procesar, se compararon los aislados de

cada uno de los grupos de procedencia para determinar las diferencias

estadísticas entre estos. Se compararon los aislados obtenidos a los 7, 30 y 60

días y luego se determinaron los más prominentes según los resultados obtenidos

frente a los parámetros evaluados, analizándose mediante el análisis de varianza



simple One Way ONOVA y la prueba paramétrica de de rangos múltiples de

Tuckey HSD.

Los aislados de mejores respuestas en las evaluaciones realizadas se compararon

entre ellos para determinar las diferencias estadísticas individuales de los

tratamientos mediante un análisis de varianza simple (One-Way ANOVA) y la

prueba paramétrica de rangos múltiples de Tuckey HSD con nivel de significación

p<0.05. En todos los casos evaluados se realizó la verificación de varianza para

conocer la homogeneidad de estas y por consiguiente seleccionar la prueba

paramétrica o no paramétrica idónea a utilizar.

Se realizó un análisis de correlación utilizándose el coeficiente de Pearson con

niveles de significación 0.01>p0.05. La contribución de la estimulación del AIA al

crecimiento y formación de biomasa de las plantas se analizó mediante la

correlación (R2) de estos parámetros.

_________________________________________________________Resultados y Discusión


4 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

4.1 Características del suelo para el aislamiento de bacterias endófitas

Las semilla de sorgo de la variedad UDG-110 se sembraron en suelo Pardo

Mullido Medianamente Lavado en la Estación Experimental Agrícola “Álvaro

Barba” de la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, el cual presentaba

las siguientes características: materia orgánica 2.6%, P2O5: 32.60 (mg 100g-1),

K2O: 55.50 (mg 100g-1) y pH (KCl) 6.8. Estos resultados demuestran la

abundancia de nutrientes esenciales en el suelo, ya que tanto el contenido de

fósforo como de potasio se catalogan de adecuados (Hernández et al., 2004), sin

embargo la materia orgánica tiende a ser ligeramente escasa, aspecto este muy

frecuente para este tipo de suelo en la localidad evaluada (Díaz et al., 2005). El

análisis del pH evidencia un valor muy cercano a la neutralidad, por lo que es muy

adecuado para el crecimiento de arqueas, bacterias y actinomicetos en estas

condiciones.

4.2 Obtención de aislados endófitos y parámetros morfológicos de las

colonias

En cada periodo de muestreo se obtuvo un abundante número de bacterias

procedente de las raíces y de las semillas de sorgo. La comprobación de la

procedencia de los aislados determinó que todas las bacterias procedieron del

interior de tejidos de las plantas, ya que la siembra en placas del último lavado de

las muestras, tanto de raíces como de semillas, demostró que no existió

crecimiento microbiano en ninguna de las placas.

Luego de la obtención de todos los aislados por cada muestra se procedió a la

diferenciación de los mismos basado en el análisis de las características

morfológicas de las colonias. De este análisis se obtuvo 10 colonias aisladas a los

7 días, 6 colonias aisladas a los 30 días, 6 colonias aisladas a los 60 días y 15

colonias aisladas de las semillas de sorgo, totalizando 37 bacterias endófitas.



En la tabla 4.1 se muestra el comportamiento morfológico de los aislados endófitos

obtenidos, contando con un total de 37 cepas aislados que mostraron al menos un

parámetro morfológico diferente. Se puede apreciar como todos los aislados

tuvieron un crecimiento desde moderado (5.41%) a abundante (94.59%) lo cual

está en correspondencia con el medio de cultivo utilizado (Agar Triptona Soya)

muy enriquecido en nutrientes. El 83.78% de las cepas bacterianas presentaron

un color blanco opaco. En cuanto a la consistencia fue ligera para el 10.81%,

moderada para 51.35% y abundante para el 37.84% de los aislados obtenidos.

Los bordes de las colonias fueron regulares para el 18.92% e irregulares para el

81.08%. La elevación sobre el medio de la colonia mostró que el 70.27% fueron

elevadas y 29.73% planas. La morfología de la bacteria observada al microscopio

óptico reflejó que el 81.08% fueron bacilos cortos, el 16.22% bacilos largos y el

2.70% cocobacilos. En la respuesta a la tinción diferencial de Gram el 70.27%

fueron positivos mientras que el resto (29.73%) Gram negativos.

Tabla 4.1 Descripción morfológica de los aislados bacterianos

No Código Crec. Color Consist Bordes Elevación Morfología Gram

1 7 ER-1 +++ 3* ++ ++ ++ BL - 2 7 ER-2 +++ 3* + ++ ++ BL - 3 7 ER-3 +++ 3* + ++ ++ BC + 4 7 ER-4 +++ 3* +++ ++ ++ BC + 5 7 ER-5 +++ 3* ++ ++ + BC + 6 7 ER-6-A ++ 3* +++ + + BC + 7 7 ER-6-B +++ 3* +++ ++ ++ BC + 8 7 ER-6-C +++ 3* +++ ++ ++ BC + 9 7 ER-7 +++ 3* +++ + + BL +

10 7 ER-8 +++ 3* +++ + + BL - 11 30 ER-1 +++ 3* ++ ++ ++ BC + 12 30 ER-2 +++ 3* ++ ++ ++ BC + 13 30 ER-3 +++ 3* ++ ++ ++ BC + 14 30 ER-4 +++ 3* ++ ++ ++ BC + 15 30 ER-5 +++ 3* + ++ + BC + 16 30 ER-6 ++ 3* +++ ++ ++ BL + 17 60 ER-1 +++ 3* ++ ++ + BC + 18 60 ER-2 +++ 3 +++ ++ ++ BC - 19 60 ER-3 +++ 3* ++ ++ ++ BC + 20 60 ER-4 +++ 2 +++ ++ + BC + 21 60 ER-5 +++ 3*** +++ ++ ++ BC +



Tabla 4.1 Descripción morfológica de los aislados bacterianos (continuación)

No Código Crec. Color Consist. Bordes Elevación Morfología Gram

22 60 ER-6 +++ 3* ++ + + BC + 23 ET-1 +++ 3* ++ ++ ++ BC - 24 ET-2 +++ 3* ++ ++ ++ BC - 25 ET-3 +++ 3* ++ ++ ++ BC - 26 ET-4 +++ 3* ++ ++ ++ BC + 27 ET-5 +++ 3* ++ ++ ++ BC + 28 ET-6 +++ 2** + ++ ++ BC + 29 ET-7 +++ 3* ++ ++ ++ CB - 30 ET-8 +++ 3* +++ + + BC + 31 ET-9 +++ 3* +++ ++ ++ BC - 32 ET-10 +++ 3** +++ + + BL - 33 ET-11 +++ 3* ++ ++ ++ BC - 34 ET-I +++ 3* ++ + + BC + 35 ET-II +++ 3*** ++ ++ ++ BC + 36 ET-III +++ 3* +++ ++ ++ BC + 37 ET-IV +++ 3* ++ ++ ++ BC +

Parámetro Descripción

Crecimiento (+) ligero (++) moderado (+++) abundante Color (1) Transparente (2) Translucido (3) Opaco (2*) rosado translúcido

(2**) amarillo translucido (2***) blanco translucido (3*) blanco opaco (3**) amarillo opaco (3***) naranja opaco

Consistencia (-) ninguna (+) ligero (++) moderado (+++) abundante Bordes (+) regular (++) irregular Elevación (+) plano (++) elevado Gram (+) positivo (-) negativo Morfología (BL) bacilo largo (BC) bacilo corto (CB) cocobacilo

4.2.1 Aislados bacterianos endófitos por grupo de procedencia

Los aislados endófitos obtenidos procedieron de diferentes momentos de

aislamiento, para lo cual se tomaron muestras de plantas a los 7, 30 y 60 días

después de sembradas las plantas de sorgo. Debido al alto número de aislados

fue imposible realizar una comparación entre ellos por un método estadístico

apropiado, por lo que se agruparon por grupos de procedencia para determinar los

grupos más prominentes por los principales parámetros analizados en las plantas

en condiciones controladas.

En la tabla 4.2se muestra la comparación de los parámetros evaluados que

arrojaron diferencias entre los grupos según su origen de procedencia con el



tratamiento control. Se observa una preponderancia del grupo de aislados

obtenidos a los 7 días, lo cual está en correspondencia con la capacidad que

pueda tener cada cepa bacteriana de colonizar un nicho bacteriano determinado

en la raíz con la mayor brevedad posible estableciendose en la rizosfera, rizoplano

y posteriormente colonizando endófitamente el cultivo y ejerciendo un efecto

beneficioso sobre el mismo. De manera menos efectiva se muestran las cepas

bacterianas obtenidas a partir de la semilla e incluso en algunos casos por debajo

del tratamiento control, por lo que se puede inferir la necesidad de inocular la

semilla del cultivo con aquellos aislados que resultan los mejores en la

estimulación del cultivo en el presente estudio.

Tabla 4.2 Comparación de los aislados bacterianos endófitos por grupo de

procedencia

Grupo* PFF (g) PSF (g) PFR (g) PSR (g) L. raíz (cm)

7 días 2,49 a 0,38 ab 0,26 a 0,22 a 18,75 a 30 días 2,13 ab 0,35 ab 0,09 b 0,05 b 15,13 c 60 días 2,25 ab 0,41 a 0,09 b 0,04 b 18,01 ab Semilla 1,94 b 0,34 b 0,12 b 0,90 b 16,04 bc Control 2,16 ab 0,37 ab 0,29 a 0,21 a 16,22 abc EE 0.05 0.1 0.01 0.01 0.26

* Los grupos de procedencia se determinaron mediante el aislamiento de las bacterias endófitas a los 7, 30 y 60 días de sembradas las plantas de sorgo. Abreviaturas: PFF (g)/ peso fresco del follaje, PSF (g)/ peso seco del follaje, PFR (g)/ peso fresco de la raíz, PSR (g)/ peso seco de la raíz, L. raíz (cm)/ longitud de la raíz. Letras desiguales en una misma columna difieren para p<0.05 por Tukey HSD

A partir de estos resultados obtenidos en los grupos de procedencia, se tomaron

los asilados (tratamientos) que tuvieron mejores resultados en la producción de

auxinas (AIA), los parámetros de crecimiento y la producción de masa seca de las

plantas de sorgo en condiciones controladas para compararlos entre ellos y

determinar individualmente los mejores aislados endófitos.



4.3 Determinación de la producción de auxinas (ácido indol-3-acético) por los aislados

El análisis de la producción de acido indol-3-acético se realizó mediante el método

espectrofotométrico de Salkowski, el cual es ampliamente usado para estimar la

producción de esta fitohormona por bacterias (Sapaepen, 2008).

La figura 4.1 muestra la comparación de los mejores resultados por los aislados

seleccionados en comparación con el tratamiento control respecto a la producción

de AIA en la fase estacionaria del crecimiento de las bacterias. Como se aprecia,

el aislado bacteriano que mayor producción de ácido indol acético presentó fue el

22 (60 ER-6, aislado a los 60 días), teniendo un promedio de 33.75 µg ml-1,

seguido por el aislado 2 (7 ER-2, aislado a los 7 días), con una media estadística

de 28.20 µg ml-1.

28.2

14.9512.35

17.9 19.55

13.45

33.75

18.6

0

5

10

15

20

25

30

35

40

2 3 4 5 6 8 22 36

AIA

µg/

mL

Aislados

Figura 4.1 Producción de AIA (µg ml-1) por los mejores aislados seleccionados. Identificación de los aislados: 2/-7 ER-2- aislado a los 7 días, 3/-7 ER-3- 2/-7 aislado a los 7 días, 4/-7 ER-4- aislado a los 7 días, 5/-7 ER-5- aislado a los 7 días, 6/-7 ER-6- aislado a los 7 días, 8/-7 ER-8- aislado a los 7 días, 22/-60 ER-6- aislado a los 60 días, 36/- ET-III- aislado a los de las semillas. Letras desiguales en las columnas difieren para p<0.05 por Tickey HSD. Error estándar: 1.48. La producción de AIA es uno de los mecanismos de estimulación de las bacterias

mayormente difundidos. Se estima que aproximadamente el 80% de las bacterias

rizosféricas son capaces de producir auxinas y promover el desarrollo de las

plantas (Patten y Glick, 1996; Dobbelaere, 2002). Según Van Noorden et al.

(2006), ciertas bacterias del suelo capaces de producir AIA pueden estimular el



crecimiento y desarrollo de las raíces y el follaje de las plantas por la acción

directa de estas sustancias en los órganos de las plantas. Sin embargo, Okon y

Vandereleyden (1997) reportan que las concentraciones de estas sustancias en el

suelo es uno de los factores determinantes en el estímulo de las bacterias sobre

las plantas. Concentraciones de hasta 100 nM de AIA se ha visto que ejercen

acción estimulante en el cultivo del frijol común, mientras que concentraciones

superiores pueden inhibir el desarrollo de las raíces laterales y los pelos radicales

(Remans et al., 2008).

4.4 Efecto de endófitos bacterianos sobre la brotación, parámetros de crecimiento y biomasa de plantas de sorgo en condiciones controladas

Los resultados del análisis microbiológico al sustrato utilizado en el experimento

en condiciones controladas demostró la abundancia de microorganismos en la

mezcla compost-zeolita, donde se alcanzaron los siguientes niveles por los

principales grupos microbianos: 8 x 105 ufc g-1 de hongos, 9.2 x 107 ufc g-1 de

bacterias y 4.6 x 106 ufc g-1 de actinomicetos. Estos resultados ponen en evidencia

que las bacterias inoculadas en condiciones controladas pudieran realizar la

misma acción en condiciones de campo, debido a la alta carga microbiana

presente en el sustrato, la cual pudiera ser similar a las condiciones microbianas

en un agroecosistema determinado.

4.4.1 Influencia de aislados endófitos sobre la brotación de plántulas de sorgo.

Plantas de sorgo de la variedad UDG-110 se sembraron en un experimento en

condiciones controladas en el Instituto de Biotecnología de las Plantas para

determinar le efecto de los aislados endófitos sobre los parámetros de crecimiento

y la fijación de nitrógeno del cultivo bajo la influencia de diferentes aislados.

La figura 4.2 muestra el porcentaje de brotación de las plántulas de sorgo a los 7

días de sembrado e inoculado el experimento. Se puede apreciar en la figura que

mediante la inoculación de diferentes aislados se pudo obtener niveles de

brotación superiores al 90%, no siendo así con el tratamiento control (tratamiento



38). Dentro de las bacterias de mayor incremento en la brotación se destacan los

aislados: 9, 10 (aislados a los 7 días), 11, 13, 14, 16 (aislados a los 30 días), 29,

30, 31, 33 y 34 (aislado de la semilla). En todos estos aislados la brotación fue

superior al 90 %, mientras que otros aislados tales como: 2 (aislado a los 7 días),

12 (aislado a los 30 días), 17, 20 (aislados a los 60 días), 36 y 37 (aislados de las

semillas), obtuvieron niveles de brotación superior al 85%.

Se destacan los resultados obtenidos por aquellos endófitos aislados a los 30 días

y aislados de las semillas, respecto a la brotación de las plántulas de sorgo. Estos

resultados se encuentran en estrecha relación con los reportados por Idris et al.,

(2009), al señalar que diferentes aislados bacterianos procedentes del cultivo del

sorgo ejercen un marcado efecto sobre la germinación y parámetros de

crecimiento de cultivares de sorgo.

Figura 4.2 Porcentaje de brotacion de semillas de sorgo var. UDG-110. Se muestran todos los aislados resultantes del análisis morfológico en comparación con el tratamiento control (38). El análisis para la brotación se realizó a los 7 días de sembradas e inoculadas las semillas en condiciones controladas.

Es significativo señalar que ninguno de los aislados resultantes como mayores

productores de AIA no tuvieron incidencia en elevados porcentajes de brotación

(mayor del 90%), sin embargo, los aislados 2 (aislado a los 7 días) y 36 (aislados

de las semillas), los cuales tuvieron más del 85% de brotación, fueron superior al

tratamiento control y pertenecieron al segundo grupo de aislados que tuvieron los

mejores resultados en este parámetro. Teniendo en cuenta los mecanismos de



acción de estos endófitos, se puede sugerir que la estimulación mediante la

producción de auxinas no tuvo un efecto significativo en los primeros estadios del

establecimiento del cultivo del sorgo. Estos resultados pueden deberse a la baja

colonizacion de los endófitos en las primeras etapas del cultivo y a las especies de

bacterias inoculadas, las cuales pueden requerir de mayor cantidad de tiempo

para expresar su capacidad de producción de auxinas u otro mecanismo de acción

que posibilite el incremento de la germinación y brotación de las plantas en las

primeras etapas del crecimiento. Según Khalid et al. (2004), las bacterias

endofíticas requieren de las condiciones fisiológicas necesarias para la

colonización en los tejidos vegetales y luego de su establecimiento pueden lograr

los resultados esperados mediante los mecanismos de acción de la fijación de

nitrógeno, producción de sustancias estimuladoras del crecimiento vegetal, la

solubilización de fosfatos o los mecanismos indirectos de producción de

sideróforos o sustancia que inhiben el desarrollo de agentes patógenos (Idris et

al., 2009).

4.4.2 Influencia de aislados endófitos sobre el crecimiento y biomasa de plántulas de sorgo

En la tabla 4.3 se presentan los resultados obtenidos mediante la inoculación de

los mejores aislados endofíticos sobre los parámetros de crecimiento de las

plántulas de sorgo en condiciones controladas. Se destacan en estos resultados

que todos los aislados mejores productores de AIA fueron aquellos que lograron

estimular los parámetros de crecimiento. Sin embargo, al realizar la comparación

entre las bacterias respecto a la altura de las plantas, en el ancho de las hojas y el

diámetro del tallo puede apreciarse como no existieron diferencias significativas

entre estos y el tratamiento control (tratamiento 38).

Respecto al largo de la raíz puede observarse como el único tratamiento que tuvo

diferencias significativas con los aislados 2, 3 (aislados a los 7 días) y el control fue

el aislado 5 (aislado a los 7 días), sin embargo, otros tratamientos tales como 6 y 8

(aislados a los a los 7 día), 22 (aislado a los 60 días) y el 36 (aislado de las



semillas), tuvieron el mismo comportamiento que el tratamiento 5, no existiendo

diferencias significativas con este ultimo.

Estos resultados demuestran que el momento de aislamiento de los aislados no

infiere en el resultado de estos sobre los parámetros de crecimiento de las plantas,

sino el tipo de bacteria y su capacidad o mecanismo de acción para estimular el

crecimiento y desarrollo de las plantas.

Tabla 4. 3 Efecto de los aislados endófitos sobre los parámetros de crecimiento

de plantas de sorgo

Letras desiguales en una misma columna difieren para p<0.05 por Tuckey HSD

El efecto de las bacterias endófitas sobre la parte aérea y las raíces de las plantas

ha sido ampliamente discutido, sin embargo, existe un consenso generalizado en

la comunidad científica internacional que el mayor efecto de estas bacterias se

ejerce en las raíces y luego se favorecen los órganos aéreos como responsables

de la producción de sustancias de reserva para toda la planta (Suzuki et al., 2004).

En nuestro estudio se observa como el largo de las raíces se ve favorecido por la

colonización de las bacterias y al posible mecanismo de acción de la producción

de sustancias estimuladoras del crecimiento vegetal.

Tratamiento Altura de plantas (cm)

Ancho de hojas (cm)

Diámetro tallo (mm)

Largo de raíz (cm)

2 (7 días) 43.80 a 1.94 a 4.60 a 16.05 b 3 (7 días) 43.69 a 1.84 a 4.74 a 17.08 b 4 (7 días) 45.19 a 1.68 a 4.66 a 20.75 ab 5 (7 días) 45.69 a 1.79 a 4.74 a 22.76 a 6 (7 días) 46.46 a 1.68 a 4.74 a 20.38 ab 8 (7 días) 45.31 a 1.95 a 5.01 a 19.00 ab 22 (60 días) 46.78 a 1.91 a 5.11 a 18.44 ab 36 (semilla) 44.78 a 1.89 a 5.13 a 19.56 ab 38 (control) 40.18 a 1.71 a 4.76 a 16.22 b EE 0.74 0.04 0.09 0.50



Aunque no se apreciaron

diferencias estadísticas

entre los aislados y en

comparación con el

tratamiento control

respecto a la altura,

número de hojas y

diámetro del tallo de las

plántulas de sorgo, se

puede apreciar en la figura

4.3 como al comparar los

valores medios de los

aislados con respecto a

los resultados obtenidos

con el tratamiento control,

en la mayoría de los

parámetros evaluados,

existe una tendencia al

incremento del efecto de

los aislados en

comparación con en

control, teniendo

porcentajes superiores en

estos parámetros,

especialmente con

inoculación de los aislados

8 (aislado a los 7 días), 22

(aislado a los 60 días) y

36 (aislado de la semilla).

Según lo reportado por Asghar et al. (2002), Bacillus cereus fue una de las

bacterias más abundantes encontradas endofíticamente en las raíces de las

B

C

A

Figura 4.3 Porcentaje de incremento o disminución del efecto de los aislados respecto al tratamiento control. A/ altura de las plantas, B/ ancho de las hojas y C/ diámetro de las plantas.



plantas, la cual en condiciones experimentales fue la de mejores resultados en la

producción de AIA por métodos espectrofotométricos y a la vez la de mejores

resultados en el largo de las raíces de plántulas de sorgo.

Resultados similares a los obtenidos en los parámetros de crecimiento se

observaron en el análisis de la biomasa de las plantas de sorgo. La tabla 4.4

muestra los valores obtenidos por cada uno de los aislados y el tratamiento control

respecto al peso fresco y seco del follaje y la raíz.

Se destaca en este análisis que solamente en el peso fresco de raíz (PFR) se

obtuvieron diferencias significativas entre los aislados y el tratamiento control, no

existiendo diferencias en el peso fresco (PFF) y seco del follaje (PSF) y en el peso

seco de la raíz (PSR).

Tabla 4. 4 Efecto de los aislados endófitos sobre los la biomasa radical y área de plantas de sorgo

*

Abreviaturas: PFF/ peso fresco del follaje, PSF/ peso seco del follaje, PFR/ peso fresco de la raíz, PSR/ peso seco de la raíz. Letras desiguales en una misma columna difieren para p<0.05 por Tuckey HSD.

La inoculación con el aislado 5 (aislado a los 7 días) fue el único tratamiento que

tuvo diferencias estadísticas con los tratamientos 8 (aislados a los 7 días) y 36

Tratamiento PFF (g) PSF (g) PFR (g) PSR (g)

2 (7 días) 2.85 a 0.39 a 0.37 ab 0.25 a 3 (7 días) 2.88 a 0.37 a 0.44 ab 0.26 a 4 (7 días) 2.68 a 0.39 a 0.33 ab 0.22 a 5 (7 días) 2.97 a 0.41 a 0.52 a 0.29 a 6 (7 días) 2.58 a 0.42 a 0.38 ab 0.28 a 8 (7 días) 2.76 a 0.45 a 0.20 b 0.29 a 22 (60 días) 2.82 a 0.53 a 0.45 ab 0.28 a 36 (semilla) 2.57 a 0.41 a 0.21 b 0.28 a 38 (control) 2.16 a 0.37 a 0.28 ab 0.25 a EE 0.09 0.01 0.02 0.01



(aislado de las semillas), los cuales fueron los valores más bajos estadísticamente.

Sin embargo, al analizar la masa seca no existieron diferencias significativas.

Al igual que para los parámetros de crecimiento, en la biomasa de las plantas se

analizó el incremento o disminución de los valores medios obtenidos por los

aislados respecto al , pero teniendo en cuenta solamente el peso seco del follaje

como de la raíz.

La figura 4.4 muestra los

resultados obtenidos en esta

comparación, teniendo en

cuenta el porcentaje de

incremento o disminución del

efecto de los aislados en

comparación con los

resultados obtenidos por el

control.

Al analizar el peso del follaje

se aprecia como el aislado 22

(aislado a los 60 días) tuvo un

incremento de 30.18%

respecto al tratamiento

control, seguido del aislado 8

(aislado a los 7 días) con

17.77.

En el peso seco de la raíz se destacan los aislados 8 y 5 (aislados a los 7 días),

los cuales tuvieron un incrementos de 13.79% respectivamente en comparación

con el tratamiento control. Con excepción del tratamiento 4, el cual tuvo una gran

B

A

Figura 4.4 Porcentaje de incremento o disminución del efecto de los aislados respecto al tratamiento control. A/ Peso seco del follaje, B/ Peso seco de la raíz.



disminución en el peso de la raíz en comparación con el control (-13.63), los

demás tratamientos tuvieron un estable incremento en este parámetro.

Al comparar los resultados obtenidos por estos aislados con los observados en la

producción de AIA, la germinación y los parámetros de crecimiento puede inferirse

que la inoculación con los aislados 5, 8 y 22 pueden incrementar el crecimiento y

desarrollo del cultivo del sorgo en condiciones controladas. Entre estos resultados

se destacan los obtenidos con la inoculación del aislado 22 (aislado a los 60 días),

mediante el cual se logra incrementar significativamente la producción de AIA,

tener un porcentaje de brotación superior al 80%, incrementar significativamente el

largo de la raíz, así como obtener satisfactorios resultados en los parámetros de

crecimiento y la biomasa de las plantas de sorgo.

Estos resultados ponen de manifiesto que mediante el mecanismo de acción de la

producción de AIA es posible obtener satisfactorios resultados respecto a la

producción de semillas y biomasa del cultivo del sorgo. Estudios similares son los

obtenidos por Idris et al. (2009) al reportar el efecto beneficioso de diferentes

aislados endofíticos sobre parámetros de crecimiento de cultivo del sorgo,

teniendo en cuenta diferentes mecanismos de acción de las bacterias,

prestándosele una gran importancia a la producción de AIA, como un mecanismo

directo de estimulación por los endófitos. En este sentido Patten y Glick, (2002)

reportan que varias especies de bacterias endofíticas de los géneros

Stenotrophomonas, Bacillus, Pseudomonas, Cerratia, entre otros, pueden afectar

positivamente las raíces y el follaje de diferentes cultivos en condiciones

controladas, sin embargo, sugieren la realización de ensayos en campo para

validar el efecto de los asilados en condiciones naturales. Singh et al. (2007)

reportan que el estudio en condiciones naturales de la rizo-deposición de carbono

sobre las bacterias endófitas, así como la interacción de componentes químicos,

físicos y biológicos, en especial el efecto sobre la microflora rizosférica son

estudios que deben encaminarse en aras de lograr una adecuada diversidad

microbiana en los suelos.



4.4.3 Correlaciones de los parámetros de crecimiento, biomasa y producción de AIA

La correlación de los parámetros evaluados previamente demuestra la

correspondencia existente entre el crecimiento, la biomasa de las plantas y el

mecanismo de acción de la producción de auxinas como responsable de la

estimulación de estos parámetros. La tabla 4.5 resume las diferencias

significativas que existen entre los parámetros, destacándose que en el peso seco

del follaje (PSF), con excepción de la no correlación significativa con el peso

fresco de la raíz (PFR), todos los demás parámetros correlacionan para

0.01>p<0.05. Este resultado demuestra que a medida que la producción de

auxinas es adecuada, como se aprecia con los resultados obtenidos con el

tratamiento 22 (aislado a los 60 días), puede beneficiarse la masa seca del follaje

y por consiguiente los parámetros de crecimiento en la parte aérea de las plantas,

así como en las raíces.

Tabla 4.5 Correlación de Pearson

PFF PSF PFR PSR Diam. Tallo

Ancho hojas

Largo de raíz

Altura planta

AIA- 48 h

PFF 1

PSF .756(**) 1

PFR .688(**) .254 1

PSR .511(**) .589(**) .265 1

Diam. Tallo .267 .488(**) -.049 .245 1

Ancho hojas .762(**) .791(**) .333(*) .531(**) .602(**) 1

Largo raíz .617(**) .459(**) .508(**) .344(*) -.007 .333(*) 1

Altura planta .775(**) .727(**) .350(*) .430(**) .327(*) .636(**) .515(**) 1

AIA- 48 h .275 .358(*) .021 .236 .003 .320 .099 .291 1

** Correlación significativa (p<0.01), * Correlación significativa (p<0.05) por el coeficiente de Pearson. Abreviaturas: PFF/ peso fresco del follaje, PSF/ peso seco del follaje, PFR/ peso fresco de la raíz, PSR/ peso seco de la raíz.

La figura 6.6 muestra la distribución de la correlación existente entre el peso seco

del follaje (PSF) y la producción de AIA. Se aprecia que aunque existe alguna



dispersión en las muestras, a medida que se elevan las cantidades de AIA (µl ml-1)

se incrementa el peso seco del follaje, existiendo un R2 de 34.21%.

Asghar et al. (2002) reportan la existencia de una positiva correlación entre la

colonización de las raíces de plantas de sorgo por bacterias endófitas, la

adecuada arquitectura de estos órganos (largo y diámetro de las raíces), la

producción de masa seca y la producción de AIA por las bacterias endófitas, lo

que se corrobora en el presente estudio con aislados endofíticos cubanos.

Figura 4.5 Correlación entre el peso seco del follaje y las cantidades del AIA producidas por bacterias endófita.

4.5 Fijación de nitrógeno en plantas de sorgo

El mecanismo de acción dela fijación de nitrógeno (N) se estimó mediante el

contenido de N total foliar en las plantas de sorgo. Este análisis se realizó

mediante la técnica de KJjeldahl (1980). Se evaluaron los mejores tratamientos

frente a la producción de AIA, los parámetros de crecimiento y la biomasa de las

plantas.

La figura 4.6 muestra el porcentaje de N de los diferentes tratamientos, donde se

observa como los aislados 2, 6, 8 (aislados a los 7 días), 22 (aislado a los 60 días)

y 36 (aislado de las semillas) obtuvieron resultados superiores al tratamiento

control (38). Los demás aislados no lograron superar al tratamiento control. El

R2= 34.21%



contenido de N total es uno de los valores por los cuales se puede estimar la

fijación de N por las bacterias de vida libre en los cultivos (Burdman et al., 2000).

Este parámetro es uno de los mecanismos de acción por los cuales se ejerce un

mayor estímulo en el crecimiento y desarrollo de las plantas, ya que se les provee

de un nutriente esencial para las diversas funciones metabólicas (Dobbelaere,

2002). De este modo se puede especular que las bacterias de los aislados 2, 22 y

36 pudieran pertenecer a géneros diazotróficos.

Figura 4.6 Porcentaje de nitrógeno foliar en plantas de sorgo.

Según Döbereiner, (1996), diversos cultivares de maíz (Zea mays L.) pueden fijar

hasta un 60% del N derivado de la atmosfera debido a la asociación endofítica con

bacterias pertenecientes al géneros Azospirillum, mientras que otros cultivares, los

cuales no se inocularon, mostraron síntomas claros de deficiencia de este elemento

y por consiguiente se vieron afectados los rendimientos en granos. En caña de

azúcar (Saccharum officinarum) se ha observado que mutantes de Acetobacter

diazotrophicus incapaces de fijar N inoculados en plantas lograron menor

rendimiento del cultivo que cuando se inocularon cepas nativas de esta bacteria,

por lo que se sugiere que aunque las cepas de este endófito no sean eficientes en

el proceso de fijación de N se incorpora mayores cantidades de N que cuando hay

bacterias que no tienen la habilidad de fijar N atmosférico.

% d

e N

itróg

eno

tota

l

________________________________________________________________Conclusiones


5 CONCLUSIONES

1. Mediante el aislamiento de las bacterias se obtuvo una alta biodiversidad

morfológica de aislados bacterianos, contando con un total de 37 bacterias

endófitas, de ellas, 10 aisladas a los 7 días, 6 a los 30 días, 6 a los 60 días

y 15 de las semillas de sorgo.

2. El análisis de los grupos de procedencia determinó que las bacterias

aisladas a los 7 días logran estimular generalmente los parámetros de

crecimiento y biomasa de plantas de sorgo en condiciones controladas en

comparación con los grupos de aislados de la semilla y a los 30 días.

3. La producción de ácido indol-3-acético por las bacterias demostró que esta

sustancia puede ser uno de los mecanismos de acción de la estimulación

por parte de las bacterias endófitas, ya que varios aislados son capaces de

producir esta fitohormona, en especial el aislado 22 (aislado a los 60 días).

4. Los 8 aislados seleccionados fueron los de mejores valores respecto a los

parámetros de crecimiento y biomasa de las plantas de sorgo, sin embargo,

los aislados 5, 8 (aislados a los 7 días), 22 (aislado a los 60 días) y 36

tuvieron los mejores resultados estadísticos y promedios en comparación

con el resto de los aislados.

5. El análisis de las correlaciones de los parámetros de crecimiento y biomasa

de las plantas con la producción de AIA, unido a los resultados del % de

nitrógeno total demuestran que los aislados 8 (aislado a los 7 días), 22

(aislado a los 60 días) y 36 (aislado de la semilla) pueden estimular el

crecimiento de las plantas mediante los mecanismos de acción de

producción de AIA y la fijación de N por las bacterias.

_____________________________________________________________Recomendaciones


6 RECOMENDACIONES

1. Continuar los estudios morfológicos e identificar genéticamente los 8

aislados seleccionados y en especial aquellos de mejores resultados en

este estudio (5, 8, 22 y 36).

2. Estudiar en condiciones de campo el efecto de los aislados 5, 8, 22 y 36 en

la estimulación del crecimiento de plantas de sorgo utilizando otras

variedades.

3. Evaluar otros mecanismos de acción de las bacterias, tales como:

solubilización de fosfatos, producción de sideróforos y producción de otras

fitohormonas para dilucidar el mecanismo de acción por el cual estas

bacterias pueden lograr la fitoestimulación.

__________________________________________________________Bibliografía

Influencia de aislados bacterianos endófitos sobre el desarrollo del cultivo del sorgo (Sorghum biocolor)

7 BIBLIOGRAFÍA

Araujo, W. L., Marcon, J., Maccheroni, W., Jr., Van Elsas, J. D., Van Vuurde, J. W. L. and

Azevedo, J. L. (2002). Diversity of endophytic bacterial populations and their interaction

with Xylella fastidiosa in citrus plants. Appl. Environ. Microbiol. 68:4906-4914.

Asghar HN, Zahir Z.A, Arshad M and Khalig A (2002). Plant growth regulating substances

in the rhizozphere: microbial production and functions. Adv agron 62: 146-151.

Azevedo, J. L., Maccheroni, W., Jr., Pereira, J. O. and de Araujo, W. L. (2000). Endophytic

microorganisms: A review on insect control and recent advances on tropical plants.

Electron. J. Biotechnol. 3: 258-269.

Barka, E. A., Belarbi, A., Hachet, C., Nowak, J., and Audran, J. C. (2000). Enhancement of

in vitro growth and resistance to gray mould of Vitis vinifera co-cultured with plant

growth-promoting rhizobacteria. FEMS (Fed. Eur. Microbiol. Soc.) Microbiol. Lett.

186:91-95.

Barraquio, W. L., Revilla, L., and Ladha, J. K. (1997). Isolation of endophytic diazotrophic

bacteria from wetland rice. Plant Soil 194:15-24.

Bell, C. R., G. A. Dickie, W. L. G. Harvey, and J. W. Y. F. Chan. (1995). Endophytic

bacteria in grapevine. Can. J. Microbiol. 41:46–53.

Berg, T., Tesoriero, L., and Hailstones, D. L. (2005). PCR-based detection of

Xanthomonas campestris pathovars in Brassica seed. Plant Pathol. 54:416-427.

Becker, D.; Stanke, R.; Fendrik, I.; Frommer, W. B.; Vanderleyden, J.; Kaiser, W. M. y

Hedrich, R. (2002). Expression of the NH+4-transporter gene LEAMT1;2 is induced in

tomato roots upon association with N2-fixing bacteria. Planta 215:424–429.

Boddey, R. M., de Oliveira, O. C., Urquiaga, S., Reis, V. M., Olivares, F. L., Baldani, V. L.

D., and Döbereiner, J. (1995). Biological nitrogen fixation associated with sugar cane

and rice: Contributions and prospects for improvement. Plant Soil 174:195-209.

Burdman, s.; Hamaoui, B. y Okon, Y. (2000). Improvement legume crop yields by co-

inoculation with Azospirillum and Rhizobium. The Otto Warburg Center for Agricultural

Biotechnology. The Hebrew University of Jerusalem, Israel.

__________________________________________________________Bibliografía


Cankar, K., Kraigher, H., Ravnikar, M., and Rupnik, M. (2005). Bacterial endophytes from

seeds of Norway spruce (Picea abies L. Karst) FEMS (Fed. Eur. Microbiol. Soc.)

Microbiol. Lett. 244:341-345.

Cargill. (2005). Manual del cultivo del sorgo [consultado 20/05/2009]. Disponible en la

World Wide Web:

http://www.viarural.com.ar/viarural.com.ar/insumosagropecuarios/agricolas/semillas

shibrida/cargill/manualsorgo/manualsorgocargill00.htm

Chelius, M. K., and Triplett, E. W. (2000). Diazotrophic endophytes associated with maize.

Pages 779-791 in: Prokaryotic Nitrogen Fixation; A Model System for Analysis of a

Biological Process. Horizon Scientific Press, Wymondham, U.K.

Ching-Hong, Y.; Crowley, D. E.; Borneman, J. y Keen, N. T. (2001). Microbial phyllosphere

populations are more complex than previously realized. Proc. Nat. Acad. Sci.

98(7):3889-3894. 130:1081-1084.

Compant, D., Duffy, B., Nowak, J., Clément, C., Barka, E. A. (2005). Use of plant growth-

promoting bacteria for biocontrol of plant diseases: Principles, mechanisms of action,

and future prospects. Appl. Eviron. Microbiol. 71:4951-4959.

Compant, S., Reiter, B., Sessitsch, A., Nowak, J., Clement, C., and Ait Barka, E. (2005).

Endophytic colonization of Vitis vinifera L. by plant growth-promoting bacterium

Burkholderia sp. strain PsJN. Appl. Environ. Microbiol. 71:1685-1693.

Conn, V. M., and Franco, C. M. M. (2004). Analysis of the endophytic actinobacterial

population in the roots of wheat (Triticum aestivum L.) by terminal restriction fragment

length polymorphism and sequencing of 16S rRNA clones. Appl. Environ. Microbiol.

70:1787-1794.

Coombs, J. T., and Franco, C. M. M. (2003). Visualization of an endophytic Streptomyces

species in wheat seed. Appl Environ Microbiol 69:4260-4262.

Dalton, D. A., Kramer, S., Azios, N., Fusaro, S., Cahill, E., and Kennedy, C. (2004).

Endophytic nitrogen fixation in dune grasses (Ammophila arenaria and Elymus mollis)

from Oregon. FEMS (Fed. Eur. Microbiol. Soc.) Microbiol Ecol 49:469-479.

Diaz, B., Cairo Cairo, P., Rodríguez Oralia., Torres, P. , Jimenez , R., Abreu, I., Davila A.,

Colas, A. (2005). Evaluación de la sostenibilidad del manejo del suelo pardo con

http://www.viarural.com.ar/viarural.com.ar/insumosagropecuarios/agricolas/semillasshibrida/cargill/manualsorgo/manualsorgocargill00.htm

http://www.viarural.com.ar/viarural.com.ar/insumosagropecuarios/agricolas/semillasshibrida/cargill/manualsorgo/manualsorgocargill00.htm

__________________________________________________________Bibliografía


carbonatos (Inceptisol) a través de indicadores de calidad del mismo. Centro Agrícola

Año 32 No. Santa Clara Cuba pp. 73-78.

Döbereiner J, Reis VM, Paula MA and Olivares F (1996). Endophytic diazotrophs in sugar

cane, cereals and tuber plants. In: New Horizon in nitrogen fixation pp 671-676.

Palacios R, Mora J and Newton WE (eds.) Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, the

Netherlands.

Dong, Y., Iniguez, A. L., and Triplett, E. W. (2003). Quantitative assessments of the host

range and strain specificity of endophytic colonization by Klebsiella pneumoniae 342.

Plant Soil 257:49-59.

Dörr, J., Hurek, T., and Reinhold-Hurek, B.(1998). Type IV pili are involved in plant-

microbe and fungus-microbe interactions. Mol. Microbiol. 30:7-17.

Dobbelaere S (2002). The phtyostimulatory effect of Azospirillum brasilense. PhD thesis,

KULeuven.

Estrada, P.; Bustillos, R. y Caballero, J. (2001). Burkholderia, a genus rich in plant-

associated nitrogen fixers with wide environmental and geographic distribution. Appl.

Environ Microbiol 67(6):2790-2798.

Engelhard, M., Hurek, T., and Reinhold-Hurek, B. (2000). Preferential occurrence of

diazotrophic endophytes, Azoarcus spp., in wild rice species and land races of Oryza

sativa in comparison with modern races. Environ. Microbiol. 2:131-41.

FAO. (2008). El sorgo y el mijo en la nutricion humana. (Colección FAO: Aimentación y

Nutrición No. 27) ISBN 92-5-303381-9. [Consultado 25/06/2010]. Disponible en la

World Wide Web:

http://www.fao.org/documents/show_cdr.asp?url_file=/docrep/TO818S/TO818SO2.htm

FAO (2000). Fertilizer requirements in 2015 and 2030. Food and Agriculture Organzation

of the United Nation, Rome, Italy. http://www.faostat.fao.org

Fuentes-Ramírez, L. E., Caballero-Mellado, J., Sepúlveda, J., and Martínez-Romero, E.

(1999). Colonization of sugarcane by Acetobacter diazotrophicus is inhibited by high N-

fertilization. FEMS (Fed. Eur. Microbiol. Soc.) Microbiol. Ecol. 29:117-128.

Gagne, S., C. Richard, H. Rousseau, and H. Antoun. (1987). Xylem-residing bacteria in

alfalfa roots. Can. J. Microbiol. 33:996–1000.

http://www.fao.org/documents/show_cdr.asp?url_file=/docrep/TO818S/TO818SO2.htm

http://www.faostat.fao.org/

__________________________________________________________Bibliografía


Germaine, K., Keogh, E., Garcia-Cabellos, G., Borremans, B., Van der Lelie, D., Barac, T.,

Oeyen, L., Vangronsveld, J., Moore, F. P., Moore, E. R. B., Campbell, C. D., Ryan, D.,

and Dowling, D. N. (2004). Colonisation of poplar trees by gfp expressing bacterial

endophytes. FEMS (Fed. Eur. Microbiol. Soc.) Microbiol. Ecol. 48:109-118.

Germida, J. J., Siciliano, S. D., De Freitas, J. R., and Seib, A. M. (1998). Diversity of root-

associated bacteria associated with field-grown canola (Brassica napus L.) and wheat

(Triticum aestivum L.). FEMS (Fed. Eur. Microbiol. Soc.) Microbiol. Ecol. 26:43-50.

Giller, K. E., and Merckx, R. (2003). Exploring the boundaries of N2-fixation in cereals and

grasses: An hypothetical and experimental framework. Symbiosis 35:3-17.

Grimault, V., and P. Prior. (1994). Invasiveness of Pseudomonas solanacearum in tomato,

eggplant and pepper: a comparative study. Eur. J. Plant Pathol. 100:259–267.

Glickmann D.R (1995). The enhancement of plant growth by free living bacteria. Canadian

Journal of Microbiology 41: 109-117.

Guo JH, Qi HY, Guo YH, Ge HL, Gong LY and Zhang LX (2002). Biocontrol of tomato wilt

by plant growth-promoting rhizobacteria. Biolog control 29: 66-72.

Hallmann, J., A. Quadt-Hallmann, W. F. Mahaffee, and J. W. Kloepper. (1997). Bacterial

endophytes in agricultural crops. Can. J. Microbiol. 43:895– 914.

Hallmann, J., Quadt-Hallmann, A., Mahaffee, W. F., and Kloepper, J. W. (1997). Bacterial

endophytes in agricultural crops. Can. J. Microbiol. 43:895-914.

Hallmann, J., Rodriguez-Kabana, R., and Kloepper, J. W. (1999). Chitinmediated changes

in bacterial communities of the soil, rhizosphere and within roots of cotton in relation to

nematode control. Soil Biol. Biochem. 31:551-560.

Hernández, A.; Ascanio, M.O.; Morales, M.; y Cabrera C. (2004). Correlación de la nueva

versión de clasificación genética de los suelos de cuba con las clasificaciones

internacionales y nacionales: una herramienta útil para la investigación, docencia y

producción agropecuaria. Instituto Nacional de Ciencias Agrícolas (INCA). La Habana,

Cuba, 62 pp.

Hernández G, Castineira L. y Toscano V. (1996). Respuesta a la inoculación con

Rhizobium de 41 genotipos criollos de frijol común (Phaseolus vulgaris L.) en Cuba.

Biotec Apl 13: 42-51.

__________________________________________________________Bibliografía


Herrera, R. S.; González, S. B.; Hardy, C. y Pedroso, D. (1980). Análisis químico del

pasto. Editorial Feliz Varela. La Habana, Cuba. 37 pág.

Hiltner, L. (1904). Über neuere Erfahrunger und Probleme auf dem Gebiet der

Bodenbchteriologie und unter besonderer Berücksichtigung der Gründüngung und

Brache. Arbeiten Deutscher Landwirtschafts Gesellschaft 98:59-78.

Hirano, S. S. and Upper, C. D. (2000). Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on

Pseudomonas syringae-a pathogen, ice Nucleus, and epiphyte. Microbiol. Mol. Biol.

Rev. 64(3):624-653.

Holland, M. A., and Polacco, J. C. (1994). PPFMs and other covert contaminants: Is there

more to plant physiology than just plant? Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol.

45:197-209.

Hurek, T., Handley, L. L., Reinhold-Hurek, B., and Piche, Y. (2002). Azoarcus grass

endophytes contribute fixed nitrogen to the plant in an unculturable state. Mol. Plant-

Microbe Interact. 15:233-242.

Idris, A., Labuschagne, N. and Korsten, L. (2009) Efficacy of rhizobacteria for growth

promotion in sorghum under greenhouse conditions and selected modes of action

studies. Journal of Agricultural Science, 147, 17–30.

Iniguez, A. L., Dong, Y., and Triplett, E. W. (2004). Nitrogen fixation in wheat provided by

Klebsiella pneumoniae 342. Mol. Plant-Microbe Interact. 17:1078-1085.

Jacobs, M. J., W. M. Bugbee and Gabrielson D. A. (1985). Enumeration, location, and

characterization of endophytic bacteria within sugar beet roots. Can. J. Bot. 63:1262–

1265.

James, E. K., and Olivares, F. B. (1997). Infection and colonization of sugar cane and

other graminaceous plants by endophytic diazotrophs. Crit. Rev. Plant Sci. 17:77-119.

Kado, C. I. (1992). Plant pathogenic bacteria, p. 659–674. In A. Balows, H. G. Truper, M.

Dworkin, W. Harder, and K.-H. Schleifer (ed.), The prokaryotes, vol. I. Springer-Verlag,

New York, N.Y.

KHALID, A., ARSHAD, M. & ZAHIR, Z. A. (2004). Screening plant growth promoting

rhizobacteria for improving growth and yield of wheat. J Appl Microb 96, 473–480.

__________________________________________________________Bibliografía


Kobayashi, D. Y. and Palumbo J. D. (2000). Bacterial endophytes and their effects on

plants and uses in agriculture, p. 199–233. In C. W. Bacon and J. F. White (ed.),

Microbial endophytes. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.

Kovtunovych, G., Lar, O., Kamalova, S., Kordyum, V., Kleiner, D., and Kozyrovska, N.

(1999). Correlation between pectate lyase activity and ability of diazotrophic Klebsiella

oxytoca VN 13 to penetrate into plant tissues. Plant Soil 215:1-6.

Kuklinsky-Sobral, J., Araujo, W. L., Mendes, R., Geraldi, I. O., PizziraniKleiner, A. A., and

Azevedo, J. L. (2004). Isolation and characterization of soybean-associated bacteria

and their potential for plant growth promotion. Environ. Microbiol. 6:1244-1251.

Ladha, J. K., Barraquio, W. L., and Watanabe, I. (1983). Isolation and identification of

nitrogen-fixing Enterobacter cloacae and Klebsiella planticola associated with rice

plants. Can. J. Microbiol. 29:1301-1308.

Lamb, T. G., D. W. Tonkyn and Kluepfel D. A. (1996). Movement of Pseudomonas

aureofaciens from the rhizosphere to aerial plant tissue. Can. J. Microbiol. 42:1112–

1120.

Leben, C., G. C. Daft and Schmitthenner A. F. (1968). Bacterial blight of soybeans:

population levels of Pseudomonas glycinea in relation to symptom development.

Phytopathology 58:1143–1146.

Leifert, C., Morris, C. E., and Waites, W. M., (1994). Ecology of microbial saprophytes and

pathogens in tissue culture and field-grown plants: Reasons for contamination

problems in vitro. Crit. Rev. Plant Sci. 13:139-183.

Lindow, S. E. and Brandl, M.T. (2003). Microbiology of the Phyllosphere. Appl. Environ.

Microbiol. 69(4):1875-1883.

Mantelin, S. and Touraine, B. (2004). Plant growth promoting bacteria and nitrate

availability: impacts on root development and nitrate uptake. J. Exp. Bot. 55(394):27-

34.

Martin, G. (2005). Cultivos: sorgo granifero. Volver al futuro. [Consultado 05/06/05].

Disponible en la World Wide Web:

http://www.produccion.com.ar/2005/05jun_13.htm

http://www.ars.usda.gov/is/espa%C3%B1ol/pr/2005/050509.es.htm

__________________________________________________________Bibliografía


Martin, J. K. y Kemp, J. R. (1980). Carbon loss from roots of wheat cultivars. Soil Biol.

Biochem. 12:551-554.

Martínez, L., Caballero, J., Orozco, J., and Martínez-Romero, E. (2003). Diazotrophic

bacteria associated with banana (Musa spp.). Plant Soil 257:35-47.

Mayz-Figueroa, J. (2004). Fijación biológica del nitrógeno. Universidad de Oriente. Núcleo

de Monagas. Maturín. Venezuela. Revista UDO Agrícola 4 (1): 1-20.

Mayea, S, Carone, M., Novo, R., Boado, I., Silveira, E,, Soria, M., Morales, Y. y Valiño, A.

(1998). Microbiologia Agropecuaria. Tomo II. Ed. Féliz Varela. La Habna. Pp 156-

178.

Mirza, M. S.; Ahmad, W.; Latif, F.; Haurat, J.; Bally, R.; Normand, P. y Malik, K. A. (2001).

Isolation, partial characterization, and the effect of plant growth-promoting bacteria

(PGPB) on micropropagated sugarcane in vitro. Plant Soil 237:47–54.

Miyamoto, T., Kawahara, M., and Minamisawa, K. (2004). Novel endophytic nitrogen-fixing

clostridia from the grass Miscanthus sinensis as revealed by terminal restriction

fragment length polymorphism analysis. Appl. Environ. Microbiol. 70:6580-6586.

Okon, Y. y Vanderleyden, J. (1997). Root associatied Azospirillum species can stimulate

plants. ASM News 63 (7) 364-370.

Patten CL and Glick B.R. (1996). Bacterial biosynthesis of indole-3-acetic acid. Can J

Microbiol 42: 207-220.

Patten, C.L. and Glick, B.R. (2002). Role of Pseudomonas putida indoleacetic acid in

development of the host plant root system. Appl Environ Microb 68: 3795-3801.

Persello-Cartieaux, F.; Nussaume, L. and Robaglia, C. (2003). Tales from the

underground: molecular plant–rhizobia interactions. Plant Cell Environ. 26:189–199.

Pillay, V. K., and Nowak, J. (1997). Inoculum density, temperature, and genotype effects

on in vitro growth promotion and epiphytic and endophytic colonization of tomato

(Lycopersicon esculentum L.) seedlings inoculated with a pseudomonad bacterium.

Can. J. Microbiol. 43:354361.

Pons, L. (2005). Explorando la capacidad del sorgo en combatir malezas. [Consultado

20/05/05]. Disponible en la World Wide Web:

http://www.ars.usda.gov/is/español/pr/2005/050509.es.htm

http://www.ars.usda.gov/is/espa%C3%B1ol/pr/2005/050509.es.htm

__________________________________________________________Bibliografía


Reinhold-Hurek, B., and Hurek, T. (1998a). Interactions of gramineous plants with

Azoarcus spp. and other diazotrophs: Identification, localization, and perspectives to

study their function. Crit. Rev. Plant Sci. 17:29-54.

Reinhold-Hurek, B., and Hurek, T. (1998b). Life in grasses: Diazotrophic endophytes.

Trends Microbiol. 6:139-44.

Reinhold-Hurek, B., Hurek, T., Gillis, M., Hoste, B., Vancanneyt, M., Kersters, K., and De-

Ley, J. (1993). Azoarcus gen. nov., nitrogen-fixing proteobacteria associated with roots

of Kallar grass (Leptochloa fusca (L.) Kunth), and description of two species, Azoarcus

indigens sp. nov. and Azoarcus communis sp. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. 43:574-584.

Reiter, B., Bürgmann, H., Burg, K., and Sessitsch, A. (2003). Endophytic nifH gene

diversity in African sweet potato. Can. J. Microbiol. 49:549555.

Remans, R. (2007). Searching for nitrogen under phosphorus deficiency: the interplay

between common bean (Phaseolus vulgaris L.), Rhizobium and plant growth-

promoting rhizobacteria. PhD thesis, KULeuven. Belgium.

Riggs, P. J., Chelius, M. K., Iniguez, A. L., Kaeppler, S. M., and Triplett, E. W. (2001).

Enhanced maize productivity by inoculation with diazotrophic bacteria. Aust. J. Plant

Physiol. 28:829-836.

Roos, I. M. M., and M. J. Hattingh. (1983). Scanning electron microscopy of Pseudomonas

syringae pv. morsprunorum on sweet cherry leaves. Phytopathol. Z. 108:18–25.

Rosenblueth, M., and Martinez Romero, E. (2004). Rhizobium etli maize populations and

their competitiveness for root colonization. Arch. Microbiol. 181:337-344.

Saucedo, O. (2005). Cultivos: sorgo granifero. UDG-110 variedad de sorgo de grano

blanco con adaptación tropical. Centro Agrícola, año 2005, no. 2, mayo-agosto,

90.

Schloter, M., and Hartmann, A. (1998). Endophytic and surface colonization of wheat roots

(Triticum aestivum) by different Azospirillum brasilense strains studied with strain-

specific monoclonal antibodies. Symbiosis 25:159-179.

Seghers, D., Wittebolle, L., Top, E. M., Verstraete, W., and Siciliano, S. D. (2004). Impact

of agricultural practices on the Zea mays L. endophytic community. Appl. Environ.

Microbiol. 70:1475-1482.

__________________________________________________________Bibliografía


Sessitsch, A., Howieson, J. G., Perret, X, Antoun, H., and MartínezRomero, E. (2002a).

Advances in Rhizobium research. Crit. Rev. Plant Sci. 21:323-378.

Sessitsch, A., Reiter, B., Pfeifer, U., and Wilhelm, E. (2002b). Cultivationindependent

population analysis of bacterial endophytes in three potato varieties based on

eubacterial and Actinomycetes-specific PCR of 16S rRNA genes. FEMS (Fed. Eur.

Microbiol. Soc.) Microbiol. Ecol. 39:2332.

Sevilla, M., Burris, R. H., Gunapala, N., and Kennedy, C. (2001). Comparison of benefit to

sugarcane plant growth and 15N incorporation following inoculation of sterile plants

with Acetobacter diazotrophicus wildtype and Nif–2 mutants strains.

Singh, B. K., Munro, S., Potts, J.M. and Millard, P. (2007). Influence of grass species and

soil type on rhizosphere microbial community structure in grassland soils. Applied Soil

Ecology 36, 147–155.

Somers, E., Vanderleyden, J., and Srinivasan, M. (2004). Rhizosphere bacterial signaling:

A love parade beneath our feet. Crit. Rev. Microbiol. 30:205-240.

Sprent, J. I., and James, E. K. (1995). N2-fixation by endophytic bacteria: Questions of

entry and operation. Pages 15-30 in: Azospirillum VI and Related Microorganisms. I.

Fendrik, M. del Gallo, J. Vanderleyden, M. de Zamaroczy (eds.). Springer-Verlag,

Berlin.

Sturz, A. V., and Nowak, J. (2000). Endophytic communities of rhizobacteria and the

strategies required to create yield enhancing associations with crops. Appl. Soil Ecol.

15:183-190.

Sturz, A. V., Christie, B. R., and Nowak, J. (2000). Bacterial endophytes: Potential role in

developing sustainable systems of crop production. Crit. Rev. Plant Sci. 19:1-30.

Sturz, A. V., Christie, B. R., Matheson, B. G., and Nowak, J. (1997). Biodiversity of

endophytic bacteria which colonize red clover nodules, roots, stems and foliage and

their influence on host growth. Biol. Fertil. Soils 25:13-19.

Smith, W. H. (1976). Character and significance of forest tree root exudates. Ecology

57:324-331.

Spaepen S, Vanderleyden J and Remans R (2007). Indole-3-acetic acid in microbial and

microorganism-plant signaling. FEMS Microbiol Rev 31: 425-448.

__________________________________________________________Bibliografía


Sundin, G. W. y Jacobs, J. L. (1999). Ultraviolet radiation (UVR) sensitivity analysis and

UVR survival strategies of a bacterial community from the phyllosphere of field-grown

peanut (Arachis hypogeae L.). Microb. Ecol. 38:27-38.

Suzuki, S., He, Y. And Oyaizy, H. (2004). Indole-3-acetic acid production in Pseudomonas

fluorescens HP72 and its association with suppression of creeping bentgrass brown

patch. Current Microbiology 47, 138–143.

Tan, Z., Hurek, T., and Reinhold-Hurek, B. (2003). Effect of N-fertilization, plant genotype

and environmental conditions on nifH gene pools in roots of rice. Environ. Microbiol.

5:1009-1015.

Torres-Gutiérrez, R. (2008). Phytoestimulatory effect of Rhizobium and Plant Growth

Promoting Rhizobacteria in common bean (Phaseolus vulgaris L.) interaction.

Dissertationes de Agricultura. PhD thesis, Katholieke Universiteit Leuven. 155 pp.

Tsiantos, J., and W. A. Stevens. (1986). The population dynamics of Corynebacterium

michiganense pv. michiganensis and other selected bacteria in tomato leaves.

Phytopathol. Mediterr. 25:160–162.

Van Noorden G.E. Ross JJ, Reid JB, Rolfe BG and Mathesius U (2006). Defective long-

distance auxin transport regulation in the Medicago truncatula super numeric nodules

mutant. Plant Physiol 140: 1494-1506.

Verma SC, Ladha JK & Tripathi AK (2001) Evaluation of plant growth promoting and

colonization ability of endophytic diazotrophs from deep water rice. J Biotechnol 91:

127–141.

Verma, S. C., Singh, A., Chowdhury, S. P., and Tripathi, A. K. (2004). Endophytic

colonization ability of two deep-water rice endophytes, Pantoea sp. and Ochrobactrum

sp. using green fluorescent protein reporter. Biotechnol. Lett. 26:425-429.

Weber, O. B., Baldani, V. L. D., Teixeira, K. R. S., Kirchhof, G., Baldani, J. I., and

Dobereiner, J. (1999). Isolation and characterization of diazotrophic bacteria from

banana and pineapple plants. Plant Soil 210:103113.

Zinniel, D. K., Lambrecht, P., Harris, N. B., Feng, Z., Kuczmarski, D., Higley, P., Ishimaru,

C. A., Arunakumari, A., Barletta, R. G, and Vidaver, A. K. (2002). Isolation and

characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomic crops and prairie

plants. Appl. Environ. Microbiol. 68:2198-2208.

influencia de aislados bacterianos endfitos sobre el

Documents