influenţa farmacoterapiei cu unii cationi bivalenţi asupra unor

2

CUPRINS I. STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII. 11

I.1. Stresul ca noțiune fiziopatologică. 12

I.1.1. Definiție şi istoric. 12

I.1.2. Clasificarea formelor de stres. 13

I.1.3. Implicații la nivel celular şi subcelular. Fiziopatologia stresului. 14

I.1.4. Mecanisme biochimice implicate în producerea stresului. 16

I.1.4.1. Modificări biochimice primare. 16

I.1.4.2. Proteine de stres. 17

I.1.5. Implicații în patologia umană. 22

I.2. Cationi bivalenți cu implicații în fiziopatologia stresului. 25

I.2.1. Clasificare. 25

I.2.2. Manganul. 26

I.2.2.1. Proprietăţi fizice, chimice şi biologice. 26

I.2.2.2. Rolul manganului în organismul uman şi animal. 40

I.2.2.3. Complecşi ai manganului cu acțiune superoxid dismutazica (SOD

mimici). 41

I.3. Stresul experimental. 47

I.3.1. Modele folosite în studiile farmacologice. 47

I.3.1.A. Modele experimentale de stres - stresori fizici. 47

I.3.1.B. Modele experimentale de stres - stresori chimici. 51

I.3.1.C. Modele experimentale de stres - stresori biologici. 53

I.3.1.D. Modele experimentale de stres - stresori psihologici. 53

I.3.1.E Stresul oxidativ. 56

I.3.1.F. Agenţi stresori genotoxici folosiți în studiul leziunilor ADN pentru

modelul Schizosaccharomyces pombe. 58

I.3.1.F.F.1.Agenţi genotoxici fizici. 58

I.3.1.F.F.2. Agenţi genotoxici chimici. 64

I.3.2. Modele experimentale de stres şi influenta oligoelementelor asupra

parametrilor biochimici şi funcționali. 68

I.3.3 Modelul Schizosaccharomyces pombe. 69

II. PARTEA PERSONALĂ. 76

II.1. Scopul şi structura studiilor. 77

II.1.1. Metode folosite . 79

II.2.A. Cercetări referitoare la influenţa risperidonei asupra unor cationi

plasmatici şi urinari în condiții normale şi de stres. 83

II.2.A.1. Introducere. 83

II.2.A.2. Material şi metodă. 83

II.2.A.3. Rezultate. 87

II.2.A.4. Discuții şi concluzii. 91

II.2.B. Corelarea patologiei psihiatrice cu stresul oxidativ. 91

II.2.B.1. Introducere. 91

3

II.2.B.2. Material şi metodă. 92

II.2.B.3. Rezultate. 95

II.2.B.4. Discuții şi concluzii. 97

II.3. Influenţa cationului de mangan asupra unor parametri biochimici în

diabetul zaharat aloxanic la şobolani. 100

II.3.1. Introducere 100

II.3.2. Material şi metoda 102

II.3.3. Rezultate 104

II.3.4. Discuții şi concluzii 107

II.4.A. Influenţa manganului asupra reactivității vasculare la șobolani. 109

II.4.A.1. Introducere. 109

II.4.A.2. Material şi metodă. 109

II.4.A.3. Rezultate. 116

II.4.A.4. Discuții şi concluzii. 116

II.4.B. Sistem de generare controlată a radicalilor liberi pentru studiul

reactivității vasculare sub acțiunea oligoelementelor. 117

II.4.B.1. Introducere. 117

II.4.B.2. Material şi metodă. 119

II.4.B.3. Rezultate. 120

II.4.B.4. Discuții şi concluzii. 122

II.5. Studiul compecşilor cu mangan SOD mimici pe un model

Schizosaccharomyces pombe cu deleţia genei SOD2. 123

II.5.1. Introducere. 123

II.5.2. Material şi metodă. 124

II.5.3. Rezultate. 140

II.5.4. Discuții şi concluzii. 149

II.6. Compuși ai manganului cu proprietăti potențiale SOD-mimice

peroxidaza/catalaza mimice. 152

II.6.1. Introducere. Compușii SOD mimici. 152




II.7. Metodă originală de cuantificare a proprietăţilor SOD-mimice pentru

combinaţiile complexe ale manganului folosind o tehnică de chemiluminescenţă

amplificată cu lucigenină.

169

II.7.1. Introducere. 169




II.8. Concluzii finale. 188

II.8.1 Aspectele originale ale lucrării 188

II.8.2. Perspective de cercetare 190

III. BIBLIOGRAFIE 192

4

INTRODUCERE

Noţiune fiziopatologică generală complexă, stresul este privit ca o reacţie de răspuns şi apărare a

unui sistem biologic asupra căruia se acţionează în sensul modificării oricărui parametru al homeostaziei

acestuia.

Toate tipurile de celule, chiar şi celulele individuale din organisme multi-celulare, au capacitatea de

a răspunde la schimbările condiţiilor de mediu. Astfel de răspunsuri necesită o complexa reţea de

detectare şi transducţie, de semnal, care să conducă la adaptări, celulelor în creştere şi proliferare, precum

şi ajustări ale programului expresiei genice, activităţi metabolice, şi alte caracteristici ale celulei.

Condiţiile de mediu, care ameninţă supravieţuirea unei celule, sau cel puţin împiedică funcţionarea

optimă, sunt denumite, în mod obişnuit, stres celular [1].

În funcţie de nivelul la care se manifestă agentul stresor, fiziopatologia stresului poate fi înțeleasă,

ca manifestându-se asupra întregului complex homeostatic, în cazul organismelor superioare sau asupra

celulei (indiferent dacă organismul este uni sau pluricelular).

Cele mai importante proteine implicate în mecanismele biochimice ale stresului se numesc

proteinele de şoc termic (heat shock proteins, HSP). În condiții normale, HSP se găsesc sub forma

inactivă în majoritatea celulelor, fiind monomeri sau dimeri. Activarea se poate face sub influenţa mai

multor tipuri de agenți stresori, care vor induce modificări conformaționale în structura proteinelor de

şoc. după activare, HSP vor fi translocate în nucleu unde vor induce transcripția pentru gene specifice,

legându-se la receptorul “heat shock element” sau HSE. Principala creștere a ARN-ului mesager se

observă chiar în cazul ARNm care codează HSP [2].

Legătura dintre mecanismele fiziopatologice şi stres se face în două sensuri: pe de o parte agenții stresori acuți sau cronici pot fi factori etiologici pentru patologii diverse şi pe de altă parte, orice situație

patologică poate fi privită ca un factor generator de stres pentru organism. Acest tip de corelare

bidirecțională, uneori cu caracteristici de amplificare în cascadă, a fost subliniată încă de la începutul

secolului, de către Walter Cannon and Hans Selye [3].

In ultimii ani s-a constatat o implicare masivă şi profundă a cationilor bivalenți în mecanismele de

adaptare la stres, cu legături directe sau indirecte în etiopatogenia unor afecțiuni declanșate de agenți stresori diverși.

Deoarece oricare dintre cationii bivalenți este implicat direct sau indirect în aceste mecanisme, o

primă clasificare ce se impune ţine cont de concentrațiile acestor cationi la nivelul diferitelor

compartimente celulare.

Aproximativ 31 de elemente din sistemul periodic al elementelor sunt considerate indispensabile

sau benefice vieții. Dintre acestea, cationii bivalenți ocupă un loc central şi pot fi impărţiţi după

concentraţia în care se găsesc în organismul uman: cationi prezenți în cantităţi mari (calciu, magneziu,

etc.) şi cationi prezenți în cantităţi infime - oligoelementele - (zinc, nichel, mangan, etc.).

Manganul este considerat un oligoelement esenţial sistemelor vii şi deşi funcţiile sale biologice au

fost studiate extensiv, rămân în continuare o serie de necunoscute legate de mecanismele intime prin care

acest mineral funcţionează drept cofactor enzimatic, corelaţiile dintre intoxicaţia cronică şi simptomele

neurologice sau mecanismele de acţiune pentru unele potenţiale medicamente bazate pe combinaţii

complexe ale manganului.

Multă vreme rolurile biologice ale manganului au fost ignorate, pentru ca după aceea să fie

considerat doar un eventual înlocuitor al magneziului (cation cu care prezintă într-adevăr câteva

similitudini structurale şi pe care îl poate înlocui în anumite reacţii biochimice), însă e suficient sa ne

gândim că animalele de experienţă care au deleţia genei responsabile de sinteza Mn-SOD mitocondrial nu

reuşesc sa depăşească durata de o saptămană de viață, ca să înţelegem importanţa acestui oligoelement

esenţial şi indispensabil sistemelor vii [4].

Superoxid dismutaza mitocondrială mangan-dependentă reprezintă una dintre cele mai importante

enzime cu rol antioxidant din organism, fiind prezentă în mitocondriile tuturor celulelor eucariote dar şi în

citoplasma celulelor procariote, chiar organisme anaerobe. Rolul enzimatic este acela de a dismuta

anionul superoxid format în condiţiile vieţii aerobe în peroxid şi oxigen molecular: (O-) (O

2-) + (O2

0)

[5].

5

Numeroase studii au evidențiat eficacitatea terapeutică a superoxid dismutazei: injectarea locala a

SOD pare a fi o terapie promițătoare în poliartrita reumatoidă şi protecția antiradiaţii [6,7], practic în

orice patologie care are în componenţă stresul oxidativ. În orice caz, în multe alte situații, rezultatele

studiilor clinice şi a altor studii în vivo s-au dovedit dezamăgitoare pentru că, la fel ca orice proteină,

SOD are multe neajunsuri din punct de vedere al administrării şi al stabilității. Eforturile de a îmbunătăţi

proprietățile farmacocinetice ale SOD au inclus încapsularea în lipozomi sau conjugarea cu polietilen

glicol cu masa moleculară mare. Datorită rezultatelor echivoce obținute, a crescut în ultimii ani interesul

de a obține compuși sintetici care mimează activitatea SOD, şi care au în schimb proprietăţi

farmacologice mult mai atrăgătoare decât enzima brută : mai ieftine, mai stabile şi cu posibilitatea

administrării orale.

CONTRIBUŢII PERSONALE

Studiile din această lucrare de doctorat au urmărit influenţa stresului (atât ca noțiune fiziopatologică

complexă – aplicabilă întregului organism cât şi ca fenomen celular, cu mecanisme moleculare bine

definite) asupra homeostaziei unor oligoelemente, în special a cationului de mangan. Legătura dintre stres

şi oligoelemente s-a urmărit bidirecțional: pe de o parte – influenţa oligoelementelor asupra

fiziopatologiei stresului (evidenţiată prin modificările parametrilor biochimici şi funcţionali atât la

microorganisme cât şi la macroorganisme) şi pe de altă parte modificările concentrațiilor

oligoelementelor induse de stres – rezultat ca urmare a patologiilor declanşatoare sau folosind variate

modele experimentale.

Între mineralele luate în studiu (cupru, zinc, mangan, calciu, magneziu) manganul a reprezentat

ţinta principală, fiind analizat atât ca ion simplu prezent în diverse produse biologice (ser, urină) cât şi ca

element central al unor combinaţii complexe cu potenţiale roluri catalitice şi biologice.

Pentru realizarea obiectivelor, s-au folosit mai multe tipuri de modele biologice, mai multe modele

de stres experimental sau situații care declanșează mecanisme de stres şi diverse variante de determinări

legate direct sau indirect de subiectul tezei (figura 1).

Modele folosite în studii:

- Pacienți cu patologie psihiatrică (capitolul II.2).

- Animale de experiență: șobolani rasa Wistar (capitolele II.2, II.3 şi II.4).

- Organisme unicelulare eucariote din clasa drojdiilor: Schizosaccharomyces pombe (capitolul II.5).

- Modele chimice de generare a anionilor superoxid: alopurinol + xantin oxidaza, xantina + xantin

oxidaza, menadiona în medii de cultura, aloxan, menadiona iradiata cu UV, etc (capitolele 3, 4, 5, 6 şi7).

- Modele chimice de generare a radicalilor peroxid (capitolul II.6).

Stresul experimental a fost obținut sau măsurat intr-o varietate de situații: - Stres de contenţie (capitolul II.2).

- Stres oxidativ indus chimic sau fotochimic (capitolele II.3, II.4, II.6 şi II.7).

- Stres oxidativ datorat patologiilor asociate (capitolele II.2, II.3 şi II.5).

- Stres termic acut sau cronic (capitolul II.5).

6

Figura 1: Structura generală a studiilor realizate.

II.1.1. Metode folosite

Determinările efectuate în cadrul studiilor (prezentate pe larg în cadrul capitolelor parții personale)

au acoperit o paletă largă de analize biochimice şi fiziologice, sistematizabile în 5 grupuri mari:

- Determinări ale concentrațiilor oligoelementelor şi mineralelor în ser, plasmă sau urină, folosind

tehnici de flamfotometrie sau absorbție atomică cu cuptor de grafit.

- Determinări ale markerilor de stres oxidativ, folosind tehnici de spectrofotometrie sau

chemiluminescenţă.

- Determinări ale reactivității vasculare folosind tehnici de miografie computerizată.

7

- Determinări ale supraviețuirii organismelor Schizosaccharomyces pombe (manipulate genetic în

prealabil – tehnici PCR, electroforeza ADN) folosind tehnici de chemiluminescenţă, coloraţie vitală sau

spot test.

- Determinări ale eficacității unor săruri sau complecși ai manganului cu proprietăţi superoxid

dismutazice, folosind tehnici de chemiluminescenţă.

Prima jumătate a părţii personale (capitolele II.2, II.3 şi II.4) a încercat o analiză mai largă a

legăturii dintre oligoelemente si patologia care cuprinde mecanisme variate de declanșare a stresului.

Situaţiile generatoare de stres au inclus atât afecțiuni din sfera psihiatrică cat si modele specifice realizate

pe loturi de animale.

Partea finală a tezei s-a centrat pe oligoelementul mangan privit din punct de vedere al rolului de

cofactor enzimatic pentru superoxid dismutaza mitocondrială mangan dependentă. Modelul central de

stres în acest caz a fost stresul oxidativ, deoarece superoxid dismutaza mitocondrială reprezintă elementul

primar de apărare împotriva acestui tip de stres. Ionul de mangan folosit în studii a fost utilizat ca atare

(săruri care disociază în soluție apoasă), sub formă de săruri organice cu compuși antioxidanți sau sub

formă de complexe ale manganului. S-au investigat funcțiile peroxidaza-like şi superoxid dismutaza-like

în vitro sau pe modele biologice, cu ajutorul metodelor dedicate sau a unor metode originale, puse la

punct în această lucrare.

Partea de evaluare a fost precedată de etapele de sinteză pentru unii dintre compușii manganului

care au inclus şi protocoale de purificare. Partea de evaluare a fost făcuta şi pe modele care conțin diferite

protocoale de stres, de etiologii diverse sau prin determinarea supravieţuirii unui organism unicelular

eucariot modificat genetic, modelul Schizosaccharomyces pombe.

Software-ul folosit în cadrul studiilor a fost: SPSS 17 şi Microsoft Excel 2010 pentru studiile

statistice; Grapher 7 şi Graph Pad Prism 5 pentru realizarea graficelor şi determinarea ariilor de sub curbă

şi Origin - Microcal Software pentru prelucrarea datelor experimentale din studiul reactivității vasculare.

Prelucrarea statistică a datelor s-a efectuat folosind media aritmetică, abaterea standard (DS) sau

coeficientul de variabilitate (%).

Pentru prelucrarea statistică a datelor s-a utilizat testul t-Student, corelaţia Pearson, sau corelaţia

Chi-Square.

Pentru determinarea ariilor de sub curbă, valorile obţinute au fost exportate din Microsoft Excel în

Grapher 7 şi rezultatele obţinute au fost verificate cu programul Graph Pad Prism 5.

II.2. A. Cercetări referitoare la influenţa risperidonei asupra unor cationi plasmatici şi

urinari în condiții normale şi de stres

II.2.A.1. Introducere

Studiul prezent a urmărit influenţa unor antipsihotice asupra concentrațiilor serice şi urinare a unor

cationi bivalenți în condiții normale şi de stres la șobolani şi la pacienţi cu patologie psihiatrică.

II.2.A.2. Material şi metodă

S-a lucrat pe pacienţi cu schizofrenie paranoida si cu loturi de câte 8 șobolani Wistar, adulți, de

ambele sexe, cu greutate de 175 – 180 g, crescuți în condiții obișnuite de laborator şi alimentați identic.

Lotul I a fost lot de control şi nu a primit nici o substanță, fiind menținut în condiții obișnuite de

laborator (hrană şi apă ad libidum, fără privare de somn, la temperatura camerei - 200C). Lotul II a fost

păstrat în aceleași condiții ca şi lotul I dar a primit risperidonă (Rispolept ®) 0.25 mg/kg/zi pe sonda

intragastrică, timp de 14 zile. Lotul III a fost supus unui stres de contenţie la temperatura camerei, cu

durata de 180 min/zi, 4 zile consecutiv. Lotul IV a fost supus unui stres similar dar a primit cu 2 ore

înainte de imobilizare risperidona 0,25 mg/kg/zi pe sondă endogastrică.

Înainte de stres şi de administrarea risperidonei s-a determinat concentrația plasmatica şi urinara a

calciului total, magneziului total, cuprului, manganului şi a zincului.

II.2.A.3. Rezultate

In urma aplicării analizei cationilor, rezultatele au fost reprezentate grafic pentru valorile cuprului,

zincului, calciului, magneziului si manganului, serice, urinare sau eritrocitare (figurile 2 - 7):

8

Figurile 2-4: 2-influenţa terapiei cu haloperidol (3 săptămâni) asupra nivelurilor serice de cupru şi

zinc la pacienţi cu schizofrenie paranoidă; 3-influenţa terapiei cu haloperidol si risperidonă asupra

nivelurilor serice si eritrocitare a magneziului la pacienţi cu schizofrenie paranoidă; 3-variatii ale

concentratiilor serice pentru zinc si cupru la sobolan sub actiunea risperidonei (0,25 mg/kgc/zi, 14 zile)

2

3

4

9

Figurile 5–7: Variații ale concentrațiilor pentru magneziu si zinc seric (figura 5), calciu şi

magneziu seric (figura 6) sau mangan seric si urinar (figura 7) la șobolan sub acțiunea risperidonei (0,25

mg/kgc/zi, 14 zile) şi a stresului de contenţie.

7

5

6

10

II.2.A.4. Discuții şi concluzii

Datele noastre arată că risperidona 6 mg/zi per os şi haloperidolul 8 mg/zi, 28 de zile, administrată

la pacienți cu schizofrenie paranoidă creşte semnificativ concentrația zincului plasmatic şi pe cea a

magneziului intraeritrocitar şi reduce moderat concentrația cuprului plasmatic [8,9]. În cazul manganului

se observă o scădere a cationului în ser şi creşterea acestuia în urină. O explicatie posibila se bazează pe

modificările de la nivel mitocondrial care pot sa apară ca urmare a stresului sau chiar ca efect secundar al

antipsihoticului. Rezultatele obținute după administrarea de 14 zile a risperidonei la șobolan concordă

numai parțial cu datele obținute la bolnavii cu schizofrenie.

Considerăm că variațiile concentrațiilor celulare şi plasmatice ale unor cationi ar putea fi implicate

în producerea efectelor farmacoterapice ale unor compuși cu proprietaţi antipsihotice.

II.2. B. Corelarea patologiei psihiatrice cu stresul oxidativ

II.2.B.1. Introducere

In acest capitol sunt prezentate rezultatele masuratorilor enzimelor ce țin de apărarea periferică

antioxidantă (SOD şi GPX) cat şi valorile MDA la pacienții cu MCI şi AD ("mild cognitive impairment"

– MCI; demenţa Alzheimer - AD) comparativ cu un lot martor de pacienți cu aceeași vârstă.

II.2.B.2. Material şi metoda

Pacienții din studiul prezent (45 de subiecți) au constituit 3 grupuri: 15 pacienți cu MCI (5 - sex

feminin, 10 - sex masculin, vârsta - 63.2 ± 4.2 ani), 15 pacienți cu AD (6 - sex feminin, 9 - sex masculin,

vârsta - 65.8 ± 3.9 ani) şi 15 aparent sanatosi (lotul martor, 7 - sex feminin, 8 - sex masculin, vârsta - 6252

± 3.4 ani). Pacienții au fost recrutați de la Spitalul Universitar de Psihiatrie Socola - Iași. Statusul cognitiv şi mental a fost analizat cu ajutorul "Mini-Mental State Examination" (Control

26±0.5; MCI 22.2±0.3; AD 18.5±0.3) şi "Alzheimer’s Disease Assessment Scale-Cognitive" (ADAS-

Cog) (Control 7±0.2; MCI 14±0.4; AD 18.5±0.3) [10,11]. Pacienții cu AD au îndeplinit pe deplin

criteriile NINCDS şi ADRDA [12], în timp ce pacienții diagnosticați cu MCI au respectat criteriile lui

Petersen şi colab., legate de procesele memoriei, abilităţile generale cognitive şi funcționale şi absenţa

vreunui diagnostic de demenţă în antecedente [13,14]. Rezultatele activității antioxidante măsurate prin

metodele descrise mai sus, au fost analizate statistic cu ajutorul ANOVA.

II.2.B.3. Rezultate

Analizele biochimice au arătat o descreștere similară pentru principalele enzime cu rol antioxidant

(SOD şi Gpx) şi o creștere semnificativă a markerului de peroxidare lipidică (MDA) pentru serul

pacienților cu AD şi MCI, comparativ cu lotul de control. Figura 8 arată o scădere a activității SOD

(F(2,42) = 21, p < 0.0004) în serul pacienților cu MCI (n = 15) şi AD (n = 15).

Figura 8: Activitatea superoxid dismutazei serice pentru loturile AD, MCI şi Control. Valorile

reprezintă media a 15 determinări (15 pacienți/grup), **p < 0.0004 faţă de lotul Control.

11

Analiza statistică remarcă atât scăderea SOD faţă de lotul martor cat şi lipsa de diferența dintre

loturile AD şi MCI.

Analiza valorilor glutation peroxidazei evidențiază o scădere semnificativă a activității acestei

enzime F(2,42) = 54, p < 0.0001) în serurile lotului MCI cât şi a lotului AD, comparativ cu lotul martor.

La fel ca şi în cazul valorilor superoxid dismutazei, valorile intre loturile MCI şi AD nu diferă

semnificativ intre loturi (figura 9).

Figura 9: activitatea glutation peroxidazei serice pentru loturile AD, MCI şi Control. Valorile

reprezintă media a 15 determinări (15 pacienți/grup), ***p < 0.0001 faţă de lotul Control.

Din punct de vedere al peroxidarii lipidice, s-a constatat o creștere semnificativă a nivelurilor

malondialdehidei pentru loturile MCI şi AD (F(2,42) = 90, p < 0.0005), comparativ cu lotul de control

(figura 10). Pentru acest tip de marker au apărut diferențe semnificative şi intre cele doua loturi cu

patologie psihiatrică, lotul MCI având o creștere evident mai mare a valorilor MDA comparativ cu lotul

AD (p < 0.0002).

Figura 10: nivelurile malondialdehidei serice pentru loturile AD, MCI şi Control. Valorile

reprezintă media a 15 determinări (15 pacienți/grup), ***p < 0.0005 faţă de lotul Control.

Studiul statistic prin regresie liniară a sugerat o corelare a valorilor Gpx cu MDA, SOD cu MDA

sau Gpx cu SOD (figura 11 A, B şi C). Nu s-au observat legături intre valorile oricărui marker de stres

oxidativ şi vârstă sau sexul subiecților luați în studiu.

12

Figura 11: Corelarea dintre glutation peroxidază vs. superoxid dismutază (A), glutation peroxidază

vs. malondialdehidă (B) şi superoxid dismutază vs. Malondialdehidă (C), în lotul de control (▲), MCI (●)

şi AD (■).

II.2.B.4. Discuții şi concluzii

In studiul prezent s-au măsurat nivelurile unor markeri ai stresului oxidativ în patologia psihiatrică

din clasa demenţelor, având în vedere legătura dintre concentrațiile unor cationi şi evoluția bolii pe de o

parte şi influenta risperidonei ca antipsihotic de rezervă asupra parametrilor stresului oxidativ pe de altă

parte. Evidențierea modificărilor descrise deschide noi drumuri de analiză a influenţei tratamentului cu

antipsihotice şi/sau suplimentarea tratamentului cu minerale de tip cationi bivalenți (magneziu, mangan,

cupru, zinc, etc) pentru o astfel de patologie. Un aspect interesant il constituie deci şi eventualele corelații cu parametrii stresului oxidativ în noile condiții, atât timp cat acest tip de stres pare sa joace un rol

important în etiopatogenia demenţelor, atât în faza incipientă cat şi în faza avansată.

Datele obținute arată pentru prima dată că o exacerbare a stresului oxidativ apare atât în fazele

prodromale ale demenţei (MCI) cât şi în fazele avansate în care diagnosticul este de certitudine (AD), cu

aceeași intensitate. Studii anterioare au generat rezultate contradictorii legate de modificarea balanței

apărare-stres oxidativ în diverse boli neurodegenerative. Principalul beneficiu al studiului actual poate

veni din zona soluțiilor terapeutice. De vreme ce stresul oxidativ joacă un rol important în astfel de

afecțiuni psihiatrice, prima abordare logica a terapiei specifice ar putea fi introducerea de adjuvanți cu

proprietaţi antioxidante [15,16]. şi pentru ca superoxid dismutaza mitocondrială mangan dependentă

reprezintă primul şi cel mai important jucător în acest sistem, rezultate spectaculoase s-ar putea obține din

partea compușilor cu mangan cu proprietaţi SOD mimice. Aceștia vor trebui sa aibă atât o constantă de

cataliză apropiată de enzima naturală cat şi disponibilitatea de a trece bariera hemato-encefalică pentru a

putea fi utili la nivelul potențialelor leziuni din demenţa Alzheimer. O alta abordare, legată de cofactorul

glutation peroxidazei, este suplimentarea cu seleniu [17]. Pe de alta parte, trebuie remarcat că

introducerea în terapie a unor antioxidanți obișnuiți, fara posibilitatea de traversare a barierei hemato-

encefalice, a rămas fara rezultatele scontate: vitamina E [18], gingo biloba [19] sau curcumina [20].

Rezultate pozitive după o terapie antioxidantă care sa țintească sistemul nervos central şi mitocondriile, ar

putea fi obținute mai ales pentru pacienții cu MCI, unde indicii de peroxidare lipidica ne arată că procesul

distructiv este încă la început. Şi în acest caz, compușii artificiali cu mangan cu proprietăţi SOD mimice

vor reprezenta principalii candidați pentru terapia adjuvantă.

13

II.3. Influenţa cationului de mangan asupra unor parametri biochimici în diabetul zaharat

aloxanic la şobolani

II.3.1. Introducere

Scopul studiului a fost testarea eficacității clorurii de mangan, administrată pe modelul

experimental al diabetului aloxanic, în condițiile în care este binecunoscută poziția cationului de mangan

în apărarea antioxidantă, reprezentând cofactorul superoxid dismutazei mitocondriale.

Ca elemente de cuantificare a acțiunii cationului, s-au ales: determinarea capacitații antioxidante

totale (care reflectă cel mai bine o eventuală modificare globală a statusului antioxidant) şi determinarea

concentrației serice a malondialdehidei (care e proporționala cu gradul de peroxidare lipidică).

II.3.2. Material şi metodă

Determinările s-au realizat în condiţiile respectării GLP (Good Laboratory Practice) ale Uniunii

Europene (European Council for Clinical and Laboratory Standards, 2002).

Diabetul experimental a fost declanșat cu aloxan (Sigma) pentru loturile II şi III (la concentrația de

110 mg/kgc), s.c., în injecție unică. Confirmarea declanșării diabetului s-a făcut prin măsurarea glicemiei

la 1h, 24h, 48h, 72h, prin metoda enzimatică cu glucozoxidază (kit BioSystems, Spania).

S-au urmărit pe parcursul primelor 4 zile de la declanșarea diabetului, doi parametri biochimici:

capacitatea antioxidantă totală (TAS) şi concentrația serică a malondialdehidei (MDA).

Determinarea TAS s-a făcut printr-o metodă chemiluminometrică (sistemul luminol – horseradish

peroxidase) pe un aparat Berthold Lumat 9507 (Germania): este măsurată în dinamică emisia luminoasă

constantă rezultată din reacția de descompunere a luminolului cu apa oxigenată, în prezenţa peroxidazei

din hrean (catalizator) şi a para-iod-fenolului (amplificator) [21,22].

Determinarea MDA s-a făcut prin metoda colorimetrică cu acid tiobarbituric (ATB) [23].

II.3.3. Rezultate şi discuții Valorile medii ale glicemiei pentru cele patru loturi, releva creșterea semnificativă, peste valorile

normale, pentru loturile tratate cu aloxan, creștere care se accentuează pe parcursul celor patru zile ale

experimentului. (Figura 12). Nu s-a obținut o reducere evidentă a glicemiei în urma administrării orale a

clorurii de mangan.

Figura 12: Creșterea glicemiei este semnificativă pentru loturile tratate cu aloxan şi nu există o

modificare netă a valorilor în cazul asocierii cu mangan.

Valorile capacitații antioxidante totale nu s-au modificat semnificativ pentru loturile aloxan –

aloxan-mangan, existând o diferență evidentă doar intre aceste loturi şi cele martor (Figura 13).

0

100

200

300

400

500

600

700

1 2 3 4Ziua

Glic

emia

(mg/

dl)

Lot martor Lot aloxan Lot aloxan-mangan Lot mangan

14

Figura 13: Există o scădere semnificativă a TAS la loturile tratate cu aloxan faţă de martori dar

suplimentarea cu mangan nu a modificat semnificativ valorile obținute.

Determinarea MDA a arătat o reducere a peroxidarii lipidice, atât în cazul comparării loturilor

tratate cu aloxan faţă de martori cat şi în cazul lotului care a primit mangan şi aloxan faţă de lotul cu

aloxan (Figura 14).

Figura 14: Există o creștere semnificativă a MDA la loturile tratate cu aloxan faţă de martori (p <

0.05) şi suplimentarea cu mangan a scăzut valorile obținute pentru loturile cu diabet experimental (p <

0.05).

Există studii care prezintă cationul de mangan ca un compus cu acțiune insulin-like [24], reducând

în acest fel nivelul stresului oxidativ indus de diabetul zaharat. Mecanismele implicate acționează prin

influențarea nivelului mesagerilor secunzi, creșterea transportului de glucoză la nivelul țesutului adipos,

intervenția în sinteza insulinei la nivelul celulelor β încă valide, potențarea acțiunii nivelurilor scăzute de

insulină sau prin modularea profilelor metabolice consecutiv modificării enzimelor şi a sintezei de lipide

[25].

O posibilă asemănare cu alți cationi bivalenți (magneziu, zinc) ar putea explica o serie din acțiunile

biochimice ale manganului, un exemplu fiind posibilitatea înlocuirii ionului de magneziu în reacțiile

catalizate de unele kinaze. în același timp, excesul de mangan ar putea mari activitatea enzimelor mangan

– dependente, crescând stabilitatea acestora [25]. Deși era de așteptat ca statusul antioxidant sa se

îmbunătăţească şi peroxidarea lipidică să scadă odată cu scăderea hipoglicemiei, după incarcarea cu acest

cation a animalelor cu diabet experimental, rezultatele arată doar o scădere a MDA serice. Explicația ar

putea fi dată de studii care sugerează ca reducerea glicemiei nu se mai obține la modelele experimentale

în care nu exista un procent suficient de celule β-pancreatice funcționale, ca exemplu fiind citat modelul

diabetului aloxanic la șobolani [26].

0

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

1 2 3 4Ziua

TAS

(Eq

Trol

ox)


0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

5

1 2 3 4Ziua

MD

A (n

g/m

l)


15

In aceste condiții, doar o mică parte din perturbările biochimice ale modelului ales vor fi afectate de

suplimentarea orală cu mangan şi în consecință, statusul antioxidant total va suferi modificări minore,

nesemnificative. Pe de altă parte, este posibil ca în condițiile experimentale din acest studiu să conteze în

primul rând protecția antioxidantă împotriva aloxanului. În aceste condiții, ionul de mangan nu poate să

deţină roluri asemănătoare cu ionul de zinc (cunoscut ca modulator al funcției pancreatice într-o

multitudine de studii, inclusiv la nivelul structurii insulinei şi mecanismului de eliberare a hormonului).

Singurul rol al manganului care l-ar putea face eligibil în ameliorarea diabetului aloxanic ar fi cel de

suplimentare al funcției superoxid dismutazelor de la nivelul celulelor beta pancreatice.

II.3.4. Concluzii

Suplimentarea cu mangan în diabetul zaharat experimental nu a determinat o reducere semnificativă

a valorilor glicemiei. Explicația acestui rezultat este pusă pe seama distrugerii masive a celulelor beta-

pancreatice, cele mai susceptibile la atacul radicalic produs de administrarea aloxanului.

Pe de altă parte, alte studii arată că diabetul zaharat de tip autoimun poate fi substanțial ameliorat cu

ajutorul compușilor SOD mimici bazați pe complexe ale manganului cu porfirine [27]. Cel mai probabil,

compușii cu mangan ar putea îmbunătăţi constantele biochimice din diabetul zaharat dacă sunt respectate

două condiții: administrarea manganului ar trebui sa fie sub formă de complecși cu proprietăţi SOD

mimice pronunțate (deși ionul de mangan 2+ din clorura manganoasă are proprietăţi catalitice de

dismutare a anionului superoxid, constanta sa de cataliză nu se poate compara cu cea a unei porfirine

complexată cu mangan, de exemplu) şi diabetul experimental generat ar trebui sa fie mai puțin agresiv, cu

un grad de destrucție al celulelor beta pancreatice mult mai mic (distrugerea masiva a celulelor beta duce

la dispariția țintei celulare asupra căreia ar putea acționa compusul cu mangan).

Cu toate că manganul a scăzut nivelul peroxidarii lipidice, s-a constatat o lipsă a unei modificări

semnificative în cazul capacitații antioxidante totale. TAS a fost influențată de stresul indus de aloxan,

fără ca suplimentarea cu mangan sa crească valorile capacitații antioxidante în ser.

II.4.A. Influenţa manganului asupra reactivităţii vasculare la şobolani.

II.4.A.1. Introducere

Studiul urmărește să analizeze influenţa ionilor de mangan liberi (nelegați în complexe) asupra

reactivității vasculare, atât în condiții normale cât şi intr-un model realizat pe șobolani în care agentul

stresor pentru vase a fost aloxanul administrat în vederea inducerii diabetului, stresului oxidativ şi

arteriopatiei diabetice. S-au căutat efectele manganului atât pentru concentrații fiziologice cât şi pentru

concentrații apropiate de cele toxice. În partea a doua a studiului, a fost pus la punct un dispozitiv care

este capabil sa genereze anioni superoxid intr-o manieră precisă şi controlată, folosind radiația

ultravioletă. În acest fel se poate cuantifica mai precis influenţa manganului la diferite concentrații asupra

vaselor normale sau afectate de arteriopatia diabetică.

II.4.A.2. Material şi metodă

Pentru toate experimentele au fost utilizaţi şobolani Wistar masculi adulţi, cu greutate de 180-220

g. Animalele au fost găzduite în cuşti individuale, la o temperatură de 23 ± 2ºC, ciclu nictemeral de 12-12

ore, cu hrană şi apă la discreţie.

Animalele au fost împărţite în următoarele loturi:

- Lot martor (animalele au fost ținute în condiții ideale)

- Lotul care a primit clorura de mangan per os (3, 4 sau 10 mg/kgc/zi, timp de 7 – 10 zile)

- Lotul care a primit o doză unică de aloxan la concentrația de 110 mg/kgc, s.c. Confirmarea

declanșării diabetului s-a făcut prin măsurarea glicemiei la 1h, 24h, 48h, 72h, prin metoda enzimatică cu

glucozoxidaza (kit BioSystems).

- Lotul cu diabet aloxanic care a primit clorura de mangan per os (3 mg/kgc/zi, timp de 7 zile).

II.4.A.3. Rezultate

Mecanismele modificărilor induse de administrarea cronică de Mn asupra reactivității vasculare.

16

Studiile efectuate pe lotul de șobolani care a primit aloxan au arătat că ionul de mangan nu induce

modificări majore la nivelul reactivității vasculare. Studii anterioare [28] au analizat efectul administrării

de Mn (MnCl2 3 mg/kg, 7 zile), la şobolani sănătoşi şi cu diabet indus de aloxan şi s-a constatat că nu

există o corelaţie între influenţa cationului de mangan asupra glicemiei şi asupra capacităţii antioxidante

totale. Animalele au fost sacrificate pentru studiul activităţii contractile în fragmente inelare din aortă şi

din artere mezenterice mici, în condiţii izometrice. Atunci s-a constatat că relaxarea endoteliu-dependentă

indusă de carbacol (10-5

M) ar putea fi afectată de mangan. Studiul a fost reluat asupra şobolanilor

sănătoşi, prin administrarea unei doze crescute de Mn (MnCl2 10 mg/kg, 7 zile) şi s-a constatat reducerea

până la dispariţie a relaxării endotelio-dependente în ambele tipuri de vase, fără modificări privind

efectele induse de K 40 mM, fenilefrină 10-5

M, nitroglicerină 10-6

M, metoxi-verapamil (D600) 10-5

M.

II.4.A.4. Discuții şi concluzii

Datele indică apariţia unor efecte toxice ale cationului de mangan bivalent asupra endoteliului la

doze mult sub cele recunoscute ca având efecte toxice hepatice şi neurale. În artere de rezistenţă

componenta EDHF a relaxării endotelio-dependente (în prezenţă de 0,01 mM L-NAME şi 0,01 mM

indometacin) a fost crescută, compensând parţial afectarea de către Mn a relaxării dependente de oxidul

nitric [29]. Modificarea aportului de mangan influenţează reactivitatea vasculară probabil legat de faptul

că manganul este un co-factor pentru arginază. Deficienţa de mangan creşte răspunsul contractil alfa1-

adrenergic arterial şi reduce relaxarea indusă de nitroprusiat şi acetilcolină printr-un mecanism COX-

dependent [30], efecte care nu pot fi legate de faptul că manganul este un co-factor pentru arginază, care

explică creşterea contradictorie a relaxării endotelio-dependente în aorta de şobolan în deficienţa de

mangan [31].

Deși la concentrații fiziologice ionii de mangan par a nu influenţa reactivitatea vasculară, atât în

cazul vaselor normale cât şi în cazul vaselor afectate de diabetul aloxanic, prezenţa acestui oligoelement

în concentrații apropiate de doza toxică sau care o depășesc induce modificări majore ale reactivității vasculare. Aceste modificări apar deci şi la concentrații mai mici ale manganului, concentrații la care

oligoelementul nu este considerat toxic pentru alte organe sau țesuturi.

II.4.B. Sistem de generare controlată a radicalilor liberi pentru studiul reactivității vasculare

sub acțiunea oligoelementelor

II.4.B.1. Introducere

Sistemul (figura 15) folosește un compus cu structură chinonică, (derivat al vitaminei K –

menadiona) care poate genera specii reactive ale oxigenului (preponderent radical superoxid) daca este

iradiat cu UV la 365 nm. Nivelul radicalilor liberi generați este proporțional în anumite limite cu timpul

de iradiere.

După iradierea soluției de menadionă aceasta a fost combinată cu o soluție de lucigenină care are

proprietatea de a emite lumină numai în prezenţa radicalului superoxid.

II.4.B.2. Material şi metodă

Toți compușii folosiți (menadiona, lucigenina, soluțiile tampon PBS şi Krebs) provin de la Sigma.

Chemiluminometrul este Berthold Lumat LB 9501 cu doua injectoare (Wildbad, Germania).

Soluția de menadionă pentru lucru s-a realizat în ser Krebs, la o concentrație de 500 uM. Pentru

aceasta, s-a realizat o soluție stoc de menadionă în etanol absolut, 50 mM (34.5 mg menadionă dizolvate

la cald în 4 ml alcool absolut). Soluția de lucru s-a obținut prin dizolvarea a 100 ul soluție stoc în 9900 ul

ser Krebs (diluție 1/100).

Soluția de lucigenină s-a obținut prin amestecul a 100 ul soluție stoc lucigenină (5,1 mg lucigenină

dizolvată în 100 ml tampon PBS – pH 7,4) cu 100 ul tampon glicină – pH 10,5. pH-ul bazic final este

necesar reacției de chemiluminescenţă dar nu interferă cu pH-ul serului Krebs folosit în studiile de

reactivitate vasculară.

Semnalul chemiluminescent obținut din soluția de lucigenină la pH alcalin a fost 1144 RLU (4

determinări – 1194, 1106, 1119, 1157) şi reprezintă background-ul sistemului de chemiluminescenţă.

17

Iradierea cu UV la 365 nm s-a realizat cu ajutorul unei lămpi Wood intr-o incintă prevăzută cu o

fantă de 2 cm2, de la distanţa de 1 cm faţă de sursă, puterea luminoasă obținută astfel fiind de 2W/cm

2.

II.4.B.3. Rezultate

Verificarea şi calibrarea metodei

Înregistrările chemiluminescenţei s-au făcut la 300C, timp de 2 secunde, la 3 secunde după iradiere.

(tabelul 1).

Tabelul 1: valorile medii a câte 3 determinări pentru timpi de iradiere diferiți exprimate în RLU

(relative light units) sau valori ale absorbanţei.

Nr crt Reactiv (200 µM) Valoare RLU/Abs

1 menadionă neiradiată 4100/0.093

2 menadionă iradiată 20 de secunde 9190/0.197



Se observă o dependenţă liniară a generării radicalilor liberi faţă de timpul de iradiere a menadionei.

Menadiona neiradiată ridică semnalul chemiluminescent probabil din cauza faptului ca la astfel de

concentrații devine slab generatoare de radicali liberi şi în lipsa stimulului UV.

Figura 15: Schema dispozitivului realizat pentru studiul reactivității vasculare sub acțiunea

stresului oxidativ controlat prin iradiere UV.

Detecția superoxidului prin colorimetrie cu WST-1

S-a folosit un kit pentru detecția superoxid dismutazei bazat pe reacția de culoare a compusului

WST-1 (un derivat al sării de nitro-blue-tetrazolium) în prezenţa radicalului superoxid (Fluka, 19160).

Diferența impusă de tipul de măsurătoare a constat în eliminarea sistemului propriu de generare a

radicalilor superoxid şi folosirea noului sistem iradiat la intervale diferite de timp. Rezultatele obținute au

fost aproape perfect superpozabile peste cele obținute prin chemiluminescenţă

Testarea sistemului pentru studiul reactivității vasculare

În experimente separate, s-a pregătit același protocol de iradiere folosind în baia de organ o soluție

Krebs-Henseleit (cu un adaos de menadionă 0.5 mM). În această soluție s-au introdus imediat inele de

artera mezenterică de la șobolan care s-au montat, s-au echilibrat şi s-au conectat la un miograf legat la

calculator. Folosind procedura stresului oxidativ controlat, a fost posibilă inducerea unei disfuncții endoteliale, fără afectarea răspunsului contractil (stimulată de epinefrină, de concentrații mari de potasiu

extracelular sau de relaxarea endotelio-independentă indusă de nifedipină). Folosind inhibitori de nitric

oxid sintază sau ciclooxigenază, s-a constatat că reducerea relaxării endotelio-dependente este legată de

18

reducerea biodisponibilitaţii oxidului nitric. Aceasta scădere a reducerii relaxării (care poate fi controlata

prin durata iradierii cu ultraviolete) este parțial compensată prin amplificarea unei componente EDHF.

II.4.B.4. Discuții şi concluzii

Ambele determinări ale dependenţei timpului de iradiere faţă de producția de anion superoxid (atât

metoda chemiluminometrică cât şi cea colorimetrică) arată o corelație liniară între cele două variabile

luate în calcul. Rezultatele obținute garantează un control proporțional, precis şi fin al nivelului stresului

oxidativ asupra vasului, în special asupra endoteliului vascular. Modificările iniţiale, grosiere se pot face

prin alegerea celei mai potrivite concentraţii pentru menadiona din soluţie iar ajustările fine se fac prin

variaţia timpului de iradiere cu radiaţii ultraviolete. În concluzie, metoda poate fi folosită în studiile legate

de reactivitatea vasculară atât sub influenţa ionilor de mangan la diferite concentrații cat şi sub influenţa

compușilor cu mangan SOD-mimici sau epuratori de anion peroxinitrit.

Rezultatele obținute se suprapun peste alte studii privind efectele stresului oxidativ asupra relaxării

endotelio-dependente [32,33].

II. 5. Studiul compecşilor cu mangan SOD mimici pe un model Schizosaccharomyces pombe cu

deleţia genei SOD2

II.5.1 Introducere

Studiul prezent propune o noua metodă de cuantificare a compușilor SOD – mimici, folosind o

tulpină de Schizosaccharomyces pombe modificată genetic prin deleţia genei responsabile de superoxid

dismutaza mangan dependentă (SOD2 -).

Tipul de stress folosit pentru Schizosaccharomyces pombe a fost stressul termic moderat şi cronic,

cunoscându-se potenţialul generator de radicali liberi pentru acest model [34]. Utilizând un test simplu de

supravieţuire (spot test), a fost posibilă compararea eficacităţii diverselor clase de SOD – mimici ca

factori de protecţie împotriva stressului oxidativ generat de căldură.

Nivelul global al speciilor reactive de oxigen a fost estimat direct cu ajutorul unei tehnici de

chemiluminescenţă proiectată iniţial pentru studii de supravieţuire: menadiona funcţionează ca un

intermediar între NADPH-oxidaza celulară şi semnalul chemiluminescent amplificat de către luminol

[35]. În tulpinile care prezintă deleţia SOD2 acest semnal de chemiluminescenţă va fi semnificativ crescut

datorită unui nivel ridicat de anion superoxid nedismutat.

În paralel, s-a urmărit eficacitatea compuşilor de mangan şi supravieţuirea modelelor biologice

folosite şi la alte tipuri de stress: cu apa oxigenată de diferite concentraţii, stress termic intens şi acut

(480C, 30 de minute), expunere la radiaţii UV (300 nm), administrare de menadiona în mediu (compus

cunoscut ca generator de radicali liberi [36]) şi administrare de antimicina (compus care blochează

complexul III al lanţului respirator crescând astfel producţia mitocondrială de anion superoxid [37]).


Tulpini folosite

S-a utilizat o tulpină sălbatica (wt - wild type) provenită de la Prof. Antony Carr (Genome Damage

and Stability Center, Sussex University Brighton, UK) care a fost folosită mai departe pentru deleţia genei

superoxid dismutazei mitocondriale mangan dependentă SOD2 -.

Determinarea supravieţuirii prin Spot test

Celulele au fost crescute până la faza de midlog, exponenţiala târzie sau staţionară, după care au

fost diluate serial 10X şi 5 µl de mediu lichid cu celule au fost însămânţaţi în cutii Petri cu mediu solid

YES. Folosind citirea spectrofotometrică la 595 nm - OD595 - (spectrofotometru Beckman DU 800) şi

diluţiile seriale, s-au realizat spoturi de celule pe plăci a căror concentraţie a variat intre 105 şi 10

1 celule/5

µl. Plăcile obţinute astfel s-au incubat la 300C şi 37

0C (fără agitare) pentru 96 de ore după care au fost

fotografiate. Toate experimentele au fost repetate de minimum 3 ori.

Reactivi folosiţi

Luminolul, clorura de mangan (II) - MnCl2, menadiona, sarea disodică a acidului

etilendiaminotetraacetic (Na2EDTA), antimicina, troloxul şi boratul de sodiu provin de la Sigma Aldrich

(St. Louis, USA).

19

EUK-8 [manganese N,N’-bis(salicylidiene)ethylenediamine chloride] şi MnIII

TE-2-PyP5+

Mn(III)

[meso-tetrakis(N-ethylpyridinium-2-yl)porphyrin] (Figura 16) au fost donaţii prin bunavoinţa Prof. Irwin

Fridovich (Duke University, USA).

Figura 16: Structurile complecşilor cu mangan testaţi. Structura porfirinei cu mangan şi a salen

manganului folosite in studiu. Tipul de complexare oferă posibilitatea trecerii Mn II ↔ Mn III.

Testarea chemiluminescentă mediată de menadiona - test de detecţie directă a producţiei

intracelulare de anion superoxid

Anionul superoxid a fost detectat direct, folosindu-se o metoda uşor modificată, proiectata iniţial

pentru studii de viabilitate cu ajutorul chemiluminescenţei [5]: S. Pombe generează radical superoxid in

prezenţa menadionei datorită unei NADPH-oxidaze şi intensitatea chemiluminescenţei amplificată cu

luminol va fi proporţională cu numărul de celule vii/ml. Pentru un număr de celule S. pombe cuprins intre

0 şi 105 celule/ml se poate observa o dependenţa între semnalul chemiluminescent obţinut şi procentul de

supravieţuire, din care se poate calcula supravieţuirea tulpinilor supuse diferitelor forme de stres.

Etapele deleţiei

Pentru realizarea transformarii a fost necesară obţinerea unui construct liniar compus din trei

segmente: segmentele I şi III constând în câte 500 de perechi de baze, de o parte şi de alta a genei

înlocuitoare (in amonte şi în aval) şi segmentul II care e reprezentat de gena URA4, conform schemei din

figura 17:

Figura 17: Obţinerea celor trei fragmente ale constructului şi fuziunea acestora.

Toate fragmentele au fost obtinute prin ampificare PCR pe un termociclor Eppendorff – Cycle

Master: fragmentele I şi III au necesitat PCR colony (s-a folosit ADN-ul natural drept matrita, fara etapa

de extractie, pe organisme aflate in stadiul de crestere exponential tardiv). Fragmentul II a fost amplificat

folosind ca template material genetic obtinut de la Sussex University.

Dupa fuziunea segmentelor s-a facut transformarea tulpinei 501, frecvent folosita in studiul

molecular şi genetic pe modelul Pombe. Acesta este URA4 – şi creste doar pe medii imbogatite cu uracil.

20

Pentru recombinare, tulpuna a fost pregatita cu ajutorul unui soc osmotic dupa un protocol descris de

Bahler et al., 1998. Transferul celulelor pe medii fara uracil a condus la selectia mutantelor la care

transformarea s-a produs, gena SOD2 fiind inlocuita cu URA4 (figura 18):

Figura 18: capetele complementare din aval şi din amonte permit alinierea şi recombinarea, deletia

rezultata avand ca urmare şi dobandirea unui caracter de selectie

In urma transferului pe mediu fara uracil, doar 22 de colonii au crescut, demonstrand deci preluarea

functiei dihidroorotazei in cadrul procesului de recombinare. Deoarece exista posibilitatea existentei unei

recombinari in alta zona decat cea dorita, s-a facut o verificare a insertiei. Pentru aceasta, s-a folosit o

pereche de primeri care sa poata produce amplificarea prin copierea unei portiuni care sa cuprinda flancul

din aval şi o parte a genei nou inserate (figura 19):

Figura 19: Verificarea inserţiei corecte se poate face prin PCR, amplificând o porţiune a ADN ce

cuprinde un segment original legat de un segment nou introdus. Obţinerea unui fragment ce conţine

ambele tipuri de ADN reprezintă un element de siguranţa al inserţiei în zona corectă.

Cu ajutorul perechii de primeri construite, s-a realizat PCR colony pentru toate tulpinile obţinute

după selecţie. Dintre acestea, doar cu tulpină nr. 14 s-a obţinut o amplificare a unui segment de

aproximativ 1000 de nucleotide, conform designului anterior al primerilor (s-a făcut comparaţia cu o

scară de fragmente ADN, de lungimi cunoscute), conform figurii 20:

Figura 20: Existenţa unei benzi fluorescente de mărime aşteptată (aproximativ 1000 perechi de

nucleotide) demonstrează transformarea corectă a tulpinii numărul 14.

21

Studiul prin chemiluminescenţă a proprietăţilor antioxidante a compuşilor cu mangan SOD-like in

vitro

a) determinarea proprietăţilor peroxidazice şi catalazice

S-a folosit o metodă dedicată determinării capacităţii antioxidante prin chemiluminescenţă, care are

la baza o reacţie redox amplificată de un compus special, luminolul, care va emite o cantitate de lumină

proporţională cu nivelul oxidării, comparând astfel compuşii testaţi cu o peroxidază naturală.

Astfel, semnalul chemiluminescent s-a obţinut prin amestecul a 140 ul apă distilată, 20 ul soluţie

luminol, 20 ul soluţie oxidantă (reactivi pentru chemiluminescenţă Amersham) şi 20 ul soluţie HRP

(concentraţia acesteia s-a realizat prin diluţie aprox. 1/6000 dintr-o soluţie stoc de 1 mg/ml - activitate100

UI/mg, Sigma). Pentru citire s-a folosit un chemiluminometru Berthold Lumat 9507, setat să preia

semnalul în dinamică, din 5 în 5 secunde.

b) determinarea capacităţii de scavenger pentru radicalul superoxid

Metoda implică reacţia de oxidare a xantinei în prezenţa xantin-oxidazei, detecţia

chemiluminescenţei făcându-se în acest caz cu un compus specific pentru superoxid, lucigenina.

Sistemul funcţionează cu cele mai bune randamente în tampon glicină (pH – 10) şi toţi compuşii

folosiţi pentru testare au avut concentraţia 100 micromolar. Semnalul chemiluminescent a fost setat la 130

000 RLU, prin amestecul a 400 μl tampon glicina, 20 μl soluţie lucigenină 100 μmolar în tampon PBS

(pH – 7,4), 20 μl soluţie xantină 100 μmolar în tampon glicină (pH - 10) şi 20 μl soluţie xantin-oxidază în

tampon PBS, pH – 7,4 (concentraţia enzimei a fost ajustată pentru obţinerea unui semnal

chemiluminescent de 130 000 RLU). Pentru inhibiţia semnalului, s-au folosit câte 20 μl din următoarele

soluţii cu concentraţie 100 μmolar, în apă distilată: clorură de mangan (martor pentru cationii de mangan

2+), superoxid dismutaza de origine bovină – 3,88 U/l (folosită ca standard, pentru posibilitatea raportării

la compusul natural), mangan-salen (EUK - 8) şi porfirina cu mangan (MnTe2PyP). Experimentele s-au

efectuat în triplicat.

II.5.3. Rezultate

a) determinarea proprietăţilor peroxidazice şi catalazice

Din figura 21, se observă că tendinţa curbelor de chemiluminescenţă pentru EUK şi porfirină cu

mangan se apropie de enzima naturală (cu un semnal iniţial mai puternic la porfirină dar cu o latenţă mai

mare la EUK).

Figura 21: comparaţie între cinetica sistemului chemiluminescent în prezenţa a diferiţi compuşi cu

capacitate antioxidantă (HRP, 3.3x10-4

UI/20 µl – peroxidaza naturală extrasă din hrean, Trolox 100

µmolar, 20 µl – antioxidant hidrosolubil derivat din vitamina E, EUK-8 şi Mn porfirina 100 µmolar, 20 µl

– compuşi artificiali cu activitate SOD şi peroxidaza like).

0

500000

1000000

1500000

2000000

2500000

3000000

3500000

4000000

4500000

0 20 40 60 80 100 120 140

t(sec)

RL

U

HRP

HRP + Trolox

EUK-8

Mn porf

22

b) determinarea proprietăţilor superperoxid dismutazice

În toate situaţiile se observă o inhibiţie a semnalului chemiluminescent, neaşteptat de mare în cazul

martorului cu clorura de mangan şi moderată în cazul superoxid dismutazei de origine bovină (din cauza

concentraţiei mici la care s-a lucrat cu această enzimă). Este de remarcat că pe acest sistem de testare în

vitro, porfirina cu mangan se dovedeşte a fi mai eficace decât mangan-salenul (figura 22). Acest rezultat

este în perfectă concordanţă cu datele din literatură, cuantificarea clasică a proprietaţilor superoxid

dismutazice pentru orice complex cu metale diverse făcadndu-se cu ajutorul unei tehnici de colorimetrie

care foloseşte drept detector citocromul c [38]. În urma competiţiei pentru anionul superoxid generat tot

cu ajutorul sistemului xantina-xantin oxidază se determină concentraţia de complex metalic care inhibă cu

50 de procente reducerea citocromului c. Prin această metodă s-a observat ca porfirinele cu mangan sunt

cu mult mai eficiente in dismutarea anionului superoxid decăt salen mnganii, dar in condiţiile de pH

specifice metodei citocromului c (pH 7.8).

Figura 22: Toţi compuşii testaţi prezintă activitate superoxid dismutazică în vitro, cel mai activ

dovedindu-se a fi complexul porfirină-mangan (~ 7000 RLU), comparativ cu complexul salen-mangan

(12000 RLU).

Modele de stress la Schizosaccharomyces pombe. Alegerea celui mai bun model pentru experiment.

Pentru Schizosaccharomyces pombe s-au propus diverse modele de stress: osmotic, termic, cu

radiaţii ionizante (UV, gamma, X), oxidativ (cu peroxid de hidrogen – radical peroxid ; cu paraquat,

plumbagin – radical superoxid), declanşat chimic (ex. MMS – agent metilant), etc.

Dintre multitudinea de variante, s-au ales pentru acest studiu 3 modele:

a) modelul stressului cu radiaţii UV

b) modelul stressului cu antimicină

c) modelul stressului termic

Pentru toate modelele experimentate s-a folosit ca indicator de supravieţuire protocolul “spot test”.

a) modelul stressului cu radiaţii UV

Pentru acest model, s-a folosit un transiluminator ca sursă de iradiere UV, setat să emită la lungimea

de undă de 280 nm. Distanţa de iradiere a fost constantă în toate situaţiile (5 cm), la o putere de 120 W,

energia transmisă fiind controlată cu ajutorul timpului de iradiere.

Figura 23: modelul stresului cu radiaţii UV (280 nm) timp de 30 de secunde. Se observă inhibiţia

completă a creşterii pentru tulpina RAD3 şi o uşoară scădere a supravieţuirii în cazul mutantei SOD2.

0

20000

40000

60000

80000

100000

120000

140000

1

RL

U

Semnal fara inhibitie

Superoxid dismutaza bovina 3,88 U/l

Clorura de mangan 100 umolar

Mangan-porfirina 100umolar

Salen-mangan 100 umolar

23

Posibile explicaţii în cazul diferenţei mici de creştere (figura 23) pe acest model de stress pot fi:

- Radiaţia UV acţioneaza atât ca generator de radicali liberi (o parte dintre aceştia fiind de tip

superoxid – prin generarea oxigenului singlet din moleculele dizolvate în apă) cât şi prin intervenţie

directă (ruperea lanţurilor ADN, dimerizarea timinei, denaturarea directă a proteinelor, etc). În al doilea

caz, activitatea superoxid dismutazei mitocondriale nu are un efect notabil.

- Există probabil alte sisteme de protecţie şi alte căi de semnalizare pentru acest tip de stress, care

nu au legatură directă cu Mn-SOD.

b) modelul stressului cu antimicina

Acest model s-a bazat pe observaţia că antimicina este un inhibitor al complexului III pentru lanţul

respirator. Împiedicând fluxul normal de electroni de la coenzima Q spre complexul III, o parte din

electroni vor interacţiona cu oxigenul din mediul mitocondrial, crescând producţia de superoxid de

aproximativ 40 ori. Pentru modelul S. Pombe, antimicina adăugată în mediul de cultură la diferite

concentraţii nu a determinat o diferenţa de supravieţuire între tulpinile 501 şi cele cu deleţia SOD 2

(figura 24):

Figura 24: Antimicina administrată la concentraţii de 2, 20 şi 200 micromolar a avut acelaşi efect

asupra supravieţuirii tulpinilor cercetate.

c) stresul oxidativ indus de menadiona

Prin dizolvarea unei solutii alcoolice de menadiona în mediul de cultură (0, 25 şi 50 micromolar -

concentratii finale), s-a observat o diminuare semnificativă a supravieţuirii pentru tulpina cu deleţie

SOD2 (-) comparativ cu o tulpină normală (figura 25) la concentraţia de 25 micromolar. La concentraţii

de 50 micromolar menadiona devine toxică şi pentru tulpinile martor testate.

Figura 25: Influenţa menadionei la diferite concentraţii (0, 25 şi 50 micromolar) asupra unor tulpini

de S. pombe. M1 şi M2 - tulpini martor (wt) de provenienţa diferită: M1 - Prof Tony Carr, M2 - Prof.

Mircea Rusu; SOD2 (-) tulpină cu deleţia superoxid dismutazei mitocondriale.

Testele de chemiluminescenţă mediate de menadionă

După efectuarea experimentelor în triplicat, semnalele de chemiluminescenţă au fost reprezentate

grafic, pentru comprararea nivelului de specii reactive ale oxigenului (în special anion superoxid) între

cele două tulpini testate.

24

Diferenţele semnificative între semnale s-au menţinut şi în condiţiile cultivării în stress termic

(370C) după 4 ore şi după 8 ore, dar cu valori mai mici ale semnalelor de chemiluminescenţă (figura 26).

În cazul folosirii altor tulpini cu mutaţii care nu au legatură cu balanţa apărare antioxidantă

(protecţie enzimatică sau neezimatică) şi specii reactive ale oxigenului (în special anionul superoxid), nu

s-au observat nici un fel de diferenţe din punct de vedere al intensităţii semnalului chemiluminescent.

Figura 26: Semnalele de chemiluminescenţa obţinute după 2 secunde de măsurare de la tulpinile

SOD2(-) şi wt în condiţii normale (300C) sau stress termic (37

0C).

Stressul termic cronic şi moderat la Schizosaccharomyces pombe. Rezultatele testului de

supravieţuire – spot test

Dintre toate modelele de stress folosite în studiu pentru S. pombe, cel mai eficient a fost modelul

stressului termic moderat şi cronic, obţinut prin incubare fără agitare la 370C, timp de 96 de ore. Din

punct de vedere al ciclului celular, celulele cele mai afectate de stress termic au fost cele din faza

staţionara sau exponenţială târzie. Toţi compuşii testaţi s-au dovedit a fi lipsiţi de toxicitate la

concentraţia finală de 200 µM şi la 300C (Figura 27).

Din acest punct de vedere compuşii testaţi se dovedesc a fi mult mai eficace la concentraţii relativ

mici daca se compara concentraţia toxica intre acestia si ftalocianina cu mangan.

Figura 27: creşterea tulpinilor testate (wt – tulpină salbatică; SOD2(-) – tulpină cu deleţia

superoxid dismutazei mitocondriale) în condiţii normale (300C, 96 ore). M-30 – mediu YES simplu; Mn-

30 – mediu YES + 200 µM clorura de mangan (II); EUK-30 - mediu YES + 200 µM EUK-8; Mn porf-30

- mediu YES + 200 µM MnIII

TE-2-PyP5+

.

25

După 96 de ore la 37 de grade Celsius s-a observat o scădere semnificativă a supravieţuirii pentru

tulpina S. Pombe cu deleţia superoxid dismutazei mitocondriale mangan-dependentă, comparativ cu o

tulpină normală. Diferenţele de supravieţuire pe modelul spot test pot fi apreciate semicantitativ (deoarece

diluţiile folosite la realizarea spoturilor cu celule au fost seriale, între 105 şi 10

1 celule/ml). Astfel, s-a

putut aprecia o scădere de aproximativ 100 de ori a rezistenţei la stress termic pentru tulpina SOD2 (-).

Acest deficit semnificativ de creştere a fost corectat practic complet prin adăugarea în mediul de cultură a

compuşilor SOD mimici, în concentraţie de 200 µM. Cei doi compuşi folosiţi au refăcut supravieţuirea

practic în aceeaşi măsură. Prezenţa ionilor de mangan nu a influenţat supravieţuirea la 370C (figura 28).

Figura 28: creşterea tulpinilor testate (wt – tulpina sălbatică; SOD2(-) – tulpină cu deleţia

superoxid dismutazei mitocondriale) în condiţii de stress termic moderat şi cronic (370C, 96 ore). M-37 –

mediu YES simplu; Mn-37 – mediu YES + 200 µM clorura de mangan (II); EUK-37 - mediu YES + 200

µM EUK-8; Mn porf-37 - mediu YES + 200 µM MnIII

TE-2-PyP5+

.

II.5.4. Discuţii şi concluzii

Prezenţa unui semnal chemiluminiscent intens pentru tulpina S. pombe cu deleţia SOD2 reprezintă o

dovadă directă de lipsă a apărării primare pentru producţia mitocondrială de anion superoxid. Se pare că

în acest caz particular, menadiona funcţionează ca un mediator chemiluminescent nu doar pentru

NADPH-oxidoreductaza membranară (folosită ca marker al supravieţuirii în protocolul original [5]) şi

reprezintă un indicator şi pentru anionul superoxid nedismutat. În cazul martorului reprezentat de tulpina

wt, variaţia semnalului chemiluminescent a fost nesemnificativă în timpul celor opt ore de stress termic,

ceea ce demonstrează implicarea punctuală a superoxid dismutazei mangan-dependentă în mecanismele

declanşate de stress. Rezultatele obţinute concordă cu acele rezultate din studiile anterioare – dacă s-a

folosit un stress termic de durată relativ lungă, dar cu temperaturi necritice [39]. . Dacă se foloseşte o

temperatură prea înaltă (420C de exemplu), gena MnSOD va fi indusă de căldură în cazul tulpinii

salbatice wt [40] şi acest tip de răspuns nu ar fi de dorit pentru o analiză corectă a compuşilor SOD

mimici. Desi s-a menţinut o diferenţa mare intre semnalele chemiluminescente şi în stressul termic pentru

cele două tulpini, tendinţa a fost de descreştere pentru tulpina SOD (-), datorită morţii celulare a acestei

tulpini la 370C (moartea celulară a fost verificată prin coloraţie vitală).

În concluzie, rezultatele studiilor subliniază rolul major al superoxid dismutazei mitocondriale

mangan-dependentă în cazul răspunsului celular la stres termic moderat. Acest model de stress, aplicat

tulpinilor de Schizosaccharomyces pombe, poate fi considerat o unealtă deosebit de utilă pentru un triaj

simplu, rapid şi precis al compuşilor cu mangan cu potentţiale proprietăţi de SOD mimici. Modelul se

dovedeşte superior celui clasic (E. Coli, [41]), ţinând cont de faptul ca S. Pombe este un organism

eukariot (prezenţa mitocondriilor îl face mai apropiat de celulele mamifere), uşor de cultivat şi

nepretenţios în utilizare. Experimentele au demonstrat posibilitatea dezvoltării unor modele, atât în vitro

cât şi în vivo, pentru studiul compuşilor cu acţiune enzyme-like. Cele două clase de substanţe cu mangan

se pretează la studiul pe sisteme de chemiluminescenţă, dar şi la experimente pe modele biologice simple,

create prin manipulare genetică.

26

II.6 Compuși ai manganului cu proprietăţi potențiale SOD-mimice şi peroxidaza/catalaza

mimice

II.6.1. Introducere. Sărurile de mangan ale unor acizi organici

Curcumina, alcaloid izolat din Curcuma longa, compus cunoscut cu proprietăţi antioxidante [42],

are posibilitatea de a complexa manganul şi complexul rezultat a demonstrat proprietăţi SOD mimice

[43]. Conform structurii chimice, curcumina reprezintă un dimer al unui hidroxi-acid cu structură fenolică

sau hidroxi-cinamică, acidul ferulic. Studiul actual a căutat sa determine potențialele proprietăţi SOD

mimice şi peroxidază/catalază mimice pentru sarea de mangan a acidului ferulic, care poate fi asimilată

cu jumătate din molecula cu proprietăţi SOD mimice demonstrate – curcumina complexată cu mangan.

Urmărind aceeași logică, au fost testate şi o serie de săruri de mangan ale unor hidroxi-acizi fenoli

înrudiţi cu acidul ferulic (figura 29): acizii cafeic, cumaric şi cinamic. În același experiment s-a testat şi

sarea de mangan a acidului ascorbic, vitamină cunoscută cu proprietăţi antioxidante.

(a)

(b)

(c)

Figura 29: Structurile hidroxi-acizilor folosiți pentru prepararea sărurilor de mangan

corespondente: (a) – acidul cinamic (acid (E)-3-fenil 2-propenoic) (b) acidul cafeic (acid 3-(3,4-

dihidroxyfenil 2-propenoic) (c) – acidul cumaric (acid 3-(4-hidroxyfenil)-2-propenoic).

Au fost investigate şi ftalocianinele complexate cu mangan, structuri asemănătoare cu nucleul

porfirinic, la care cei 4 nuclei pirolici sunt legați de benzen formând 4 heterocicli numiți izoindoli (figura

30) - din punct de vedere al potențialelor proprietăţi de tip peroxidază/catalază.

Complecşi ai manganului cu porfirine sau ftalocianină

Figura 30: Structurile complexelor cu mangan testate; (a) – ftalocianina-Mn [ftalocianina – mangan

9III)]; (b) – octaetil-porfirina cu mangan [clorura de 2,3,7,8,12,13,17,18-Octaetil-21H,23H-porfirin

mangan(III)]; (c) – tetrafenil porfirina cu mangan [clorura de 5,10,15,20-Tetrafenil-21H,23H-porfirin

mangan(III)]; (d) – TEP porfirina cu mangan MnIII

TE-2-PyP5+

sau Mangan(III) [meso-tetrakis(N-

etilpiridil-2-il)porfirina].

27

II.6.2. Material şi metodă. Reactivi

Reactivii pentru studiile de chemiluminescenţă au fost luminolul, peroxidaza extrasa din hrean

(HRP), alopurinolul, xantin-oxidaza, lucigenina, soluţia tampon PBS (50 mM, pH 7.4), soluția tampon

glicina-NaOH (50 mM, pH 10.1) clorura de mangan (II), peroxidul de amoniu, para-iod-fenolul –

provenite de la Sigma Aldrich (St. Louis, USA).

Combinațiile complexe ale manganului cu porfirine sau ftalocianine au fost procurate de la Sigma

Aldrich (St. Louis, USA): ftalocianina-Mn [ftalocianina – mangan 9III)], octaetil-porfirina cu mangan

[clorura de 2,3,7,8,12,13,17,18-Octaetil-21H,23H-porfirin mangan(III)], tetrafenil porfirina cu mangan

[clorura de 5,10,15,20-Tetrafenil-21H,23H-porfirin mangan(III)] şi TEP porfirina cu mangan - MnIII

TE-

2-PyP5+

sau Mangan(III) meso-tetrakis(N-etilpiridil-2-il)porfirina.

Compușii din clasa sărurilor de mangan au fost preparați în două etape (obţinerea unei sări de

mangan provenite de la un acid foarte slab, uşor de dezlocuit şi reacţia acesteia cu acizii luaţi în studiu).

Determinarea proprietăţilor peroxidazice/catalazice

Determinarea proprietăţilor peroxidazice ale compușilor cu mangan s-a făcut utilizând o metodă

modificată care se adresează măsurătorii capacitații antioxidante totale [21,44]. Protocolul determinării

capacitații antioxidante prin chemiluminescenţă, are la bază o reacție redox amplificată de un compus

special, luminolul, care va emite o cantitate de lumină proporțională cu nivelul oxidării. Sistemul este

compus din peroxid de amoniu (oxidant – sursa de peroxid), para-iod-fenol (amplificator), HRP –

peroxidaza din hrean (enzima necesară generării radicalilor oxidanți – horseradish peroxidase) şi luminol

(reducător, marker luminescent). Un astfel de amestec emite lumină relativ constant, timp de câteva

minute, după o cinetică enzimatică clasică, de tip Michaelis-Menten (vezi capitolul 5). Adăugarea unui

compus antioxidant unui astfel de sistem duce la prăbușirea chemiluminescenţei pentru o perioadă de

timp proporțională cu puterea antioxidantă a compusului.

Ținând cont ca metoda descrisă folosește o enzimă din clasa peroxidazelor pentru obținerea

semnalului chemiluminescent, simpla înlocuire a peroxidazei originale cu compușii de testat (fără

adăugarea unui alt antioxidant) a făcut posibilă cuantificarea şi compararea compușilor cu mangan din

acest punct de vedere.

Pe de altă parte, păstrarea enzimei inițiale şi adăugarea la un moment dat a compușilor cu mangan a

făcut posibilă măsurarea capacitații antioxidante a acestora la diferite concentrații şi compararea faţă de

un antioxidant clasic – Troloxul.

Toți compușii au fost preparați în ziua experimentelor, la concentrații intre 0.1 μmolar şi 1 mmolar

şi testarea s-a făcut conform protocolului descris la capitolul 5. Pentru etalonare, s-a folosit o peroxidază

naturală (HRP, horseradish peroxidase sau peroxidaza din hrean) la mai multe concentrații. Testarea functiei superoxid dismutazice

Testarea functiei superoxid dismutazice s-a facut după un protocol asemanator protocolului original

descris în capitolul 7. Lucigenina a fost dizolvată intr-o solutie tampon fosfat salin (PBS) (pH = 7.4), la o

concentratie finală de 100 μM, cu ajutorul careia s-au realizat şi dilutii succesive. Alopurinolul a fost

solubilizat în tampon PBS (pH = 7.4) în mai multe concentratii şi concentratia 100 μM a fost determinată

ca fiind optimă pentru determinarile finale la pH = 10.1. Xantin oxidaza a fost preparată ca solutie stoc (1

mg enzima liofilizata cu o activitate de 22 U/mg a fost dizolvat în 10 ml solutie tampon PBS, pH = 7.4).

Determinarile s-au facut cu o soluţie de lucru obtinută prin diluţia 1/200 a solutiei stoc. Pentru

compararea compusilor potential SOD mimici, concentraţia finală a enzimei a fost ajustată în asa fel incat

varful semnalului chemiluminescent sa atingă 2,5 x 106 RLU (unitati relative de lumina) pentru pH-ul de

10.1. Toti compuşii testaţi au fost dizolvaţi în ziua experimentului, în dorinţa de a evita o eventuală

decomplexare a ionului de mangan ce ar fi putut duce la modificarea proprietăţilor superoxid dismutazice.

Pentru inhibiţia semnalului, s-au folosit câte 100 μl urmatoarele solutii cu concentratie 0.1 - 100 μmolar:

ftalocianina-Mn [ftalocianina – mangan 9III)], octaetil-porfirina cu mangan [clorura de

2,3,7,8,12,13,17,18-Octaetil-21H,23H-porfirin mangan(III)], tetrafenil porfirina cu mangan [clorura de

5,10,15,20-Tetrafenil-21H,23H-porfirin mangan(III)] şi TEP porfirina cu mangan - MnIII

TE-2-PyP5+

sau

Mangan(III) meso-tetrakis(N-etilpiridil-2-il) porfirina. Experimentele s-au efectuat în triplicat.

Toate reacțiile de chemiluminescenta au fost înregistrate folosind o metodă cinetică, pe un

chemiluminometru Berthold Lumat LB 9507 (Bad Wildbad, Germany), cu ajutorul celor două injectoare

automate, la 250C (capitolul 7).

28

Rezultatele cineticii măsurate timp de 100 de secunde s-au transferat în programul Grapher 7 pentru

calcularea ariei de sub curbă. Valorile obținute au generat grafice în Excel cu ajutorul cărora s-a

determinat IC50 (concentrația necesară inhibării semnalului chemiluminescent cu 50 %).

II.6.3. Rezultate

Determinarea proprietăţilor peroxidază/catalază-like ale compușilor cu mangan

Folosind acest sistem, au fost testați toți compușii cu mangan prezentați mai sus. În timp ce nici o

sare de mangan a hidroxi-acizilor nu s-a comportat ca un înlocuitor cu adevărat eficace al peroxidazei

naturale, toți complecșii manganului cu porfirine sau ftalocianină au avut grade diverse de activitate

peroxidazo-like. Daca se folosesc concentrații milimolare, activitatea peroxidazică este atât de intensă

incât substratele folosite în protocol se consumă rapid şi semnalul chemiluminescent se prăbuşeşte înainte

de 60 de secunde. Cel mai eficient compus s-a dovedit a fi TEP-porfirina cu mangan, care a avut o

eficacitate de sute de ori mai mare decât restul compușilor , motiv pentru care a fost testată şi la

concentrații mai mici. S-a constatat ca TEP-porfirina prezintă o activitate peroxidazică în același interval

de măsurătoare la concentrații de 0.1 µM comparativ cu restul compușilor care au avut concentrația de

100 µM. Pe de altă parte, concentrații mai mari de 1 µM consuma rapid substratele din reacție,

comportându-se ca restul compușilor aflați la concentrații milimolare.

Se poate observa şi influenţa substituenților de pe nucleele porfirinelor: în cazul octaetil-porfirinei

capacitatea peroxidazica a fost mai slabă decât în cazul tetrafenil-porfirinei cu mangan. Eficacitatea

diferită ramane vizibilă chiar şi la concentrații milimolare (figurile 31 - 33).

Figurile 31 si 32: Funcțiile peroxidazice ale complecsilor cu mangan

0

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

0 50 100 150 200

Ch

emilu

min

esce

nta

(RLU

)

Timp (secunde)

Peroxidaza hrean 22U/L

Ftalocianina-Mn 1mm

Octo-etil-porfirina-Mn1mm

Tetra-fenil-porfirina-Mn 1mm

Tetra-(etil-2-piridil)-porfirina-Mn

29

Figura 33: Testarea funcţiei peroxidazice/catalazice pentru complecşii cu mangan cu structură

porfirinică folosind concentraţii submilimolare.

Determinarea proprietăţilor SOD-like a compuşilor cu mangan

După înregistrarea şi prelucrarea rezultatelor (conform protocolului prezentat în capitolul 7) s-a

putut face o comparație între proprietățile SOD-like pentru toți compușii luați în studiu faţă de TEP-

porfirină (compus cunoscut cu o capacitate mare de dismutare a anionului superoxid) şi clorură de

mangan II (martor, cation de mangan necomplexat şi nelegat în hidroxi acizi cinamici). Datele obținute

după determinări în triplicat sunt prezentate în tabelul 2.

Tabelul 2: Valorile IC50 pentru compușii studiați prin tehnica xantin oxidaza-alopurinol amplificată

chemiluminescent cu lucigenină.

Nume compus Valoare IC50 Valoare IC50

din literatură

Ferulat de mangan 2.1 ± 0.2 -

Cafeat de mangan 2.4 ± 0.3 -

Cinamat de mangan 2.92 ± 0.3 -

Cumarat de mangan 2.6 ± 0.25 -

Ascorbat de mangan 1.9 ± 0.2 -

Ftalocianina-Mn 3.54 ± 0.3 4.027 [45]

Octatetil-porfirina-Mn 33.5 ± 3.1 -

Tetra-fenil-porfirina-Mn 35.1 ± 3.3 38.45 [45]

TEP-porfirina-Mn 0.049 ± 0.05 0.045 [46]

Clorura de mangan II 2.94 ± 0.4 2.6 [38]

Determinarea acţiunii mangan-ftalocianinei pe modelul Schizosaccharomyces pombe.

Deoarece ftalocianina complexată cu mangan a demonstrat atât proprietăţi SOD-mimice cât şi

proprietăţi peroxidazice (care concorda cu datele din literatura [47]), s-a testat proprietăţile acesteia pe un

model de celulă eucariotă (S. Pombe), folosind atât o tulpină nemodificată genetic cât şi o tulpină care are

deleţia genei raspunzatoare de superoxid dismutaza mitocondrială mangan dependentă. Concentraţia

folosită (200 µM concentrație finală în mediul de cultură) a fost identică cu concentraţiile folosite pentru

compuşi recunoscuţi ca fiind SOD mimici. Conform figurii 34, se observă existenţa unui grad de

toxicitate pentru acest compus, chiar la temperatura normală de creştere a S. Pombe – 300 C. Toxicitatea

este mai mare pentru tulpina care prezintă deleţia genei SOD2.

30

Figura 34: testarea toxicităţii ftalocianinei complexate cu mangan pe un model

Schizosaccharomyces pombe. Doua tipuri de tulpini (o tulpina salbatică – wt şi o tulpină cu deleţia genei

superoxid dismutazei mangan dependentă) au fost folosite intr-un protocol „spot test” în care numărul de

celule/ml pentru fiecare spot a variat de la 105 la 10

1 celule/ml. Concentraţia finală a ftalocianinei cu

mangan a fost 200 µM. Imaginea prezentată este relevantă pentru 3 testări ale compusului.

Determinarea proprietăţilor antioxidante ale sărurilor manganului cu hidroxi-acizii derivaţi de la

acidul cinamic

Acizii folosiți în acest studiu pentru prepararea sărurilor de mangan dețin importante proprietăţi

antioxidante, chiar în absenţa formării sărurilor metalice [48]. În aceste condiții, o direcție a studiului

actual a constat în analiza acestor compuși cu mangan ca simpli antioxidanți (deosebiți de catalizatori

pentru că se consuma stoichiometric în timpul procesului redox). Pentru aceasta, s-a folosit tehnica

determinării capacitații antioxidante totale [44] (in prezenta peroxidazei). Rezultatele obținute (ca timpi

de revenire a semnalului chemiluminescent la 10 % din valoarea sa inițiala - exprimați în secunde) au fost

convertite în unităţi Trolox cu ajutorul graficului de calibrare şi sunt prezentate în tabelul 3:

Tabelul 3: proprietățile antioxidante ale sărurilor de mangan (II) 100µM pentru o serie de hidroxi-

acizi derivați de la acidul cinamic şi acidul ascorbic şi acizii corespunzatori, exprimate în unităţi Trolox.

Denumire compus Rezultat (Unităţi Trolox - µM)

Acid cinamic 3 ± 1

Cinamat de mangan 11 ± 2

Acid cumaric 11 ± 1

Cumarat de mangan 28 ± 2

Acid cafeic 101 ± 4

Cafeat de mangan 250 ± 6

Acid ferulic 13 ± 2

Ferulat de mangan 98 ± 3

Acid ascorbic 26 ± 2

Ascorbat de mangan 158 ± 5

Trolox 97 ± 3

II.6.4. Discuții şi concluzii

In literatura de specialitate apar puține date despre efectul antioxidant, superoxid dismutaza like sau

peroxidaza like al sărurilor de mangan provenite de la hidroxi-acizii derivați de la acidul cinamic. Deși aceste săruri nu prezintă proprietăţi SOD sau peroxidazo-like comparabile cu compușii dedicați, potențialul antioxidant este semnificativ crescut pentru sărurile de mangan comparativ cu acizii liberi.

Aceleași concluzii se pot trage şi pentru ascorbatul de mangan, compus folosit doar ca modulator al

matrixului cartilajului articular în asociere cu compusul condroitin-sulfat [49].

Dintre complecșii cu mangan studiați, ftalocianina cu mangan a demonstrat capacități catalitice atât

peroxidazo cât şi SOD like, rezultate comparabile cu datele din literatura [47]. Studiile pe modelul

celulelor eucariote S. Pombe cu sau fără deletia genei SOD2 au arătat o toxicitate crescuta a acestui

compus la concentrații la care alți compuși SOD mimici dedicați nu prezintă nici o toxicitate (vezi

capitolul 5). Mai mult, tulpina mai afectată de toxicitatea ftalocianinei este cea cu deleţia genei superoxid

dismutazei ceea ce demonstrează prezenţa măcar parțială a unui mecanism prooxidant în mecanismul

toxicității ftalocianinei. Într-adevăr, şi alți compuși SOD mimici care se comportă remarcabil în testele in

31

vitro devin prooxidanti în testele pe modele biologice, mai ales în cazul concentrațiilor crescute ale

compușilor testați [50].

Cel mai eficace compus atât ca SOD mimic cât şi ca peroxidazo mimic ramane TEP-porfirina cu

mangan a cărei performanţe depășesc de zeci sau chiar sute de ori oricare din restul complecșilor cu

mangan luați în studiu. Rezultatele obținute sunt în concordanţa cu alte studii [38] şi pot fi explicate la

nivel structural: prezenta celor patru substituenți de tip etil-piridil modifica potențialul redox al

manganului complexat în porfirina în așa fel încât constanta de cataliză pentru dismutarea superoxidului

ajunge la una din cele mai mari valori găsite la aceasta clasa de compuși. In cazul octaetil-porfirinei cu mangan, capacitatea peroxidazica a fost mai slabă decât în cazul

tetrafenil-porfirinei cu mangan şi acest fapt s-ar putea explica prin potențialul redox diferit al ionului de

mangan în cele două combinații. În același timp, se pare că potențialul manganului este modificat de

substituenții porfirinei, mai eficace în acest caz fiind substituenți cu pronunțat caracter electromer

atrăgător de electroni (radicali fenil).

Capacitatea antioxidantă a acestor săruri ale manganului a fost mult amplificată comparativ cu

acizii liberi. De asemenea, s-a observat o corelație intre capacitatea antioxidanta şi numărul de grupări

hidroxil libere, atât pentru sărurile de mangan cât şi pentru acizii liberi. Din acest punct de vedere,

eficacitatea antioxidantă creşte de la acidul cinamic la acidul cafeic: acid cinamic (± Mn) < acid cumaric

(± Mn)< acid ferulic (± Mn)< acid cafeic (± Mn).

În concluzie, toți complecșii manganului au prezentat proprietăţi SOD mimice şi sărurile de

mangan ale hidroxi-acizilor s-au dovedit a fi compuși antioxidanți eficace. Din punct de vedere al

eficacității catalizei, compușii cercetați se situează la distanţă de compusul cunoscut cu proprietăţi SOD

mimice, Mn-TEP-porfirina. Nici una dintre sărurile de mangan testate nu au depăşit semnificativ

proprietățile SOD mimice sau peroxidazice ale clorurii de mangan dar proprietățile antioxidante testate cu

ajutorul protocolului de chemiluminescenţă sunt semnificativ mai mari în comparație cu acizii simpli,

făcând-se remarcați din acest punct de vedere ferulatul, cafeatul şi ascorbatul de mangan.

II.7. Metodă originală de cuantificare a proprietăţilor SOD-mimice pentru combinaţiile

complexe ale manganului folosind o tehnică de chemiluminescenţă amplificată cu lucigenină.

II.7.1. Introducere

Studiul descris în acest capitol propune un nou sistem generator de anion superoxid, în care

alopurinolul este folosit ca înlocuitor al substratului natural recunoscut de către enzima. Deși alopurinolul

reprezintă un binecunoscut inhibitor enzimatic, proprietatea acestui compus de a genera radical superoxid

poate fi explicată dacă inhibiția realizată este privită în două etape: în prima etapă, alopurinolul se

atașează la nivelul centrului activ al enzimei, atașare explicată prin similaritatea structurală între

substratul natural (xantina) şi inhibitor. Dar aceasta atașare nu reprezintă un simplu mecanism de inhibiție

competitivă deoarece alopurinolul este transformat prin oxidare în oxipurinol, concomitent eliberându-se

anion superoxid în cantitati mari, mai ales în condiții de pH alcalin (figura 35). În a doua etapă, care se

suprapune parțial peste prima etapă, oxipurinolul nou format devine practic adevăratul inhibitor pentru ca

are capacitatea de a se lega foarte strâns de ionul de molibden redus al centrului activ, funcționând ca un

inhibitor sinucigaș [51].

32

Figura 35: Reprezentarea schematică a mecanismului posibil implicat în eliberarea anionului

superoxid din interacţia alopurinol-xantin oxidaza. Cu ajutorul chemiluminescenţei lucigeninei, cele 2

etape ale procesului sunt evidențiate, fără a putea fi separate în timp în mod real. Vârful semnalului

chemiluminescent reprezintă prima faza - cea de transformare a alopurinolului în oxipurinol. A doua

etapa e reprezentată de linia orizontală foarte apropiată de valoarea minimă, reprezentând inhibiția finală

data de oxipurinol. Oxipurinolul ca atare nu produce chemiluminescenţă (linia punctată).

Această nouă metodă de analiză a compușilor SOD-mimici utilizează lucigenina ca detector pentru

anionul superoxid datorită unei specificitaţi relative a acestui compus pentru anion superoxid [52,53]. In

condiții alcaline (pH = 10.1) sau fiziologice (pH = 7.4), cantitatea de radical produs din interacțiunea

alopurinol - xantin oxidază poate fi evaluată ca fiind aria de sub curbă după 100 de secunde de

măsurătoare a chemiluminescenţei în cinetică. Acest nivel al anionului superoxid poate fi scăzut într-o

manieră dependentă de concentrație prin adăugarea unor compuși cu rol potențial anihilator pentru

superoxid. În acest fel, nivelul noului semnal chemiluminescent va reflecta nivelul de inhibiție deci

consecutiv capacitatea SOD-mimică a compușilor testați. Compușii cu capacitați catalitice importante vor

produce o inhibiție non echimolară, deoarece funcționează ca şi catalizatori:

- superoxid dismutaza mangan dependentă de origine umană

- superoxid dismutaza cupru-zinc dependentă de origine bovină (folosită şi pentru standardizarea

metodei prin comparație cu metoda citocromului c)

- clorura de mangan II (MnCl2)

- un complex al salenului cu mangan (EUK - 8)

- un compex al porfirinei-mangan [mangan (III) -tetraetil-2-piridil-porfirina sau MnIII

TE-2-PyP5+

).


Metoda chemiluminescenţei

Toate reacțiile de chemiluminescenţă au fost înregistrate folosind o metoda cinetica, pe un

chemiluminometru Berthold Lumat LB 9507 (Bad Wildbad, Germany), cu două injectoare automate, la

250C.

Pentru semnalul chemiluminescent neinhibat, 100 μL de soluție substrat (xantina sau alopurinol) a

fost adăugată peste 400 μL soluție tampon glicina sau PBS. Chemiluminometrul a injectat automat 100

μL soluție de xantin oxidaza (11mU/ml sau o concentrație adecvată producerii unui semnal

chemiluminescent cu un maxim de 2.5 x 106 unităţi relative de lumina RLU la pH = 10.1 sau 1.3 x 10

6

unităţi relative de lumină RLU la pH = 7.4) şi 100 μL soluție lucigenină. Timpul dintre injectările

33

automate a fost setat la 0.7 secunde şi începutul citirii în cinetică timp de 100 de secunde s-a făcut cu o

întârziere de 0 secunde. Pentru determinările activităților de tip superoxid dismutază s-a adăugat 100 μL

soluție de analizat (la concentrații diferite) sau 100 μL soluție tampon (la pH-uri de 7.4 sau 10.1) ca şi

control negativ. Înregistrările cineticii chemiluminescente s-au făcut din 2 în 2 secunde, iar datele

obținute au fost exportate în tabele Excel. După generarea graficelor rezultate în urma fiecărei măsurători,

s-a calculat aria de sub curbă prin exportul graficelor în programul Grapher 7 (s-a observat o corelație

aproape perfectă [r2

= 0.99] intre valorile obținute după măsurarea ariei de sub curbă şi valorile generate

direct de chemiluminometru - reprezentând suma tuturor semnalelor de chemiluminescenţă din timpul

unei măsurători). Toate determinările finale s-au făcut în prezenta catalazei, 300 U/ml (cu scopul

eliminării potențialilor radicali peroxid care pot să apară în prezenţa urmelor de Fe2+

prin reacții Fenton).

Sarea de sodiu a EDTA a fost folosită în concentrație de 0.1 mM pentru determinările superoxid

dismutazei naturale şi a porfirinei cu mangan dar nu şi pentru clorura manganoasă sau salen-mangan

(pentru a se evita complexarea ionilor de mangan liberi sau legați în salen, care ar duce la pierderea

capacităților de superoxid dismutază).

II.7.3. Rezultate

Studiul comparativ al generării anionului superoxid cu xantina şi alopurinol

Metoda chemiluminescenţei

Folosind aceeași concentrații de xantină şi alopurinol (100 μM) şi măsurând semnalul

chemiluminescent produs datorită generării anionilor superoxid s-au descoperit două tipuri de cinetică ce

prezintă diferențe majore. Nivelul maxim al anionilor superoxid rezultați din oxidarea alopurinolului s-a

obținut după 5 - 10 secunde şi a devenit similar cu cel obținut din oxidarea xantinei după 40 de secunde

de măsurătoare (figura 36 a). Aceasta porțiune a cineticii a fost considerată a fi prima etapa a interacţiei

inhibitorului cu enzima (transformarea alopurinolului în oxipurinol). Spre deosebire de xantină care a

generat un semnal constant în timpul celor 100 de secunde de măsurătoare (şi chiar minute după

măsurătoare), alopurinolul a generat un vârf mult mai înalt urmat de un semnal foarte slab (practic zero)

datorat fixării şi blocării enzimei de către oxipurinol.

Figura 36: Studiu comparativ privind generarea anionului superoxid cu ajutorul xantin oxidazei,

folosind xantina şi alopurinol în concentrații identice (a – 12.5 μM, b – 40 μM).

(a) Metoda chemiluminescentă cu lucigenină: amestecul final a conținut tampon glicină (6.25 mM,

pH - 10.1, 250C), xantină sau allopurinol (12.5 μM), 100 μL xantin oxidază (~1.37 mU/ml) şi lucigenină

(12.5 μM) într-un volum total de 800 μL.

(b) Metoda spectrofotometrică cu citocrom c: reacţiile au avut loc la 250C intr-un volum total de 2

ml, tamponat la pH = 7.8 cu soluție tampon fosfat 0.05 M. Cuvetele (drum optic 1 cm) au conținut 1500

μL tampon fosfat cu xantină sau allopurinol (40 μM) şi citocrom c (10 μM). Reacția a fost pornită prin

adăugarea a 500 μL soluție xantin oxidază (~ 2nM).

Același aspect al curbei de chemiluminescenţă s-a obținut şi în cazul folosirii altor concentrații de

allopurinol sau xantină şi o dependenţă liniară între aria de sub curbă şi concentrație a fost observată doar

34

în cazul lucigeninei, alopurinolul comportându-se ca un substrat ce ajunge la saturație peste o anumită

concentrație (figura 37 aşi b).

Ținând cont de posibila implicație a lucigeninei la concentrații mari într-un ciclu redox care poate

produce rezultate false, s-a determinat şi concentrația minimă de lucigenină care încă generează un

semnal robust (cu un raport semnal/zgomot de 20 la1). Rezultatul obținut (0.2 μM) se situează cu mult

mai jos decât valoarea minimă recomandată pentru lucigenină în cazul studiilor in vivo.

Figura 37: Efectul variației concentrației lucigeninei (a) sau alopurinolului (b) asupra semnalului

chemiluminescent. Amestecul final a conținut tampon glicină (6.25 mM, pH - 10.1, la 250C), xantin

oxidază (~1.37 mU/ml) şi concentrații variabile de lucigenină (a) sau alopurinol (b), într-un volum total

de 800 μL. Concentrațiile finale de lucigenină sau allopurinol au variat intre 0 şi 12.5 μM pentru ambii

compuși. Efectul pH-ului

Variația condițiilor de pH a arătat că cel mai puternic semnal chemiluminescent se obține la pH =

10.1. (figura 38 a). Crescând concentrațiile reactivilor folosiți (figura 38 b2) şi adăugând Tween 20

(figura 38 b3) semnalul a fost puternic amplificat la pH = 7.4 şi acest nou sistem la pH fiziologic a

reprezentat a doua alegere pentru testarea compușilor SOD mimici.

Figura 38: Efectul pH-ului asupra semnalului chemiluminescent: semnalul cel mai puternic,

obținut la pH = 10.1, a fost considerat ca fiind 100 %.

a. Amestecul final a conținut diverse soluții cu sisteme tampon care au acoperit plaja de pH de la

7.4 la 10.5 (tampon PBS 6.25 mM pentru pH = 7.4 şi tampon glicină-hidroxid de sodiu pentru pH-urile

finale de 8.6 - 10.6). Amestecul a mai conținut deasemenea xantin oxidază (~1.37 mU/ml), alopurinol

(12.5 μM) şi lucigenină (12.5 μM) intr-un volum total de 800 μL.

35

b. Optimizarea la pH = 7.4: 1. Același amestec de la punctul a. 2. Concentrațiile reactivilor au fost

crescute astfel: Xantin oxidază (8 mU/ml), alopurinol (125 μM), lucigenină (25 μM), într-un volum total

de 800 μL. 3. Același amestec de la punctul 2 conține deasemeni Tween 20 (4.5 mM).

Metoda spectrofotometrica a citocromului c

Spre deosebire de metoda chemiluminescentă, reducerea citocromului c a arătat o producție mult

mai bună a anionilor superoxid din oxidarea xantinei. Oxidarea alopurinolului la aceeași concentrație a

produs o modificare aproape nesemnificativă a absorbantei citocromului c, în condițiile specifice acestei

determinări (figura 36 b). S-ar părea că proprietăţile diferite ale citocromului c, pH-ul mai scăzut (7.8 în

loc de 10.1) şi concentrația mai mică a substratelor intr-o analiză care durează 10 minute, duce la un tip

diferit de cinetică în care vârful generării de anion superoxid caracteristic allopurinolului nu se poate

observa. Rezultatele obținute prin această metodă au fost similare cu studiile din literatură [54].

Corelarea dintre concentrația compuşilor SOD mimici şi semnalul de chemiluminescenţă

Adăugarea a 100 μL soluție de superoxid dismutază la diferite concentrații în amestecul final de

chemiluminescenţă cu allopurinol a făcut posibilă determinarea limitei minime de cuantificare pentru

această enzimă, care a fost stabilită la 0.00781 U/ml - cu un procent de inhibiție de 19.8 ± 2.2 %. Sub

această valoare minimă, nivelul de inhibiție devine prea apropiat de controlul negativ (sub 10 x valoarea

controlului negativ). Limita superioară de detecție a fost stabilită la 5 U/ml, cu un procent de inhibiție

procentuală de 99.96 ± 0.02 %. În urma determinărilor de mai sus, curba de calibrare a metodei s-a

construit folosind concentrații ale superoxid dismutazei bovine care au variat între 0.00781 – 0.25 U/ml

(Figurile 39 şi 40). Curba de calibrare rezultată a fost similară cu cea obtinută din interacţiunea xantina -

xantin oxidază [55].

Figura 39: Curbele de chemiluminescenţă obținute după adăugarea superoxid dismutazei bovine la

concentrații variind intre 0 şi 0.5 U/ml. Soluțiile de superoxid dismutază de diferite concentrații (100 μL;

0 - 0.5 U/ml) au fost adaugate la 400 μL tampon glicină pH final = 10.1, amestecate cu 100 μL soluție de

allopurinol, urmate de injectarea automată a 100 μL soluție xantin oxidază (concentrația a fost ajustată în

așa fel incât vârful maxim de chemiluminescenţă sa ajungă la 2.5 x 106 RLU) şi 100 μL soluție

lucigenină. Concentrațiile finale pentru alopurinol şi lucigenină au fost 12.5 μM. pH-ul final a fost 10.1

(pentru pH = 7.4, semnalele de chemiluminescenţă au fost identice dar cu o intensitate mai mică).

36

Figura 40: Corelația dintre concentrația superoxid dismutazei de tip bovin şi gradul procentual de

inhibiție a anionului superoxid. Nivelul procentual al inhibiției a fost calculat folosindu-se următoarea

ecuație: Rsi (%) = 100 – 100*Ax/Aun unde Rsi – procentul de inhibiție a anionului superoxid, Ax – aria de

sub curbă pentru fiecare compus testat, Aun – aria de sub curbă pentru controlul negativ (cu concentrația

SOD = 0 U/ml – cu semnalul chemiluminescent cel mai puternic). Toate ariile de sub curbă au fost

calculate după 100 de secunde de masurătoare în cinetică, din 2 în 2 secunde. (○) – pH final = 10.1, (●) –

pH final = 7.4

Corelarea cu metoda spectrofotometrica a citocromului c

Deoarece metoda reducerii citocromului c de către anionul superoxid a dat aceleași constante de

cataliză ca şi metoda directă – puls radioliza -, [56] corelarea metodei chemiluminiscente cu cea clasică a

citocromului c se justifică atât ca precizie cât şi ca accesibilitate.

Concentrația superoxid dismutazei necesară pentru o inhibiție de 50 % a sistemului

chemiluminescent a fost comparată cu valoarea obținută prin metoda citocromului c. Sensibilitatea

metodei chemiluminescente la pH = 10.1 a fost găsită ca fiind de 16 ori mai mare faţă de metoda

spectrofotometrică şi ramâne mai mare decât aceasta chiar şi la pH = 7.4 (Figura 41).

37

Figura 41: Comparație intre metoda chemiluminescentă cu alopurinol şi metoda spectrofotometrică

cu citocrom c. Aceleași amestecuri de reacție în prezenţa superoxid dismutazei la diferite concentrații s-

au folosit pentru metoda chemiluminescentă la pH = 10.1 (♦), metoda chemiluminescentă la pH 7.4 (▲),

şi metoda spectrofotometrică cu citocrom c (●). Gradul de inhibiție al superoxid dismutazei s-a calculat

folosindu-se aceeași ecuație Rsi.

Activitatea SOD determinată prin metoda chemiluminescenţei a fost comparată cu metoda clasică a

citocromului c. În ciuda unui număr mai mic de probe, s-a observat o corelare excelentă a celor doua

metode (R2 = 0.997, n = 6, figura 42).

Pentru același nivel al inhibiției, concentrațiile superoxid dismutazei folosite în metoda

chemiluminescentă la pH alcalin au fost de 16 ori mai mici decât cele necesare variantei cu citocrom c.

Această diferență ar putea fi modificată prin schimbarea concentrației de xantin oxidază care determină

practic producția de anion superoxid/minut. In același fel, metoda chemiluminescenţei cu alopurinol a

fost ajustată sa genereze 50 % inhibiție pentru o unitate de superoxid dismutază/3 ml – ceea ce reprezintă

același nivel de inhibiție ca metoda citocromului c şi este totodată definiția acceptată pentru 1 U/ml SOD.

Figura 42: Corelarea dintre sistemul chemiluminometric allopurinol-xantin oxidază/lucigenină şi

metoda spectrofotometrică xantina-xantin oxidază/citocrom c. Pentru metoda prin chemiluminescenţă,

concentrațiile superoxid dismutazei au variat intre 0.00781 şi 0.25 U/ml (pH = 10.1) şi pentru metoda

spectrofotometrică intre 0.125 şi 4 U/ml.

38

Analiza compușilor SOD mimici

Folosind sistemul alopurinol-xantin oxidază amplificat cu lucigenină, trei compuși artificiali cu

mangan au fost testați, în scopul determinării potențialelor proprietăţi SOD – mimice: clorura de mangan

II (ca scavenger simplu de anion superoxid) şi doi complecși din clase chimice diferite – salen manganul

EUK-8 şi porfirina cu mangan MnIII

TE-2-PyP5.

Procentajele de inhibiție a anionului superoxid au fost calculate după determinările ariei de sub

curba şi aplicării ecuației Rsi, la pH 10.1 şi 7.4 (figura 43).

Figura 43: Valorile inhibiției procentuale a sistemului chemiluminescent după adăugarea a 100 μL

de soluție conținând clorură de mangan II, salen manganul EUK-8 şi porfirina cu mangan MnIII

TE-2-

PyP5. Toți compușii au fost testați la cinci concentrații: 0.01 μM, 0.1 μM, 1 μM, 10 μM, şi 100 μM.

Datele obținute sunt prezentate ca inhibiție procentuală, după aplicarea acelorași formule de conversie ale

ariei şi de transformare în procente. Ambele variante de pH au fost inițial calibrate pentru a genera o

inhibiție de 50 % pentru o unitate de superoxid dismutază bovină.

Rezultatele obținute au demonstrat o bună capacitate de dismutare a anionului superoxid pentru toți cei trei compuși testați, cu o activitate de remarcat în cazul compusului Mn

IIITE-2-PyP

5. Clorura de

mangan simplă a prezentat o inhibiție puternică la diferite concentrații, cu rezultate care concordă cu

literatura [57]. MnIII

TE-2-PyP5 a prezentat o activitate dismutazică net mai bună la pH = 7.4 comparativ

cu pH = 10.1 ceea ce arată dependenţa de pH pentru unii dintre compușii SOD mimici.

II.7.4. Discutii şi concluzii

Reacția de conversie a alopurinolului catalizată de xantin oxidază a fost investigată intr-un număr

considerabil de publicaţii dar partea legată de producția anionului superoxid a fost mai puțin analizată şi

concluziile din literatură sunt divergente în legătură cu generarea acestui tip de radical liber. Unele studii

in vivo pretind ca alopurinolul posedă proprietăţi antioxidante [58,59], în timp ce studii in vitro au

raportat producții de anion superoxid de la cantităţi nesemnificative [54] la cantităţi echimolare de

radical, la fel cum se întâmplă în cazul interacţiei xantină - xantin oxidaza [60].

Folosirea detecției chemiluminescente conduce la concluzia ca există o producție semnificativă de

anion superoxid în prima etapă a interacțiunii allopurinol - xantin oxidază, mai ales în condiții alcaline.

Deși producția asociată acestei noi metode de generare nu poate depăși ca valoare pe cea din sistemul

xantină xantin oxidază, cinetica este complet diferită şi conduce la un semnal amplificat într-un timp de

reacție mult mai scurt.

Studiul prezent sugerează ca reducerea citocromului c este un proces cumulativ care nu poate

urmări în cinetică scăderea nivelului de anion superoxid care rezultă din oxidarea enzimatică a

alopurinolului. Odată redus, citocromul c va modifica absorbanţa doar intr-un singur sens - al creșterii. In

39

cazul scăderii sau dispariției agentului oxidant citocromul c va rămâne la aceeași absorbanţă ceea ce îl

descalifică drept marker pentru procese în care generarea radicalului liber se face discontinuu, atât

crescător cât şi descrescător.

In contrast, în metoda chemiluminescentă propusă, nivelurile de lumină rezultate din reacție vor fi

permanent corelate cu producția radicalului superoxid, indiferent dacă aceasta are caracter crescător sau

descrescător. Numai un astfel de sistem a putut să depisteze cele doua etape ale interacţiei dintre

alopurinol şi xantin oxidază.

Producția aparent masivă a radicalului superoxid în primul pas al interacțiunii alopurinol - xantin

oxidază vizualizată prin metoda chemiluminescentă cu lucigenină ar putea avea câteva explicații. Constanta de inhibiție pentru alopurinol (Ki) (care poate fi asimilată ca o constantă a lui Michaelis - atâta

vreme cât prima etapă poate fi considerată o inhibiție competitivă) este mult mai mică decât constanta lui

Michaelis (Km) pentru xantină şi diferența e cu atât mai mare cu cât pH-ul mediului este mai alcalin (la

pH = 8.6 Ki este de 200 de ori mai mică decât Km [61]).

Pe de altă parte, producția inițiala a anionului superoxid (radical liber cu un timp de injumătăţire

relativ mic) are loc intr-un spațiu care poate exclude posibilitatea de reducere a citocromului c, ipoteză

susținută şi de datele din literatură [62]. Această "ipoteza a crevasei" propusă în literatură pentru

interacțiunea dintre xantină şi xantin oxidază are toate șansele să fie valabilă şi pentru alopurinol. Spațiul

din jurul situsului de generare a anionului superoxid ar putea sa nu fie accesibil citocromului c însa sa fie

mult mai permisiv pentru lucigenină, o molecula mult mai mică şi mai mobilă. In cazul xantinei,

fenomenul descris mai sus nu interfera esențial cu detecția daca se folosește citocrom c şi perioada de

reacție este de ordinul minutelor. Pentru alopurinol, doar o molecula mică ce are un răspuns rapid poate

identifica prima etapă a interacţiei cu enzima care durează doar zeci de secunde.

Posibilitatea interacțiunilor date de radicalul hidroxil a fost eliminată folosindu-se catalaza pe post

de control şi epurator al radicalilor peroxid care ar putea sa apară în prezenta metalelor traziţionale

contaminante, chiar dacă se găsesc în sistem în cantitati infime (reacția Fenton). Oricum, în condiții alcaline (pH = 10.10) scăderea semnalului chemiluminescent este doar de 17 %, ceea ce reprezintă un

comportament diferit faţă de interactia xantină - xantin oxidază la un pH cuprins intre 5.5 şi 7.4 [63]. S-ar

părea că producția de radical superoxid este puternic amplificată de către condițiile alcaline, indiferent

dacă substratul este alopurinol sau xantină.

Rezultatele obținute pot fi corelate deasemenea cu o specificitate relativă a lucigeninei pentru

radicalii superoxid. Toate datele din studiul prin chemiluminescenţă legate de producția mai multor specii

radicalice sunt comparabile cu cele obținute din interacţia clasică xantină- xantin oxidază la pH = 10.0,

când aproximativ 80 % din fluxul total al electronilor poate fi contabilizat în termenii reducerii

citocromului c. Cum reducerea citocromului c este considerată strict univalentă, se poate afirma ca 80 %

din producția de radicali liberi este acoperită de anionul superoxid [62]. Intr-adevăr, alte studii au arătat

ca o creștere a pH-ului şi/sau o scădere a temperaturii de lucru va duce la creșterea consecutivă a

producției de anion superoxid, afirmații valabile şi pentru interacțiunea alopurinol – xantin oxidază [60].

Este de remarcat influenţa pH-ului fiziologic asupra metodei propuse: din rațiuni care țin de

comportamentul şi stabilitatea diferite ale compușilor SOD mimici la pH alcalin, este necesară adaptarea

metodei pentru un pH = 7.4. Însă, această schimbare va afecta atât producția de anion superoxid cât şi

sensibilitatea lucigeninei pentru radical. Prin urmare, a fost necesară atât creșterea concentrațiilor

reactivilor folosiți care va determina o creștere a producției radicalului superoxid cât şi adăugarea unui

compus tensioactiv, Tween 20, care va repara sensibilitatea mai scăzută a lucigeninei în noile condiții. Utilizarea metodei alopurinol – xantin oxidază amplificată şi detectată prin chemiluminescenţa

lucigeninei ar putea avea un număr important de avantaje practice:

A] Intensitatea maximă a semnalului de chemiluminescenţă este de aproximativ 40 de ori mai mare

atunci când xantina este înlocuită cu alopurinol la aceeași concentrație, mai ales în condiții alcaline.

B] Scurtarea dramatică a analizei capacitaților de tip superoxid dismutaza pentru compușii de

analizat, comparativ cu alte metode similare [64,65,66,67].

C] Un aspect interesant al noului sistem de generare în doi pași este legat de fenomenul de “redox

cycling” care pare să fie evitat de acest sistem.

40

D] Sistemul alopurinol – xantin oxidază a demonstrat o bună sensibilitate pentru determinările

activității superoxid dismutazice atât pentru compuși artificiali cât şi pentru enzima naturală, din moment

ce limita inferioară de detecție a atins 0.0078 U/ml.

E] Cuantificarea eficacității eliminării radicalului superoxid folosind sistemul alopurinol/xantin

oxidază – amplificat cu lucigenină s-a demonstrat a fi rapid, sensibil, precis şi implică costuri mici.

F] Crescând concentrațiile reactivilor utilizați şi adăugând Tween 20 se poate folosi metoda şi la pH

fiziologic, cu o sensibilitate mai mică decât cea din condiții alcaline dar mai bună decât metoda clasică cu

citocrom c.

G] Sistemul xantina – xantin oxidază s-a demonstrat a fi un candidat bun pentru etichetarea

anticorpilor secundari folosiți în diverse metode de laborator.

II.8. CONCLUZII FINALE

II.8.1 Aspectele originale ale lucrării

1. Concentrațiile serice şi urinare ale unor oligoelemente (cuprul, zincul, manganul) se

modifică semnificativ în stresul de contenţie şi în cazul administrării unui antipsihotic atipic, risperidona.

Variațiile concentrațiilor celulare şi plasmatice ale unor cationi ar putea fi implicate în producerea

efectelor farmacoterapice a unor compuși cu proprietăţi antipsihotice şi ar putea influenta apărarea

antioxidantă. Importanţa stresului oxidativ în patologia psihiatrică este exemplificata în partea a doua a

capitolului 1, la pacienți cu afecțiuni din clasa demenţelor. Rezultatele obținute indică posibilitatea

folosirii oligoelementelor în terapia psihiatrică (ca săruri simple sau combinații complexe) atât în asociere

cu antipsihoticele cât şi ca terapie profilactică în situații particulare cum ar fi debutul demenţelor.

2. Suplimentarea cu mangan în diabetul zaharat experimental indus cu aloxan nu determină o

reducere semnificativă a valorilor glicemiei sau a capacitații antioxidante totale a serului dar reduce

peroxidarea lipidică scăzând nivelul seric al malondialdehidei.

3. Suplimentarea cu mangan în diabetul zaharat experimental indus cu aloxan nu influențează

esențial reactivitatea vasculară dar datele obținute indică apariţia unor efecte toxice ale manganului

asupra endoteliului la doze mult sub cele recunoscute ca având efecte toxice hepatice şi neurale. Pentru

testarea influentei stresului oxidativ asupra vaselor s-a realizat un dispozitiv original de generare

controlată a anionilor superoxid cu ajutorul unui compus generator al radicalului superoxid în prezenţa

radiațiilor ultraviolete.

4. Evidențierea rolului major al superoxid dismutazei mitocondriale mangan-dependentă în

cazul răspunsului celular la stres termic moderat folosind o tulpină de Schizosaccharomyces pombe

modificată genetic prin deleţia genei responsabile de superoxid dismutaza mangan dependentă. După

analiza a cinci modele de stres experimental aplicate acestui microorganism, s-a determinat modelul de

stres cel mai eficient – stresul termic cronic.

5. Compușii SOD mimici adăugați în mediul de cultură au proprietatea de a restaura complet

supraviețuirea tulpinii Schizosaccharomyces pombe cu deletia genei responsabile de superoxid dismutaza

mangan dependenta aflata în condiții de stres termic cronic. Clorura de mangan nu a prezentat astfel de

proprietăţi dar complecșii analizați (un complex al manganului cu salenul şi un complex cu tetra-etil-

piridil-porfirina) restaurează o sensibilitate de circa 100 de ori mai mare la stres termic a tulpinii deletate,

aducând-o în domeniul tulpinii martor.

6. Cuantificarea unor complexe ale manganului din punct de vedere al potențialelor

proprietati de tip superoxid-dismutază şi peroxidază/catalază prin tehnici originale de chemiluminescenţă.

S-a putut realiza o ierarhizare a acestor compuși şi o corelare a proprietaţilor analizate cu structurile

chimice. Cei mai eficienți substituenți ai porfirinelor cu mangan analizate au fost ierarhizați conform

proprietaţilor superoxid dismutazice şi peroxidazice ale compușilor în ordinea: 2-etil-piridil > fenil > etil.

7. Cuantificarea unei ftalocianine complexate cu mangan a generat rezultate remarcabile din

punct de vedere al potențialelor proprietăţi de tip superoxid-dismutază şi peroxidază/catalază prin tehnici

originale de chemiluminescenţă. Studiul pe o tulpină Schizosaccharomyces pombe cu deleţia genei

responsabile de superoxid dismutază mangan dependentă a demonstrat efectul invers a unor astfel de

compuși care la anumite concentrații se pot transforma din molecule enzyme-like antioxidante în agenți

41

prooxidanţi ceea ce subliniază importanţa naturii substituenţilor atât in modificarea caracterului lipofil-

hidrofil cât şi in modificarea proprietăţilor de tip enzimă artificială.

8. Analiza unor săruri de mangan ale hidroxiacizilor derivați de la acidul cinamic din punct

de vedere al proprietăţilor antioxidante neenzimatice a arătat importanţa manganului în augmentarea

proprietăţilor acestor compuși. S-a observat că, din punct de vedere structural, numărul grupărilor

hidroxil prezente în aceste săruri de mangan se poate corela cu capacitatea antioxidantă neenzimatică.

9. Prin utilizarea alopurinolului ca substrat generator al anionului superoxid în urma

interacțiunii cu xantin oxidaza, s-a pus la punct o metodă originală de analiză şi cuantificare a compușilor

cu mangan cu potențiale proprietăţi SOD mimice. Detecția finală s-a realizat printr-o tehnică de

chemiluminescenţă în care detectorul a fost lucigenina. Metoda a fost validată, calibrată şi apoi testată cu

trei combinații ale manganului, rezultatele fiind superpozabile cu cele din literatură.

II.8.2. Perspective de cercetare

Cele mai importante perspective deschise de studiile din această lucrare de doctorat sunt:

1. Implicarea unor cationi în producerea efectelor farmacoterapice ale unor compuși cu

proprietati antipsihotice. Dezvoltarea unor modele ale afecțiunilor psihiatrice şi testarea administrării

concomitente a manganului şi a altor oligoelemente cu antipsihoticele atipice.

2. Studiul terapiei antioxidante bazata pe compuși ai manganului care sa țintească sistemul

nervos central şi mitocondriile, pe modele de dementa în stare incipienta sau avansată.

3. Studiul reactivității vasculare pentru loturi de animale care primesc doze cu concentrații diverse ale manganului. Depistarea implicării radicalilor liberi se poate face folosind sistemul de generare

controlată a producției anionului superoxid.

4. Blocarea chimică a sintezei glutationului pe modelul S. Pombe cu şi fara deleţia genei

responsabile de sinteza superoxid dismutazei mangan-dependentă. Aplicarea modelelor de stres în aceasta

variantă şi aprecierea eficacității compușilor SOD mimici.

5. Diversificarea generării exogene de radical superoxid, pe cale chimică. Trei compuși ar

putea candida pentru aceasta poziție: menadiona, paraquatul şi plumbaginul. Dintre aceștia, menadiona (o

forma a vitaminei K fara radical lateral) reprezintă o prima opțiune, mai ales pentru ca generarea de anion

superoxid poate fi controlată şi amplificată cu ajutorul radiațiilor luminoase. Ar trebui apreciate

avantajele şi diferențele folosirii celor trei compuși în prezenţa şi în absenţa compușilor cu mangan SOD

mimici.

6. Testarea unui număr mai mare ale complexelor dintre ftalocianine cu substituenți diferiți şi

mangan folosind metoda bazată pe interacțiunea alopurinol-xantin oxidază şi testarea candidaților cu

IC50 sub 1 µM pe modelul S. Pombe cu deleţia genei pentru superoxid dismutaza mangan dependentă.

7. Legarea xantin oxidazei la nivelul fragmentului Fc al anticorpilor secundari şi testarea

chemiluminescentă cu alopurinol în mediu alcalin în scopul îmbunătăţirii semnalului chemiluminescent

din tehnici de tip ELISA sau Western Blot.

Bibliografie selectivă

[1] S. Hohmann, W.H. Mager, Yeast stress responses, [Rev. ed., Springer, Berlin ; New York, 2003.

[2] L. Tutar, Y. Tutar, Heat shock proteins; an overview, Curr Pharm Biotechnol 11 (2010) 216-222.

[3] H.S. Willenberg, S.R. Bornstein, G.P. Chrousos, Encyclopedia of Stress, Elsevier - ACADEMIC

PRESS, 2007.

[4] Y. Li, T.T. Huang, E.J. Carlson, S. Melov, P.C. Ursell, J.L. Olson, L.J. Noble, M.P. Yoshimura, C.

Berger, P.H. Chan, D.C. Wallace, C.J. Epstein, Dilated cardiomyopathy and neonatal lethality in mutant

mice lacking manganese superoxide dismutase, Nat Genet 11 (1995) 376-381.

[5] M. Pick, J. Rabani, F. Yost, I. Fridovich, The catalytic mechanism of the manganese-containing

superoxide dismutase of Escherichia coli studied by pulse radiolysis, J Am Chem Soc 96 (1974) 7329-

7333.

[6] E. Tremblay, L. Nitecka, M.L. Berger, Y. Ben-Ari, Maturation of kainic acid seizure-brain damage

syndrome in the rat. I. Clinical, electrographic and metabolic observations, Neuroscience 13 (1984) 1051-

1072.

42

[7] H. Baran, W. Loscher, M. Mevissen, The glycine/NMDA receptor partial agonist D-cycloserine

blocks kainate-induced seizures in rats. Comparison with MK-801 and diazepam, Brain Res 652 (1994)

195-200.

[8] M. Nechifor, Interactions between magnesium and psychotropic drugs, Magnesium Research 21

(2008) 97-100.

[9] M. Nechifor, C. Vaideanu, I. Palamaru, C. Barza, I. Mindreci, The influence of some antipsychotic

drugs on erythrocyte and plasmatic magnesium level and other bivalent cations level., 10th International

Magnesium Symposium (2003).

[10] R.C. Mohs, W.G. Rosen, K.L. Davis, The Alzheimer's disease assessment scale: an instrument for

assessing treatment efficacy, Psychopharmacol Bull 19 (1983) 448-450.

[11] W.G. Rosen, R.C. Mohs, K.L. Davis, A new rating scale for Alzheimer's disease, Am J Psychiatry

141 (1984) 1356-1364.

[12] G. McKhann, D. Drachman, M. Folstein, R. Katzman, D. Price, E.M. Stadlan, Clinical diagnosis of

Alzheimer's disease: report of the NINCDS-ADRDA Work Group under the auspices of Department of

Health and Human Services Task Force on Alzheimer's Disease, Neurology 34 (1984) 939-944.

[13] J. Greilberger, C. Koidl, M. Greilberger, M. Lamprecht, K. Schroecksnadel, F. Leblhuber, D. Fuchs,

K. Oettl, Malondialdehyde, carbonyl proteins and albumin-disulphide as useful oxidative markers in mild

cognitive impairment and Alzheimer's disease, Free Radic Res 42 (2008) 633-638.

[14] R.C. Petersen, G.E. Smith, S.C. Waring, R.J. Ivnik, E.G. Tangalos, E. Kokmen, Mild cognitive

impairment: clinical characterization and outcome, Arch Neurol 56 (1999) 303-308.

[15] M.F. Beal, Oxidative damage as an early marker of Alzheimer's disease and mild cognitive

impairment, Neurobiol Aging 26 (2005) 585-586.

[16] P. Mecocci, E. Mariani, V. Cornacchiola, M.C. Polidori, Antioxidants for the treatment of mild

cognitive impairment, Neurol Res 26 (2004) 598-602.

[17] T. Ishrat, K. Parveen, M.M. Khan, G. Khuwaja, M.B. Khan, S. Yousuf, A. Ahmad, P. Shrivastav, F.

Islam, Selenium prevents cognitive decline and oxidative damage in rat model of streptozotocin-induced

experimental dementia of Alzheimer's type, Brain Res 1281 (2009) 117-127.

[18] R.C. Petersen, R.G. Thomas, M. Grundman, D. Bennett, R. Doody, S. Ferris, D. Galasko, S. Jin, J.

Kaye, A. Levey, E. Pfeiffer, M. Sano, C.H. van Dyck, L.J. Thal, Vitamin E and donepezil for the

treatment of mild cognitive impairment, N Engl J Med 352 (2005) 2379-2388.

[19] S.T. DeKosky, J.D. Williamson, A.L. Fitzpatrick, R.A. Kronmal, D.G. Ives, J.A. Saxton, O.L.

Lopez, G. Burke, M.C. Carlson, L.P. Fried, L.H. Kuller, J.A. Robbins, R.P. Tracy, N.F. Woolard, L.

Dunn, B.E. Snitz, R.L. Nahin, C.D. Furberg, Ginkgo biloba for prevention of dementia: a randomized

controlled trial, JAMA 300 (2008) 2253-2262.

[20] B.J. Kelley, D.S. Knopman, Alternative medicine and Alzheimer disease, Neurologist 14 (2008)

299-306.

[21] I.L. Chapple, G.I. Mason, I. Garner, J.B. Matthews, G.H. Thorpe, S.R. Maxwell, T.P. Whitehead,

Enhanced chemiluminescent assay for measuring the total antioxidant capacity of serum, saliva and

crevicular fluid, Ann Clin Biochem 34 ( Pt 4) (1997) 412-421.

[22] W.R. McLauchlan, J. Sanderson, M. Quinlan, G. Williamson, Measurement of the total antioxidant

activity of human aqueous humor, Clin Chem 44 (1998) 888-889.

[23] Z.A. Placer, L.L. Cushman, B.C. Johnson, Estimation of product of lipid peroxidation (malonyl

dialdehyde) in biochemical systems, Anal Biochem 16 (1966) 359-364.

[24] N.Z. Baquer, J.S. Hothersall, A.L. Greenbaum, P. McLean, The modifying effect of manganese on

the enzymic profiles and pathways of carbohydrate metabolism in rat liver and adipose tissue during

development, Biochem Biophys Res Commun 62 (1975) 634-641.

[25] N.Z. Baquer, M. Sinclair, S. Kunjara, U.C. Yadav, P. McLean, Regulation of glucose utilization and

lipogenesis in adipose tissue of diabetic and fat fed animals: effects of insulin and manganese, J Biosci 28

(2003) 215-221.

[26] K. Mogre, S.J. Kashalikar, S.M. Kendurkar, Effect of Mn++ on blood sugar level in rats, Indian J

Physiol Pharmacol 26 (1982) 227-230.

[27] J.D. Piganelli, S.C. Flores, C. Cruz, J. Koepp, I. Batinic-Haberle, J. Crapo, B. Day, R. Kachadourian,

R. Young, B. Bradley, K. Haskins, A metalloporphyrin-based superoxide dismutase mimic inhibits

adoptive transfer of autoimmune diabetes by a diabetogenic T-cell clone, Diabetes 51 (2002) 347-355.

43

[28] B. Stoica, M. Nechifor, S. Dragomir, Effects of manganese cations on some biochemical parameters

in alloxan-induced diabetes of rats, TMJ 2 (2006) 447 - 451.

[29] D. Serban, B. Stoica, M. Hogas, I. Serban, A. Budurca, M. Nechifor, Manganese supplementation

affects endothelium-dependent relaxation in rats, Acta Physiologica 191 (2007) 18-145.

[30] A.Z. Kalea, D.A. Schuschke, P.D. Harris, D.J. Klimis-Zacas, Cyclo-oxygenase inhibition restores the

attenuated vasodilation in manganese-deficient rat aorta, J Nutr 136 (2006) 2302-2307.

[31] J.L. Ensunsa, J.D. Symons, L. Lanoue, H.R. Schrader, C.L. Keen, Reducing arginase activity via

dietary manganese deficiency enhances endothelium-dependent vasorelaxation of rat aorta, Exp Biol Med

(Maywood) 229 (2004) 1143-1153.

[32] O. Huet, L. Dupic, A. Harrois, J. Duranteau, Oxidative stress and endothelial dysfunction during

sepsis, Front Biosci 16 (2011) 1986-1995.

[33] A. Csiszar, J. Toth, J. Peti-Peterdi, Z. Ungvari, The aging kidney: role of endothelial oxidative stress

and inflammation, Acta Physiol Hung 94 (2007) 107-115.

[34] J.F. Davidson, B. Whyte, P.H. Bissinger, R.H. Schiestl, Oxidative stress is involved in heat-induced

cell death in Saccharomyces cerevisiae, Proc Natl Acad Sci U S A 93 (1996) 5116-5121.

[35] S. Yamashoji, A. Asakawa, S. Kawasaki, S. Kawamoto, Chemiluminescent assay for detection of

viable microorganisms, Anal Biochem 333 (2004) 303-308.

[36] D. Chen, C.R. Wilkinson, S. Watt, C.J. Penkett, W.M. Toone, N. Jones, J. Bahler, Multiple pathways

differentially regulate global oxidative stress responses in fission yeast, Mol Biol Cell 19 (2008) 308-317.

[37] V. Pevala, J. Kolarov, P. Polcic, Alterations in mitochondrial morphology of Schizosaccharomyces

pombe induced by cell-death promoting agents, Folia Microbiol (Praha) 52 (2007) 381-390.

[38] I. Batinic-Haberle, J.S. Reboucas, I. Spasojevic, Superoxide dismutase mimics: chemistry,

pharmacology, and therapeutic potential, Antioxid Redox Signal 13 (2010) 877-918.

[39] H.I. Jung, Y.Y. Lee, H.W. Lim, K.S. Ahn, E.H. Park, C.J. Lim, Regulation of the manganese-

containing superoxide dismutase gene from fission yeast, Mol Cells 14 (2002) 300-304.

[40] J.H. Jeong, E.S. Kwon, J.H. Roe, Characterization of the manganese-containing superoxide

dismutase and its gene regulation in stress response of Schizosaccharomyces pombe, Biochem Biophys

Res Commun 283 (2001) 908-914.

[41] A. Okado-Matsumoto, I. Batinic-Haberle, I. Fridovich, Complementation of SOD-deficient

Escherichia coli by manganese porphyrin mimics of superoxide dismutase activity, Free Radic Biol Med

37 (2004) 401-410.

[42] S. Nakmareong, U. Kukongviriyapan, P. Pakdeechote, W. Donpunha, V. Kukongviriyapan, B.

Kongyingyoes, K. Sompamit, C. Phisalaphong, Antioxidant and vascular protective effects of curcumin

and tetrahydrocurcumin in rats with L: -NAME-induced hypertension, Naunyn Schmiedebergs Arch

Pharmacol 383 (2011) 519-529.

[43] O. Vajragupta, P. Boonchoong, H. Watanabe, M. Tohda, N. Kummasud, Y. Sumanont, Manganese

complexes of curcumin and its derivatives: evaluation for the radical scavenging ability and

neuroprotective activity, Free Radic Biol Med 35 (2003) 1632-1644.

[44] T.P. Whitehead, G.H.G. Thorpe, S.R.J. Maxwell, Enhanced chemiluminescent assay for antioxidant

capacity in biological fluids, Analytica Chimica Acta 266 (1992) 265-277.

[45] F. Matemadombo, M. Durmus, V. Escriou, S. Griveau, D. Scherman, F. Bedioui, T. Nyokong,

Evaluation of the Performance of Manganese Phthalocyanines as Superoxide Dismutase Mimics, Current

Analytical Chemistry 5 (2009) 330-338.

[46] I. Spasojevic, I. Batinic-Haberle, R.D. Stevens, P. Hambright, A.N. Thorpe, J. Grodkowski, P. Neta,

I. Fridovich, Manganese(III) biliverdin IX dimethyl ester: a powerful catalytic scavenger of superoxide

employing the Mn(III)/Mn(IV) redox couple, Inorg Chem 40 (2001) 726-739.

[47] Q. Feng, L. Liu, Y. He, H. Wang, M. Wu, F. Mei, Studies on metal phthalocyanine as a dual

functional mimic enzyme, J Tongji Med Univ 21 (2001) 13-16.

[48] S. Butsat, S. Siriamornpun, Phenolic acids and antioxidant activities in husk of different thai rice

varieties, Food Sci Technol Int 16 (2010) 329-336.

[49] K.A. Johnson, D.A. Hulse, R.C. Hart, D. Kochevar, Q. Chu, Effects of an orally administered

mixture of chondroitin sulfate, glucosamine hydrochloride and manganese ascorbate on synovial fluid

chondroitin sulfate 3B3 and 7D4 epitope in a canine cruciate ligament transection model of osteoarthritis,

Osteoarthritis Cartilage 9 (2001) 14-21.

44

[50] F. Matthijssens, P. Back, B.P. Braeckman, J.R. Vanfleteren, Prooxidant activity of the superoxide

dismutase (SOD)-mimetic EUK-8 in proliferating and growth-arrested Escherichia coli cells, Free Radic

Biol Med 45 (2008) 708-715.

[51] K. Okamoto, T. Nishino, Crystal structures of mammalian xanthine oxidoreductase bound with

various inhibitors: allopurinol, febuxostat, and FYX-051, J Nippon Med Sch 75 (2008) 2-3.

[52] M.A. Barbacanne, J.P. Souchard, B. Darblade, J.P. Iliou, F. Nepveu, B. Pipy, F. Bayard, J.F. Arnal,

Detection of superoxide anion released extracellularly by endothelial cells using cytochrome c reduction,

ESR, fluorescence and lucigenin-enhanced chemiluminescence techniques, Free Radic Biol Med 29

(2000) 388-396.

[53] N.S. Matveeva, O.B. Liubitskii, A.N. Osipov, A. Vladimirov Iu, [Lucigenin-enhanced

chemiluminescence of the animal tissues], Biofizika 52 (2007) 1120-1127.

[54] H. Tamta, S. Kalra, A.K. Mukhopadhyay, Biochemical characterization of some

pyrazolopyrimidine-based inhibitors of xanthine oxidase, Biochemistry (Mosc) 71 Suppl 1 (2006) S49-

54.

[55] S. Banu, G.M. Greenway, R. Alan Wheatley, Luminol chemiluminescence induced by immobilised

xanthine oxidase, Anal Chim Acta 541 (2005) 89-85.

[56] I. Batinić-Haberle, I. Spasojević, R.D. Stevens, P. Hambright, I. Fridovich, Manganese(iii) meso-

tetrakis(ortho-N-alkylpyridyl)porphyrins. Synthesis, characterization, and catalysis of O2˙− dismutation,

Journal of the Chemical Society, Dalton Transactions (2002) 2689-2696.

[57] S. Hussain, S.F. Ali, Manganese scavenges superoxide and hydroxyl radicals: an in vitro study in

rats, Neurosci Lett 261 (1999) 21-24.

[58] J.G. Duncan, R. Ravi, L.B. Stull, A.M. Murphy, Chronic xanthine oxidase inhibition prevents

myofibrillar protein oxidation and preserves cardiac function in a transgenic mouse model of

cardiomyopathy, Am J Physiol Heart Circ Physiol 289 (2005) H1512-1518.

[59] L.B. Stull, M.K. Leppo, L. Szweda, W.D. Gao, E. Marban, Chronic treatment with allopurinol boosts

survival and cardiac contractility in murine postischemic cardiomyopathy, Circ Res 95 (2004) 1005-1011.

[60] C. Galbusera, P. Orth, D. Fedida, T. Spector, Superoxide radical production by allopurinol and

xanthine oxidase, Biochem Pharmacol 71 (2006) 1747-1752.

[61] G.B. Elion, Enzymatic and metabolic studies with allopurinol, Ann Rheum Dis 25 (1966) 608-614.

[62] I. Fridovich, Quantitative aspects of the production of superoxide anion radical by milk xanthine

oxidase, J Biol Chem 245 (1970) 4053-4057.

[63] E.E. Kelley, N.K. Khoo, N.J. Hundley, U.Z. Malik, B.A. Freeman, M.M. Tarpey, Hydrogen peroxide

is the major oxidant product of xanthine oxidase, Free Radic Biol Med 48 (2010) 493-498.

[64] E.B. Menshchikova, N.K. Zenkov, N.V. Kandalintseva, A.E. Prosenko, Combination of methods for

in vitro study of antioxidant properties of chemical compounds, Bull Exp Biol Med 146 (2008) 741-743.

[65] L. Naso, A.C. Gonzalez Baro, L. Lezama, T. Rojo, P.A. Williams, E.G. Ferrer, Synthesis, chemical

speciation and SOD mimic assays of tricarballylic acid-copper(II) and imidazole-tricarballylic acid-

copper(II) complexes, J Inorg Biochem 103 (2009) 219-226.

[66] A. Barik, B. Mishra, L. Shen, H. Mohan, R.M. Kadam, S. Dutta, H.Y. Zhang, K.I. Priyadarsini,

Evaluation of a new copper(II)-curcumin complex as superoxide dismutase mimic and its free radical

reactions, Free Radic Biol Med 39 (2005) 811-822.

[67] H. Kimura, M. Nakano, Highly sensitive and reliable chemiluminescence method for the assay of

superoxide dismutase in human erythrocytes, FEBS Lett 239 (1988) 347-350.

45

Lucrări publicate în legătură cu tematica tezei de doctorat

Articole în extenso

[1] B.A. Stoica, G. Bordeianu, R. Stanescu, D.N. Serban, M. Nechifor, A new method for the

quantification of superoxide dismutase mimics with an allopurinol-xanthine oxidase-lucigenin enhanced

system, J Biol Inorg Chem 16 (2011) 753-761 DOI: 10.1007/s00775-011-0777-8. (Factor de impact –

3,67)

[2] B.A. Stoica, M. Rusu, T. Petreus, M. Nechifor, Manganese SOD Mimics Are Effective Against

Heat Stress in a Mutant Fission Yeast Deficient in Mitochondrial Superoxide Dismutase, Biol Trace Elem

Res (2011) DOI: 10.1007/s12011-011-9035-8. (Factor de impact – 1,4)

[3] B.A. Stoica, M. Nechifor, D.N. Serban, Effects of manganese cations on some biochemical

parameters in alloxan-induced diabetes of rats, Timisoara Medical Journal 56 (2006) 447-450. (Articol

premiat)

[4] M. Padurariu, A. Ciobica, L. Hritcu, B.A. Stoica, W. Bild, C. Stefanescu, Changes of some

oxidative stress markers in the serum of patients with mild cognitive impairment and Alzheimer's disease,

Neurosci Lett 469 (2010) 6-10. (Factor de impact – 2.2, 17 citări)

[5] E. Petrescu, P.M. Voicu, M. Poitelea, B.A. Stoica, R. Stanescu, M. Rusu, Deletion of two genes

from the genome of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Genetic manipulation and phenotype

study, Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi 109 (2005) 105-109.

[6] R. Haliga, V. Mocanu, I. Paduraru, B.A. Stoica, T. Oboroceanu, V. Luca, Effects of dietary

flaxseed supplementation on renal oxidative stress in experimental diabetes, Rev Med Chir Soc Med Nat

Iasi 113 (2009) 1200-1204.

[7] I. Dobrin, A. Ciobîca, M. Padurariu, B.A. Stoica, C. Stefanescu, R. Chirita, Comparison

between the effects of typical and atypical antipsychotics on oxidative stress status in schizophrenic

patients, Analele stiintifice ale Universitatii Alexandru Ioan Cuza, Sectiunea Genetica si Biologie

Moleculara TOM XI Fasc.4 (2010) 197-203.

Rezumate

[1] D.N. Serban, B.A. Stoica, M. Hogas, I.L. Serban, A.R. Budurca, M. Nechifor, Manganese

supplementation affects endothelium-dependent relaxation in rats, Acta Physiol 190 (S658) (2007) 91.

(Factor de impact – 2.085)

[2] D.N. Serban, B.A. Stoica, M.M. Hogaş, I.L. Serban, M. Nechifor, Suplimentarea aportului de

mangan la şobolan afectează relaxarea endotelio-dependentă, A XXII-a Conferinţa Societăţii Române de

Stiinţe Fiziologice (Bucureşti, 1-2 iunie 2007) p. 125, ISBN 978-973-708-227-5.

[3] D.N. Serban, I.L. Serban, M.M. Hogas, S.E. Tucaliuc, B.A. Stoica, M. Nechifor, Changes of

arterial pressure and in vitro arterial reactivity in rats subjected to chronic L-NAME and Mg treatment,

Acta Physiol 190 (S658) (2007) 34. (Factor de impact – 2.085)

[4] B.A. Stoica, I.L. Serban, D.D. Branisteanu, S. Beschea-Chiriac, D.N. Serban, Prominent role of

large conductance calcium-dependent potassium channels in endothelium-dependent relaxation of rat

small mesenteric arteries in alloxanic diabetes, J Vasc Res 46 (S1) (2009) 194. (Factor de impact –

2.792)

[5] B.A. Stoica, I.L. Serban, M.M. Hogas, M. Nechifor, D.N. Serban, Original system for

controlled oxidative stress, used to induce endothelial dysfunction in isolated arteries, Works and views in

endothelium-dependent vasodilation, 13-14 May 2009, Iasi, Romania.

[6] B.A. Stoica, I.L. Serban, M. Nechifor, M.M. Hogas, D.N. Serban, Quinone-based system for the

controlled induction of oxidative stress and endothelial dysfunction in isolated arteries, J Vasc Res 46

(S1) (2009) 97. (Factor de impact – 2.792)

[7] M. Padurariu, C. Stefanescu, R. Branzei, A. Ciobica, B.A. Stoica, Oxidative stress in patients

with mild cognitive impairment and depression: a possible factor for increasing the risk of developing

dementia?, Journal of Neurology Volume 256 Supplement 2 June (2009) 70-71. (Factor de impact –

2.536)

46

[8] M. Padurariu, C. Stefanescu, A. Ciobica, B.A. Stoica, The importance of oxidative stress in

dementia progression, Parkinsonism & Related Disorders Volume 15, Supplement 2 December (2009)

S38. (Factor de impact – 1.907)

[9] R. Ciobotariu, M. Padurariu, A. Ciobica, B.A. Stoica, C. Stefanescu, Some important

implications of oxidative stress in patients with depression and insomnia, European Journal of Neurology

17 (Suppl. 3) 620. (Factor de impact – 2.51)

[10] D. Ciubotariu, D.I. Chelărescu, B.A. Stoica, M. Pascu, M. Nechifor, Manganese Influence on

Morphine-Induced Conditioned Place Preference in Rats, The Journal of European College of

Neuropsychopharmacology, Vol. 18 Suppl. 4 (2008) p. S242 ISSN: 0924-977X (Print), 0924-977X

(Online).

[11] D. Ciubotariu, D.I. Chelărescu, B.A. Stoica, M. Nechifor, Manganese Effects on Brain

Dopamine Levels Evaluated in the Context of Morphine Conditioned Place Preference Model, 5th

International Meeting “Advances in Antioxidants (Trace Elements, Vitamins and Polyphenols):

Molecular Mechanisms, Nutritional and Clinical Aspects” Monastir-Sousse (Tunisia) Abstract Book

(2008) p. 25-27 October 11-15, ISBN: 1724-9793.

[12] B.A. Stoica, M. Rusu, M. Nechifor, Cercetari privind actiunea unor compusi ai manganului cu

actiune SOD-mimetica in vitro si in vivo; al IX-lea Congres International de Farmacologie Terapeutica si

Toxicologie Clinica Sibiu poster (2008).

[13] D.N. Şerban, B.A. Stoica, I.L. Şerban, A.I. Creţu, C. Gaşpar, M. Nechifor, Reactivitatea

vasculară şi capacitatea antioxidantă în diabetul aloxanic: efectul dietei bogate în Mn, A XXI-A

Conferinţă Naţională a Societăţii Române de Ştiinţe Fiziologice Oradea, 11-13 Mai (2006).

[14] M. Nechifor, B.A. Stoica, I. Mindreci, S. Negru, Cercetări referitoare la influenţa risperidonei

asupra unor cationi plasmatici şi urinari în condiţii normale şi de stress, Al V-lea Congres Naţional de

Farmacologie Terapeutică şi Toxicologie Clinică Mai (2004).

[15] B.A. Stoica, G. Bordeianu, R. Stanescu, D.N. Serban, M. Nechifor, A kinetic study of

superoxide generation from allopurinol-xanthine oxidase. Potential uses in superoxide dismutase

determination, 11-th International Congress of Clinical Pharmacology, Therapeutics and Toxicology

Oradea, Romania 8-11 June (2010).

influenţa farmacoterapiei cu unii cationi bivalenţi asupra unor

Documents