informe depractiaca de capacidada antioxidante y polifenoles totales del ajos sacha jork...
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I. INTRODUCCION
En el presente informe de práctica se hace conocer que el Centro
de investigación para el Desarrollo biotecnológico de la Amazonia (CIDBAM),
es un centro de investigación orientado a fomentar el desarrollo de los diversos
recursos naturales que existe en nuestro ecosistemas de la amazonia, a la vez
se describe los procedimientos realizados en los trabajos de investigación
como también el reconocimiento de las instalaciones, áreas, equipos, reactivos
y los métodos de los análisis.
El CIDBAM viene desarrollando investigaciones en frutas,
vegetales y plantas, que presentan propiedades funcionales medicinales ya
que ayuda a prevenir las enfermedades de las persona. Productos elaborados
en forma natural a base de estas plantas están siendo comercializados como:
fármacos, jarabes, bebidas, productos atomizados entre otros productos, el
consumo y la alta demanda existente, es por ello que se enfocó sobre la
cuantificación de sus propiedades químicas y capacidad antioxidante en hojas
de ajos sacha (Mansoa alliacea L.) deshidratado y liofilizado.
En el desarrollo de la práctica se planteó los siguiente objetivos:
Conocer el funcionamiento del centro de investigación.
Caracterizacion fisico – quimico, determinacion de polifenoles totales y
capacidad antioxidante en hojas de ajos sacha, por el metodo del radical
DPPH.
II. REVISION BIBLIOGRAFICA
2.1. Aspectos generales de ajos sacha
Crece en zonas tropicales con precipitación pluvial de 1800 a
3500 mm/año, temperaturas entre 20 a 26 ºC, son de suelo arenoso o
arcilloso con abundante materia orgánica. Habita en faldas de altura, alejada
de cuerpos de agua, chacras nuevas, áreas sombreadas o poco
sombreadas tanto de purmas como de bosque primario. No es resistente a la
inundación. Comparte su hábitat con las siguientes especies: aguaje, algodón,
bijao, caña agria, carahuasca, castaña, cedro, cetico, cordoncillo,
charichuelo, chiricsanango, chuchuhuasi, espintana, huacapú,
huamansamana, huito, limón, patiquina, pijuayo, poma rosa, pona, sangre de
grado, sapohuasca, shapaja, ubos, umarí, uña de gato, uvilla, yarina, zapote.
Su área de distribución se extiende desde México a Perú incluyendo toda
Centroamérica, en Perú se encuentra distribuida en los departamentos de
Amazonas, Huánuco, Loreto (Tamshiyacu, Valentín e Indiana, río
Amazonas; Llachapa y Corazón de Jesús, río Napo; Padre Cocha, río
Nanay; Contamana, río Ucayali) y San Martín (IIAP, 1995).
En Nicaragua, en la medicina tradicional de la isla de Ometepe, se
usa para curar las cefaleas haciendo vaporaciones de la decocción de este
vegetal, la cual es respirada durante varios días después de disminuir la fiebre.
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Los amerindios de la Amazonía peruana usan las hojas, raíces y corteza del
bejuco, macerados en agua fresca, contra problemas sistémicos como gripe,
fiebre y reumatismo. También se tiene el conocimiento de que posee
propiedades repulsivas de insectos (insecticida), para lo cual se usa una
maceración de sus hojas y raíces en frío durante un día, tras lo cual ésta se
pulveriza directamente sobre las plantas impidiendo que sean invadidas por
molestos insectos patógenos y otros desfoliadores en cultivos (LOPEZ Y
PEREZ, 2010)
2.1.1. Clasificación taxonómica
Según RENGIFO (2001), menciona que el ajo sacha está
clasificado:
Familia: BIGNONIACEAE
Nombre científico: Mansoa alliacea L.
Nombre común: Ajos del monte
Figura 1. Ajos sacha (Mansoa alliacea L.)
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2.1.2. Características morfológicas
Arbusto semitrepador de 3 m de altura o más, partes vegetativas
con olor a ajos o cebolla, pseudo estípulas pequeñas, aplanadas y cónicas.
Hojas bifolioladas con zarcillo trífido, foliolos abovados a elípticos de 5-27 x 2-
18 cm, de ápice agudo a obtuso y base cuneada. Inflorescencias axilares en
racimos o panículas pausifloras; cáliz cupular de 5-10 cm x 6-11 mm; corola
violeta tubular campanulada de 6 a 9 cm de largo. Fruto cápsula lineal oblonga
lignificada, fuertemente angulada, de superficie lisa. Semillas con dos alas
membranáceas, parduzcas y subhialinas en el borde (TAYLOR, 2006).
2.2. Antioxidantes
Un antioxidante es una sustancia capaz de neutralizar la acción
oxidante de los radicales libres, liberando electrones que son captados por los
radicales libres, manteniendo su estabilidad (AVELLO Y SUWALSKY, 2006).
Estos compuestos prolongan la vida útil de los alimentos, protegiendo contra el
deterioro causado por la oxidación, evitando la rancidez de las grasas y los
cambios de color (SEIS, 1997). Deben estar presentes en el organismo en una
concentración suficiente que permita prevenir la acumulación de elementos
pro-oxidantes (HALLIWELL Y GUTTERIDGE, 1985).
2.2.1. Función de los antioxidantes
El antioxidante al reaccionar con el radical libre, le cede un
electrón, oxidándose a su vez y transformándose en un radical libre débil no
tóxico, que en algunos casos, puede volver a su estado inicial mediante la
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actuación de otros antioxidantes (SEIS, 1997). Pueden actuar previniendo la
formación de radicales libres, interceptando el ataque de las mismas, captando
los metabolitos reactivos y convirtiéndolos en moléculas menos reactivas,
facilitando la reparación del daño provocado y manteniendo un ambiente
favorable para la actuación de otros antioxidantes (HALLIWELL Y
GUTTERIDGE, 1985).
2.2.2. Tipos de antioxidantes
- Antioxidantes endógenos
Son los antioxidantes que se encuentran normalmente en el
organismo se llaman endógenos y generalmente son sistemas enzimáticos
como la superóxido dismutasa (mitocondrial, citoplasmática y extracelular), la
catalasa y el complejo glutatión peroxidasa (PINEDA, 2005).
- Antioxidantes exógenos
Los antioxidantes exógenos o no enzimáticos, transforman los
radicales libres en menos agresivos. Entre ellos tenemos: Flavonoides, alfa
tocoferol (vitamina E), beta caroteno, vitamina C, glutatión y urato reporta que
las plantas producen una gran variedad de productos secundarios que
contienen grupos de fenoles, flavonoides, lignina, y taninos condensados
(POKORNY et al., 2005).
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2.2.3. Polifenoles
VON (2011), hace mención que los polifenoles son un amplio grupo
de metabolitos secundarios que abundan en las plantas. Cumplen importantes
funciones como agentes de defensa contra estrés bióticos (patógenos y
herbívoros) y abióticos (radiaciones ultravioletas y sequía). Los compuestos
fenólicos son metabolitos secundarios de las plantas, estos compuestos son
importantes en el crecimiento y reproducción, proveen protección contra los
patógenos y depredadores, también contribuyen en el color y las características
sensoriales de las frutas y vegetales.
Los compuestos fenólicos exhiben un amplio rango de propiedades
fisiológicas, tales como antialérgico, anti-artherogenic, antiinflamatorio,
antimicrobiano, antioxidante, antitrombotico, protección cardiovascular y
efectos vasodilatador, estos compuestos han sido asociados con la salud por
los beneficios que aportan en el consumo de frutas y vegetales, esto es
atribuido a su actividad antioxidante (BALASUNDRAM et al., 2005).
2.3. Radicales libres
ANDERSON Y PHILLIPS (2001) mencionan que cualquier
molécula o átomo que contiene uno o más electrones desapareados es un
radical libre; por lo tanto, los radicales libres intentaran arrancar un electrón de
otra molécula y en este proceso rompen otras parejas de electrones para
conseguir su propio apareamiento creando así moléculas inestables
generándose una reacción en cadena.
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Los procesos de oxidación producen radicales libres que pueden
interferir en los procesos normales y dañar las células corporales causando
estrés oxidativo. El estrés oxidativo, se define como el desbalance entre la
producción de radicales libres y la cantidad de antioxidantes presentes en el
ambiente intracelular (ELEJALDE, 2001). Muchas sustancias tóxicas son
capaces de producir radicales libres y de disminuir nuestra defensa
antioxidante (MURILLO, 2006).
2.3.1. Radical 1,1 difenil-2-picril-hidrazil (DPPH)
Es un radical libre estable y se utiliza como indicador para medir la
capacidad de secuestro de cualquier compuesto que posea actividad
antioxidante. El principio del método del DPPH consiste en la sustracción de un
átomo de hidrogeno proveniente de un fenol donador (ejemplo compuesto
fenólicos) para generar el compuesto definilpicrihidrazina y un radicalfenoxil. En
este proceso, la reacción desarrolla un cambio de color de violeta a amarillo a
medida que disminuye la absorbancia detectable a 515 nm. (LEBEAU, et al.,
2000).
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III. PLAN DE TRABAJO
3.1. Funcionamiento del Centro de Investigación para el Desarrollo
Biotecnológico de la Amazonía - CIDBAM
3.1.1. Ubicación
3.1.2. Organización
3.1.3. Reconocimiento de áreas de trabajo, materiales,
equipos y reactivos
3.2. Caracterización fisico - química y capacidad antioxidante de las hojas
de ajos sacha
3.2.1 Método de análisis
Para cumplir con este propósito se realizará diversos análisis de
estudio como: químico proximal, polifenoles totales y capacidad antioxidante.
3.2.2. Caracterización fisicoquímica de las hojas de ajos sacha
Para cumplir con este propósito se preparará la muestra y luego se
caracterizará fisicoquímicamente.
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3.2.3. Polifenoles totales y su capacidad antioxidante de las
hojas de ajos sacha
- .Determinación de polifenoles totales
- Determinación de la capacidad antioxidante
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IV. DESARROLLO DEL PLAN DE TRABAJO
4.1. Del funcionamiento del Centro de Investigación para el Desarrollo
Biotecnológico de la Amazonía (CIDBAM)
4.1.1. Ubicación
El Centro de Investigación para el Desarrollo Biotecnológico de la
Amazonía (CIDBAM) se encuentra ubicado en la avenida universitaria s/n 1.5
km. de la carretera central Tingo María- Huánuco, a 650 m.s.n.m. con una
humedad relativa de 80% y una temperatura promedio de 25º C.
4.1.2. Organización
El Centro de investigacion para el desarrollo Biotecnologico de la
amazonia (CIDBAM) es un organo desconcentrado del vicerrectorado de la
universidad nacional agraria de la selva cuya mision es la formacion cientifica y
tecnicas a profesionales de distintas especialidades en ciencia y se encuentra
conformado con un organigrama como se muestra en el anexo 01.
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4.2. Reconocimiento de Áreas de trabajo, materiales, equipos y
reactivos
Centro de Investigación para el Desarrollo Biotecnológico de la
Amazonía (CIDBAM) consta de 5 áreas de trabajo que son:
- Área de micro propagación in vitro de vegetales.
- Área de antioxidantes.
- Área de HPLC.
- Área de cultivo celular.
- Área de biología molecular.
4.2.1. Área de micropropagación in vitro de vegetales
El área de micropropagación realiza cultivo de células vegetales
para multiplicar cualquier parte de la planta para trabajo de investigación y se
da las condiciones ambientales para dicho proceso.
Esta área cuenta con 3 ambientes que son: sala de preparación
(ahí se realiza la desinfección de la muestra, materiales y se preparación de
medios de cultivo), de siembra (este ambiente tiene que estar aséptico para la
siembra respectivamente) y de incubación (en este ambiente se da las
condiciones adecuadas tanto de temperatura, humedad, y de fotoperiodo para
el respetivo crecimiento de la muestra).
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a) Materiales
- Asa de siembra.
- Baguetas de vidrio.
- Fiolas de 1000mL, 500mL, 50mL y 10mL.
- Matraces.
- Mecheros.
- Placas Petri.
- Pipetas de 1 mL.
- Probetas.
- Termómetros.
- Tubos de ensayo Genx Mate (10mL, 50 mL).
- Vasos de precipitación (100mL, 500mL, 100mL).
b) Equipos
- Autoclave NAPCO model – 9000 D, 32 psi, 130ºC, 230 V, 6,3 A, 1430
w, USA.
- Balanza analítica AE 163 (ADAM TOLEDO, Switzerland).
- Equipo de flujo laminar marca PIDESTAL modeloODH4- 9340A, 220-
110 V.
- Equipo de PCR marca BIOMETRA modelo T personal TVL-312A, 220-
240 V.
- Equipo de electroforesis marca ESPECTROLINE modelo 25x-2, 220-
240 V.
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4.2.2. Área de antioxidantes
En esta área se realizaba la determinación de la capacidad
antioxidante, polifenoles totales, carotenoides, etc. De plantas de la amazonia
para conocer y determinar los compuestos activos presentes en ellos.
a) Equipos
- Autoclave NAPCO modelo – 9000 D, 32 psi, 130ºC, 230 V, 6,3 A, 1430
w, USA.
- Baño maría modelo YCW-010E (Associated With Cannic, Inc, USA).
- Balanza analítica: digital Precisión, capacidad máxima 210 g., modelo
ESJ 210-4.
- Balanza analítica digital, sensibilidad ± 0.0001g. U.S.A. marca
Sartorius.
- Balanza analítica modelo AE 163 (METLER TOLEDO, Switzerland).
- Centrifuga marca Hettich – modelo MIKRO 22R y velocid. 10,000 rpm.
- Congelador FFV-2065FW (Frigidaire, USA).
- Congelador vertical BOSCH.
- Desionizador modelo D 7035 (Barnstead).
- Espectrofotómetro modelo Genesys 6 (Thermo Electrón Corporation).
- Estufa modelo ODH6- 9240A (TOMOS Heatring Drying Oven).
- Homogenizador modelo VORTEX GENIE-2 (Scientific industrias SITM).
- Horno microondas SANSUNG.
- pH metro marca METTLER TOLEDO.
- Micropipetas de 0.1-1.0
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- Refrigerador Icebeam Door Cooling LG GR-5392QLC.
- Rotavapor BUCHI R-200.
- Sonicador JAC ULTRASONIC 1002.
4.2.3. Área de HPLC
El área de Cromatografía Líquida de Alta Performancia (HPLC),
tiene un ambiente de 50.08 m2. Ahí se realiza la separación de compuestos,
que permite aislar, identificar y cuantificar los compuestos desconocidos tales
como vitaminas, proteínas y compuestos activos como flavonoides, alcaloides y
esteroles en una muestra o solución conocida. Para la cuantificación de estos
compuestos se utiliza estándares específicos.
a) Materiales
- Fiolas de 1000mL, 500mL, 100mL, 50mL y 10mL.
- Matraces Erlenmeyer, PIREX.
- Micropipetas, Gene Mate® de 1000 µL, 200µL y 100µL.
- Probetas.
- Termómetros.
- Tips, FISHERBRAND® de1000µL, 200µL y 100 µL.
- Vasos de precipitación de 1000 mL, 500 mL, 100 mL, 50 mL y 10mL.
b) Equipos
- Equipo de cromatografía líquida de alta performancia (HPLC) modelo
LC-10AVP (ShimadzuScientific, MD, USA.). Equipado con:
Desgasificador modelo FCV – 10AL VP, Bomba modelo LC-10ATVP,
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Columna cromatográfica C18-110R Gemini, Horno de columna modelo
CTO – 10ASVP Detector UV-Vis modelo SPD-10AVVP, Controlador
Modelo SCL – 10AVP, Software de interfase CLASS-VP, Computadora
compatible USB-52X, Inyector de muestra de capacidad 20 µL.
- Homogenizador modelo VORTEX GENIE-2 (Scientificindustrias SITM).
c) Reactivos y solventes
- Ácido acético, Sigma Chemical.
- Acetonitrilo (grado HPLC), Sigma Chemical.
- Etanol (grado HPLC), Sigma Chemical.
- L(+) ácido ascórbico puro, Sigma Chemical.
- (+)-catequin, Sigma Chemical.
- Metanol (grado HPLC), Sigma Chemical.
4.2.4. Área de cultivo celular
El área de cultivo celular tiene 30.08 m2, está enfocada en la
búsqueda de microorganismos productores de enzimas, de interés las lipasas.
a) Materiales
- Asa de siembra.
- Baguetas de vidrio estériles.
- Erlenmeyer estériles.
- Gradillas.
- Matraz.
- Mecheros.
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- Micro pipetas.
- Pipetas bacteriológicas estériles.
- Placas petri.
b) Equipos
- Agitador orbital de bandeja BAMSTEAD internacional Lab-Line, Modelo
MaxQ2000, 220 – 240V, 0.4 A, 45 w, 50/60 Hz, 500 rpm USA.
- Incubadora Labor MUSZERIPARI MUVER LP – 111, 220V, 0,19 Kw,
HUNGARA.
c) Medios de cultivo
- Agar-agar Merck GERMANY.
- Agar OGY Merck GERMANY.
- Agar glucosa Merck GERMANY.
- Agar Sabouraud Merck GERMANY.
- Extracto de carne seco granulado Merck GERMANY.
- Extracto de levadura BIOGEN.
- Glicerina Merck GERMANY.
- Goma arábiga SIGMA ALDRICH.
- Peptona de carne obtenida por digestión pancreática granulado Merck
GERMANY.
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4.2.5. Área biología molecular
Es un ambiente de 50,08 m2, es el encargado de realizar los
ensayos de determinación de ADN.
a) Materiales
- Erlenmeyer estériles de 500 ml de capacidad.
- Gradillas.
- Mecheros.
- Pipetas bacteriológicas estériles.
b) Equipos
- Equipo de electroforesis marca ESPECTROLINE modelo TVL-312A,
220-240 V.
- Destilador modelo D 7036 (Barnstead).
- Equipo de PCR marca BIOMETRA modelo T personal TVL-312A, 220-
240 V.
- Equipo de termociclador marca MINICYCLER TM modelo MJ Research
- PTC-150, 220-240 V.
4.3. Métodos de análisis realizados en el CIDBAM
4.3.1. Análisis químico proximal
La Materia prima seleccionada se sometió a las siguientes
determinaciones:
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- Humedad, método 23.003 AOAC (1997).
- Proteína, método 991.29 AOAC (1997).
- Grasa, método 935, 60 AOAC. (1997).
- Fibra, método 930.20 AOAC (1997).
- Cenizas, método 942.50 de calcinación directa AOAC (1997).
4.3.2. Cuantificación de polifenoles Totales
Se empleó el Método de Folin-Ciocalteu reportado por SANDOVAL
et al., (2001).
- Curva patrón
La curva patrón se preparó a partir de una solución stock de 10
mL de ácido gálico a una concentración de 2 mg/mL, a partir de esta solución
stock se prepararon diluciones de 0,0625; 0,125; 0,25; 0,50; 1,00; 1,25
mg/mL. En cada tubo de ensayo se adicionó 1580 µL agua destilada, 20 µl de
las soluciones patrones diluida, 100 µL de reactivo de fenol follin-ciocalteu y
finalmente 300 µL Na2CO3 al 20%. Se dejó reaccionar por 2 horas a
temperatura ambiente y luego se realizó la lectura en el espectrofotómetro
UV/VIS, a una longitud de onda de 700 nm.
- Cuantificación de polifenoles totales en hojas de ajos
sacha
Se tomó 1580 µL de H2O destilada y se agregó en un tubo de
ensayo, luego se adiciono 20 µl de la muestra centrifugada de hojas de ajos
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sacha deshidratadas (45 mg/mL) y liofilizado (40 mg/mL), seguidamente se
adiciono 300 µl de Carbonato de sodio (Na2CO3) para neutralizar la reacción y
finalmente 100 µl de reactivo de fenol follin-ciocalteu; vortear toda la solución
y luego se incubo por 2 horas en la oscuridad y ser leída a 700 nm. Los
resultados se expresaron en miligramos equivalentes de Ácido Gálico (EAG)
por 100 gramos de muestra.
4.3.3. Determinación de la capacidad antioxidante mediante
la prueba DPPH.
Se utilizó el Método de inhibición del radical DPPH (2,2-diphenyl-1-
picrilhydrazyl), descrito por Brand- Williams modificado por Sandoval et al.,
(2001).
Se preparó la solución stock de 10 mL a 1 mM del reactivo DPPH
con metanol, luego se homogenizó la solución (con Vortex) de 2 a 5 minutos
hasta una completa solubilización y se almacenó a 4 º C. A partir de la solución
stock 1 mM se preparó 40 mL de solución a 100 µM DPPH con metanol. Luego
se preparó soluciones de trabajo a partir del extracto (60, 200, 400, 800 µg/mL)
y liofilizado (40, 250, 500, 700 µg/mL). Después se hizo reaccionar cada
solución de trabajo con 50 µL de cada extracto con 950 µL de la solución de
DPPH (100 µM) en una cubeta de poliestireno. La inhibición de los radicales
libres DPPH se determinó por la decoloración de la solución violeta a amarillo,
la cual se monitoreó por espectrofotómetro a 515 nm. A medida que hay un
mayor secuestro de los radicales libres por un antioxidante, la absorbancia
disminuye. Para la determinación del porcentaje de inhibición se utilizó la
siguiente ecuación:
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% InhibicionDPPH=[ (AbsControl−AbsMuestra)AbsControl ]×100
Dónde: Abs. Control: Absorbancia del control
Abs. Muestra: Absorbancia de la muestra en 10 min.
4.4. Caracterización fisicoquímica de las hojas de ajos sacha
4.4.1. Recolección y preparación de Materia prima
Las hojas de ajos sacha fueron recolectadas en horas de la
mañana sortilegio, perteneciente al departamento de Huánuco, provincia de
Leoncio prado, distrito de Hermilio Valdizán, en la finca Milagros en el Km
27.8 de la carretera Tingo María- Aguaytía.
Las hojas de ajos sacha recolectadas y seleccionados se
trasladaron al Laboratorio del Centro de Investigación para el Desarrollo
Biotecnológico de la Amazonia (CIDBAM). Las hojas de ajos sacha se
llevaron a un secado directo (65 °C/12 horas) en estufa y a un liofilizado.
Las hojas deshidratadas y liofilizadas se molieron en un molinillo
eléctrico, luego pesó y fue envasado en bolsas de polietileno, codificadas y
almacenadas. Para el análisis de proteína, fibra, grasa, ceniza, se usaron
hojas secas. En la Figura 2, se muestra los pasos realizados para obtención
de las muestras.
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Figura 2. Preparación de la muestra.
4.4.2. Preparación de los extractos
Se pesó 2 g muestra deshidratada y liofilizada se añadió 20 mL de
solución hidroalcoholica (alcohol a 96°/ agua; 50/50 v/v) haciendo 100 mg/mL,
estas muestras fueron transferidas a unos frascos de color ámbar; a
temperatura ambiente, se llevó al agitador por 24 horas, luego se filtró cada
Temperatura ambiente
100 g de muestra
Molinillo eléctrico
Temperatura: 65°CTiempo: 12 horas
Tiempo: 20horas
Almacenado
Envasado
Molido
LiofilizadoDeshidratado
Selección
Recepción
Hojas de ajos sacha
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muestra, los extractos filtrados se colocaron frascos ámbar y fueron
almacenados a -20 ºC, hasta su posterior análisis.
Figura 3. Preparación del extracto.
4.4.2 Caracterización fisicoquímico de las hojas de ajos
sacha
Se realizó el análisis fisicoquímico de las hojas de ajos sacha,
siguiendo los métodos ya descritos en el método de análisis. Los resultados
se muestran en Cuadro 1.
Cuadro 1. Análisis fisicoquímico de la hoja ajos sacha.
Análisis Hojas de ajos sacha
Humedad (%) 52,21 ± 0,27
Proteína (%) (N x 6.25) 6,48 ± 0,13
Grasa (%) 5, 44 ± 5,8 E-5
Muestra seca y liofilizada
-20°C
Papel whatman N° 40
Almacenado
Filtrado
Extracción(100 mg/mL)
Extracción hidroalcoholicaAgitación por 24 horas
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Fibra (%) 24,29 ± 0,006
Ceniza (%) 6,48 ± 0,13
Los datos representan al promedio ± SD, n = 3.
4.5 Capacidad antioxidante de las hojas de ajos sacha
4.5.1 Cuantificación de polifenoles totales en hojas de ajos
sacha
- Curva patrón
Los resultados obtenidos de la curva patrón del ácido gálico se
muestran en el cuadro 2 y figura 4.
Cuadro 2. Análisis fisicoquímico de la hoja ajos sacha.
Concentraciones(mg AG/mL)
AbsorbanciasPromedio
R1 R2 R3
0,0625 0,060 0,074 0,075 0,0697
0,125 0,136 0,183 0,138 0,1523
0,250 0,250 0,315 0,295 0,2867
0,500 0,469 0,549 0,569 0,5290
1,00 0,986 1,176 1,158 1,1067
1,50 1.568 1,64 1,469 1,559
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0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.60
0.20.40.60.8
11.21.41.61.8
f(x) = 1.04365388238461 x + 0.019295518772709R² = 0.998299692832958
Curva de Ácido Gálico
mg/mL
Abso
rvan
cia
Figura 4. Curva de ácido gálico.
- Cuantificación de polifenoles totales.
Los resultados obtenidos en la cuantificación de polifenoles totales
se muestran en el Cuadro 3. Se observa que en hojas de ajos sacha liofilizado
el contenido de polifenoles totales es mayor al deshidratado por estufa, siendo
1,38 y 1,17 g EAG/100 g respectivamente.
Cuadro 3. Contenido de polifenoles totales en hojas de ajos sacha.
Tratamiento g EAG/100 g
Secado 1,17 ± 0,03
Liofilizado 1,38 ± 0,07
Los datos representan al promedio ± SD, n = 3.
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4.5.2 Determinación de la capacidad antioxidante de las
hojas de ajos sacha mediante la prueba DPPH
Los resultados de la determinación de la actividad antioxidante
mediante la prueba de DPPH, expresado en porcentaje de inhibición y IC50 (µ
g/mL) se muestra en el Cuadro 4. El IC50 representa la cantidad de muestra
deshidratada y liofilizada de ajos sacha (µg/ml), requerido para inhibir el 50%
de DPPH utilizado en la reacción.
Cuadro 4. Efecto de las hojas de ajos sacha frente a la actividad antioxidante.
Tratamiento % inhibición IC50 (ug/mL)
Deshidratado 85,08 ± 0,42 348,74 ± 2,60
Liofilizado 86,11 ± 0,43 246,67 ± 3,57
Los datos representan al promedio ± SD, n = 3.
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V. DISCUSIONES
V.1. Reconocimiento del Centro de Investigación para el
Desarrollo Biotecnológico de la Amazonía (CIDBAM)
El Centro de Investigación para el Desarrollo Biotecnológico de la
Amazonia (CIDBAM), es de la Universidad Nacional Agraria de la Selva
orientado a promover el desarrollo socio-económico sostenible de la amazonia
a través de la ciencia y tecnología. Promueve el entrenamiento a estudiantes y
profesionales con el fin de transmitir el conocimiento y resultados científicos de
las investigaciones biotecnológicas de los países desarrollados.
USC (2007), menciona que la función del laboratorio de
investigación es apoyar las actividades de investigación y/o desarrollo
tecnológico adelantado por investigadores y estudiantes que desarrollan un
proyecto de investigación vinculado a una línea de investigación de la
institución, en temas referidos a la validación de principios, leyes y fenómenos
científicos y tecnológicos. Y apoyar con desarrollo tecnológico de instituciones
y entes externos a la Universidad, como una forma práctica de materializar la
extensión y el apoyo a la comunidad.
El CIDBAM cuentan con equipos, materiales y reactivos las cuales
se encuentran en las diferentes áreas, los equipos cuenta con su manual y
26
registro de uso, así mismo cuenta con un cuaderno de asistencia y control de
trabajos realizados en el centro (describen la actividad que se realiza, entrada y
salida de la persona que ingresa al laboratorio).
Según las NTP-ISO/IEC 17025 (2001), menciona que el laboratorio
debe tener instrucciones para el use y operación de todo el equipo pertinente, y
para la manipulación y preparación de los objetos para el ensayo y/o
calibración, o ambos, cuando la ausencia de tales instrucciones puede poner
en riesgo los resultados de los ensayos y/o calibraciones. Las instrucciones,
normas, manuales y datos de referencias pertinentes al trabajo del laboratorio
deben mantenerse actualizados y estar fácilmente disponibles para el personal.
V.2. Capacidad antioxidante de las hojas de ajos sacha
5.2.1. Cuantificación de polifenoles totales en hojas de ajos
sacha.
- Curva patrón
Para realizar la cuantificación de polifenoles totales se elaboró una
curva patrón en base a ácido gálico cuyas concentraciones fueron 0,0625;
0,125; 0,25; 0,50; 1,00; 1,25 mg/mL; los resultados se presenta en el Cuadro 0
y figura 0, en ella se puede apreciar el diagrama de dispersión de las
absorbancias, obteniendo una ecuación matemática de dos variables y un
coeficiente de determinación R2 = 0,9983.
27
WEBSTER (2000), menciona que la regresión simple establece
que “y” es una función de solo una variable. Solo hay dos variables una
dependiente y una independiente. Es habitual colocar la variable independiente
en el eje horizontal. Cuando los valores de (x, y) se mueven en la misma
dirección se dice que es una relación lineal y positiva.
MURRAY (1969) indica que si “Y” tiende a incrementarse cuando
incrementa “X” la correlación se dice positiva o correlación directa. CÓRDOVA
(2003), manifiesta que los diagramas de dispersión o nube de puntos se le
denomina a la gráfica de los valores (x, y), que pueden ser de relación lineal,
no lineal o no tener ninguna relación lineal; así mismo, el coeficiente de
correlación R2 es una medida de la proximidad del ajuste de la recta de
regresión. Cuanto más alto sea el valor de R2 mejor será el ajuste y más útil la
recta de regresión.
- Cuantificación de polifenoles totales.
En el cuadro 3, muestra que el mayor contenido en polifenoles
totales lo posee el liofilizado 1,38 ± 0,07 g EAG/100g, mientras que en hojas
deshidratadas el contenido es menor 1,17 ± 0,03 g EAG/100g, ya que se pierde
por efecto de la temperatura, está perdida es explicado por CHITINDINGU et
al., (2007), que indica que en algunos vegetales que son fuente rica en
polifenoles que contribuyen a la actividad antioxidante, son afectado por la
exposición a diferentes procesos y técnicas de secado. MADRAU et al., (2009)
en su estudio demostró que el contenido de polifenoles disminuye a medida
que aumenta la temperatura del aire caliente de secado.
28
La variación de los resultados encontrados en hojas de ajos sacha
puede ser explicado por KATIYAR y MUKHTAR (1997) quienes mencionan que
los factores que influyen en la cantidad de polifenoles presentes en una hoja
puede variar de acuerdo a las condiciones geográficas y procesamiento.
ROJAS et al., (2012), menciona que la liofilización preserva las
características funcional (capacidad antioxidante), debido a que las condiciones
de secado protegen los compuestos bioactivos presentes en la muestra.
V.3. Determinación de la capacidad antioxidante de las hojas de
ajos sacha mediante la prueba DPPH
Los resultados de la prueba de DPPH se presenta en el cuadro 00,
indicando que la mayor capacidad antioxidante lo presenta el liofilizado con un
IC50 246,67 ± 3,57 ug/mL y la menor capacidad antioxidante es para hojas
deshidratado con un IC50 348,74 ± 2,60 ug/mL, como se puede apreciar a
menor valor existe mayor actividad antioxidante esto concuerda con
VILLANUEVA et al., (2010) que indica que IC50 menores refleja una alta
actividad para inhibir radicales libres.
Esta variación encontrada en la capacidad antioxidante puede ser
explicado por RAMOS et al., (2009) que indica que la variabilidad entre los
valores IC50 puede atribuirse a la diferencia entre la metodología para
determinar la actividad antioxidante, la localización geográfica de la muestra,
temperatura y tratamiento de proceso.
Las hojas secadas posiblemente no presento la desactivación de la
enzima polifenoloxidasa ya que estas protegen a las sustancias fenólicas
29
contra la oxidación catalizada por las enzimas lo que conlleva a la formación de
quinonas con escasa o nula actividad antioxidante (POKORNY et al., 2005).
30
VI. CONCLUSIONES
- Se logró conocer las diferetes áreas, funcionamiento de equipos,
materiales y reactivos utilizados para los análisis realizados.
- Se conoció los metodos de analisis para determinar polifenoles totales,
analisis quimico proximal y actividad antioxidante, que se realizan en el
CIDBAM.
- La caracterizacion química de las hojas de ajos sacha, mostró una
humedad de 52,21 %, proteína 6,48 %, grasa 5,44 %, fibra 24,29 % y
ceniza 6,48 %.
- La cuantificación de polifenoles totales presenta mayor en la hoja
liofilizada de 1,38 ± 0,07 g AGE/100 g de muestra seca y para la hoja
deshidratada es de 1,17 ± 0,03 g AGE/100 g de muestra seca.
- La mayor eficiencia frente al radical DPPH presentan las hojas
liofilizadas con IC50 246,67 ± 3,57 µg/ml y la menor eficiencia lo presenta
las hojas deshidratadas con IC50 348,74 ± 2,60 µg/ml.
31
VII. RECOMENDASIONES
- Elaborar un manual y establecer un sistema de calidad de
procedimientos para la manipulación segura, el uso y el mantenimiento
planificado de los equipos de medición.
- Cuantificar los compuestos bioactivos responsables de la actividad
antioxidante presentes en las hojas de ajos sacha.
- Realizar estudios de extracción sólido líquido para optimizar parámetros
de extracción de los compuestos bioactivos de hojas de ajos sacha.
- Realizar investigaciones otras partes de la planta (tallos y raíces) que
puedan contener mayor actividad y concentración de antioxidantes útiles
en diferentes industrias.
32
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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34
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35
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verde y proteínas del lactosuero sobre las propiedades biológicas y
funcionales de las mezclas. Tesis. Universidad de Buenos Aires. 250 p.
WEBSTER, A. 2000. Estadística aplicada a los negocios y la economía. Trad.
por Yelka García. 3 ed. Bogotá, Colombia, McGraw-Hill. 638 p.
36
ANEXO
37
A1. Organigrama del Centro De Investigación para el Desarrollo Biotecnológico
De La Amazonia (CIDBAM)
COORD. AMBIENTE
COORD. ZOOTECNIA
COORD. AGRONOMIA
JEFE DEL CIDBAM
ASISTENTE DE INVESTIGACIÓN
COORD.FIIA
VICERRECTOR
RECTOR
38
INDICE GENERAL
I. INTRODUCCION 1
II. REVISION BILBIOGRAFICA 2
II.1. Aspectos generales de ajos sacha 2
II.1.1. Clasificación taxonómica 3
II.1.2. Características morfológicas 4
II.2. Antioxidantes 4
II.2.1. Función de los antioxidantes 4
II.2.2. Tipos de antioxidantes 5
II.3. Radicales libres6
II.3.1. Radical 1,1 difenil-2-picril-hidrazil(DPPH) 7
III. PLAN DE TRABAJO 8
III.1. Funcionamiento del Centro de Investigación para el Desarrollo
Biotecnológico de la Amazonia . CIDBAM…………………………………8
III.1.1. Ubicación…………………………………………………………8
III.1.2. Organización……………………………………………………..8
III.1.3. Reconocimiento de áreas de trabajo , materiales, equipos y
reactivos…………………………………………………………..8
III.2. Caracterización físico-química y capacidad antioxidante de las hojas
de ajos sacha………………………………………………………………….8
III.2.1. Métodos de análisis…………………………………………….8
39
III.2.2. Caracterización fisicoquímica de las hojas de ajos
sacha….8
III.2.3. Polifenoles totales y su capacidad antioxidante de
las hojas de ajos sacha
……………………………………………………9
IV. DESARROLLO DEL PLAN DE TRABAJO 10
IV.1. Del funcionamiento del Centro de Investigación para el Desarrollo
Biotecnológico de la Amazonia (CIDBAM)……………………………….10
IV.1.1. Ubicación 10
IV.1.2. Organización 10
IV.2. Reconocimiento de Áreas de trabajo , materiales, equipos y
reactivos 11
IV.2.1. Área de micropropagacion in vitro de vegetales 11
IV.2.2. Área de antioxidantes 13
IV.2.3. Área de HPLC 14
IV.2.4. Área de cultivo celular…………………………………………15
IV.2.5. Área de biología molecular………………………………..………..17
IV.3. Métodos de análisis realizado en el CIDBAM 17
IV.3.1. Análisis químico proximal 17
IV.3.2. Cuantificación de polifenoles Totales 18
IV.3.3. Determinación de la capacidad antioxidante mediante la
prueba DPPH 19
IV.4. Caracterización fisicoquímica de las hojas de ajos sacha………….20
IV.4.1. Recolección y preparación de Materia prima……………….20
40
IV.4.2. Preparación de los extractos………………………………….21
IV.4.3. Caracterización fisicoquímico de las hojas de ajos sacha...22
IV.5. Capacidad antioxidante de las hojas de ajos sacha…………………23
IV.5.1. Cuantificación de polifenoles totales en hojas de ajos
sacha…………………………………………………………....23
IV.5.2. Determinación de la capacidad antioxidante de las hojas de
ajos sacha mediante la prueba DPPH……………………….24
V. DISCUSIÓN 26
V.1. Reconocimiento del Centro de Investigación para el Desarrollo
Biotecnológico de la Amazonia (CIDBAM) 26
V.2. Capacidad antioxidante de las hojas de ajos sacha 27
V.2.1. Cuantificación de polifenoles totales en hojas de ajos
sacha……………………………………………………………27
V.3. Determinación de la capacidad antioxidante de las hojas de ajos
sacha mediante la prueba DPPH 29
VI. CONCLUSIONES 31
VII. RECOMENDACIONES 32
VIII. REFERENCIAS CONSULTADAS 33
ANEXOS ..........................................................................................................37
41
UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA
FACULTAD DE INGENIERIA EN INDUSTRIAS ALIMENTARIAS
DEPARTAMENTO ACÁDEMICO DE CIENCIA Y TECNOLOGÌA E INGENIERIA DE
ALIMENTOS
PRACTICA PRE - PROFESIONAL
“DETERMINACION DE POLIFENOLES TOTALES Y
CAPACIDAD ANTIOXIDANTE EN HOJAS DE AJOS SACHA
(Mansoa alliacea (Lam.) A. Gentry.)” EN EL CIDBAM-UNAS
EJECUTOR : MEZARINO TARAZONA, Jork Lee Michael
ASESOR : Ing. Msc Roberto Dávila Trujillo
LUGAR : Centro de Investigación para el Desarrollo
Biotecnológico de la Amazonia (CIDBAM)
FECHA DE EJECUCIÓN : Enero – Abril del 2013
TINGO MARIA - PERU
2013
42