ing metabolica prezentare curs posdru
DESCRIPTION
Inginerie metabolicaTRANSCRIPT
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Elemente de
Inginerie Metabolica Celulara
Profesor Dr. Ing. Gheorghe MARIA
Denumirea programului de studii: Chimie Alimentara
An:…2.. Sem:…3….
Adresa de contact: Universitatea Politehnica din Bucuresti, Catedra de
Inginerie Chimica si Biochimica, Str. Polizu 1, Bucuresti
E-mail: [email protected]
Tel: (021) 402 3903
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Cuprins
1. Notiuni introductive privind domeniul ingineriei metabolice celulare.
1. Formalizarea reactiilor biochimice (stoichiometrie si viteze de reactie
biochimice).
2. Modele de crestere celulara si de analiza a metabolismului celular.
3. Utilizarea bazelor de date biochimice celulare.
4. Fluxomica, analiza controlului metabolic si reglarea celulara.
5. Modele dinamice de reprezentare a procesele metabolice celulare.
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Continutul cursului
• Cap 1. Notiuni introductive privind domeniul ingineriei
metabolice celulare.
• 1.1 Structura celulelor procariote si eucariote.
• 1.2. Rolul principalilor componenti metabolici (aminoacizi, proteine,
DNA, RNA, etc.)
• 1.3. Ciclul celular. Sinteza principalelor componente celulare. Tehnici
de modificare genetica si de clonare a genelor si implicatii
industriale.
• 1.4. Metabolismul celular (carbohidrati, lipide, proteine).
• 1.5. Respiratia si eliberarea de energie celulara
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Structura celulelor procariote Structura celulelor eucariote
- Componenti metabolici:
aminoacizi, proteine,
enzime, anticorpi,
membrane, hormoni,
DNA, RNA, etc.
-- Structura proteinelor
Proiect POSDRU ID 56711
Stru
ctura
pro
tein
elo
r
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
- Ciclul celular. Sinteza principalelor componente celulare
- Sinteza (Replicarea) DNA
i1n
2Mg ,polimerazaDNA fragmenten PP (DNA) dNTP (DNA) + →+ +
+−
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
- Sinteza (Replicarea) RNA
- Metabolismul zaharidelor (Glicoliza, Glucogeneza, Metabolismul
Glicogenului).
- Metabolismul acizilor grasi, grasimilor si al colesterolului.
- Respiratia si eliberarea de energie (ciclul acidului citric si
fotosinteza).
- Metabolismul aminoacizilor (ciclul acidului uric).
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Continutul cursului
• Cap 2. Formalizarea reactiilor biochimice (stoichiometrie si
viteze de reactie biochimice).
• 2.1. Stoichiometria reactiilor biochimice celulare (determinare
experimentala).
• 2.2. Formalizarea reactiilor biochimice.
• 2.3. Factorii de dependenta ai vitezei de reactie biochimice.
• 2.4. Echilibrul chimic. Conceptul de stari stationare (homeostaza
celulara). Aplicatii.
• 2.5. Evaluarea stoichiometriei proceselor metabolice celulare
(studiu de caz - metabolismul central al Saccharomyces cerevisiae la
fermentatia alcoolica).
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Studiu de caz - metabolismul central al Saccharomyces
cerevisiae la fermentatia alcoolica).
Proiect POSDRU ID 56711
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
KEGG result: Metabolismul central al Saccharomyces cerevisiae
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Continutul cursului
Cap 3. Modele de crestere celulara si de analiza a metabolismului
celular.
• 3.1. Clasificare modele de crestere celulara.
• 3.2. Modele cinetice nestructurate, nesegregate pentru reprezentarea
proceselor enzimatice si biologice (Michaelis-Menten, Monod, etc).
• 3.3. Modele cinetice nestructurate, segregate pentru reprezentarea
cresterii celulare.
• 3.4. Modele cinetice structurate, nesegregate, pentru reprezentarea
sintezelor celulare.
• 3.5. Modele cinetice structurate, complexe, pentru simularea
metabolismului celular.
• 3.6. Interactiuni intre celule. Modele de competitie si selectie in
sisteme biologice (Biologie Sistemica).
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Continutul cursului
Cap 3. (continuare)
• 3.7. Procese metabolice oscilatorii. Ciclul celular.
• 3.8. Elemente de proiectare a micro-organismelor modificate genetic
OMG (Biologie Sintetica). Aplicatii.
• 3.9. Exemple de utilizare a simulatoarelor celulare pentru
caracterizarea metabolismului organismelor de Saccharomyces
cerevisiae, Escherichia coli, Pseudomonas putida.
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Modele
de populaţii
celule
nesegregate (celule identice, reacţionează identic
la condiţiile de mediu)
segregate (lucrează cu clase de celule, deosebite
după anumite criterii)
Modele
nestructurate (celulele nu se deosebesc între ele prin
vârstă, caracteristici fiziologice; nu se
modelează procesele interne)
structurate (celulele sunt analizate în detaliu, prin modele
compartimentate / modulare, extinse / reduse,
inclusiv procesele de biosinteză, bioreglare,
transfer de masă intra-celular)
=↑↑
n
2ttanmu
2
1ttanmu
1 X,,X,XX
L
K
=↑↑
S
2componenta
2
1componenta
1 C,,C,CX
L
K
tultanmu
CCC
CCC
X
nS2n1n
S11211
specia
↓
=
→
L
LLLL
L
celulă
X
S P
model nestructurat
I1
I2
RS P
model structurat
(X = R + I1 + I2)
Clasificare modele celulare
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
- Selectivitatea proceselor enzimatice
- Mecanismul de actiune al enzimelor
(“cheie-lacat” si “geometrie indusa”)
- Depententa de pH si Temperatura
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Reprezentarea grafica a
dependentei vitezei de reactie
enzimatice (Michaelis-Menten) cu
concentratia de substrat.
Sm
Smax
S1
21
SE2
SE2C
CK
CV
Ck
kk
CCkCk
dt
dV
0P
+
⋅=
++
⋅⋅=⋅==
−
Linearizarea Lineweaver-Burk
pentru o cinetica de tip Michaelis-
Menten
Cinetica enzimatica simpla
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Cinetica enzimatica - Inhibiţia competitiva
( )
'1
/11
S
S
I
I
II
S
S
S
EISES
K
K
K
C
KC
C
K
CkCCkr
⋅+
+⋅+
⋅=+⋅=
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Cinetica enzimatica - Inhibiţia necompetitiva
( )
Im
IS
I
I
m
S
TSm
KK
CC
K
C
K
C
ECKkr
⋅
⋅+++
⋅⋅=
1
/2
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Cinetica enzimatica - Inhibiţia incompetitiva
m
I
I
S
S
KK
CC
CVr
+
+⋅
⋅=
1
max
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Cinetica enzimatica – Inhibiţia mixta si alosterica
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Tip interacţieOrganism
A B
Neutralism 0 0
Comensalism 0 +
Naturalism + +
“Vânător – pradă” + -
“Vânător – pradă” - +
Amensalism 0 -
Amensalism - 0
Competitiv - -
Tipuri de interacţii între reactii biochimice si intre celule vii
(+) efect benefic, pozitiv; (-) efect negativ;
(0) efect neutru.
Neutralism S1 A
S2 BComensalism
S2 P (+)
S1 S2(0)
B
AS2 P2
(0)
S1 P1(+)B
A
(nitrificare, digestie
anaerobă metanogenare)
Mutualism
AS2 P2(+)
S1 S2(+)
B
S1 + PB PA(+)
S2 + PA PB(+)B
A
“Vânător-pradă”
S A (-)
A B(+)B
A
Amensalism
S2 PA (-)
S1 PB(0)B
A
Competiţie
S
PA(-)
PB(-)
A
B
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
X
Y
t
Y
Modele de competitie Lotka-Volterra (sisteme oscilante)
−=
−=
dYYXctd
Yd
YXbXatd
Xd
Modele segregate de crestere celulara (Leslie)
( )( )( )
( )
( )
( )
( )
β
β
α
=
=
−−
+
=∑
01n1n
011
pk
ki
0ii
1n
12
11
1
tx
tx
tx
tx
tx
tx
tX
LL
β
β
ααα
=
++
0000
0000
0000000
0000000
00000
2
1
pk1kk
LLLLL
LLLLL
LLLLLLLLL
L
L
L
L
( ) ( )1kk tt −⋅= XLX
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Simulator celular de tip Electronic-Cell (M. genitalium; Tomita et al., 2001)
Sunt incluse principalele procese metabolice:� transport ionic;� glicoliza;� fermentatie acid lactic (ciclul Krebs);� degradare/sinteza grasimi;� biosinteza fosfo-lipide;� transcrierea genetica;� sinteza proteine/aminoacizi;� sinteza ansamblu ribozom + polimeraza;� degradare proteine;� degradare mRNA.
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Simulator celular de tip Virtual-Cell (Hucka et al., 2003)
•• ElementeleElementele unui model “V-Cell”:
• specii (ATP, Ca2+ etc.);
• reactii (ex.: enzimatice, legare
receptor, fluxuri membranare);
• structuri (ex.: RER, citosol etc.)
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Simulator celular stocastic de tip M-Cell (Bartol & Stiles, 2002)
Platforma „M-Cell” include:
- construcţia sistemului prin includerea moleculelor de
ligand, parametrii de difuzie;
- definirea reacţiilor posibile;
- definire: Liganzi, Efectori, Reacţii, Suprafeţe 3D, Restricţii
(limbaj MDL-Biologically oriented);
- crearea de „obiecte de simulat” ;
- soluţionarea (simularea numerica) obiectelor;
- prezentarea rezultatelor în formă numerică şi vizuală.
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Continutul cursului
Cap 4. Utilizarea bazelor de date biochimice celulare.
• 4.1. Baze de date biochimice celulare: genomica, proteomica,
metabolomica, fluxomica.
• 4.2. Reprezentarea topologiei reactiilor metabolice: grupare si
modularizare.
• 4.3. Cuplarea bancilor de date biochimice cu tehnicile de modelare
celulara. Aplicatii.
• 4.4. Utilizarea bazelor de date EcoCyc, KEGG, Brenda, etc.
• 4.5. Exemplu - Simularea sintezei celulare a PHB (acid poli-beta-hidroxi-
butiric) in celula de Escherichia coli.
• 4.6. Modele cinetice simple privind reglarea homeostatica a sintezei
proteinelor (exemple cu aplicatii industriale).
Proiect POSDRU ID 56711
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Baza de date E. Coli cell (EcoCyc)( http://ecocyc.org/ )EcoCyc is a scientific database for the bacterium Escherichia coli K-12
MG1655.
The EcoCyc project performs literature-based curation
of the entire genome, and of transcriptional regulation, transporters,
and metabolic pathways.
EEcoCyc gene/protein pageTTranscription-unit pageTTranscription-factor pageGGenome browserPPathway pageRReaction pageCCompound pageTTransport-reaction page
Transporter pageMetabolic map diagramRegulatory network diagram
©2011 SRI International, Menlo Park, CA 94025-3493
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Baza de date BRENDA (http://www.brenda-enzymes.org/ )
The Comprehensive Enzyme
Information System
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Baza de date KEGG (http://www.genome.jp/kegg/ )
KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
Main entry point to the KEGG web service
Data-oriented entry pointsKEGG pathway maps BRITE functional hierarchies KEGG modules
Human diseases[Cancer | Infectious disease]Drugs [ATC drug classification]Ortholog groups [KO system]Genomes [KEGG organisms]Genes and proteins
Chemical informationHealth-related information for wider society
Organism-specific entry pointsKEGG OrganismsAnalysis toolsKEGG PATHWAY - mapping toolsNavigation tool to explore KEGG mapsKEGG automatic annotation serverSequence similarity searchChemical structure similarity search
Biodegradation/biosynthesis pathway prediction
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Baza de date CellML-JWS(http://jjj.biochem.sun.ac.za/ ). Ex. Glicoliza in
E. coli
CellML: simulator metabolism celular de baza
Main entry points:
- alege organism- Alege subsistemul metabolic celular
Rezultate:
- Fluxuri metabolice- Coeficienti MCA
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Continutul cursului
Cap 5. Fluxomica, analiza controlului metabolic si reglarea
celulara.
• 5.1. Analiza de bilant a fluxurilor metabolice celulare (FBA).
Optimizarea fluxurilor metabolice celulare cu scop industrial.
• 5.2. Analiza Controlului Metabolic (MCA) cu aplicatii la realizarea de
organisme modificate genetic cu importanta in industria alimentara si
de biosinteza.
• 5.3. Retele de reglare genetica celulara (modele de tip circuit logic).
• 5.4. Evaluarea fluxurilor metabolice celulare in regim stationar (studiu
de caz - metabolismul central al Saccharomyces cerevisiae la
fermentatia alcoolica).
• 5.5. Exemplu - Simularea metabolismului celular al Ferului cu asimilatie
mitocondriala (in celule eucariote).
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Bilantul / optimizarea fluxurilor
metabolice celulare
Metabolismul central al
Escherichia coli
(dupa Maria et al., 2011) →→→→
( )
( )
===π
α=⋅
=α⋅−=
∑∑.const
jC
1
,jC
1TR
k,Ctd
Vd
V
1
m,,1j,Ck,Ctd
Cd
j0
jjj
Kf
La homoestaza:
[ ] biomassM1 v Maxargv,...,v == Φ
∑ ==
M
1jjij 0vS max,jjmin,j vvv ≤≤
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Retele de reglare genetica celulara
PG GP
M
P
P
MP
P
MPP 3P
P
MPPP
Module G(P)1;M(P)3
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Switch genetic bistabil (modelul Jacob-Monod de biosenzor)
−+
=
−+
=
22m12
22
11m21
11
PqPB
A
td
Pd
PqPB
A
td
Pd
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
• use cascade control, multiple effectors
• allosteric enzyme activity control
Cope with complexity
& synchronization
Dyn
Senz
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Ex. Simulare metabolism Fe in miotocondrie (Hudder, Maria, 2002)
[Fe]env
k1[Fe]Cy
[Fe]mit
k2
k4
[Hem]mit
k3
(S)[Fe/S]mit
k6
k5
Mitochondria
[Fe/S]Cy Cytosol
[Hem]Cy
[Fe]env
k1[Fe]Cy
[Fe]mit
k2
k4
[Hem]mit
k3
(S)[Fe/S]mit
k6
k5
Mitochondria
[Fe/S]Cy Cytosol
[Hem]Cy
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Continutul cursului
Cap 6. Modele dinamice de reprezentare a procesele metabolice
celulare.
• 6.1. Elemente de teoria oscilatiilor in procese biochimice.
• 6.2. Procese metabolice oscilatorii. Ciclul celular. Aplicatii.
• 6.3. Testarea modelelor cinetice nestructurate pentru procese oscilante de biosinteza celulara (studiu de caz - o etapa a procesului de glicoliza).
• 6.4. Exemplu - Simularea procesului oscilant de crestere a celulelor de drojdie de bere (model cinetic structurat).
• 6.5. Simularea unor procese enzimatice industriale (studiu de caz biosinteza D-fructozei si a derivatilor sai din D-glucoza).
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Ex. Mecanismul oscilatiilor in sinteza proteinelor
Modelul Goldbeter (1995) pentru ritmurile circadiene. Proteina PER este sintetizata in
citoplasma, unde este succesiv fosforilata. A doua forma fosforilata patrunde in nucleu si
reprima transcrierea genei per.
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Lucrari de laborator de calcul (simulatoare celulare)
1. Evaluarea indicatorilor ce caracterizeaza transformarea biochimica.
2. Evaluarea stoichiometriei proceselor metabolice celulare (studiu de caz - metabolismul central
al Saccharomyces cerevisiae).
3. Evaluarea fluxurilor metabolice celulare in regim stationar (studiu de caz - metabolismul
central al Saccharomyces cerevisiae).
4. Calculul constantei de echilibru si a conversiei de echilibru (bio)chimic.
5. Simularea sintezei celulare a PHB (acid poli-beta-hidroxi-butiric) in celula de Escherichia coli.
6. Simularea metabolismului celular al Ferului cu asimilatie mitocondriala. Simularea raspunsului
celular la perturbatii externe pentru celula normala si cea mutanta. Simularea maladiei de
asimilare defectuoasa a Ferului in celula umana.
7. Modele cinetice simple privind reglarea homeostatica a sintezei proteinelor (exemple cu
aplicatii industriale).
8. Testarea modelelor cinetice nestructurate pentru procese oscilante de biosinteza (studiu de
caz).
9. Simularea performantelor unei reactii consecutive de sinteza biochimica, in sistem oscilant.
Exemplificare pentru o etapa a procesului de glicoliza (Model cinetic structurat).
10. Simularea procesului oscilant de crestere a celulelor de drojdie de bere (model cinetic
structurat).
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Bibliografie
• 1. Stephanopoulos, G.N., Aristidou, A.A., Nielsen, J., Metabolic engineering. Principles and
methodologies, Academic Press, NY, 1998.
• 2. Heinrich, R., Schuster, S., The Regulation of Cellular Systems, Chapman & Hall, New York, 1996.
• 3. The Metabolic Control Analysis Web, The University of Manchester, 2004.
http://dbkgroup.org/mca_home.htm
• 4. Mihail, R., Muntean, O., Lavric, V., Ingineria Proceselor Biochimice, Litografia Institutului
Politehnic Bucuresti, 1988.
• 5. Ofiteru, D., Lavric, V., Woinaroschy, A., Introducere in bioingineria celulelor animale, Ed. Matrix
Rom, Bucuresti, 2003.
• 6. Lavric, V., Ofiteru, D., Woinaroschy, A., Modelarea bioreactoarelor cu celule animale, Ed. Matrix
Rom, Bucuresti, 2004.
• 7. Muntean, O., Bales, V., Meszaros, A., Biochemical Technology, Ed. Printech, Bucuresti, 2003.
• 8. Vallino, J.J., Stephanopoulos, G., Flux determination in cellular bioreaction networks:
Applications to lysine fermentations, In: Frontiers in bioprocessing (Sikdar, S.K., Bier, M., Todd, P.,
Eds.), CRC Press, Boca Raton, 1990.
• 9. Maria, G., Modular-based modelling of protein synthesis regulation, Chemical and Biochemical
Engineering Quarterly 19, 213-233 (2005).
• 10. Maria, G., Application of lumping analysis in modelling the living systems -A trade-off between
simplicity and model quality, Chemical & Biochemical Engineering Q. 20, 353-373 (2006).
Pro
iect
PO
SD
RU
ID
56
71
1
Bibliografie (continuare)
• 11. Maria, G., Modelling bistable genetic regulatory circuits under variable volume framework,
Chemical and Biochemical Engineering Quarterly 21, 417-434 (2007).
• 12. Maria, G., Enzymatic reactor selection and derivation of the optimal operation policy by using
a model-based modular simulation platform, Comput. & Chem. Engineering 36(1), 325–341
(2012).
• 13. Maria, G., Xu, Z., Sun, J., Investigating alternatives to in-silico find optimal fluxes and
theoretical gene knockout strategies for E. coli cell, Chem. & Biochemical Eng. Q. 25(4), 403-424
(2011).
• 14. Maria, G., Ene, M.D., Jipa, I., Modelling enzymatic oxidation of D-glucose with pyranose 2-
oxidase in the presence of catalase, Jl. Molecular Catalysis B: Enzymatic 74, 209-218 (2012).
• 15. Rensing, L., Meyer-Grahle, U., Ruoff, P., Biological timing and the clock metaphor: oscillatory
and hourglass mechanisms, Chronobiology International 18 (2001) 329-369.
• 16. Tyson, J.J., Novak, B., Regulation of the Eukaryotic Cell Cycle: Molecular Antagonism,
Hysteresis, and Irreversible Transitions, J. theor. Biol. 210 (2001) 249-263.