ingrid rivera ficha agosto 2011 un reloj circadiano en los queratinocitos hacat

5/11/2018 Ingrid Rivera Ficha Agosto 2011 Un Reloj Circadiano en Los Queratinocitos HaCaT - slidepdf.com

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Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT

Journal of Investigative Dermatology 2011;131:338 –

348

•Investigación y Desarrollo, Beiersdorf AG, Hamburgo, Alemania

•Laboratorio de Cronobiología, Charité 'Universita Berlín, Alemania




Variaciones diarias en el medio ambiente

Ciclos de luz-oscuridad

Periodicidad - Evolución

Temperatura Disponibilidadde alimentos

Ritmo circadiano

(cerca – día 24 horas) Reloj circadiano

Introducción



Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT Introducción

Ritmo circadiano

Origen:•Células más primitivas•Proteger la replicación del ADN de la altaradiación ultravioleta durante el día

•Hongo Neurospora

Endógenos•Persisten en condiciones de laboratorio, aun sinestímulos externos•Modificables por señales exógenas



“Reloj maestro” Núcleo supraquiasmático (NSQ) - Hipotálamo




“Reloj maestro” Núcleo supraquiasmático (NSQ) - Hipotálamo


•Células ganglionares con unpigmento melanopsina

•Tracto retinohipotalámicollevan información al NSQ

•Glándula pineal: hormonamelatonina

•Si no ha sido suprimido por lapresencia de luz brillante

•Melatonina baja durante el día

y aumenta durante la noche



“Relojes periféricos”


“Reloj maestro”

Zeitgebers

Luz, temperatura,alimentos, fármacos



Nivel molecular

•

Células autónomas

•Modelo de retroalimentaciónmolecular




Nivel molecular


Factores de transcripción del reloj circadiano•CLOCK: ciclos de producción del aparato locomotor circadiano kaput

•BMAL1: cerebro-músculos de hidrocarburos arilo receptor nuclear

translocator (ARNT)-like proteína-1



Nivel molecular


Activa la transcripción de gen periodo1-3 (Per1-3) ycriptocromos 1 y 2 (Cry1 y Cry2)



Nivel molecular


PER y CRY llevan a la represión de CLOCK/BMAL1 y lainhibición de su propia transcripción

24 horas



Piel: Barrera entre cuerpo y medio ambiente

Relojes periféricos se han demostrado en piel murina y enfibroblastos de piel humana

Radiación UVTemperatura

Recuperación de la barreraPérdida de agua transepidérmicaProducción de sebopH y temperatura de la piel

¿Cómo este reloj puede regular la fisiología de la

epidermis?

¿Los queratinocitos de la epidermis poseen un relojcircadiano autónomo?




Células para estudiar la fisiología epidérmica

controlada por el reloj circadiano

Líneas de células inmortalizadas

•Línea de células epidérmicas dequeratinocitos humano adulto bajocalcio temperatura (HaCaT)

•In vitro: se deriva de piel adulto normaly refleja fielmente el comportamiento dequeratinocitos




Cultivo celular:•Queratinocitos normales epidérmicos humanos deprepucio neonatal

•

Queratinocitos HaCaT

Prodecimientos:

•Inmunohistoquímica

•PCR

•Bioluminiscencia

Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT Materiales y métodos



Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT Materiales y métodos

Bioluminiscencia: producción de luz de ciertos

organismos vivos

Diseñaron que los queratinocitos HaCaT presentaranun gen que produce luciferasa + genes del reloj




1º - Genes del reloj maestro:

•Inmunocitoquímica: anticuerpos

•CLOCK: núcleo•PER1: citoplasma y núcleo

•Co-tinción del núcleo: DAPI (40-

6-diamidin-20-phenylindol-dihydrochlorid)

1.- Queratinocitos HaCaT poseen un reloj circadiano funcional

Resultados

Queratinocitos HaCaT

Queratinocitos neonatal primario



•HaCaT + lentivirus•

Luciferasa + fragmento del gendel reloj Bmal1•Los ritmos circadianos sesincronizan con dexametasona y laactividad rítmica luciferasa



Resultados

•Amortiguación de la oscilación: desincronización progresiva

de queratinocitos individuales

2º - Transcripción rítmica de los genes del reloj



•Queratinocitos HaCaT – sincronizan con dexametasona - cosecha el ARNtotal - PCR transcriptasa inversa

•Se detectaron ritmos circadianos de Rev-Erba y Per3: alta amplitud

•Per1, 2 o Cry1, 2: menores oscilaciones de amplitud



Resultados

2º - Transcripción rítmica de los genes del reloj





Resultados

3º - Modificación de la dinámica del reloj

Farmacológico:•Interferencia con la fosforilación de las proteínas PER•Inhibidores CKI-7 y DMAT

El ritmo circadiano se alarga de manera significativa ydependiente de la dosis





Resultados

Farmacológico:•Interferencia con la degradación de proteínas CRY•Interferencia de ARN - Fbxl3

El ritmo circadiano se alarga de manera significativo ysustancial



•ARNsh•Silenciamiento de Bmal1 resultando en una revocación

completa de la ritmicidad



Resultados




Queratinocitos HaCaT poseen un reloj circadianofuncional, con propiedades indistinguibles de

otros relojes periféricos

Resultados

Transcripción rítmicade genes del reloj

Localización correcta de

la proteína del reloj

Alteraciones en la dinámicacircadiano del reloj (genética,

farmacológico)



Variaciones de temperatura de 1-2ºK.


2.- La temperatura es un potente Zeitgeber de queratinocitos

HaCaT

Resultados

Temperatura corporal

Sincroniza los relojes periféricos

Conduce la expresión de genes circadianos enfibroblastos humanos





HaCaT

Resultados

Los ritmos circadianos de Q-HaCaT se sincronizaron con dexametasona –

bioluminiscencia Bmal1

a y c -- ciclos de temperatura de 24 horas (calentamiento 12 horas 37ºC yfrío 12 horas 33ºC

b -- temperatura constante 37ºC

b y c -- las células fueron sincronizadas 8,5 horas de diferencia





HaCaT

Resultados

•Bmal1: adoptó una relación estable con el ciclo de la temperatura y mayoramplitud (solo Dex)

•

Cuando la Temp fue constante las oscilaciones persistieron similares a losciclos anteriores





HaCaT

Resultados

Comprobar

b.- HaCaT Dex 0 y - 8,5 horas + temperatura constantec.- Ciclos de temperatura 24h: sincronización gradual con latemperatura

R l d



Los ciclos de temperatura puede arrastrar los relojescircadiano en los queratinocitos


La temperatura es un potente Zeitgeber dequeratinocitos HaCaT

Resultados

R l d



Queratinocitos HaCaT:

•Ciclos de temperatura por 2 días y 1 día de temperatura constante

•Cosecha el ARN total cada 4 horas - PCR transcriptasa inversa


3.- Arrastre de la temperatura aumenta la expresióncircadiana de genes del reloj

Resultados

R lt d



Un reloj circadiano en los queratinocitos HaCaT Resultados

Genes del reloj•Las amplitudes de los ritmos arrastradospor la temperatura fueron sustancialmentemayores

•Persistieron luego con temperaturaconstante

•Diferencias por el ritmo de expresión deacuerdo al ritmo circadiano (CRY - BMAL1)

R lt d



Genes de salidaControlados por el reloj

Significativa expresión circadianade factores de transcripción

•Dbp: objetivo directo del relojcircadiano.

•Insig2a: gen implicado en lahomeostasis del colesterol

•Actina

•c-Myc: oncogen (ritmos solo contemperatura constante)

•

Gen receptor LDL y HMGCR:homeostasis del colesterol (ritmossolo con los ciclos de temperatura)


R lt d



•Limitaciones célulasinmortalizadas

•

Interrumpe el control delciclo celular•Limitada capacidad dediferenciación

•Ciclos de temperatura•Per2, Per3, Ap-Erba, Insig2a:similar HaCaT

4.- Queratinocitos primarios de prepucio neonatal


U l j i di l i i H C TR lt d




Analizar la expresión de genes para identificarlos procesos fisiológicos que son controlados

por el sistema circadiano

Queratinocitos epidérmicosprimarios poseen un reloj

circadiano periférico

Este reloj se comporta de

forma muy similar al relojHaCaT

Algunos genes del relojidentificadas en HaCaTpueden ser validados en

queratinocitos primarios

U l j i di l ti it H C TDi ió



•Abren la puerta del estudio de la relación molecular entre elreloj circadiano y la fisiología de la epidermis

•Temperatura actúa como potente Zeitgeber del reloj

•Las limitaciones de los modelos in vitro para el estudio delos ritmos circadianos puede por lo menos superar los ciclos

térmicos.

•Herramienta viable: resultados al comparar conqueratinocitos primarios


Queratinocitos HaCaT como un nuevo sistema modelo paraestudiar el control circadiano de la fisiología epidérmica

Discusión

U l j i di l ti it H C TDi ió



Colesterol:

•

Insig2a, HMGCR, gen receptor de LDL

•Esencial para diferenciación / proliferación de queratinocitos•Formación de la capa córnea•Se libera a partir de queratinocitos cornificados para formar

la barrera de lípidos epidérmica


Posible papel de los genes controlados por el reloj en lafisiología epidérmica

Discusión

U l j i di l ti it H C TDisc sión



•Oncogén c-Myc :

•Induce la proliferación de células madre epidérmicas•Estimula la diferenciación terminal de queratinocitos

•Dbp:•Involucra a la familia del citocromo P450•Metabolismo Vit D en los queratinocitos


Posible papel de los genes controlados por el reloj en lafisiología epidérmica

Discusión

Un reloj circadiano en los q eratinocitos HaCaTConclusión




Modelo para el estudio los ritmos circadianos en losqueratinocitos epidérmicos, que facilitaría la investigación en

la regulación circadiana de la fisiología epidérmica

Conclusión

Reloj circadiano de la epidermis, podría dar lugar a la

administración de fármacos optimizados y sofisticados para eltratamiento de enfermedades de la piel

ingrid rivera ficha agosto 2011 un reloj circadiano en los queratinocitos hacat

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