inhibition der rig-i- und tlr3-vermittelten signalwege zur...
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Untersuchungen zur Suppression der durch doppelsträngige RNA
induzierten IFN-β-Expression durch das Hepatitis A-Virus:
Inhibition der RIG-I- und TLR3-vermittelten Signalwege
zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors IRF-3
Dissertation
zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
im Fachbereich Biologie / Chemie
Universität Bremen
vorgelegt von
Volker Fensterl
Dezember 2005
1. Gutachter: Prof. Dr. Angelika Vallbracht
2. Gutachter: Prof. Dr. Reimer Stick
Teile dieser Arbeit sind veröffentlicht in:
Fensterl, V.; Grotheer, D., Berk, I.; Schlemminger, S.; Vallbracht, A.; Dotzauer, A.:
Hepatitis A Virus Suppresses RIG-I-mediated IRF-3 Activation To Block Induction of Beta Interferon
Journal of Virology (2005), 79(17):10968-10977
Danksagung
In kurzen Worten danke ich an dieser Stelle allen, die zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben und die vergangenen drei Jahre zu einer so positiven Erfahrung haben werden lassen. Mein besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. Angelika Vallbracht. Sie ließ mir viel Raum für Eigeninitiative bei der Durchführung dieser Arbeit und gewährte jederzeit sowohl spontane als auch prospektive Unterstützung. Ich danke außerdem Herrn Prof. Dr. Reimer Stick für die bereitwillige Übernahme des Zweitgutachtens. Herrn Dr. habil. Andreas Dotzauer gebührt mein Dank für seine immerwährende Bereitschaft zu Diskussion, Beratung und Betreuung. Der gesamten Arbeitsgruppe, besonders den aktiven und ehemaligen Doktorandinnen und Doktoranden Iris Berk, Dajana Grotheer, Sonja Händschke, Oliver Janssen-Weets und Thomas Magulski, danke ich für eine wirklich angenehme Zeit und die gute Zusammenarbeit. Gleiches gilt für die zahlreichen Diplomandinnen und Diplomanden, die sich im Laufe der letzten Jahre zeitweilig zu uns gesellten. Ein großer Dank geht an Frau Renate Mester und Frau Heike Kettler, die mit vorbildlicher Motivation und Freundlichkeit den reibungslosen Laborbetrieb ermöglichten. Des weiteren bedanke ich mich bei der Tönjes-Vagt-Stiftung Bremen für die Bereitstellung der Mittel für die Durchführung dieser Arbeit. Meinen Eltern möchte ich herzlich für den kontinuierlichen Rückhalt während meiner gesamten Ausbildung danken.
Inhaltsverzeichnis ____________________________________________________________
Abkürzungen und Akronyme ............................................................................................................................. 3 1 Einleitung
1.1. Interferone .......................................................................................................................................... 5 1.2. Interferon-β-Induktion ........................................................................................................................ 8 1.2.1. Transkriptionsfaktor IRF-3 ................................................................................................................. 15 1.3. Detektion des Signalmoleküls dsRNA ............................................................................................... 20 1.4. Hepatitis A-Virus ................................................................................................................................ 25 1.5. Zielsetzung ......................................................................................................................................... 30
2 Material und Methoden 2.1. Material 2.1.1. Viren ................................................................................................................................................... 31 2.1.2. Zellen .................................................................................................................................................. 31 2.1.3. Kompetente Bakterien ........................................................................................................................ 31 2.1.4. Plasmide ............................................................................................................................................. 32 2.1.5. Enzyme, Proteine und Antikörper ...................................................................................................... 34 2.1.6. Serum für Zellkultur ........................................................................................................................... 36 2.1.7. Antibiotika .......................................................................................................................................... 36 2.1.8. Kits und Standards .............................................................................................................................. 36 2.1.9. Primer für die RT-PCR ....................................................................................................................... 36 2.1.10. Chemikalien und Reagenzien ............................................................................................................. 37 2.1.11. Puffer und Lösungen .......................................................................................................................... 39 2.1.12. Geräte ................................................................................................................................................. 46 2.1.13. Verbrauchsmaterial ............................................................................................................................. 47 2.2. Methoden 2.2.1. Hitzeschock-Transformation kompetenter E. coli-Bakterien ............................................................. 48 2.2.2. Schnellpräparation bakterieller Plasmid-DNA (Miniprep) ................................................................ 49 2.2.3. Plasmidpräparation (Maxiprep) .......................................................................................................... 49 2.2.4. Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA ..................................................................... 51 2.2.5. Restriktionsspaltungsanalyse von Plasmid-DNA ............................................................................... 51 2.2.6. Agarose-Gelelektrophorese für DNA ................................................................................................. 52 2.2.7. Zellkultur FRhK-4-Zellen .................................................................................................................. 52 2.2.8. Zellkultur MRC-5-Zellen ................................................................................................................... 52 2.2.9. Cryokonservierung von Zellen ........................................................................................................... 53 2.2.10. Mycoplasmen-Test per PCR (VenorGeM) ......................................................................................... 53 2.2.11. Herstellung eines Viruspools (Hepatitis A-Virus) ............................................................................. 54 2.2.12. Endpunkttitration von HAV-Viruspools (TCID50) ............................................................................. 54 2.2.13. Herstellung eines Viruspools (Newcastle Disease-Virus) .................................................................. 56 2.2.14. Endpunkttitration von NDV-Viruspools (TCID50) ............................................................................. 56 2.2.15. Infektion mit Hepatitis A-Virus (HAV) ............................................................................................. 57 2.2.16. Infektion mit Newcastle Disease-Virus (NDV) ................................................................................. 57 2.2.17. NDV-Replikationskinetik in FRhK-4-Zellen (One step growth curve) ............................................. 58 2.2.18. Zellzahlbestimmung ........................................................................................................................... 58 2.2.19. Indirekte Immunfluoreszenz zur HAV-Detektion .............................................................................. 59 2.2.20. Intrazelluläre Lokalisation von GFP-IRF-3 ........................................................................................60 2.2.21. Transfektion nach der Calciumphosphat-Methode ............................................................................ 60 2.2.22. Transfektion mittels jetPEI transfection reagent ............................................................................... 61 2.2.23. Stabile Plasmid-Transfektion ............................................................................................................. 62 2.2.24. poly(IC)-Transfektion mittels DEAE-Dextran ................................................................................... 62 2.2.25. Extrazelluläre poly(IC)-Stimulation ................................................................................................... 63 2.2.26. Freeze & Thaw-Lyse zur Proteinextraktion ....................................................................................... 63 2.2.27. Proteinbestimmung nach Bradford ..................................................................................................... 64 2.2.28. Luciferase-Assay ................................................................................................................................ 64 2.2.29. CAT-ELISA ....................................................................................................................................... 64
2.2. Methoden (Fortsetzung)
2.2.30. Diskontinuierliche Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ................................................. 65 2.2.31. Immunoblot ........................................................................................................................................ 66
2.2.32. Herstellung von Leervektoren durch Insert-Excision und Religation ................................................ 67 2.2.33. Phenol-Ether-Extraktion von DNA aus LMP-Agarose-Gel ............................................................... 68 2.2.34. RNA-Extraktion (AGPC-Methode) .................................................................................................... 68 2.2.35. DNase-Verdau und Phenol-Chloroform-Extraktion nach RNA-Extraktion ...................................... 69 2.2.36. Photometrische Konzentrationsbestimmung von RNA ......................................................................70 2.2.37. RT-PCR (Reverse transcription-polymerase chain reaction) ............................................................ 70 3 Ergebnisse 3.1. Einfluss einer HAV-Infektion auf die RIG-I-vermittelte IRF-3-Aktivierung durch intrazelluläre dsRNA
3.1.1. Einsetzbarkeit von jetPEI-Transfektionsreagens und NDV-Infektion ............................................... 72 3.1.1.1. Plasmid-Cotransfektion mittels jetPEI-Transfektionsreagens ............................................................ 72 3.1.1.2. NDV-Replikationskinetik in HAV-infizierten FRhK-4-Zellen .......................................................... 74 3.1.2. Untersuchung der nucleären Translokation von IRF-3 ...................................................................... 75 3.1.2.1. Suppression der NDV-induzierten nucleären Translokation von GFP-IRF-3
in HAV/7-infizierten FRhK-4-Zellen ................................................................................................. 75 3.1.2.2. Suppression der durch poly(IC)-Transfektion induzierten nucleären Translokation
von GFP-IRF-3 in HAV/7-infizierten FRhK-4-Zellen ....................................................................... 77 3.1.3. Untersuchung der IFN-β-Enhancer- und IRF-3-Aktivierung durch IKKε und TBK1 ....................... 78 3.1.3.1. IKKε-vermittelte IFN-β-Enhancer- und IRF-3-Aktivierung
in HAV/7-infizierten FRhK-4-Zellen ................................................................................................. 79 3.1.3.2. TBK1-vermittelte IFN-β-Enhancer- und IRF-3-Aktivierung
in HAV/7-infizierten FRhK-4-Zellen ................................................................................................. 80
3.1.4. Untersuchung des IKKε/TBK1-Bindeproteins TANK ...................................................................... 82 3.1.4.1. Einfluss einer TANK-Überexpression auf die Suppression der IRF-3-Aktivierung
in HAV/7-infizierten FRhK-4-Zellen ................................................................................................. 82 3.1.5. Untersuchung der RIG-I-vermittelten IFN-β-Enhancer- und IRF-3-Aktivierung ............................. 84 3.1.5.1. Suppression der RIG-I-induzierten IFN-β-Enhancer- und IRF-3-Aktivierung
in HAV/7-infizierten FRhK-4-Zellen ................................................................................................. 84 3.1.5.2. RIG-IC-vermittelte Hemmung der IFN-β-Enhancer-Induktion
durch NDV-Infektion oder poly(IC)-Transfektion ............................................................................. 85 3.1.6. Endogene RIG-I-, TLR3- und TRIF-Expression in FRhK-4-Zellen .................................................. 87 3.1.6.1. Nachweis endogener mRNA von RIG-I, TLR3 und TRIF in FRhK-4-Zellen
mittels RT-PCR .................................................................................................................................. 87 3.2. Einfluss einer HAV-Infektion auf die TLR3-vermittelte IRF-3-Aktivierung durch extrazelluläre dsRNA 3.2.1. Untersuchung der TRIF-vermittelten IFN-β-Enhancer- und IRF-3-Aktivierung .............................. 89 3.2.1.1. Beeinträchtigung der TRIF-induzierten IFN-β-Enhancer- und IRF-3-Aktivierung
in HAV/7-infizierten FRhK-4-Zellen ................................................................................................. 90 3.2.2. Untersuchung der IRF-3-Aktivierung durch Stimulation des TLR3 .................................................. 91 3.2.2.1. Nachweis der TLR3-Überexpression in FRhK-4/TLR3-Zellen mittels RT-PCR .............................. 92 3.2.2.2. Zeitabhängigkeit der Stimulierbarkeit des TLR3 in FRhK-4-Zellen ................................................. 93 3.2.2.3. Beeinträchtigung der durch TLR3-Stimulation induzierten IRF-3-Aktivierung
in HAV/7-infizierten FRhK-4- und FRhK-4/TLR3-Zellen ................................................................ 94 4 Diskussion ......................................................................................................................................................... 96 5 Zusammenfassung ............................................................................................................................................ 112 6 Literatur ............................................................................................................................................................ 113 Anhang ............................................................................................................................................................... 135
Abkürzungen und Akronyme ____________________________________________________________ Aufgrund der großen Anzahl der verwendeten Abkürzungen sind an dieser Stelle nur die für das inhaltliche Verständnis der Arbeit wesentlichen aufgeführt. Zudem werden die meisten Abkürzungen bei ihrem ersten Vorkommen im Text direkt erklärt.
Ac Acetylrest AKT zelluläres Homolog des v-akt-Onkogens des transformierenden murinen Retrovirus AKT8 (= PKB) ALT, AST Alanin-Aminotransferase (= GPT), Aspartat-Aminotransferase (= GOT) AP-1 Activating protein 1 (c-JUN/c-Fos; allgemein die ATF- und JUN-Familie-Komplexe) ATF-2 Activating transcription factor 2 Bcl-2 B-cell lymphoma 2 (Proteinfamilie) bp Basenpaare CARD Caspase recruitment domain CAT Chloramphenicol-Acetyltransferase CBP CREB-binding protein (homolog zu p300; CREB = cAMP response element binding protein) CD4, CD8 Cluster of differentiation protein 4 bzw. 8 (Oberflächenmarker für T-Zellen) cIAP cellular inhibitor of apoptosis (Proteinfamilie) c-JUN cellular v-jun-homolog (v-jun = Onkogen in Avian Sarcoma Virus 17) CMV Cytomegalievirus (Herpesviridae) CPE Cytopathischer Effekt CTL Cytotoxischer T-Lymphocyt DEAE Diethyl-aminoethyl (positiv geladener Substituent des DEAE-Dextrans) DEPC "Diethylpyrocarbonat" (Diethyldicarbonat) DNA-PK DNA-abhängige Protein-Kinase dNTP Desoxyribonucleosidtriphosphat DMEM Dulbecco`s modified Eagle`s Medium DRAF1 dsRNA-activated factor (p300/CBP + IRF-3) dsRNA doppelsträngige Ribonucleinsäure (RNA) EDTA Ethylen-diamin-tetraacetat eIF2α eukaryotic (translation) initiation factor 2α ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay FADD Fas-associated Death domain (= MORT-1) FCS Fetal calf serum (= FBS) FITC Fluorescein-isothiocynanat FRhK-4 Fetal Rhesus monkey kidney-Zell-Linie 4 GCN5 hefehomologe Histonacetyltransferase, GCN5/PCAF-Familie GFP Green fluorescent protein H+ Proton HAV Hepatitis A-Virus (Picornaviridae) HAV-cr1 HAV cellular receptor 1 (= TIM-1) HcRed Rot fluoreszierendes Protein aus Heteractis crispa HDAC Histon-Desacetylase HEK293 human embryonic kidney 293 (= 293; Adenovirus 5-transformierte Zell-Linie) HMG-I(Y) High mobility group-Protein-I(Y) (neue Nomenklatur: HMG-A1) IFN Interferon IgA/M/G Immunglobulin A, M, G IκB Inhibitor of NF-κB (Familie: IκB-α, β, γ, ε) IKK IκB kinase (IKKα = IKK1, IKKβ = IKK2; IKKγ = NEMO; IKKε = IKK-i) IRES Internal ribosome entry site IRF Interferon regulatory factor ISG Interferon-stimulated gene ISGF3 ISG-factor 3 (STAT1 + STAT2 + IRF-9) ISRE Interferon-stimulated response element JAK Janus-Kinase JNK c-Jun N-terminal kinase kb Kilobasen kDa Kilodalton LCPS Luminescence counts per second LGP2 Laboratory of Genetics and Physiology gene 2 Luc Luciferase MAPK Mitogen-activated protein kinase MAVS Mitochondrial antiviral signaling (= IPS-1, VISA, CARDIF) MDA-5 Melanoma differentiation-associated gene-5 (= HELICARD, RH116)
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mDC myeloide Dendritische Zelle MEKK1 MAPK/ERK kinase kinase 1 MHC Major histocompatibility complex (I und II) MKK MAPK kinase MOI Multiplicity of infection (Infektionsverhältnis Viren/Zelle) MRC-5 Medical research council-Zell-Linie 5 (humane embryonale Lungenfibroblasten) NAK NF-κB-activating kinase (= TBK1) NAP1 NAK-associated protein 1 NDV Newcastle disease virus (Paramyxoviridae) NEMO NF-κB essential modulator (= IKKγ) NES Nuclear export signal NF-κB Nuclear Factor κB (Familie: RelA/p65, RelB, c-Rel, p50, p52) NK Natural killer cell NLS Nuclear localization signal NRF NF-κB-repressing factor NTR nicht-translatierte Region OAS 2'-5'-Oligoadenylat-Synthetase OD260 Optische Dichte bei 260 nm Wellenlänge ORF Open reading frame
Phosphorylierung an Serin-/Threonin-/Tyrosinresten p300 300 Kilodalton-Protein, E1A-bindend (homolog zu CBP) p38 Mitogen-activated protein kinase 38 kDa PACT PKR-activating protein (= RAX) PBS Phosphate buffered saline PCAF p300/CBP associated factor (Histonacetyltransferase) pDC plasmacytoide Dendritische Zelle p.i. post infection PI3K Phosphatidyl-inositol-3-kinase PIASy Protein inhibitor of activated STAT y PIP3 Phosphatidyl-inositol-3,4,5-trisphosphat PKR Protein kinase, dsRNA-activated poly(IC) poly-Inosinsäure:poly-Cytidylsäure (= poly(I:C), poly(I)*poly(C), pIC) PRD Positive regulatory domain (IV, III-I, II) des IFN-β-Enhancers PRDI-BF1 PRDI-binding factor 1 (= BLIMP-1) RANTES Regulated upon activation, normal T-cell expressed and secreted (Chemokin) RIG-I Retinoic acid-induced gene I (= RHIV-1) RIG-IC RIG-I C-Terminus (ohne CARD-Domäne) RIP1 Receptor interacting protein-1 RNase L latente Ribonuclease rpm revolutions per minute (U/min) RT Room temperature (etwa 20°C) RT-PCR Reverse transcription & polymerase chain reaction SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese siRNA short interfering RNA ssRNA einzelsträngige (single-stranded) RNA STAT Signal transducer and activator of transcription SV40 Simian virus 40 (Papovaviridae) SWI/SNF ATP-abh. Chromatin-Remodeling-Komplex; Hefe-Homologe: Switch defective/Sucrose non-fermenter TAB TAK1-binding protein TAK1 TGF-β-activated kinase 1 TANK TRAF-associated NF-κB-activator (= I-TRAF) TBK1 TANK-binding kinase 1 (= NAK, T2K) TBP TATA-Box binding protein (in TFIID-Komplex) TCID50 Tissue culture infectious dose 50% (mittlere Zellkulturinfektionsdosis) TFIID Transkriptionsfaktor D der RNA-Polymerase II (Komplex) TH T-Helfer-Zelle TIR Toll-/IL-1-receptor homology domain TLR Toll-like receptor (Familie: TLR1-10) TRAF Tumor necrosis factor-receptor associated factor (Familie TRAF1-6) TRAIL Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (= APO-2L) TRIF TIR-domain containing adapter inducing IFN-β (= TICAM-1, Lps2) TYK Tyrosin-Kinase Ub Ubiquitin VAF Virus-activated factor (p300/CBP + IRF-3 + IRF-7) VAK Virus-activated kinase (IRF-3-Kinase-Komplex mit TBK1 / IKKε u.a.) VP Virusprotein VT Volumenteil w/v weight / volume (Masse pro Volumen)
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1. Einleitung ____________________________________________________________
1.1. Interferone
Im Jahre 1957 beschrieben Alick Isaacs und Jean Lindenmann ein sezerniertes Makromolekül,
welches von Chorioallantoismembran-Zellen produziert wurde, nachdem diese mit hitze-
inaktiviertem Influenzavirus inkubiert worden waren. Jenes Molekül besaß die Fähigkeit, mit der
Replikation von Wildtyp-Influenzaviren zu "interferieren", sie also zu hemmen. Sie nannten den
sezernierten Faktor entsprechend seiner Funktion "Interferon" (140). Innerhalb der folgenden
48 Jahre wurden die Induktion und die Wirkung jener Familie von Cytokinen, sowie ihre
zentrale Rolle innerhalb des unspezifischen Immunsystems, eingehend untersucht.
Interferone (IFN) sind sezernierte Glykoproteine und zählen zu den Cytokinen, wobei man
zwischen Typ I- und Typ II-Interferon unterscheidet. Zu den Typ II-Interferonen zählt
ausschließlich das IFN-γ, welches den Typ I-Interferonen strukturell unverwandt ist und
vornehmlich von T- und NK-Zellen, also Zellen des Immunsystems, produziert wird, wenn diese
mittels entsprechender Interleukine (z.B. IL-2, IL-12, IL-18) stimuliert worden sind; das IFN-γ
tritt also erst in der späten Phase einer Infektion auf. Die Wirkung des IFN-γ wird über den
IFN-γ-Rezeptor vermittelt und beschränkt sich im Allgemeinen auf immunmodulatorische
Funktionen innerhalb des spezifischen Immunsystems, jedoch gibt es Überlappungen mit der
Wirkung von Typ I-Interferon. Zu den Typ I-Interferonen gehören beim Menschen die
wenigstens 13 Subtypen des IFN-α, das IFN-β und einige andere Vertreter wie IFN-ω, IFN-κ
und IFN-ε. IFN-α wird dabei besonders von bestimmten Leukocyten, wie den plasmacytoiden
Dendritischen Zellen (pDC), produziert; das IFN-β kann von sehr vielen Zelltypen gebildet
werden, wobei Fibroblasten vergleichsweise große Mengen sezernieren können. Den zentralen
Stimulus für die Induktion von IFN-α/β stellt meist eine virale Infektion und das damit
verbundene Auftreten virusspezifischer Moleküle dar (siehe unten) (18, 112, 299, 320). Alle
Typ I-Interferone nutzen den selben IFN-α/β-Rezeptor, und entsprechend ihrem Induktor haben
sie in erster Linie antivirale Wirkung, indem sie in benachbarten Zellen (parakrin) über die
rezeptorvermittelte Initiation des "JAK-STAT-Weges" (Abb. 1) die Induktion bestimmter Gene
bewirken, was den Zellen einen antiviralen Status verleiht (21):
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Die Bindung von IFN-α/β bringt die beiden Untereinheiten des Rezeptors in räumliche Nähe,
was die Transphosphorylierung der assoziierten Janus-Kinasen JAK1 und TYK2, sowie die
Phosphorylierung von Tyrosinresten in der cytoplasmatischen IFN-α/β-Rezeptordomäne zur
Folge hat. Anschließend können auch die Proteine STAT1 und STAT2 (Signal transducer and
activator of transcription) durch die rezeptorassoziierten Janus-Kinasen phosphoryliert werden,
was ihre Dimerisierung und Assoziation mit IRF-9 (= p48/ISGF3γ) zu einem Komplex namens
ISGF3 nach sich zieht, welcher in den Zellkern transloziert und dort an das Interferon-stimulated
response element (ISRE) zahlreicher, folglich als Interferon-stimulated genes (ISG)
bezeichneter, Gene bindet (195). Die Expression jener Gene bedeutet den Aufbau eines
antiviralen Status, was anhand einiger Beispiele erläutert werden soll.
Abb. 1: JAK-STAT-Weg. IFN-α/β bindet an die IFN-α/β-Rezeptor-Untereinheiten IFNAR1und 2, daraufhin phosphorylieren die assoziierten Janus-Kinasen JAK1 und TYK2 einander;die Phosphorylierung des Rezeptors führt zur Rekrutierung der STAT-Proteine (Signaltransducer and activator of transcription), welche nach ihrer JAK1/TYK2-vermitteltenAktivierung mit IRF-9 den ISGF3-Komplex (ISG-factor 3) bilden, welcher im Zellkern überdie Bindung des ISRE (Interferon-stimulated response element) die Induktion von ISGs(Interferon-stimulated genes) einleitet.
Es seien zunächst die beiden klassischen Beispiele der Proteinkinase R (PKR) und des
OAS/RNase L-Systems genannt. Die PKR-Expression wird durch Interferon hochreguliert, liegt
aber konstitutiv in basalen Mengen vor. Die Kinase-Aktivität nimmt sie erst nach Bindung an
doppelsträngige RNA (dsRNA) auf, einem klassischen Signalmolekül viraler Infektionen (siehe
unten), woraufhin sie dimerisiert und ihre Untereinheiten transautophosphoryliert. In diesem
Zustande kann sie den eukaryotischen Translations-Initiationsfaktor eIF2α phosphorylieren, was
das Recycling von eIF2 unterbindet und letztlich eine generelle Translationsinhibition zur Folge
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hat. Auf diese Weise kann die PKR nach ihrer Aktivierung auch Apoptose auslösen, was die
Ausbreitung einer viralen Infektion beeinträchtigt (72, 254, 369). Im übrigen kann bei zellulärem
Stress auch in Abwesenheit von dsRNA der PKR-Aktivator PACT (= RAX) durch direkte
Bindung die PKR aktivieren (144, 252, 254).
Die 2'-5'-Oligoadenylat-Synthetase (OAS) repräsentiert ein weiteres ISG, welches nach seiner
Interferon-vermittelten Induktion und Expression vorerst latent im Cytoplasma vorliegt, jedoch
im Falle einer viralen Infektion durch Bindung an dsRNA aktiviert wird; die OAS synthetisiert
sodann 2'-5'-verknüpfte Oligoadenylate aus ATP, welche als spezifische Aktivatoren der
Latenten RNase (RNase L) dienen. Die infolgedessen dimerisierte RNase L spaltet nun
unspezifisch einzelsträngige RNA, darunter zelluläre mRNA und rRNA, aber auch virale RNA.
So kann das OAS/RNase L-System die Replikation von Viren hemmen und gegebenenfalls
Apoptose auslösen (21, 112). Es zeigt sich also, dass Zellen auf eine virale Infektion nicht nur
mit der Synthese von Interferon reagieren können, sondern auch Apoptose einleiten können, eine
Art altruistische, koordinierte Selbstzerstörung ohne Entlassung des Zellinhalts in die
Umgebung.
Weitere klassische Beispiele interferonstimulierter Gene sind zum einen die Mx-Proteine,
ihrerseits Dynamin-verwandte GTPasen, welche die Replikation verschiedener RNA-Viren
stören, und zum anderen die dsRNA-abhängige Adenosin-Desaminase 1 (ADAR1), die
doppelsträngige RNA (als virales Replikationsintermediat) entwindet und deren Adenosine
desaminiert, was einer mutagenen Inosinsubstitution entspricht (112, 280, 334).
In jüngerer Zeit sind weitere ISGs mit antiviralen Eigenschaften beschrieben worden. Das p56,
Genprodukt des ISG56, bindet beispielsweise an den eIF3-Komplex und inhibiert so die
Translation (119); die Exonuclease ISG20 degradiert einzelsträngige RNA (86, 87); das Viperin
(CIG5) ist mit intrazellulären Membransystemen assoziiert und hemmt z.B. das Assembly des
humanen Cytomegalievirus (47). Es bleibt festzuhalten, dass Interferone bezüglich ihrer
Wirkung keine Virusspezifität besitzen, was sie als Komponente des unspezifischen
Immunsystems auszeichnet. Allerdings zeigt sich eine Wirtsspeziesbarriere in Hinblick auf ihre
Wirksamkeit, wobei zu erwähnen ist, dass Affen-Interferon durchaus auf menschliche Zellen
wirkt, und umgekehrt (321).
Bei der Reaktion eines Organismus auf virale Infektionen sind die erwähnten Dendritischen
Zellen (DC) involviert, spezialisierte, zur Migration befähigte Antigen-präsentierende Zellen
(APC); die extrazelluläre Stimulation durch virale Komponenten, oder deren Phagocytose,
induziert in ihnen die Synthese und Sekretion großer Mengen von zumeist IFN-α, welches nicht
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nur ihre eigene Reifung fördert, sondern auch die Aktivierung von NK-Zellen sowie CD4- und
CD8-positiven T-Zellen unterstützt; im letzteren Falle spricht man von Cross-priming (7, 66,
132, 145, 296). Außerdem werden durch Interferon auch MHC-Proteine hochreguliert. Über
diese MHC-Proteine kann virales Antigen durch entsprechende DC-Subsets CD4- und auch
CD8-positiven T-Zellen präsentiert werden (Cross-presentation), wobei durch die gleichzeitige
Sekretion von Typ I-IFN eine TH1-polarisierte Immunantwort herbeigeführt wird (41, 57, 143,
296). Kurz gesagt bedeutet dies eine spezifische Immunreaktion, die mit Unterstützung von
CD4-positiven Typ-1 T-Helfer-Zellen (TH1) eine Reifung und Aktivierung von CD8-positiven,
cytotoxischen T-Zellen (CTL) zum Ziel hat, was im weiteren Verlauf die Zerstörung infizierter
Zellen durch die CTLs bedeutet. Die soeben geschilderten Erkenntnisse machen deutlich, dass
Typ I-Interferone ihren Wirkungsbereich auch an der Grenze zwischen unspezifischem und
spezifischem Immunsystem haben.
Die Bedeutung des Typ I-Interferonsystems bezüglich einer viralen Infektion liegt − neben der
Möglichkeit einer Elimination des Virus − sicherlich in der Regulation der frühen
Infektionsphase im Sinne einer Eindämmung der viralen Replikation, bis das spezifische
Immunsystem eine T- und B-Zellantwort etablieren kann. Aus diesem Grunde ist es nicht
überraschend, dass die meisten Viren, wenn nicht sogar alle, Mechanismen zur Beeinträchtigung
der IFN-Induktion, des IFN-Signalings oder der Funktion der ISGs entwickelt haben; dies wird
in der Diskussion detaillierter behandelt werden. Es sei an dieser Stelle die Fähigkeit des in der
vorliegenden Arbeit untersuchten Hepatitis A-Virus vorweggenommen, bereits die Induktion des
Interferon-β zu supprimieren. Daher werden im nächsten Abschnitt die Signalwege zur
transkriptionellen Aktivierung des IFN-β-Gens, induziert durch dsRNA, eingehend betrachtet.
1.2. Interferon-β-Induktion
Die transkriptionelle Induktion des IFN-β-Gens kann durch virale Nucleinsäuren, besonders
doppelsträngige RNA (dsRNA), welche durch extra- und intrazelluläre Sensorproteine detektiert
werden kann, stimuliert (147). Im Folgenden werden zunächst die Gemeinsamkeiten jener
dsRNA-induzierten Signalwege besprochen, nämlich die Initiation der Transkription nach der
Aktivierung der benötigten Transkriptionsfaktoren, bevor die unterschiedlichen dsRNA-
Rezeptormoleküle und die durch ihre Adapter vermittelte, spezifische Signaltransduktion
erläutert werden.
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Das humane IFN-β-Gen verfügt zur Kontrolle seiner Expression neben einer TATA-Box über
einen direkt vorgelagerten Enhancer, der im Gegensatz zur TATA-Box nicht von den Histon-
Proteinen eines Nucleosoms maskiert wird und daher frei zugänglich ist (208, 214).
Abb. 2: Das IFN-β-Enhanceosom. Darstellung des assemblierten Transkriptionsfaktor-komplexes (grün) auf dem Enhancer des IFN-β-Gens, sowie die Untergliederung desEnhancers in Positive regulatory domains (PRD). Die IFN-β-Induktion erfolgt durchRekrutierung der RNA-Polymerase II. Repressorproteine (grau) sorgen für das postinduktiveund konstitutive Silencing des IFN-β-Gens. Weitere Erläuterungen siehe Text.
Dieser Enhancer untergliedert sich in drei Positive regulatory domains (PRDIV, PRDIII-I und
PRDII), die -102 bis -55 bp vor der Transkriptionsstartposition liegen, sowie eine Negative
regulatory domain (NRD I) (-60 bis -37, Abb. 2) (214). Der inaktive Zustand des Gens wird
durch Repressorproteine wie NRF gewährleistet, die konstitutiv an den Enhancer binden und so
spontane Interaktionen mit anderen Transkriptionsfaktoren unterbinden, oder durch repressor-
vermittelte Rekrutierungen von Histon-Desacetylasen und anderen Proteinen, welche die
nucleosomale Chromatinstruktur durch Desacetylierung oder Methylierung stabilisieren, um das
Gen zu inaktivieren. Solche Rekrutierungen werden in diesem Falle vom PRDI-binding factor 1
(PRDI-BF1) vermittelt (121, 134, 167, 242, 271, 388). Nach Detektion einer viralen Infektion
werden in der betreffenden Zelle jedoch bestimmte Transkriptionsfaktoren aktiviert, welche
sodann nach Verdrängung der Repressoren an ihre spezifische PRD binden; dazu gehören das
Dimer aus den Leucin-Zipper-Proteinen ATF-2 und c-JUN (Activating transcription factor 2 /
9
cellular v-jun homolog), welches an die PRDIV bindet, ferner der an die PRDII bindende dimere
NF-κB (Nuclear factor-κB) und ein Dimer aus IRF-3-Proteinen (Interferon regulatory factor 3)
(214, 233). IRF-3 bindet dabei, auch in Heterodimeren mit IRF-7, an die PRDIII-I und stellt
einen essentiellen Faktor für die IFN-β-Induktion dar (Abb. 2) (16, 151, 256, 285, 363, 379). Es
kann hierbei von zwei IRF-Dimeren pro PRDIII-I ausgegangen werden (250). Sämtliche
genannten Faktoren sind imstande, die Proteine p300 oder CBP (CREB-binding protein) zu
rekrutieren, transkriptionale Coaktivatoren, die unzählige weitere Transkriptionsfaktoren binden
können und somit an der Induktion zahlreicher Gene beteiligt sind (214, 224, 358, 384). p300
und CBP sind funktionelle Homologe und besitzen zudem eine Acetyltransferase-Funktion (42,
209, 245). Gemeinsam mit "architektonischen" High mobility group-Proteinen HMG-I(Y) (neue
Nomenklatur: HMG-A1), welche an zwei Stellen des IFN-β-Enhancers binden, eine Krümmung
der DNA verursachen und so die Bindung der Transkriptionsfaktoren begünstigen, bilden die
erwähnten Faktoren das IFN-β-Enhanceosom (Abb. 2) (89, 171, 339, 382, 383).
Dieses kann über den Coaktivator p300/CBP die Assoziation mit der RNA-Polymerase II
vermitteln und so letztlich die Initiation der Transkription induzieren (2, 166, 172). Auch dieser
Prozess ist mehrstufig und beinhaltet die Acetylierung der Histone benachbarter Nucleosomen,
das Remodeling der Chromatinstruktur, welches eine Lockerung der Histon/DNA-
Komplexierung nach sich zieht, und die Bindung der auf diese Weise freigelegten TATA-Box
durch den allgemeinen Transkriptionsfaktor TFIID, welcher das TATA-box binding protein
(TBP) enthält. Das Zurückweichen des Nucleosoms und die Präsenz der übrigen
Transkriptionsfaktoren (wie TFIIB, TFIIA und TFIIH) eröffnet der RNA-Polymerase II sodann
die Möglichkeit der Transkriptionsinitiation (1, 2, 208). Die eben geschilderten Vorgänge sind
im Anhang 1 übersichtlich illustriert.
Die Architektur des Enhancers ermöglicht einen Synergie-Effekt des Enhanceosoms bezüglich
der Aktivierung der Transkription: die Bindung einzelner Transkriptionsfaktoren wie NF-κB
oder ATF-2/c-JUN resultiert dabei kaum in einer Initiation, im Falle von IRF-3 ist sie stärker;
sind jedoch alle Komponenten vorhanden, kommt es zu einer überproportional gesteigerten
Transkriptionsrate (151, 171, 339, 379). Solche Effekte sind auf konformatorische
Veränderungen der DNA (250) und zum Teil auf die Interaktion zwischen den einzelnen
Untereinheiten zurückführbar, wie zwischen ATF-2 und IRF-3, NF-κB und IRF-3, sowie
Bindungen mit den HMG-Proteinen (82, 88, 171, 224, 339, 379). Auf diese Weise wird also eine
versehentliche, übermäßige IFN-β-Induktion verhindert, zumal ATF-2/c-JUN und NF-κB auch
über andere Stimuli an der Expression unzähliger anderer Gene beteiligt sind (125, 249, 288,
397).
10
Die Maximalinduktion des IFN-β-Gens wird interessanterweise erst in Cooperation von IRF-3
mit dem erwähnten IRF-7 erreicht (379). IRF-7 ist ein interferon-induziertes Protein (ISG),
welches erst durch die autokrine Wirkung des "Initial-Interferons" IFN-β induziert wird und
dann sowohl die Transkription von IFN-β verstärkt als auch die Induktion der IFN-α-Subtypen
ermöglicht, welche mit Ausnahme von IFN-α1 nicht durch IRF-3 regulierbar sind (196, 205,
234, 381). Auf diese Weise entsteht ein positives Feedback zwischen IRF-7 und Typ I-Interferon
(215, 284). Ein solcher Mechanismus steht hinter der Fähigkeit von z.B. plasmacytoiden
Dendritischen Zellen (pDC), außerordentlich große Mengen IFN-α zu produzieren. Zudem
exprimieren diese Zellen konstitutiv basale Mengen IRF-7, was ihnen eine außerordentlich
schnelle Reaktion auf einen viralen Stimulus erlaubt (65). Für andere Zelltypen wie Fibroblasten
und Epithelzellen gilt hingegen die erwähnte Initialwirkung des IFN-β und somit die imperative
Rolle des IRF-3 (196).
Die Abschaltung des IFN-β-Gens durch Zerfall des Enhanceosoms ist beispielsweise durch
Acetylierung ihrer Komponenten durch p300/CBP oder die assoziierte Acetyltransferase PCAF
(p300/CBP-associated factor) möglich: die Acetylierung der p65-Untereinheit von NF-κB durch
PCAF bedeutet eine Verminderung der DNA-Bindung (168); die CBP-vermittelte Acetylierung
der HMG-I(Y)-Proteine hat eine Destabilisierung des Enhanceosoms zur Folge (232). Im
übrigen kann NF-κB ins Cytoplasma rücktransportiert werden (12), und IRF-3 wird nach seiner
Aktivierung alsbald proteosomal degradiert (203). Auch die erwähnten Repressoren treten
wieder auf den Plan, wie die virusinduzierten PRDI-BF1 und IRF-2, und besetzen den IFN-β-
Enhancer (Abb. 2) (123, 167, 206). Eine weitere Regulationsebene liefern die AU-reichen
Elemente (ARE) im 3'-Ende der IFN-β-mRNA, welche die Degradierung der mRNA steuern
(251, 267).
Nach dieser Einführung zum Mechanismus der IFN-β-Induktion durch das Enhanceosom befasst
sich der nächste Abschnitt dieser Einleitung mit der eigentlichen Aktivierung der einzelnen
Transkriptionsfaktoren. Da sich die Signalwege, welche durch intra- bzw. extrazelluläre dsRNA
initiiert werden (Abb. 3 bzw. 4), sehr ähnlich sind, werden sie hier in ihrer Übereinstimmung
beschrieben, bevor an späterer Stelle ihre rezeptorbedingten Unterschiede aufgezeigt werden.
11
Abb. 3: IFN-β-Induktion durch intrazelluläre dsRNA (RIG-I-Signaling). Die intrazellulärendsRNA-Rezeptoren RIG-I und MDA-5 vermitteln über ihren Adapter MAVS/IPS-1/VISA/CARDIFdie Aktivierung der Signalwege zu IRF-3, NF-κB und ATF-2/c-JUN, resultierend im Aufbau einesEnhanceosoms und der Initiation der Transkription. Weitere Erläuterungen siehe Text. DasEnhanceosom und die Repressoren des Enhancers sind bereits durch Abb. 1 beschrieben.
12
Abb. 4: IFN-β-Induktion durch extrazelluläre dsRNA (TLR3-Signaling). Extrazelluläre dsRNA bindet an den TLR3 und vermittelt über dessen Adapter TRIF die Aktivierung der Signalwege zu IRF-3, NF-κB und ATF-2/c-JUN. Über die Ausbildung eines Enhanceosoms wird die Transkription initiiert. WeitereErläuterungen siehe Text.
13
Die beiden zur AP-1-Gruppe gehörenden Transkriptionsfaktoren c-JUN und ATF-2 können über
verschiedene mitogen-aktivierte Proteinkinase (MAPK)-Kaskaden aktiviert werden, abhängig
vom entsprechenden Stimulus, wie Wachstumsfaktoren, inflammatorischen Cytokinen, DNA-
Schäden oder zellulärem Stress (160, 247, 370). Der Signalweg ist dabei stets eine hierarchische
Kaskade von MAPKs, die im Falle der Stimulation durch dsRNA (also in erster Linie durch
Virusinfektion) mit der TAK1 (Transforming growth factor-β-activated kinase 1) im Komplex
mit ihren Bindeproteinen TAB1 und TAB2 beginnt (Abb. 3 & 4, gelbe Proteine) (150, 375); die
aktivierte TAK1 übernimmt zunächst die Phosphorylierung der downstream-Kinasen MKK3 und
6 bzw. MKK4 und 7, welche ihrerseits p38 bzw. JNK (c-JUN N-terminal kinase) aktivieren
(150, 277, 286, 288, 359, 375). Die Letztgenannten phosphorylieren im letzten Schritt ATF-2
bzw. c-JUN im Zellkern und induzieren auf diese Weise deren Heterodimerisierung und die
Bindung an u.a. die PRDIV des IFN-β-Enhancers (81, 88, 250, 288).
Die TAK1 besitzt höchstwahrscheinlich noch eine weitere Rolle im dsRNA-Signaling, nämlich
bei der Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-κB (150, 359). Dessen Name leitet sich von
seiner erstmaligen Entdeckung in Kernextrakten von B-Zellen ab, sowie der Annahme seiner
essentiellen Beteiligung an der Expression von leichten Immunglobulin-Ketten des κ-Typs
(300). Die NF-κB/Rel-Proteinfamilie besteht aus p65/RelA, RelB, c-Rel, p50 und p52, wobei der
Faktor stets als Homo- oder Heterodimer auftritt. Das prototypische Dimer besteht aus p65 und
p50 und ist in dieser Form auch an der IFN-β-Induktion beteiligt (199, 340). NF-κB besitzt eine
ausgesprochen pleiotrope Wirkung, indem er an der Induktion zahlloser inflammatorischer Gene
maßgeblich beteiligt ist, wie Cytokinen und Chemokinen, Immunrezeptoren,
Akutphaseproteinen, Oberflächenrezeptoren, Wachstumsfaktoren, Transkriptionsfaktoren und
verschiedenen Enzymen (249, 397). Zudem hat NF-κB bedeutenden Anteil an der Kontrolle der
Apoptose-Induktion; so reguliert er die Expression sowohl anti-apoptotischer Gene der cIAP-
und Bcl-2-Familien und c-FLIP, als auch pro-apoptotischer Gene wie Fas-Ligand, TRAIL, deren
Rezeptoren und p53 (19, 44, 52, 180, 360). So vielfältig wie seine Wirkungen ist auch die Liste
seiner Aktivatoren, darunter Bakterien und Viren, Cytokine, verschiedener zellulärer und
physiologischer Stress, verschiedene Drogen und Chemikalien, Wachstumsfaktoren und
Hormone (249).
NF-κB liegt im inaktiven Zustand im Cytoplasma vor, wo er durch seinen Inhibitor IκB über
nichtkovalente Assoziation festgehalten wird, da dieser das basische Nuclear localization signal
(NLS) von NF-κB maskiert. Für die Aktivierung von NF-κB ist folglich die Dissoziation des
IκB vonnöten; diese wird durch den IκB-Kinase (IKK)-Komplex vermittelt, welcher z.B. IκBα
14
an den Serinresten 32 und 36 phosphoryliert und so dessen Ubiquitinylierung und proteosomale
Degradation einleitet (Abb. 3) (45, 73, 290). Der IKK-Komplex besteht hierbei wenigstens aus
den katalytischen Untereinheiten IKKα und IKKβ, mindestens zwei Molekülen IKKγ (= NEMO)
und dem assoziierten Gerüstprotein IKAP (56, 391). Der freigesetzte NF-κB wird vor seiner
nucleären Translokation zusätzlich an seiner p65-Untereinheit phosphoryliert, dies kann z.B.
durch IKKβ, die Proteinkinase A oder die im nachfolgenden Abschnitt beschriebenen Kinasen
TBK1 und IKKε, welche im übrigen auch IκB phosphorylieren können, vollzogen werden (38,
199, 276, 293, 309, 396). Erst auf diese Weise entfaltet sich die volle Transaktivität des NF-κB,
indem beispielsweise die Interaktion mit dem Coaktivator p300/CBP stabilisiert wird (395). Der
soeben beschriebene Aktivierungsweg wird als der "klassische" oder "kanonische" Weg
bezeichnet; ein alternativer, IκB-unabhängiger Weg betrifft Kompositionen aus p52, welches als
p100-Precursor vorliegt und durch Prozessierung zu p52 aktiviert wird (269, 378). Im Falle der
Induktion durch dsRNA kommt jedoch lediglich der klassische Weg zum Einsatz, und
interessanterweise wird der IKK-Komplex offenbar sowohl durch intra- wie auch durch
extrazelluläre dsRNA über die erwähnte TAK1 aktiviert (Abb. 3 und 4). Es bleibt festzuhalten,
dass der aktivierte NF-κB über die Bindung an die PRDII an der Induktion des IFN-β beteiligt
ist (85, 194). Im nächsten Abschnitt soll der für die IFN-β-Induktion und damit für die
vorliegende Arbeit so entscheidende Transkriptionsfaktor IRF-3 ausführlich vorgestellt werden.
1.2.1. Transkriptionsfaktor IRF-3
Die initiale Induktion von IFN-β erfordert neben NF-κB und ATF-2/c-JUN in ihrer Rolle als
synergistische Verstärker vor allem den Transkriptionsfaktor IRF-3 (Interferon regulatory
factor 3), ein Mitglied der IRF-Familie aus bislang neun humanen Vertretern, die eine
aminoterminale DNA-Bindedomäne und eine carboxyterminale Transaktivierungsdomäne
besitzen und an der Genexpression von Zellen des unspezifischen wie auch des spezifischen
Immunsystems beteiligt sind (213, 331). Seit Beginn der Klärung des Aufbaus und der
Bindeproteine des IFN-β-Enhancers Anfang der 1980er Jahre mit Identifikation der PRDI und
der NRDI bis zum Nachweis der Rolle der PRDIV (10 Jahre später) war nur IRF-1 als PRDIII-I-
Induktor bekannt (81, 103, 110, 111, 188, 194, 243, 266, 338, 339, 398). Es zeigte sich jedoch in
IRF-1-knock out-Modellen, dass IRF-1 nicht für die IFN-β-Induktion benötigt wird, und zudem
ist IRF-1 weitgehend von vorangehender Induktion durch vor allem IFN-γ abhängig, woraufhin
er nach Expression konstitutiv aktiv ist (213, 270, 274, 332). Die kurze Zeit später gelungene
15
Identifikation von IRF-3 (15) und seine Eigenschaft als konstitutiv exprimierter,
virusaktivierbarer Faktor, der sogar allein zur IFN-β-Induktion befähigt und laut Ergebnissen aus
IRF-3-knock out-Systemen für die IFN-β-Induktion auch essentiell notwendig ist, erlaubte ab
1998 die eingehende Untersuchung der Signalwege zur Induktion des IFN-β und der
Charakterisierung der IRF-3-Aktivierung (203, 204, 285, 289, 365, 387).
Die Domänenstruktur des IRF-3-Proteins (Abb. 5) gibt bereits einigen Aufschluss über die
resultierende Funktionsweise als Transkriptionsfaktor. IRF-3 ist ein 427 Aminosäuren
umfassendes, etwa 55 kDa großes Protein, welches konstitutiv in allen Zelltypen exprimiert wird
und inaktiv als Monomer im Cytoplasma vorliegt (15, 203, 204). Es findet ein kontinuierliches
Shuttling zwischen Cytoplasma und Nucleus statt, das Gleichgewicht liegt dabei aber, vermittelt
durch das Nuclear export signal (NES), klar auf cytoplasmatischer Seite (182).
Abb. 5: Domänenstruktur von IRF-3. Das Protein besitzt eine DNA-Bindedomäne (DBD), einNuclear localization signal (NLS) und ein Nuclear export signal (NES); die IRF associationdomain (IAD) vermittelt die Dimerisierung nach Aktivierung; die Regulatorische Domäne (RD)interagiert mit der Prolinreichen Region, bis zwei Cluster von Serin-/Theroninresten in der RDdurch die Kinasen TBK1/IKKε phosphoryliert werden, was in der Aktivierung von IRF-3resultiert. Weitere Erläuterungen siehe Text.
Das Protein untergliedert sich in eine aminoterminale DNA-Bindedomäne, gefolgt vom Nuclear
localization signal (NLS) und dem NES. Der Carboxyterminus besteht im Wesentlichen aus der
IRF association domain (IAD), welche die IRF-3-Homo- und Heterodimerisierung (mit IRF-7)
ermöglicht, und der Regulatorischen Domäne (RD) (204, 301, 303). Untersuchungen mit
Deletionsmutanten von IRF-3 und röntgenkristallographische Analysen der 3D-Struktur des
Proteins offenbarten, dass die Regulatorische Domäne im inaktiven Zustand mit der
16
Prolinreichen Domäne interagiert, somit die IAD einschließt und IRF-3 in inaktiver
Konformation bewahrt, wodurch möglicherweise auch die Funktion des NLS beeinträchtigt wird
(204, 263, 304, 329). IRF-3 liegt im inaktiven Status sowohl unphosphoryliert als auch
aminoterminal, im Bereich der Aminosäuren 186-198, phosphoryliert vor, was nach Auftrennung
im Gel (SDS-PAGE) in zwei distinkten Banden resultiert, den sogenannten Formen I und II. Die
Bedeutung dieser aminoterminalen Phosphorylierung und die Identität der modifizierten
Aminosäurereste sind nicht bekannt, es gibt jedoch Hinweise auf eine Beteiligung von MAP-
Kinasen (MAPK) wie MEKK1 (303). Die cytoplasmatische Aktivierung von IRF-3 in Reaktion
auf die Detektion von dsRNA geschieht durch Phosphorylierung bestimmter Serin-/Threonin-
reste in der Regulatorischen Domäne (Abb. 5). Diese Reste sind in zwei Clustern angeordnet, der
erste bestehend aus Serin 385 und 386 (S385/S386), der zweite bestehend aus S396/S398 und
S402/T404/S405 (204, 324). Die Reihenfolge und die Funktion der einzelnen
Phosphorylierungen sind nicht bekannt, vielmehr wurden sowohl Serin 386 als auch Serin 396
als die minimal benötigten oder entscheidenden Phosphorylierungsstellen postuliert (230, 302).
Die erwähnten 3D-Strukturanalysen zeigten, dass S385/S386 besonders zugänglich sind,
während die übrigen Reste womöglich erst durch konformatorische Änderungen nach der
Modifikation der ersteren beiden zugänglich werden. Die zusätzlichen Phosphatgruppen führen
bei Proteinauftrennung im Gel zu einer weiteren Retention, welche im Auftreten von bis zu zwei
weiteren Formen, nämlich III und IV, resultiert (303).
Die Phosphorylierung der genannten Aminosäurereste übernehmen zwei IKK-verwandte
Kinasen, nämlich TANK-binding kinase 1 (TBK1, auch bekannt als NAK oder T2K) und IKKε
(auch bekannt als IKK-i) (96, 128, 255, 306). Beide Kinasen wurden ursprünglich aufgrund ihrer
Fähigkeit identifiziert, NF-κB aktivieren zu können (27, 257, 258, 309, 344), diese Funktion
scheint im vorliegenden System aber redundanten Charakter zu besitzen, da z.B. in TBK1-
knock out-Zellen die viral induzierte NF-κB-Aktivierung unbeeinflusst bleibt (221). Die
Expression von TBK1 ist konstitutiv und ubiquitär (344), diejenige von IKKε ist möglicherweise
zelltypabhängig und zudem induzierbar durch NF-κB (daher das Synonym IKK-i) (309) und
kann zusätzlich zu TBK1 erfolgen, wobei beide Kinasen unabhängig voneinander funktionieren,
und in Komplexen mit den Proteinen TANK (TRAF-associated NF-κB-activator, = I-TRAF) und
NAP1 vorliegen können (Abb. 3) (43, 46, 102, 240, 336). TANK kann hierbei den gebildeten,
zuweilen als VAK (Virus-activated kinase) bezeichneten, Komplex über IKKγ/NEMO mit dem
IKK-Komplex verbinden (Abb. 3) (43, 303, 306).
Die vollzogene carboxyterminale Phosphorylierung von IRF-3 führt zu konformatorischen
Veränderungen, die zunächst eine Dimerisierung mithilfe der nun freigelegten IAD ermöglichen,
17
wobei dem chaperonähnlichen Cyclophilin B eine Rolle bei beiden Prozessen zukommt (204,
244, 263, 264, 329). Die Dimerisierung wird offensichtlich von einer verbesserten
Zugänglichkeit des NLS begleitet, denn das Dimer transloziert umgehend in den Zellkern und
muss dort durch Bindung von p300/CBP festgehalten werden, um nicht ins Cytoplasma
rücktransportiert zu werden (Abb. 3) (182, 203, 264). Der so gebildete Komplex heißt DRAF1
(dsRNA-activated factor 1) und kommt durch Assoziation der IAD und der RD des IRF-3 mit der
IRF-3-binding domain (IBiD) des p300/CBP zustande (67, 182, 200, 264). Vor der Bindung an
die PRDIII-I des IFN-β-Enhancers wird IRF-3 durch p300/CBP acetyliert (325). Gemeinsam mit
NF-κB, ATF-2/c-JUN und den HMG-I(Y)-Proteinen vermittelt das konstituierte Enhanceosom
die Induktion des IFN-β (Abb. 3 und 4). Die Sekretion von IFN-β und, reguliert durch IRF-3,
auch IFN-α1 führt in auto- und parakriner Weise zur Induktion von ISGs (s.o.), unter anderem
auch IRF-7, welcher dem IRF-3 nahe verwandt ist. Wie erwähnt kommt es in dieser Situation,
die einer "späten Phase" einer Virusinfektion entspricht, zur Heterodimerisierung mit IRF-3 (16,
215, 284, 285, 381, 393). Das IRF-3/7-Heterodimer bildet im Zellkern mit p300/CBP den Virus-
activated factor (VAF) und ermöglicht die Maximalinduktion von IFN-β sowie die Induktion
weiterer IFN-α-Subtypen (53, 196, 363, 379, 381). Nach Wahrnehmung seiner transaktiven
Aufgabe wird IRF-3 proteosomal degradiert; auch IRF-7 wird proteolytisch abgebaut, es besitzt
eine ohnehin sehr viel geringere Halbwertszeit als IRF-3, welche im Bereich von einer Stunde
liegt (203, 285).
Es ist außerdem eine Transaktivierung von IRF-3 in HeLa-Zellen durch UV-Bestrahlung oder
Doxorubicin-Behandlung beschrieben worden, also durch DNA-schädigende Einflüsse (170).
Dem entgegen stehen Ergebnisse, wonach Doxorubicin, die Stress-Induktoren Sorbitol oder
Anisomycin sowie der Phorbol-Ester PMA die konstitutive aminoterminale IRF-3-
Phosphorylierung verstärken, was jedoch nicht in einer funktionellen Veränderung resultiert. Da
die aminoterminale, MAPK-vermittelte Modifikation (möglicherweise Serin 188) im Bereich der
Prolinreichen Region und damit in einer autoinhibitorischen Region liegt, wäre als Effekt eine
die Aktivierung begünstigende Konformationsänderung vorstellbar (303). Im Zusammenhang
mit UV-Strahlung ist der Befund, dass die DNA-anhängige Proteinkinase (DNA-PK), eigentlich
ein DNA-Doppelstrangbruch-Reparatur-Enzym (315), IRF-3 nach Virusinfektion oder UV-
Bestrahlung an Threonin 135 phosphorylieren kann, sehr interessant (Abb. 5). Diese
aminoterminale Phosphorylierung direkt neben dem NES hat eine Retention von IRF-3 im
Zellkern zur Folge, also eine verzögerte Degradierung (161). Eine weitere Verbindung zu MAP-
Kinasen konnte bislang aber nicht hergestellt werden; die aminoterminalen Phosphorylierungen
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bleiben also letztlich ein ungeklärtes Phänomen, da aber für eine IRF-3-Aktivierung, wie sie
durch Virusinfektion oder dsRNA induziert wird, selektiv die carboxyterminalen
Serin-/Threoninreste modifiziert werden, ist diese Tatsache für das Verständnis der Funktion des
IRF-3 in diesem Zusammenhang nicht essentiell.
Der Transkriptionsfaktor IRF-3 konnte im übrigen nicht nur mit der Induktion und Sekretion von
IFN-β in Verbindung gebracht werden, welche über den JAK-STAT-Weg die verzögerte
Induktion von ISGs einleitet; es konnte darüber hinaus eine direktere antivirale Wirkung
gefunden werden, welche auf der IRF-3-vermittelten Induktion eines Subsets von ISGs beruht.
So kann die ISRE in den Promotoren bestimmter ISGs nicht nur über ISGF3 (siehe S. 6),
sondern zusätzlich durch aktiviertes IRF-3 gebunden werden, so dass die entsprechenden Gene
exprimiert werden (15, 117). Zu diesen zählen die Chemokine IP-10 und RANTES, ISG15,
ISG54 und die bereits beschriebenen Proteine Viperin und p56 (ISG56) (80, 84, 202, 234). Auf
diese Weise können nach Detektion einer viralen Infektion bereits vor dem Einsetzen der
Interferonwirkung antivirale Maßnahmen eingeleitet werden, welche unter Umständen den
apoptotischen Zelltod herbeiführen. In diesem Zusammenhang fällt die ungewöhnlich starke
p56-Induktion auf (106, 120). Wie erwähnt ist p56 ein Translationshemmer (119), welcher
möglicherweise auch zur Apoptoseeinleitung beiträgt. In der Tat konnten IRF-3 mehrfach
proapoptotische Eigenschaften nachgewiesen werden, so bei der Apoptose-Induktion durch
Newcastle Disease-Virus (NDV), Sendai-Virus und transfizierter dsRNA (130, 348, 364). Dieser
Effekt wird möglicherweise durch die IRF-3-vermittelte Transaktivierung der p56-, TRAIL
(Tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand)- und Arginase II-Gene gefördert
(116, 174). Die Arginase II ist Bestandteil des Polyamin-Syntheseweges, und natürliche
Polyamine wie Spermin oder Spermidin haben offenbar auch proapoptotische Wirkung (116).
Letztlich mag sogar eine Verbindung zur mitochondrial vermittelten Apoptose bestehen, die
durch Permeabilisierung der Mitochondrienmembran durch Bcl-2-Familie-Proteine wie Bax,
Bak und Noxa zur Freisetzung von Cytochrom c und damit der Assemblierung des aktiven
Caspase 9-Komplexes führt, welcher über die proteolytische Spaltung seiner Targets Apoptose
einleitet (212, 327). Die sehr wahrscheinliche Verbindung zu IRF-3 liegt hierbei in der
Induzierbarkeit von Noxa durch dsRNA, Virusinfektion oder Interferon (327).
Es ist offensichtlich geworden, dass IRF-3 eine entscheidende Rolle bei der Initiation der
Interferonexpression und der Reaktion der Zelle auf eine virale Infektion zukommt, und dass das
Interferon selbst mit seiner Wirkung eine zentrale, erste antivirale Verteidigungslinie darstellt.
19
Nun bleibt nur noch zu klären, wie Zellen einer viralen Infektion gewahr werden können,
genauer gesagt, wie sie das so oft erwähnte Signalmolekül dsRNA detektieren können, um
daraufhin die bereits geschilderten Signalwege zu IRF-3, NF-κB und ATF-2/c-JUN mit dem Ziel
der IFN-β-Induktion zu aktivieren.
1.3. Detektion des Signalmoleküls dsRNA
Die virale Infektion eines Organismus zeichnet sich zunächst durch die Präsenz viraler
Nucleinsäure aus, also z.B. dem RNA- oder DNA-Genom. Kommt es zur Replikation des Virus,
so entsteht besonders bei RNA-Viren ein doppelsträngiges RNA-Intermediat, welches als
Signalmolekül für die Induktion von Interferon fungiert. Doppelsträngige RNA tritt aber auch als
virales Genom (Reovirus) und als Sekundärstruktur viraler Genome (IRES) oder zellulärer
mRNA in Erscheinung, wird bei nekrotischem Zelltod freigesetzt, ist in Helminthen-Eiern und
MS2-Bacteriophagen-infizierten E. coli-Bakterien enthalten und wird für die künstliche RNA-
Interferenz als siRNA eingesetzt, stets mit dem Potential einer Interferon-Induktion (4, 35, 94,
157, 159, 169, 313, 326). Schon seit Ende der 1960er Jahre weiß man, dass dsRNA aus
Penicillium-Extrakten und künstliche dsRNA (poly(IC) = poly-Inosinsäure:poly-Cytidylsäure)
als IFN-Induktor wirken, ohne die zugrunde liegenden Mechanismen gekannt zu haben (95,
187). Später wurde mithilfe von Extrakten interferonbehandelter Zellen, die mit poly(IC) versetzt
worden waren, eine 68 kDa-Proteinkinase identifiziert, die die Fähigkeit besaß, eIF2α zu
phosphorylieren und so die Translation zu inhibieren (367). Gemäß ihrer Eigenschaften wurde
sie unter anderem als DAI (dsRNA-activated inhibitor) bezeichnet (177). Rückblickend ist
offensichtlich, dass es sich um die oben beschriebene PKR handelt, ein antivirales ISG-Produkt,
welches durch IFN-Behandlung ("Priming") hochreguliert und durch Bindung von dsRNA
mittels klassischen dsRNA-Bindemotivs aktiviert wurde (368). Somit war der erste und für lange
Zeit einzige intrazelluläre dsRNA-Sensor gefunden worden. Die mehr oder minder spezifische
Hemmung sowohl der PKR als auch der IFN-β-Induktion durch 2-Aminopurin führte zur
Untersuchung möglicher Gemeinsamkeiten, wie der bereits gut dokumentierten NF-κB-
Aktivierung, und tatsächlich ließ sich eine PKR-abhängige IκB-Phosphorylierung zeigen (181,
390, 399). PKR-knock out-Mausfibroblasten zeigten zudem eine attenuierte IFN-Induktion nach
dsRNA-Behandlung, nicht aber nach Virusinfektion (380). Inzwischen wird der PKR keine
essentielle Rolle bei der NF-κB-Aktivierung und IFN-Induktion in Reaktion auf dsRNA mehr
beigemessen, da beide Vorgänge auch in ihrer Abwesenheit stattfinden (138), doch ihre
20
Beteiligung steht außer Frage (Abb. 3): Die PKR kann physisch mit dem IKK-Komplex
interagieren und so eine NF-κB-Aktivierung herbeiführen, obschon ihre katalytische Aktivität
dabei eventuell nicht notwendig ist (28, 108, 142). Die Interaktion wird dabei über TRAF-
Proteine (Tumor necrosis factor receptor-associated factor) vermittelt, einer Familie von sechs
Proteinen, die in zahlreichen Signalwegen an der NF-κB-Aktivierung und Apoptose-Induktion
teilhaben (11, 107). TRAF6 kann als Ubiquitin-Ligase Polyubiquitin-Ketten auf andere Proteine
wie den IKK-Komplex oder TAK1 übertragen, um sie zu aktivieren, was eine sehr interessante
weitere Funktion des Ubiquitins darstellt (71, 308, 359, 371). Weiterhin ist die PKR in die
ATF-2-Aktivierung involviert, indem sie die MAP-Kinase MKK6 phosphoryliert (Abb. 3) (310),
allerdings konnte keine Notwendigkeit bei der Aktivierung von IRF-3 und IRF-7 festgestellt
werden (314), so dass die PKR insgesamt als Regulator des pro-/antiapoptotischen
Gleichgewichts nach Detektion von dsRNA einzustufen ist, da sie einerseits die Translation
hemmen und Apoptose induzieren kann und andererseits bei der NF-κB-Aktivierung mitwirkt.
Erst im Jahre 2004 gelang die Identifizierung zweier nahe verwandter intrazellulärer dsRNA-
Rezeptoren aus der Familie der nach ihrem charakteristischen Sequenzmotiv benannten
DExD/H-Box RNA-Helicasen (9, 311, 328, 386). Beide können dsRNA über ihre
carboxyterminale Helicase-Domäne binden und daraufhin mittels aminoterminaler CARD-
Domäne (Caspase recruitment domain) die Signaltransduktion zur Aktivierung von IRF-3,
NF-κB und ATF-2/c-JUN einleiten (305, 385, 386). Außerdem werden beide Helicasen in allen
getesteten Geweben exprimiert und sind durch Interferon hochregulierbar, was eine erhöhte
Sensitivität der Zelle gegenüber dsRNA bedeutet und damit indirekt dem antiviralen Status
zuträglich ist (61, 135, 154, 386). Die erste und im Zusammenhang mit viralen Infektionen
offenbar dominante heißt RIG-I (Retinoic acid-inducible gene I, = RHIV-1) und wurde anhand
ihrer Fähigkeit, die IFN-β-Induktion nach poly(IC)-Transfektion zu steigern, identifiziert (386,
394). Genetische knock out-Studien und siRNA-medierte knock down-Experimente haben klar
die essentielle Rolle von RIG-I bei der IRF-3-Aktivierung und IFN-β-Induktion durch
Virusinfektion oder intrazelluläre dsRNA verdeutlicht, so dass sich RIG-I mittlerweile als der
zentrale intrazelluläre dsRNA-Rezeptor darstellt (Abb. 3) (162, 197, 223, 326, 385, 386). Die
zweite CARD-Helicase wurde, ebenfalls bereits in anderem Kontext, als MDA-5 (Melanoma
differentiation-associated gene 5, = HELICARD, RH116) beschrieben, womöglich besitzt sie
eine Redundanzfunktion zu RIG-I (9, 55, 154, 178, 385).
Es folgte die Suche nach einem Adapterprotein, welches die CARD-vermittelte Weiterleitung
des Signals würde übernehmen können. Erst nach Ende der praktischen Arbeiten für die
21
vorliegende Dissertation wurde innerhalb eines Monats in vier verschiedenen Labors unabhängig
voneinander das Multiadapterprotein MAVS (Mitochondrial antiviral signaling) identifiziert und
beschrieben, das bis dahin nur als uncharakterisierter NF-κB-Aktivator gelistet war
("KIAA1271") (217, 305). Die weiteren Bezeichnungen lauten demnach IPS-1 (IFN-β promoter
stimulator 1) (165), VISA (Virus-induced signaling adaptor) (375) und CARDIF (CARD
adaptor inducing IFN-β) (226), wobei an dieser Stelle der Einfachheit halber die
Erstbezeichnung MAVS verwendet werden wird. Sein Name verrät schon, dass es neben seiner
aminoterminalen CARD-Domäne eine carboxyterminale Transmembran-Domäne besitzt, die es
in der äußeren Mitochondrienmembran verankert (Abb. 3) (305). MAVS kann auf diese Weise
als Adapter dienen, indem es nach Bindung von dsRNA an RIG-I (und MDA-5) diese mithilfe
einer direkten CARD-CARD-Assoziation bindet und anschließend durch direkte oder indirekte
Bindung weiterer Proteine die Induktion von u.a. IFN-β vermittelt (165, 226, 305, 375).
Zusammen mit TRAF2 und TRAF6 kommt es zur Rekrutierung des TAK1-Komplexes (375),
welcher, wie oben beschrieben, sowohl die MAP-Kinase-Kaskade zu ATF-2/c-JUN initiiert, als
auch den ebenfalls durch MAVS gebundenen IKK-Komplex aktivieren kann, was
wahrscheinlich durch direkte Phosphorylierung und TRAF6-vermittelte Ubiquitinylierung
geschieht. Die Notwendigkeit der Präsenz von RIP1 und dem Adapter FADD bei dieser NF-κB-
Aktiverung ist noch nicht geklärt (Abb. 3) (165), es sei aber unabhängig davon auf die
beeindruckende Größe des offenbar gebildeten Superkomplexes aus RIG-I, MAVS, TRAFs,
RIP1/FADD, TAK1/TABs und IKK-Komplex hingewiesen. Auch der entscheidende Schritt, die
RIG-I-vermittelte IRF-3-Aktivierung, wird durch MAVS ermöglicht. MAVS kann die IRF-
Kinasen TBK1 und IKKε rekrutieren, mit der Folge einer Komplexierung mit IRF-3 und
gegebenenfalls IRF-7 (226, 375). Endlich konnte also der intrazelluläre Signalweg von der
Detektion der dsRNA durch RIG-I/MDA-5 und PKR bis zur Aktivierung der benötigten
Transkriptionsfaktoren und der Bildung des IFN-β-Enhanceosoms aufgeklärt werden.
Die Situation wäre jedoch nicht vollständig beschrieben, wenn man nicht das Phänomen der
Stimulation einer IFN-β-Induktion durch extrazelluläre dsRNA mit einbeziehen würde. Seit
Nutzung des poly(IC) für die Stimulation der Interferon-Expression war auffällig geworden, dass
manche Zelltypen, wenn überhaupt, nur nach vorangegangenem IFN-Priming auf extrazelluläres
poly(IC) reagieren konnten und dass Fibroblasten besonders gut reagierten (173, 236, 323).
Dagegen konnte mittels Liposomen transfiziertes poly(IC) auch priming-unabhängig Interferon
induzieren (228). Der Unterschied liegt aus jetziger Sicht auf der Hand: Intrazelluläres poly(IC)
kann RIG-I-vermittelt wirken, während die extrazelluläre Stimulation offenbar einen IFN-
22
induzierbaren Oberflächen-Rezeptor benötigt, der womöglich auf Fibroblasten konstitutiv
exprimiert wird.
Eine entsprechende Entdeckung gelang 2001 mit der Beschreibung des humanen Toll-like
receptor 3 (TLR3) (6, 219). Seine Benennung leitet sich von seiner Verwandtschaft mit dem
Toll-Protein der Taufliege Drosophila melanogaster ab, einem Transmembran-
Oberflächenrezeptor, dessen Signaling u.a. antifungale Wirkung hat und dessen Name in der Tat
vom deutschen Wort "toll" herrührt (8, 189, 190). Die Familie der in allen Wirbeltieren
vorkommenden TLRs umfasst beim Menschen 10 identifizierte Mitglieder (TLR1 bis TLR10),
welche sich durch eine glykosylierte, extrazelluläre liganden-bindende Domäne auszeichnen, die
durch zahlreiche Leucin-reiche Repeats (LRR) charakterisiert ist, sowie eine Transmembran-
Domäne und eine cytoplasmatische Toll/IL-1-receptor (TIR)-Domäne, welche nahe mit der
entsprechenden Region des Interleukin 1-Rezeptors verwandt ist (Abb. 4) (3). Die
unterschiedlichen TLRs erkennen verschiedene bakterielle, virale und parasitäre Proteine,
Nucleinsäuren und Lipide (Pathogen-associated molecular patterns, PAMP) und können durch
ihre Dimerisierung intrazelluläre Signalwege initiieren, die wenigstens die Aktivierung von
NF-κB zum Ziel haben (3). Virale Nucleinsäuren werden dabei von TLR3 (dsRNA), sowie im
Falle spezialisierter Zellen wie Dendritischen Zellen durch TLR7/TLR8 (ssRNA) sowie TLR9
(dsDNA) erkannt, mit der Folge einer Interferon-Induktion. Unter den genannten ist jedoch nur
TLR3 in der Lage, auch TBK1/IKKε und somit IRF-3 zu aktivieren (s.u.) (26).
Der TLR3 wird von zahlreichen Zelltypen aller untersuchten Gewebe exprimiert, wie z.B.
Fibroblasten, Epithelzellen, Keratinocyten, Neuronen, Astrocyten und Gliazellen, myeloiden
DCs, Macrophagen und NK-Zellen (40, 90, 118, 129, 146, 152, 237, 260, 312, 342, 343, 347,
357). Als Beispiele für Zell-Linien seien HeLa-Zellen und MRC-5-Fibroblasten genannt (219,
333). Viele Zelltypen beherbergen den TLR3 größtenteils oder gänzlich in undefinierten
intrazellulären Vesikeln, wobei die cytoplasmatische "linker-Region" in direkter Nachbarschaft
der Transmembrandomäne für diese Lokalisation verantwortlich ist (104, 218, 238, 239, 260,
297). Eine Überexpression des TLR3 in humanen Nierenepithelzellen (HEK293) führt
interessanterweise zur intrazellulären Akkumulation mit partieller Exposition des TLR3 an der
Zelloberfläche, was diese Zellen erst für extrazelluläre dsRNA sensitiviert (104). Eine ähnliche
Situation wird vielleicht durch IFN-Priming geschaffen, denn der TLR3 ist interferon-
induzierbar (127, 227).
Der durch extrazelluläre oder in Vesikeln befindliche dsRNA aktivierte Signalweg gestaltet sich
nun folgendermaßen (Abb. 4): Die Bindung an die leucinreiche, hufeisenförmige extrazelluläre
Domäne des TLR3 induziert dessen Di- oder Oligomerisierung (23, 49, 68). Für die
23
Signaltransduktion ist eine lysosomal vermittelte Ansäuerung des Kompartiments erforderlich
(68), der TLR3 sollte also spätestens jetzt vesikulär lokalisiert sein, womöglich findet ohnehin
ein ständiges Trafficking zwischen Oberfläche und Vesikeln statt. Nach Tyrosin-
Phosphorylierung seiner TIR-Domäne (281, 282) kommt es mithilfe des essentiellen
Adapterproteins TRIF (TIR-domain containing adaptor inducing IFN-β, = TICAM-1, Lps2)
(131, 248, 376, 377) zur RIP1- und TRAF6-vermittelten Rekrutierung des TAK1/TAB-
Komplexes, welcher nach Aktivierung dissoziiert, wie bereits oben beschrieben den IKK-
Komplex aktiviert und, auch in Anwesenheit der PKR, welche hier möglicherweise indirekt
aktiviert werden kann, die MAP-Kinase-Kaskaden initiiert, um so zum einen NF-κB, zum
anderen ATF-2/c-JUN zu transaktivieren (Abb. 4) (122, 149, 150, 225, 248, 287). TRIF hat also
offensichtlich eine dem MAVS recht ähnliche Adapterfunktion, die sich in der RIP1- und
TRAF6-unabhängigen Rekrutierung der Kinase TBK1 (und IKKε) und der anschließenden
Komplexierung mit IRF-3 oder IRF-7 fortsetzt, gefolgt von der Induktion von IFN-β und ISGs
(63, 122, 149, 287). Das Gerüstprotein NAP1 (NAK-associated protein 1) ist hierbei von
Wichtigkeit, im Gegensatz zu TANK (Abb. 3), welches nicht im TRIF-Komplex gefunden
werden kann (102, 283). Ein auch für andere TLRs beschriebener Interaktionspartner ist die
PI3K (Phosphatidylinositol-3-kinase) (10, 58). Ihre Aktivierung nach Bindung der
Phosphotyrosinreste der TLR3-TIR-Domäne resultiert in der über Second messenger wie z.B.
PIP3 vermittelten AKT/Proteinkinase B-Aktivierung (Abb. 4). Dieser Signalweg hat hier dann
die bislang einzigartige Funktion, zur IRF-3-Transaktivierung beizutragen; wird die PI3K
pharmakologisch gehemmt, kann IRF-3 nach Dimerisierung und Translokation nicht mehr mit
p300/CBP assoziieren und folglich kaum noch transaktiv wirken (281). Nähere Details hierzu
sind noch nicht bekannt.
Wie eingangs erwähnt kann es durch dsRNA neben der Interferon-Induktion auch zur Einleitung
der Apoptose kommen (137, 322). Dies wurde zum einen für den TLR3/TRIF-Weg beschrieben,
wobei TRIF über RIP1 und FADD die proapoptotische Caspase 8 aktivieren kann (Abb. 4) (122,
392); zum anderen wird durch intrazelluläre dsRNA die PKR aktiviert (siehe S. 6), und
möglicherweise wird der FADD/Caspase 8-Weg auch über MAVS vermittelt (Abb. 3): Der
Helicase MDA-5 konnte nämlich eine gewisse proapoptotische Wirkung nachgewiesen werden
(153, 178), und außerdem sind FADD und RIP1 auch in den intrazellulären dsRNA-Signalweg
involviert (17, 165). Sollte es infolge der Detektion von dsRNA nicht zur Apoptose gekommen
sein, müssen die betroffenen Signalwege abgeschaltet werden. Dies geschieht nicht nur auf
Ebene des Enhanceosoms (Abb. 2), sondern auch durch Hochregulation von cytoplasmatischen
24
Repressoren wie PIASy, welcher IRF-3/7 und TRIF (und STAT1) bindet (392), oder dem
NF-κB-induzierten A20, welches TRIF und TBK1/IKKε bindet und inhibiert und außerdem
TRAF6 desubiquitinyliert; somit terminiert A20 sowohl TLR3- als auch virusinduzierte
Signalwege zur NF-κB- und IRF-3-Aktivierung (29, 275, 362). Die Folge dieser Interaktionen
mag der Zerfall der Signaling-Komplexe sein. Die autokrine Interferonwirkung bewirkt zudem
die Induktion von LGP2, einer RIG-I/MDA-5-verwandten Helicase, welche keine CARD-
Domäne besitzt und somit intrazelluläre dsRNA maskiert und entwindet (62, 273, 385).
Insgesamt können Zellen auf diese Weise effizient die IFN-Expression terminieren (Abb. 3 & 4,
graue Proteine).
Nach dieser ausführlichen Schilderung der durch Detektion intra- und extrazellulärer dsRNA
ausgelösten Signalwege wird im direkten Vergleich (Abb. 3 & 4) die große Übereinstimmung
der drei Hauptwege zu IRF-3, NF-κB und ATF-2/c-JUN deutlich, und dass der entscheidende
Unterschied im Rezeptor/Adapter-Komplex liegt, also RIG-I/MAVS bzw. TLR3/TRIF. Dennoch
ist die Unabhängigkeit beider Signalwege voneinander mehrfach belegt worden (34, 99, 162,
197). Die vorliegende Dissertation hatte natürlich die Untersuchung der Interaktion des
Hepatitis A-Virus mit den erläuterten Signalwegen zur IFN-β-Induktion, speziell der IRF-3-
Aktivierung, zum Ziel, daher ist der folgende Abschnitt eben jenem Objekt des eigentlichen
Interesses gewidmet.
1.4. Hepatitis A-Virus
Seit Jahrhunderten ist die Gelbsucht mit Fieber als Krankheit bekannt, doch gibt es erst seit
Anfang des 20. Jahrhunderts detailliertere Aufzeichnungen über Verlauf und Epidemiologie
dieser entzündlichen Lebererkrankung sowie die Vermutung eines viralen Ursprungs (54, 220).
Erschwerend kamen zahllose Benennungen wie Feldzugs-Gelbsucht (Campaign jaundice),
Akute gelbe Atrophie der Leber oder Infektiöse Hepatitis hinzu, außerdem die Beobachtung
einer ähnlichen Krankheit, der "Serum-Hepatitis". 1947 prägte MacCallum die Begriffe
"Hepatitis A" für die ersteren, und "Hepatitis B" für die letztere, welche bis heute Gültigkeit
besitzen (210). Mittlerweile kennt man weitere virale Hepatitiden wie Hepatitis C, D und E.
Die virale Typ A-Hepatitis, hervorgerufen durch fäkal-orale Infektion mit dem Hepatitis A-Virus
(HAV, s.u.), ist eine akute Leberentzündung, die keinen chronischen Verlauf nimmt und in der
Regel ausheilt, wobei relapsierende und fulminante Verläufe auftreten, letztere insbesondere bei
25
über 50-jährigen Patienten (64, 192). Vor allem während der etwa einmonatigen Inkubationszeit
kommt es zur Ausscheidung des Virus über die Faeces, außerdem ist in dieser Phase die
Viruslast im Blut besonders hoch (Virämie), wobei auch viele Monate nach Icterus häufig noch
große Mengen HAV-Genoms im Serum nachweisbar sind (241, 319). Mit Auftreten der
Symptome wie Appetitlosigkeit, Fieber, Erschöpfung, Übelkeit und Erbrechen können im Serum
HAV-spezifische Antikörper der Klassen IgM (Immunglobulin M), IgA und IgG nachgewiesen
werden, dabei konnte weltweit bislang nur ein Serotyp gefunden worden, obschon sich die
zahllosen HAV-Stämme, wie HM175, MS-1 oder GBM, in sieben Genotypen unterteilen lassen
(191, 319). Bald darauf kommt es im Zuge der Leberentzündung zur Freisetzung von
Leberenzymen (ALT, AST) und der Akkumulation von freiem Bilirubin im Serum, mit der
Folge eines Icterus (Gelbsucht), welcher auf der Ablagerung des Bilirubins in der Haut und der
Bindehaut des Auges beruht. Nach wenigen Wochen erfolgt die Konvaleszenz (192, 319). Die
Leberentzündung als solche ist im übrigen keine Folge der Virusinfektion selbst, sondern wird
durch CD8-positive cytotoxische T-Lymphocyten (CTL) hervorgerufen, welche infizierte Zellen
zerstören und nekrotische Gewebeveränderungen in der Leber bewirken (98, 141, 351, 354).
Das Hepatitis A-Virus weist in vivo einen starken Hepatotropismus auf, und die Leber ist sehr
wahrscheinlich auch der einzige Replikationsort für das Virus. Dies steht nicht in Einklang mit
seiner Fähigkeit, auch humane Lungenfibroblastenkulturen und ihre Derivate (z.B. MRC-5),
sowie Primaten-Nierenzellen (FRhK-4, BS-C-1, Vero) und Zellen von Meerschweinchen,
Delphin oder Schwein produktiv zu infizieren (69, 78, 97). Der zelluläre Rezeptor des Hepatitis
A-Virus ist noch nicht identifiziert, lediglich ein Binderezeptor namens HAVcr-1 (= TIM-1)
wurde gefunden (13, 91, 155). Der Befund, dass HAV-IgA-Komplexe mittels pIgR (Polymeric
immunoglobulin receptor) von Epithelzellen transcytiert werden können, um so möglicherweise
vom Darmlumen in die Blutbahn zu gelangen (77), und dass jene Komplexe über den ASGPR
(Asialoglycoprotein receptor) Leberzellen infizieren können (79), eröffnete eine erste
Erklärungsmöglichkeit für den Hepatotropismus des Virus, mindestens in Bezug auf die
Reinfektion der Leber in relapsierenden Verlaufsformen.
Das Hepatitis A-Virus zählt zur Familie Picornaviridae, Genus Hepatovirus (59). Seit seiner
erstmaligen Identifikation per Elektronenmikroskop im Jahre 1973 war der Weg für weitere
Forschung geebnet (92). 1979 konnten erfolgreiche Infektionen von Zellkulturen berichtet
werden (101, 262), seit 1980 werden hierfür zudem fetale Rhesusaffen-Nierenzellen (FRhK-4)
genutzt, für welche erstmalig die Freisetzung von Nachkommenviren in den Überstand
beschrieben werden konnte (97). Drei Jahre später war das HAV-Genom denn auch kloniert und
26
charakterisiert worden (341). Das Hepatitis A-Virus besitzt ein einzelsträngiges RNA-Genom in
Positivorientierung, welches von einem nicht umhüllten ikosaedrischen Capsid von 27 nm
Durchmesser umschlossen wird (92, 191, 341). Das Genom hat eine Länge von 7,5 kb (Abb. 6)
(341).
Abb. 6: Genomorganisation und Proteine des Hepatitis A-Virus. Das ssRNA-Genom (oben) untergliedert sich in die 5'-NTR mit IRES (Internal ribosome entry site), den Open reading frame(ORF), die 3'-NTR und den poly-A-Tail. Das 5'-Ende ist kovalent mit dem viralen VPg verbunden. Das direkt translatierte Polyprotein (unten) wird durch die virale 3C-Protease in einzelne Proteine gespalten, die entsprechenden Funktionen sind in grauer Schrift angegeben. WeitereInformationen siehe Text.
Das 5'-Ende ist kovalent mit dem VPg (Virus protein genome-associated) verbunden; die
5'-Nicht-translatierte Region (NTR) enthält eine komplexe Sekundärstruktur, die Internal
ribosome entry site (IRES) (109), welche die cap-unabhängige Translationsinitiation vermittelt
und dem positive sense-Genom somit den Charakter einer mRNA verleiht. Das 3'-Ende
beinhaltet sowohl eine weitere NTR mit einfacher Sekundärstruktur und einen poly-A-Tail
(345).
Das Genom enthält des weiteren einen einzigen Open reading frame (ORF), der für ein 251 kDa-
Polyprotein von etwa 2225 Aminosäuren Länge codiert, welches cotranslational durch die virale
3C-Protease in einzelne Proteine gespalten wird. Es finden sich zunächst die Polypeptide P1
(Strukturproteine), P2 und P3 (Nichtstrukturproteine) (Abb. 6) (191, 295, 345). Die
Strukturproteine VP1 bis VP4 bilden das Capsid, wobei die Abspaltung des nicht myristoylierten
VP4 vom VP2 womöglich erst im Virion vollzogen wird (105, 261, 337); der Proteinnachweis
27
gelang bislang nur für den Vorläufer VP0 (= VP4/VP2) und VP2 (105). Das 2A-Protein besitzt
bei HAV eine Rolle beim Assembly und findet sich zeitweilig auf der Oberfläche der Virionen
(als VP1/2A = PX), dabei hat es im Gegensatz zu z.B. Poliovirus keine Proteasefunktion (261,
265) und kann 3C-unabhängig abgespalten werden (216, 265). 2B und 2C sind
membranassoziiert und bewirken charakteristische Veränderungen des Aufbaus intrazellulärer
Membransysteme; sie sind dadurch der Replikation förderlich (114, 184). Der RNA-bindende
Vorläufer 3AB, welcher die Membranassoziation des Genoms bewerkstelligt, liefert nach
Spaltung das erwähnte VPg (3B), das vermutlich wie beim Poliovirus als "Primer" für die
Replikation der RNA durch die RNA-abhängige RNA-Polymerase 3D fungiert (24, 345). Nach
Translation und Replikation akkumuliert virales Antigen um den Zellkern herum (175), und die
assemblierten, pH 1-stabilen Virionen verlassen die Zelle auf unbekannte Weise ohne eine Lyse.
In diesem Zusammenhang sind einige Merkmale einer HAV-Infektion in Zellkultur
hervorzuheben:
Das Hepatitis A-Virus etabliert in Zellkultur eine persistente Infektion; eine Ausnahme bilden
lediglich einige an bestimmte Zellkultursysteme hochadaptierte cytopathogene Varianten (32,
193, 353, 356). Die Persistenz mag dabei auf wenigstens drei Eigenschaften beruhen. I) Das
Virus repliziert ausgesprochen langsam, führt keinen host-shut off durch und kompetiert kaum
die zelluläre mRNA-Translation (109, 191). II) HAV supprimiert aktiv die Apoptose-Induktion
durch z.B. transfiziertes poly(IC), NDV und Serumentzug (5, 31, 113). III) HAV induziert keine
Interferonexpression und supprimiert vollständig die Interferon-Induktion durch transfiziertes,
also intrazelluläres, poly(IC) (31, 211); diese Fähigkeit ist sehr wahrscheinlich auch in vivo in
der frühen Infektionsphase von entscheidender Bedeutung, da HAV durch exogenes Interferon
eliminierbar ist (60, 350). Bis zum Einsetzen der zellvermittelten und humoralen Immunantwort
könnte HAV so seine Replikation und Transmission sichern.
Das Ausbleiben einer Interferonsekretion in HAV-infizierten Zellkulturen ist ein lange bekanntes
Phänomen und war nach Induktion durch sowohl transfiziertes als auch extrazelluläres poly(IC)
evident (31, 352). Weitergehende Untersuchungen der Arbeitsgruppe Vallbracht brachten
zutage, dass die IFN-β-Suppression zelltyp- und virusstammunabhängig bereits auf
Transkriptionsebene passiert. Da die Induktion eines IFN-β-Enhancer-Reporterplasmids
ebenfalls durch HAV unterdrückt wurde, konnte ein posttranskriptionaler (also IFN-β-mRNA-
spezifischer) Mechanismus ausgeschlossen werden, so dass bereits die transkriptionale Induktion
des Gens durch HAV supprimiert sein musste (25, 31, 211). Durch den Einsatz von transient
oder stabil transfizierten Reporterplasmiden mit isolierten Subdomänen des IFN-β-Enhancers
28
(Abb. 2) konnte nachgewiesen werden, dass nur die PRDII und die PRDIII-I durch HAV
beeinflussbar sind. Die PRDII wurde in FRhK-4-Zellen durch alleinige HAV-Infektion leicht
aktiviert, und die Reporterinduktion nach poly(IC)-Transfektion war sogar bis zum Doppelten
verstärkt; der korrespondierende Transkriptionsfaktor, NF-κB, erfuhr also eine Positivregulation
durch HAV und konnte daher nicht für die IFN-β-Suppression verantwortlich sein (14, 33, 163,
291). NF-κB-Immunfluoreszenz-Assays in MRC-5-Fibroblasten bestätigten dessen ungehinderte
nucleäre Translokation (25). Im Falle der Verwendung von PRDIII-I-Konstrukten hingegen war
− genau wie für den gesamten IFN-β-Enhancer − eine vollständige Blockade der durch
transfiziertes poly(IC) erreichten Reporter-Induktion durch HAV zu beobachten (14, 93, 163).
Diese Befunde führten zu der Schlussfolgerung, dass der entsprechende Transkriptionsfaktor
IRF-3 (oder dessen Aktivierung bzw. DNA-Bindung) durch das Hepatitis A-Virus beeinflusst
wird, um die vollständige Unterdrückung der IFN-β-Expression zu gewährleisten. An der
Klärung genau diesen Punktes setzt die vorliegende Arbeit an.
29
1.5. Zielsetzung
Die bisherigen Ergebnisse zur Suppression der dsRNA-abhängigen IFN-β-Enhancer-Induktion
und speziell der PRDIII-I durch das Hepatitis A-Virus warfen die Frage nach dem Mechanismus
der Inhibition des betroffenen Transkriptionsfaktors IRF-3 auf. Da das IRF-3-Protein im Laufe
einer HAV-Infektion nicht degradiert wird (93), sollte in der vorliegenden Arbeit der
Angriffspunkt des Hepatitis A-Virus vor allem im intrazellulären, RIG-I-vermittelten Signalweg,
aber auch im TLR3-vermittelten Signalweg, lokalisiert werden.
Abbildung 7 gibt einen Gesamtüberblick über die IRF-3-Aktivierungswege durch intra- und
extrazelluläre dsRNA mit dem Kenntnisstand während der praktischen Arbeiten (es fehlt
demnach der Adapter MAVS). Die nachfolgend in die Untersuchungen einbezogenen
Signalwegs-Komponenten sind violett/rot gefärbt.
Abb. 7: IRF-3-Aktivierung durch intra- oder extrazelluläre dsRNA.
30
2. Material und Methoden ____________________________________________________________
2.1. Material
2.1.1. Viren
Hepatitis A-Virus (HAV): HAV/7 als Variante des Stammes HM175, TCID50 = 5,62*106/ml
bzw. 9,55*105/ml, passagiert in FRhK-4-Zellen. TLR3-Experimente: TCID50 = 5,33*106/ml.
Newcastle Disease-Virus (NDV): NDV-Stamm R 05/93, TCID50 = 4,37*106 oder 3,72*106
(GFP-Experimente) bzw. 1*107/ml (Reportergenexperimente), erhalten von der Bundes-
forschungsanstalt für Viruskrankheiten der Tiere, Insel Riems; passagiert in FRhK-4-Zellen.
2.1.2. Zellen
FRhK-4: fetale Rhesusaffen-Nierenzellen (CBER/FDA, Department of Virology, Bethesda,
Maryland, USA). Epithelartige, nicht transformierte Zellen, Passagen 30-70.
FRhK-4/GFP-IRF-3: FRhK-4-Zellen, mittels Calciumphosphat-Methode stabil transfiziert mit
dem Plasmid pcDNA3/GFP-IRF-3, selektiert mit G418.
FRhK-4/TLR3: FRhK-4-Zellen, mittels jetPEI stabil transfiziert mit dem Plasmid pUNO-
hTLR3, selektiert mit Blasticidin S (hergestellt von Ines L. Mordhorst).
MRC-5: humane embryonale Lungenfibroblasten (American Type Culture Collection).
Nichttransformierte Lungenfibroblasten, Passagen 22-28.
2.1.3. Kompetente Bakterien
Escherichia coli, Stämme HB101, C600, DH5α und GT110.
31
2.1.4. Plasmide
(-110-IFN-β)-CAT: Reporterplasmid; enthält das Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen unter
der Kontrolle des humanen Interferon-β-Enhancer/Promotors (bp -116 bis +11). Das Plasmid
wurde freundlicherweise von Tom Maniatis (Dept. of Molecular and Cellular Biology, Harvard
University, Cambridge, Maryland, USA) zur Verfügung gestellt (339).
(PRDIII-I)3-CAT: Reporterplasmid; enthält das Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gen unter
der Kontrolle dreier Repeats der PRDIII-I des humanen Interferon-β-Enhancers (IRF-3-
Bindestelle). Es wurde freundlicherweise von Tom Maniatis (Dept. of Molecular and Cellular
Biology, Harvard University, Cambridge, Maryland, USA) zur Verfügung gestellt (339).
p125-Luc (IFN-β-Luc): Reporterplasmid; enthält das Leuchtkäfer-Luciferase-Gen unter der
Kontrolle des Interferon-β-Enhancer/Promotors (bp -125 bis +17). Das Plasmid wurde
freundlicherweise von Takashi Fujita (Department of Tumor Cell Biology, The Tokyo
Metropolitan Institute of Medical Science, Tokyo, Japan) zur Verfügung gestellt (387).
(PRDIII-I)4-Luc ("4xIRF3"): Reporterplasmid; enthält das Leuchtkäfer-Luciferase-Gen unter der
Kontrolle vierer Repeats der PRDIII-I des humanen Interferon-β-Enhancers (IRF-3-Bindestelle).
Der Basisvektor ist pGL3 (Promega) inklusive einer TATA-Box (Abb. 8A). Das Plasmid wurde
freundlicherweise von Stephan Ludwig (Institute of Molecular Medicine, Heinrich-Heine-
Universität, Düsseldorf, Germany) zur Verfügung gestellt (83).
pcDNA3/GFP-IRF-3(wt): Expressionsvektor; enthält die cDNA des humanen IRF-3 in
N-terminaler Fusion mit dem GFP-Gen (GFP-IRF-3) unter Kontrolle eines CMV-Promotors, der
Basisvektor ist pcDNA3, welcher üblicherweise eine Neomycin-Resistenz (G418) enthält
(Abb. 8B). Das Plasmid wurde freundlicherweise von Nancy C. Reich (Department of
Pathology, SUNY at Stony Brook, New York, USA) zur Verfügung gestellt (182).
pcDNA3.1/IKKε-myc: Expressionsvektor; enthält die cDNA der humanen IKKε in C-terminaler
Fusion mit einem Myc-tag unter der Kontrolle eines CMV-Promotors, der Basisvektor ist
pcDNA3.1 (Abb. 8C). Das Plasmid wurde freundlicherweise von Ulrich Siebenlist (NIAID, NIH
Bethesda, Maryland, USA) zur Verfügung gestellt (43). Als Leervektor wurde in den
Experimenten pcDNA3.1 (Invitrogen) benutzt.
32
pcDNA3/Flag-TBK1 ("Flag-NAK"): Expressionsvektor; enthält die cDNA der humanen TBK1
in N-terminaler Fusion mit einem FLAG-tag unter der Kontrolle eines CMV-Promotors, der
Basisvektor ist pcDNA3. Das Plasmid wurde freundlicherweise von Makoto Nakanishi
(Department of Biochemistry, Nagoya City University Medical School, Japan) zur Verfügung
gestellt (344). Als Leervektor wurde in den Experimenten pcDNA3 (Invitrogen) benutzt.
pEF-Flag-RIG-I full: Expressionsvektor; enthält die cDNA des humanen full-length RIG-I in
N-terminaler Fusion mit einem FLAG-tag unter der Kontrolle des EF-1α-Promotors, der
Basisvektor ist pEF-BOS (Abb. 8D). Das Plasmid wurde freundlicherweise von Takashi Fujita
(Department of Tumor Cell Biology, The Tokyo Metropolitan Institute of Medical Science,
Tokyo, Japan) zur Verfügung gestellt (386). Durch Excision des RIG-I-Inserts wurde der
Leervektor für die Experimente erhalten (2.2.32.).
pEF-Flag-RIG-IC: Expressionsvektor; enthält die cDNA der C-terminalen Helicase-Domäne des
humanen RIG-I in N-terminaler Fusion mit einem FLAG-tag unter der Kontrolle des EF-1α-
Promotors, der Basisvektor ist pEF-BOS. Das Plasmid wurde freundlicherweise von Takashi
Fujita (Department of Tumor Cell Biology, The Tokyo Metropolitan Institute of Medical
Science, Tokyo, Japan) zur Verfügung gestellt (386). Durch Excision des RIG-I-Inserts wurde
der Leervektor für die Experimente erhalten (siehe oben).
PL1004 TRIF (Flag-TRIF): Expressionsvektor; enthält die cDNA des humanen TRIF
(= TICAM-1) in N-terminaler Fusion mit einem FLAG-tag unter der Kontrolle eines CMV-
Promotors, der Basisvektor ist pCR3 (Abb. 8E). Das Plasmid wurde freundlicherweise von Jürg
Tschopp (Department of Biochemistry, University of Lausanne, BIL Biomedical Research
Center, Epalinges, Schweiz) zur Verfügung gestellt (225). Durch Excision des TRIF-Inserts
wurde der Leervektor für die Experimente erhalten (2.2.32.).
pcDNA3.1/Flag-TANK: Expressionsvektor; enthält die cDNA des humanen TANK (= I-TRAF)
in N-terminaler Fusion mit einem FLAG-tag unter der Kontrolle eines CMV-Promotors, der
Basisvektor ist pcDNA3.1. Das Plasmid wurde freundlicherweise von Ulrich Siebenlist (NIAID,
NIH Bethesda, Maryland, USA) zur Verfügung gestellt (43). Als Leervektor wurde in den
Experimenten pcDNA3.1 (Invitrogen) benutzt.
33
pHcRed-Tandem-N1: Expressionsvektor; enthält die cDNA des rot fluoreszierenden Proteins
HcRed der Leder-Anemone Heteractis crispa in zweifacher, fusionierter Kopie unter Kontrolle
eines CMV-Promotors. Für die Selektion enthält der Vektor ein Kanamycin/Neomycin-
Resistenzgen. Das Plasmid stammt von der Firma Evrogen.
pGL2-control: Expressionsvektor; enthält ein Luciferase-Gen unter Kontrolle des SV40-
Promotors. Es wurde in dieser Arbeit an einer Stelle als Füllplasmid genutzt (Abb. 9). Das
Plasmid stammt von der Firma Promega.
pUNO-hTLR3: Expressionsvektor; enthält die cDNA des humanen TLR3 unter der Kontrolle
eines EF-1/HTLV-Promotors (Abb. 8F) und ein Blasticidin S-Resistenzgen. Das Plasmid stammt
von der Firma Invivogen.
2.1.5. Enzyme, Proteine und Antikörper
Antikörper Maus-anti-HAV "7E7", monoklonal Mediagnost
Antikörper Ziege-anti-Maus, FITC-konjugiert Kierkegaard & Perry (KPL)
Antikörper Ziege-anti-Maus, Texas Red-konjugiert Kierkegaard & Perry (KPL)
Antikörper Maus-anti-FLAG "M2", monoklonal Sigma
Antikörper Ziege-anti-Maus, Peroxidase (HRP)-konjugiert Santa Cruz
Bovines Serumalbumin, BSA (Fraktion V) Roche
DNase RQ1 mit 10x Puffer Promega
Klenow-Fragment (von E. coli DNA-Pol. I) mit 10x Puffer Invitrogen
Lysozym (aus Hühnereiklar) Serva
MB-Taq-Polymerase Minerva Biolabs
Restriktionsendonucleasen mit 10x Puffer Roche
Reverse Transkriptase "Expand RT" mit 5x Puffer Roche
RNase A Roche
T4 DNA-Ligase mit 10x Puffer Roche
Taq-Polymerase Eppendorf
Trypsin-EDTA Sigma
34
E F
C D
A B
Abb. 8: Plasmidkarten. (A-F) Darstellung einiger der eingesetzten Plasmide mit Genen undPromotoren, Resistenz-Genen und Restriktionsenzym-Schnittstellen. Erläuterungen siehe Text.
35
2.1.6. Serum für Zellkultur
Fetal calf serum (FCS) Gibco BRL
2.1.7. Antibiotika
Ampicillin Serva
Kanamycin Invitrogen
G418 (Geneticin) Sigma
Blasticidin S Invivogen
Penicillin (10000 U/ml) / Streptomycin (10mg/ml) Sigma
2.1.8. Kits und Standards
CAT-ELISA Roche
DNA-Längenstandard "1kb ladder" Invitrogen
DNA Molecular weight marker VIII Roche
ECL Detection reagent (für Immunoblot) Amersham
Luciferase Assay System Promega
Protein Assay Dye Reagent (5x Bradford-Reagens) Bio-Rad
Protein-Marker (pre-stained, low-range für SDS-PAGE) Bio-Rad
VenorGeM PCR-based Mycoplasma Detection Kit Minerva Biolabs
2.1.9. Primer für die RT-PCR
Alle Oligonucleotid-Primer beziehen sich auf die humane mRNA-Sequenz, alle Primer wurden
von Firma Roth synthetisiert.
TLR3 sense AAC CTT TGC CTT CTG CAC GA antisense AAA GCC CGT GCA AAG AGT GA (615 bp Amplifikat)
36
TRIF sense GAG GAG ATG AGC TGG CCG CCA T antisense TGT TGG CCA CCT TCC TGG CGA A (828 bp Amplifikat)
RIG-I (Imaizumi et al., 2004) sense GCA TAT TGA CTG GAC GTG GCA antisense CAG TCA TGG CTG CAG TTC TGT C (645 bp Amplifikat)
MDA-5 (Cocude et al., 2003) sense GGA AGT ACA ATG AGG GCC TAC AAA antisense TCC TCA GCC CTA GTA TAT TGC TCC (339 bp Amplifikat)
β-Actin (Wünschmann, 1998) sense AGA AGA GCT ACG AGC TGC CTG ACG antisense CGT CAT ACT CCT GCT TGC TGA TCC (381 bp Amplifikat)
2.1.10. Chemikalien und Reagenzien
Aceton Fluka
Acrylamid Pharmacia Biotech
Agar "Bacto Agar" Becton Dickinson
Agarose "LM-MP" low melting point Roche
Agarose "SeaKem LE" Cambrex
Ammoniumpersulfat Serva
Bisacrylamid (Methylenbisacrylamid) Pharmacia Biotech
Bromphenolblau Sigma
Calciumchlorid Merck
Cäsiumchlorid (CsCl) Serva
Chloroform Fluka
DEAE-Dextran (Diethylaminoethyl-Dextran) Sigma
DEPC ("Diethylpyrocarbonat") Sigma
Diethylether Riedel-de Haen
Dinatriumhydrogenphosphat Riedel-de Haen
DMEM (mit L-Glutamin) Sigma
DMSO (Dimethylsulfoxid) Merck
dNTPs (dATP, dCTP, dTTP, dGTP) Roche
37
DTT (Dithiothreitol) Sigma
DTT (100 mM für reverse Transkription) Roche
EDTA (Ethylendiamin-tetra-acetat) Sigma
Entwickler & Fixierer "Adefodur" Adefo
Essigsäure (Eisessig) Fluka
Ethanol Roth
Ethidiumbromid Sigma
Glucose Janssen Chimica
Glycerol Riedel-de Haen
Glycerol/PBS (Eindeckmedium) Euroimmun
Glycin Roth
Guanidin-thiocyanat Serva
Harnstoff Merck
Hefe-Extrakt "Bacto yeast extract" Becton Dickinson
HEPES Acros
Immersionsöl Immersol F Zeiss
Isoamylalkohol (Isopentylalkohol) Merck
Isopropanol (2-Propanol) Fluka
jetPEI transfection reagent Qbiogene
Kaliumchlorid Merck
Kaliumdihydrogenphosphat Riedel-de Haen
N-Lauroyl-Sarcosinat (Sarcosyl) Sigma-Aldrich
Mineral-Öl Sigma
Magnesiumchlorid Merck
Magnesiumsulfat Riedel-de Haen
2-Mercaptoethanol Merck
Natriumacetat Merck
Natriumchlorid Fluka
Natriumhydroxid Fluka
Paraformaldehyd Fluka
Phenol (wassergesättigt) "Roti-Aqua-Phenol" Roth
Phenol (TE-Puffer-gesättigt) "Roti-Phenol" Roth
poly(IC) (Poly-Inosinsäure:poly-Cytidylsäure) Sigma
Saccharose Acros
38
Salzsäure (HCl) Merck
SDS (Natriumdodecylsulfat) Pharmacia Biotech, Roth
TEMED (Tetramethylethylendiamin) Sigma
Trinatriumcitrat Roth
Tris Base [Tris(hydroxymethyl)-aminomethan] Sigma, Roth
Triton X-100 Serva
Trockenmagermilch Saliter
Trypan Blue Sigma
Trypton "Bacto Tryptone" Becton Dickinson
Tween-20 Serva
2.1.11. Puffer und Lösungen
PBS (pH 7,4) 140 mM NaCl 2,7 mM KCl 6,5 mM Na2HPO4 1,5 mM KH2PO4
DEPC-Wasser 500 µl DEPC in 500 ml Aqua dest. übernacht auf Magnetrührer (RNase-frei) 2x autoklavieren
Bakterienkultur
LB-Medium 10 g Trypton 5 g Hefe-Extrakt 8 g NaCl ad 1 Liter mit Aqua dest., autoklavieren Zugabe von 100 µg/ml Ampicillin bei Benutzung
LB-Agar LB-Medium mit 1,5% (w/v) Agar (15 g/l) autoklavieren, Zugabe von 100 µg/ml Ampicillin
LB++-Medium LB-Medium mit 20 mM MgSO4 und 10 mM KCl
Ampicillin-Stammlösung 50 mg/ml Amp in autoklaviertem Aqua dest. suspendieren, Lagerung bei −20°C
39
Schnellpräparation bakterieller Plasmid-DNA (Miniprep)
Lösung 1 50 mM Glucose 10 mM EDTA 10 mM Tris pH 8,0 einstellen mit HCl autoklavieren bei 100°C kurz vor Gebrauch 2 mg/ml Lysozym dazu
Lösung 2 0,2 M NaOH 1% (w/v) SDS frisch ansetzen
Lösung 3 3 M Natriumacetat pH 4,8 mit Eisessig einstellen
Plasmidpräparation (Maxiprep) nach Sambrook et al., 1989, verändert
2 M Tris pH 8,0 mit HCl einstellen
0,5 M EDTA pH 8,0 mit NaOH einstellen
TES 50 mM Tris (pH 8,0) 5 mM EDTA (pH 8,0) 50 mM NaCl
STET 50 mM Tris (pH 8,0) 50 mM EDTA (pH 8,0) 8% (w/v) Saccharose 5% (w/v) Triton X-100 frisch ansetzen
Lysozymlösung 20 mg/ml Lysozym in 20 mM Tris (pH 8,0) frisch ansetzen
Sarcosyl 1% 1% (w/v) in 20 mM Tris (pH 8,0) frisch ansetzen
NaCl-gesätt. Isopropanol Isopropanol ausschütteln in 10 mM Tris (pH 8,0) / 1 mM EDTA, gesättigt mit NaCl
40
Cäsiumchlorid-Lösung 50 g CsCl in 65 ml 20 mM Tris (pH 8,0) lösen Refraktionsindex mit 20 mM Tris auf 1,3865 einstellen
Ethidiumbromid-Suspension 10 mg/ml in Aqua dest.
5 mM Trispuffer 2 M Tris (pH 8,0) 1:400 mit Aqua dest. verdünnen
Indirekte Immunfluoreszenz zur HAV-Detektion
Paraformaldehyd (4%) 1 g Paraformaldehyd ad 25 ml PBS übernacht auf Magnetrührer sterilfiltrieren bei RT mindestens 14 Tage haltbar
Triton X-100 (0,2%) 200 µl in 100 ml PBS lösen
Calciumphosphat-Transfektion
TE-Puffer 10 mM Tris 1 mM EDTA natriumfrei pH 7,8 einstellen mit 1 M HCl autoklavieren
Calciumchloridlösung 2 M CaCl2 in Aqua dest. autoklavieren
2x HBS 50 mM HEPES 1,5 mM Na2HPO4 280 mM NaCl pH 7,1 präzise einstellen mit 5 M NaOH sterilfiltrieren
Glycerol-Schocklösung Glycerol 1:3 in Aqua dest. (= 30%) autoklavieren bei 100°C 1:2 in 2x HBS verdünnen (= 15% Schocklösung)
41
jetPEI-Transfektion
150 mM NaCl 0,8766 g Natriumchlorid ad 100 ml DEPC-Wasser, autoklavieren
poly(IC)-Transfektion mittels DEAE-Dextran
DEAE-Dextran 10 mg/ml in autoklaviertem Aqua dest. sterilfiltrieren, Lagerung bei 4°C
poly(IC) 2 mg/ml in RNase-freiem Aqua dest., Lagerung bei −80°C
Freeze & Thaw Lyse zur Proteingewinnung
Tris-HCl 250 mM Tris pH 7,5 einstellen mit HCl autoklavieren
TEN 40 mM Tris-HCl (pH 7,5) 1 mM EDTA (pH 8,0) 150 mM NaCl autoklavieren
Proteinbestimmung nach Bradford
BSA-Stammlösung 10 mg/ml BSA in 0,25 M Tris-HCl (pH 7,5) verdünnen mit Tris-HCl für diverse Standards (0,25 - 4 mg/ml)
1x Bradford-Reagens 5x Bradford-Reagens (Bio-Rad Protein Assay) auf 1x verdünnen mit Aqua dest., filtrieren mit Schleicher & Schuell "Schwarzband"-Filterpapier, lichtgeschützt bis 14 Tage haltbar
SDS-PAGE & Immunoblot (PAGE nach Laemmli, 1970, verändert)
Lower Tris (pH 8,8) 1,5 M Tris Base 0,4% SDS
pH 8,8 einstellen mit HCl
42
Upper Tris (pH 6,8) 0,5 M Tris Base 0,4% SDS pH 6,8 einstellen mit HCl
Acrylamid/Bisacrylamid 29% Acrylamid (w/v) 1% Bisacrylamid (w/v) filtrieren, bei 4°C lichtgeschützt drei Monate haltbar
Ammoniumpersulfat (10%) 100 mg APS pro ml Aqua dest. bei 4°C vier Wochen haltbar
Trenngel (10%) 10 ml Volumen für 2 kleine Gele: 3,3 ml Acrylamid/Bisacrylamid-stock (30%) 2,6 ml Lower Tris pH 8,8 4,1 ml Aqua dest. 10 min entgasen per Saugpumpe 50 µl Ammoniumpersulfat und 5 µl TEMED zugeben schwenken, aspirieren, Gel gießen
Sammelgel (3%) 10 ml Volumen für 2 kleine Gele: 1 ml Acrylamid/Bisacrylamid-stock (30%) 2,6 ml Lower Tris pH 8,8 6,4 ml Aqua dest. 10 min entgasen per Saugpumpe 50 µl Ammoniumpersulfat und 10 µl TEMED zugeben schwenken, aspirieren, Gel gießen
Protein-Probenpuffer 40% Saccharose (w/v) 12% SDS (w/v) 62,5 mM Upper Tris 0,025% Bromphenolblau (w/v) 8% 2-Mercaptoethanol (v/v) bei −20°C lagern
Elektrophorese-Puffer 192 mM Glycin 25 mM Tris Base 1% SDS
Renaturierungspuffer 50 mM Natriumchlorid 10 mM Tris pH 7,0 (aus 1 M Tris pH 7,0 stock) 4 M Harnstoff 0,1 mM DTT
43
Blotting-Puffer 192 mM Glycin 25 mM Tris bei 4°C lagern
TBS (pH 8,0) 2 mM Tris Base 137 mM Natriumchlorid pH 8,0 einstellen mit HCl bei 4°C lagern
TBST TBS pH 8,0 0,1% Tween-20 bei 4°C lagern
TBST/Trockenmagermilch TBST 5% Trockenmagermilch (w/v) bei 4°C lagern
0,1% Bromphenolblau 50 mg Bromphenolblau in 50 ml Aqua dest.
Phenol-Ether-Extraktion von DNA aus LMP-Agarose-Gel
Phenol/Chloroform/ 25:24:1 (v/v) Isoamylalkohol
Ether (wasser-gesättigt) Diethylether mit 1 VT Aqua dest. schütteln, warten, obere Phase nutzen
RNA-Extraktion (nach Chomczynski & Sacchi, 1987, verändert)
GT-stock-Lösung 5 M Guanidin-thiocyanat 31,25 mM Trinatriumcitrat 0,625% Sarcosyl (w/v) pH 7,0 lichtgeschützt 3 Monate haltbar
Lösung D 125 mM 2-Mercaptoethanol (0,45 ml) 50 ml GT-stock lichtgeschützt 1 Monat haltbar
44
Natriumacetat 1 M Natriumacetat pH 4,0 mit Eisessig einstellen bei 4°C lagern
Chloroform/Isoamylalkohol 49:1 (v/v), frisch ansetzen bei 4°C für mehrere Tage lagern
DNase-Verdau und Phenol-Chloroform-Extraktion nach RNA-Extraktion
Natriumacetat 3 M Natriumacetat pH 4,8 mit Eisessig einstellen bei 4°C lagern
Chloroform/Isoamylalkohol 24:1 (v/v), frisch ansetzen bei 4°C für mehrere Tage lagern
Agarose-Gelelektrophorese
50x TAE 2 M Tris 0,25 M Natriumacetat 5 mM EDTA pH 7,8 einstellen für Gebrauch Verdünnung in Aqua dest. auf 1x
DNA-Probenpuffer 40% (w/v) Saccharose 1 mM EDTA (pH 8,0) 0,1% (w/v) SDS 0,05% (w/v) Bromphenolblau
DNA-Größenstandard 60 µl DNA-Marker "1kb ladder" bzw. 73 µl Marker "VIII" 40 µl 10x TAE 100 µl DNA-Probenpuffer 300 µl Aqua dest. Inkubation 10 min bei 56°C, Lagerung bei −20°C
Ethidiumbromid-Suspension 10 mg/ml in 20 mM Tris (pH 8,0)
45
2.1.12. Geräte
Analysenwaage BP 61 Sartorius
Analysenwaage MC 1 Sartorius
Begasungsbrutschränke Heraeus
Blotting-Kammer (TE Series Transphor Epho Unit) Hoefer
ELISA-Reader mit Software SOFTmaxPRO Molecular Devices
Elektrophorese-Kammer (PAGE) "Mighty Small II" SE250 Hoefer
Entwicklermaschine SRX-101 Konica
Epifluoreszenzmikroskop "Axioskop 2" (HAL100 & HBO100) Carl Zeiss
Fluoreszenzfilter-Sets 09 (450-490nm) und 15 (546 nm) Carl Zeiss
Fuchs-Rosenthal-Zählkammer Assistent
Gelkammern für Agarose-Gelelektrophorese Bio-Rad
Gel-Gießkammer (PAGE) "Mighty Small" SE245 Hoefer
Glaspipetten Hirschmann EM
Glaswaren Schott, Brand, B.Braun
Inkubator Certomat HK B.Braun Biotech Int.
Kolbenhub-Pipetten (Multipipetten, µl-Pipetten) Eppendorf, Gilson
Kühlblock TR-L 288 (für Ligation) Liebisch
Kühlzentrifuge 5403 Eppendorf
Lichtmikroskop Wilovert S Hund
Lumineszenz-Counter "Trilux 1450 MicroBeta" mit Software Wallac
Magnetrührtisch RCT basic Ika Labortechnik
Mehrkanalpipetten (8fach) Eppendorf
Messzylinder VitLab
PCR-Cycler "Gene Amp PCR Sytem 2400" Perkin Elmer
pH-Meter pH 537 WTW
Pipettierhilfe "Acuboy" TecNoMara
Pipettierhilfe "Pipetboy acu" Integra Biosciences
Power Supply 200/2.0 Bio-Rad
Quarzküvetten Suprasil Hellma
Refraktometer Optronic
Saugpumpe Vacuboy (Sauger) Integra Biosciences
Schüttler Certomat S B.Braun Biotech Int.
46
Schweißgerät (Tube Sealer für Quick Seal) Beckman
Sofortbildkamera MP4+ Polaroid
SpeedVac SC 110 Vakuumzentrifuge Savant
Spektralphotometer DU 640 Beckman
Sterilbank Clean Air Haan
Sterilbank LaminAir HB 2448 Heraeus
Taumler "Red Rotor" Hoefer
Thermomixer 5436 (für Reaktionsgefäße) Eppendorf
Tischzentrifuge GS-6R mit Rotor GH 3.7 (für Falcons) Beckman
Tischzentrifuge 5415 C (für Cups) Eppendorf
Ultraschallgerät UW 200 Bandelin
Ultrazentrifuge LE-70 mit Rotor Typ FW 65 Beckman
UV-Handlampe VL-6C Serva
UV-Transluminator "Mighty Bright" Hoefer
Vakuum-Saugpumpe (Membranpumpe) Vacuubrand
Vortexer VF2 Ika Labortechnik
Wasserbad (37°C) Memmert
Zentrifuge RC28S mit Rotor F-28/50 und F-16/250 Sorvall
2.1.13. Verbrauchsmaterial
24-Well-plates, Nunclon ∆ Nunc
96-Well-plates, Nunclon ∆ Nunc
Bakterienröhrchen 14ml Greiner
Biomax MR Filme 18x40 cm Kodak
Chamber slides, 8-Well, Plastik Labtek/Nunc
Combitips Eppendorf
Deckgläschen (24x60 mm) Omnilab
Dialyseschläuche (MW cutoff 14 kDa) "ultrapure", "Visking" Gibco, Serva
Einmal-Küvetten 1,5ml Plasik Plastibrand, Nerbe plus
Filterpapier "Schwarzband" Schleicher & Schuell
Kanülen (0,9x40 mm / 0,45x25 mm) B. Braun
Kimwipes lite (Wischtücher) Kimberly-Clark
47
Nitrocellulose-Membran "Protran" Schleicher & Schuell
Quick-Seal-Röhrchen (Polyallomer) Beckman
Parafilm "M" American National Can
Pasteur-Pipetten Brand
PCR-Cups 200 µl Eppendorf
Pipettenspitzen 200 & 1000µl "Standartips / epTips" Eppendorf
Reaktionsgefäße 1,5 + 2 ml (Cups) Eppendorf
Sample plates (96-Well) 1450-401 (Luminometer) Wallac
Sofortbilder 667 Filmpack Polaroid
Spritzen B. Braun
Sterilfilter für Spritzen "Millex" Millipore
Whatman Chromatographie-Papier Whatman
Zellkulturflaschen (80 + 185 cm²), Nunclon ∆ Nunc
Zellkulturschalen (6cm + 10cm), Nunclon ∆ Nunc
Zentrifugenröhrchen ("Falcons", 15 + 50 ml) Greiner
2.2. Methoden
2.2.1. Hitzeschock-Transformation kompetenter E. coli-Bakterien
Ein Plasmid sollte zunächst in geeignete (kompetente) Bakterien eingebracht werden
(Transformation), um es von diesen in großen Mengen replizieren zu lassen und es letztlich für
weitere Experimente zu reisolieren:
Jeweils 80 µl (bzw. 30 µl) der kompetenten Escherichia coli-Bakterien der Stämme HB101,
C600 oder DH5α wurden von −80°C aufgetaut und für 10 min in Reaktionsgefäßen auf Eis
gestellt. Dann wurden 20 µl (bzw. 1 µl) Plasmid-DNA-Lösung (1:10, 1:100 und 1:1000
verdünnt) hinzugegeben und die Ansätze für 20 min auf Eis stehen gelassen. Eine Kontrolle mit
Aqua dest. ohne Plasmid wurde mitgeführt. Es folgte der Hitzeschock von 42°C für 2 min auf
dem Schüttelinkubator (Thermomixer 5436), welcher zur Aufnahme des Plasmids durch die
Bakterien führt. Nach zweiminütiger Inkubation auf Eis wurde das vierfache Volumen an LB++-
Medium zugegeben, also 320 µl (bzw. 120 µl), um die Transformanten für 1 h bei 37°C im
Schüttler zu inkubieren. Die erfolgte Expression der plasmidcodierten Ampicillin-Resistenz
(β-Lactamase) (bzw. Kanamycin-Resistenz) ermöglichte eine Ausplattierung der Bakterien auf
48
LB-Agar mit 100 µg/ml Ampicillin zur Selektion der Transformanten, welche bei 37°C
übernacht zu Kolonien heranwuchsen.
2.2.2. Schnellpräparation bakterieller Plasmid-DNA (Miniprep)
Mehrere Mikrogramm Plasmid-DNA sollten aus Transformanten isoliert und letztlich durch
Restriktionsspaltung charakterisiert werden:
Zunächst wurden mehrere Transformanten-Klone mittels Zahnstocher gepickt und in je 3 ml LB-
Medium mit 100 µg/ml Ampicillin übernacht schüttelnd bei 37°C inkubiert. 1 ml dieser
Übernachtkultur wurde in der Tischzentrifuge 5415 C für 30 sec bei 9000 rpm im
Reaktionsgefäß zentrifugiert, die verbleibende Bakteriensuspension wurde bei 4°C aufgehoben,
um beizeiten die zweite Übernachtkultur für die Maxiprep animpfen zu können. Der Überstand
wurde verworfen, um 100 µl Lösung 1 zusetzen zu können, welche nach vortexen und 5 min
Inkubation bei RT zur Lyse der Bakterien führte. Anschließend wurden 100 µl Lösung 2
hinzupipettiert und nach vortexen wurde die Suspension 5 min bei 60°C inkubiert, was neben
Lyse auch eine Proteindenaturierung zur Folge hatte. Zur besseren Fällung der Proteine wurden
nun noch 150 µl Lösung 3 zugesetzt und nach kurzem Vortexen wurde das Gemisch für 15 min
auf Eis stehen gelassen. Nach 10 min Zentrifugation bei 14000 rpm in der Tischzentrifuge
5415 C wurde der plasmidhaltige Überstand in ein neues Reaktionsgefäß überführt und 1 ml
eiskalter Ethanol zugegeben, um die DNA zu fällen. Dies geschah während einer
zwanzigminütigen Inkubation bei −80°C, gefolgt von 20 min Zentrifugation bei 14000 rpm in
der Tischzentrifuge 5415 C.
Das DNA-Pellet wurde zweimal mit 70% Ethanol gewaschen (Zentrifugationen 15 min bei
14000 rpm, Tischzentrifuge 5415 C) und in der SpeedVac vakuumgetrocknet. Abschließend
wurde die lyophilisierte DNA in 50 µl autoklaviertem Aqua dest. aufgenommen und konnte nun
für den Restriktionsverdau eingesetzt und bei −20°C gelagert werden.
2.2.3. Plasmidpräparation (Maxiprep) nach Sambrook et al., 1989, verändert
Die nach der Miniprep per Restriktionsverdau (2.2.5.) als richtig identifizierten Transformanten-
Klone sollten in größerem Maßstab kultiviert werden, um anschließend die vervielfachte
Plasmid-DNA mittels Cäsiumchloridgradient in der Ultrazentrifuge zu separieren:
49
Zunächst wurden je 20 µl der aufbewahrten ersten Übernachtkultur in 5 ml LB-Medium mit 100
µg/ml Ampicillin in Bakterienröhrchen übernacht schüttelnd bei 37°C inkubiert, um mit 1 ml
dieser frischen Übernachtkultur je 500 ml LB-Medium (mit ebenfalls 100 µg/ml Ampicillin)
beimpfen zu können. Nach schüttelnder Übernachtkultur bei 37°C wurde die
Bakteriensuspension 20 min bei 4000 rpm und 4°C in der Sorvall-Zentrifuge (Rotor F-16/250)
zentrifugiert, das Pellet in 20 ml TES-Puffer resuspendiert und in kleineren Röhrchen für 10 min
bei 5000 rpm zentrifugiert (Rotor F-28/50), was insgesamt einen Waschschritt darstellte. Auf
eine Resuspension des Pellets in 22 ml frischem STET folgte die Überführung der Suspension in
100 ml-Erlenmeyer-Kolben und die Zugabe von 1 ml Lysozymlösung von 20 mg/ml. Das
Gemisch wurde umgehend für 40 sec über der Bunsenbrennerflamme aufgekocht, was zur Lyse
der Bakterien führte. Das entstandene zähflüssige Produkt konnte in Zentrifugenröhrchen
überführt und in der Sorvall-Zentrifuge (Rotor F-28/50) für 45 min bei 16000 rpm und 4°C
zentrifugiert werden, was zur Pellettierung eines Großteils der Zellwand- und
Membranbestandteile sowie unlöslicher Proteine führte. Der Überstand wurde in neue Röhrchen
verbracht und mit einem Volumenteil Isopropanol gemischt, um die enthaltene DNA zu fällen.
Nach 15 min bei −80°C wurde erneut zentrifugiert, und zwar für 60 min bei 12000 rpm und 4°C
(Rotor F-28/50).
Der Überstand enthielt nun lösliches Protein und weitere unerwünschte Zellbestandteile, und
wurde daher verworfen. Das Röhrchen wurde mit punktiertem Parafilm geschlossen, um das
enthaltene DNA-Pellet in der SpeedVac vakuumzutrocknen. Es folgte eine Aufnahme und
Resuspension in 1% Sarcosyl, einem Detergens, welches für hohe Salzkonzentrationen geeignet
ist, was schüttelnd bei 37°C etwa 1 h in Anspruch nahm. Anschließend wurden 9,4 g
Cäsiumchlorid in 50 ml-Falconröhrchen eingewogen, die DNA-Sarcosyl-Lösung zugegeben und
das CsCl-Salz gelöst; außerdem wurden 900 µl Ethidiumbromid (von 10 mg/ml) hinzugefügt,
einem DNA-Intercalator, welcher in UV-Licht orangefarben fluoresziert und die DNA später
sichtbar machen würde. Die gesamte Lösung wurde mittels Pasteurpipetten in Quick Seal-
Zentrifugenröhrchen überführt, der verbleibende Hohlraum mit Mineral-Öl aufgefüllt und das
Röhrchen zugeschweißt. Es erfolgte eine Ultrazentrifugation bei 55000 rpm und 20°C für 18 h in
der Beckman-Zentrifuge (Rotor FW 65). Während dieser isopyknischen Zentrifugation stellte
sich im Röhrchen ein Cäsiumchlorid-Gradient ein, in welchem sich Plasmid-DNA und
genomische DNA im Bereich entsprechender Dichte separat bandenförmig sammelten. Es
konnte nun im UV-Licht die Plasmid-DNA-Bande mit Kanüle und Spritze abgezogen und in
15 ml-Falconröhrchen mit einer eingestellten Cäsiumchlorid-Lösung (Refraktionsindex 1,3865)
auf 12 ml aufgefüllt werden. Nach erneuter Zentrifugation in Quick Seal-Röhrchen für 24 h bei
50
50000 rpm (Rotor FW 65) wurde abermals die Plasmid-Bande gezogen und die nun sehr rein
vorliegende Plasmid-DNA durch siebenfaches Ausschütteln in NaCl-gesättigtem Isopropanol
vom Ethidiumbromid befreit. Das Ethidiumbromid wurde hierbei in die alkoholische Phase
aufgenommen. Das letzte Ausschütteln wurde mit einer zweiminütigen Zentrifugation bei 2000
rpm (Tischzentrifuge GS-6R, Beckman) für saubere Phasentrennung abgeschlossen, außerdem
wurde ein Tropfen der CsCl-DNA-Lösung auf dem UV-Transluminator auf Ethidium-
bromidreste hin überprüft. Abschließend wurde die Plasmid-Lösung per Dialyse gegen 5 mM
Trispuffer bei dreimaligem Wechseln des Puffers übernacht vom Cäsiumchlorid befreit. Es
folgte eine photometrische Konzentrationsbestimmung, und zur Überprüfung der
Plasmididentität wurde auch hier ein Restriktionsverdau durchgeführt. Die Plasmid-DNA wurde
bei −20°C gelagert.
2.2.4. Photometrische Konzentrationsbestimmung von DNA
Auf die Maxiprep folgte eine photometrische Konzentrations- und Reinheitsbestimmung der
erhaltenen DNA, wobei 100 µl einer 1:20-Verdünnung in autoklaviertem Aqua dest. in
Quarzküvetten bei 260 und 280 nm gegen Aqua dest. gemessen wurden. Eine OD260 entspricht
50 µg DNA/ml, der Quotient OD260/OD280 wird durch die Absorption aromatischer Aminosäuren
(Proteingehalt) bei 280 nm beeinflusst und sollte bei 1,8 bis 2,0 liegen.
2.2.5. Restriktionsspaltungsanalyse von Plasmid-DNA
Zur Kontrolle der Identität der präparierten Plasmide nach Mini- und Maxiprep wurden diese
mittels Restriktionsendonucleasen an bekannten Stellen geschnitten und die erhaltenen
Fragmente im Agarosegel aufgetrennt:
Nach Miniprep:
20 µl der in der Miniprep isolierten DNA-Lösung wurden in Reaktionsgefäßen mit 3 µl des
entsprechenden 10x Puffers, 2 µl RNase A (10 mg/ml), 3 U Restriktionsenzym und Aqua dest.
ad 30 µl versetzt, um für 2 h bei 37°C inkubiert zu werden.
Nach Maxiprep:
Es wurden meist jeweils drei Ansätze gefahren, nämlich fragmentiertes, ungeschnittenes und, bei
Bedarf, linearisiertes Plasmid. Für ungeschnittenes Plasmid wurden 500 ng Plasmid mit
51
autoklaviertem Aqua dest. auf 30 µl aufgefüllt. Für fragmentiertes oder linearisiertes Plasmid
wurden 500 ng Plasmid eingesetzt, außerdem 3 µl 10x Puffer und 3 U Restriktionsenzym, wobei
mit autoklaviertem Aqua dest. auf 30 µl aufzufüllen war. Die Ansätze wurden für 2 h bei 37°C
inkubiert.
Die Zugabe von nicht weniger als 1:6 DNA-Probenpuffer (hier 6 µl) beendete in beiden Fällen
die Reaktion und es lag ein durch Saccharose (im Probenpuffer) beschwertes Probengemisch für
die Gelelektrophorese vor.
2.2.6. Agarose-Gelelektrophorese für DNA
Nach Herstellung eines 1%-Agarosegels (w/v) aus Agarose und 1x TAE sowie 0,5 µg/ml
Ethidiumbromid wurde dieses in eine mit 1x TAE gefüllte Gelkammer eingesetzt und die
Geltaschen mit Probengemisch befüllt. 5µl DNA-Größenstandard wurden mitgeführt. Die
Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgte nach Anlegen von 60 V für 1-2 h, wobei die DNA in
Richtung der Anode durch das Gel wanderte. Abschließend wurde das Gel auf einen UV-
Transluminator gelegt und fotografiert.
2.2.7. Zellkultur FRhK-4-Zellen
FRhK-4-Zellen sowie die stabil transfizierten FRhK-4/GFP-IRF-3-Zellen wurden kontinuierlich
bei 37°C und 5% CO2 mit DMEM (1% FCS) und den Zusätzen 100 U/ml Penicillin und
100 µg/ml Streptomycin gehalten. Das Medium wurde zweimal pro Woche gewechselt. Alle 7
bis 10 Tage erfolgte eine Passagierung (Split 1:5) mit 10% FCS/DMEM in neue 80 cm²-
Zellkulturflaschen, wobei zur Ablösung der Zellen stets Trypsin-EDTA-Lösung verwendet
wurde, welche für etwa 8 min bei 37°C einwirkte. Die stabil transfizierten FRhK-4/TLR3-Zellen
wurden außerhalb der Experimente mit einem Zusatz von 10 µg/ml Blasticidin S gehalten.
2.2.8. Zellkultur MRC-5-Zellen
MRC-5-Zellen wurden kontinuierlich bei 37°C und 5% CO2 mit DMEM (3% FCS) und den
Zusätzen 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin gehalten. Das Medium wurde
52
zweimal pro Woche gewechselt. Alle 10-12 Tage erfolgte eine Passagierung (Split 1:2) mit 10%
FCS/DMEM in neue 80 cm²-Zellkulturflaschen, wobei zur Ablösung der Zellen stets Trypsin-
EDTA-Lösung verwendet wurde, welche für etwa 3 min bei 37°C einwirkte. Die abgelösten
Zellen wurden anschließend bei 1200 rpm in der Tischzentrifuge GS-6R für 2 min pelletiert und
in 10% FCS/DMEM aufgenommen, um das Trypsin zu entfernen.
2.2.9. Cryokonservierung von Zellen
Um Zellen in flüssigem Stickstoff (−196°C) dauerhaft zu lagern, wurden im Falle von FRhK-4-
Zellen diese in einer 80 cm²-Flasche bis kurz vor Erreichen der Konfluenz kultiviert, mit Trypsin
gespült, mit 3 ml Trypsin abgelöst und in 7 ml 10% FCS/DMEM aufgenommen. Nach 5 min
Zentrifugation bei 2500 rpm in der Tischzentrifuge GS-6R wurde das Zellpellet in 4 ml
gekühltem Cryomedium (10% DMSO in FCS) aufgenommen und als 4 Aliquots in
Cryoröhrchen für 1 Tag bei −80°C zwischengelagert, um anschließend in flüssigem Stickstoff
endgelagert zu werden.
Im Falle von MRC-5-Zellen wurden diese nach Abtrypsinieren für 5 min bei 1200 rpm pelletiert
und in 4 ml Cryomedium (10% DMSO in 30% FCS/DMEM) aufgenommen. 3-4 Aliquots,
welche jeweils 25 cm² Kulturfläche entsprechen, wurden sodann in Cryoröhrchen für 1 Tag bei
−80°C zwischengelagert, um anschließend in flüssigem Stickstoff endgelagert zu werden.
In allen Fällen wurde nach etwa 14 Tagen ein Aliquot aufgetaut, um die Lebensfähigkeit der
Zellen zu überprüfen und einen Mycoplasmentest durchzuführen.
2.2.10. Mycoplasmen-Test per PCR (VenorGeM)
Dieser PCR-basierte Mycoplasmen-Test wurde exakt nach den Angaben des Herstellers Minerva
Biolabs durchgeführt. Er dient zum Nachweis von Mycoplasmen-Kontaminationen in
Zellkulturen, intrazellulären bakteriellen Parasiten also, die den Stoffwechsel der Wirtszelle
beeinflussen und somit Ergebnisse verfälschen können. 2 µl Zellkulturüberstand wurden hierfür
mit 48 µl eines PCR-Mixes versetzt, welcher neben MB-Taq-Polymerase, Puffer, dNTPs und
RNase-freiem Aqua dest. auch gegen die 16S-rRNA-Gensequenz gerichtete Primer enthält,
mithilfe derer entsprechende Sequenzbereiche zahlreicher Mycoplasma-, aber auch
Acholeplasma- und Ureaplasma-Spezies amplifiziert und somit nachgewiesen werden können.
53
Eine interne Kontrolle (winzige Mengen Plasmid-DNA, welche als Template für ein zusätzliches
Amplifikat dient) ermöglichte zudem den Nachweis der Aussagekraft jedes Ansatzes. Keiner der
regelmäßig durchgeführten Tests erbrachte ein positives Ergebnis im Sinne einer Kontamination.
2.2.11. Herstellung eines Viruspools (Hepatitis A-Virus)
Um Zellkulturen für Experimente mit HAV infizieren zu können, benötigt man einen Viruspool,
welcher aus Zell-Lysat inklusive Überstand von HAV-infizierten Zellen besteht und durch
Einfrieren und Auftauen gewonnen wird. Hierzu wurden FRhK-4-Zellen 1:8 in 185 cm²-
Flaschen gesplittet (mindestens eine Flasche für HAV-Lysat und eine Flasche für mock-Lysat)
und bis zu 90%iger Konfluenz kultiviert. Anschließend wurden die Zellen einmal mit 1%
FCS/DMEM gespült und das Virusinoculum aufgebracht, bestehend aus 1 ml Virus-Lysat bzw.
mock-Lysat und 4 ml 1% FCS/DMEM. Während zweistündiger Inkubation bei 37°C wurde
mehrfach geschwenkt, anschließend wurde das Inoculum abgenommen und 25 ml 1%
FCS/DMEM zugegeben. Nach 7 Tagen bei 34°C und 5% CO2 wurden 10 ml 1% FCS/DMEM
zugefüttert und weiter inkubiert; 34°C statt 37°C stellen hierbei eine Sonderbehandlung für
HAV/7 dar, welche sich nicht bis in das eigentliche Experiment erstreckt. Nach insgesamt
14 Tagen wurden die Zellkulturflaschen dreimal bei −80°C eingefroren und bei RT wieder
aufgetaut, was den Lyseschritt darstellt. Die Lysate wurden in 50 ml-Falconröhrchen überführt
und dreimal für 20 sec ultraschallbehandelt. Es folgte eine 10 min-Zentrifugation bei 3000 rpm
(Tischzentrifuge GS-6R), um überflüssige Membranbestandteile zu pelletieren. Der Überstand
wurde zu 1 ml in Reaktionsgefäße gefüllt und bei −80°C gelagert. Es folgte die Titerbestimmung
(TCID50) per Immunfluoreszenztest.
2.2.12. Endpunkttitration von HAV-Viruspools (TCID50)
Eine Endpunkttitration ist eine quantale Methode zur Bestimmung der infektiösen Einheiten pro
Milliliter, bei der die kleinste Virusmenge mit nachweisbarem Effekt auf das Testsystem als
Endpunkt bezeichnet wird. Man erhält im Falle einer Infektion von Zellkultureinheiten mit
verschiedenen Virusverdünnungen nach Berechnung mithilfe der Kärber-Gleichung (s.u.) einen
sogenannten Titer, die 50% tissue culture infectious dose (TCID50/ml). Zunächst wurden für die
HAV-Titration FRhK-4-Zellen 1:5 in zwei 96-Well-plates umgesetzt und übernacht bei 37°C
54
und 5% CO2 inkubiert. Am nächsten Tag wurden Virus- und mock-Lysat aufgetaut und dreimal
für 20 sec ultraschallbehandelt. Es folgte die Herstellung zweier Verdünnungsreihen des
Viruslysats 1:10 bis 1:1011 in Reaktionsgefäßen (Cups), wofür in alle Cups 900 µl 1%
FCS/DMEM vorgelegt wurden, und jeweils 100 µl von Stufe zu Stufe überführt wurden. 100 µl
dieser Verdünnungen wurden sodann nach Entfernen des Mediums in die ersten 11 Spalten der
96-Well-plate aufgetragen; die 12. Spalte wurde mit je 100 µl unverdünntem mock-Lysat
beschickt. Die beiden Titerplatten wurden für 2 h bei 37°C inkubiert, danach wurden alle Wells
einmal mit 1% FCS/DMEM gewaschen und anschließend mit 200 µl 1% FCS/DMEM für
14 Tage bei 34°C und 5% CO2 inkubiert. Es folgte die Markierung von intrazellulärem HAV-
Antigen per Immunfluoreszenz:
Nach einmaligem Waschen mit PBS wurden die Zellen in den Titerplatten mit 150 µl/Well
eiskaltem 90% Aceton in PBS für 20 min bei −20°C fixiert, dann dreimal mit PBS gewaschen,
um den primären Antikörper (Maus-anti-HAV IgG "7E7") in einer 1:800 Verdünnung in PBS,
40 µl pro Well, aufbringen zu können und 45 min bei 37°C zu inkubieren. Auf eine dreimalige
Waschung mit PBS folgte die Inkubation mit sekundärem Antikörper (Ziege-anti-Maus, FITC-
konjugiert; 1:80 in PBS) für 45 min bei 37°C. Nach dreimaligem Waschen mit PBS und
Trocknung der Titerplatten erfolgte die Auswertung am Fluoreszenz-Mikroskop (Vergrößerung
200x):
Jede eindeutig HAV-positive Zelle bedeutet ein positives Well. Es wurde alsdann die Anzahl
positiver Wells pro Verdünnungsstufe gezählt und notiert (z.B. 6 von 8 = 0,75 = 75%). Mithilfe
der Kärber-Methode (aus Hawkes, 1979, nach Kärber, 1931) ließ sich nun der Virustiter pro ml
(TCID50/ml) errechnen:
Diese Gleichung vereinfacht sich folgendermaßen:
Als Ergebnis erhält man z.B. "−6", was 106 TCID50/100 µl entspricht, also 107 / ml.
55
2.2.13. Herstellung eines Viruspools (Newcastle Disease-Virus)
Um Zellen im Rahmen von Experimenten mit NDV infizieren zu können, benötigt man einen
Viruspool, welcher aus dem Zellkulturüberstand infizierter Zellen besteht. Hierzu wurden
FRhK-4-Zellen 1:5 in eine 185 cm²-Flasche umgesetzt und nach Erreichen der Konfluenz (nach
2-3 Tagen) mit steriler PBS gewaschen, um mit NDV inoculiert zu werden. 0,5 ml NDV-
Suspension in 19,5 ml 1% FCS/DMEM wurden auf die Zellen aufgebracht und mehrere Tage bei
37°C und 5% CO2 inkubiert, bis sich >50% der Zellen aufgrund virusinduzierter Apoptose
abgelöst hatten, die Zellkultur aber noch nicht vollständig zerstört war (etwa 5 Tage). Der
virushaltige Überstand wurde sodann in ein 50ml-Falcon-Röhrchen überführt und für 7 min bei
1500 rpm in der Tischzentrifuge GS-6R abzentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Nach
Überführen des Überstands in ein neues Röhrchen wurde dieser zu 1 ml in Reaktionsgefäße
aliquotiert und bei −80°C gelagert. Es folgte die Titerbestimmung per CPE.
2.2.14. Endpunkttitration von NDV-Viruspools (TCID50)
Zunächst wurden für die NDV-Titration FRhK-4-Zellen 1:5 in zwei 96-Well-plates umgesetzt
und übernacht bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Nach Erreichen der Konfluenz (2 Tage) folgte
die Herstellung zweier Verdünnungsreihen der NDV-Suspension 1:10 bis 1:1011 in
Reaktionsgefäßen (Cups), wofür in alle Cups 900 µl 1% FCS/DMEM vorgelegt wurden, und
jeweils 100 µl von Stufe zu Stufe überführt wurden. 100 µl dieser Verdünnungen wurden sodann
nach Entfernen des Mediums und Waschen mit steriler PBS in die ersten 11 Spalten der
96-Well-plate aufgetragen; die 12. Spalte wurde mit je 100 µl 1% FCS/DMEM beschickt. Die
beiden Titerplatten wurden für 2 h bei 37°C inkubiert, danach wurden alle Wells einmal mit
steriler PBS gewaschen und anschließend mit 100 µl 1% FCS/DMEM für 6-10 Tage bei 37°C
und 5% CO2 inkubiert, bis vorhandenes Virus auch in hoher Verdünnung zur vollständigen
Zerstörung des Zellrasens durch CPE geführt hatte. Nun konnte auf einfache Weise per
Lichtmikroskop und mithilfe der Kärber-Methode (siehe 2.2.12.) der Titer des NDV-Pools,
ausgedrückt als TCID50/ml, bestimmt werden.
56
2.2.15. Infektion mit Hepatitis A-Virus (HAV)
In allen Experimenten mit HAV wurden Zellen eingesetzt, die bereits 10 (selten 11) Tage vor
dem Umsetzen für das Experiment infiziert worden waren. Dies gewährleistet die vollständige
Infektion der Kultur und die hinreichende Akkumulation viraler Proteine in den Zellen, so dass
zum einen die zu untersuchende Suppression bezüglich des Transkriptionsfaktors IRF-3
vollständig etabliert war und zum anderen die Infektion per Immunfluoreszenz nachweisbar war
(siehe 2.2.19.). FRhK-4-Zellen wurden zunächst 1:6 in 80 cm²-Flaschen umgesetzt und am
nächsten Tag nach einmaligem Waschen mit 1% FCS/DMEM mit HAV/7-Lysat bzw. mock-
Lysat inoculiert (1 ml + 3 ml 1% FCS/DMEM, entspricht etwa MOI 1). Nach zwei Stunden bei
37°C wurde einmal mit 1% FCS/DMEM gewaschen und mit frischem 1% FCS/DMEM für
10 Tage bei 34°C und 5% CO2 inkubiert, wobei bereits nach 7 Tagen ein Mediumwechsel
durchgeführt wurde. Die Zellen konnten nun abtrypsiniert, gezählt und umgesetzt werden (s.u.).
2.2.16. Infektion mit Newcastle Disease-Virus (NDV)
Das Newcastle Disease-Virus diente in den Experimenten stets als starker und verlässlicher,
intrazellulärer Aktivator von IRF-3 bzw. der IFN-β-Induktion.
Reportergen-Induktion (MOI~0,1):
Transfizierte FRhK-4-Zellen in 6cm-Schalen wurden (24 h nach Transfektion) einmal mit
steriler PBS gewaschen und anschließend mit 105 infektiösen Einheiten (TCID50) in 2,5 ml 1%
FCS/DMEM inoculiert, was einer MOI von etwa 0,1 entspricht. Alle übrigen Schalen erhielten
virusfreies Medium. Nach 18 h bei 37°C und 5% CO2 erfolgte die Proteinextraktion (siehe
2.2.26.).
GFP-IRF-3-Translokation (MOI~10):
FRhK-4/GFP-IRF-3-Zellen in 8-Well Chamber slides wurden einen Tag nach Umsetzen einmal
mit steriler PBS gewaschen und mit 4*105 infektiösen Einheiten (TCID50) in 200 µl 1%
FCS/DMEM infiziert, alle übrigen Ansätze erhielten virusfreies Medium. Nach 4 Stunden
Inkubation bei 37°C und 5% CO2 wurde erneut gewaschen und die Zellen zwecks paralleler
Detektion von HAV per Immunfluoreszenz (siehe 2.2.19) fixiert.
57
2.2.17. NDV-Replikationskinetik in FRhK-4-Zellen (One step growth curve)
Um den Nachweis zu erbringen, dass NDV in mock- und HAV-infizierten FRhK-4-Zellen im
zeitlichen Rahmen der Experimente (0-24 h p.i.) gleichermaßen gut repliziert, wurden mock- und
HAV/7-infizierte Zellen FRhK-4-Zellen 10 d p.i. in eine 24-Well-plate (sowie einen Chamber
slide zur Infektionskontrolle per Immunfluoreszenz, siehe 2.2.19.) umgesetzt und am nächsten
Tag im Doppelansatz NDV-infiziert. Hierfür wurde einmal mit steriler PBS gewaschen und die
Zellen anschließend mit 106 infektiösen Einheiten (TCID50) NDV in insgesamt 500 µl 1%
FCS/DMEM, entsprechend einer MOI von etwa 10, für 1 h bei 37°C inoculiert. Nach
zweimaliger Waschung mit steriler PBS wurden alle Wells mit 600 µl 1% FCS/DMEM versorgt
(= Nullpunkt). Es erfolgte eine Inkubation für 4, 8 und 24 h bei 37°C und 5% CO2, die
Zellkulturüberstände wurden sodann für 20 sec bei 14000 rpm (Tischzentrifuge 5415 C)
zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen, und bei −80°C gelagert. Von jeder NDV-Probe
wurde im folgenden eine doppelte Verdünnungsreihe (1:10 bis 1:108) in gläsernen Wassermann-
Röhrchen angesetzt, die mock-infizierten Proben wurden unverdünnt eingesetzt. Die NDV-
Titration wurde ansonsten wie unter 2.2.14. beschrieben durchgeführt und der Titer sechs Tage
danach anhand des CPE ermittelt.
2.2.18. Zellzahlbestimmung
Nach dem Abtrypsinieren von Zellen soll deren Zahl pro Milliliter Suspension bestimmt werden,
um bei der Umsetzung in 6cm-Schalen 3,5*105 bis 4*105 Zellen einsetzen zu können. 10 µl
abtrypsinierter, in 10% FCS/DMEM aufgenommener Zellen wurden hierfür mit 10 µl Trypan
Blue gemischt, welches aufgrund der "dye exclusion" durch lebende Zellen nur tote Zellen blau
anfärbt. Für die Zählung wurde eine Fuchs-Rosenthal-Kammer mit den 20 µl Suspension
beladen und die Zellzahl von zweimal 4 B-Feldern notiert und gemittelt. Die vorherige
Verdünnung wurde durch Verdoppeln des Wertes kompensiert, und die Zellzahl pro Milliliter
der Ausgangs-Suspension konnte durch Multiplikation mit dem "Kammerfaktor" 5000 erhalten
werden.
58
2.2.19. Indirekte Immunfluoreszenz zur HAV-Detektion
Mithilfe des monoklonalen Maus-anti-HAV IgG "7E7" soll intrazelluläres HAV-Antigen per
Immunfluoreszenz visualisiert werden.
Einfache Infektionskontrolle (96-Well-plate):
Um eine HAV-Infektion 11 d p.i. direkt vor Plasmid-Transfektion zu überprüfen, wurden
HAV/7-infizierte bzw. mock-Lysat-behandelte FRhK-4-Zellen in je 4 Wells einer 96-Well-plate
umgesetzt (etwa 15000 Zellen pro Well) und übernacht bei 37°C und 5% CO2 inkubiert. Am
nächsten Tag wurde dreimal mit PBS gewaschen und die Zellen anschließend mit 100 µl 90%
Aceton in PBS für 20 min bei −20°C fixiert, und erneut dreimal mit PBS gewaschen, um den
primären Antikörper (Maus-anti-HAV IgG "7E7") in einer 1:800 Verdünnung in PBS, 40 µl pro
Well, aufbringen zu können und 45 min bei 37°C zu inkubieren. Auf eine kurze und eine
zehnminütige Waschung mit PBS folgte die Inkubation mit sekundärem Antikörper (Ziege-anti-
Maus, FITC-konjugiert; 1:80 in PBS) für 45 min bei 37°C. Nach dreimaligem Waschen mit PBS
und Trocknung der Titerplatte erfolgte die Auswertung am Epifluoreszenz-Mikroskop
(Vergrößerung 200x, Anregungswellenlängen 450-490 nm).
HAV-Paralleldetektion mit GFP-IRF-3 (Chamber slide):
Mock- und HAV/7-infizierte FRhK-4/GFP-IRF-3-Zellen waren tags zuvor 1:5 in 8-Well
Chamber slides umgesetzt worden. Auf die vierstündige NDV-Induktion (siehe 2.2.16) folgten
eine einmalige Waschung mit steriler PBS, eine 10-minütige Fixierung der Zellen mit 4%
Paraformaldehyd und die Permeabilisierung der Membranen mittels 15 min Inkubation in 0,2%
Triton X-100, alles bei RT. Die Kammeraufsätze auf den Plastikobjektträgern wurden nun
entfernt. Im Anschluss an dreimaliges Waschen mit PBS wurden die Präparate 45 min bei 37°C
mit 1:600 in PBS verdünntem Maus-anti-HAV IgG "7E7" inkubiert (40 µl pro Well).
Ungebundene Antikörper wurden durch dreimal 5 min Waschen in PBS entfernt, die Markierung
des primären Antikörpers geschah mittels Texas Red-konjugiertem Ziege-anti-Maus-Antikörper
(50 µl), der 1:400 in PBS verdünnt aufgetragen wurde. Nach 45 min bei 37°C wurde dreimal
5 min mit PBS gewaschen, der Objektträger komplett getrocknet und das Präparat mit 10 µl pro
Well Glycerol/PBS eingebettet und mit Deckgläschen und Immersionsöl versehen. Die
Auswertung (Vergrößerung 400x, Anregungswellenlänge 546 nm) erfolgte am Epifluoreszenz-
mikroskop unter Verwendung eines 40x Ölimmersions-Objektivs.
Fotos wurden stets mithilfe einer Digitalkamera und dem dazugehörenden Software-Paket
"analySIS" aufgenommen.
59
2.2.20. Intrazelluläre Lokalisation von GFP-IRF-3
Die Lokalisation von GFP-markiertem IRF-3 in FRhK-4/GFP-IRF-3-Zellen per
Epifluoreszenzmikroskopie erfolgte einen Tag nach 1:5 Umsetzen in 8-Well Chamber slides, es
wurden mock- und HAV/7-infizierte Zellen 10 d p.i. verwendet. Als Translokationsinduktor
wurde eine NDV-Infektion (MOI~10) benutzt (siehe 2.2.16.), 4 h p.i. wurden alle Zellen fixiert,
permeabilisiert und mit Antikörpern intrazelluläres HAV-Antigen markiert (siehe 2.2.19.). Die
Auswertung (Vergrößerung 400x) erfolgte am Epifluoreszenzmikroskop (GFP: Filter 450-
490 nm; HAV/Texas Red: Filter 546 nm) unter Verwendung eines 40x Ölimmersions-Objektivs.
Fotos wurden mithilfe einer Digitalkamera und dem dazugehörenden Software-Paket "analySIS"
aufgenommen.
Die Paralleldetektion von GFP-IRF-3 und HcRed erfolgte 24 h nach transienter Cotransfektion
gleicher Mengen beider Expressionsvektoren bei 200-facher Vergrößerung (Anregungs-
Wellenlängen siehe oben).
2.2.21. Transfektion nach der Calciumphosphat-Methode
Plasmid-DNA soll in eukaryotische Zellen eingebracht werden. Hierfür wird eine Ca2+-Ionen-
DNA-Lösung mit einer Hydrogenphosphat-haltigen Lösung zusammengebracht. Es bilden sich
feine Kristallpräzipitate aus Calciumphosphat, in welche die DNA eingeschlossen ist. Die
Kristalle werden auf die Zellen gebracht, welche das Präzipitat und damit das Plasmid
aufnehmen, um letztlich plasmidcodierte Proteine zu exprimieren:
Einen Tag vor der Transfektion wurden die Zellen im Verhältnis 1:4 in 10cm-Zellkulturschalen
gesetzt, so dass sie subkonfluent gewachsen waren. 2,5 h vor der Transfektion wurden je 10 ml
frisches 10% FCS/DMEM auf die Zellen gebracht, und während dieser Zeit konnten die
Transfektionsmixe angesetzt werden. Jede Schale wurde mit 1 ml Mix transfiziert, welcher in
Reaktionsgefäßen hergestellt wurde.
Für den Transfektionsmix wurden 20 µg DNA pro Ansatz mit kaltem TE-Puffer auf 438 µl
aufgefüllt und 62 µl kaltes 2 M Calciumchlorid hinzugetropft. Die auf Eis gestellte Lösung
konnte alsdann tropfenweise in 500 µl kalte 2x HBS gebracht werden, und zwar unter stetigem
Anschnipsen des Reaktionsgefäßes. Die Ansätze wurden 15-25 min auf Eis stehen gelassen, um
eine Kristallbildung (Calciumphosphat/DNA) zu ermöglichen. Je 1 ml Transfektionsmix wurde
ohne Abnahme des Mediums auf die Zellen aufgetropft und diese für 3,5 h bei 37°C und 5%
60
CO2 inkubiert. Am Ende dieser Zeit erhielten alle Schalen für 90 sec 3 ml 15% Glycerol-
Schocklösung, um die Kristallaufnahme zu verbessern. Nach zweimaligem Waschen mit je 5 ml
1% FCS/DMEM wurden die Zellen mit 10 ml 10% FCS/DMEM für 21 h bei 37°C und 5% CO2
gehalten.
2.2.22. Transfektion mittels jetPEI transfection reagent
In der vorliegenden Arbeit kam in allen Experimenten mit transienten Transfektionen jetPEI
(Qbiogene) zum Einsatz, um Plasmid-DNA in eukaryotische Zellen einzubringen. Das
kationische Polymer jetPEI (Poly-ethylenimin) bildet über die negativen Ladungen der Plasmid-
DNA mit dieser Komplexe, wobei eine positive Nettoladung die Interaktion mit anionischen
Proteoglykanen auf der Zelloberfläche und die Aufnahme der Komplexe per Endocytose
ermöglicht. Das Verhältnis betrug N/P = 5, was bedeutet, dass 5 positive Stickstoffladungen des
Imins auf ein Phosphat der DNA kommen. Es wurde stets mit 5 µg Gesamt-DNA-Menge pro
6cm-Schale transfiziert, wobei jeweils 10 µl jetPEI eingesetzt wurden; erhöhte Mengen jetPEI
waren hierbei dem Zustand der Zellen abträglich, obschon die Transfektionseffizienz sichtbar
anstieg. Die Durchführung erfolgte nach den Angaben des Herstellers: Am Tage vor der
Transfektion wurden, gegebenenfalls nach Zellzahlbestimmung, 3,5 - 4*105 Zellen pro 6cm-
Schale umgesetzt, so dass die Konfluenz am Folgetag 60-80% betrug. Pro Transfektionsansatz
wurden zweimal 250 µl sterile 150 mM NaCl in Falconröhrchen vorgelegt. In eines davon
wurden 10 µl jetPEI pipettiert und 10 sec gevortext, in das andere wurde eine Gesamt-DNA-
Menge von 5 µg gegeben, meistens 4 µg Expressionsvektor plus 1 µg Reportervektor, und
ebenfalls 10 sec gevortext. Anschließend wurde die jetPEI-Lösung als Ganzes in die DNA-
Lösung überführt, 10 sec gevortext und 20 min bei RT zwecks Komplex-Bildung stehen
gelassen. Die Transfektionsmixe können problemlos in entsprechenden Vielfachen hergestellt
werden. In der Zwischenzeit wurde bei den 6cm-Schalen ein Mediumwechsel mit 4,5 ml 10%
FCS/DMEM durchgeführt und danach die fertigen 500 µl Transfektionsmix schneckenförmig in
die Schalen getropft. Das Volumen des Mixes nahm folglich ein Zehntel des Gesamtvolumens in
Anspruch. Nach sorgfältigem Schwenken der Schälchen wurden diese übernacht bei 37°C und
5% CO2 inkubiert. Am nächsten Tag erfolgte je nach Ansatz ein Mediumwechsel zu 1%
FCS/DMEM oder eine NDV-Infektion.
61
2.2.23. Stabile Plasmid-Transfektion
Für eine stabile Transfektion von Zellen mit Plasmid-DNA ist ein Resistenzgen vonnöten,
welches in dem transfizierten oder einem cotransfizierten Plasmid enthalten sein muss. Mithilfe
eines in eukaryotischen Zellen wirksamen Antibiotikums kann dann ein Selektionsdruck
ausgeübt werden, welcher nichttransfizierte Zellen absterben lässt.
FRhK-4/GFP-IRF-3:
FRhK-4-Zellen wurden in einer 10cm-Schale mittels Calcium-Phosphat-Transfektion mit 20 µg
des Plasmids pcDNA3/GFP-IRF-3(wt) transfiziert. Nach 4 Tagen begann die Selektion mit 1%
bzw. 10% FCS/DMEM mit Zusatz von 600 µg/ml G418. Nach Beginn des deutlichen
Absterbens nichttransfizierter Zellen wurden die Zellen unter fortgesetzter Verwendung von
G418 mehrfach umgesetzt. Die stabile Population GFP-IRF-3-exprimierender Zellen war sodann
gebrauchsfertig.
FRhK-4/TLR3:
FRhK-4-Zellen wurden in einer 10cm-Schale mittels jetPEI-Transfektion mit 13 µg des Plasmids
pUNO-hTLR3 (Invivogen) transfiziert, hierfür wurden 26 µl jetPEI verwendet. Nach 48 h
begann die Selektion mit 1% bzw. 10% FCS/DMEM mit Zusatz von 10 µg/ml Blasticidin S.
Nach Beginn des deutlichen Absterbens nichttransfizierter Zellen wurden die Zellen unter
fortgesetzter Verwendung von Blasticidin S mehrfach umgesetzt. Die Herstellung dieser stabilen
Population und die entsprechenden Reporterexperimente wurden von Ines L. Mordhorst im
Rahmen einer parallelen Diplomarbeit durchgeführt.
Vor Beginn der Experimente mit beiden stabilen Populationen wurde stets auf den Einsatz der
Selektionsantibiotika verzichtet.
2.2.24. poly(IC)-Transfektion mittels DEAE-Dextran
Die Reportergen-Induktion erfolgte zuweilen durch intrazelluläre, künstliche dsRNA [poly(IC)].
Mittels der DEAE-Dextran-Methode wurde mit 20 µg/ml poly(IC) transfiziert, als Kontrollen
dienten DEAE-Dextran bzw. serumfreies DMEM. Die Transfektion beruht hierbei auf der
Aufnahme der poly(IC)/Dextran-Komplexe, welche dank der Diethylaminoethyl-Reste des
Dextrans eine positive Nettoladung besitzen. 48 h nach der Plasmidtransfektion wurde das
Medium von den Zellen entfernt, eine Waschung mit 2 ml PBS durchgeführt und anschließend
2 ml des Induktionsmixes pro 6cm-Schale zugegeben. Dieser setzte sich aus serumfreiem
62
DMEM mit 20 µg/ml poly(IC) und 100 µg/ml DEAE-Dextran zusammen, für die DEAE-
Dextran-Kontrolle wurde poly(IC) durch die entsprechende Menge DEPC-Wasser ersetzt, die
Medium-Kontrolle bestand aus serumfreiem DMEM. Einer Inkubation von 2 h bei 37°C und 5%
CO2 folgte eine einmalige Waschung mit je 2 ml PBS und die Zugabe von 2,5 ml 1%
FCS/DMEM. Nach 18 h bei 37°C und 5% CO2 folgte die Lyse der Zellen.
2.2.25. Extrazelluläre poly(IC)-Stimulation
Die TLR3-vermittelte Reportergen-Induktion in FRhK-4/TLR3-Zellen (durchgeführt im Rahmen
einer parallelen Diplomarbeit von Ines L. Mordhorst) wurde 72 h nach Plasmidtransfektion
durch extrazelluläre Zugabe von 100 µg/ml poly(IC) in 2 ml serumfreiem DMEM für 2 h bei
37°C und 5% CO2 erreicht, wobei zuvor und im Anschluss mit steriler 2 ml PBS gewaschen
wurde. Nach Zugabe von 2 ml 1% FCS/DMEM wurde bei 37°C und 5% CO2 inkubiert, 18 h
nach Stimulation wurden die Zellen lysiert.
2.2.26. Freeze & Thaw-Lyse zur Proteinextraktion
Im Anschluss an Transfektion und Infektion/Induktion sollten die Zellen durch die während
wiederholtem Einfrieren und Auftauen auftretende Wasserkristallbildung lysiert und so die
löslichen Proteine gewonnen werden: Nach Mediumabnahme und zweimaligem Waschen mit je
1 ml kalter PBS wurde 1 ml kalter, EDTA-haltiger TEN-Puffer auf die Zellen gebracht. Die
Schalen wurden 15 min auf Eis gestellt, für 5 min auf RT erwärmt, die Zellen abgespült, somit
suspendiert, und in Reaktionsgefäße auf Eis überführt. Die Suspension wurde sodann 1 min bei
14000 rpm zentrifugiert (Tischzentrifuge 5415 C), der Überstand dekantiert und dessen Rest
abpipettiert. Es folgten eine Resuspension des Zellpellets in 100 µl kalter 0,25 M Tris-HCl und
ein dreimaliges Einfrieren und Auftauen in unter −80°C kaltem Ethanol (mit Trockeneis, 5 min)
bzw. im 37°C-Thermomixer (2 min). Das Lysat wurde 5 min in der Tischzentrifuge 5415 C bei
14000 rpm zentrifugiert und der proteinhaltige Überstand in neue Reaktionsgefäße auf Eis
überführt. Die Proben wurden nach Proteinbestimmung und Reporter-Assay bei −80°C gelagert.
63
2.2.27. Proteinbestimmung nach Bradford
Die Protein-Konzentration in einer Lösung kann mithilfe von Bradford-Reagens bestimmt
werden, welches u.a. Coomassie-Blau enthält. Dieses erfährt durch Bindung an Protein eine
Verschiebung des Absorptionsmaximums auf 595 nm, eine konzentrationsabhängige Reaktion,
die unter Verwendung einer abgespeicherten Bovines Serumalbumin-(BSA-)Eichgerade im
Spektralphotometer für die Bestimmung unbekannter Lösungen nützlich ist: 5 µl jeder Probe
wurde doppelt in Plastik-Einmal-Küvetten vorgelegt, zusätzlich ein blank (5 µl Tris-HCl). Es
folgten die Zugabe von 1 ml 1x Bradford-Reagens (Bio-Rad Protein Assay) im 15 sec-Takt von
Probe zu Probe, Mischen, und nach genau 15 min die photometrische Messung der Absorption
bei 595 nm, ebenfalls im 15 sec-Takt. Das Photometer gab die Proteinkonzentration als "mg/ml"
aus, nach Freeze & Thaw-Lyse lagen die Werte üblicherweise bei 1,5 bis 3 mg/ml.
2.2.28. Luciferase-Assay
Das Luciferase Assay System (Promega) ermöglicht die Messung der Luciferase-Reporter-
Aktivität in Protein-Extrakten im Luminometer nach Zugabe von Leuchtkäfer-Luciferin. Die
Durchführung ist an den Herstellerangaben orientiert: 20 µg Proben-Protein wurden mit 1x
Lysereagens (CCLR, Promega) auf 20 µl aufgefüllt und in 96-Well Sample plates mit
Rundboden überführt. Als blank dienten 20 µl Lysereagens. Nach zügiger Zugabe von je 100 µl
Luciferase-Substrat (luciferase assay reagent, Promega) und zweimaliger Aspiration wurden die
luminescence counts per second (LCPS) in 10 sec-Zeiträumen im Wallac-Luminometer
gemessen. Nach Subtraktion des blank-Wertes lagen die fertigen Messwerte für die Reportergen-
Aktivität der Proben vor.
2.2.29. CAT-ELISA
Zur Messung der Chloramphenicol-Acetyltransferase-(CAT-)Reporter-Expression in FRhK-4-
Zell-Extrakten wurde das CAT-ELISA Kit von Roche verwendet, welches als indirekter
Sandwich-ELISA eine der CAT-Proteinmenge proportionale Farbreaktion (Absorption bei
405 nm) als Messgröße im Vergleich zur stets mitgeführten Standardgerade verwendet. Die
Durchführung entspricht den Herstellerangaben: 100 µg Probenprotein wurden in den anti-CAT-
64
beschichteten Mikrotiterwells mit Probenpuffer (Roche) auf 200 µl aufgefüllt (Einfach-
bestimmung), außerdem wurden 200 µl aus CAT-Stammlösung und Probenpuffer hergestellte
CAT-Standards (0, 1000, 500, 250, 125 pg/ml) im Doppelansatz aufgetragen, um später eine
Standardgerade zu erhalten. Der blank blieb leer. Die Wells wurden mit Klebefolie verschlossen
und für 2 h bei 37°C inkubiert.
Alle Wells wurden fünfmal mit 200 µl 1x Waschpuffer (Roche) gewaschen, anschließend
wurden 200 µl anti-CAT-DIG (1:100) pro Well aufgetragen und 1 h bei 37°C mit Klebefolie
inkubiert. Nach erneuter fünfmaliger Waschung folgte die Auftragung von 200 µl pro Well des
anti-DIG-POD-Fragments (1:133,33), einem Peroxidase-konjugierten antigenbindenden
Fragment eines Antikörpers, welches gegen die Digoxigenin (DIG)-Markierung des primären
Antikörpers gerichtet ist. Die einstündige Inkubation bei 37°C wurde mit einer abermals
fünfmaligen Waschung mit Waschpuffer beendet, im Anschluss daran wurden 200 µl der
gebrauchsfertigen, ABTS und H2O2 enthaltenden Peroxidasesubstratlösung aufgetragen, diesmal
unter Berücksichtigung der beiden blank-Wells. Die enzymatische Reaktion mit grünblauem
Farbprodukt lief für 30 min bei RT auf dem Taumler, danach wurden alle Ansätze im ELISA-
Reader bei 405 nm Wellenlänge (Referenz: 490 nm) gemessen und vom Computer (Software:
SoftmaxPro) anhand der Standardgerade die CAT-Mengen in den Proben berechnet.
2.2.30. Diskontinuierliche Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die Proteine aus Zellextrakten sollen im denaturierenden SDS-Polyacrylamid-Gel
elektrophoretisch der Größe nach aufgetrennt werden. Man macht sich hierbei die negative
Ladung des SDS zunutze, welches nach Assoziation mit hydrophoben Aminosäureresten der
Proteine diesen eine proportional negative Nettoladung verleiht, so dass sie im elektrischen Feld
durch das Gel zur Anode wandern. Die Proteine werden zunächst im 3% Sammelgel an der
Grenze zum 10% Trenngel angehäuft und dann aufgetrennt (Diskontinuierliche PAGE). Es
wurde die Methode nach Laemmli (1970) in modifizierter Weise genutzt. Zunächst wurden Glas-
und Keramikplatten sowie die Spacer und Kämme mit 2-Propanol und Ethanol gereinigt und in
der Gelkammer "Mighty Small" zusammengesetzt. Das 10%ige Trenngel (siehe Abschnitt
"Material") wurde für 10 min mittels Saugpumpe entgast, mit Ammoniumpersulfat und TEMED
versetzt, geschwenkt und aspiriert und letztlich in die Gelkammer pipettiert. Das noch flüssige
Gel wurde umgehend mit 0,1% SDS überschichtet und übernacht bei RT polymerisieren
gelassen. Am nächsten Tag wurde analog das 3%ige Sammelgel hergestellt, in die Kammer auf
65
das Trenngel pipettiert und der Gelkamm eingeschoben. Während der einstündigen
Polymerisation des Gels wurden die Proteinproben vorbereitet. Hierfür wurden 20 µg Protein in
Reaktionsgefäßen mit mindestens 1:6 Protein-Probenpuffer versetzt (ad 20-25 µl), zweimal
1 min ultraschallbehandelt und für 5 min bei 95°C denaturiert. Der Protein-Marker (5 µl) wurde
lediglich mit 15 µl Probenpuffer versetzt. Nun wurden die Gele in die Elektrophorese-Kammer
eingesetzt und letztere mit Elektrophorese-Puffer befüllt. Es folgte das entfernen der Gelkämme,
eine Spülung der Geltaschen mit 0,1% Bromphenolblau und danach mit Elektrophorese-Puffer,
beides mittels Spritze. Diese Prozedur färbt die Taschenränder blau und macht so die Taschen
sichtbar. Nach Auftragung der Proben und des Markers wurde das Gel für 1,5 bis 2 Stunden bei
80 V laufen gelassen. Es folgte eine Inkubation in Renaturierungspuffer für 30 min bei RT auf
dem Taumler. Währenddessen wurden je eine Nitrocellulosemembran und je vier Whatman-
Papiere pro Gel zugeschnitten. Gel und Membran wurden im Anschluss für 30 min in Blotting-
Puffer auf dem Taumler inkubiert, gefolgt vom Western-Blot (Immunoblot).
2.2.31. Immunoblot
Die in der SDS-PAGE (siehe oben) aufgetrennten Proteine im Gel sollten nun per Elektroblot
auf eine Nitrocellulose-Membran übertragen werden, um letztlich eine spezifische Markierung
und Detektion des gesuchten Proteins mittels Antikörpern und einer enzymvermittelten
Lichtreaktion mit Filmbelichtung als Nachweis-System zu ermöglichen. Nach der beschriebenen
Elektrophorese (PAGE) und der Inkubation des Gels in Blotting-Puffer wurde das Gel rücklings
auf die Membran gelegt und beides mit je zwei Whatman-Papieren umgeben. In der mit
Blotting-Puffer gefüllten Blotting-Kammer wurde sodann der Transfer der Proteine auf die
Membran im elektrischen Feld für 2 h bei 1,6-1,8 A und 4°C vollzogen. Unspezifische
Bindestellen wurden danach während einer vierstündigen Blockierung mit
TBST/Trockenmagermilch bei RT auf dem Taumler abgesättigt. Die Inkubation mit dem in
TBST/Trockenmagermilch verdünnten primären Antikörper (Maus-anti-FLAG 1:9200) konnte
dann übernacht bei 4°C auf dem Taumler stattfinden. Am nächsten Tage wurde die Membran
dreimal 5 min in TBST bei RT auf dem Taumler gewaschen, um den sekundären Antikörper
(Ziege-anti-Maus-HRP 1:400) in TBST/Trockenmagermilch verdünnt für 5 h aufbringen zu
können, wiederum bei RT auf dem Taumler. Nach erneuter dreimaliger Waschung in TBST
wurde das ECL-Reagens (enhanced chemiluminescence) vorbereitet, welches eine Meerrettich-
Peroxidase (HRP)-vermittelte Lichtreaktion ermöglicht. Nach einminütiger Einwirkung des
66
ECL-Mixes auf der Membran wurde ein Kodak Biomax-Film dieser je nach Bedarf für 20 sec
bis 2 min ausgesetzt und sofort im Anschluss in der Entwicklermaschine entwickelt und fixiert.
Die erhaltenen Schwärzungen entsprechen dann der Bande des gesuchten Proteins auf der
Membran, wobei Größe (kDa) und relative Menge ablesbar sind.
2.2.32. Herstellung von Leervektoren durch Insert-Excision und Religation
In Reportergen-Experimenten mit Überexpression bestimmter Proteine werden als Kontrollen
Leervektoren eingesetzt, die das proteincodierende Insert nicht besitzen. Liegt der Leervektor
nicht vor, muss er durch Herausschneiden (Excision) des Inserts mittels Restriktionsenzymen
und anschließender Ligation des offenen Vektors eigenhändig hergestellt werden. Im Falle der
RIG-I/RIG-IC- und TRIF-Expressionsvektoren geschah dies durch Inkubation von 2x 5 µg
pEF-Flag-RIG-I full bzw. PL 1004 TRIF (Flag-TRIF) mit 10 U KpnI bzw. HindIII+KpnI für 2 h
bei 37°C mit anschließender Auftrennung der Plasmid-Fragmente im 0,6% Low melting point-
(LMP-)Agarose-Gel (60V). Die entsprechenden Leervektorbanden wurden auf dem UV-
Transluminator mittels Skalpell herausgeschnitten. Es folgte eine Phenol-Ether-Extraktion der
DNA aus dem LMP-Gel (2.2.33.), der Erfolg der Extraktion wurde per Kontrollgel mit 2 der
20 µl DNA-Lösung überprüft.
Hieran schloss sich eine Klenow-Fragment-Auffüll-Reaktion überhängender DNA-Enden an,
welche auf der Fähigkeit des großen Fragments der E. coli-DNA-Polymerase I, genannt Klenow-
Fragment, freie 5'-DNA-Enden aufzufüllen und freie 3'-Enden abzubauen, beruht; die so
erhaltenen blunt ends lassen sich anschließend besser mittels einer DNA-Ligase verbinden. Die
verbliebenen 18 µl Vektor-DNA aus der LMP-Extraktion wurden dafür mit 4 µl 10x Klenow-
Puffer (enthält 0,1 M MgCl2), 2,5 U Klenow-Fragment und 0,1 mM dNTPs (Endkonzentration)
versetzt und auf 40 µl mit Aqua dest. aufgefüllt. Der Ansatz wurde für 20 min bei 22°C (RT)
inkubiert; die Reaktion wurde durch 15 min Inkubation bei 65°C im Thermomixer 5436 beendet.
Die Ligation des linearisierten, blunt-endigen Leervektors wurde durch Zusetzen von 5 µl 10x
Ligase-Puffer, 2,5 µg BSA und 1 U T4 DNA-Ligase in insgesamt 50 µl Reaktionsvolumen
vorbereitet. Nach 5 min Inkubation bei 37°C und 60 min Inkubation bei RT fand die
Ligationsreaktion bei 14°C im Kühlblock übernacht statt. Am nächsten Tag wurde erneut 1 U
Ligase zugesetzt und noch einmal 2 h bei 14°C inkubiert. Mit 0,2 µl der nun fertig gestellten
Leervektoren "pEF-BOS" bzw. "pCR3" wurden kompetente E. coli transformiert und ausplattiert
(2.2.1.), um nach DNA-Extraktion aus gepickten Klonen (Miniprep, 2.2.2.) per
67
Restriktionsanalyse die Qualität der Leervektoren zu überprüfen. Es folgte eine Maxiprep der
Plasmide (2.2.3.).
2.2.33. Phenol-Ether-Extraktion von DNA aus LMP-Agarose-Gel
Um Plasmid-DNA nach Behandlung mit Restriktionsenzymen und Auftrennung im LMP-
Agarose-Gel zurückzugewinnen, muss sie aus dem Gel extrahiert werden. Die ausgeschnittenen
Gelstücke (2.2.32.) wurden bei maximal 65°C im Thermomixer 5436 geschmolzen, was den
Sinn hinter der Verwendung der low melting point-Agarose verdeutlicht. Nach Zugabe von 1 VT
Aqua dest. (56°C) und wiederum 1 VT TE-gesättigtem Phenol (56°C) wurde 2 min gevortext
und 2 min bei 14000 rpm (Tischzentrifuge 5415 C) zentrifugiert, um eine Phasentrennung zu
erreichen. Die obere, wässrige, DNA-haltige Phase wurde in ein neues Reaktionsgefäß überführt
und mit 1 VT Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol gemischt, 2 min geschüttelt, 2 min bei
14000 rpm zentrifugiert und die obere Phase in ein neues Reaktionsgefäß überführt. Dieses Mal
wurde 1 VT TE-gesättigtes Phenol zugegeben, geschüttelt und zentrifugiert (s.o.) und die obere
Phase in einem neuen Reaktionsgefäß mit 2,5 VT wassergesättigtem Ether für 2 min geschüttelt
und für 2 min bei 14000 rpm zentrifugiert. Die obere Etherphase wurde verworfen und die
untere, wässrige Phase noch zweimal mit wassergesättigtem Ether gewaschen (s.o.). Der
Etherschritt diente der Entfernung des Phenols. Die untere, wässrige Phase wurde zwecks
Fällung der DNA mit 1/10 VT 3 M Natriumacetat (pH 4,8) und 2,5 VT Ethanol versetzt,
gemischt, und für 1 h bei −80°C inkubiert. Die Pelletierung der DNA geschah durch 20 min
Zentrifugation bei 14000 rpm (Tischzentrifuge 5415 C) und 4°C. Der Überstand wurde
verworfen und das Pellet zweimal mit 70% Ethanol gewaschen (s.o.). Nach Trocknung des
Pellets in der SpeedVac wurde die DNA in 20 µl Aqua dest. aufgenommen. 2 µl der DNA-
Lösung wurden für ein Kontroll-Gel aufgewendet, der Rest fiel Klenow-Reaktion und Ligation
zwecks Schließung des linearisierten Vektors anheim (2.2.32.).
2.2.34. RNA-Extraktion (AGPC-Methode) (Chomczynski & Sacchi, 1987, verändert)
Es soll die RNA aus einer Zellsuspension extrahiert werden, und zwar mithilfe der "sauren
Guanidinthiocyanat-Phenol-Chloroform-Methode" (AGPC). Die erhaltene Nucleinsäure enthält
z.B. rRNA, mRNA aber auch DNA-Reste. Alle einzusetzenden Lösungen enthalten dabei
68
RNase-freies DEPC-Wasser. Zunächst wurden entsprechende, bei −80°C eingefrorene FRhK-4-
oder MRC-5-Zellpellets, entsprechend maximal 80 cm² Kulturfläche, in 200 µl Aqua dest.
resuspendiert und mit 500 µl Lösung D versetzt und gevortext. Lösung D enthält
Guanidinthiocyanat, welches aufgrund seiner Reaktivität die Zellen umgehend lysiert und zudem
RNasen u.a. inaktiviert. Zur Entfernung von Protein und großen Teilen der DNA wurden 100 µl
1 M Natriumacetat (pH 4), 500 µl wassergesättigtes Phenol und 100 µl
Chloroform/Isoamylalkohol (49:1) zugegeben, 10 sec kräftig geschüttelt und 45 min auf Eis
inkubiert. Nach Zentrifugation für 20 min bei 10000 rpm und 4°C in der Kühlzentrifuge 5403
konnte die obere, wässrige, RNA-haltige Phase abgenommen und in ein neues Reaktionsgefäß
überführt werden. Die RNA wurde sodann durch Zugabe von 1 VT eiskaltem Isopropanol,
Inkubation für 1 h bei −80°C und daran anschließende Zentrifugation für 20 min bei 4°C und
10000 rpm (Kühlzentrifuge 5403) präzipitiert. Das Pellet erfuhr eine zweimalige Waschung mit
eiskaltem 75% Ethanol und eine fünfminütige Vakuumtrocknung in der SpeedVac. Das
getrocknete RNA-Pellet wurde schließlich in 43 µl DEPC-Wasser aufgenommen und bei −80°C
eingefroren. Es folgten DNase-Verdau und erneute Extraktion.
2.2.35. DNase-Verdau und Phenol-Chloroform-Extraktion nach RNA-Extraktion
Die nach der RNA-Extraktion verbliebene Rest-DNA soll mithilfe von DNase abgebaut werden.
Anschließend muss die RNA zur Entfernung von DNase und deren Puffer erneut mithilfe von
Phenol und Chloroform extrahiert werden. Für den DNase-Verdau wurden die 43 µl aus der
Extraktion (s.o.) in Reaktionsgefäßen (Cups) mit 5 µl 10x DNase-Puffer und 2 U DNase (2 µl)
versetzt und 30 min bei 37°C inkubiert. Dem gesamten 50 µl-Ansatz wurden nun 450 µl DEPC-
Wasser und 500 µl TE-gesättigtes Phenol hinzugefügt. Zweiminütiges Schütteln wurde mit
2 min Zentrifugation bei 14000 rpm (Tischzentrifuge 5415 C) beendet, die obere, wässrige Phase
wurde in ein neues Cup überführt und mit 250 µl Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) sowie
250 µl TE-gesättigtem Phenol versetzt. Nach erneutem Schütteln und Zentrifugieren wurde die
obere Phase mit 500 µl Chloroform/Isoamylalkohol vermischt, 2 min geschüttelt und 2 min
zentrifugiert. Der wässrigen Oberphase wurden nach Überführen in ein neues Cup 1/10 VT 3 M
Natriumacetat und 2,5 VT eiskalter Ethanol hinzugefügt; es wurde gemischt und die RNA nach
Inkubation für 1 h bei −80°C durch Zentrifugieren für 30 min bei 14000 rpm und 4°C gefällt
(Tischzentrifuge 5415 C). Das Pellet wurde zweimal mit 1 ml eiskaltem Ethanol gewaschen
69
(Zentrifugation 15 min bei 14000 rpm und 4°C), in der SpeedVac für 4 min vakuumgetrocknet
und in 20-50 µl DEPC-Wasser aufgenommen. Das Lösen der RNA wurde durch schüttelnde
Inkubation für 10 min bei 65°C im Thermomixer erleichtert. Vor der Messung der RNA-
Konzentration im Photometer wurden die Proben bei −80°C eingefroren und gelagert.
2.2.36. Photometrische Konzentrationsbestimmung von RNA
Auf jede RNA-Extraktion mit DNase-Verdau folgte eine photometrische Konzentrations-
bestimmung der erhaltenen RNA, wobei 100 µl einer 1:50-Verdünnung in DEPC-Wasser in
Quarzküvetten bei 260 nm gegen DEPC-Wasser gemessen wurden. Eine OD260 entspricht 40 µg
RNA/ml.
2.2.37. RT-PCR (Reverse transcription-polymerase chain reaction)
Die Expression eines bestimmten zellulären Gens soll durch Nachweis der entsprechenden
mRNA erfolgen. Hierfür wird die gesuchte mRNA zunächst mithilfe eines spezifischen
Oligonucleotids (antisense-Primer) und dem Enzym Reverse Transkriptase (RT) in
komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. Diese kann dann in zyklischer Weise mithilfe der
Taq-DNA-Polymerase vervielfacht werden (polymerase chain reaction, PCR). Die
Amplifikation der mRNA für β-Actin dient dabei als eine Kontrolle für die eingesetzte RNA-
Menge. Des weiteren werden Kontrollen ohne RT oder ohne RNA mitgeführt. Plasmid-
Kontrollen für TRIF und RIG-I wurden mit 100 ng in die PCR eingesetzt. Die reverse
Transkription und die PCR laufen in getrennten Reaktionsgefäßen, man spricht von einem Two-
step-Protokoll. Alle Lösungen basieren auf RNase-freiem DEPC-Wasser. Als erstes wurde eine
Vorverdünnung der extrahierten RNA vorgenommen, und zwar auf 200 ng/µl. Es kamen 2 µg
RNA für die Amplifikation von TLR3-, TRIF- und RIG-I-mRNA zum Einsatz, sowie 1 µg für
β-Actin. Der RT-Reaktion war ein 10 min Denaturierungsschritt von RNA-Template und
antisense-Primer bei 65°C im PCR-Cycler vorgeschaltet, anschließend wurden die
entsprechenden RT-Mixe zugegeben. Der komplette Ansatz von 21 µl enthielt sodann 30 pmol
antisense-Primer, RT-Puffer, je 1 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 10 mM DTT und 5 U
Expand RT (Reverse Transkriptase). Die RT-Reaktion als solche lief bei 42°C für 45 min im
PCR-Cycler. 5 µl der erhaltenen cDNA wurden im nächsten Schritt einer PCR unterzogen, im
70
Falle der Verdünnungen für die TLR3-RT-PCR wurde das RT-Produkt zusätzlich 1:2, 1:5, 1:10
und 1:20 verdünnt und in die PCR eingesetzt. Der Reaktionsansatz von 50 µl enthielt neben dem
cDNA-Template je 30 pmol sense- und antisense-Primer, Taq-Puffer, 200 µM dATP, dCTP,
dGTP und dTTP, 1 U Taq-Polymerase und DEPC-Wasser. Die PCR-Programme des Cyclers
lauteten wie folgt, wobei 30 Zyklen mit Denaturierung (95°C), Hybridisierung/Annealing und
Synthese (72°C) gefahren wurden:
TLR3: 2 min 95°C; 30x (1 min 95°C; 2 min 54°C; 3 min 72°C); 10 min 72°C; 4°C
TRIF: 2 min 95°C; 30x (1 min 95°C; 2 min 55°C; 3 min 72°C); 10 min 72°C; 4°C
RIG-I: 2 min 95°C; 30x (1 min 95°C; 2 min 55°C; 3 min 72°C); 10 min 72°C; 4°C
β-Actin: 2 min 95°C; 30x (1 min 95°C; 2 min 60°C; 3 min 72°C); 10 min 72°C; 4°C
Nach Ende der PCR wurden die PCR-Cups mit den Amplifikaten bei −20°C gelagert, das
Ergebnis wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese erhalten (siehe 2.2.6.), wobei 10 µl
Amplifikat mit 2 µl DNA-Probenpuffer gemischt und aufgetragen wurden.
71
3. Ergebnisse ____________________________________________________________
3.1. Einfluss einer HAV-Infektion auf die RIG-I-vermittelte IRF-3-Aktivierung durch intrazelluläre dsRNA
Im ersten Abschnitt dieses Ergebnisteils sind die Untersuchungen zum Einfluss einer
Hepatitis A-Virus-Infektion auf den durch RIG-I vermittelten Signalweg zur IRF-3- und IFN-β-
Enhancer-Aktivierung zusammen gestellt.
3.1.1. Einsetzbarkeit von jetPEI-Transfektionsreagens und NDV-Infektion
In den geplanten Experimenten zur Untersuchung der verschiedenen Signalwegskomponenten
der IRF-3-Aktivierung sollte meistens eine Cotransfektion zweier Plasmide (s.u.) zur
Anwendung kommen. Daher musste das verwendete Transfektionsreagens in Vorversuchen auf
seine Fähigkeit hin getestet werden, eine strikte Cotransfektion jeweils derselben Zellen mit zwei
verschiedenen Plasmiden zu vermitteln, und zudem sollten auch HAV-infizierte Zellen
transfizierbar sein. Abgesehen davon bestand die Absicht, das Newcastle Disease-Virus (NDV)
als potenten IRF-3- und IFN-β-Enhancer-Aktivator einzusetzen, da NDV- und andere
Paramyxovirus-Infektionen erwiesenermaßen TLR3-unabhängig wirken (99, 197, 386). Es
bestand daher die Notwendigkeit, die Replikationsfähigkeit von NDV in HAV-infizierten Zellen
zu überprüfen, um dessen Einsetzbarkeit zu gewährleisten.
3.1.1.1. Plasmid-Cotransfektion mittels jetPEI-Transfektionsreagens
Aufgrund seiner Eigenschaft, eine deutlich bessere Effizienz bei der transienten Transfektion der
eingesetzten fetalen Rhesusaffen-Nierenzellen (FRhK-4) im Vergleich zur Calciumphosphat-
Transfektion zu vermitteln, wurde das Reagens jetPEI (Qbiogene) eingesetzt. In Vorversuchen
wurde bereits die optimale Plasmid-DNA-Menge pro 6cm-Schale, nämlich 5 µg, ermittelt,
ebenso wurde ein Verhältnis von 10 µl jetPEI zu 5 µg DNA für geeignet befunden (Daten nicht
gezeigt). Die Effizienz der Transfektion lag fortan bei über 10%. Die Notwendigkeit einer
strikten Cotransfektion zweier Plasmide für die geplanten Experimente erforderte einen visuellen
72
Nachweis, der durch Einsatz zweier für fluoreszierende Proteine codierende Plasmidvektoren
erbracht wurde. Das erste, GFP-IRF-3, ist ein Fusionsprotein aus dem Green-flourescent protein
(GFP) aus der Tiefseequalle Aquorea victoria und dem humanen Transkriptionsfaktor IRF-3,
welches cytoplasmatisch lokalisiert ist und bei entsprechender Anregung grün fluoresziert. Das
zweite, HcRed, stammt ursprünglich aus der Leder-Anemone Heteractis crispa und leuchtet bei
Anregung rot, wobei es durch Diffusion in den Zellkern gelangt, so dass dieser stark hervortritt.
Durch diese Unterschiede in der Lokalisation ist die zweifelsfreie Paralleldetektion beider
Proteine möglich. Mock- bzw. HAV/7-infizierte FRhK-4-Zellen (11 d p.i.) wurden einen Tag
nach Umsetzen in 6cm-Schalen mit einem Transfektionsmix aus je 2,25 µg pcDNA3/GFP-IRF-3
und pHcRed-Tandem-N1 sowie 0,5 µg pGL2-control (hier nur als Füllplasmid benutzt) in
150 mM NaCl mit einem Zusatz von 10 µl jetPEI behandelt. Die Zellen wurden also bei etwa
80% Konfluenz transfiziert, wobei der Mix in das Medium eingetropft wurde. Das positiv
geladene jetPEI, ein Poly-ethylenimin, bildet mit der DNA Komplexe von positiver Nettoladung,
welche rasch von den Zellen aufgenommen werden können. Nach 24-stündiger Inkubation bei
Standardbedingungen (37°C und 5% CO2) erfolgte nach Paraformaldehyd-Fixierung der Zellen
die Auswertung am Epifluoreszenzmikroskop. Die Ergebnisse sind in Abb. 9 dargestellt. Es ist
klar ersichtlich, dass stets beiderlei spezifische Fluoreszenz in jeweils den selben Zellen
ggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggg
mock HAV
GFP- IRF-3
HcRed
Abb. 9: jetPEI-vermittelte Cotransfektion von Plasmiden. FRhK-4-Zellen wurden11 Tage nach mock- oder HAV/7-Infektion in 6cm-Schalen umgesetzt und am Tagdarauf mit je 2,25 µg pcDNA3/GFP-IRF-3 und pHcRed-Tandem-N1 (sowie 0,5 µgpGL2-control) cotransfiziert, wobei 10 µl jetPEI-Reagens eingesetzt wurden. 24 hspäter erfolgte die Auswertung nach Paraformaldehyd-Fixierung am Epifluoreszenz-mikroskop unter Verwendung entsprechender Anregungswellenlängen, Vergrößerung200x. Die HAV-Infektion wurde per Immunfluoreszenztest kontrolliert (nicht gezeigt).
73
vorlag, die Cotransfektion war demnach strikt. Des weiteren konnten HAV-infizierte Zellen mit
vergleichbarer Effizienz transfiziert werden, die Infektion beeinträchtigte die Funktion des jetPEI
nicht; dies bestätigte sich in den späteren Experimenten auch quantitativ in Reporterassays und
Immunoblots (s.u.). Das Reagens jetPEI erfüllte demnach die gestellten Anforderungen und
wurde in gleicher Weise weiterverwendet.
3.1.1.2. NDV-Replikationskinetik in HAV-infizierten FRhK-4-Zellen
Um NDV als "natürlichen" IFN-β-Induktor anstelle von mittels DEAE-Dextrans transfiziertem
poly(IC) einsetzen zu können, musste geklärt werden, ob eine vorangegangene HAV-Infektion
die NDV-Replikation würde beeinträchtigen können, was eine indirekte Hemmung der NDV-
vermittelten IFN-β-Induktion bedeutet hätte. Zu diesem Zweck wurden mock- bzw. HAV/7-
infizierte FRhK-4-Zellen 10 Tage p.i. umgesetzt und am folgenden Tag mit NDV (MOI 10)
infiziert, mit Mediumbehandlung als Kontrolle. Nach 0, 4, 8 und 24 h wurde der Überstand
gggggggggggg
Abb. 10: NDV-Replikationskinetik in HAV/7-infizierten FRhK-4-Zellen. Mock- bzw.HAV/7-infizierte FRhK-4-Zellen wurden 10 Tage nach Infektion umgesetzt und am Folgetagmit NDV (MOI 10) infiziert. Durch Ernte des Überstandes nach 0, 4, 8 und 24 h undanschließender Titration auf frischen FRhK-4-Zellen wurden die dargestellten One stepgrowth curves erhalten. Rechts im Bild ist die HAV-Infektionskontrolle per Immun-fluoreszenztest dargestellt, Vergrößerung 400x. Die Titer sind als TCID50/ml (50% tissueculture infectious dose per milliliter) angegeben und wurden über CPE-Bildung in frischenFRhK-4-Zellen bestimmt. Jeder Datenpunkt entspricht den Mittelwerten mitStandardabweichung einer Doppelbestimmung aus Doppelansätzen. MediumbehandelteKontrollen entwickelten keinerlei CPE und sind nicht dargestellt.
74
abgenommen und der NDV-Titer (TCID50/ml) anhand des cytopathischen Effektes (CPE) auf
frische FRhK-4-Zellen 6 Tage nach Inokulation bestimmt. Die HAV-Infektion im Sinne einer
detektierbaren Infektion aller Zellen wurde am Tag der NDV-Infektion per Immunfluoreszenz
kontrolliert. Auf diese Weise war der zeitliche Rahmen für den Einsatz von NDV in allen
zukünftigen Experimenten abgedeckt. Abb. 10 zeigt die Resultate der Titrationen und der
Infektionskontrolle. Es konnte nachgewiesen werden, dass NDV in HAV-infizierten Zellen
gleichermaßen gut repliziert. HAV interferiert demnach nicht mit der Replikation von NDV,
welches somit in der geplanten Form einsetzbar war.
3.1.2. Untersuchung der nucleären Translokation von IRF-3
Um sich dem gesetzten Ziel, der Lokalisierung des Angriffspunktes von HAV im Signalweg zur
IFN-β-Induktion, zu nähern, wurde direkt an den bisherigen Kenntnisstand angeknüpft.
Demzufolge supprimierte HAV selektiv die PRDIII-I des IFN-β-Enhancers, und somit die
Aktivität von − mit aller Wahrscheinlichkeit − IRF-3. Im übrigen wäre auch die direkte Blockade
der PRDIII-I durch einen zellulären oder viralen Repressor möglich gewesen. Aus diesem
Grunde, und um im Falle eines Eingriffs in den IRF-3-Weg die Lokalisation des viralen Eingriffs
als cytoplasmatisch oder nucleär beschreiben zu können, wurde das GFP-IRF-3, wie erwähnt ein
Fusionsprotein aus GFP und humanem IRF-3, eingesetzt. Dieses wird wie das "freie" IRF-3
durch dsRNA oder Virusinfektion zur nucleären Translokation angeregt und gibt somit im
Fluoreszenzmikroskop visuelle Information über seinen Aktivierungsstatus.
3.1.2.1. Suppression der NDV-induzierten nucleären Translokation von GFP-IRF-3 in HAV/7-infizierten FRhK-4-Zellen
Die Untersuchungen zur Lokalisation des GFP-IRF-3 erforderten zuerst die Herstellung einer
Zellpopulation, die stabil mit dem Plasmid pcDNA3/GFP-IRF-3 transfiziert worden war. Per
Calciumphosphat-Transfektion wurde mit 20 µg Plasmid pro 10cm-Zellkulturschale transfiziert
und nach 4 Tagen die Selektion mit G418 begonnen. Die entstandene stabile Population
(FRhK-4/GFP-IRF-3) wurde für die Experimente eingesetzt.
FRhK-4/GFP-IRF-3-Zellen wurden mit HAV/7 (MOI~1) infiziert oder mit Lysat behandelt
(mock-Infektion); 10 Tage p.i. wurden die FRhK-4/GFP-IRF-3-Zellen in 8-well-Objektträger mit
75
Zellkulturaufsatz (Chamber slides) umgesetzt und tags darauf mit NDV infiziert (MOI 10). Eine
Mediumbehandlung diente als Kontrolle. 4 h p.i. wurden die Zellen mit Paraformaldehyd und
Triton X-100 fixiert und permeabilisiert. Für die Detektion von HAV wurden die Präparate mit
einem HAV-spezifischen monoklonalen Antikörper sowie einem sekundären, Texas Red-
konjugierten Antikörper inkubiert. Die Auswertung erfolgte am Epifluoreszenzmikroskop bei
400-facher Vergrößerung. Die je zwei Einzelaufnahmen (GFP- und Texas Red-Filter) wurden
anschließend überlagert und sind in Abb. 11 gezeigt. Wie erwartet befand sich IRF-3 in
unbehandelten Zellen (Abb. 11 A) ausschließlich im Cytoplasma, während er in NDV-infizierten
Zellen in den Zellkern translozierte (Abb. 11 C). Durch alleinige HAV-Infektion (Abb. 11 B),
erkennbar als rote Fluoreszenz, kam es nicht zur Translokation von IRF-3, ebensowenig nach
Superinfektion mit NDV (Abb. 11 D). Diese Ergebnisse belegen, dass bereits die Aktivierung
von IRF-3 im Cytoplasma, oder sein Transport in den Zellkern, durch HAV supprimiert wird.
HAV mock
C D
A B
Med
ium
ND
V
Abb. 11: Suppression der NDV-induzierten GFP-IRF-3-Translokation durch HAV.FRhK-4/GFP-IRF-3-Zellen wurden 10 Tage nach mock- bzw. HAV/7-Infektion in Chamber slidesumgesetzt und am nächsten Tag mit NDV (MOI 10) infiziert (C und D); Mediumbehandlung dienteals Kontrolle (A und B). 4 h p.i. wurden die Zellen mit Paraformaldehyd und Triton X-100 fixiertund permeabilisiert um intrazelluläres HAV-Antigen mittels Antikörpern zu markieren (sekundärerAntikörper Texas Red-konjugiert). Die Auswertung erfolgte am Epifluoreszenzmikroskop,Vergrößerung 400x. Dargestellt sind Überlagerungen der Einzelbilder der GFP-IRF-3- und derTexas Red (HAV)-Fluoreszenz.
76
3.1.2.2. Suppression der durch poly(IC)-Transfektion induzierten nucleären Translokation von GFP-IRF-3 in HAV/7-infizierten FRhK-4-Zellen
Um eine Stimulus-Spezifität des eben gezeigten Suppressions-Effektes auszuschließen und die
funktionelle Homologie von NDV-Infektion und der bislang in der Arbeitsgruppe genutzten
poly(IC)-Transfektion zu demonstrieren, wurde die Untersuchung der Lokalisation des
ggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggg
gggggggggg HAV mock
E F
C D
A B
Med
ium
DEA
E-D
extr
an
poly
(IC)/
DEA
E-D
extr
an
Abb. 12: Suppression der poly(IC)-induzierten GFP-IRF-3-Translokation durch HAV. FRhK-4/GFP-IRF-3-Zellen wurden 10 Tage nach mock- bzw. HAV/7-Infektion in Chamber slides umgesetzt und amnächsten Tag mit 20 µg/ml poly(IC) in 100 µl/ml DEAE-Dextran transfiziert (E und F); Behandlungen mitDEAE-Dextran (C und D) oder serumfreiem Medium (A und B) dienten als Kontrollen. 4 h nachTransfektion wurden die Zellen mit Paraformaldehyd und Triton X-100 fixiert und permeabilisiert umintrazelluläres HAV-Antigen mittels Antikörpern zu markieren (sekundärer Antikörper Texas Red-konjugiert). Die Auswertung erfolgte am Epifluoreszenzmikroskop, Vergrößerung 400x. Dargestellt sindÜberlagerungen der Einzelbilder der GFP-IRF-3- und der Texas Red (HAV)-Fluoreszenz.
77
GFP-IRF-3 unter Verwendung der poly(IC)-Transfektion als Induktor wiederholt. Mock- bzw.
HAV/7-infizierte FRhK-4-GFP-IRF-3-Zellen wurden analog zu 3.1.2.1. umgesetzt und am
Folgetag mit 20 µg/ml poly(IC) in 100 µg/ml DEAE-Dextran transfiziert. Der positiv geladene
DEAE-Dextran vermittelt hierbei die Aufnahme der dsRNA in die Zellen. Als Kontrollen
dienten DEAE-Dextran- oder Mediumbehandlungen. 4 h nach Transfektion wurden die Zellen
fixiert, permeabilisiert und HAV-Antigen mittels Antikörpern markiert. Die Auswertung am
Epifluoreszenzmikroskop lieferte die in Abb. 12 dargestellten Ergebnisse. So kam es nach
Medium- oder DEAE-Dextran-Behandlung nicht zur Aktivierung und Translokation von IRF-3,
unabhängig von einer bestehenden HAV-Infektion (Abb. 12 A bis D). Analog zur geschilderten
Situation nach NDV-Infektion war nach poly(IC)-Transfektion eine Akkumulation von GFP-
IRF-3 im Zellkern zu beobachten (Abb. 12 E), wohingegen eine vorangehende HAV-Infektion
dies komplett supprimierte (Abb. 12 F).
Zusammenfassend konnte mithilfe dieser Experimente gezeigt werden, dass das Hepatitis A-
Virus nicht die nucleäre Translokation von IRF-3 induziert, sondern diese nach NDV-Infektion
oder poly(IC)-Transfektion aktiv und vollständig unterbindet. Der virale Angriffspunkt liegt also
mit großer Wahrscheinlichkeit im Cytoplasma, und dort vermutlich innerhalb des IRF-3-
Aktivierungsweges. Zudem konnte vor dem Hintergrund der bislang bekannten Suppression der
PRDIII-I erstmals die direkte Beeinflussung von IRF-3 durch HAV demonstriert werden.
3.1.3. Untersuchung der IFN-β-Enhancer- und IRF-3-Aktivierung
durch IKKε und TBK1
Die berechtigte Annahme, der Angriffspunkt der HAV-vermittelten Suppression läge im
Cytoplasma, wurde durch Befunde aus einer parallel durchgeführten Doktorarbeit gestützt. In
dieser wurden per Immunoblot der Phosphorylierungsstatus und die Dimerisierung von IRF-3
nach NDV-Infektion untersucht. Es zeigte sich zum einen, dass IRF-3 nicht durch HAV
degradiert wird, zum anderen konnte keine IRF-3-Phosphorylierung und -Dimerisierung in
HAV-infizierten Zellen gefunden werden (93 und Dajana Grotheer, persönl. Mitteilung).
Demzufolge musste bereits die Aktivierung von IRF-3 durch HAV supprimiert worden sein. Als
direkte Mediatoren dieser Aktivierung wurden zunächst die beiden IRF-Kinasen IKKε und
TBK1 untersucht.
78
3.1.3.1. IKKε-vermittelte IFN-β-Enhancer- und IRF-3-Aktivierung
in HAV/7-infizierten FRhK-4-Zellen
Die IKK-verwandte Kinase IKKε, wie auch ihre nahe Verwandte TBK1, ist durch direkte
Phosphorylierung des IRF-3-C-Terminus in der Lage, dessen Aktivierung zu kontrollieren. Es ist
beschrieben worden, dass die alleinige Überexpression einer der beiden Kinasen bereits die
Induktion des IFN-β-Enhancers und der IRF-3-abhängigen Genexpression bewirkt (96), obschon
der zu Grunde liegende Mechanismus unbekannt ist. Diese Eigenschaft der IKKε ermöglicht die
direkte Untersuchung einer möglichen Beeinflussung durch HAV, und darum wurden Versuche
mit transienter IKKε-Überexpression durchgeführt.
Nach 10-tägiger Infektion mit HAV/7 bzw. Lysat-Behandlung (mock) wurden die FRhK-4-
Zellen in 6cm-Schalen umgesetzt und am nächsten Tage bei einer Konfluenz von 60-80% mit
Plasmiden cotransfiziert. Es wurde dabei Leervektor (pcDNA3.1) oder IKKε-Expressionsvektor
(pcDNA3.1/IKKε-myc) zusammen mit einem Chloramphenicol-Acetyltransferase (CAT)-
Reporterplasmid transfiziert. Die Expression des Reportergens stand dabei unter Kontrolle des
gggggggggggg
Abb. 13: IKKε-vermittelte IFN-β-Enhancer- und IRF-3-Aktivierung in HAV-infizierten Zellen. Mock-bzw. HAV/7-infizierte FRhK-4-Zellen wurden 10 Tage p.i. in 6cm-Schalen umgesetzt und am Folgetag mit (A) 3 µg Expressionsvektor (Leervektor oder IKKε) + 2 µg Reporterplasmid [(-110-IFNβ)-CAT] oder (B) 4 µg Expressionsvektor + 1 µg Reporterplasmid [(PRDIII-I)3-CAT] cotransfiziert. 24 h später erfolgte die NDV-Infektion (MOI~0,1) bzw. ein Mediumwechsel. Weitere 18 h danach wurden die Zellen perAuftauen/Einfrieren lysiert und 100 µg extrahiertes Protein in den CAT-ELISA eingesetzt. Dargestellt sind Mittelwerte mit Standardabweichungen aus Doppel- bzw. Dreifachbestimmungen (Vektor- bzw. IKKε-Ansätze). Die vollständige HAV-Infektion der Zellen wurde am Tag der Transfektion mittels Immunfluoreszenztest kontrolliert.
79
humanen IFN-β-Enhancers (Abb. 13 A) oder dreier Kopien der PRDIII-I (Abb. 13 B) zum
Nachweis der IRF-3-Aktivität. 24 h danach erfolgte für die IKKε-Ansätze ein Mediumwechsel,
für die Leervektorkontrollen entweder ein Mediumwechsel oder eine NDV-Infektion (MOI~0,1).
Die Lyse der Zellen wurde 18 h nach NDV-Infektion, also insgesamt 42 h nach Transfektion
durchgeführt; 100 µg Protein wurden abschließend zur Bestimmung der Reporterexpression in
den CAT-ELISA eingesetzt. Die erhaltenen Ergebnisse waren eindeutig. So führte eine
Mediumbehandlung auch bei zusätzlicher HAV-Infektion nicht zur Induktion des IFN-β-
Enhancers oder der PRDIII-I, eine NDV-Infektion erwies sich hingegen wie erwartet als starker
Induktor (Abb. 13 A und B). Die NDV-Infektion hatte hier die Aufgabe, eine funktionale HAV-
Infektion nachzuweisen, indem die NDV-vermittelte IFN-β-Enhancer- und IRF-3-Aktivierung
durch HAV komplett supprimiert wurden (Abb. 13 A und B). Vor diesem Hintergrund wurden
die folgenden Aussagen bezüglich der Ansätze mit IKKε ermöglicht. Die IKKε-Überexpression
führte in der Tat zur Induktion von IFN-β-Enhancer und PRDIII-I, doch wurde diese
überraschender Weise nicht durch HAV beeinflusst (Abb. 13 A und B). Das bedeutet, dass die
Aktivität der IRF-3-Kinase IKKε nicht durch HAV inhibiert wird, obwohl die entsprechende
NDV-vermittelte Induktion blockiert werden kann; des weiteren wird das IRF-3-Protein nach
seiner Aktivierung nicht durch HAV beeinflusst. Für eine vollständige Aussage musste nun
natürlich die Situation für die Schwesterkinase TBK1 untersucht werden.
3.1.3.2. TBK1-vermittelte IFN-β-Enhancer- und IRF-3-Aktivierung
in HAV/7-infizierten FRhK-4-Zellen
Da im Falle der genutzten FRhK-4-Zellen nicht bekannt ist, ob sie IKKε oder TBK1 (oder beide)
exprimieren, wurden auch Versuche mit TBK1-Überexpression durchgeführt. Mock- bzw.
HAV/7-infizierte FRhK-4-Zellen wurden einen Tag nach Umsetzen in 6cm-Schalen per
Immunfluoreszenztest auf HAV-Infektion kontrolliert und anschließend mit Leervektor
(pcDNA3) oder TBK1-Expressionsvektor (pcDNA3/Flag-TBK1) zusammen mit einem IFN-β-
Enhancer-Luc- (Abb. 14 A) oder einem PRDIII-I-Luc-Reporterplasmid (Abb. 14 B) transfiziert.
Der Wechsel zur Luciferase als Reporter geschah lediglich im Zuge einer laborinternen
Umstellung. 24 h später erfolgte in den entsprechenden Ansätzen die NDV-Infektion (MOI~0,1),
alle übrigen Ansätze wurden mit Medium behandelt. Nach weiteren 18 h Inkubation wurden die
Zellen lysiert und 20 µg Protein in den Luciferase-Assay zur Messung der Reporteraktivität
eingesetzt. Die Resultate entsprachen denen der IKKε-Experimente (Abb. 14 A und B):
80
ggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggg
gggggg
Abb. 14: TBK1-vermittelte IFN-β-Enhancer- und IRF-3-Aktivierung in HAV-infizierten Zellen.Mock- bzw. HAV/7-infizierte FRhK-4-Zellen wurden 10 Tage p.i. in 6cm-Schalen umgesetzt und amFolgetag mit 4 µg Expressionsvektor (Leervektor oder TBK1) + 1 µg Reporterplasmid [(A) p125-Luc= IFN-β-Luc oder (B) (PRDIII-I)4-Luc] cotransfiziert. 24 h später erfolgte die NDV-Infektion(MOI~0,1) bzw. ein Mediumwechsel. Weitere 18 h danach wurden die Zellen per Auftauen/Einfrieren lysiert und 20 µg extrahiertes Protein in den Luciferase-Assay eingesetzt. Dargestellt sindMittelwerte mit Standardabweichungen aus Doppel- bzw. Dreifachbestimmungen (Vektor- bzw.TBK1-Ansätze). Die vollständige HAV-Infektion der Zellen wurde am Tag der Transfektion mittelsImmunfluoreszenztest kontrolliert.
Während die NDV-induzierte Reporterexpression durch HAV vollständig gehemmt wurde,
beeinflusste HAV nicht die durch TBK1-Überexpression hervorgerufene Induktion. Eine
zusätzliche Kontrolle wurde bei PRDIII-I-Luc-Cotransfektion mitgeführt (Abb. 14 B). TBK1-
transfizierte Ansätze waren zusätzlich mit NDV infiziert worden, und in diesen Zellen konnte
HAV die IRF-3-Aktivität nicht vollständig, sondern nur auf das TBK1-induzierte Niveau
81
reduzieren. Obwohl also wie erwähnt die Phosphorylierung von IRF-3 nach NDV-Infektion
durch HAV supprimiert wird (93), sind die IRF-3-Kinasen von diesem Effekt nicht betroffen;
der letztgenannte Ansatz (Abb. 14 B) zeigte dies sehr anschaulich. Die Ergebnisse
demonstrierten in ihrer Gesamtheit klar die IKKε/TBK1-Unabhängigkeit der HAV-vermittelten
Suppression der IRF-3-Aktivierung und legten die Untersuchung von Upstream-
Signalwegskomponenten nahe.
3.1.4. Untersuchung des IKKε/TBK1-Bindeproteins TANK
Der TRAF-associated NF-κB-activator (TANK) besitzt die Fähigkeit, die beiden Kinasen IKKε
und TBK1 zu binden, des weiteren vermittelt er Interaktionen mit TRAF2 und IKKγ/NEMO aus
dem IKK-Komplex. TANK könnte daher als Gerüstprotein für die Ausbildung von
Subkomplexen im TLR3-unabhängigen Signaling betrachtet werden. Seine genaue Funktion bei
der Aktivierung von IRF-3 ist unklar, dennoch sollte im Zusammenhang mit einer HAV-
Infektion durch eine TANK-Überexpression die Kompetition des Suppressionseffektes versucht
werden, um die Möglichkeit der direkten Interaktion mit HAV zu untersuchen.
3.1.4.1. Einfluss einer TANK-Überexpression auf die Suppression der IRF-3-Aktivierung in HAV/7-infizierten FRhK-4-Zellen
Die Transfektion der mock- bzw. HAV/7-infizierten Zellen wurde einen Tag nach Umsetzen
vorgenommen, und es wurde Leervektor (pcDNA3.1) oder Expressionsvektor (pcDNA3.1/Flag-
TANK) mit (PRDIII-I)4-Luc-Reporterplasmid cotransfiziert. Nach einer 24-stündigen
Inkubationszeit erfolgte die NDV-Infektion (MOI~0,1) bzw. eine Mediumbehandlung, nach
weiteren 18 h die Lyse und der Luciferase-Assay mit 20 µg Proteineinsatz. Außerdem wurde die
Expression des Flag-markierten TANK-Proteins mittels SDS-PAGE und Immunoblot
nachgewiesen. Hierfür wurden ebenfalls 20 µg Protein eingesetzt. Abb. 15 zeigt das Resultat der
Experimente. Die IRF-3-Aktivierung und die damit einhergehende PRDIII-I-Induktion durch
NDV wurde komplett durch HAV unterbunden, dies war erwartet. Die Überexpression von
TANK als solche führte nicht zu einer IRF-3-Aktivierung, jedoch verstärkte sie die Induktion
durch NDV-Infektion (Abb. 15, obere Hälfte). Dennoch supprimierte HAV auch in diesem Fall
die Induktion der PRDIII-I. Das erwartete Fehlen einer Eigenaktivität des TANK erforderte
82
ggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggg
ggggggggg
Abb. 15: Effekt einer TANK-Überexpression auf die HAV-vermittelte Suppression der IRF-3-Aktivierung. FRhK-4-Zellen wurden 10 Tage nach HAV/7-Infektion bzw. Mock-Infektion in 6cm-Schalen umgesetzt. Am nächsten Tag wurde die Infektion per Immunfluoreszenztest kontrolliertund die Zellen mit 4 µg Expressionsvektor (Leervektor oder TANK) + 1 µg Reporterplasmid[(PRDIII-I)4-Luc] transfiziert. 24 h danach erfolgte die NDV-Infektion (MOI~0,1) oder Medium-behandlung, und nach weiteren 18 h Inkubation wurden die Zellen durch Auftauen/Einfrierenlysiert, um 20 µg Protein in den Luciferase-Assay einzusetzen (obere Hälfte). Dargestellt sindMittelwerte mit Standardabweichungen aus Doppel- bzw. Dreifachansätzen (Vektor- bzw. TANK-Ansätze). Außerdem wurden 20 µg Protein mittels SDS-PAGE aufgetrennt und per Immunoblot(Anti-Flag-Antikörper) die Expression des Flag-markierten TANK-Proteins nachgewiesen (untereHälfte).
dessen Nachweis per Immunoblot (Abb. 15, untere Hälfte). Die Expression des Flag-markierten
TANK-Proteins konnte in allen transfizierten Ansätzen visualisiert werden, wobei in HAV-
infizierten Proben ein leicht erhöhter Level festzustellen war. Es konnte nun folgende Aussage
getroffen werden: Die Überexpression von TANK war nicht geeignet, den HAV-vermittelten
IRF-3-Suppressionseffekt zu kompetieren, d.h. abzuschwächen. Es musste somit davon
ausgegangen werden, dass HAV weiter upstream in den Signalweg zur Aktivierung der Kinasen
IKKε und TBK1 eingreift.
83
3.1.5. Untersuchung der RIG-I-vermittelten IFN-β-Enhancer- und
IRF-3-Aktivierung
Die Feststellung, dass HAV "oberhalb" der Kinasen IKKε und TBK1 interveniert, führte zur
Untersuchung des intrazellulären dsRNA-Rezeptors RIG-I (siehe Abb. 7 der Einleitung). RIG-I
bindet dsRNA mithilfe seiner C-terminalen Helicasedomäne, die Signaltransduktion wird durch
die N-terminale CARD-Domäne vermittelt. Die Überexpression von RIG-I resultiert
zelltypabhängig bereits in der Induktion von IFN-β, möglicherweise ist dafür die
Oligomerisierung von RIG-I mittels CARD-Domäne verantwortlich. Auf diese Weise lässt sich
der RIG-I-induzierte Effekt isoliert von zusätzlichen Stimuli wie NDV-Infektion betrachten.
3.1.5.1. Suppression der RIG-I-induzierten IFN-β-Enhancer- und
IRF-3-Aktivierung in HAV/7-infizierten FRhK-4-Zellen
Die Versuche zur RIG-I-induzierten Reporterinduktion über IFN-β-Enhancer oder PRDIII-I
sollten klären, ob die alleinige RIG-I-Überexpression in FRhK-4-Zellen bereits zur Induktion
führte, und wenn ja, ob HAV diese Induktion würde unterdrücken können. Wie in
vorangegangenen Experimenten wurden mock- bzw. HAV/7-infizierte Zellen einen Tag nach
Umsetzen in 6cm-Schalen bei einer Konfluenz von 60-80% mit Plasmiden cotransfiziert. Es
kamen dabei Leervektor (pEF-BOS) oder Expressionsvektor (pEF-Flag-RIG-I full) zusammen
mit Reporterplasmid [(-110-IFNβ)-CAT bzw. (PRDIII-I)3-CAT] zum Einsatz. 24 h später
erfolgte ein Mediumwechsel, und nach weiteren 18 h Inkubation wurden die Zellen lysiert und
100 µg Protein in den CAT-ELISA eingesetzt, um die Reporterexpression zu quantifizieren.
Abb. 16 (obere Hälfte) zeigt die Ergebnisse dieser Versuche. In der Tat führte die alleinige
Expression von RIG-I bereits zu einer starken Induktion des IFN-β-Enhancers (Abb. 16 A) und
der PRDIII-I (Abb. 16 B). Dieser Effekt wurde jedoch in HAV-infizierten Zellen vollständig
supprimiert. Dieser Befund warf die Frage nach der Expression des Flag-markierten RIG-I-
Proteins auf, darum wurde diese durch Einsatz von 20 µg Protein in SDS-PAGE mit
anschließendem Immunoblot untersucht (Abb. 16, untere Hälfte). Es gelang der eindeutige
Nachweis der Flag-RIG-I-Überexpression sowohl in mock-, als auch in HAV-infizierten
FRhK-4-Zellen, somit ließ sich folgende Schlussfolgerung ziehen:
84
Abb. 16: Suppression der RIG-I-induzierten IFN-β-Enhancer- und IRF-3-Aktivierung durch HAV.FRhK-4-Zellen wurden 10 Tage nach HAV/7-Infektion bzw. Mock-Infektion in 6cm-Schalen umgesetzt. Am folgenden Tag wurde die Infektion per Immunfluoreszenztest kontrolliert und dieZellen mit (A) 3 µg Expressionsvektor (Leervektor oder RIG-I) + 2 µg Reporterplasmid [(-110-IFNβ)-CAT] oder (B) 4 µg Expressionsvektor (Leervektor oder RIG-I) + 1 µg Reporterplasmid [(PRDIII-I)3-CAT] cotransfiziert. 24 h danach erfolgte ein Mediumwechsel, und nach weiteren 18 h Inkubation wurden die Zellen durch Auftauen/Einfrieren lysiert, um 100 µg Protein in den CAT-ELISA einzusetzen (obere Hälfte). Dargestellt sind Mittelwerte mit Standardabweichungen aus Doppel-bzw. Dreifachansätzen (Vektor- bzw. RIG-I-Ansätze). Außerdem wurde die Expression des Flag-markierten RIG-I-Proteins durch Einsatz von 20 µg Protein in SDS-PAGE und Immunoblot (Anti-Flag-Antikörper) nachgewiesen (untere Hälfte).
Das Hepatitis A-Virus supprimiert vollständig den intrazellulären, RIG-I-vermittelten Signalweg
zur IRF-3- und IFN-β-Enhancer-Aktivierung, genau wie im Falle der Induktion durch NDV-
Infektion oder poly(IC)-Transfektion.
3.1.5.2. RIG-IC-vermittelte Hemmung der IFN-β-Enhancer-Induktion
durch NDV-Infektion oder poly(IC)-Transfektion
Das RIG-I-Protein bietet in seiner trunkierten Form, RIG-IC, welche nur die carboxyterminale
Helicase-Domäne, nicht aber die CARD-Domäne besitzt, die Möglichkeit, intrazelluläres
dsRNA-Signaling durch Bindung und somit Maskierung und Entwindung der dsRNA zu
verhindern (386). Damit ähnelt es sehr stark dem in der Einleitung erwähnten endogenen LGP2.
85
ggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggg
gggg
Abb. 17: RIG-IC-vermittelte Hemmung der IFN-β-Enhancer-Induktion durch NDV oderpoly(IC)-Transfektion. FRhK-4-Zellen wurden in 6cm-Schalen umgesetzt und am folgenden Tagmit 3 µg Expressionsvektor (Leervektor oder RIG-IC) + 2 µg Reporterplasmid [(-110-IFNβ)-CAT]transfiziert. (A) 24 h nach Transfektion erfolgte die NDV-Infektion (MOI~0,1) mit Medium-behandlung als Kontrolle, nach weiteren 18 h die Lyse durch Auftauen/Einfrieren. (B) 24 h nachPlasmidtransfektion wurde ein Mediumwechsel durchgeführt und nach weiteren 24 h erfolgte diepoly(IC)-Transfektion [20 µg/ml in 100 µg/ml DEAE-Dextran (DD)]. Als Kontrollen dienten DEAE-Dextran- oder Mediumbehandlung. 100 µg Protein aus (A) und (B) wurden in den CAT-ELISAeingesetzt. Dargestellt sind Mittelwerte mit Standardabweichungen aus Doppelbestimmungen.
Der Einsatz von RIG-IC sollte in der vorliegenden Arbeit zur Demonstration des rein
intrazellulären, also TLR3-unabhängigen, Charakters der Signaltransduktion durch NDV oder
transfiziertes poly(IC) dienen. Extrazelluläres Signaling ist demnach nicht durch RIG-IC
hemmbar.
FRhK-4-Zellen wurden dafür zunächst in 6cm-Schalen umgesetzt und am nächsten Tag mit 3 µg
Leervektor (pEF-BOS) oder Expressionsvektor (pEF-Flag-RIG-IC) + 2 µg Reporterplasmid
86
[(-110-IFNβ)-CAT] cotransfiziert. Für die Untersuchung der Supprimierbarkeit der NDV-
vermittelten Induktion wurden die entsprechenden Ansätze 24 h danach mit NDV infiziert
(MOI~0,1) oder mediumbehandelt, und nach 18 h Inkubation wurden die Zellen lysiert, um
100 µg Protein in den CAT-ELISA einsetzen zu können (Abb. 17 A). Für die Untersuchung der
Suppression der durch poly(IC)-Transfektion induzierten Reporterexpression (Abb. 17 B) wurde
24 h nach Plasmidtransfektion zunächst ein Mediumwechsel durchgeführt und erst weitere 24 h
später wurden die entsprechenden Ansätze mittels DEAE-Dextrans mit 20 µg/ml poly(IC)
transfiziert. Als Kontrollen dienten DEAE-Dextran- oder Mediumbehandlung. 18 h nach
poly(IC)-Transfektion wurden die Zellen lysiert und 100 µg Protein im CAT-ELISA auf die
Reporterexpression hin untersucht. Die Ergebnisse in Abb. 17 zeigen eine deutliche
Übereinstimmung zwischen NDV-Infektion und poly(IC)-Transfektion: Beide Stimuli führen zur
robusten IFN-β-Enhancer-Induktion, und beide sind blockierbar durch das cytoplasmatische
RIG-IC-Protein, welches dsRNA sequestriert. Daraus lässt sich zum einen eine funktionale
Äquivalenz beider Stimuli ableiten, zum anderen konnte demonstriert werden, dass das
Induktionssignal rein cytoplasmatischen Ursprungs gewesen sein muss. NDV, transfiziertes
poly(IC) und RIG-I können somit auch im Kontext weiterer, publizierter Daten als TLR3-
unabhängig bezeichnet werden. Sollten also FRhK-4-Zellen konstitutiv endogenes RIG-I
exprimieren, könnte geschlossen werden, dass NDV und transfiziertes poly(IC) RIG-I-vermittelt
IFN-β induzieren, und dass HAV dies supprimieren kann.
3.1.6. Endogene RIG-I-, TLR3- und TRIF-Expression in FRhK-4-Zellen
Um die Expression von RIG-I in FRhK-4-Zellen nachzuweisen, und um darüber hinaus
herauszufinden, ob FRhK-4-Zellen, die in bisherigen Versuchen der Arbeitsgruppe nicht auf
extrazelluläre dsRNA reagiert hatten, die Komponenten TLR3 und TRIF des extrazellulären
Signalwegs exprimieren, wurden RT-PCRs mit Primern zum Nachweis der entsprechenden
mRNAs durchgeführt.
3.1.6.1. Nachweis endogener mRNA von RIG-I, TLR3 und TRIF in FRhK-4-Zellen mittels RT-PCR
Der Nachweis der RIG-I- und TRIF-mRNA-Expression erfolgte nach Extraktion der zellulären
RNA aus unbehandelten, konfluenten FRhK-4-Zellen nach der Methode von Chomczynski &
87
88
A B
Sacchi, 1987, welche sich u.a. Guanidinthiocyanat und Phenol/Chloroform zunutze macht. Zur
Entfernung von Rest-DNA wurde die extrahierte RNA einem DNase-Verdau unterzogen. In die
folgende Reverse Transkription mit angeschlossener Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)
wurden je 2 µg RNA für den RIG-I- bzw. TRIF-Nachweis eingesetzt. Als Positivkontrollen für
das Amplifikat wurden 100 ng der entsprechenden Expressionsvektoren als Template für die
PCR verwendet. Kontrollen ohne RNA oder ohne Reverse Transkriptase (RT) wurden
mitgeführt. Die Ergebnisse (Abb. 18 A) nach Auftrennung der Amplifikate im Agarosegel
belegen, dass sowohl RIG-I als auch TRIF in FRhK-4-Zellen exprimiert werden.
gggggggggggggggggg
TLR3
β-Actin
Abb. 18: RT-PCR zum Nachweis endogener RIG-I-, TRIF- und TLR3-mRNA in FRhK-4-Zellen.(A) 2 µg extrahierter RNA unbehandelter FRhK-4-Zellen wurde zum Nachweis von endogenerRIG-I- bzw. TRIF-mRNA in eine RT-PCR eingesetzt. Als Positivkontrolle ("Plasmid") wurden100 ng Expressionsvektor (pEF-Flag-RIG-I full bzw. PL 1004 TRIF) der PCR unterworfen. WeitereKontrollen waren Ansätze ohne RNA bzw. ohne Reverse Transkriptase (RT), letztere diente alsKontrolle der Abwesenheit von Rest-DNA. (B) Die extrahierte RNA unbehandelter FRhK-4- bzw.MRC-5-Zellen (letztere als Positivkontrolle für TLR3) wurde zum Nachweis endogener TLR3-mRNA mit 3 µg RNA (TLR3) bzw. 1 µg RNA (β-Actin) in die RT-PCR eingesetzt. Die β-Actin-RT-PCR diente als Kontrolle der RNA-Einsatzmenge, weitere Kontrollen beinhalteten Ansätze ohneRNA bzw. ohne RT. Alle Amplifikate wurden im 1% Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt.
Zur Überprüfung einer möglichen Expression des TLR3 in FRhK-4-Zellen wurde eine RT-PCR
unter Einsatz von 3 µg RNA (TLR3-Nachweis) bzw. 1 µg RNA (β-Actin-Nachweis)
durchgeführt. Als Positivkontrolle wurde die RNA aus unbehandelten MRC-5-Zellen (humane
embryonale Lungenfibroblasten) eingesetzt, da für diese Zellen die Expression des TLR3
publiziert ist (219). Die β-Actin-RT-PCR wurde lediglich für die Kontrolle der RNA-
Einsatzmengen herangezogen. Kontrollen ohne RNA oder ohne Reverse Transkriptase (RT)
wurden ebenfalls mitgeführt (Abb. 18 B). Wie erwartet konnte in MRC-5-Zellen TLR3-mRNA
nachgewiesen werden. Überraschender Weise gelang dies auch bei FRhK-4-Zellen (Abb. 18 B).
Es stellte sich nun die Frage, warum FRhK-4-Zellen in den bisherigen Experimenten offenbar
keinen Gebrauch vom TLR3-Signalweg gemacht hatten (Abb. 17), obwohl sie doch die
entscheidenden Komponenten, TLR3 und TRIF, zu besitzen schienen. Dieser Frage wird im
Folgenden noch nachgegangen werden (s.u.). Festzuhalten bleibt, dass die Expression von RIG-I
in FRhK-4-Zellen im Zusammenhang mit den obigen Ergebnissen die Schlussfolgerung erlaubt,
dass NDV und transfiziertes poly(IC) auch in FRhK-4-Zellen RIG-I-vermittelt IFN-β induzieren.
3.2. Einfluss einer HAV-Infektion auf die TLR3-vermittelte IRF-3-Aktivierung durch extrazelluläre dsRNA
Nach den Experimenten zur Interaktion des Hepatitis A-Virus mit dem intrazellulären dsRNA-
Signalweg und dem Nachweis der TLR3- und TRIF-mRNA-Expression in den verwendeten
FRhK-4-Zellen wurde im zweiten Teil der praktischen Arbeit der Einfluss einer HAV-Infektion
auf den durch extrazelluläre dsRNA induzierten, TLR3/TRIF-vermittelten Signalweg zur IRF-3-
Aktivierung untersucht.
3.2.1. Untersuchung der TRIF-vermittelten IFN-β-Enhancer- und
IRF-3-Aktivierung
Die folgenden Experimente widmeten sich also der Frage, ob HAV den TLR3-abhängigen
Signalweg ebenso effizient hemmen kann wie den intrazellulären, RIG-I-abhängigen. Dazu
sollte als erstes die entscheidende cytoplasmatische Komponente, nämlich der Adapter TRIF,
untersucht werden. Es ist bekannt, dass die alleinige TRIF-Überexpression IRF-3 aktiviert und
IFN-β induziert (122), daher wurden in Analogie zu den RIG-I-Versuchen (Abb. 16)
Experimente mit Überexpression von TRIF durchgeführt.
89
3.2.1.1. Beeinträchtigung der TRIF-induzierten IFN-β-Enhancer- und
IRF-3-Aktivierung in HAV/7-infizierten FRhK-4-Zellen
Die Umsetzung von mock- bzw. HAV/7-infizierten FRhK-4-Zellen in 6cm-Schalen wurde einen
Tag vor der Plasmidtransfektion vorgenommen. Nach Kontrolle der vollständigen HAV-
Infektion per Immunfluoreszenztest kamen bei der Cotransfektion Leervektor (pCR3) oder
Expressionsvektor (PL 1004 TRIF) zusammen mit Reporterplasmid [(-110-IFNβ)-CAT bzw.
(PRDIII-I)3-CAT] zum Einsatz. Auf einen 24 h später vorgenommenen Mediumwechsel oder
eine NDV-Infektion (MOI~0,1) bei den PRDIII-I-Kontrollansätzen folgte eine 18-stündige
Inkubation bis zur Lyse der Zellen durch Auftauen/Einfrieren. 100 µg Protein wurden im CAT-
ELISA auf Reporterexpression untersucht, die Ergebnisse sind in Abb. 19 graphisch dargestellt.
gggggggg
Abb. 19: Reduktion der TRIF-induzierten IFN-β-Enhancer- und IRF-3-Aktivierung durch HAV.FRhK-4-Zellen wurden 10 Tage nach HAV/7-Infektion bzw. Mock-Infektion in 6cm-Schalenumgesetzt. Am folgenden Tag wurde die Infektion per Immunfluoreszenztest kontrolliert und dieZellen mit (A) 3 µg Expressionsvektor (Leervektor oder TRIF) + 2 µg Reporterplasmid [(-110-IFNβ)-CAT] oder (B) 4 µg Expressionsvektor (Leervektor oder TRIF) + 1 µg Reporterplasmid [(PRDIII-I)3-CAT] co-transfiziert. 24 h danach erfolgte ein Mediumwechsel, und nach weiteren 18 h Inkubationwurden die Zellen durch Auftauen/Einfrieren lysiert, um 100 µg Protein in den CAT-ELISAeinzusetzen. Die Funktionalität der HAV-Infektion wurde in (B) mittels einer NDV-Infektion (MOI~0,1;18 h vor der Lyse) kontrolliert, für (A) war diese durch die Parallelansätze aus Abb. 16 A bestätigt.
Die Überexpression von Flag-markiertem TRIF führte zu einer starken Induktion des IFN-β-
Enhancers (Abb. 19 A). In HAV-infizierten Zellen wurde diese Induktion jedoch nicht komplett
supprimiert, sondern um etwa 40% reduziert, die Suppression war also unvollständig. Die
funktionale HAV-Infektion musste hier nicht durch parallele NDV-Infektion nachgewiesen
90
werden, da Abb. 19 A und die entsprechenden RIG-I-Versuche (Abb. 16 A) Teil desselben
Experiments waren, so dass die funktionale Integrität der HAV-vermittelten Suppression auf
diese Weise überprüft war. Das gleiche Bild ergab sich auch in Versuchen mit IRF-3-abhängiger
PRDIII-I-Induktion durch TRIF: Die TRIF-vermittelte Induktion wurde durch HAV um etwa
40% reduziert, jedoch im Gegensatz zur Induktion durch NDV eben nicht vollständig
unterbunden (Abb. 19 B). Der Nachweis der Flag-TRIF-Überexpression im Immunoblot ist auch
unter Verwendung verschiedener detergenshaltiger Lysepuffer (NP-40 oder Triton X-100) nicht
gelungen, und tatsächlich ist das membranassoziierte TRIF-Protein bekannt dafür, schlecht
detektierbar zu sein (198). Da die Suppression durch HAV aber nicht, wie bei RIG-I-
Überexpression, vollständig ist, wird der Nachweis der Überpression nicht zwingend benötigt,
um Aussagen zu treffen. HAV ist demnach ansatzabhängig bis zu maximal 50% in der Lage, die
TRIF-vermittelte Aktivierung von IFN-β-Enhancer bzw. PRDIII-I zu inhibieren. Für eine
korrekte Interpretation dieser Befunde wurde im Anschluss der Rezeptor für extrazelluläre
dsRNA, TLR3, auch direkt stimuliert.
3.2.2. Untersuchung der IRF-3-Aktivierung durch Stimulation des TLR3
FRhK-4-Zellen hatten in bisherigen Experimenten auf extrazelluläres poly(IC) nicht mit der
Aktivierung der PRDIII-I, des IFN-β-Enhancers oder mit der Sekretion von IFN reagiert
(Thomas Magulski & Kerstin Brack, persönl. Mitteilung). Da aber Hepatocyten, welche in vivo
den Replikationsort für HAV darstellen, durchaus einen funktionalen TLR3-Weg besitzen (197),
sollte dieser Signalweg auch in den bislang verwendeten FRhK-4-Zellen untersucht werden,
zumal diese die benötigten Komponenten auch exprimieren (Abb. 18). In Analogie zu den in
vielen Labors verwendeten, nicht HAV-infizierbaren HEK293-Zellen, die nur bei TLR3-
Überexpression diesen auch auf der Zelloberfläche, und nicht nur in intrazellulären Vesikeln,
exponieren, wurde zunächst eine stabil transfizierte Zellpopulation (FRhK-4/TLR3) hergestellt,
welche anschließend für Experimente mit extrazellulärer poly(IC)-Stimulation genutzt wurde.
Dies war allein deshalb notwendig, weil die alleinige TLR3-Überexpression nicht zu
nennenswerten Reporterinduktionen führt. Die Untersuchungen zum TLR3-Signaling wurden in
Zusammenarbeit mit Ines L. Mordhorst durchgeführt (229), welche im Rahmen ihrer parallel
durchgeführten Diplomarbeit die stabile TLR3-Population herstellte und für die gezeigten
Reporterexperimente verwendete.
91
3.2.2.1. Nachweis der TLR3-Überexpression in FRhK-4/TLR3-Zellen mittels RT-PCR
Der erste Schritt bestand in der Transfektion einer 10cm-Schale FRhK-4-Zellen mit 13 µg des
TLR3-Expressionsplasmides pUNO-hTLR3, gefolgt von einer Selektion transfizierter Zellen
mittels Blasticidin S. Die überlebende Zellpopulation (FRhK-4/TLR3) wurde daraufhin per
semiquantitativer RT-PCR auf eine Überexpression des TLR3 untersucht.
Nach Extraktion der RNA aus unbehandelten FRhK-4- und FRhK-4/TLR3-Zellen
(Durchführung Ines L. Mordhorst) wurden 2 µg RNA für den TLR3- und 1 µg RNA für den
β-Actin-mRNA-Nachweis in die RT-Reaktion eingesetzt. Die erhaltenen, noch nicht
amplifizierten TLR3-cDNAs wurden zusätzlich 1:2, 1:5, 1:10 und 1:20 verdünnt und zusammen
mit allen anderen Proben der PCR unterworfen, als Kontrollen dienten Ansätze ohne RT bzw.
ggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggg
gggggg
Abb. 20: RT-PCR zum Nachweis der TLR3-Überexpression in FRhK-4/TLR3-Zellen. In dieReverse Transkriptions-Reaktion wurden für den TLR3- bzw. β-Actin-mRNA-Nachweis 2 µg bzw. 1 µgRNA aus FRhK-4- oder FRhK-4/TLR3-Zellen eingesetzt. Die erhaltene TLR3-cDNA wurde vor ihrerAmplifikation 1:2 bis 1:20 vorverdünnt. Anschließend wurden alle Proben in der PCR vervielfältigt undim 1% Agarosegel elektrophoretisch separiert. Ansätze ohne Reverse Transkriptase (RT) oder ohneRNA dienten als Kontrollen.
ohne RNA. Die Amplifikate wurden im 1% Agarosegel aufgetrennt, das Ergebnis ist in Abb. 20
gezeigt. Es lässt sich eindeutig ersehen, dass FRhK-4-Zellen, wie bereits bekannt, TLR3-mRNA
exprimieren, und dass FRhK-4/TLR3-Zellen deutliche größere Mengen TLR3-mRNA
aufweisen. Die semiquantitative Aussage wird dabei durch die Verdünnungen des PCR-
Templates und die mitgeführte β-Actin-Kontrolle gestützt.
92
3.2.2.2. Zeitabhängigkeit der Stimulierbarkeit des TLR3 in FRhK-4-Zellen
Die extrazelluläre Stimulation des TLR3 auf FRhK-4-Zellen sollte mithilfe der PRDIII-I-
kontrollierten Luciferase-Expression detektiert werden. Es war dafür zunächst der optimale
Zeitpunkt für die poly(IC)-Stimulation zu ermitteln. Laborintern wurden für die Stimulation stets
100 µg/ml poly(IC) verwendet (25), im Gegensatz zu 20 µg/ml bei der poly(IC)-Transfektion.
FRhK-4- und FRhK-4/TLR3-Zellen wurden einen Tag vor der Transfektion des (PRDIII-I)4-
Luc-Reporterplasmides (je 1 µg zusammen mit 4 µg pcDNA3 als Füllplasmid ad 5 µg) in 6cm-
Schalen umgesetzt. 24 h nach Plasmidtransfektion wurde das Medium gewechselt. Einen bzw.
zwei weitere Tage später, also 72 bzw. 96 h nach Umsetzen der Zellen in die Schalen wurde die
poly(IC)-Stimulation (100 µg/ml in Medium) durchgeführt. Eine Mediumbehandlung wurde als
Kontrolle für die Induktionsansätze mitgeführt. 18 h nach poly(IC)-Induktion wurden die Zellen
lysiert und alle Proben gemeinsam mit 20 µg Proteineinsatz im Luciferase-Assay ausgewertet
(Abb. 21). Es zeigte sich, dass FRhK-4- und FRhK-4/TLR3-Zellen 72 h nach Umsetzen nur
schwach auf poly(IC)-Stimulation reagieren konnten, denn in zwei von drei
ggggggggggggggggggg
Abb. 21: Zeitabhängigkeit der TLR3-vermittelten IRF-3-Aktivierung in FRhK-4-Zellen.FRhK-4-Zellen oder deren stabil TLR3-exprimierende Population (FRhK-4/TLR3) wurdeneinen Tag nach Umsetzen in 6cm-Schalen mit je 1 µg (PRDIII-I)4-Luc-Reporterplasmid + je4 µg pcDNA3 als Füllplasmid cotransfiziert. Am nächsten Tage erfolgte ein Mediumwechsel.Einen bzw. zwei Tage darauf (= 72 h bzw. 96 h nach Umsetzen) wurden die Zellenextrazellulär mit 100 µg/ml poly(IC) in Medium stimuliert und jeweils 18 h später durchAuftauen/Einfrieren lysiert. Alle Proben wurden gemeinsam im Luciferase-Assay ausgewertet,bei Einsatz von 20 µg Protein. Dargestellt sind Mittelwerte mit Standardabweichungen ausDoppel- bzw. Dreifachbestimmungen [Medium- bzw. poly(IC)-Ansätze].
93
Versuchsdurchläufen blieben die Reporteraktivitäten auf Hintergrundniveau oder waren im
Mittel nur etwa 2- bis 3-fach erhöht (Abb. 21). Erfolgte die poly(IC)-Stimulation hingegen einen
Tag später, also 96 h nach Umsetzen der Zellen, konnte sogar bei "normalen" FRhK-4-Zellen
eine deutliche Induktion der PRDIII-I erreicht werden; diese Induktion der IRF-3-Aktivität lag
im Vergleich zu 72 h nach Umsetzen bis zu dreimal höher und war in FRhK-4/TLR3-Zellen
noch erhöht. Der zusätzliche, hier erstmalig einbezogene Inkubationstag war also
ausschlaggebend, und offensichtlich unterliegt die Fähigkeit von FRhK-4-Zellen, ob mit oder
ohne Überexpression des TLR3, auf extrazelluläres poly(IC) zu reagieren, einer
Zeitabhängigkeit, welche sich auf den Zeitraum zwischen Umsetzen und Stimulation richtet.
Zudem hat die nachgewiesene TLR3-mRNA-Expression ihre Entsprechung auf funktionaler
Ebene gefunden, bestätigt durch die verstärkte Reaktion der FRhK-4/TLR3-Zellen auf poly(IC)-
Stimulation. In den folgenden Experimenten mit HAV-infizierten Zellen wurde mit einem 96 h-
Zeitraum gearbeitet.
3.2.2.3. Beeinträchtigung der durch TLR3-Stimulation induzierten IRF-3-Aktivierung in HAV/7-infizierten FRhK-4- und FRhK-4/TLR3-Zellen
Nach der Bestätigung der Fähigkeit von FRhK-4-Zellen, ab 96 h nach Umsetzen auf
extrazelluläres poly(IC) reagieren zu können, konnten Versuche mit HAV-infizierten Zellen
begonnen werden. Es wurden weiterhin "normale" FRhK-4-Zellen sowie FRhK-4/TLR3-Zellen
verwendet. 10 Tage nach HAV/7-Infektion wurden die Zellen in 6cm-Schalen umgesetzt und am
nächsten Tag die vollständige HAV-Infektion per Immunfluoreszenztest kontrolliert. Es folgte
die Cotransfektion mit (PRDIII-I)4-Luc und pcDNA3 (s.o.), und 24 h darauf wurde das Medium
gewechselt. Zwei weitere Tage danach, also 96 h nach Umsetzen, wurden die entsprechenden
Ansätze mit 100 µg/ml poly(IC) in Medium stimuliert, zum Vergleich wurden auch poly(IC)-
Transfektionen vorgenommen (20 µg/ml in 100 µg/ml DEAE-Dextran in Medium). Die üblichen
Kontrollen beinhalteten Mediumbehandlung und DEAE-Dextran-Behandlung. 18 h nach dieser
Induktion wurden die Zellen lysiert und die Reporteraktivität mit 20 µg Proteineinsatz im
Luciferase-Assay bestimmt (Abb. 22). Nach DEAE-Dextran-vermittelter poly(IC)-Transfektion
konnte HAV wie erwartet die Aktivierung von IRF-3 vollständig supprimieren; diese Ansätze
dienten als Kontrolle für die Funktionalität des inhibitorischen Mechanismus in den HAV-
infizierten Zellen. Die Suppression war dabei sowohl in FRhK-4-, als auch in FRhK-4/TLR3-
Zellen zu beobachten. Bei Stimulation mit extrazellulärem poly(IC) hingegen war in beiden
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ggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggg
gggggg
Abb. 22: Beeinträchtigung der TLR3-vermittelten IRF-3-Aktivierung durch HAV. FRhK-4- oderFRhK-4/TLR3-Zellen wurden einen Tag nach Umsetzen in 6cm-Schalen mit 1 µg Reporterplasmid[(PRDIII-I)4-Luc] + 4 µg Füllplasmid (pcDNA3) cotransfiziert, nachdem die HAV-Infektion per Immun-fluoreszenztest kontrolliert worden war. 24 h später wurde das Medium gewechselt, und weitere 48 hdanach, also 96 h nach Umsetzen, wurde mit extrazellulärem poly(IC) stimuliert (100 µg/ml, rechteHälfte) oder mit poly(IC) transfiziert [20 µg/ml in 100 µg/ml DEAE-Dextran (DD), linke Hälfte]. 18 hnach Induktion wurden die Zellen durch Auftauen/Einfrieren lysiert und die Luciferase-Reporteraktivitätdurch Einsatz von 20 µg Protein in den Luciferase-Assay quantifiziert. Dargestellt sind Mittelwerte mitStandardabweichungen aus Doppelbestimmungen.
Zellvarianten die erreichte Induktion der PRDIII-I nur unvollständig unterdrückt (Abb. 22, rechte
Hälfte). Dennoch lag die Suppression in FRhK-4-Zellen nach Abzug des Hintergrundes bei etwa
70%. In FRhK-4/TLR3-Zellen, die nach poly(IC)-Stimulation stets ein stärkeres, und ein für die
Aussage somit klareres Reportersignal lieferten, reduzierte HAV die PRDIII-I-Induktion um
etwa 50%. Die erhaltenen Werte ähneln auffallend denen aus den TRIF-Überexpressions-
experimenten (Abb. 19), es darf daher geschlossen werden, dass die Suppression des TLR3-
vermittelten Signalweges durch HAV in Zellkultur nur unvollständig erfolgt, dabei aber dennoch
etwa 50% Reduktion erreicht.
95
4. Diskussion ____________________________________________________________
Die Beschreibung des antiviral wirkenden Interferons durch Isaacs und Lindenmann als
sezerniertes Makromolekül, dessen Synthese in Chorioallantoismembranzellen durch
hitzeinaktiviertes Influenzavirus stimuliert werden konnte, war zweifellos der Grundstein für die
Erforschung der Induktion und der Wirkung der Interferone und in der Folge auch der
Aufklärung der Funktionsweise des unspezifischen Immunsystems (140). Die Untersuchungen
blieben dabei natürlich nicht auf die zelluläre Seite, also die des viralen Wirts, beschränkt,
sondern schlossen auch die Charakterisierung der Interaktionen des Virus mit der Zelle ein.
Schon 1960, drei Jahre nach Publikation der Entdeckung des Interferons, veröffentlichte
Lindenmann neue Daten, die ein als "Inverse Interferenz" bezeichnetes Phänomen beschrieben
(207). Es hatte sich herausgestellt, dass Wildtyp-Influenzavirus in der frühen Infektionsphase
kein Interferon induziert, und dass zudem die IFN-Induktion durch hitzeinaktiviertes Virus bei
dessen gleichzeitiger oder nachfolgender Infektion supprimiert wurde. Diesem ersten Beispiel
einer viralen IFN-Suppression sollten viele weitere folgen (s.u.). Eines davon ist das Hepatitis A-
Virus, welches in Zellkultur bei Ausbildung einer persistenten Infektion keine
Interferonsekretion induziert. Untersuchungen auf mRNA-Ebene und die Verwendung von
IFN-β-Enhancer-Reporterkonstrukten ermöglichten die Präzisierung dieser Aussage
dahingehend, dass HAV die Induktion des IFN-β-Gens nach poly(IC)-Transfektion bereits auf
transkriptionaler Ebene aktiv supprimiert. Darüber hinaus zeigten transiente und stabile
Reporter-Transfektionsexperimente, dass nur die PRDIII-I des IFN-β-Enhancers durch HAV
eine Negativregulation erfährt, im Gegensatz zur PRDII, die nach poly(IC)-Transfektion
verstärkt aktiviert wird (31, 93, 352). Es stand somit fest, dass IRF-3 mit größter
Wahrscheinlichkeit der betroffene Transkriptionsfaktor war, dessen Aktivierung oder Funktion
durch HAV negativ beeinflusst wurde, sofern nicht die PRDIII-I durch direkte Bindung eines
viralen oder zellulären Repressors blockiert wurde. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den
viralen Angriffspunkt im Aktivierungsweg zur dsRNA-abhängigen Induktion der PRDIII-I durch
IRF-3 zu lokalisieren.
Die zahlreichen neuen Erkenntnisse bezüglich der IRF-3-Aktivierung durch doppelsträngige
RNA (siehe Einleitung und Abb. 7) ermöglichten erst die hier durchgeführten Untersuchungen.
So wird intrazelluläre dsRNA durch das cytoplasmatische RIG-I, oder dessen Verwandten
MDA-5, gebunden. Es kommt daraufhin zur Aktivierung von IKKε oder TBK1, die über die
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CARD-Domäne des RIG-I vermittelt wird. Der CARD-Adapter MAVS (Abb. 3), welcher die
genannten Komponenten verbindet, war bis vor kurzem unbekannt und konnte daher im Rahmen
dieser Arbeit nicht untersucht werden. Die Kinasen IKKε oder TBK1, in Proteinkomplexen mit
z.B. TANK zuweilen als Virus-activated kinase (VAK)-Komplex bezeichnet, phosphorylieren
direkt den Carboxyterminus von IRF-3 und regulieren so dessen Dimerisierung, nucleäre
Translokation, p300/CBP-Assoziation und damit die Induktion IRF-3-abhängiger Gene wie
IFN-β. Extrazelluläre oder endosomale dsRNA wird hingegen vom TLR3, einem
Transmembran-Rezeptor, gebunden, der nach seiner Di- oder Oligomerisierung und lysosomaler
Ansäuerung des Kompartiments das Signal mittels seines intrazellulären Adapters TRIF
weiterleitet (Abb. 7). TRIF assoziiert direkt mit TBK1 (und evtl. IKKε) sowie IRF-3 und
kontrolliert so, unter Beteiligung des unterstützenden PI3K/AKT-vermittelten Weges, die
Aktivierung von IRF-3 (297, 298, 301).
Für die Durchführung der geplanten Experimente musste zuerst das verwendete
Transfektionsreagens, jetPEI, bezüglich seiner Fähigkeit, eine strikte Cotransfektion mit zwei
Plasmiden auch in HAV-infizierten Zellen zu ermöglichen, getestet werden. Dies gelang mithilfe
der Expression plasmidcodierter fluoreszierender Proteine (GFP-IRF-3 und HcRed), deren
Coexpression auch in HAV-infizierten Zellen mit vergleichbarer Effizienz visuell ablesbar war
(Abb. 9); dies war auch bei Veränderung der relativen Plasmidmengen zueinander der Fall
(Daten nicht gezeigt). Eine derartige Cotransfektion wäre z.B. mit mechanischen
Transfektionsmethoden nicht zu gewährleisten, sie war aber für den gleichzeitigen Einsatz von
Expressionsvektor und Reporterplasmid essentiell.
Anschließend sollte die Einsetzbarkeit des Newcastle Disease-Virus (NDV) überprüft werden.
NDV und andere Paramyxoviren induzieren über RIG-I, und dabei TLR3/TRIF-unabhängig,
IFN-β (99, 197, 386). Diese Induktion wird durch das Hepatitis A-Virus unterdrückt, wobei
sicherzustellen war, dass nicht etwa eine Inhibition der Replikation von NDV in HAV-infizierten
Zellen ursächlich für diesen Effekt war. Aus diesem Grunde wurde eine NDV-
Replikationskinetik (One step growth curve) in mock- bzw. HAV-infizierten Zellen durchgeführt
(Abb. 10). Die Ergebnisse belegen, dass die NDV-Replikation von einer bestehenden HAV-
Infektion unbeeinflusst bleibt, daher wurde NDV in den folgenden Experimenten als potenter
IRF-3-Aktivator und IFN-β-Induktor eingesetzt.
Ganz am Anfang der Untersuchungen zum IRF-3-Aktivierungsweg stand die Frage, ob die
HAV-vermittelte Suppression der PRDIII-I auf einem Eingriff in die Aktivierung von IRF-3
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beruhte, und wenn ja, wo dieser Eingriff stattfand. Die nucleäre Translokation des aktivierten
IRF-3 bot sich als Startpunkt an: Sollte die Translokation des IRF-3 in HAV-infizierten Zellen
nach NDV-Induktion stattfinden können, so wäre z.B. die Inhibition der p300/CBP-Assoziation
oder der DNA-Bindung ein möglicher Mechanismus, neben der Bindung der PRDIII-I durch
einen Repressor. Wäre jedoch die Translokation des IRF-3 trotz NDV-Induktion unterbunden, so
müsste HAV in den cytoplasmatischen Aktivierungsweg eingreifen oder spezifisch den
Transport von IRF-3 in den Zellkern verhindern. FRhK-4-Zellen, die stabil das GFP-IRF-3-
Fusionsprotein exprimierten, wurden daher nach HAV-Infektion mit NDV infiziert (Abb. 11). In
der Tat war die nucleäre Translokation des GFP-IRF-3 in NDV-infizierten Zellen komplett durch
HAV unterbunden. Dies lieferte den ersten Hinweis auf IRF-3 als Target für HAV, und die
Befunde verwiesen auf einen cytoplasmatischen Angriffspunkt von HAV. Die geschilderten
Versuche wurden auch mit poly(IC)-Transfektion durchgeführt, mit dem gleichen Ergebnis
(Abb. 12); beide Stimuli wiesen somit eine funktionale Äquivalenz auf. Die Untersuchung der
IRF-3-Phosphorylierung und -Dimerisierung per Immunoblot im Rahmen einer parallelen
Doktorarbeit lieferte die Bestätigung der bisherigen Ergebnisse: Weder die Phosphorylierung
oder Dimerisierung des IRF-3, noch dessen Degradierung, konnten in HAV-infizierten Zellen
nachgewiesen werden (93, und Dajana Grotheer, persönl. Mitteilung). Zudem konnte in den
IFN-insensitiven FRhK-4-Zellen kein IRF-7-Protein detektiert werden (Kerstin Brack und Sonja
Händschke, persönl. Mitteilung). Diese Daten verwiesen in ihrer Gesamtheit klar auf die
Blockierung der Aktivierung des IRF-3 als Mechanismus der HAV-vermittelten Suppression.
Als nächster Schritt waren daher die beiden direkten Mediatoren der IRF-3-Aktivierung
einbezogen worden, nämlich IKKε und TBK1 (Abb. 13 und 14). Die Überexpression der
einzelnen Kinasen resultierte bereits in der Induktion des IFN-β-Enhancers oder der PRDIII-I,
wobei deren Ausmaß stets hinter der Induktion durch NDV zurückblieb. Warum dies der Fall
war, ist unerklärlich, bedeutet aber keinerlei Nachteil für die Interpretation der Ergebnisse. Die
Aktivität von IKKε oder TBK1 nach ihrer Überexpression mag auf der thermodynamischen
Begünstigung der Bildung von Proteinkomplexen mit endogenem IRF-3 und evtl. MAVS oder
TANK beruhen, hierzu existieren allerdings keine Daten. Die Situation in zuvor HAV-infizierten
FRhK-4-Zellen war besonders aufschlussreich. So wurde zwar die NDV-induzierte
Reporterexpression vollständig supprimiert, was die funktionale Integrität der viralen Hemmung
bestätigte, die IKKε/TBK1-vermittelte Induktion hingegen blieb unbeeinflusst. Zudem wurde in
TBK1-transfizierten Ansätzen mit NDV-Superinfektion nur die NDV-induzierte Luciferase-
Expression durch HAV unterdrückt (Abb. 14 B). Dies weist klar auf einen IKKε/TBK1-
98
unabhängigen Suppressionsmechanismus von HAV hin, welcher upstream der beiden Kinasen
im IRF-3-Aktivierungsweg liegen muss. Anderenfalls wäre es zu einer partiellen Inhibition der
Kinaseaktivitäten durch HAV gekommen, wie sie z.B. für das Rabiesvirus-P-Protein bei TBK1-
Überexpression beschrieben werden konnte (36). Darüber hinaus birgt eine spezifische
Hemmung eines Proteins, welches in Redundanz mit einem verwandten Protein funktioniert,
immer den möglichen Nachteil der Unterwanderung der Suppression, daher ist ein solches
Target (wie IKKε/TBK1) nicht für das "Ziel" einer vollständigen Signalunterdrückung geeignet,
wie sie bei HAV-Infektionen zu beobachten ist. Im übrigen konnten zwei weitere Erkenntnisse
gewonnen werden: Zum einen inhibiert HAV offensichtlich nicht die nucleäre Translokation
oder die DNA-Bindung von IRF-3, zum anderen wird die PRDIII-I in HAV-infizierten Zellen
nicht durch einen Binderepressor blockiert, denn sonst wären IKKε und TBK1 nicht zur
Induktion der PRDIII-I-abhängigen Reporterexpression befähigt gewesen.
Da die Rolle des IKKε/TBK1-bindenden Proteins TANK bei der intrazellulären IRF-3-
Aktivierung noch ungeklärt ist, wurde es in den Untersuchungen berücksichtigt (Abb. 15). Die
Überexpression des TANK führte nicht zur IRF-3-Aktivierung, allerdings verstärkte TANK die
PRDIII-I-Induktion nach NDV-Infektion. Die Anwesenheit zusätzlichen TANK-Proteins,
nachgewiesen per Immunoblot, konnte dagegen nicht die HAV-vermittelte Suppression
kompetieren, somit ist nicht von einer direkten Interaktion von HAV mit TANK auszugehen.
Das Target des Hepatitis A-Virus muss somit oberhalb des VAK-Komplexes liegen. Da zu
diesem Zeitpunkt die Proteine FADD und RIP1 als Bestandteile des intrazellulären IRF-3-
Aktivierungsweges postuliert worden waren (Abb. 3) (17), wurde das Adapterprotein FADD,
welches dank seiner Death Domain für gewöhnlich in Apoptosewegen eine Rolle spielt und des
weiteren bei der NF-κB-Aktivierung mitwirken kann (48, 165), in Überexpressionsexperimenten
untersucht (Daten nicht gezeigt). Überraschender Weise supprimierte FADD vollständig die
NDV- und die RIG-I-induzierte IRF-3-Aktivierung, im Gegensatz zu einer aminoterminal
deletierten Mutante, dem FADD-∆N. Die HAV-vermittelte Suppression blieb in beiden Fällen
unverändert, und da die Resultate keine Aussage bezüglich HAV erlaubten, sind sie in der
vorliegenden Arbeit nicht dargestellt. Es ist allerdings bemerkenswert, dass Kawai et al. kürzlich
die direkte Assoziation von FADD mit dem Adapter MAVS zeigen konnten (165), und dass die
Überexpression des FADD-∆C-Proteins (bestehend aus dem N-Terminus) die MAVS-induzierte
NF-κB-Aktivierung hemmen konnte. Der N-Terminus ist also womöglich in der Lage, MAVS
zu binden und so zu inhibieren, was auch die obige IRF-3-Suppression durch das full length-
FADD, nicht aber durch das FADD-∆N (ohne N-Terminus), erklären könnte. Gegenwärtig ist
99
die Rolle von FADD und RIP1 bei der IRF-3-Aktivierung noch undefiniert, es sollte aber an
dieser Stelle darauf hingewiesen werden, dass die beobachtete Suppression von IRF-3-
abhängiger Genexpression durch FADD potentiell durch Hemmung von MAVS möglich wäre.
Das Sensormolekül für intrazelluläre dsRNA stellt, wie erwähnt, die RNA-Helicase RIG-I dar,
gemeinsam mit dem verwandten MDA-5 (298). Eine RIG-I-Überexpression in FRhK-4-Zellen
führte zu einer robusten IFN-β-Enhancer- und PRDIII-I-Induktion, welche genau wie im Falle
einer NDV-Infektion vollständig durch HAV supprimiert wurde (Abb. 16). Der Mechanismus
der Suppression basierte also nicht auf der Maskierung doppelsträngiger RNA durch ein virales
Protein oder das zelluläre LGP2, und offenbar kam es auch nicht zur direkten Interaktion von
HAV mit RIG-I, denn eine derartige Situation hätte in einer Kompetition des viralen Effektes
resultiert. Des weiteren mag auch hier die Überlegung zutreffen, dass eine Protein-
Redundanzsituation (wie RIG-I/MDA-5) kein ideales Target für die vollständige Unterdrückung
eines Signalweges bietet. Den geschilderten Ergebnissen zufolge muss also der Angriffspunkt
des Hepatitis A-Virus im intrazellulären IRF-3-Weg zwischen dem dsRNA-Rezeptor
RIG-I/MDA-5 und den Kinasen IKKε/TBK1 liegen.
Um die Stimuli NDV-Infektion und poly(IC)-Transfektion als intrazellulär, und somit TLR3-
unabhängig charakterisieren zu können, wurde eine RIG-I-Mutante eingesetzt (RIG-IC), welche
nur aus der carboxyterminalen Helicase-Domäne besteht und nicht die signaltransduzierende
CARD-Domäne besitzt. Diese cytoplasmatische Helicase, die in ihrer Funktion dem endogenen
LGP2 gleichkommt (273, 386), kann cytoplasmatische dsRNA binden und ATP-abhängig
entwinden, sie also der Erkennung durch RIG-I/MDA-5 entziehen. TLR3-vermittelte Signale
werden auf diese Weise nicht blockiert. Die Überexpression von RIG-IC supprimierte tatsächlich
vollständig die IFN-β-Enhancer-Induktion durch NDV-Infektion oder poly(IC)-Transfektion
(Abb. 17). Im Zusammenhang mit der anschließenden RT-PCR zum Nachweis von RIG-I-
mRNA in den stets verwendeten FRhK-4-Zellen, mittels welcher die Expression von RIG-I
nachgewiesen werden konnte (Abb. 18), lässt sich nun die Aussage treffen, dass das
intrazelluläre dsRNA-Signaling zur Aktivierung von IRF-3 und dem IFN-β-Enhancer durch
NDV-Infektion oder poly(IC)-Transfektion auch in FRhK-4-Zellen durch RIG-I vermittelt und
durch das Hepatitis A-Virus vollständig supprimiert wird.
Wie erwähnt deuten die Ergebnisse ferner daraufhin, dass der virale Angriffspunkt zwischen
RIG-I und IKKε/TBK1 liegt, somit kommt nach jetzigem Stand des Wissens nur der Adapter
MAVS in Frage, gewissermaßen die Schlüsselstelle des intrazellulären dsRNA-Signalings
100
(Abb. 23). Bedauerlicher Weise konnte MAVS aufgrund seiner späten Entdeckung im Rahmen
dieser Arbeit nicht mehr untersucht werden.
Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde der Einfluss von HAV auf Komponenten des extrazellulären
dsRNA-Signalweges untersucht, welcher durch TLR3 und den Adapter TRIF initialisiert wird. In
früheren Experimenten der Arbeitsgruppe hatten FRhK-4-Zellen nicht auf Stimulation mit
extrazellulärem poly(IC) reagiert, die angewendeten CAT-Reporter-ELISAs zeigten keinerlei
Induktion von IFN-β-Enhancer oder PRDIII-I, außerdem verlief der Nachweis sezernierter
IFN-Aktivität nach Stimulation negativ (Thomas Magulski und Kerstin Brack, persönl.
Mitteilung). Vor Beginn der Untersuchungen wurde daher zunächst untersucht, ob jene Zellen
die mRNA für TLR3 und TRIF exprimieren, um eine Erklärungsmöglichkeit zu finden. Der
Nachweis per RT-PCR verlief für beide positiv (Abb. 18). Da für verschiedene Zelltypen die
intrazelluläre Lokalisation des TLR3 in endosomalen Vesikeln beschrieben worden war, mit
allenfalls schwacher Exposition auf der Zelloberfläche (104, 218, 238, 239, 260, 297), wurde
beschlossen, eine stabile TLR3-Überexpression in FRhK-4-Zellen vorzunehmen, um eine
verstärkte Lokalisation auf der Zelloberfläche zu erreichen. Ein solches Verhalten war bereits für
transformierte humane embryonale Nierenzellen (HEK293) beschrieben worden (104). In
Ermangelung eines TLR3-spezifischen Antikörpers zum Nachweis des unmarkierten
überexprimierten TLR3 wurde der erhöhte TLR3-Expressionslevel mittels semiquantitativer
RT-PCR nachgewiesen (Abb. 20). Das Resultat rechtfertigte Experimente mit FRhK-4- und
FRhK-4/TLR3-Zellen, die mit PRDIII-I-Luc-Reporterplasmiden transfiziert und mit
extrazellulärem poly(IC) stimuliert wurden, um den Stimulationszeitpunkt zu optimieren
(Abb. 21). Bei diesen Experimenten stellte sich heraus, dass eine Zeitabhängigkeit für die
Reaktion auf extrazelluläre dsRNA bestand. Die IRF-3-Aktivierung konnte erst 96 h nach
Umsetzen der Zellen verlässlich und ausreichend stark induziert werden, mit vergleichsweise
schwachem Reporter-Output nach 72 h, welche in früheren Experimenten der Arbeitsgruppe
maximal bis zur Stimulation verstrichen waren. Es bot sich mit diesen neuen Resultaten eine
gute Erklärungsmöglichkeit, die bezüglich der Reaktionsfähigkeit der "normalen" FRhK-4-
Zellen auch in Einklang mit dem positiven mRNA-Nachweis für TLR3 und TRIF stand.
Möglicherweise benötigen FRhK-4-Zellen, welche ein epitheliales Wachstumsverhalten zeigen,
einige Tage Zeit, um nach Kontaktinhibition durch benachbarte Zellen eine Polarisierung zu
erreichen oder ein Gleichgewicht des TLR3-Shuttlings von Endosomen zur Zelloberfläche und
zurück aufzubauen. Hierüber ist aber noch nichts bekannt. Abgesehen davon besteht natürlich
die Möglichkeit, dass die exponierte Ectodomäne des TLR3 beim trypsinvermittelten Ablösen
101
der Zellen proteolytisch entfernt worden war; dies wird durch Nutzung einer proteasefreien
Ablösemethode rasch zu überprüfen sein. Es ist im übrigen auffällig, dass die Differenz der
Reporteraktivitäten zwischen FRhK-4- und FRhK-4/TLR3-Zellen, gemessen am relativen
Unterschied der TLR3-mRNA-Expression, mit maximal 25% recht gering ausfiel (Abb. 21). Es
bleibt auch hier Raum für Vermutungen; es ist denkbar, dass der intrazelluläre, endogene Pool
von TRIF-Proteinen nicht ausreicht, um eine proportionale Signalverstärkung dank erhöhter
TLR3-Expression zu vermitteln. Ebenso wäre möglich, dass überexprimierter TLR3 zum
größten Teil in Vesikeln zurückgehalten wurde. Die Tatsache, dass der exogene TLR3 humanen
Ursprungs war, ist dabei nicht problematisch, die Nucleotidsequenzidentität der intrazellulären
TIR-Domäne beträgt zwischen Mensch und Rhesusaffe (Macaca mulatta) 97% (279).
Nach der Ermittlung eines geeigneten Stimulationszeitpunktes konnten Experimente zum
Einfluss einer HAV-Infektion auf das TLR3-Signaling durchgeführt werden. Erneut kamen
FRhK-4- und FRhK-4/TLR3-Zellen zum Einsatz, als Kontrollen für die Integrität des viralen
Suppressionsmechanismus wurde jeweils auch die TLR3-unabhängige DEAE-Dextran-
vermittelte Transfektion von poly(IC) vorgenommen (Abb. 22). Sowohl intra- als auch
extrazelluläre poly(IC)-Stimulation resultierte in einer deutlichen PRDIII-I-Induktion, die in
FRhK-4/TLR3-Zellen stärker ausfiel, überraschender Weise auch nach poly(IC)-Transfektion.
Während die IRF-3-abhängige PRDIII-I-Induktion nach poly(IC)-Transfektion durch HAV
vollständig unterdrückt wurde, konnte die Induktion durch extrazelluläres poly(IC) in FRhK-4-
bzw. FRhK-4/TLR3-Zellen nur zu 70% bzw. 50% supprimiert werden. Für ein besseres
Verständnis dieses Phänomens wurde zusätzlich die Signalwegskomponente TRIF untersucht.
Die Überexpression des Adapterproteins TRIF führte in FRhK-4-Zellen zur Induktion von
IFN-β-Enhancer und PRDIII-I (Abb. 19). Dieser Effekt wurde in der Literatur zwar vielfach
beschrieben, aber nie erklärt (34, 122, 149, 362, 377). TRIF besitzt zwar keine Kinasedomäne,
verfügt jedoch genau wie der TLR3 über eine TIR-Domäne, welche Proteininteraktionen
vermittelt (248, 377). Die bei Überexpression vorhandene große Menge TRIF-Protein mag
sodann zur Bildung von Oligomeren neigen, die ansonsten nur über eine TLR3/TRIF-
Komplexierung entstünden, mit der Folge einer Signaltransduktion. Eine vorangehende HAV-
Infektion in FRhK-4-Zellen bewirkte bei TRIF-Überexpression eine Reduktion der
Reporterinduktion um etwa 40-50%, ein Effekt, der in auffälliger Weise an die Resultate der
TLR3-Stimulation erinnerte. Handelte es sich um eine direkte Interaktion von HAV mit TRIF,
wie sie den TLR3-Experimenten zufolge denkbar gewesen wäre, so hätte bei TRIF-
102
Überexpression der Suppressionseffekt stärker abgeschwächt oder gar aufgehoben werden
müssen. Dies legt die Vermutung nahe, dass eine andere, limitierte Komponente, die sowohl bei
TLR3-Stimulation als auch bei TRIF-Überexpression entscheidend an der Signaltransduktion
mitwirkt, betroffen war.
Hierfür kommt zunächst das Gerüstprotein NAP1 in Frage, welches TRIF und TBK1 bindet und
dessen siRNA-medierter Expressions-Knock-down zur Suppression der IRF-3-Aktivierung durch
TLR3 führt. Im Gegensatz zum intrazellulären Signalweg mag es im TLR3-Weg entscheidend
für die Rekrutierung von TBK1 an den TLR3/TRIF-Komplex sein, womit es als mögliches
HAV-Target zu berücksichtigen ist (Abb. 23) (283). Leider konnte es aufgrund mangelnder
Verfügbarkeit eines NAP1-Expressionsvektors nicht untersucht werden. Der zweite mögliche
Angriffspunkt von HAV in den TLR3-Signalweg liegt im hier noch wenig verstandenen
PI3K/AKT-Weg, welcher offenbar nicht bei der Dimerisierung und nucleären Translokation von
IRF-3, wohl aber bei dessen Assoziation mit p300/CBP und der DNA-Bindung eine wichtige
Rolle übernimmt (Abb. 23). Die Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3K) kann die TLR3-TIR-
Domäne und TRIF binden und durch Synthese von Second messengers wie PIP3 die Kinase AKT
aktivieren, welche anschließend auf nicht bekannte Weise zur Gesamtphosphorylierung von
IRF-3 beiträgt. Die Beteiligung des PI3K-Weges beschränkt sich laut bisheriger Kenntnisse auf
den TLR3-Signalweg. Eine katalytisch inaktive PI3K-Untereinheit bzw. die pharmakologische
Hemmung der PI3K können beispielsweise die Induktion des IRF-3-abhängigen ISG56 zum
größten Teil unterdrücken bzw. die Bindung des ISG56-Promotors durch IRF-3 nahezu
blockieren (281). Aus diesem Grunde stellt das PI3K-abhängige Signaling ein mögliches HAV-
Target dar. Es sollte dabei aber bedacht werden, dass die PI3K in zahlreiche zelluläre Prozesse
wie Zellzyklus und Zellwachstum sowie Apoptose involviert ist und durch zahlreiche
Rezeptoren aktiviert werden kann (58). Insofern stellen Proteine wie NAP1 und, im Falle des
intrazellulären Signalweges, MAVS, geeignetere Ziele dar, da ihre Hemmung weniger
Nebeneffekte mit sich brächte. Die auf der Grundlage der Ergebnisse der vorliegenden Arbeit
diskutierten möglichen Angriffspunkte von HAV in die IRF-3-Aktivierungs-Wege sind in
Abb. 23 markiert.
Die Überlegungen zu geeigneten Angriffspunkten des Hepatitis A-Virus in den IRF-3-
Aktivierungsweg werfen die Frage nach bekannten Mechanismen anderer Viren auf. Hierauf soll
im Folgenden, wie in der Einleitung angekündigt, eingegangen werden. Das Typ I-
Interferonsystem, welches sich in die Induktion und Sekretion des Interferons, seine Wirkung
103
über JAK-STAT-induzierte ISG-Induktion, und die Funktion der ISGs selbst unterteilt, bietet
eine Vielzahl von Eingriffsmöglichkeiten. Tatsächlich besitzen sehr viele animale Viren,
vermutlich sogar alle, die Fähigkeit zur Modulation des Interferonsystems. Diese Fähigkeit ist
aus evolutionsbiologischer Sicht essentiell, denn ansonsten hätte ein ungestört funktionierendes
Interferonsystem wahrscheinlich bereits zur Elimination der meisten Viren aus den animalen und
humanen Populationen geführt. Vertreter verschiedenster Virusfamilien besitzen die
Möglichkeit, die Wirkung des IFN-α/β abzuschwächen, indem sie z.B. lösliche IFN-
Rezeptorhomologe produzieren oder die Degradation der JAK- bzw. STAT-Proteine einleiten.
Andere Viren hemmen auf verschiedene Weise die Wirkung von ISGs, wie der PKR, die durch
Bindung spezieller viraler RNAs inhibiert oder deren Proteolyse induziert werden kann. Auch
die Inhibition der RNase L durch Hochregulation des zellulären RLI (RNase L-Inhibitor) ist
beschrieben worden (112, 299, 366). Mit Blick auf das Hepatitis A-Virus soll an dieser Stelle
lediglich auf die Möglichkeiten der Suppression der IFN-Induktion genauer eingegangen
werden.
Die effizienteste Möglichkeit zur Kontrolle des Interferonsystems bietet die Modulation der IFN-
Induktion über die direkte oder indirekte Inhibition von IRF-3 als essentiellem Mediator, wie sie
auch das Hepatitis A-Virus wahrnimmt. Abbildung 23 vermittelt einen Eindruck von der Vielfalt
der Angriffspunkte in die dsRNA-vermittelten IRF-3-Aktivierungswege. Viele Viren
supprimieren die Interferoninduktion nicht vollständig, sondern regulieren sie auf eine Weise,
die ihnen die Replikation und Transmission sichert, ohne dass dabei einerseits eine verfrühte
Elimination durch die IFN-Wirkung stattfindet oder andererseits die virale Infektion aufgrund
vollständiger Suppression der IFN-Induktion und infolgedessen exzessiver Replikation des Virus
für den Wirt letal ist, was die Verbreitung des Virus behindern würde. Die V-Proteine der
Paramyxoviren (wie NDV) sind ein Beispiel dafür; sie binden und inhibieren MDA-5 und
möglicherweise gemeinsam mit den viralen C-Proteinen noch andere Targets (9, 176), dennoch
sind NDV, Sendai-Virus und andere Paramyxoviren potente IFN-Induktoren, und erst bei
Deletion des V-Proteins wird dessen modulatorische Wirkung deutlich (126, 222, 259). Eine
andere Möglichkeit der dsRNA-Rezeptorinhibition nutzt das Vaccinia-Virus (Poxviridae),
dessen A46R-Protein TIR-Homologie besitzt und so durch Bindung der TLR3-TIR das Signaling
hemmen kann (318). Andere Mechanismen greifen bereits auf Ebene der dsRNA selbst: so
können die Proteine NS1 des Influenza A- und B-Virus (Orthomyxoviridae) und E3L des
Vaccinia-Virus intrazelluläre dsRNA binden und somit maskieren (76, 330, 361, 374), gleiches
104
ggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggggg
gggggggggg
Abb. 23: Virale Angriffspunkte in den Signalwegen der IRF-3-Aktivierung. Die IRF-3-Aktivierung durch intra- bzw. extrazelluläre dsRNA kann auf vielfältige Weise durchverschiedenste virale Proteine reguliert werden, welche hier rotviolett coloriert mit Kürzelangabedes zugehörigen Virus (in Klammern) eingetragen sind. Die möglichen Targets desHepatitis A-Virus (HAV) sind in gelb anvisiert. Gestrichelte Linien weisen auf ungesicherteAngriffspunkte hin. Weitere Erläuterungen siehe Text. Die Abkürzungen lauten von oben nachunten: FLUAV, Influenza A-Virus; VV, Vaccinia-Virus; BVDVncp, noncytopathogenes Bovine viraleDiarrhoe-Virus; SeV, Sendai-Virus; SV5, Simian Virus 5; MV, Mumps-Virus; PIV2,Parainfluenzavirus 2; HeV, Hendra-Virus; HCV, Hepatitis C-Virus; RABV, Rabies-Virus; BDV,Borna-Disease-Virus; EBOV, Ebola-Virus; RSV, Respiratorisches Syncytial-Virus; SARS-CoV,Severe acute respiratory syndrome-Coronavirus; HPV-16, Humanes Papilloma-Virus 16; HHV-8,Humanes Herpes-Virus 8; THOV, Thogoto-Virus.
gelingt den nicht-cytopathogenen Varianten des Bovine virale Diarrhoe-Virus (BVDV,
Flaviviridae), deren Erns-Protein in sezernierter Form extrazelluläre dsRNA binden kann (139).
Die Erkennung von Nucleinsäuren über den TLR3 (dsRNA), TLR7 und TLR8 (ssRNA) wird
interessanter Weise durch Nucleosidmethylierung stark erschwert (158, 246), was am Beispiel
der Methylierung von mRNAs von z.B. Herpes simplex-Virus (HSV-1), SV40 und
Influenzavirus (39, 231, 235) möglicherweise als viraler Tarnmechanismus betrachtet werden
kann. Die P-Proteine des Rabiesvirus (Rhabdoviridae) und des Borna Disease-Virus
(Bornaviridae), sowie das N1L-Protein des Vaccinia-Virus sind imstande, die Kinase TBK1 zu
105
binden und so ihre Funktion zu beeinträchtigen, mit der Folge einer verringerten
Phosphorylierung von IRF-3 (36, 74, 349). Viele andere Viren unterbinden die IRF-3-
Phosphorylierung auf noch nicht definierte Weise, darunter das VP35 des Ebolavirus
(Filoviridae), das NS1/2 des Respiratorischen Syncytial-Virus (RSV, Paramyxoviridae) und das
SARS-Coronavirus (Coronaviridae) (22, 30, 316, 317). IRF-3 kann auch durch direkte Bindung
in seiner Funktion beeinträchtigt werden, so wie im Falle des Humanen Papillomavirus-E6-
Proteins (HPV-16, Papillomaviridae) und des Rotavirus-NSP1 (Reoviridae) (115, 272).
Letzteres induziert sogar die Degradierung von IRF-3 (20). Das Thogoto-Virus-ML-Protein
supprimiert hingegen nicht die Phosphorylierung von IRF-3, hemmt aber die IRF-3-
Dimerisierung und dessen Assoziation mit p300/CBP (148). Virale IRF-3-
Suppressionsmechanismen sind aber nicht auf das Cytoplasma begrenzt, sondern erstrecken sich
auch in den Zellkern. Das nucleäre W-Protein des Nipah-Virus (Paramyxoviridae) ist
beispielsweise in der Lage, die Degradierung von aktiviertem IRF-3 nach dessen Translokation
in den Zellkern auf ungeklärte Weise einzuleiten. Auf diese Weise kann das Nipah-Virus sowohl
RIG-I-, als auch TLR3-vermitteltes IRF-3-Signaling unterdrücken (307). Die Assoziation des
IRF-3 mit dem Coaktivator p300/CBP kann kompetiert werden, dies vermögen das erwähnte E6-
Protein des HPV und das herpesvirale vIRF-1 (HHV-8, Herpesviridae), bei letzterem handelt es
sich um ein virales IRF-Homolog (37, 201, 253). Eine sehr spezielle Strategie wird durch das
Classical Swine Fever-Virus (CSFV, Flaviviridae) verfolgt, welches offenbar Einfluss auf den
IRF-3-Promotor nehmen kann, um bereits die Synthese des IRF-3 zu reduzieren (185). Viele
weitere Beispiele von IFN-β-Induktionsantagonisten sind bekannt, wie das Theiler-Virus
(TMEV, Picornaviridae), welches im Gegensatz zum Hepatitis A-Virus ein am Anfang des ORF
codiertes Leader-(L-) Protein besitzt, das die IRF-3-abhängige IFN-Synthese unterdrückt (70,
355). Ein anderer Vertreter der Picornaviren, das Poliovirus, greift zu einem sehr späten
Zeitpunkt ein, indem es die Sekretion von IFN-β, sowie anderen Cytokinen wie Interleukin
(IL)-6 und IL-8, mithilfe seines 3A-Proteins limitiert. Dies erreicht es durch Inhibition des ER-
Golgi-Traffickings, wobei diese Eigenschaft nicht dem HAV-3A zu eigen ist (50, 75).
Die Erforschung des RIG-I-Signalweges war eng verbunden mit der Aufklärung der IRF-3-
Suppression durch das Hepatitis C-Virus (HCV, Flaviviridae). Bereits vor der Identifikation von
RIG-I war publiziert worden, das HCV-NS3/4A-Protein habe die Fähigkeit, die Sendai-Virus-
induzierte IRF-3-Aktivierung zu supprimieren, und dass hierfür die Protease-Funktion des
NS3/4A erforderlich sei (100). HCV verhielt sich also in Zellkultur (als autonom replizierendes
Replikon, da bis dato kein produktives Zellkultursystem für HCV zur Verfügung stand) sehr
ähnlich wie HAV, indem es die IRF-3-Phosphorylierung und -Translokation sowie die
106
Reportergeninduktion blockieren konnte. Mittlerweile sind auch die zellulären Targets von HCV
bekannt: Zum einen degradiert NS3/4A TRIF, und inhibiert somit TLR3-Signaling (198), zum
anderen degradiert es den intrazellulären Adapter MAVS (Abb. 23) (226). Das Hepatitis C-Virus
kann auf diese Weise die Schlüsselproteine beider Signalwege ausschalten und die Synthese von
IFN-β effizient unterdrücken, eine für die virale Persistenz wichtige Eigenschaft, bedenkt man
die IFN-Sensitivität von HCV-Replikons in Zellkultur und den relativ erfolgreichen Einsatz von
IFN bei Hepatitis C-Patienten in vivo. Es drängt sich nun der Gedanke auf, auch das Hepatitis A-
Virus könne womöglich mithilfe seiner 3C-Protease agieren, wenigstens bezüglich seines
prominenten Target-Kandidaten MAVS. Reporterexperimente mit klonierten HAV-Proteinen
deuteten jedoch keineswegs auf eine derartige Funktion der 3C-Protease hin, so dass dieser
Gedanke noch unbeantwortet bleibt (persönl. Mitteilung Thomas Magulski).
Die Vielzahl viraler IFN-Suppressionsmechanismen zeigt, wie wirksam das Typ I-Interferon-
System ist, und es wird deutlich, dass dennoch eine Modulation des Systems durch Viren
dauerhaft etabliert wurde, so als würden Virus und Wirt in balancierter Coexistenz verbleiben.
Womöglich führen radikale virale Mechanismen zu drastischer Letalität, welche die
Transmission des Virus wenigstens in kleinen Populationen terminieren würde; im umgekehrten
Falle würde das betreffende Virus alsbald durch das Interferonsystem eliminiert. Diese
Überlegungen gelten zumindest für den Zeitraum bis zur Aktivierung des spezifischen
Immunsystems, welches dem Wirt in vielen Fällen die Elimination des Virus ermöglicht,
obschon auch dann noch ein Wechselspiel zwischen Wirt und Virus einsetzen kann, z.B. bei
Integration viraler DNA-Genome in das Wirtsgenom. Das Hepatitis A-Virus geht hingegen mit
diesen allgemeinen Überlegungen nicht konform. Es generiert als Replikationsintermediat
nachweisbare Mengen an dsRNA, induziert dabei in Zellkultur aber keinerlei Interferon und
supprimiert dessen dsRNA-abhängige Synthese (31). Trotzdem repliziert HAV ausgesprochen
langsam und unterdrückt zudem die Apoptoseinduktion durch intrazelluläre dsRNA (31). Somit
ist die Replikationsgeschwindigkeit des HAV wenigstens in Zellkultur nicht IFN-kontrolliert.
Bedenkt man, dass in vivo die Leber den einzigen Replikationsort darstellt, gewinnt man den
Eindruck, das Replikations-"Verhalten" von HAV sei auf größtmögliche Unauffälligkeit vom
Erreichen des Targetorgans bis zur Ausscheidung von Nachkommenviren mit den Faeces
ausgelegt. Das Fehlen eines primären, extrahepatischen Replikationsortes mag hierzu beitragen.
Erst die CTL-vermittelte Leberzellzerstörung leitet die eigentliche Hepatitis mit nekrotischen
Gewebsveränderungen ein, begleitet von der Antikörperproduktion durch B- bzw. Plasmazellen,
was in den meisten Fällen zur Abheilung und verzögert zur Elimination des Virus führt. Die
107
langsame Replikation und das Ausbleiben von CPE mögen also für HAV die Voraussetzungen
sein, auf Zellkulturebene eine persistente Infektion zu etablieren, wobei die Blockade der
IFN-α/β-Synthese für das IFN-sensitive Virus grundsätzlich, also auch in vivo, von essentieller
Bedeutung sein dürfte.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnte demonstriert werden, dass der Mechanismus der
Suppression der dsRNA-vermittelten IFN-β-Induktion durch HAV auf der Inhibition der
Aktivierung von IRF-3 beruht, und die Relevanz dieser Fähigkeit von HAV wurde soeben
erläutert, doch sollte nicht unerwähnt bleiben, dass die TLR3-vermittelte IRF-3-Aktivierung in
Reporterassays stets drastisch, aber unvollständig durch HAV reduziert wurde. Es stellt sich
daher die Frage, ob dieses Ergebnis auch auf die Sekretion von IFN-β übertragbar ist, und ob
HAV-dsRNA überhaupt in den extrazellulären Raum oder endosomale Vesikel entlassen wird,
ob also der TLR3-Weg für HAV von Bedeutung ist. Bereits 1985 wurden (rückblickend) hierzu
Befunde erhalten. So wurden humane PBLs (Peripheral blood lymphocytes) bzw. Fibroblasten
nach IFN-Priming, welches durch Hochregulation von IRF-7 und TLR3 die dsRNA-Sensitivität
stark erhöht, mit extrazellulärem poly(IC) stimuliert. Die IFN-Sekretion wurde mittels Bioassay
quantifiziert, und es stellte sich heraus, dass eine HAV-Infektion die IFN-Sekretion (>100 bzw.
1000 IU/ml) auf Null reduzierte (352). Offensichtlich kann eine bezüglich Reporterassay
unvollständige Suppression auf chromosomaler Ebene für eine vollständige Suppression
ausreichend sein. Es ist davon auszugehen, dass die Beeinträchtigung der TLR3-induzierten IFN-
Synthese für HAV in vivo von Nutzen ist, anderenfalls hätte ein solcher Mechanismus ohne
Selektionsdruck wohl nicht etabliert werden können. Noch immer stellt sich daher die Frage der
Erreichbarkeit der intrazellulären dsRNA von HAV für den TLR3; eine HAV-Infektion induziert
keine Zell-Lyse oder Apoptose, somit wird kein Zellinhalt entlassen (31, 353). Die Replikation
des Hepatitis A-Virus ist mit auffälligen Rearrangements intrazellulärer Membransysteme
verbunden (175), ob die membranassoziierte Genomreplikation dabei jedoch eine räumliche
Nähe zu TLR3-Kompartimenten schafft, ist völlig unbekannt. Einen interessanten Aspekt
beinhaltet die Tatsache, dass humane Monocyten HAV-infizierbar sind (373). Sollten auch die
davon abgeleiteten myeloiden Dendritischen Zellen (mDC), die den TLR3 exprimieren und in
vivo wichtige IFN-Produzenten darstellen (153, 294), infizierbar sein, so würde HAV die TLR3-
induzierte IFN-Synthese unterdrücken können, um das in der Einleitung bereits erwähnte IFN-
basierte Cross-priming von T-Zellen durch die mDCs zu schwächen, spätestens zu einem
Zeitpunkt, wo die CTL-vermittelte Lyse der infizierten Leberzellen begonnen hat. Dieser Weg
der verzögerten T-Zell-Aktivierung ist natürlich hochgradig spekulativ.
108
Angesichts der präsentierten Ergebnisse und Fakten könnte man davon ausgehen, dass in vivo im
Serum von HAV-Patienten keinerlei Interferon nachzuweisen ist. Die Angaben zur in vivo-
Situation sind jedoch in der Tat widersprüchlich (268, 335, 389). In vitro konnte nach
Zusammenführung von PBMCs (Peripheral blood mononuclear cells) nichtimmuner Spender
mit HAV-infizierten Zellkulturen anschließend sezerniertes IFN-α nachgewiesen werden (183).
Eine Interferon-Induktion durch HAV in vivo ist, sofern sie tatsächlich auftritt, mit dem jetzigen
Stand des Wissens zumindest kein Widerspruch zu der IFN-Suppression in HAV-infizierten
Zellen. Die zu den PBMCs gehörenden plasmacytoiden Dendritischen Zellen (pDC) exprimieren
zwar nicht (wie die mDCs) den TLR3, wohl aber TLR7, der durch einzelsträngige RNA (z.B.
virale RNA-Genome) aktiviert wird (153, 158, 292). Die pDCs produzieren daraufhin IRF-7-
abhängig, aber IRF-3-unabhängig, IFN-α (346). Die Aktivierung von IRF-7 geschieht bei TLR7
und TLR8 im übrigen unabhängig von TRIF, RIG-I oder IKKε/TBK1 (133, 164), daher würde
eine Infektion von pDCs mit HAV die Induktion von IFN-α vermutlich nicht unterdrücken
können.
Nach diesen Überlegungen zur Relevanz der Unterdrückung der IFN-β-Induktion durch HAV
bleiben natürlich noch Fragen zum Mechanismus der Suppression beider Wege zur IRF-3-
Aktivierung offen, zu deren Beantwortung einige Vorschläge gemacht werden sollen. Neben der
Identifikation des/der verantwortlichen Proteine auf viraler Seite durch Experimente mit
Überexpression einzelner klonierter HAV-Proteine muss auch das jeweils betroffene zelluläre
Protein im RIG-I- bzw. TLR3-Weg gefunden werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit
weisen für den RIG-I-Signalweg deutlich auf ein Protein in der Position wie MAVS hin
(Abb. 23). Die mit einer MAVS-Überexpression verbundene IRF-3- und IFN-β-Enhancer-
Aktivierung wären in diesem Fall durch HAV anteilig kompetierbar. Nach Identifikation des
viralen Effektorproteins wäre eine Copräzipitation beider Proteine vonnöten, um deren
Interaktion nachzuweisen. Möglicherweise ließe sich also das virale Target im intrazellulären
Signalweg relativ schnell nachweisen. Der Angriffspunkt innerhalb des TLR3-Signalweges
könnte wie erwähnt NAP1 oder der PI3K-Weg sein. Beide Proteine wären ebenfalls zunächst
durch Überexpression auf einen Kompetitionseffekt bezüglich HAV zu untersuchen. Der bessere
Weg wäre jedoch ein umgekehrter Ansatz, in dem mithilfe des bereits identifizierten HAV-
Proteins eine Copräzipitation von Kandidaten wie TRIF, NAP1 und PI3K/AKT versucht würde.
Von großem Interesse ist die Lokalisation des TLR3 in FRhK-4-Zellen, insbesondere bei dessen
Überexpression; diese könnte per Immunfluoreszenz oder Durchflusscytometrie bestimmt
werden, um eine Erklärung für die nur relativ schwach ausgeprägte Verstärkung der
109
Reporterinduktion in FRhK-4/TLR3-Zellen zu erhalten. Kinetisch angelegte durchfluss-
cytometrische Analysen würden zudem einen Hinweis geben, ob der TLR3 nach verschieden
langer Inkubation nach Umsetzen zunehmend auf der Zelloberfläche exponiert wird. Der
genutzte Antikörper würde außerdem den TLR3-Expressionsnachweis auf Proteinenebene im
Immunoblot ermöglichen. Ein eleganter Ansatz zur Demonstration der RIG-I-Unabhängigkeit
des Signalings durch extrazelluläres poly(IC) läge im stabilen siRNA-vermittelten Knock-down
von RIG-I und gegebenenfalls MDA-5, wobei FRhK-4-Zellen dann nur noch auf extrazelluläre
dsRNA reagieren dürften. In diesem Zusammenhang wäre die Frage, ob die HAV-IRES-
Struktur, welche eine partiell doppelsträngige RNA-Sekundärstruktur darstellt, zur Initiation des
TLR3-Signalings in der Lage ist, sehr interessant; dies gäbe einen zusätzlichen Hinweis auf die
Relevanz der Suppression des TLR3-Signalings durch HAV. Die Unvollständigkeit der HAV-
vermittelten Reduktion des TLR3-Signals sollte im übrigen auf der Basis endogener IFN-β-
mRNA-Nachweise bzw. IFN-β-Sekretion untersucht werden, um die Signifikanz der Befunde
aus Reporterassays mit FRhK-4-Zellen bewerten zu können.
Nicht vergessen sei an dieser Stelle das Inhibitor-Protein A20 (Abb. 4), welches nach seiner
Induktion über NF-κB die IRF-3- und NF-κB-Aktivierung durch TRIF hemmen kann (179, 275,
362). Da HAV stets zu einer leichten NF-κB-Aktivierung führt (93), wäre ein entsprechender
Mechanismus zwar denkbar, jedoch bindet und inhibiert A20 auch TBK1, welche nicht durch
HAV betroffen ist. Dennoch lohnt auf jeden Fall eine semiquantitative A20-RT-PCR, um zu
ermitteln, ob eine A20-Induktion durch HAV stattfindet.
Die Fähigkeit des Hepatitis A-Virus, die Aktivierung von IRF-3 zu inhibieren, ist womöglich
nicht nur für die Unterdrückung der IFN-β-Induktion von Bedeutung, sondern auch für die
Suppression der dsRNA-induzierten Apoptose. Da IRF-3, sehr wahrscheinlich über die
Induktion bestimmter Gene (siehe Einleitung S. 19), bei der durch NDV- oder Sendai-Virus-
Infektion oder poly(IC)-Transfektion hervorgerufenen Apoptose beteiligt ist (130, 348, 364),
eröffnet sich die Möglichkeit eines Sekundäreffektes der IRF-3-Suppression durch HAV,
welcher in seiner antiapoptotischen Wirkung dem persistenten Charakter einer HAV-Infektion in
Zellkultur zuträglich wäre, gemeinsam mit der Blockade der IFN-β-Induktion und dem
langsamen Replikationsverhalten. Die erwähnte direkte ISG-Induktion über IRF-3 muss dabei
nicht umgehend proapoptotisch wirken, sondern könnte zunächst antivirale Eigenschaften haben.
Wie erwähnt induziert IRF-3 zahlreiche der ansonsten über Interferon aktivierten ISGs (84), so
dass HAV möglicherweise nicht nur als Interferon- sondern auch als IRF-3-sensitiv zu
110
bezeichnen wäre. HAV-Replikationskinetiken in Zellen mit stabiler Überexpression eines
konstitutiv aktiven IRF-3 (203) werden darüber Aufschluss geben können.
Die bevorstehende Identifikation des Proteins im RIG-I-vermittelten Signalweg, welches durch
das Hepatitis A-Virus in seiner Funktion unterdrückt wird, wird außerdem ein Beispiel dafür
geben, dass ein Virus die Schlüsselkomponenten von zellulären Signalwegen im Laufe seiner
Evolution "ausfindig" machen kann, um, wie in diesem Falle, eine vollständige Suppression des
Signalwegs zu erzielen. Das Verständnis viraler Interaktionen mit der Wirtszelle gibt dabei nicht
nur Aufschluss über Pathogenitäts-Mechanismen, sondern es wird zudem umgekehrt möglich,
mithilfe eines Virus oder eines viralen Proteins mehr über zelluläre Prozesse zu lernen, oder es
als Kontrollen für weitere Fragestellungen einzusetzen.
111
5. Zusammenfassung ____________________________________________________________
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollte der Angriffspunkt des Hepatitis A-Virus in den
dsRNA-induzierten Signalwegen zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors IRF-3 lokalisiert
werden, da in HAV-infizierten Zellen die IRF-3-abhängige PRDIII-I des IFN-β-Enhancers
supprimiert wird und somit keine IFN-β-Synthese eingeleitet werden kann.
Unter Verwendung von NDV-Infektionen oder poly(IC)-Transfektionen als IRF-3-
Aktivierungsstimuli konnte zunächst ermittelt werden, dass bereits die nucleäre Translokation
von IRF-3 durch HAV blockiert wird. Die anschließende Überexpression von Komponenten des
intrazellulären, RIG-I-vermittelten dsRNA-Signalwegs und die damit einhergehende
reporterbasierte Untersuchung einer Suppression durch HAV erbrachte anschaulich die
Erkenntnis, dass das virale Target im Signalweg zwischen RIG-I und den IRF-Kinasen IKKε
und TBK1 liegen muss; die Lokalisation innerhalb des intrazellulären Signalwegs ist im Sinne
eines Ausschlussverfahrens gelungen, welches auf den jüngst entdeckten RIG-I-Adapter MAVS
als Target von HAV hinweist.
Erstmals wurde im zweiten Teil der Arbeit der Einfluss des Hepatitis A-Virus auf das TLR3-
vermittelte Signaling durch extrazelluläre dsRNA näher untersucht. Die durch TRIF-
Überexpression oder TLR3-Stimulation hervorgerufene IRF-3-Aktivierung konnte durch HAV
deutlich beeinträchtigt werden, die Suppression gelang aber im Gegensatz zur Aktivierung durch
intrazelluläre dsRNA nicht vollständig.
Das Hepatitis A-Virus besitzt demnach die Fähigkeit, die IRF-3-Aktivierung und IFN-β-
Induktion besonders durch intrazelluläre dsRNA, wie sie auch im Laufe der HAV-Replikation
akkumuliert, effizient zu supprimieren. Diese Eigenschaft ist angesichts des langsamen
Replikationsverhaltens und der persistenten Infektionen in Zellkultur sicherlich auch in vivo von
großer Bedeutung, da das interferonsensitive Hepatitis A-Virus auf diese Weise das
unspezifische Immunsystem unterwandern und seine Replikation bis zum Einsetzen der
spezifischen Immunantwort sichern kann.
112
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Anhang ____________________________________________________________
Anhang 1: Initiation der IFN-β-Transkription durch das Enhanceosom. A, Nach Formierung desEnhanceosoms kommt es über die p300/CBP-assoziierte Acetyltransferase GCN5 zurHistonacetylierung der benachbarten Nucleosomen; B, ATP-abhängiges Chromatin-Remodeling durchden SWI/SNF-Komplex, welcher p300/CBP und acetylierte Histone bindet und die Histon/DNA-Bindungen lockert; Rekrutierung der Polymerase II durch p300/CBP; C, Bindung der freigelegtenTATA-Box durch TFIID (welcher das TATA-Box-binding protein TBP enthält) mit der Folge einesNucleosome sliding um 36 bp downstream und der Transkriptionsinitiation nach Bindung weitererallgemeiner Transkriptionsfaktoren wie TFIIH, -B und -A. (nach Agalioti et al., 2000 und Lomvardas &Thanos, 2001)
Erklärung gemäß $6 Abs. 5 der Promotionsordnung Ich versichere, diese Dissertation mit dem Titel "Untersuchungen zur Suppression der durch doppelsträngige RNA induzierten IFN-β-Expression durch das Hepatitis A-Virus: Inhibition der RIG-I- und TLR3-vermittelten Signalwege zur Aktivierung des Transkriptionsfaktors IRF-3" selbständig verfasst und keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel verwendet zu haben. Bremen, Volker Fensterl