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Inhibition des réactions enzymatiques
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Abréviations utilisées
2
AS : activité spécifique AT : activité totale E : enzyme libre EF : enzyme à l’état fondamental EI : complexe enzyme-inhibiteur EP : complexe enzyme-produit ES : complexe enzyme-substrat ESI : complexe enzyme-substrat-inhibiteur ET : enzyme à l'état de transition I : inhibiteur Ic : inhibiteur compétitif Iirr : inhibiteur irréversible kcat : constante catalytique Ki : constante d'inhibition Km : constante de Michaelis P : produit
S : substrat Sc : substrat compétitif TO : turn-over TP : triphosphate U : unité enzymatique (UI) Vmax : vitesse maximale : vitesse initiale 0v
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Cinétique de Michaëlis-Menten (rappels) :
E + S ESk
1
k-1
E + Pk
2
3
1. Présentation
1.1. Généralités
1
21m
k
kkK
Constante de Michaelis-Menten
[S]
[S]V
s
max0
K
v
Vitesse initiale
cat2 kk
1
1
[ES]
[E][S]
k
kKS
Constante de dissociation de ES en E + S
1. Équilibre rapide entre E + S et ES et k2 lente :
2. Hypothèse de l’état quasi-stationnaire :
[S]
[S]V
m
max0
K
v
Équation de Michaelis-Menten
Km = KS si k2 « k-1
[E]T = [ES] + [E]
Vmax = kcat[E]T
vo = kcat[ES]
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Inhibiteur d’enzyme (I) :
-Entité l’activité enzymatique ( la vitesse d’une réaction enzymatique) :
-En se liant à l’enzyme, un inhibiteur peut :
• empêcher la fixation de S au site actif,
• provoquer une déformation du site actif (notamment à l’état de transition) et
rendre l’enzyme moins active (voire inactive) vs S.
-L’affinité d’I pour E est traduite par la constante d’inhibition Ki :
• Ki = cte de dissociation de EI en E + I (unité : M),
4
• Lorsque [I] = Ki , la moitié des sites enzymatiques est occupée,
• + Ki est petit, + l’affinité d’I pour E est grande,
[EI]
[E][I]
i
i-i
k
kKE + I EI
ki
k-i
0
I
0 vv
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Inhibiteur « idéal » :
• forte affinité (Ki petit) pour E
• forte sélectivité vs S (Km/Ki grand).
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Types de cinétiques d’inhibitrices
Inhibiteurs réversibles :
-Liaison non-covalente (ou covalente) peu stable de l’inhibiteur à l’enzyme (complexes EI,
ESI).
-L'inhibition est réversible (peut être levée), i.e. l’enzyme n’est pas irréversiblement
inhibée :
• Inhibiteurs compétitifs
• Inhibiteurs incompétitifs (et inhibition par excès de substrat)
• Inhibiteurs non-compétitifs purs
• Inhibiteurs non-compétitifs mixtes
Inhibiteurs irréversibles :
-Liaison covalente (ou non-covalente) stable de l’inhibiteur à l’enzyme (complexe E-I)
-Inhibition ne peut pas être levée (inactivation l’enzyme est irréversiblement inhibée) :
• Marqueurs d'affinité
• Inhibiteurs suicides (ou mécanistiques)
• Cas particulier : inhibiteurs dits à interaction lente et/ou à forte affinité : inhibition
non-covalente mais quasi-irréversible (slow-binding, tight-binding inhibitors)
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6
50%
100%
[I] IC50
Mesure du paramètre IC50
IC50 = conc. d’inhibiteur pour laquelle v0 mesurée i.e. sans inhibiteur
(mesure réalisée généralement à [S] = Km)
+
+
+
+
+ +
+
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2pour[I]IC 0
I
050 vv
0
I
0 %50 vv
00 / vv I
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IC50 pour des types différents d’inhibition réversible
BCM 2505 7
Compétitive
𝐼𝐶50 =𝐾𝑖𝐾𝑚
𝑆 + 𝐾𝑖 𝐼𝐶50 > 𝐾𝑖
si 𝑆 = 𝐾𝑚; 𝐼𝐶50 = 2𝐾𝑖 si 𝑆 = 2𝐾𝑚; 𝐼𝐶50 = 3𝐾𝑖 etc.
Incompétitive
𝐼𝐶50 = 𝐾𝑖 +𝐾𝑖𝐾𝑚𝑆
𝐼𝐶50 > 𝐾𝑖
si 𝑆 = 𝐾𝑚; 𝐼𝐶50 = 2𝐾𝑖 si 𝑆 = 2𝐾𝑚; 𝐼𝐶50 = 1.5𝐾𝑖 etc.
Non-compétitive (simple)
𝐼𝐶50= 𝐾𝑖
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Variation de IC50 pour différents types d’inhibition
BCM 2505 8
Graphique sommaire de la variation en IC50
Notez que l’IC50 = Ki en trois cas : 1. inhibition non-compétitive (simple) 2. inhibition compétitive lorsque [S] 0 3. inhibition incompétitive lorsque [S]
• La valeur d’IC50 varie en fonction de la concentration de substrat selon le mode d’inhibition. • Bien que Ki soit constant, la fraction d’enzyme inhibée peut varier considérablement,
dépendante de la concentration de substrat et du mécanisme d’inhibition.
0 2 4 6 8 10 12 14 16
[S] / KM
0
2
4
6
8
10
12
14
16IC
50 / K
i
compétitive
incompétitive
non-compétitive
[S] / Km
incompétitive
non-compétitive
compétitive IC50 / Ki
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2. Inhibiteurs réversibles : structure et mécanisme
2.1. Inhibiteurs analogues de substrats
• Leur structure ressemble à celle du S (ou cofacteur) dans son état fondamental
• Ils sont reconnus par E, sans être transformés (sauf dans le cas des substrats compétitifs)
• Les + courants et les + faciles à concevoir
• Cinétique d'inhibition compétitive
• N'exploitent que l'étape de reconnaissance de S (≠ aux analogues de l'état de transition)
• Sauf cas particulier, sont en général peu efficace (Km/Ki < 10)
• Souvent, il faut [I] >> [S] pour pouvoir entrer en compétition avec le S
Caractéristiques principales :
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10
Structure des inhibiteurs analogues de substrat :
• La fonction réactive de S peut être supprimée ou remplacée par un groupe ne pouvant être transformé : I compétitif classique
• Un groupement de S autre que la fonction réactive peut être supprimée ou remplacée :
- soit I n'est pas transformé : I compétitif classique - soit I est transformé : I compétitif particulier = S compétitif
N
OHOP
O
-O
O- CH3
I analogue du cofacteur
N
OHOP
O
-O
O- CHO
PLP (cofacteur)
fonction réactive
CHO
H
OH
OH
OH
CH2OH
H
H
H
H
I analogue de S (2d-G6P)
CHO
OH
OH
OH
OH
CH2OH
H
H
H
H
CH2OH
O
OH
OH
OH
CH2OH
H
H
H
PGI
G6P F6P
fonction réactive
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Inhibition de la dihydroptéroate (DHP) Synthase
• Enzyme présente uniquement chez les bactéries (exemple : M. leprae) : cible idéale ! • Impliquée dans la biosynthèse de l'acide tétrahydrofolique nécessaire à la synthèse des bases purines, pyrimidines (ADN) et de certains aa • Inhibiteurs : dérivés sulfonamides (sulfamides)
Sulfaméthoxazole® (Bayer)
I compétitif : Ki = 0,03 mM
Km/Ki = 20 ! Bon inhibiteur analogue de S,
et de plus, spécifique (la DHP Synthase
n'existe pas chez l'homme !)
J. Bacteriol. 1999,181, 6814-6821
N
N
N
H N H 2 N
O H
P 2 +
N
N
N
H N H 2 N
O H
H N C O O -
Dihydroptéridine acide p-aminobenzoïque
Dihydroptéroate
P 2 DHP Synthase
Km = 0.6 µM
autre fonction remplacée
NH2 SO2NH
N O
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Inhibition de la dihydrofolate réductase
-Biosynthèse de l'acide tétrahydrofolique (suite) -Enzyme présente chez l'homme et les bactéries (exemple : M. tuberculosis)
Trimethoprim
Km = 20 mM
Km/KI = 3
N
N
N
H N H 2 N
O H
H N C O O -
Dihydroptéroate
G l u
Dihydrofolate Synthase
N
N
N
H N H 2 N
O H
H N C O N H
Dihydrofolate Réductase
Dihydrofolate
N A D P H
N A D P +
N
N
N H
H N H 2 N
O H
H N
Tétrahydrofolate
C H C O O -
( C H 2 ) 2
C O O -
C O N H C H C O O -
( C H 2 ) 2
C O O -
Km = 4 µM
Km/Ki = 0,5
Mauvais I, mais sélectivité > efficacité !
H. sapiens : Km = 3 µM, Ki = 41 µM : Km/Ki = 0,07 FEMS Microbiol Lett. 2004, 232, 101-105
I compétitif sélectif de
l'enzyme bactérienne : Ki = 8 mM
NNH2
N
NH2
OMe
OMe
OMe
fonction réactive remplacée
sélectivité
(pas d’effets secondaires chez l’homme)
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Résumé de la biosynthèse du tétrahydrofolate chez les bactéries
acide p-aminobenzoïque
Dihydroptéroate
Dihydrofolate
Tétrahydrofolate
DHP Synthase
DHF Synthase
DHF Réductase
acide folique
(vitamine B9) mammifères
X
X Trimethoprim®
Sulfaméthoxazole®
Purines Pyrimidines Aminoacides
Sulfaméthoxazole® +
Trimethoprim® Bactrim®
S1
S2
I1
I2
Bithérapie antibiotique
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Methotrexate® (anticancéreux à effets secondaires importants). -I compétitif "spécial", dit "à forte affinité".
Inhibition de la dihydrofolate réductase (suite)
Methotrexate® I compétitif : Ki = 6 pM !
Dihydrofolate Km = 3 µM
Km/Ki = 500 000 !
-En réalité, bien que cet I compétitif soit a priori analogue au S, des études structurales ont montré qu'il se fixait dans le site actif de la DHF réductase à l'envers vs S, du fait d'interactions très favorables fortuites !
Arch. Biochem. Biophys. 1971, 142, 417-425
NH
NN
N
NH
NH2
OH
O
O
O-
NH
O
O-
N
NN
N
N
NH2
NH2
O
O
O-
NH
O
O-
CH3
inhibe aussi la DHFR des cellules saines
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C H O
C H O
C O O - , N a +
C O O - , N a +
Éthylène glycol Oxalate
alcool déshydrogénase
+
+
C H O
C H 3
Éthanol Acétaldéhyde
C O O -
C H 3
Acétate
non toxique
S
I
15
Inhibition de l'alcool déshydrogénase par un substrat compétitif
-Alcool déshydrogénase (ADH) : enzyme à NAD+/NADH -Intoxication à l'éthylène glycol (S de l'ADH) : 50 décès / an -Cette réaction peut être inhibée compétitivement par ingestion d'un excès d'éthanol… si l'intoxication est traitée à temps !
-L'éthanol, S naturel de l'ADH, est un I compétitif particulier : c'est un S compétitif de la transformation de l'éthylène glycol
CH2OH
CH2OH
CH2OH
CH3
précipite dans les reins !
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Inhibition de la transcriptase inverse du VIH
2’-deoxythymidine-5’-TP (dTTP)
3’-azido-2’,3’-dideoxy-thymidine-5’-TP (AZT-TP)
O
N
N
NH
O
OHO
NN+-
3’-azido-2’,3’-dideoxy-thymidine (AZT, 1985, BW) (Jérôme Horwitz, 1964)
• AZT-TP (issu de l'AZT) : I compétitif (S compétitif) ~ spécifique de la transcriptase inverse du VIH, analogue du S dTTP • AZT-TP est utilisé par l'enzyme, mais termine la réplication de l'ADN virale (arrêt de chaîne → Ic) • Effets secondaires importants :
- AZT-TP vs. ADN polymérases humaines ? - AZT vs. thymidine kinase (TK) humaine ?
O
O H
N
N H
O
O O P O P
O
O
O
O - O -
P
O - O
O - O
N
N
N H
O
O O P O P
O
O
O
O - O -
P
O - O
O -
N N + -
fonction réactive remplacée
enzyme propre aux rétrovirus
in
out
+ TKs
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Inhibition de l'ADN-polymérase virale
-Aciclovir/Ganciclovir : Ic/Sc spécifiques de la thymidine kinase du virus de l'Herpès-VZV, analogues de la déoxyguanosine.
Ki TKhumaine/Ki TKvirale = 3000 (aciclovir)
-Les dérivés TP formés, Ic/Sc de l'ADN-polymérase, terminent la réplication de l'ADN viral (→ Ic).
Ki ADN-Phumaine/Ki ADN-Pvirale = 100 (aciclovir-TP)
NO
OH
OH
N
NHN
NH2
O
NO
O
OH
N
NHN
NH2
O
NO
O
OH
N
NHN
NH2
O
P PPPTKvirale TKcell.
ADN-polym.
Ganciclovir Ganciclovir-TP
NO
OH
OH N
NHN
NH2
O
Aciclovir Aciclovir-TP
NO
OH N
NHN
NH2
O
aucun effet secondaire
2’-Déoxyguanosine (dG)
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18
Aciclovir – Modèle du « dead-end complex » en présence du prochain dNTP (Cf. Barbara Selisko, Univ. Aix-Marseille II)
Liu et al., J. Biol. Chem. (2004), 281, 18193 BCM 2505
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2.2. Inhibiteurs analogues de l'état de transition
• I analogues de ET : analogues stables de S à l'ET (espèce instable !)
• Leur structure et ppts électroniques ressemblent à celles du S à l'état de transition (ET)
ou d'un intermédiaire réactionnel de haute énergie (IHE)
• La plupart des I dits "analogues de ET" sont en fait des I "analogues d'IHE" plus proche
de l'ET que de l'EF
• Ils sont reconnus par E, sans être transformés
• Conception rationnelle (si mécanisme connu ou postulé)
• Cinétique d'inhibition compétitive
• Exploitent l'étape de reconnaissance de S et l'étape catalytique
• Sont en général très efficaces (Km/Ki très grand)
• Même si [I] << [S], I peut entrer en compétition avec S
Caractéristiques principales :
• E a beaucoup plus d'affinité pour le substrat à l'ET (S≠) que pour le substrat à l'EF (S) E doit avoir bcp + d'affinité pour un I qui ressemble (mime) à S≠ plutôt qu'à S
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• I très efficace (Km/Ki très grand) ne signifie pas automatiquement que I est analogue de ET/IHE (ex. : Methotrexate®). Pour cela, il faut en plus :
-Structures X d’ET comparatives kcat , Km’ Ki
-log Ki = f[log(Km/kcat)] ≈ linéaire pour ≠ S et I analogues de l'ET correspondants :
O
NH
H CH2CH(CH3)2
O
YHN
R
NH
H CH2CH(CH3)2Y
HN
R
HO O-
PNH
H CH2CH(CH3)2
O
YHN
R
O O-
Substrats
IHE tétrahèdriquesO
I analogues de ET(phosphonamides)
Biochemistry (1983) 22, 4618-4624
log Ki
log(Km/kcat)
-5 -4 -3
-8
-7
-6
-5
S
IHE
I
= G# (E+S→ES#)/RT
BCM 2505
RT
‡ΔG
obs eh
kTk
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Exemples d'inhibiteurs analogues de l'ET/IHE :
Inhibition de la triosephosphate isomérase (TIM) de levure
La TIM a 100 x plus d’affinité pour le PGH que pour le DHAP
CH2OPO3
2-O
OHH
HB
CH2OPO3
2-
OH
O-
BH+
CH2OPO3
2-
O-
OH
BH+
CH2OPO3
2-OH
H O
B
DHAP IHEs 1,2-cis-ènediolate G3P
Km = 1,5 mM
O
CH2OPO3
2-O
-
Phosphoglycolate
NHOH
CH2OPO3
2-O
- H+
CH2OPO3
2-O
-N OH
Acide phosphoglycolohydroxamique (PGH)
Ki = 30 µM Km/Ki = 50
Ki = 15 µM Km/Ki = 100
enzyme glycolytique
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Inhibition des glycosidases
O R 2 O
O H
H O X
H
O R 1
X = OH, NHAc R 1 = glycoside R 2 = H, glycoside
O R 2 O
O H
H O X H
O R 2 O
O H
H O X H
R 1 OH O R 2 O
O H
H O X
H
O H
IHE oxocarbonium stabilité par -COO - du site actif :
-par liaison électrostatique (inverting glycosidases : a→b, b→a)
-par liaison covalente (retaining glycosidases : a→a, b→b)
C anomère trigonal (plan) sp 2
O R 2 O
O H
H O X O
H 2 O
H N H O
O H
H O H O O H
H N H O
O H
H O O H H
H
gluconolactones
X = NHAc, R 2 = H
K i = 5x10-7
M ( b -N-Ac-glucosaminidase)
Km/K i moyen = 40 000
Km = 1 à 3 10 -3 M
nojirimycine
K i = 6 x10-10
M ( sucrase)
Km/K i moyen = 3x106 !
+
+
+
sp3 sp2 sp2 sp3
sp2 sp2
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Inhibition de la neuraminidase virale par le Tamiflu®
Oseltamivir® (Tamiflu®)
out in
O COOH
O R
OH
OH
OH
OH
H
AcHN
O+ COOH
OH
OH
OH
OH
H
AcHN
O COOH
OH
OH
OH
OH
OH
H
AcHN+ R OH
COOEt
NH2
OH
AcHN
COO-
NH2
OH
AcHN
IHE
I analogue IHE
sp2
sp2
acide sialique (acide N-acétyle-neuraminique)
Virus « accroché »
Virus « libre »
BCM 2505
Prodrogue
• Bloque les fonctions de la neuraminidase, l’enzyme de surface des virus A et B de la grippe, qui détache des glycoconjugués des résidus acide N-acétyle neuraminique (= acide sialique).
• Cette hydrolyse dont la fonction est incomplètement comprise est une étape nécessaire à la diffusion de l’infection virale.
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24
Inhibition des protéases
R
O
HN
R'
Nu
R
O-
Nu
NHR'
H+
R
O
Nu + R'NH2
IHE tétraèdriqueNu = OH-, SerO-, CysS-
R
O
OR'
Nu
R
O-
Nu
OR'
H+
R
O
Nu+ R'OH
IHE tétraèdriqueNu = OH-, SerO-, CysS-
Activ ité estérase
Activ ité peptidase
sp2
sp2
sp2
sp2 sp3
sp3
RCOOH
RCOOH
BCM 2505
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25
Quelques types d'analogues de l’IHE des protéases
R H
O
R
H O N u
H
a ldéhydes
R C F 2 R '
O
R
H O N u
C F 2 R '
cétones α-difluorées
R B
O H
O H
R B
H O N u
O H
acides boroniques/boronates
-
phosphates
R O P O R '
O
O -
phosphonates
R P O R '
O
O -
phosphinates
R P R '
O
O -
phosphonamidates
R P N H R '
O
O -
fluorophosphates (gaz Sarin)
R O P F
O
R ' O
NuH NuH NuH
RO P N u
O NuH H F
(inhibition irréversible) R
H O H
R '
alcools secondaires (Ritonavir® vs. protéase du VIH)
R’O
1
2
3
L’espèce tétraédrique I anal. de l’IHE est formée par réaction réversible de l’E → complexe EI stable anal. de ES#
I anal. de l’IHE « classiques » (tétraédriques)
I anal. de l’IHE « irréversibles »
BCM 2505
R
H O N u
N H R '
( Nu H = H 2 O , SerOH, CysSH )
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HN
O
N
ONHR'
HN
N
ONHR'HO O-
RHN
O
HN
ONHR'
OH
+
O
N
S
HN
HO H
NH
O
OHN O
NS
N
O
R
O
R
HN
HO H
O
N
O NH
H
H
NH
O
N
H2NOC
Ritonav ir
Saquinav ir
26
Inhibition de la protéase du VIH (protéase à acides aspartiques)
sp2
R-Phe–Pro-R’
sp3
sp3
sp3
Alcools secondaires : liaison C–C très stable, non-hydrolysable !
BCM 2505
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27
Stereoview of the overlay of the inhibitor bound to HTLV-1 protease with the
clinical inhibitors of HIV-1 protease.
Li et al. PNAS (2005)102,18332-18337
Amprenavir, Ritonavir, Nelfinavir, Saquivavir, Indivavir
BCM 2505
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28
3. Inhibiteurs irréversibles
3.1. Marqueurs d'affinité
• Principaux types d'inhibiteurs irréversibles : marqueurs d'affinité et inhibiteurs suicides • Inhibiteurs irréversibles non-spécifiques du site actif (réactifs dits « résidus-spécifiques »)
[EI]
[E][I]
i
i-i
k
kKE + I EI E-I
k-i
ki kinact
complexe covalent
inactif
• Marqueur d'affinité = Réactif chimique formant une liaison covalente stable avec un résidu
du site actif de l'enzyme (réactifs spécifiques du site actif ou « site-spécifique »)
• "active-site irreversible inhibitors"
• L'enzyme est protégée de l'inhibition par le S (ou cofacteur) ou un I compétitif
• Modification irréversible (covalente) de l'enzyme par l'inhibiteur
• Un I irréversible présente un équilibre de fixation (Ki) avec l'enzyme, avant l'étape de
l'inactivation proprement dite (kinact)
BCM 2505
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Marqueurs par affinité
BCM 2505 29
• Réactifs démontrent la spécificité envers un
groupement fonctionnel des acides aminés du site actif – analogues de substrat pour favoriser la liaison aux sites actifs
– contient un groupement réactif (pharmacophore) • typiquement un électrophile qui réagit avec un nucléophile dans le
site actif
• réagissant de façon covalente à un seul site saturable
et de manière stœchiométrique (1 mol d’I / mol d’E)
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Marquage par affinité
• L’enzyme est protégée contre cette inhibition par le substrat (ou
le cofacteur)
• La perte d’activité suit une cinétique de 1er ordre, vu que
l’enzyme est consommée comme un réactif pendant la réaction
• L’inhibition est accompagnée par la modification covalente
irréversible de l’enzyme : – l’enzyme demeure inactive après la séparation de l’excès de l’inhibiteur
– l’inhibiteur reste lié à la protéine après dialyse ou filtration sur gel, et
même après la dénaturation de l’enzyme
BCM 2505 30
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O
Cl
CH2Ph
HNS
O
OO
HN
O
NH
R
CH2Ph
R'
31
Exemple de marquages par affinité
Histidine du site actif de la Chymotrypsine :
Substrat Tosyl Phenylalanine Chloromethyl Ketone (TPCK)
-I irr. analogue de S (mime de S + gpe réactif) - également sur Cys du site actif de la papaïne (Cys-S- 100 x plus réactif que His)
a-halocétone
Liaison covalente stable : His du site actif de la chymotrypsine est irréversiblement modifiée
Ts
O
Cl
CH2Ph
N
N
His
H
Ts
O
CH2Ph
N+
N
His
H
Ts
O
CH2Ph
N
N
His
BCM 2505
Université de Montréal
Faculté de Médecine Département de biochimie
32
Sérine (activée) du site actif des protéases (acétylcholinestérase) :
-I irr. analogue de l’IHE (mime de IHE + gpe réactif)
O
O
NMe3
+
H2O AcOH
OHNMe3
acétylcholine choline
E impliquée dans la régulation de la transmission des impulsions nerveuses aux muscles (notamment respiratoires) !
O
O-
NMe3
OSer
+
IHE
O P
O
F
O O P
O
F
Gaz Sarin diisopropylphosphofluoridate
OSer
H
N
N
His
H
O P
O
F
O O P
O
O
O
Ser
N+
N
His
H
H
F-
Forte affinité d’E pour I + Ser irréversiblement inactivée : inactivation rapide de l’enzyme
Paralysie respiratoire (asphyxie)
BCM 2505
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33
Triosephosphate isomérase :
I irr. analogues des S (mimes de S + gpe réactif)
• Nombreux autres exemples • Peu utilisés en thérapeutique, car forte réactivité chimique (armes chimiques !)
O
N
N
His OPO3
2-
HO
O
OPO32-
TIMO OPO3
2-OH
DHAP G3P
I
O
OPO32-
vs His du sa
OPO32-
vs Asp du sa
O
OH
OPO3
2-O
O
Asp
BCM 2505
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34
3.2. Inhibiteurs suicides
• Inhibiteurs basés sur le mécanisme : « mechanism-based inhibitors » (1978) : 1) Au départ, la réactivité de l'inhibiteur est cachée : il agit comme un substrat. 2) Ensuite, l'enzyme, par son activité, génère l'espèce inhibitrice active EI*.
• Caractéristiques d'inhibition analogues à celles des marqueurs d'affinité, si ce n'est la participation
de l'étape catalytique au processus d'inactivation (effet isotopique sur la cinétique de l'inhibition).
• Présentant une sélectivité encore meilleure que celles des marqueurs d'affinité
• Absence de réactivité intrinsèque initiale : agents thérapeutiques de choix
• Autorise la génération de fonctions très réactives, inaccessibles aux marqueurs d'affinité
• Très nombreux exemples, notamment dans le cas des enzymes à PLP dont le mécanisme implique la
formation d'un carbanion, stabilisé par le PLP. En effet, le substrat "inhibiteur suicide" restant lié au
coenzyme, n'aura pas la tendance à diffuser en dehors du site actif.
E EI EI*E-I+ I
I*E +
ki
k-i
k3k-3
kcat kinact
BCM 2505
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35
Inhibition de l'ornithine décarboxylase par le DFMO (enzyme régulatrice de la biosynthèse des polyamines)
H2N
NH2
HCOOH
enzyme
PLPH2N
NH2
HH + CO2
• La difluorométhylornithine (DFMO) est un inhibiteur suicide de cette enzyme • Le DFMO est reconnu comme substrat (voir inhibition compétitive par l'α-méthylornithine) • L'espèce réactive formée au cours de la réaction (imine conjuguée, EI*) est un accepteur de
Michaël qui va réagir avec un nucléophile du site actif (Cys)
H 2 N
N H 2
C F 2 H C O O H H 2 N
N H 2
CH3 COOH H 2 N
NH+
H
F
α-méthylornithine EI*
1. - COOH , 2. - F-
DFMO
BCM 2505
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36
DFMO + PLP
R
N+
CF2H
H
N+
H
O-
OP
O
O-
O-
O
O H B R
N+
H
N
H
O-
OP
O
O-
O-
F
HF
HB+
H2O CO2
R
N+
H
N+
H
O-
OP
O
O-
O-
F
H
H S Cys
B
R
N+
H
N
H
O-
OP
O
O-
O-
S
HF
Cys
HB+
HF
B
R
N+
H
N+
H
O-
OP
O
O-
O-
S Cys
F HH
Mécanisme d’inhibition de l'ornithine décarboxylase par le DFMO
1. - COOH 2. - F- 3. + CysS- 4. + H+
accepteur de Michaël (EI*) Liaison C–S stable : Cys irréversiblement
modifiée → enzyme inactivée
BCM 2505
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0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
% a
cti
vit
é
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Temps (min)
en absence de substrat
en présence de substrat
Mécanisme d’inactivation • si la cinétique d’inactivation est de second ordre, l’inactivation
se fait entre E et I en solution
• si la cinétique d’inactivation est de premier ordre, l’inactivation
a lieu à partir du complexe E•I
• si l’enzyme est protégé par le substrat, l’inhibiteur se lie au site
actif de l’enzyme :
protection partielle; inhibition irréversible
BCM 2505 37
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Mécanisme cinétique de l'inhibition irréversible
• L’inhibiteur irréversible présente un équilibre rapide de fixation (KI)
avec l'enzyme avant la formation lente et irréversible, proprement dite
kinact, d’un complexe inactif :
BCM 2505 38
• la proportion d’enzyme sous forme complexe binaire E•I augmente avec
la concentration d’I
• Le complexe binaire E•I s’inactive suivant une cinétique du premier ordre
𝐾𝐼 =𝑘−1𝑘1
Complexe covalent
inactif
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Analyse cinétique de l'inhibition irréversible
BCM 2505 39
Les paramètres à utiliser pour évaluer un inhibiteur
irréversible sont: k2 et Ki
𝑑 𝐸−𝐼
𝑑𝑡= 𝑘2 𝐸 ∙ 𝐼 et avec 𝐾𝑖 =
𝐸 𝐼
𝐸 ∙ 𝐼 𝐸 = 𝐸 ∙ 𝐼 ×
𝐾𝑖𝐼
Alors, 𝐸 0 = 𝐸 + 𝐸 ∙ 𝐼 = 𝐸 ∙ 𝐼 1 +𝐾𝑖
𝐼
qui donne 𝐸 ∙ 𝐼 =𝐸 0
1+𝐾𝑖𝐼
𝑑 𝐸 − 𝐼
𝑑𝑡=
𝑘2 𝐸 0
1 +𝐾𝑖𝐼
= 𝑘𝑜𝑏𝑠 𝐸 0 𝑘𝑜𝑏𝑠 =𝑘2 𝐼
𝐾𝑖 + 𝐼
Équilibre rapide
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Analyse cinétique de l'inhibition irréversible
BCM 2505 40
• La perte d'activité de l'enzyme mesurée en fonction du temps à des concentrations différentes d’I suit une cinétique du premier ordre :
avec
- La représentation double réciproque de 1/kobs = f(1/[I]) permet de déterminer les paramètres Ki et kinact :
ln𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡é 𝑟é𝑠𝑖𝑑𝑢𝑒𝑙𝑙𝑒
𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡é 𝑖𝑛𝑖𝑡𝑖𝑎𝑙𝑒= 𝑘𝑜𝑏𝑠𝑡
𝑘𝑜𝑏𝑠 =𝑘𝑖𝑛𝑎𝑐𝑡
1 +𝐼𝐾𝑖
1
𝑘𝑜𝑏𝑠=
1
𝑘𝑖𝑛𝑎𝑐𝑡+
𝐾𝑖𝑘𝑖𝑛𝑎𝑐𝑡
1
[𝐼]
1/k
ob
s
1/[I]
+
+
+
+ -1/Ki
1/kinact
pente = Ki/kinact
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Analyse cinétique de l'inhibition irréversible
BCM 2505 41
En pratique, l’inhibition de la vitesse est suivie en présence du substrat:
𝑘𝑜𝑏𝑠 =𝑘2[𝐼]
𝐾𝑖 1 +[𝑆]𝐾𝑚
+ [𝐼]
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Analyse cinétique de l'inhibition irréversible
BCM 2505 42
• Dans le cas d’un inhibiteur irréversible, la formation de produit en fonction du
temps n’est pas linéaire, et suit une cinétique correspondant à une réaction de
premier ordre:
A – amplitude; kobs - constante de vitesse de
premier ordre (s-1); offset - correction pour signal
initial (ex: fluorescence résiduelle provenant du
milieu de réaction)
[P]
t
Courbe de progrès d’une réaction à 1er ordre
𝑃 = 𝐴 1 − 𝑒−𝑘𝑜𝑏𝑠𝑡 + 𝑜𝑓𝑓𝑠𝑒𝑡
• Pour caractériser un inhibiteur irréversible, il faut déterminer kobs à diverses [I].
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BCM 2505 43
• Si [I] << Ki, seulement le ratio
k2/Kiapp sera déterminé
• Il faut corriger par le facteur
(1 + [S]/KM) ou utiliser des [S]
<< KM, afin d’obtenir k2/Ki
𝑘𝑜𝑏𝑠 =𝑘2 𝐼
𝐾𝑖 1 +𝑆𝐾𝑚
+ 𝐼
• k2 et Kiapp obtenu par régression
non-linéaire avec
𝑘𝑜𝑏𝑠 ≈𝑘2𝐾𝑖
𝐼
1 +𝑆𝐾𝑚
kobs (s-1)
[I]
kobs (s-1)
[I]
Si [I] << Ki
Analyse cinétique de l'inhibition irréversible
𝐾𝑖𝑎𝑝𝑝
= 𝐾𝑖 1 +𝑆
𝐾𝑚
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Rappel: Cinétique d’inhibition irréversible
• Pour les inhibiteurs réversibles, le Ki
sert comme un indice de l’efficacité de
l’inhibition
• Pour les inhibiteurs irréversibles, le
kinact et le Ki ensemble déterminent
l’indice de l’efficacité de l’inhibition
BCM 2505 44
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Inhibiteurs dits à interaction lente
• Inhibition non-covalente et quasi-irréversible
• L’équilibre de liaison avec l’enzyme est atteint
lentement par l’inhibiteur – Des secondes ou minutes pour atteindre l’état stationnaire au lieu des
millisecondes
– L’affinité forte (Ki faible) est possible, cependant les constantes de
vitesses des étapes de liaison et dissociation ont des petites valeurs
BCM 2505 45
Cstes petites 𝐾𝑖 = 𝑘2𝑘1
k1 = 107 M-1s-1 et k2 = 10 s-1 ou k1 = 104 M-1s-1 et k2 = 0.01 s-1 conduit à la même Ki
interaction lente
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Effet cinétique de la liaison lente
• établissement lent de l’équilibre entre la forme libre E et le complexe E•I :
BCM 2505 46
liaison rapide [P]
Temps
sans I
Formation d’EI
Dissociation d’EI
+ I
+ I
Sans pré-incubation avec inhibiteur ; réaction initiée avec enzyme
Enzyme pré-incubée avec inhibiteur ; réaction initiée avec substrat
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Inhibition de la liaison lente
BCM 2505 47
Détermination des paramètres cinétiques
1) Mesurer la vitesse à l’état stationnaire et analyser les données (ex: méthode de Lineweaver-Burk)
2) Analyser le progrès de la réaction, [P] vs temps, dans la région préstationnaire:
vs - vitesse à l’état stationnaire; vo - vitesse initiale; kobs - constante de vitesse de premier ordre
caractérisant la période pré-stationnaire
𝑃 = 𝑣𝑠𝑡 − 𝑣𝑠 − 𝑣0 1 − 𝑒−𝑘𝑜𝑏𝑠𝑡 𝑘𝑜𝑏𝑠 Le cas sans préincubation avec inhibiteur ; réaction initiée avec enzyme
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Inhibition de la liaison lente
BCM 2505 48
𝐾𝑖 = 𝑘4 𝑘3
𝑘𝑜𝑏𝑠 = 𝑘4 + 𝑘3[𝐼] 1 + [𝑆] 𝐾𝑚
si [S] >> [E],
Rappel:
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Cas: Inhibition de la liaison lente
BCM 2505 49
Concentration utilisable pour la caractérisation
Note: une cinétique d’inhibition lente ne dit pas toujours que l’inhibiteur se lie lentement à l’enzyme; la dissociation pourrait être lente uniquement
Mécanisme précédent: 𝑘𝑜𝑏𝑠 = 𝑘4 + 𝑘3[I] 1 + [S] 𝐾𝑚
Si [S] << Km → 𝑘𝑜𝑏𝑠 = 𝑘3[I] + 𝑘4
For [I] = 10-5 M kobs = 102 s-1 t1/2 = 0.0069 s
= 10-7 M kobs = 1 s-1 t1/2 = 0.69 s
= 10-9 M kobs = 0.01 s-1 t1/2 = 69 s
= 10-11 M kobs = 2 x 10-4 s-1 t1/2 = 3450 s
= 10-15 M kobs = 10-4 s-1 t1/2 = 6900 s
𝑘3 = 107𝑀−1𝑠−1
𝑘4 = 10−4𝑠−1 ( ≈ 1 x 3 heures )
𝐾𝑖 =𝑘4𝑘3
= 10−11𝑀 (10 𝑝𝑀)
Mettons
et
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Inhibition à forte affinité
BCM 2505 50
Un “inhibiteur à forte affinité” ne se lie pas nécessairement à l’enzyme avec
une forte affinité !
• “forte affinité” est un terme plutôt subjectif
• Il faut mieux parler de comportement “forte affinité” pour le profil cinétique
observé aux conditions de l’essai.
Pour un inhibiteur avec Ki = 1 µM
1) Essai effectué à [E] = 1 nM [I] sera toujours >> [E]
• la “perte” d’inhibiteur lié à E est négligeable; [I]libre = [I]T
• inhibition classique, les conditions “Michaelis-Menten” s’appliquent
2) Essai effectué à [E] = 1 µM [I] [E]
• la perte d’inhibiteur est significatif; [I]libre [I]T
• comportement “forte affinité”
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Inhibition par liaison à forte affinité
• inhibition classique : – haute concentration en I par rapport de [E]
• [I] >> [E] et [S] >> [E]
– [I] libre [I] totale (équilibre rapide et constant)
– v [E], en absence et en présence de l’inhibiteur
• inhibition de forte affinité : – Faible concentration en I – similaire à [E]
• [I] [E] (l’inhibiteur est efficace à [I] [E]), cependant [S] >> [E]
– [I] libre [I] totale (la formation de E•I réduit [I] libre, on ne peut pas
considérer que [I] est cste)
– v vs [E] n’est pas linéaire
BCM 2505 51
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Inhibition à forte affinité
BCM 2505 52
• Pour un inhibiteur compétitif à forte affinité, le Ki est obtenu par
régression non-linéaire de l’équation:
• Une autre façon d’obtenir le Ki est de diminuer la concentration
d’enzyme utilisée lors de l’essai (par exemple en utilisant un essai plus
sensible), pour avoir [I] >> [E]
• On peut alors utiliser un graphique de Lineweaver-Burk, par exemple,
pour obtenir le Ki
𝑣𝑖 =𝑘𝑐𝑎𝑡 𝑆
2 𝐾𝑚 + 𝑆𝐾𝑖 + 𝐼 𝑇 + 𝐸 𝑇
2 − 4[𝐸]𝑇[𝐼]𝑇− 𝐾𝑖 + 𝐼 𝑇 − 𝐸 𝑇
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Identification de l’inhibition à forte affinité
1. les concentrations (mesurées) de l’enzyme et de l’inhibiteur
sont similaires
2. le Ki est comparable à [E] dans l’essai cinétique très faible
3. l’inhibiteur est difficile à séparer de l’enzyme (par ex. par
dialyse ou filtration de gel)
4. le degré d’inhibition varie avec la concentration d’enzyme
(IC50 [E])
5. les courbes de Ackermann-Potter (v vs [E]) ne sont pas
linéaires
BCM 2505 53
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Courbes de Ackermann-Potter
BCM 2505 54
Ki classique Ki très élevé
[I] = 0 [I] = x [I] = 0
vi
[I] > [E]
[I] [E]
[I] < [E]
[E]T x
Inhibition de forte affinité [I] [E];
à [I] constante, v est f([E]) non-linéaire due à la formation significative de [EI]
Inhibition classique [I] >> [E];
à [I] constante, v [E]
concentrations similaires
Perte de l’activité due
à la formation de [EI]
Ki [E]
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Courbes de Ackermann-Potter • à Ki > [E] et [I], faible déviation de la linéarité :
BCM 2505 55
0 1 2 3 4
[E]T (nM)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100v n
orm
alis
ée
Ki = 6 nM
[I] = 0 nM 1.5 nM
4.5 nM
3.0 nM
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Courbes de Ackermann-Potter • à Ki < [E] et [I], forte déviation de la linéarité :
BCM 2505 56
0 1 2 3 4
[E]T (nM)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100v n
orm
alis
ée
Ki = 0.6 nM
[I] = 0 nM
1.5 nM
4.5 nM
3.0 nM
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Courbes de Ackermann-Potter
• à Ki << [E] et [I], très forte déviation de la linéarité :
BCM 2505 57
0 1 2 3 4
[E]T (nM)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100v n
orm
alis
ée
Ki = 0.06 nM
[I] = 0 nM
1.5 nM
4.5 nM
3.0 nM
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Courbes de Ackermann-Potter • à Ki <<< [E] et [I], on a le titrage stœchiométrique :
BCM 2505 58
0 1 2 3 4
[E]T (nM)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100v n
orm
alis
ée
Ki = 0.006 nM
[I] = 0 nM
1.5 nM
4.5 nM
3.0 nM
pas d’inhibition; v [E] à [E]>[I]
décalée par [I]
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Exemple de l’inhibition lente à forte affinité
• Les enzymes effectuent la catalyse en stabilisant l’état de transition d’une
réaction; alors, elles démontrent une grande affinité pour des analogues
d’état de transition
• 5'-méthylthioadenosine/S-adenosylhomocystéine nucléosidase catalyse
l’hydrolyse du nucléoside 5'-méthylthioadenosine en adénine et thioribose.
Singh V, et al. Femtomolar transition state analogue inhibitors of 5'-methylthioadenosine/S-adenosylhomocysteine nucleosidase from Escherichia coli. J Biol Chem. 2005 May 6;280(18):18265-73.
BCM 2505 59
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Exemple de l’inhibition lente à forte affinité
BCM 2505 60
• Des études mécanistiques suggèrent les aspects chimiques spécifiques à l’état de transition de la réaction
• Modélisation / enzymologie computationnelle facilite ensuite la conception des analogues appropriés
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Exemple de l’inhibition lente à forte affinité
• Les analogues de l’état de transition montrent souvent de
l’inhibition lente due au fait que l’enzyme change sa conformation à
celle propice pour la catalyse (recherche d’une conformation rare):
très stable
BCM 2505 61
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Équations pour IC50 (forte affinité)
• IC50 pour les trois modes d’inhibition réversible :
BCM 2505 62
N.B. : IC50 ½ [E]T
Mode d’inhibition Équation
compétitif
incompétitif
non-compétitif (simple)
[S]]E[IC Mi
iT21
50
KKK
iT21
50 ]E[IC K
]S[]E[ICM
iiT2
150
K
KK
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BCM 2505 63
Classe
d’inhibiteur
Relation entre
[E]T et [I]T
Équilibre
Traites
caractéristiques
classique [I]T >> [E]T Rapide (ms)
IC50 ne dépend pas de [E]T ;
v vs [E]T linéaire
[P] vs temps linéaire
« tight-binding » [I]T [E]T Rapide (ms)
IC50 dépend de [E]T ;
v vs [E]T non-linéaire
[P] vs temps linéaire
« slow-binding » [I]T >> [E]T Lent (s à min)
IC50 ne dépend pas de [E]T ;
v vs [E]T linéaire
[P] vs temps non-linéaire
« slow, tight-
binding » [I]T [E]T Lent (s à min)
IC50 dépend de [E]T ;
v vs [E]T non-linéaire
[P] vs temps non-linéaire
Tableau sommaire des inhibiteurs réversibles
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Remerciements
Pr Jeffrey Keillor, Département de chimie, Université
d’Ottawa, 10 Marie-Curie, Ottawa, ON K1N 6H5
Dr Robert Menard (défunt), Chef de groupe, Institut de
recherche en biotechnologie du CNRC, 6100, avenue
Royalmount, Montréal, QC H4P 2R2
Pr Laurent Salmon & Dr Casimir Blonski, Institut de Chimie
Moléculaire et des Matériaux d’Orsay (ICMMO), Université
Paris-Sud 11, 91405 Orsay Cedex, France
BCM 2505 64