inhibitory a aktivátory
DESCRIPTION
Inhibitory a aktivátory. Inhibitory. Látky snižující rychlost enzymově katalyzované reakce Látky nejrůznější povahy – ionty, organické i anorganické látky Nízkomolekulární i vysokomolekulární látky Vyvolávají buď změnu struktury molekuly enzymu, nebo konkurují substrátu. - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Inhibitory
• Látky snižující rychlost enzymově katalyzované reakce
• Látky nejrůznější povahy – ionty, organické i anorganické látky
• Nízkomolekulární i vysokomolekulární látky
• Vyvolávají buď změnu struktury molekuly enzymu, nebo konkurují substrátu
Klasifikace inhibitorů
• Podle původu (přirozené a umělé)• Podle specifity účinku (specifické a nespecifické)• Reversibilní (možno odstranit dialysou) a ireversibilní
(nemohou být odstraněny dialysou)• Podle mechanismu působení (reversibilní)- kompetitivní- nekompetitivní- akompetitivní- smíšené
Rozlišení typů inhibice- Podle změn Vmax a KM u inhibované a neinhibované
reakce
Význam inhibitorů
• Regulace enzymové aktivity
• Studium enzymové aktivity
• Zásahy do látkové přeměny organismů
- léčiva (antibiotika, cytostatika)
- herbicidy, insekticidy
- vojenské bojové látky
Kompetitivní inhibitory
• Mají strukturu podobnou substrátu (buď celá molekula, nebo část uplatňující se při vazbě na enzym)
• V přítomnosti inhibitoru se vytváří inaktivní komplex enzym-inhibitor
• Tvorba komplexu s inhibitorem je vratná• Za přítomnosti substrátu dochází ke kompetici• Účinek inhibitoru lze zcela odstranit dostatečně
vysokou koncentrací substrátu• Často využívány jako léčiva
Kompetitivní inhibitory
Kompetitivní inhibice
Sukcinát Glutarát Malonát Oxalát
Sukcinátdehydrogenasa
Substrát Kompetitivní inhibitorProdukt
C-OO-
C-H C-H C-OO-
C-OO-
H-C-H H-C-H C-OO-
C-OO-
H-C-H H-C-H H-C-H C-OO-
C-OO-
C-OO-
C-OO-
H-C-H C-OO-
Kompetitivní inhibitory
Kompetitivní inhibice
k1 kcat
E + S <===> ES ===> P + E k-1
E + I EI
KI = [E][I] / [EI] KI = inhibiční konstanta
Kompetitivní inhibice - kalkulace
[E]tot = [E] + [ES] + [EI]
[E]tot = [E] + [ES] + [E][I] / KI
[E]tot = [E] (1 + [I]/KI) + [ES]
Vyjádříme [E] :
[E] = [E]tot - [ES] / (1 + [I]/KI)
KI = [E][I] / [EI]
Kompetitivní inhibice - kalkulace
Víme že:
Rozšíříme poslední rovnici členem [S] / [ES]
[E] = [E]tot - [ES] / (1 + [I]/KI)
[E][S]/[ES] = KM = ([E]tot - [ES])[S] / (1 + [I]/KI)[ES]
Vyjádříme [ES]
E S ES
k 1 kcatk1
KM
Kompetitivní inhibice - kalkulace
[ES] = [E]tot [S] / (KM + [S] + KM[I]/KI)
Analogická úprava jako v klasické rovnici MM (rozšíření obou stran rovnice výrazem kcat)
)/][1(
][max
IM KIKS
SVv
Kompetitivní inhibice
Výnos podle Lineweaver-Burka
• Maximální rychlost reakce se nemění
• KM se u inhibované reakce zvyšuje
Sulfonamidy jako kompetitivní inhibitory
-COOHH2N-
-SONH2H2N-
PrekursorFolát Tetrahydro-
folát
Sulfonamidy
Para-aminobenzoová kyselina (PABA)
Bakterie potřebují PABA pro biosynthesu folátu
Sulfonamidy mají podobnou strukturu jako PABA, ainhibují bakteriální růst.
Domagk (1939)
Tato metabolická dráha pro biosynthesu folátu se nenachází u člověka!
Nekompetitivní inhibitory
• Neovlivňují vazbu substrátu na enzym (neváží se do aktivního centra)
• Snižují rychlost přeměny substrátu na produkt• Účinek inhibitoru je nezávislý na koncentraci
substrátu• Mechanismus účinku je založen na alosterickém
efektu (inhibitor se váže mimo aktivní centrum a mění jeho konformaci na neaktivní)
• Inhibitor se váže na samotný enzym i na komplex enzym-substrát
Nekompetitivní inhibice
Nekompetitivní inhibice
Nekompetitivní inhibice
Zjednodušující předpoklad:
• Substrát neovlivňuje vazbu inhibitoru na enzym
• Reakce E + I EI
a reakce ES + I ESI
mají stejné inhibiční konstanty KI
Nekompetitivní inhibice - kalkulace
[E]tot = [E] + [ES] + [EI] + [ESI]
[E]tot = [E] + [ES] + [E][I] / KI + [ES][I] / KI
[E]tot = ([E] + [ES]) (1 + [I]/KI)
Vyjádříme [E] :
[E] = [[E]tot / (1 + [I]/KI)] - [ES]
KI = [E][I] / [EI]
KI = [ES][I] / [ESI]
Nekompetitivní inhibice - kalkulace
Víme že:
Rozšíříme poslední rovnici členem [S] / [ES]
[E] = [[E]tot / (1 + [I]/KI)] - [ES]
[E][S]/[ES] = KM = [[E]tot / (1 + [I]/KI)] [[S]/[ES]] - S
Vyjádříme [ES] a provedeme analogickou úprava jako v klasické rovnici MM (rozšíření obou stran rovnice výrazem kcat). Získáme výraz:
E S ES
k 1 kcatk1
KM
Nekompetitivní inhibice - kalkulace
MI KS
S
KI
Vv
][
][
/][1
max
Nekompetitivní inhibice
Výnos podle Lineweaver-Burka
• Maximální rychlost inhibované reakce se snižuje
• KM se u inhibované reakce nemění
Akompetitivní inhibitory
• Mohou se vázat na enzym až když vazba substrátu vhodně pozmění jeho konformaci
• Nereagují s volným enzymem!• Vazbou na komplex enzym-substrát (vytvořením
komplexu ESI) zabrání jeho přeměně na enzym a produkt
• Hlavně u dvousubstrátových reakcí (inhibitor se váže na vazebné místo pro druhý substrát)
• Existuje pouze několik případů
Akompetitivní inhibice
Akompetitivní inhibice
Akompetitivní inhibice
Výnos podle Lineweaver-Burka
• Maximální rychlost i KM se u inhibované reakce snižuje stejnou měrou
Inhibice enzymové aktivity (mechanismy)
I
I
S
S
S I
I
I II
S
kompetitivní nekompetitivní akompetitivní
EE
Different siteCompete for
active siteInhibitor
Substrate
Ca
rtoo
n G
uid
eEq
uatio
n an
d De
scrip
tion
[II] binds to free [E] only,and competes with [S];increasing [S] overcomesInhibition by [II].
[II] binds to free [E] or [ES] complex; Increasing [S] cannot overcome [II] inhibition.
[II] binds to [ES] complex only, increasing [S] favorsthe inhibition by [II].
E + S → ES → E + P + II↓EII
←
↑
E + S → ES → E + P + + II II↓ ↓EII + S →EIIS
←
↑ ↑
E + S → ES → E + P + II ↓ EIIS
←
↑
EI
S X
Juang RH (2004) BCbasics
Km
Inhibice enzymové aktivity (grafy)
I II kompetitivní nekompetitivní acompetitivní
Dir
ect
Plo
tsD
ou
ble
Rec
ipro
cal
Vmax Vmax
Km Km’ [S], mM
vo
[S], mM
vo
II II
Km [S], mM
Vmax
II
Km’
Vmax’Vmax’
Vmax unchangedKm increased
Vmax decreasedKm unchanged
Both Vmax & Km decreased
II
1/[S]1/Km
1/vo
1/ Vmax
II
Two parallellines
II
Intersect at X axis
1/vo
1/ Vmax
1/[S]1/Km 1/[S]1/Km
1/ Vmax
1/vo
Intersect at Y axis
= Km’
Juang RH (2004) BCbasics
Ireversibilní inhibitory
• Enzym je kovalentně modifikován po interakci s inhibitorem
• Typickým příkladem jsou organofosfáty (insekticidy, nervové bojové látky) ireversibilní inhibitory acetylcholinesterasy tvoří kovalentní komplex s hydroxyskupinou serinu
• -SH skupiny cysteinu mohou být modifikovány alkylací
E-SH + ICH2COO- E-S-CH2COO- + HI
Ireversibilní inhibitory
Ireversibilní inhibitory
• Tyto inhibitory jsou využívány pro studium aktivních center enzymů (díky kovalentní vazbě je možno v hydrolyzátu detegovat příslušnou aminokyselinu)
Studium aktivního místa chymotrypsinu
Modifikace chymotrypsinu DIFP (diisopropylfluorfosfát)
• Modifikován pouze Ser 195• Ostatní serinové zbytky nejsou modifikovány• Ser 195 se nachází v aktivním místě
Proč je modifikován pouze Ser 195?• Vyšší reaktivita díky sousedním aminokyselinám
v aktivním centru
Studium aktivního místa chymotrypsinu
Modifikace chymotrypsinu TPCK (N-tosylamido-L-phenylethylchloromethylketon)
• Modifikován pouze His 57• Ostatní histidinové zbytky nejsou modifikovány• TPCK napodobuje substrát
Proč je modifikován pouze His 57?• Vyšší reaktivita díky sousedním aminokyselinám v
aktivním centru• His 57 je v aktivním místě enzymu• His 57 a Ser 195 jsou blízko sebe
Inhibice substrátem
• Vysoká koncentrace substrátu• Pokud molekula substrátu musí být vázána v
aktivním centru vícebodovým záchytem konkurence molekul substrátu o vazebná místa nedokonalá orientace substrátu v aktivním centru
• Může způsobovat problémy při stanovení enzymové aktivity nebo při praktickém využití enzymů (enzymové technologie, biotechnologie)
Inhibice produktem
• Mechanismus zpětné vazby
• Zabrání se hromadění produktu
Aspartate transcarbamylase
Feedback Inhibition
Aktivace enzymů
• Aktivátory pozitivně ovlivňují rychlost enzymové reakce• Váží se na molekulu enzymu vratně
Typické příklady:• Ca2+ (mnohé enzymy; pozor na používání fosfátových
pufrů!), stabilizace proteinové struktury• EDTA (odstranění inhibujících kovových iontů)• -SH sloučeniny (např. merkaptoethanol) – reaktivace
thiolových skupin cysteinu• Chloridové ionty – aktivace živočišných α-amylas
Laboratoře z Enzymologie
• 2 dny (za sebou) v průběhu měsíce ledna
Přednášky z Enzymologie
www.usbe.cas.cz/people/safarik