inleidingsles automatische celtellingen

GASO-ASO Klinische Biologie

Inleidingsles automatische celtellingen

dr. apr.-biol. D. Kieffer

Automatische celtellingen

Algemeen

2

Abbott

Sysmex

Beckman-Coulter

Siemens


Algemeen

• celtellingen:

– grote aantallen te analyseren stalen

– meetfouten verbonden aan de manuele technieken

volautomatische analysetoestellen.

• volautomatische analyse:

– vertrekkend van 100-200 µL volbloed (K2EDTA),

– zelfstandig uitvoeren van een aantal diluties,

– simultane analyse van verschillende parameters

– resultaten - al dan niet na elektronische verwerking – samengevoegd op rapport

– doorsturen van deze resultaten naar een externe computer (LIS)

3


Algemeen

• naargelang complexiteit van analysetoestel: 7 (Hb, Hct, RBC, WBC, MCV, MCH, MCHC) tot > 110 meetgegevens al dan niet inclusief volledige (5-diff) of partiële (3-diff) WBC formule

• staalname: manueel of automatisch, vanaf open of gesloten bloedstaal

• allemaal uitgerust met barcode-lezer, zodat de meest frequente en gevaarlijke fouten, namelijk staalverwisselingen, theoretisch kunnen voorkomen worden

4


Algemeen

• monster volumina Sysmex XE-5000 Sysmex XN

– capillair bloed 40 µL /

– manueel/open 130 µL 88 µL

– automatisch/gesloten 200 µL 88 µL

– lichaamsvochten 130 µL 88 µL

5


6

Algemeen

• dilutorgedeelte meestal twee hoofdsuspensies bereid

– 1 in functie van analysen i.v.m. WBC en hemoglobine

– 1 sterker verdunde in functie van analysen i.v.m. RBC en PLT.

– metingen ivm WBC worden uitgevoerd na voorafgaande lyse van de RBC.

• hoge precisie bij aanmaak diluties (CV < 0.5 % voor volumes van enkele mL)

– roterende klep (“shear valve” of “sample rotor valve”)

– 3 keramische elementen, 2 vaste en 1 bewegend, met uitsparingen bepaald volume


7

Algemeen

• werking:

– stap 1 : aanzuiging bloed; de verschillende uitsparingen worden met bloed gevuld

– stap 2 : rotatie van het bewegend gedeelte, waardoor één of meer welbepaalde delen van de bloedlijn afgesneden worden

– stap 3 : terugspuiten afgesneden gedeelten van de bloedlijn met welbepaalde volumes diluens, waardoor zeer nauwkeurige diluties worden verkregen

• van 100 tot 200 µL opgezogen staal: slechts de laatste tientallen µL gebruikt; grootste deel van bloed om toestel te “decontamineren” van voorgaande staal.


Algemeen

8


Algemeen

9

Sysmex XE-5000

Bron: Sysmex Be/Nl


Hoofdprincipes

• colorimetrie

• impedantie

• lichtverstrooiing & fluorescentie

• lichtverstrooiing & conductiviteit

Bijkomende principes

• cytochemie

• specifieke lyse

• hoogfrequent wisselstroom

• depolarizatie verstrooid licht

10


Hoofdprincipes

• colorimetrie

• impedantie




• cytochemie

• specifieke lyse



11


Hoofdprincipes: colorimetrie

• Hb referentie methode – manueel

– RBC lyseren in 1:500 verdunning

– stap 1: Hb met gebonden Fe2+ wordt geoxideerd door K3(Fe(CN)6 metHb (Fe3+)

– stap 2: MetHb reageert met KCN stabiel, rood cyaan-hb complex absorptie maximum bij 546 nm

– extinctie vh absorptie maximum is rechtstreeks evenredig met hoeveelheid Hb

• nadelen:

– toxisch KCN

– trage reactie (stabiel complex pas na 5-6 minuten)

– geen meting van sulfHb

12



• cyanide-vrije (gemodificeerde) Hb-methoden: vb.: Sysmex SLS-methode

– SLS = Sodium Lauryl Sulphate = niet-toxisch detergens (~ zeep)

13

Bron: Sysmex Be/Nl



• cyanide-vrije (gemodificeerde) Hb-methoden: vb.: Sysmex SLS-methode

– SLS = Sodium Lauryl Sulphate, niet toxisch, deel uitmakend van een zeep

• lysis RBC door absorptie van SLS aan de RBC membraan

14

Bron: CAT A. Vandermeersch



• hydrofobe groep van SLS reageert met hemoglobine

– Fe2+ (hemo) wordt geoxideerd tot Fe3+ (hemi)

• hydrofiele groep van SLS bindt Fe3+

– vorming stabiel SLS-Hb

• fotometrische bepaling van SLS-Hb bij 540 nm

15 Bron: Sysmex Be/Nl



• interferenties?

– lipemie

• SLS = detergens dus weinig interferentie met lipiden

– hoge WBC telling

• afzonderlijke meetkamer voor Hb

• lysis van WBC dus geringe interferentie

16


Hoofdprincipes

• colorimetrie gemeten hemoglobine

• impedantie




• cytochemie

• specifieke lyse



17


Hoofdprincipes: impedantie

• 1949: Wallace Coulter

• 1953: patent

18



• ~ Coulter principe

– apparaat waarin glazen buis met een zeer kleine opening(= telbuis of aperture) geplaatst is in een suspensie van bloedcellen

– door vacuüm wordt die suspensie in telbuis opgezogen

– tijdens dit proces: elektrische weerstand aangelegd tussen 2 elektroden: één in de celsuspensie, de andere in de telbuis

– elektrolytenoplossing (met suspensie bloedcellen) zorgt voor geleiding van stroom

– owv vacuüm, passage van een cel door nauwe opening van telbuis verandering/verhoging elektrische weerstand (= impedantie)

– hoe groter de cel, hoe hoger de verandering in elektrische weerstand

– Histogram = 2-dimensionaal

19



20



21



• impedantie: verandering van elektrische weerstand

• hoogte van het signaal (grafiek piek) is evenredig met het volume van de cel

22

Bron: Analis Be (Beckman/Coulter


Hoofdprincipes: impedantie RBC histogram

• RBC veroorzaken impedantie pieken met volume tussen 35 en 120 femtoliter

23 Bron: Analis Be (Beckman/Coulter


Hoofdprincipes: impedantie PLT histogram

• PLT veroorzaken impedantie pieken met volume tussen 2 en 20 femtoliter

24 Bron: Analis Be (Beckman/Coulter


Hoofdprincipes: impedantie WBC (3-diff) histogram

• partiële leukocytendifferentiatie (3-diff) obv impedantie is mogelijk

• WBC suspenderen in hypotoon milieu

• selectieve opzwelling van de WBC – granulocyten > mononucleairen

– lysis lymfocyten: detectie celkernen < mononucleairen < genulocyten

25


Hoofdprincipes: impedantie WBC (3-diff) histogram

• partiële leukocytendifferentiatie (3-diff) obv impedantie is mogelijk

• WBC suspenderen in hypotoon milieu

• selectieve opzwelling van de WBC

26

LY

BA

MO NE

EO

Bro

n: A

nal

is B

e (B

eckm

an/C

ou

lter



27 B

ron

: An

alis

Be

(Bec

kman

/Co

ult

er


Hoofdprincipes: impedantie & hydrodynamische focusering

29



• 2 concentriche vloeistofstromen

– via centraal kanaal: injectie vh staal

– omgeven door een snel stromende elektrolytenoplossing: mantelvloeistof

• beweging mantelvloeistof:

– centrale vloeistofstroom vernauwt

– snelheid midden centrale vloeistofstroom > rand centrale vloeistofstroom

partikels (cellen) worden op 1 lijn gedwongen

slechts 1 cel tegelijk passeert de opening

30



31

back sheath-flow

front sheath-flow

Bron: Sysmex Be/Nl



32

Bro

n: S

ysm

ex B

e/N

l


Hoofdprincipes: impedantie & hematocriet meting

• referentie methode

– eenvoudige volume bepaling van de corpusculaire deeltjes in bloed

– bloed wordt opgezogen in speciale capillairen (heparine coating)

– capillairen worden afgesloten met speciale folie en in speciale centrifuge

– speciale centrifuge: scheiding vaste en vloeibare delen tgv verschillende specifiekgewicht van plasma en bloeddeeltjes

Bron: Sysmex Be/Nl 33



• referentie methode

– waarden aflezen van schaal waarin tube in 10 gelijke fracties verdeeld wordt

– scheidingslijn doorheen de splitsing van de RBC zone en de WBC zone = Hct

Bron: Sysmex Be/Nl 34



• methode Sysmex = cumulatieve pulsehoogte detectie

– sommatie van alle individuele pulsen in het RBC-kanaal

35

Bron: Sysmex Be/Nl



• methode Sysmex = cumulatieve pulsehoogte detectie

– zelfs met maximale sedimentatie van de RBC in de centrifuge kleine hoeveelheid plasma tussen de cellen

– celtellers houden hiermee rekening dmv een constante

36

Ph = k x VRBC

Bron: Sysmex Be/Nl


Hoofdprincipes: impedantie & hematocriet berekening

• methode Beckman-Coulter, Siemens, Abbott

berekening Hct (GEEN rechtstreekse meting) obv meting MCV (impedantie)

MCV (fL) x RBC (10e6/µL)

factor voor “trapped plasma”?

37


Hoofdprincipes: impedantie & RBC indices – berekend

38

Bron: Sysmex Be/Nl


Hoofdprincipes: impedantie & RBC indices – berekend (RDW)

• RDW (Red Cell Distribution Width) = variatiecoëfficient van erytrocytenvolume

• parameter afgeleid uit frequentiehistogram van RBC volume

• RDW is objectieve maat voor grootteverdeling van RBC populatie maat voor anisocytose.

• eenheid: %

• referentiewaarden: 11,5 - 14,5% (toestelafhankelijk)

39


Hoofdprincipes: impedantie & RBC indices – berekend (RDW)

40


Hoofdprincipes: impedantie & PLT indices – berekend (MPV)

• MPV (Mean platelet volume) = gemiddeld bloedplaatjesvolume

• parameter afgeleid uit het PLT frequentiehistogram

• term “mean” is misleidend : naargelang gebruikte apparatuur is MPV – gemiddelde waarde van het bloedplaatjesvolume – mediaanwaarde van het bloedplaatjesvolume – modus van het bloedplaatjesvolume

• onderliggende oorzaak is dat het bloedplaatjesfrequentiehistogram geen gausskromme is, maar een scheve populatie.

• eenheid : fL (femtoliter)

• referentiwaarden: 7 – 11 tot 9 – 13 fL (instrumentgebonden)

41


Hoofdprincipes: impedantie & PLT indices – berekend (MPV)

42


Hoofdprincipes

• colorimetrie gemeten hemoglobine

• impedantie gemeten RBC, PLT, (WBC + 3-diff), Hct*

berekend MCV*, MCH, MCHC, RDW, MPV




• cytochemie

• specifieke lyse



* Afhankelijk van type toestel

43


Hoofdprincipes

• colorimetrie

• impedantie




• cytochemie

• specifieke lyse



44


Hoofdprincipes: lichtverstrooiing

• ~ flow cytometrie = meting in een “flow”

• verstrooiing/afbuiging van licht/laserstraal

– cellen in oplossing komen door een “flow cell”

– mbv hydrodynamische focussering

– laserstraal (coherent, monochromatisch)

• voorwaartse lichtverstrooiing ~ cel volume/grootte

• zijwaartse lichtverstrooiing ~ interne structuur (granulen, kernvorm)

45



46

Voorwaartse lichtverstrooiing

Bron: Thesis C. Motmans KH LIM



47

Meting voorwaartse lichtverstrooiing




48

Intensiteit van verstrooid licht wordt omgezet in spanning




49

Grootte van de spanning ~ grootte van de cel




50

Zijwaartse lichtverstrooiing, hoe meer verstrooiing, hoe meer granulatie




51 Bron: Thesis C. Motmans KH LIM


Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & fluorescentie

• fluorescentie flow cytometrie

– reagens 1: verlaging oppervlaktespanning, lysis RBC en PLT en perforatie WBC

– reagens 2: polymethine kleurstof dringt geperforeerde WBC binnen kleuring DNA/RNA supravitale kleuring

– informatie over:

• celvolume,

• intracellulaire componenten

• celactiviteit (delingsvermogen van de kern, DNA)

• cytoplasma-activiteit (eiwitsynthese, RNA)

52



• fluorescentie flow cytometrie

– na kleuring detectie door laser (“flow cell”)

– hydrodynamische focusering om cellen 1 voor 1 te laten passeren

– de emissie van licht op de fluorescerende WBC productie licht met langere golflengte dan het originele licht

– intensiteit van fluorescerende licht stijgt met hogere concentratie van de kleuring

53



54



• wat is speciaal aan fluorescentie flow cytometrie?

– polymetine kleurt DNA/RNA = supravitale kleuring

– ook RNA wordt gekleurd (cytoplasma informatie)

• dus niet alleen informatie over – celvolume (voorwaartse verstrooiing)

– intracellulaire componenten, nucleus en granulae... (zijwaartse verstrooiing)

• maar ook informatie over de celactiviteit – duplicatie activiteit van de kern (hoog DNA)

– cytoplasma-activiteit (proteïne synthese, hoog RNA)

4-delige differentiatie!!

55



• 4-delige differentiatie (= 4-diff kanaal)


– reagens 2: polymethine kleurstof kleuring RNA/DNA







• “scattergram”

60 B

ron

: Sys

mex

Be/

Nl






• “scattergram”

61

Bro

n: S

ysm

ex B

e/N

l






• “normaal scattergram” “abnormaal scattergram”



Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & ACAS

• ACAS = Adaptive Cluster Analysis System

63

Bron: Sysmex Be/Nl




– herkenning van de centrale positie van elke WBC populatie

– berekening van lokatie en waarschijnljkheid van elk “dal” tussen celpopulaties

– celpopulaties weergeven als wolken in scattergram

– voor elk monster berekening van discriminatoren tussen elke individuele populatie

64 B

ron

: Sys

mex

Be/

Nl




a. “centroïden”

• eerste en initiële centroïden beschikbaar

• start positie van centroïden werd bepaald uit duizenden monsters

• deze waarden als start positie voor cluster analyse

65 B

ron

: Sys

mex

Be/

Nl




b. “Mahalanobis afstand”

• cel gedetecteerd berekening afstand tussen signaal en aangegeven centroïde

• deze afstand geeft aan tot welke populatie het signaal behoort

66 Bro

n: S

ysm

ex B

e/N

l




c. “vorming van celpopulaties”

• signaal identificatie en nieuwe bepaling van centroïden

• dit proces wordt uitgevoerd met 500 celsignalen

• telkens worden centroïden voor lymfocyten, monocyten en granulocyten herberekend

67

Bro

n: S

ysm

ex B

e/N

l



• ACAS = Adaptive Cluster Analysis System - procedure

1. analyse eerste 500 signalen met verplaatsbare centroïden

2. bepaling clusters lymfocyten, monocyten, granulocyten en ghost door analyse van 1000 signalen

3. herhaling stap 1 en 2 tot de waarden stabiel blijven centroïden vaste positie

4. indien geen stabilisatie: geen scheiding van WBC

5. Adaptive Cluster Analysis System wordt uitgevoerd voor alle WBC

6. resultaat: zeer nauwkeurige differentiatie in vgl met manuele microscopie

7. conclusie: goede differentiatie, zelfs voor pathologische en/of oudere monsters (48u)

68


Hoofdprincipes

• colorimetrie

• impedantie

• lichtverstrooiing & fluorescentie (vervolg)



• cytochemie

• specifieke lyse



69 dr. apr. D. Kieffer



• NRBC bepaling

– lyse RBC

– reagens:

• WBC doorlaatbaar maken

• kernen NRBC blijven intact

– SFL/FSC

– automatische correctie WBC




• RET bepaling

– perforatie membranen RBC en WBC

– fluorochroom (polymethine, RNA)

– hydrodynamische focussering

– SFL/FSC

• fluorescentie negatief: RBC (geen RNA)

• toenemende SFL: RET

• kleine FSC/SFL: PLT

– maturiteit (hoeveelheid RNA):

• LFR (Low Fluorescence Rate)

• MFR (Medium Fluorescence Rate)

• HFR (High Fluorescence Rate

– IRF (Immature Reticulocyte Fraction):

• (MFR + HFR) / (LFR + MFR + HFR)

• Fe-therapie/EPO/BM-transplantatie 71 Bron: Sysmex Be/Nl



• RET bepaling

72 dr. apr. D. Kieffer Bron: Sysmex Be/Nl

Advanced training Sysmex XE-5000

Meet- en detectieprincipes

Marc De Schinckel | Academy-Senior Product Specialist

138

Reticulocyten kanaal



• RET bepaling geautomatiseerde erythropoïese


Bron: Sysmex Be/Nl



• RET bepaling geautomatiseerde erythropoïese (Ret-He)




• RET bepaling optische meting PLT & immature PLT fractie (IPF)




– SFL/FSC




– optische meting PLT

– IPF : hogere RNA-inhoud

• DD/ thrombopenie

• BM transplantatie








– SFL/FSC




– optische meting PLT

– IPF : hogere RNA-inhoud

• DD/ thrombopenie

• BM transplantatie




77

Bron: Sysmex Be/Nl




– klinische bruikbaarheid IPF onderscheid oorzaken thrombopenie

• toegenomen vernietiging/verbruik: hoog IPF

• afgenomen productie: laaf IPF



Hoofdprincipes

• colorimetrie

• impedantie




• cytochemie

• specifieke lyse





Hoofdprincipes: lichtverstrooiing & conductiviteit


A differential cell count is obtained through VCS Technology by the interrogation of 8162 cells using the 3 separate and simultaneous probes: - Direct Current, - Radio Frequency Alternating Current - Laser Light Scatter The value of each of these measurements positions it within the three-dimensional array we term the 3D Dataplot.




A differential cell count is obtained through VCS Technology by the interrogation of 8162 cells using the 3 separate and simultaneous probes: - Direct Current (impedantie)

- cel volume - RF electromagnetic current

(conductiviteit) - interne structuur van de cel - “opaciteit”

- Laser Light Scatter (voorwaartse lichtverstrooiing 10 – 70°)

- vorm - reflectie - structuur - “rotated light scatter”




volume vs “discriminant functions” (2D-plots):

- volume vs light scatter

- neutro - eo - mono - lymfo + baso

- volume vs conductiviteit - lymfo - mono - granulo

- volume vs “gating out neutro + eo” - baso - lymfo - mono



83

volume vs “discriminant functions” (2D-plots):

- volume vs light scatter (DF1)

- neutro - eo - mono - lymfo + baso

- volume vs conductiviteit (DF2) - lymfo - mono - granulo

- volume vs “gating out neutro/eo” (DF3) - baso - lymfo - mono

volu

me

DF1




3D-plot: Cell location and color coding:

Lymphocytes (normal and many of the abnormals) are colored in Blue Monocytes (normal and many of the abnormals) are colored in Green. Neutrophil population (normal and many of the abnormals) are colored in Violet. Eosinophils (normal and many of the abnormals) are colored in Orange. Basophils (normal and many of the abnormals) are colored in White/Gray.


Hoofdprincipes

• colorimetrie

• impedantie

• lichtverstrooiing

• fluorescentie


• cytochemie

• specifieke lyse





Bijkomende principes: cytochemie

Advia – Siemens:

- WBC differentiatie gebaseerd op

• peroxidase kanaal (mono, neutro, eo: peroxidase + 4-chloro-1-naphtol)

mono, lymfo + baso, neutro en eo

• baso/lobulariteit kanaal (na zure lyse)

baso



Hoofdprincipes

• colorimetrie

• impedantie


• fluorescentie


• cytochemie

• specifieke lyse





Bijkomende principes: specifieke lyse


+ diff-kanaal = 5-delige (volledige differentiatie)!




+ diff-kanaal = 5-delige (volledige differentiatie)!


Hoofdprincipes

• colorimetrie

• impedantie


• fluorescentie


• cytochemie

• specifieke lyse

• hoogfrequent wisselstroom eigenlijk ook hoofdprincipe!



RF


Bijkomende principes:hoogfrequent wisselstroom


( impedance)

RF/DC-methode ~ VCS Coulter


Bijkomende principes:hoogfrequent wisselstroom IMI-kanaal



Hoofdprincipes

• colorimetrie

• impedantie


• fluorescentie


• cytochemie

• specifieke lyse





Bijkomende principes: depolarizatie verstrooid licht



SYSMEX: samenvatting verschillende kanalen



SYSMEX: verschillende kanalen samenvatting





Specificaties

24

Bron: Sysmex Be/Nl



102




Specificaties

25

detector methode, dilutie parameters

SLS-methode, fotometrie

1:500

HGB

RBC, HCT, PLT-I, MCV, RDW-SD, RDW-CV,

PDW, MPV,P-LCR, PCT

HDF/ DC-detectie methodeimpulse sommatie

1:500

MCH, MCHC

HGB

RBC/PLT-detector

Bron: Sysmex Be/Nl







Specificaties

26

WBC, B

A

SO #‚ BASO %

LYMPH #, LYMPH %, MONO#, MONO %,

EO #, EO%, NEUT+BASO%NEUT+BASO#

IG#, IG%

Flowcytometriediode laser - 1:50

4 DIFFFlowcytometrie

diode laser - 1:51

WBC / BASO


Bron: Sysmex Be/Nl







Specificaties

27

NRBC #NRBC %

Flowcytometrie diode laser - 1:51

IMIRF/DC – detectie methode - 1:250

IMI #, HPC #, HPC %

NRBC


Bron: Sysmex Be/Nl







Specificaties

28

RET / PLT-OFlowcytometrie

diode laser 1:204

RET #, RET %, PLT-O

HFR, MFR, LFR, IRF, Ret-He,

IPF%


Bron: Sysmex Be/Nl


Automatisatie: voor- en nadelen


Microscoop

• pro: kwalitatief: alle cellen geïdentificeerd

• contra: kwantitatief: statistisch onnauwkeurig

• contra: trage analyse , één voor één

• contra: expertise noodzakelijk (duur?)

Automaat

• contra: kwalitatief: alle cellen in 5 populaties

• pro: kwantitatief: statistisch nauwkeurig

• pro: snelle analyse

• pro: verwerking meerdere stalen

• pro: moduleerbaarheid


Automatisatie: voor- en nadelen: statistiek


dr. apr. D. Kieffer 108


Automatisatie: voor- en nadelen: moduleerbaarheid

• voorbeeld: BC 2 DXH’s (celtellers) en SMS (uitstrijktoestel)




• voorbeeld: 2x Sysmex XE-2100 en 2x uitstrijktoestellen




• voorbeeld: BC SMS (uitstrijktoestel)



Praktisch voorbeeld



Automatisatie: efficiëntie

• CBC (complete blood count) + diffferentiatie + reticulocyten

• uitstrijktoestel + automatische kleuring

• moduleerbaarheid (koppeling verschillende toestellen)

• “reflex testing” staal opnieuw of met extra analyse

• link met microscopie



Automatisatie: efficiëntie

• link met microscopie: manuele of automatische microscopie


inleidingsles automatische celtellingen

Documents