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INMUNOLOGIA GENERAL E INMUNOQUIMICA
Trabajo Práctico Nº2: Inmunodifusión
Eva Acosta [email protected]
Objetivo general:- Adquirir herramientas para evaluar, identificar y cuantificar Ags o Acs mediante técnicas de inmunoprecipitación
Objetivos específicos:- Determinar cuantitativamente la IgG purificada en el TP Nº 1 mediante IDRS (Mancini)- Determinar mediante electroinmunodifusión la posible presencia de proteínas séricas contaminantes en la IgG purificada
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Interacciones Ag-Ac
Interacción bimolecular reversible
Determinanteantigénico(epitope)
Dominiovariabledel Ac
Puente H
Enlace iónico
I. hidrofóbicas
I. van der Waals
interacciones débiles
interacción Ag-Ag fuerte requiere gran número de estas interacciones
alta complementariedad
ESPECIFICIDAD
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Gran especifidad de la interacción
Ag-Ac
Desarrollo de ensayos inmunológicos para detectar o cuantificar Ags o Acs
UTILIDADES DE LOS INMUNOENSAYOS
• Diagnóstico de enfermedades• Monitoreo de la respuesta inmune humoral• Identificación de moléculas biológicas o de interés médico
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Tipos de interacciones Ag-Ac
ENZIMOINMUNOENSAYOINMUNOFLUORESCENCIARADIOINMUNOANALISIS
Primaria:
- primera etapa- unión directa del Ac al Ag- no visualizable, sin fenómenos asociados- relativamente independiente de Tº y fuerza iónica
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AGLUTINACIONINMUNODIFUSION
ELECTROINMUNODIFUSION
Secundaria:
- segunda etapa: agregación de los complejos formados en la interacción 1ria- fenómenos visibles a simple vista: precipitación o aglutinación- dependientes de Tº, pH, fuerza iónica, etc
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Terciaria:- solo en interacciones “in vivo”
- efectos biológicos colaterales a la interacción (necrosis en la reacción de Arthus, efectos vasógenos y de miocontrac-ción en anafilaxia)
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Reacciones de inmunoprecipitación
Interacción entre un Ac y un Ag soluble en solución acuosa
Formación de complejos multimoleculares
Desarrollo de precipitados visibles
Factores físico-químicos Características
inmunoreactantes
Proporción relativa de Ag y Ac
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• Factores físico-químicos
• temperatura• fuerza iónica• pH• viscosidad
afectan la difusión de los inmunoreactantes
Difusión: movimiento de una sustancia disuelta desde el lugar de mayor concentración al de menor concentración tendiente a
igualar las concentraciones en el seno del líquido
Ley de Fick
(difusión libreunidimensional
en medio fluido)
dxdCD.A.dt
dQ −=
VTcte.D º=
Q: cantidad de sustancia que difundet: tiempoD: coeficiente de difusiónA: área de difusiónC: concentración inicialx: distancia recorridaTº: temperaturaV: volumen de la sustancia que difunde
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• Características de los inmunoreactantes
• bivalente• no fragmentos F(ab)
Ac
• bivalente (al menos dos copias del mismo epitope)•distintos epitopes (reaccionan con distintos Acs del As)Ag
complejos pequeñossolubles
complejos grandesinsolubles
complejos pequeñossolubles
complejos grandesinsolubles
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• Proporción relativa de Ag y Ac
La composición del enrejado (y su solubilidad) varían de acuerdo a la concentración relativa de los inmunoreactantes
+3 +9+1 +5 +7
sin precipitadoprecipitadoprecipitado ppdo máximosin precipitado
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Prozona
Zona de exceso de Ac
Zona de exceso de Ag
Zona de equivalencia
Precipitado
Ag agregado
Sobrenadante exceso Acexceso Ag
+-
+ + + ++ + + +- - - -- - -
- - - - - -
Composición de los
complejos
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Métodos de inmunodifusión
Utilizan medios gelificados (agar o gelatina) para evitar disturbios ocasionados por las corrientes en el fluido
•Tamaño de poros que permiten la libre difusión de inmunoreactantes•Ausencia de reacción física ó química entre los inmunoreactantes y el gel
Ley de Fick
El tamaño de los poros debe retener los inmunocomplejos facilitando la precipitación
Agar 0.3-1.5%
Sirven para determinar la concentración de Ags o Acs (cuantitativos), o para comparar Ags y evaluar su pureza (cualitativos)
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Principales sistemas de inmunodifusión
Difusión Simple Difusión Doble
Unadimensión
Dosdimensiones
(radial)
Ag
Ag Ac
Ac
Ag Ac
Ag Ac
Gel neutro
Gel neutro
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AgAc
Inmunodifusión radial simple (IDRS, o técnica de Mancini)
• técnica de ID bidimensional simple: difunde sólo uno de los inmunoreactantes (Ag) mientras que el otro (Ac) está disuelto en el gel a concentración constante.
AgAcAgAc
Exceso Ag
Exceso Ac
Zona de equivalencia
(anillo de precipitación)
precipitado
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• técnica cuantitativa: el diámetro del anillo de precipitación es proporcional a la concentración inicial del Ag
Diámetro del anillo
AgAc
Ag
Ac
AgAc
AgAc
Ecuación derivada de La Ley de Fick
D: diámetro del anilloDo: diámetro del orificiok: constante
22 DoAgkD += ][
[ ]kDoDAg
22 −=
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4. Visualizar los anillos de precipitación. Medir diámetro
[Ag]
D2
5. Realizar curva de trabajo con el diámetro de los estándares. Calcular concentración muestras problemas
PROCEDIMIENTO:
Muestra B
x
Muestra A
x
22 DoAgkD += ][
1. Preparar agar impregnado con Ac
200 mg/ml 800 mg/ml
400 mg/ml 1600 mg/ml
Muestra A
Muestra B2. Agregar estándares y muestras
3. Colocar en cámara húmeda y permitir la difusión
Do
k
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CONSIDERACIONES EXPERIMENTALES
• los estándares y las muestras problemas se deben procesar simultáneamente en la misma placa de agar para igualar las condiciones de reacción (temperatura, fuerza iónica).
• la pendiente de la curva de trabajo (k) depende de la concentración del Ac en el agar
más económico
diámetros más grande
mayor pendiente = sensibilidad
bordes más difusos = mayor error
bordes nítidos = menor error
menor pendiente = sensibilidad
Ac diluido
Ac concentrado
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Aplicación en Práctico
Determinación cuantitativa de la IgG humana purificada en el TP 1
PROCEDIMIENTO
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Inmunodifusión radial doble (IDRD, o técnica de Ouchterlony)
• técnica de ID bidimensional doble: ambos inmunoreactantes (Agy Ac) difunden radialmente uno hacia el otro. Cuando se forma alcanza la zona de equivalencia se observa una banda de precipitación.
AcAg
Zona de exceso de Ag Zona de exceso de AcZona de equivalencia
AcAg
Zona de exceso de Ag Zona de exceso de AcZona de equivalencia
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La distancia a la que una sustancia difunde está :
• en relación DIRECTA con su CONCENTRACION.
• en relación INVERSA a su PM.
Ag Ac Ag Ac
[ ] de equivalencia Exceso de Ac
Ag Ac Ag Ac
PM Ag = PM Ac PM Ac
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• técnica cualitativa: permite analizar sistemas de Ag-Ac sin poder determinar la concentración de los inmunoreactantes
• Usos principales: verificar la pureza de una muestra (Ag o Ac)
detectar Ags o Acs en una muestra
CONSIDERACIONES EXPERIMENTALES
• se debe cumplir la LEY DE FICK
• se forman tantas bandas de precipitación como sistemas Ag-Actengamos en la muestra
• los Ag o Ac no atraviesan la banda en la que ellos mismos precipitan
• los Ag o Ac pueden atravesar una banda en la que ellos no precipitan
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Sistemas con tres reservorios pueden generar bandas de precipitación que han recibido nombres específicos.
PATRONES DE PRECIPITACION POR IDRD
IDENTIDAD: los dos sistemas antigénicos son iguales, por lo lo tanto se funden en una banda de precipitación.
Y
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NO IDENTIDAD: los dos sistemas antigénicos son distintos, cada uno origina bandas de precipitación independientes que se cruzan.
YY
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IDENTIDAD PARCIAL: los dos sistemas antigénicos comparten algún componente (banda que se funde), pero no son iguales(espolón o prolongación).
YY
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Inmunoelectroforesis(IEF)
• técnica semicuantitativa que combina dos metodologías:
1°) separación de proteínas por electroforesis
2°) inmunodifusión radial doble
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Paso 1: Electroforesis
Las proteínas cargadas negativamente (en buffer alcalino) son sometidas a un campo eléctrico se separan en un gel de agar de acuerdo a su carga eléctrica.
- +- +
Consideraciones:
Fenómeno de ELECTROENDÓSMOSIS: las proteínas poco cargadas son desplazadas en sentido contrario a su migración electroforéticareal.
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Paso 2: InmunodifusiónLas proteínas cargadas negativamente (en buffer alcalino) son sometidas a un campo eléctrico se separan en un gel de agar de acuerdo a su carga eléctrica.
AntisueroAntisuero
AplicacionesEn laboratorios clínicos se utiliza para detectar presencia o ausencia de proteínas séricas, en el diagnóstico de Gammapatías.Investigar e identificar los componentes de una muestra antigénica.
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Anti proteínas séricas totales
Anti proteínas séricas totales
Anti proteínas séricas totales
Anti IgM
Anti IgG
Anti IgA
Anti proteínas séricas totales
Anti proteínas séricas totales
Anti proteínas séricas totales
Anti IgM
Anti IgG
Anti IgA