VIVIANE MILCZEWSKI

INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL OVINA COM SÊMEN REFRIGERADO APLICADO EM DIFERENTES VIAS

Dissertação apresentada como requisito à obtenção do grau de Mestre. Curso de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, Setor de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Paraná.

Orientador: Prof. Dr. Luiz Ernandes Kozicki

CURITIBA

1999

A COMISSÃO EXAMINADORA, ABAIXO ASSINADA, APROVA A TESE

INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL OVINA COM SÊMEN REFRIGERADO APLICADO EM DIFERENTES VIAS

ELABORADA POR

VIVIANE MILCZEWSKI MÉDICA VETERINÁRIA

COMISSÃO EXAMINADORA

CURITIBA 1999

A J ã o te re i apagada s d e m inka m e m ó r i a

nem um só ins t an te

d e todas a s a l e g r i a s e i n s u c e s s o s ,

a v e n t u r a s e d e s c o b e r t a s

d e s t a f a s e d a minka v i d a .

D e d i c o e s t e t r a b a l k o a o s m e u s p a i s y\loi.ze e T^ina

AGRADECIMENTOS

A o P r o f . l_uiz ( S m a n d e z KozicUi, p e l a o r i e n t a ç ã o d e s t e t r aba lho ,

A o AAéd. Vet. Sé rg io l_uís /Madal d a Luz pelo incentivo, auxílio e participação na

execução d a s atividades d e campo.

jAo P r o f . j j a i r o P e r e i r a /\)eves p e l a a t e n ç ã o d i s p e n s a d a d u r a n t e todo

e s t e pe r í odo e p e l a c o - o r i e n t a ç ã o , s e m a q u a l n ã o s e r i a poss íve l a

r e a l i z a ç ã o d e s t a d i s s e r t a ç ã o .

^ o Proj-. T^omildo IRomualdo W e i s s p e l a o r i e n t a ç ã o e pe lo aux í l io nos

t r a b a l h o s d e morfo log ia e s p e r m á t i c a .

A o s A^édicos V e t e r i n á r i o s A 1 ^ S í l v i a P i s h e r e /V\ário P i s h e r , q u e

gent i lmente ce.cle.ram os a n i m a i s d o s p a r q u e s d a P r e f e i t u r a M u n i c i p a l d e

Cur i t i b a p a r a o s e xpe r imen to s .

A T-Vop*. C r i s t i a n e Ot to e a o Prof-. i_u imar P e r l y q u e pe rmi t i r am a

u t i l i z a ç ão d a s i n s t a l a ç õ e s , bem como a co lhe i t a d e s ê m e n d o s r e p r o d u t o r e s

do S e t o r d e Ov inocu l t u r a d a F a z e n d a E x p e r i m e n t a l do C a n g u i r i - l A P P R .

A o s p rop r i e t á r i o s d a c a b a n h a l_a B e l l e P o m m e ; S r . l_uis T^enato

K r a u s e e C a b a n h a Suf-f-oll<'s V i l l l a g e , S r . W a l f r i d o I_eal pe lo empré s t imo d e

e q u i p a m e n t o s e an ima i s .

A C o o r d e n a ç ã o do (Surso d e P ó s - g r a d u a ç ã o em C i e n c i a s

V e t e r i n á r i a s , n a s p e s s o a s do Prof-. hAe.\ry B a c i l a e d a Prof-a . C lo t i l de d e

L o u r d e s B r a n c o CÀerminiani pe lo incentivo, so l i c i tude permanente/ auxí l io

financeiro e e s p e c i a l m e n t e pe lo e x e m p l o d e d e d i c a ç ã o q u e nos d e r a m no

t r a n s c o r r e r d e todos e s t e s a n o s .

A ° s funcionários d o S>etor d e O v i n o c u l t u r a d a LAPPR e d o s P a r q u e s

AAunicipais d e Cur i t i b a q u e s e m p r e e s t i v e r a m p r e s e n t e s nos t r a b a l h o s d e

campo i n d e p e n d e n t e do ho r á r i o em q u e |-ov-aw\ so l i c i t ados .

; À s s e c r e t á r i a s do C u r s o d e P ó s - C í r a d u a ç ã o , X a n i a }\Aara S c h r a n U e

D e l e u z e Che rob im , pe lo aux í l io n a s a t i v i d a d e s b u r o c r á t i c a s ne s t e pe.^\odo.

jK y\V (SPíEIR q u e em convên io com a C A P R J P A R c e d e u

e q u i p a m e n t o s p a r a a e x e c u ç ã o d o s e x p e r i m e n t o s .

.À C ; A P < S S p e l a b o l s a c o n c e d i d a no do c u r s o e a o C-]\JP(2

p e l a a p r o v a ç ã o do projeto d e t e s e e aux í l io p a r a a a q u i s i ç ã o do

yApare lko lA l t r a s sonográ f i co .

y\os c o l e g a s d e p ó s - g r a d u a ç ã o , pe lo s momentos d e e s tudo e

d e s c o n t r a ç ã o q u e p a s s a m o s juntos e e s p e c i a l m e n t e a S a m u e l P e r e i r a Br i to

q u e t ã o bem nos ens inou a v a l o r i z a r a v i d a e a c e i t a r a s d i f i c u l d a d e s

impos t a s em nos so s c a m i n h o s .

jAo c o l e g a .Luiz Pe.rv\av\do A ^ d u r e i r a O l i v e i r a p e l a d i s p o s i ç ã o em

aux i l i a r em todos os t r a b a l h o s .

jAo meu a m i g o J v a n "Roque d e B a r r o s Pi lho p e l a c o m p a n h i a ,

a m i z a d e e por t o d a a j u d a nos t r a b a l h o s d e c a m p o e d e l abora tór io .

y\o R i c a r d o Vi lani p e l a p a c i ê n c i a , incent ivo e c o l a b o r a ç ã o na

c o n f e c ç ã o d e s t a d i s s e r t a ç ã o .

y\os m e u s p a i s e i r m ã o s pe lo p r e o c u p a ç ã o , c a r i n h o e apo io em todos

os ins tantes .

j\gracie.cz\vr\e.v\to e s p e c i a l a a m i g a e s ó c i a :

C r i s t i n a S a n t o s S o t o m a i o r p e l a a m i z a d e i n t e n s a e v e r d a d e i r a , pe lo apo io ,

incentivo e auxí l io i n c a n s á v e i s d e s d e o momento d o planejamenio d e todo

e s t e t r aba lho . C r i s t i n a , q u e o t é rmino d e s t e longo t r a b a l h o s e j a u m a

a b e r t u r a d e hor izontes p a r a nos so s inves t imentos .

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS viii

LISTA DE ABREVIATURAS ix

RESUMO x

ABSTRACT xii

1 INTRODUÇÃO 1

2 REVISÃO DE LITERATURA 3

2.1 CONSERVAÇÃO DO SÊMEN A 5°C 4

2.2 MORFOLOGIA ESPERMÁTICA APÓS REFRIGERAÇÃO E TESTE

DE TERMO-RESISTÊNCIA 6

2.3 RESULTADOS DE OVELHAS INSEMINADAS COM SÊMEN

REFRIGERADO EM DIFERENTES DILUENTES 7

2.4 INFLUÊNCIA DO LOCAL DE DEPOSIÇÃO DO SÊMEN NA 10

FÊMEA

2.5 INFLUÊNCIA DO HORÁRIO DE INSEMINAÇÃO 12

3 MATERIAL E MÉTODOS 16

3.1 AVALIAÇÃO DOS DILUENTES 16

3.2 COLHEITA E DILUIÇÃO DO SÊMEN PARA A INSEMINAÇÃO

ARTIFICIAL 20

3.3 INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL 21

3.4 DIAGNÓSTICO DE GESTAÇÃO 24

3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA 24

4 RESULTADOS 27

4.1 AVALIAÇÃO IN VITRO DO SÊMEN REFRIGERADO 27

4.2 TAXAS DE PRENHEZ APÓS A INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL 33

5 DISCUSSÃO 36

6 CONCLUSÕES 48

ANEXO 1 - FÓRMULA DOS DILUENTES 49

ANEXO 2 - CÁLCULOS ESTATÍSTICOS 51

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 56

LISTA DE TABELAS

1 Resultados de parição de ovelhas, após inseminação por via cervical com sêmen fresco di luído e refr igerado 9

2 Classif icação das anormalidades espermáticas 18

3 Aval iação in vitro de sêmen ovino fresco e após 8 horas de refrigeração em 6 di luentes à temperatura de 5°C. Curit iba (PR), 1999 27

4 Valores de motil idade progressiva, turbi lhonamento e vigor na 4 a hora do TT de sêmen ovino refr igerado em 6 diluentes por 8 horas à temperatura de 5°C. Curit iba (PR), 1999 30

5 Aval iação da morfologia espermática em sêmen ovino fresco e refrigerado em 6 di luentes por 8 horas à temperatura de 5°C. Curit iba (PR), 1999 32

6 Taxas de prenhez de ovelhas inseminadas por via intra-uterina com sêmen refr igerado em 2 di luentes por 8 a 10 horas à temperatura de 5°C. Curit iba (PR), 1999 33

7 Taxas de prenhez de ovelhas inseminadas por via cervical com sêmen refrigerado em 2 di luentes por 8 horas à temperatura de 5°C. Curitiba (PR), 1999 34

8 Taxas de prenhez de ovelhas inseminadas com sêmen refrigerado em citrato-gema à temperatura de 5°C, considerando o local de deposição do sêmen e o momento de inseminação. Curitiba (PR), 1999 35

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AVEPER Associação de Médicos Veter inár ios de Pequenos Ruminantes

do Estado do Paraná

CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível

Superior

CIDR Control led Internal Drug Release Dispender

CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científ ico e

Tecnológico

CUE Cornell University Extender

CU-16 Cornell University - 16

eCG Equine Chorionic Gonadotrophin

FGA Fluorogestone Acetate

LH Luteinizing hormone

MAP Medroxyprogesterone Acetate

PMSG Pregnant Mare Serum Gonadotrophin

TRIS Hidroximeti l aminometano

TT Teste de termo resistência

UHT Ultra heat treated

RESUMO

Inseminação artif icial ovina com sêmen refr igerado aplicado em diferentes vias.

O presente trabalho objetivou inic ialmente comparar a eficiência in vitro de 6 di luentes na conservação de sêmen ovino à temperatura de 5°C por 8 horas. Em uma segunda etapa 140 ovelhas foram inseminadas para aval iação de 2 dos di luentes que demonstraram maior eficiência in vitro, pelas vias cervical superficial e intra-uterina, em diferentes momentos de apl icação após a s incronização do estro. Foram constituídos 23 homogeneizados de sêmen, divididos em 6 al íquotas, nos quais foram acrescidos os di luentes Cornell University Extender (CUE), Cornell University 16 (CU-16), gl ic ina-gema, citrato-gema, TRIS-gema e leite desnatado UHT-gema. Após 8 horas de refr igeração o sêmen di luído foi submetido a análise de turbi lhonamento, moti l idade progressiva, vigor, morfologia espermática e ao teste de termo-resistência (TT) por 4 horas. O citrato-gema apresentou resultados superiores em relação aos demais di luentes e gl ic ina-gema foi inferior (P<0,05). No TT o citrato-gema apresentou resultados superiores, concluindo o teste com 50% de motil idade progressiva média, porém os di luentes gl ic ina-gema e leite-gema demonstraram moti l idade progressiva próxima a zero ao final do teste. Não foram observadas diferenças signif icat ivas na proporção de defeitos maiores e desprendimento de acrossoma em quaisquer dos 6 di luentes após 8 horas de refr igeração. Observou-se aumento signif icativo de caudas enroladas em todas as amostras de sêmen, exceto nas com gl ic ina-gema. Anal isando todas as carateríst icas estudadas in vitro, verif icou-se que o di luente citrato-gema apresentou melhor preservabi l idade do sêmen de carneiro, seguido pelo CUE. Esses 2 diluentes foram submetidos à aval iação in vivo, inseminando-se 140 ovelhas mestiças Suffolk, as quais t iveram o estro sincronizado com pessários vaginais impregnados com 50 mg de acetato de medroxiprogesterona, permanecendo por 14 dias, quando se administrou 500 UI de Equine Chorionic Gonadotrophin intramuscularmente. A aplicação do sêmen foi pela via cervical e intra-uterina por laparoscopia. A uti l ização do di luente CUE resultou em 69,56% (n = 23) e 8,33% (n = 24) de prenhez para as vias intra-uterina e cervical, respectivamente contra 85,71% (n = 21) e 21,74% (n = 23) para o di luente citrato. O sêmen di luído em citrato-gema forneceu índices de prenhez superiores, porém não signif icativos (P>0,05), nas duas vias estudadas em relação ao CUE. Esses resultados de prenhez conf irmam o experimento realizado in vitro, quando se verif icou superior idade do di luente citrato-gema. A taxa de prenhez de ovelhas inseminadas com diluente citrato-gema no mesmo horário após a retirada dos pessários, forneceu 85,71% e 43,75% de prenhez nas vias intra-uterina e cervical, respectivamente. A ferti l idade foi superior quando se uti l izou a via intra-uterina (P<0,05)

nos 2 diluentes testados. As inseminações realizadas por via cervical com sêmen refrigerado em citrato-gema às 57 ± 1 horas e às 49 ± 1 horas após a retirada dos pessários, obtiveram 43,75% e 21,74% de prenhez, respectivamente. O grupo inseminado às 57 ± 1 horas, apresentou resultados superiores (P<0,05). Foi possível refr igerar o sêmen ovino por 8 horas em citrato-gema obtendo-se boas taxas de prenhez quando se util izou a via intra-uterina, porém os resultados foram razoáveis na inseminação cervical superf icial. A capacidade de fert i l ização do sêmen refrigerado é satisfatória desde que seja depositado próximo ao sítio de ferti l ização.

ABSTRACT

D i f f e r e n t w a y s of s h e e p a r t i f i c i a l i n s e m i n a t i o n u s i n g c o o l e d s e m e n .

The a i m of t h i s w o r k w a s to c o m p a r e in vitro e f f i c i e n c y of 6 e x t e n d e r s in t h e c o n s e r v a t i o n of r a m s e m e n at 5 °C f o r 8 h o u r s . S u b s e q u e n t l y , w i t h be s t in vitro r e s u l t s w e r e u s e d to i n s e m i n a t e 1 40 e w e s . T w e n t y - t h r e e p o o l e d e j a c u l a t e s w e r e d i l u t e d in 6 e x t e n d e r s : C o r n e l l U n i v e r s i t y E x t e n d e r ( C U E ) , C o r n e l l U n i v e r s i t y - 16 ( C U - 1 6 ) , g l y c i n e - y o l k , c i t r a t e - y o l k , T R I S - y o l k a nd UHT s k i m m i l k - y o l k . A f t e r 1 + 3 d i l u t i o n , t he s e m e n s a m p l e s w e r e c o o l e d d u r i n g 8 h o u r s at 5 °C f o l l o w i n g a n a l y s i s of p r o g r e s s i v e m o t i l i t y , v i g o r , w a v e m o t i o n , m o r p h o l o g y of s p e r m a t o z o a and t h e r m o r e s i s t a n c e t e s t (TT) . C i t r a t e - y o l k e x t e n d e d s e m e n r e s u l t s w e r e s i g n i f i c a n t l y ( P < 0 , 0 5 ) s u p e r i o r . G l y c i n e - y o l k e x t e n d e d s e m e n r e s u l t s w e r e s i g n i f i c a n t l y i n f e r i o r . D u r i n g TT , c i t r a t e - y o l k e x t e n d e d s e m e n d e m o n s t r a t e d t h e be s t r e s u l t s ( P < 0 , 0 5 ) , f i n i s h i n g t h e t e s t w i t h t h e a v e r a g e of 5 0 % of p r o g r e s s i v e m o t i l i t y . W h e n G l y c i n e - y o l k a nd UHT s k i m m i l k - y o l k e x t e n d e r s w e r e u s ed p r o g r e s s i v e m o t i l i t y w a s n e a r z e r o . T h e r e w e r e no s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e s in p e r c e n t a g e of m a j o r d e f e c t s and d e t a c h e d a c r o s o m a l c a p s w i t h a l l 6 d i l u t e r s a f t e r 8 h o u r s of c o n s e r v a t i o n . C U E , C U - 1 6 , c i t r a t e - y o l k , T R I S - y o l k and UHT s k i m m i l k - y o l k e x t e n d e d s e m e n s h o w e d s i g n i f i c a n t l y i n c r e a s e d r a t e s of ben t t a i l . W h e n a l l c h a r a c t e r i s t i c s t u d i e d in vitro w e r e a n a l y z e d , t h e c i t r a t e - y o l k e x t e n d e r s h o w e d t h e be s t s e m e n p r e s e r v a b i l i t y f o l l o w e d by C U E . So bo th w e r e e v a l u a t e d in vivo w i t h c o o l e d s e m e n f o r 8 h o u r s at 5 °C . O n e h u n d r e d a nd f o r t y c r o s s b r e d S u f f o l k e w e s had t h e e s t r u s s y n c h r o n i z e d w i t h i n t r a v a g i n a l p e s s a r i e s c o n t a i n i n g 50 m g of m e d r o x y p r o g e s t e r o n e a c e t a t e . In t he f o u r t e e n t h d a y , at t h e s a m e t i m e of t h e r e m o v a l of t h e p e s s a r i e s , 5 00 UI of E q u i n e C h o r i o n i c G o n a d o t r o p h i n ( e C G ) , w e r e i n j e c t e d i n t r a m u s c u l a r l y . C e r v i c a l a nd i n t r a u t e r i n e i n s e m i n a t i o n w e r e p e r f o r m e d w i t h t h e a id of a l a p a r o s c o p e . CUE e x t e n d e d s e m e n s h o w e d i n s e m i n a t i o n p r e g n a n c y r a t e s of 6 9 , 5 6 % and 8 , 3 3 % w i t h t h e u t e r i n e a n d c e r v i c a l m e t h o d s r e s p e c t i v e l y . C i t r a t e - y o l k e x t e n d e d s e m e n s h o w e d 8 5 , 7 1 % and 2 1 , 7 4 % w i t h t h e u t e r i n e a nd c e r v i c a l m e t h o d s r e s p e c t i v e l y . C i t r a t e - y o l k e x t e n d e d s e m e n r e s u l t e d in h i g h e r p r e g n a n c y r a t e s , u s i ng bo th i n s e m i n a t i o n m e t h o d s , h o w e v e r , w i t h o u t s t a t i s t i c s i g n i f i c a n c e ( P > 0 , 0 5 ) . T h e s e i n s e m i n a t i o n r a t e s c o n f i r m e d in vitro p e r f o r m a n c e s in w h i c h c i t r a t e - y o l k e x t e n d e d s e m e n d e m o n s t r a t e d s u p e r i o r i t y r e s u l t s . T h e p r e g n a n c y r a t e s of t h e

Xll

g roups i n s e m i n a t e d w i th coo l ed s e m e n e x t e n d e d in c i t r a t e - y o l k , 5 5 - 5 8 hou r s a f t e r p e s s a r i e s r emova l we r e 8 5 , 7 5 % and 4 3 , 7 5 % for i n t r a u t e r i n e and c e r v i c a l i n s e m i n a t i o n , r e s p e c t i v e l y . The r e was s i gn i f i c an t d i f f e r en ce ( P < 0 , 0 5 ) b e t w e e n t he g r oup s . The ce r v i c a l i n s e m i n a t i o n s w i th coo l ed s e m e n e x t e n d e d in c i t r a t e -yo l k at 57 ± 1 hou r s and 49 ± 1 hou r s a f t e r p e s s a r i e s r emova l , r e su l t ed in 4 3 , 7 5 % and 2 1 , 7 4 % p r e g n a n c y r a t e s , r e s p e c t i v e l y . The g roup i n s e m i n a t e d at 57 ± 1 hou r s p r e s e n t e d s i g n i f i c an t l y s upe r i o r r e su l t s ( P < 0 , 0 5 ) . It was po s s i b l e coo l r am s e m e n fo r 8 hou r s in c i t r a t e - y o l k e x t e n d e r w i th good p r e g n a n t r a t e s when i n t r a u t e r i n e i n s e m i n a t i o n was used , but t h e r e s u l t s we r e mode s t when ce r v i c a l i n s e m i n a t i o n s we re u sed . The f e r t i l i z a t i o n c apab i l i t y of coo l ed r am s e m e n is s a t i s f a c t o r y if t he s e m e n is d epo s i t e d nea r the f e r t i l i z a t i o n s i te .

1 INTRODUÇÃO

0 ovino apresenta-se como espécie de grande importância

econômica, difundindo-se por quase todas as regiões do mundo. Em

alguns países, como Austrál ia, Nova Zelândia, Uruguai e Argentina, a

ovinocultura representa a base da economia do país, sendo os animais

criados em avançados sistemas de produção, possibi l i tando a obtenção

de elevada rentabil idade econômica. Em outros países, a exploração é

feita empregando-se técnicas incipientes, representando, em conjunto

com a caprinocultura, a subsistência de populações desfavorecidas.

Levando-se em consideração o enorme potencial econômico da

ovinocultura, devido à produção de lã, pele ou carne, tornando-se este

um componente da mais alta consideração na economia dos

estabelecimentos dedicados à produção de ovinos, é oportuno pensar em

alternativas que determinem elevada produtiv idade à realidade brasileira

(NEVES, 1990). Torna-se necessária a modernização das técnicas de

criação, que exigem a intensif icação de processos reprodutivos e uso de

material genético qual if icado, visando atingir todo o potencial econômico

dessa atividade.

No Estado do Paraná a criação e o consumo da carne ovina tem

crescido rapidamente. Em 1990 o rebanho era constituído por 385.316

cabeças, passando para 630.500 no ano de 1996 (SEAB, 1997). Esse

aumento da população ovina paranaense deveu-se à importação de

animais da América do Norte e Europa e ao Programa Estadual de

Incentivo a Ovinocultura.

Por esse fato, existem rebanhos com característ icas distintas no

Paraná. Alguns rebanhos são constituídos por cabanhas dedicadas à

criação de matrizes e reprodutores de alta performance genética com

aptidão para a produção de carne. Outro segmento do rebanho é

formado por animais mestiços uti l izados na produção de carne e lã.

Atua lmente a maioria desses ovinos são or iundos do programa

promovido pela Secretar ia da Agr icu l tura e Abastec imento do Paraná

que nos anos de 1988 a 1994 proporc ionou a v inda de 187.000 animais,

de dupla apt idão, do Uruguai e do Estado do Rio Grande do Sul.

A adoção de biotécnicas reprodut ivas, tais como, indução de estro

e inseminação art i f ic ial (IA), permit i r ia a expansão da ut i l ização dos

genót ipos al tamente produt ivos dos animais puros com apt idão para

carne nos rebanhos gerais. Dessa forma, custos de manutenção dos

machos poder iam ser reduzidos, min imizando di f icu ldades que esses

acarretam ao manejo da propr iedade além de poss ib i l i tarem a obtenção

de cordeiros precoces e mais pesados para o abate.

A inseminação art i f ic ial , ut i l i zando-se de sêmen fresco, sem meio

de preservação, tem sido ut i l izada no País. Apesar desse método

a lcançar bons índices de prenhez, requer a presença dos machos junto

às fêmeas a serem inseminadas (CHEMINEAU e COGNIÉ, 1991).

Outra possib i l idade ser ia a ut i l i zação de sêmen congelado. A

congelação, os riscos representados pela fa l ta de nitrogênio durante a

manutenção do material congelado e a ex igênc ia de laparoscopia para a

apl icação impl icam em aumento de custos, sendo e lementos l imitantes

do emprego do sêmen congelado em larga escala.

A ut i l ização de sêmen conservado, pr inc ipa lmente sob a forma de

refr igeração seria a l ternat iva v iável no Estado do Paraná, uma vez que

os rebanhos são, de maneira geral , pequenos e de local ização próxima.

Part indo dessas premissas, este t rabalho objet iva:

a) comparar in vitro a ef ic iência de 6 d i luentes na conservação do sêmen

à temperatura de 5°C por 8 horas.

b) aval iar taxas de prenhez em ovelhas inseminadas com sêmen

refr igerado por via intra-uter ina e cerv ica l em 2 horár ios d i ferentes de

inseminação após a s incronização de estro.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 CONSERVAÇÃO DO SÊMEN A 5°C

"O Médico Veterinário russo ELIAS IVANOV efetuou em 1901 as

primeiras inseminações artif iciais em ovelhas procurando esclarecer a

função do frio na conservação do sêmen" (MIES FILHO, 1987).

Para prolongar a capacidade fecundante do espermatozóide são

uti l izadas temperaturas de armazenamento de 5°C a 15°C, reduzindo ou

interrompendo temporariamente a moti l idade e reações metabólicas. O

método consiste em refrigerar o sêmen di luído de 30°C para 15°C ou

mais freqüentemente a 5°C e mantê-lo nessa temperatura até a

uti l ização (EVANS e MAXWELL, 1987). O procedimento prático é o de

colocar o sêmen diluído em tubo e este em recipiente contendo água,

levando-se o conjunto ao refr igerador para abaixamento progressivo da

temperatura em 1°C a cada 3 ou 4 minutos (MIES FILHO, 1987). Os

espermatozóides são part icularmente suscet íveis a choques térmicos

durante a refrigeração de 18°C a 5°C (EVANS e MAXWELL, 1987).

Os diluentes são acrescidos ao sêmen logo após a colheita

objetivando manter a capacidade fecundante dos espermatozóides e

possibi l itando a inseminação em um maior número de fêmeas. Esses

diluentes proporcionam nutrientes, meio tamponado e isotônico e

protegem os espermatozóides contra choques térmicos (CÓRDOVA et ai,

1989).

O di luente ideal deve ser simples de preparar e manejar, de baixo

custo e constituir-se de ingredientes acessíveis (CÓRDOVA et al., 1989),

além de manter boa moti l idade e morfologia espermática normal durante

a estocagem, a fim de lograr boa fert i l idade (DEKA e RAO, 1980 b).

Diversos tipos de di luentes têm sido propostos para a conservação

de sêmen ovino. Dentre os di luentes naturais destaca-se o leite de vaca,

que pode ser usado na forma integral, desnatado, reconstituído ou

ultrapasteurizado. O leite possui lactenina, proteína tóxica aos

espermatozóides, porém o aquecimento por 10 minutos à temperatura de

92°C promove a inativação dessa proteína (THACKER, 1954). O leite

ultrapasteurizado é a forma preferida por ser produto estéril, de fácil

aquisição e não requer aquecimento (EVANS e MAXWELL, 1987).

Os diluentes a base de leite e suas diversas variações, parecem ser

vantajosos como conservadores de sêmen ovino e têm sido largamente

uti l izados em diferentes partes do mundo (HILL et al. 1958; JONES

1969; PETRUZZI et al., 1976; DEKA e RAO 1980a; CÓRDOVA et al.,

1989; CHEMINEAU e COGNIÉ, 1991).

TIWARI et a!., (1977) estudando trocas metabólicas concluíram

que o leite isoladamente não é meio adequado de estocagem para o

sêmen de carneiro após 8 horas a 5°C, devido ao rápido acúmulo de

ácido lático resultando em signif icante queda do pH e conseqüentemente

em alta mortalidade dos espermatozóides.

COLAS et aí., (1968), concluíram que o leite é um diluente mais

apropriado para a refr igeração a 15°C, já que aos 5°C muitos

espermatozóides morrem e também após as 10 horas de armazenamento

ocorre um decréscimo na fert i l idade.

Os di luentes sintéticos contém hidroximeti l aminometano (TRIS) ou

citrato como tampões, gl icose ou frutose como fonte de energia e gema

de ovo para proteger as membranas celulares dos espermatozóides

contra choques térmicos (EVANS e MAXWELL, 1987).

DAUZIER et al., (1954) reportaram que a moti l idade dos

espermatozóides de carneiro foi mantida por mais tempo em diluentes à

base de citrato do que em leite.

PETRUZZI et al., (1976) não observaram diferenças entre 6

diluentes testados, para sêmen ovino, aval iando-os quanto à motil idade

4 horas após refrigeração a 5°C. Às 24 horas o TRIS e citrato foram

superiores aos diluentes à base de leite. Com 120 horas foram obtidos

valores de 45%, 26%, 23% e zero de moti l idade para o TRIS, citrato,

leite com e sem gema de ovo, respect ivamente. A diferença na

percentagem média de espermatozóides móveis entre o di luente TRIS e

os demais foi significativa a partir de 48 horas de refrigeração.

DEKA e RAO (1980a) relataram que os di luentes TRIS-gl icose e

leite integral foram superiores ao citrato na preservação de sêmen ovino

a 5°C, sinalizando que o sêmen dessa espécie poderia ser mantido

nestes dois di luentes por mais de 72 horas com motil idade progressiva

satisfatória. O TRIS demonstrou maior faci l idade de avaliação

microscópica por apresentar maior clareza que o leite. Apesar da

motil idade no diluente citrato ter sido menor, mais de 50% da moti l idade

inicial foi mantida após 72 horas de conservação.

Investigações de ROY e BISHOP (1954) mostraram que a

substituição de tampões fosfato ou citrato por glicina aumentou o tempo

de sobrevivência de espermatozóides bovinos conservados. Esses relatos

foram corroborados por AHMED (1955) que obteve maior longevidade

dos espermatozóides ovinos em soluções de gl icina comparadas com

di luente citrato.

SCHINDLER e AMIR (1961) relataram que a glicina acrescida nos

di luentes promove benefíc io na longevidade de espermatozóides

mantidos a 4°C, uma vez que o di luente citrato-gl ic ina manteve a

motil idade espermática por períodos superiores ao citrato sem gema, e

ao leite integral de vaca ou ovelha com ou sem gema.

Os diluentes Cornell University Extender (CUE) e Cornell

University-16 (CU-16) inicialmente empregados para conservação de

sêmen bovino (FOOTE e BRATTON, 1960), passaram a ser uti l izados para

sêmen ovino refrigerado por SAXENA e SINGH (1967), PRASAD e

NORMAN (1969) e SAHNI e ROY (1969) com bons resultados sobre a

motil idade.

Mais recentemente, BUTSWAT et al., (1992), uti l izando técnicas

de diálise em temperatura ambiente com o uso do di luente CUE,

obtiveram média de 80% e 6% de espermatozóides móveis no primeiro e

no oitavo dia de conservação respect ivamente.

2.2 MORFOLOGIA ESPERMÁTICA APÓS REFRIGERAÇÃO E TESTE DE

TERMO-RESISTÊNCIA

Após a diluição e refr igeração alguns danos provocados nas células

espermáticas podem não afetar s ignif icat ivamente a motil idade, porém

rompem a integridade das membranas dos espermatozóides. Estas

alterações interferem seriamente na sobrevivência e capacidade

fecundante dos espermatozóides no trato genital feminino (MARTIN,

1968; MAXWELL e WATSON, 1996).

Uma vez que a integridade do acrossoma e da cauda são

indispensáveis à fert i l ização do óvulo, é essencial sua preservação

durante o manejo e processamento do sêmen (EVANS e MAXWELL,

1987).

Estudos biométricos da cabeça de espermatozóides conservados

nos di luentes à base de leite desnatado-gema, bicarbonato-gl icose-

gema, citrato-gema e CUE, foram efetuados por SAXENA e SINGH (1967)

não sendo observadas alterações signif icativas no comprimento ou

largura da cabeça das células em todos os di luentes testados. Porém, em

estudos realizados por KARCHE et aL, (1976) com diluentes à base de

citrato, gl icina e leite, foi observada diminuição signif icativa da cabeça

das células em todos os di luentes testados, sendo que o diluente citrato

apresentou melhor preservabi l idade comparado ao citrato-gl icina e este

melhor que gl icina-gema.

DEKA e RAO (1980b) obtiveram resultados semelhantes,

verif icando diminuição signif icat iva da cabeça dos espermatozóides nos 3

di luentes testados: citrato, TRIS e leite integral. De acordo com KARCHE

et <?/., (1976) e DEKA e RAO, (1980b), o decréscimo no tamanho do

espermatozóide ocorre devido a alterações morfológicas e contração do

acrossoma.

Segundo DREVIUS (1963) e BARTH e OKO (1989) o estresse

térmico e a hiposmolaridade das soluções conservantes aumentam

signif icativamente a proporção de defeitos de cauda.

Além da morfologia espermática, outro teste uti l izado para a

aval iação de sêmen conservado é o de termo-resistência (TT). Para a

viabi l idade do teste, é recomendada a incubação das amostras a 37°C,

que é uma temperatura próxima à corporal e simula o ambiente in vivo

(EVANS e MAXWELL, 1987; CHEMINEAU e COGNIÉ, 1991). LUZ (1991)

verif icou correlação entre o número médio de espermatozóides móveis

durante o TT e o índice de prenhez das ovelhas inseminadas com as

diferentes amostras de sêmen congelado.

PAGANINI et a/.,( 1997) submetendo amostras de sêmen

refrigerado ao teste de exaustão a 37°C por 4 horas, verif icaram

aumento linear signif icativo de defeitos de acrossoma e de cauda a cada

hora do teste, porém assim como VEKSLER HESS et aL, (1997) não

observaram diferenças entre os di luentes testados (glicina-gema, glicina-

gema-leite, gema-leite)

PAGANINI et aL,(1997) observaram médias de 50 a 55% de

espermatozóides com moti l idade progressiva em amostras refrigeradas

por 24 horas e submetidas por 4 horas ao TT, nos di luentes acima

citados.

2.3 RESULTADOS DE OVELHAS INSEMINADAS COM SÊMEN REFRIGERADO

EM DIFERENTES DILUENTES

São grandes as variações na taxa de prenhez de ovelhas

inseminadas com sêmen refrigerado, mesmo quando se uti l izam

diluentes semelhantes (MARTIN e WATSON, 1976).

Esta variabi l idade deve-se a vários fatores. LAPWOOD et ai,

(1972) e MARTIN e WATSON (1976) observaram diferenças signif icativas

entre inseminadores, carneiros, ejaculados do mesmo carneiro e

momento de inseminação.

No Brasil são poucos os trabalhos que retratam resultados de

inseminação artificial em ovinos com sêmen refr igerado (JOBIM et al.,

1987; CRUZ, 1994). Os pioneiros na uti l ização de sêmen refrigerado

armazenado na forma líquida, foram MIES FILHO e RAMOS (1954),

obtendo resultados de 0 a 61,7% de taxa de parição, uti l izando como

diluente leite desnatado.

Na tabela 1 estão sumarizados os resultados obtidos em ovelhas

inseminadas com sêmen di luído e refr igerado. Os di luentes à base de

leite, seguidos pelos di luentes à base de di luente citrato, foram os mais

uti l izados entre os diversos autores, tanto na conservação à temperatura

de 4 a 5°C como na inseminação com estro natural ou sincronizado.

TABELA 1- Resultados de parição de ovelhas, após inseminação por via cervical com sêmen fresco di luído e refrigerado.

Referência Diluente Temperatura (°C / horas)

N.°de espermatozóides

( X 1 0 6 ! Estro Parição

(%)

LAPWOOD etal. (1972) leite desnatado 5/24 100 natural 26,1

BARLOW et al. (1974) leite desnatado

citrato glicose

10 a 15/5 150 . sincronizado 52 a 75

(concepção) 25a 55

MARTIN e WATSON (1976)

salina-glicose-gema

5/18 25 a 100 natural 30,7

WATSON e MARTIN (1976)

salina-glicose-gema

5/24

5/48

100 natural 16,3-27,1

(não-retomo)

O - I O

SMITH eia/. (1978) leite desnatado 15/12

15/4

400 IA dupla

400 IA única

sincronizado 60,2

71,7

LANGFORD ef al. (1979) leite-citrato 16/12 720 IA dupla

Sincronizado 78

CARMENATE e GANCIK (1982)

citrato-gema sêmen diluído3 200 a 300 natural

62,5 CARMENATE e GANCIK (1982)

leite desnatado 63,6

CARMENATE e GANCIK (1982)

citrato-gema 5/12 200 a 300 natural

61,7 CARMENATE e GANCIK (1982)

leite desnatado 53,8

NEVES etal. (1982) TRIS sêmen diluído" 40

20

natural

53 (não retomo)

64

JOBIM eia/. (1987) PBS 5 / 8 180 sincronizado 45

RODRIGUEZ ef al. (1988)

citrato-aloe vera 5/24 180 implantes com progesterona

50 óvulos fertilizados

CÓRDOVA ef al. (1989) leite desnatado 15/8 300° natural 68,6 (gestação)

BUTSWAT etal. (1990) CUE 1 diad

2 diasd

3 diasd

250 a 500 natural 38,9 16,7 11,1

AGUER etal. (1992) leite desnatado 15/ 6 400 sincronizado 88% dos plantéis = 50 a 79

CRUZ (1994) lactose-glicerol

lactose-glicerol-JYPe

4/48 300 sincronizado 7,4

11,11 a Inseminação até 120 minutos após a colheita do sêmen. b Sêmen diluído e utilizado logo após a diluição a 30°C. c Número de espermatozóides móveis. d Conservação por diálise descontínua em temperatura ambiente 6 Fração ativa da água de coco. Ácido indoil-3-acético.

2.4 INFLUÊNCIA DO LOCAL DE DEPOSIÇÃO DO SÊMEN NA FÊMEA

A inseminação artificial em ovelhas pode ser realizada pelas vias

vaginal, cervical ou intra-uterina. O local de deposição do sêmen na fêmea

influencia diretamente a capacidade de fecundação (SOUZA, 1993), sendo

que o índice de fertilidade aumenta linearmente à medida que a

inseminação se processa em maior profundidade no trato genital da ovelha

(EPPLESTON et a/., 1994).

Os métodos de inseminação que não exigem a passagem da pipeta

através da cérvice da ovelha apresentam simplicidade e rapidez de

execução.

A inseminação artificial vaginal "shot in the dark", além de dispensar

o uso de espéculo e fonte de luz, facilita a inseminação em borregas. Este

método, contudo, requer elevado número de espermatozóides por fêmea e

resulta em baixos índices de fertil idade para sêmen congelado (MIES

FILHO, 1983; MAXWELL e HEWITT, 1986). Quando o sêmen conservado na

forma líquida é depositado na vagina a fertil idade é em torno de 10%

inferior em relação à deposição cervical superficial (CHEMINEAU e COGNIÉ,

1991), e esta 10% inferior à deposição cervical profunda (TEN EN BON,

1965 apud SALAMOU e MAXWELL, 1995).

A inseminação artificial pelo método cervical, tradicionalmente, é a

mais utilizada em ovelhas, dispensando o uso de técnicas e equipamentos

sofisticados, anestesia, depilação ou jejum prévio, facilitando desta forma

a sua utilização. Porém, um aspecto importante do desenvolvimento da

inseminação artificial por via exocervical é o alto grau de variabilidade dos

resultados de fertilidade alcançados, que em muitas ocasiões chega a

comprometer a viabilidade de seu emprego (LÓPEZ-BREA, 1996).

Os componentes do espermatozóide responsáveis por baixas taxas de

fertilidade na inseminação artificial cervical ainda não estão claramente

entendidos. Entretanto, evidências recentes sugerem que enquanto muitas

células permanecem móveis após a conservação, as suas membranas estão

desestabilizadas, reduzindo a sobrevivência por impossibilidade de resistir

ao envelhecimento no trato genital feminino após inseminação cervical

(MAXWELL e WATSON, 1996).

Os resultados de fertil idade obtidos com sêmen refrigerado, por via

cervical, são bastante heterogêneos: 0 a 61,7% (MIES FILHO e RAMOS,

1954); 9,7 a 50,0% (MARTIN e WATSON, 1976); 0 a 27,1% (WATSON e

MARTIN, 1976); 51,4 a 61,7% (CARMENATE e GAMCIK,1982).

Resultados em 10 anos de pesquisa em inseminação artificial

cervical, com sêmen refrigerado a 15°C na França, demonstraram variações

de 50,0 a 79,0% de fertil idade nas diferentes condições observadas

(AGUER et a/., 1992).

Além do local de deposição do sêmen, provavelmente a

heterogeneidade das taxas de fertil idade se deva a inúmeros outros fatores

que envolvem a inseminação artificial como: dose inseminante, qualidade

dos espermatozóides, estro natural ou sincronizado, situação reprodutiva,

idade, raça e condição corporal dos reprodutores e matrizes, intervalo

entre o último parto e a inseminação, estação e momento de inseminação e

inseminadores (CHEMINEAU e COGNIÉ, 1991; e LÓPEZ-BREA, 1996).

Um dos maiores obstáculos para melhorar a fertilidade na

inseminação artificial em ovinos é a impossibil idade de introdução de uma

pipeta de inseminação através da cérvice da ovelha, seja por seu formato

tortuoso ou impossibilidade de fixação pelo reto (HALBERT et a!., 1990). O

canal cervical, estrutura consistente, de forma afunilada, possui dobras

colocadas excentricamente que diminuem de espessura à medida que se

aproximam do corpo do útero ( SOUZA, 1994). Tentativas para superar o

problema da barreira cervical têm sido feitas utilizando deposição intra-

uterina do sêmen por laparoscopia (KILLEN e CAFFERY, 1982), aumentando

a profundidade de deposição no canal cervical (SALAMON e LIGHTFOOT,

1970) ou por métodos de inseminação transcervical com diferentes tipos de

aplicadores (HALBERT et a/., 1990; EPPLESTON et a/., 1994) e tração

cervical (SOUZA, 1993).

O nível de fertil idade com aplicação exocervical oscila entre 35 a

70% e no caso de inseminação intra-uterina sobe para 50 a 80% (LÓPEZ-

BREA, 1996).

SALAMON et ai, (1977) trabalhando com sêmen refrigerado por 2

dias a 5°C em diluente TRIS, obtiveram 94,4% de óvulos fertilizados em

inseminação intra-uterina por laparotomia e 40% de fertilização quando foi

utilizada a via cervical. Quando empregou-se o sêmen refrigerado por 4

dias, nas mesmas condições, as taxas de fertil ização foram de 91,3% para

inseminação intra-uterina e 0% para inseminação cervical. Resultados

discrepantes foram encontrados por SMITH et ai, (1978) que ao utilizarem

sêmen refrigerado em diluente leite por 12 horas, alcançaram 58,4% de

taxa de parição com o aplicador de Cassou para inseminação cervical

profunda, contra 72,9% quando se utilizou aplicador para inseminação

cervical superficial.

2.5 INFLUÊNCIA DO HORÁRIO DA INSEMINAÇÃO

O horário da inseminação em relação ao momento da ovulação é um

dos mais importantes fatores que afetam a taxa de concepção (EPPLESTON

e ROBERTS, 1986).

Segundo MILLER (1986) a ovulação ocorre aproximadamente 30

horas após o início do estro. Os óvulos sobrevivem de 4 a 10 horas nos

ovidutos e os espermatozóides necessitam de algumas horas para

capacitação, sendo portanto o melhor momento para a inseminação 12 a

24 horas após o início do estro.

HUNTER et ai, (1982), trabalhando com ovelhas cara-negra,

observaram incremento do transporte espermático até os ovidutos quando

a monta era realizada no segundo dia de estro, ou seja, mais próximo do

momento da ovulação. A taxa de fertil ização foi de 20% quando a monta

era realizada no momento inicial do estro e de 94,4% se a monta acontecia

24 horas mais tarde.

Porém, JONES et ai, (1969), estudando o momento da inseminação

cervical com sêmen refrigerado em relação ao estágio do estro natural,

verificaram que a fertil idade das ovelhas foi mais elevada durante as

primeiras 12 horas do estro e reduziu-se progressivamente nos dois

períodos subsequentes de 12 horas. Esses resultados confirmam os dados

de MATTNER e BRADEN (1969), que verificaram a presença de número

significativamente maior de espermatozóides na cérvice, útero e ovidutos

quando a inseminação era realizada no início do estro.

A inseminação artificial com estro natural é amplamente utilizada em

rebanhos numerosos, porém para que a inseminação seja prática e

economicamente viável em pequenos rebanhos, é necessário que todas as

fêmeas apresentem estro em momento de elevada coincidência. Para isto

são utilizados métodos naturais e/ou artificiais de indução ou sincronização

de estro.

Em ovelhas com estro sincronizado, a ovulação ocorre mais

precocemente, em relação ao início do estro, do que em ovelhas ciciando

naturalmente (LUNSTRA e CHRISTENSON, 1981).

Na sincronização com progestágenos em conjunto com Gonadotrofina

Coriônica Equina (eCG) e efeito macho, a maioria das ovelhas apresenta

estro em 36 a 48 horas e ovula aproximadamente 60 horas após a retirada

dos pessários (EVANS e MAXWELL, 1987), havendo variações conforme a

raça (SALAMON e MAXWELL, 1995). SOUZA et al., (1995), verificaram em

ovelhas Corriedale, que a ovulação ocorre 65,1 horas após a retirada de

esponjas impregnadas com acetato de medroxiprogesterona (MAP) e

aplicação do eCG em ovelhas expostas aos carneiros. O mesmo tratamento

hormonal na ausência do macho resultou em ovulação 73,5 horas após a

retirada das esponjas e aplicação do eCG.

Em esquemas comerciais de inseminação artificial, preconiza-se o uso

de um horário fixo de inseminação após a sincronização do estro com o

objetivo de maximizar o aproveitamento do sêmen e facilitar o manejo dos

animais, evitando a supervisão constante para a identificação do momento

em que as fêmeas apresentam estro (DZIUK et a/., 1972).

Com relação ao horário de inseminação, após a retirada dos

pessários e aplicação do eCG, EVANS e MAXWELL (1987) sugerem, para a

raça Merino Australiano, o horário de 55 horas e 60 a 66 horas, para uma

única inseminação artificial cervical e intra-uterina por laparoscopia,

respectivamente. CHEMINEAU e COGNIÉ (1991) trabalhando com raças

francesas preconizam 55 ± 1 horas para inseminação cervical e 60 a 72

horas para a intra-uterina.

O tipo de progestágeno usado tem um efeito significativo sobre a

taxa de parição (EPPLESTON e ROBERTS, 1986). Há significativa vantagem

pelo uso do Acetato de Fluogestona (FGA) em relação ao Acetato de

Medroxiprogesterona (MAP) quando se utilizam horários fixos de

inseminação após a remoção das esponjas (55 ± 1 h). A explicação mais

provável é que o FGA promove sincronização de estro mais precisa ou este

horário de inseminação não é adequado para animais tratados com MAP.

Para que os resultados sejam satisfatórios é necessário precisar o horário

da inseminação, uma vez que o tratamento com progestágenos e eCG

reduz o mecanismo de transporte e a sobrevivência dos espermatozóides

no trato genital da fêmea (CHEMINEAU e COGNIÉ, 1991). Determina,

ainda, aumento na taxa de mortalidade embrionária qualquer que seja a

estação do ano em que o estro é induzido (LUNSTRA e CHRISTENSON,

1981).

Com referência ao horário de inseminação intra-uterina em ovelhas

que tiveram o estro sincronizado, EPPLESTON e ROBERTS (1986),

obtiveram taxas de parição de 31,7; 61,5 e 37% para inseminações com

sêmen congelado, realizadas por laparoscopia às 48, 60 e 72 horas

respectivamente após a retirada dos pessários impregnados com MAP.

Em ovelhas superovuladas, não houve diferença na taxa de

fertilização de óvulos entre inseminações intra-uterinas às 24, 44 e 64

horas após a retirada dos pessários quando se utilizou sêmen fresco

diluído. Porém, utilizando sêmen congelado, os resultados foram superiores

às 44 horas em relação às 24 e 64 horas (EVANS et a!., 1986).

MACHADO e SIMPLÍCIO (1990), verificaram taxas de não retorno ao

estro superiores quando a inseminação intra-uterina com sêmen congelado

era realizada às 46 horas após a sincronização de estro com MAP e

cloprostenol em relação às inseminações executadas às 38 ou 54 horas.

3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 AVALIAÇÃO DOS DILUENTES

3.1.1 Animais

Foram util izados como doadores de sêmen, 3 carneiros da raça

Suffolk, com idade variando entre 3 e 6 anos, submetidos a exame

andrológico. Os animais encontravam-se na Fazenda Experimental do

Canguiri pertencente à Universidade Federal do Paraná, localizada no

Município de Pinhais (PR). Os animais apresentavam escore da condição

corporal 4, sendo mantidos em conf inamento e al imentados com silagem

de milho, concentrado e sal mineral.

3.1.2 Colheita e aval iação do sêmen fresco

O sêmen foi obtido com vagina art if ic ial1 , sendo os 3 carneiros

util izados em sistema de rodízio. Durante 4 dias da semana era colhido

um ejaculado de 2 carneiros, total izando 2 ou 3 colheitas semanais de

cada reprodutor. Os ejaculados foram obtidos nos meses de janeiro,

fevereiro e maio de 1996, estando os animais em descanso sexual.

Imediatamente após a colheita as amostras foram colocadas em

banho-maria a 30°C e examinadas conforme os critérios:

a) Volume

O volume foi medido por meio de pipeta graduada.

b) Turbi lhonamento

Uma gota de sêmen puro foi colocada, por meio de uma pipeta

Metalúrgica Walmur - Porto Alegre - RS

Pasteur, sobre lâmina aquecida a 37°C. Uti l izou-se microscópio

binocular2 (40X) com platina aquecedora para a aval iação dos resultados

que eram expressos de acordo com escala de valorização de 0 a 5,

segundo EVANS e MAXWELL (1987).

c) Moti l idade progressiva

Uma gota de sêmen fresco foi colocada em um tubo de ensaio com

0,5 ml de solução f is iológica. A seguir uma gota deste homogeneizado

era colocada entre lâmina e lamínula, aquecidas a 37°C para avaliação

microscópica (100X), sendo o resultado expresso em percentual.

d) Vigor

Simultaneamente à determinação da moti l idade progressiva,

avaliou-se o vigor, sendo o resultado expresso em escala de 0 a 5

(CHEMINEAU e COGNIÉ, 1991)

e) Concentração espermática

Esta característ ica foi estimada segundo relatos de EVANS e

MAXWELL (1987) que est imam a concentração espermática conforme a

consistência do ejaculado.

f) Morfologia espermática

Imediatamente após a homogeneização dos ejaculados, uma gota

era colocada em 1 ml de solução formol - citrato3 . Estas amostras eram

mantidas sob refrigeração até o momento do exame.

Para a preparação das lâminas era colocada uma gota do sêmen

conservado na solução formol-citrato entre lâmina e lamínula, fixadas

nas laterais por esmalte incolor, e eram contadas 200 células por lâmina

2 Ernest Leitz Wetzlar HM-LUX 3 - Germany 3 Solução mãe: citrato de sódio 29 g

H20 d 1000 ml Solução final: solução mãe 960 ml

Formol 4 0 % 40 ml

em microscópio de contraste de fase4 (1000 X). Os defeitos foram

classif icados segundo BLOM (1973) em maiores e menores, conforme

tabela 2.

TABELA 2 - Classif icação das anormal idades espermáticas. DEFEITOS MAIORES DEFEITOS MENORES

- subdesenvolvido - formas teratológicas - acrossoma (knobbed) - diadema (pouch formation) - cabeça piriforme - cabeça estreita na base - cabeça pequena anormal - cabeça isolada anormal - peça intermediária em sacarrolha - outros defeitos de peça intermediária - gota proximal - pseudogota - cauda fortemente dobrada

- cabeça estreita - cabeça pequena normal - cabeça gigante ou larga - cabeça isolada normal - acrossoma desprendido - implantação abaxial - cauda enrolada - outras elementos:

- medusas - células primordiais - células gigantes - leucócitos - hemácias - células epitel iais

Fonte: Blom, 1973.

Foram aproveitados somente os ejaculados que possuíam no

mínimo volume de 0,7 ml, 70% de moti l idade progressiva,

turbi lhonamento 3, vigor 3, concentração espermática de 2,5

milhões/mm3 e 80% de espermatozóides normais.

3.1.3 Preparação dos di luentes

Foram testados os di luentes CUE, CU-16, gl ic ina-gema, citrato-

gema, leite UHT-gema, TRIS-gema, ver anexo 1.

Os diluentes eram preparados semanalmente, armazenados em

refrigerador a 5°C e uti l izados até 4 dias após a preparação.

Os sais foram pesados em balança eletrônica digital, acrescidos de

água deionizada tridesti lada e 1,0 mg de estreptomicina mais 1000 UI de

penici l ina/ml e submetidos a f i l tragem em Steri le Acrodisc5 . A gema de

ovo foi acrescentada no momento da di luição.

4 Meiji Techno CO:, LTD. ML 5000 Microscope - Japan. 5 Sterile Acrodisc, product n° 4192: Gelman Sciences, Michiga USA.

3.1.4 Refrigeração do sêmen

Após a avaliação seminal, foram misturados 0,7 ml de cada

ejaculado, constituindo um homogeneizado de 1,4 ml. Diluía-se

lentamente 0,6 ml de cada um dos 6 di luentes a serem testados em 0,2

ml do homogeneizado (proporção de 1:3), em tubos de ensaio no

banho-maria a 30°C. Os tubos de ensaio tampados eram colocados em

recipiente plástico, contendo água do banho-maria. Este conjunto era

levado à caixa de isopor 16 x 16 x 18 cm que continha 800 ml de água

sob forma de cubos de gelo. A refr igeração para atingir 5°C era feita

gradualmente em 2 horas, correspondendo à diminuição progressiva de

0,21°C/min. O esquema de refr igeração está representado na figura 1.

colheita carneiro 1

3 colheita carneiro 2

avaliação

r

0,7 ml sêmen / 30°C

I avaliação

1 r

0,7 ml sêmen / 30°C

- volume - motilidade progressiva - turbilhonamento - concentracão

diluição / 30°C

refrigeração a 5°C em 120 minutos

FIGURAI- Esquema da metodologia uti l izada para refrigeração do sêmen.

3.1.5 Aval iação do sêmen refr igerado

Foram avaliadas 23 al íquotas do homogeneizado de sêmen, 8 horas

após o início da refrigeração em cada um dos 6 di luentes. Sete destas 23

amostras foram submetidas ao TT, colocando-se 0,5 ml do sêmen

refrigerado em tubos de ensaio com tampa, para a incubação a 38°C em

banho maria. As amostras foram aval iadas a cada hora durante 4 horas.

Tanto para o sêmen refrigerado como para o teste de termo

resistência lento procedeu-se a aval iação de:

a) Turbi lhonamento, conforme descrito no item 3.1.2 d, com o seguinte

detalhe: por se tratar de sêmen refr igerado, as amostras foram

aquecidas a 37°C durante 1 minuto, em placa aquecedora, antes de

serem avaliadas ao microscópio.

b) Moti l idade progressiva e vigor. O material foi preparado conforme

descrito nos itens 3.1.2 c e 3.1.2 d sendo colocadas 2 gotas de sêmen

refr igerado em 0,5 ml do di luente correspondente, sem a gema de

ovo, no banho-maria a 37°C por 1 minuto anteriormente a aval iação.

c) Morfologia espermática. Foram colhidas 3 gotas das amostras de

sêmen após 8 horas de refrigeração, que foram diluídas em 1 ml de

solução de formol-citrato. Procedeu-se a aval iação conforme item

3.1.2 f.

3.2 COLHEITA E DILUIÇÃO DO SÊMEN PARA A INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL

Em cada inseminação artif ic iai foi uti l izado um poo! de sêmen de 2

carneiros, de um total de 4 animais da raça Suffolk, com idade de 2 a 6

anos, previamente submetidos a exame andrológico.

Os ejaculados foram colhidos mediante vagina artif icial, avaliados,

homogeneizados, di luídos e refr igerados conforme nos itens 3.1.2 e

3.1.4.

As amostras de sêmen foram divididas em 2 al íquotas e diluídas

nos di luentes CUE e citrato-gema.

Somente foram util izados ejaculados que apresentaram o mínimo de

70% de motilidade progressiva, turbi lhonamento 3, vigor 3, concentração

espermática de 2,5 milhões/mm3 e 80% de espermatozóides normais.

3.3 INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL

A IA foi realizada nos meses de junho, ju lho de 1996 e março de

1997 em ovelhas submetidas a estro sincronizado.

3.3.1 Sincronização de estro

Todas as ovelhas t iveram o estro sincronizado uti l izando-se

pessários intravaginais6 impregnados com 50 mg de MAP, os quais

permaneceram por 14 dias quando se administraram 500 UI de eCG6 e

introduziram-se os rufiões junto às fêmeas.

3.3.2 Rufiões

Foram util izados 5% de machos vasectomizados para cada grupo

de ovelhas. Os rufiões foram previamente submetidos a exame dos

ejaculados, colhidos por eletroejaculação. Diariamente recebiam tinta7

amarela ou vermelha na região peitoral para identif icação das fêmeas em

estro.

6 CIENTISTAS ASSOCIADOS - Produtos Biológicos. Rua Andrade Neves, 438. CEP: 96020-080. Pelotas - RS 7 XADREZ - Globo S/A Tintas e Pigmentos - Mauá - SP.

3.3.3 Fêmeas

Foram inseminadas 140 ovelhas mestiças da raça Suffolk, com

idade de 2 a 6 anos, apresentando escores da condição corporal entre 3

e 4, alocadas em 2 Parques Municipais da Cidade de Curitiba (PR). Esses

animais eram mantidos em regime semi-intensivo, permanecendo

durante o dia em pastagem nativa e recebendo concentrado ao final da

tarde quando eram recolhidas ao aprisco.

Todas as ovelhas uti l izadas para a inseminação foram submetidas

ao exame ginecológico prévio por meio de espéculo vaginal, sendo

descartadas as que apresentavam constr ição vaginal persistente ou

catarro genital.

GRUPO 1: avaliação da taxa de prenhez após uti l ização de sêmen

refrigerado por via intra-uterina.

Foram inseminadas 44 ovelhas, 55 ± 1 horas após a retirada dos

pessários. Uti l izou-se o laparoscópio para inseminação intra-uterina,

segundo KILLEN e CAFFERY (1982) e NEVES e LUZ (1994), com sêmen

refrigerado durante 8 a 10 horas a 5°C. A dose mínima inseminante foi

de 125 milhões de espermatozóides, em volume de 0,2 ml, em cada

corno uterino. As ovelhas foram divididas em 2 subgrupos:

Subgrupo IA : 23 ovelhas foram inseminadas com sêmen

refrigerado em CUE.

Subgrupo 1B : 21 ovelhas foram inseminadas com sêmen

refrigerado em citrato-gema.

GRUPO 2: avaliação da taxa de prenhez após uti l ização de sêmen

refrigerado por via cervical superf icial.

Foram inseminadas 47 ovelhas, 49 ± 1 horas após a retirada dos

pessários. Foi uti l izado sêmen refr igerado durante 8 a 9 horas a 5°C,

sendo empregada a técnica de inseminação cervical superficial, com

aplicador modelo BARRETO MIES8.

A contenção das fêmeas inseminadas foi realizada mediante

elevação do posterior sobre cavalete de 90,0 cm de altura e imobil ização

dos membros pélvicos por um auxi l iar. Mediante espéculo tubular8,

local izava-se a abertura cervical e procedia-se a inseminação,

permanecendo a ovelha, na mesma posição por mais um minuto. Nos

animais que possuíam excesso de muco vaginal, este era retirado com o

auxíl io do espéculo. A dose mínima inseminante foi de 250 milhões de

espermatozóides, em volume de 0,4 ml, por ovelha. As ovelhas foram

divididas em 2 subgrupos:

Subgrupo 2A: foram inseminadas 24 ovelhas com sêmen

refr igerado em CUE.

Subgrupo 2B: foram inseminadas 23 ovelhas com sêmen

refr igerado em citrato-gema.

GRUPO 3: avaliação do índice de prenhez após uti l ização de sêmen

refrigerado por via cervical superficial às 57 horas após a

retirada dos pessários.

Foram inseminadas 34 ovelhas com sêmen refrigerado , 57 ± 1

horas após a retirada dos pessários. Foi uti l izado sêmen refr igerado no

di luente citrato-gema por 8 a 9 horas a temperatura de 5°C, sendo

empregada a técnica de inseminação cervical superficial, conforme

descrito para o grupo 2. A dose mínima inseminante foi de 250 milhões

de espermatozóides, em volume de 0,4 ml, por ovelha.

Metalúrgica Walmur - Porto Alegre - RS

24

3.4 DIAGNOSTICO DE GESTACAO

Foi realizado por exame ultra-sonografico abdominal, utilizando-se

transdutor 3,5 MHZ9, 60 dias ap6s a insemina~ao artificial.

3.5 ANALISE ESTATISTICA

Para poder efetuar as compara~oes entre semen fresco e semen

refrigerado nos 6 diluentes e os diluentes entre si~ utilizou-se a Ttknica

de Componentes Principais, atraves de uma combina~ao linear das 3

variaveis categ6ricas motilidade progressiva, vigor e turbilhonamento

com o objetivo de ser obtida apenas uma variavel resposta, a qual foi

utilizada para as compara~oes desejadas. As variaveis obtidas pela

Tecnica de Componentes Principais foram combinadas linearmente,

utilizando-se como pesos seus correspondentes autovalores, motilidade

progressiva (Fl), o turbilhonamento (F2) e o vigor (F3) :

NOVA VARIAVEL RESPOSTA = 1.9908 * Fl + 0.6387 * F2 + 0.3705 * F3

Como as suposi~oes residuais foram atendidas, para a avalia~ao do

semen realizada ap6s 8 horas de refrigera~ao, as variaveis de cada

grupo foram submetidas a Tecnica de Analise de Variancia (ANOVA) e ao

Teste de Compara~ao Multipla de Tukey.

A compara~ao entre os diluentes na quarta hora do TT foi

executada de forma semelhante aquela para a avalia~ao do semen

refrigerado por 8 horas. Utilizou-se a Tecnica de Componentes Principais

obtendo-se uma unica variavel resposta para os resultados de motilidade

progressiva (Fl), turbilhonamento (F2) e vigor (F3):

Echo Camera ssd-210-DX 2. Atoka CO., LTD. Japan

NOVA VARIÁVEL RESPOSTA (TT) = 2.1460*F1 + 0.4397*F2 +0.4143*F3

Novamente foram util izadas a Técnica de Análise de Variâncias

(ANOVA) e o Teste de Comparação Múltipla de Tukey após serem

atendidas as suposições residuais confirmadas pelo Teste de

Kolmogorov-Smirnov (valor-p=0.982966) e Teste de Bartlett (valor-

p=0.0914187).

Todas as diferenças observadas em cada defeito estudado na

morfologia espermática entre sêmen fresco e refrigerado foram

submetidas a comparação por Análise de Variância (ANOVA) e ao Teste

de Tukey.

O estudo dos resultados dos defeitos maiores atendeu as

suposições exigidas pela técnica ANOVA sendo o valor-p = 0.80948 para

o Teste de Kolmogorov-Smirnov e valor-p = 0.606866 para o Teste de

Bartlett.

Quanto aos resultados de acrossoma desprendido o Teste de

Kolmogorov-Smirnov proporcionou valor-p = 0.740299 e valor-p =

0.0971572 para o Teste de Bartlett, satisfazendo as exigências da

técnica de ANOVA.

Os dados obtidos no defeito cauda enrolada atenderam às

exigências de ANOVA para a normalidade dos resíduos, o Teste

Kolmogorov-Smirnov proporcionou valor-p = 0.594795. Porém, quanto à

suposição de homogeneidade de variâncias, o Teste de Bartlett resultou

em valor-p = 0.00013. Desta forma optou-se pela transformação raiz

quadrada dos resultados, recomendada quando a variância dos erros

cresce proporcionalmente aos valores das observações. Considerando os

dados transformados, novamente fez-se o Teste de Kolmogorov-Smirnov

obtendo-se valor-p = 0.704654 e valor-p = 0.129918 para o Teste de

Bartlett, indicando a homogeneidade das variâncias.

Os outros defeitos menores foram agrupados e satisfizeram as

exigências da técnica de ANOVA com valor-p = 0.563425 para o Teste de

Kolmogorov-Smirnov e valor-p = 0.171453 para o Teste de Bartlett.

Os resultados de total de defeitos menores também foram

submetidos aos testes de Kolmogorov-Smirnov e de Bartlett satisfazendo

as exigências de ANOVA com valor-p = 0.794024 e valor-p = 0.072429

respectivamente.

Com relação às comparações das taxas de prenhez dos diferentes

grupos de ovelhas inseminadas, uti l izou-se o Teste Exato de Fisher para

a verif icação da possibi l idade de se trabalhar com os dados referentes

aos dois parques como sendo um.

Para a verif icação das diferenças entre os grupos de ovelhas

inseminadas, foram efetuadas comparações pela Proporção Binomial de

Sucesso, pelo Teste Exato de Fisher e Teste x2. Na comparação dos

grupos o nível de signif icância foi f ixado em 5%.

4 RESULTADOS

4.1 AVALIAÇÃO IN VITRO DO SÊMEN REFRIGERADO

4.1.1 Avaliação 8 horas após refrigeração

Na tabela 3 são apresentados os resultados médios de motilidade

progressiva, turbilhonamento e vigor de 23 amostras de sêmen fresco e

posteriormente refrigeradas por 8 horas à temperatura de 5°C nos 6

diluentes testados.

TABELA 3 - Avaliação in vitro de sêmen ovino fresco e após 8 horas a refrigeração em 6 diluentes à temperatura de 5°C. Curitiba (PR), 1999.

DILUENTE MOTILIDADE

PROGRESSIVA TURBILHONAMENTO VIGOR (%) (0-5) (0-5)

sêmen fresco a 75,65 4,02 3,73

CUE* c 64,34 2,3 2,85

CU-16" c 61,73 2,21 2,94

glicina-gema d 55,22 1,06 2,42

citrato-gema b 55,22 2,64 2,74

leite UHT-gema c 67,82 1,98 2,8

TRIS-gema c 42,17 2,36 2,46 NOTA: letras diferentes indicam diferença estatística (P< 0,05)

* Cornell University Extender Cornell University - 16

Comparando-se a nova variável obtida pelo cálculo estatístico com o

uso da Técnica Análise de Componentes Principais, proveniente das

28

caracteristicas: motilidade progressiva, vigor e turbilhonamento, foram

observadas diferen<;as significativas (P<O,OS) entre semen fresco e semen

refrigerado. Observou-se superioridade de resultados do semen ap6s 8

horas de refrigera<;ao no diluente citrato-gema em rela<;ao aos demais nas

caracteristicas avaliadas. Os diluentes CUE, CU-16, Ieite UHT-gema, TRIS­

gema nao diferiram entre si e 0 diluente glicina-gema apresentou

resultados inferiores aos demais.

4.1.2 Teste de termo-resistencia

Ocorreu urn pequeno aumento da motilidade progressiva na 1 a hora

de incuba<;ao em 4 dos 6 diluentes utilizados, seguido por declinio

progressivo em todas as amostras ate o ultimo momento de observa<;ao

ver figura 1.

A melhor media de motilidade progressiva, observada na 4a hora de

incuba<;ao, foi de 50°/o para o diluente citrato-gema, seguida de 38,89°/o

para o diluente CUE.

~ -~ ~------~~--~~--------~~~~--------~~~ j t~ ~--------- =------~----~------~~--~~~~ ~ t~~------------~·=-----~----------------~~~

hcno

- CU-18

gllclna - gema

- lellel.ffi"-gema

FIGURA 1 - Valores de motilidade progressiva (0/o) durante o TT de semen ovino refrigerado em 6 diluentes por 8 horas a temperatura de soc.

29

Os valores de vigor para cada urn dos diluentes durante o TT estao

representados na figura 2. Assim como na motilidade progressiva, houve

declinio Iento e continuo do vigor em todas as amostras ate o ultimo

momento de observac;ao.

Os valores de turbilhonamento para cada urn dos diluentes durante

o TT, ap6s refrigerac;ao de 8 horas a temperatura de soc, estao

representados na figura 3.

Observou-se repetic;ao no comportamento de cada diluente, durante

avaliac;ao no 1T para as caracteristicas estudadas, ou seja, os 2 diluentes

que mantiveram melhor motilidade progressiva tambem o fizeram para o

vigore conseqOentemente turbilhonamento.

Os valores de motilidade progressiva, turbilhonamento e vigor para

cada urn dos diluentes na 4a hora do TT, ap6s refrigerac;ao de 8 horas a temperatura de soc, estao representados na tabela 4.

3,5

3

2,5 -+-CUE

---CU-16

• 2 glicina-ge!Tla I

--M-citrato-gema • .. I

1 ,5 ----Ieite UHT- gema

-+-lRIS- gema

0 3

hora•

FIGURA 2 - Valores de vigor (0-S) durante o 1T de semen ovino refrigerado em 6 diluentes por 8 horas a temperatura de soc.

0 2 3

horas

--+--a..e ---CU-16

gicina - gerra

~citralo- gerra

------- LHr- gen-a __,._ TRIS- gerra

30

FIGURA 3 - Valores de turbilhonamento (0-S) durante TT de semen ovino refrigerado em 6 diluentes por 8 horas a temperatura de S°C.

TABELA 4 - Valores de motilidade progressiva, turbilhonamento e vigor na 4a hora do TT de semen ovino refrigerado em 6 diluentes por 8 horas a temperatura de soc. Curitiba (PR), 1999.

MOTILIDADE DILUENTE PROG RESSIVA TURBILHONAMENTO VIGOR

( 0/o) (O- S) (O-S)

CUE* b 38,89 1,17 1,44

CU-16** b 29,37 1 1,S6

glicina-gema c 0 0 0

citrato-gema a so 1,S 1,89

Ieite UHT -gem a c 2,2 0 0,33

TRIS-gema b 3S 0,68 1,31

MEDIA 2S,49 0,72 1,08 NOTA: letras diferentes lndicam diferen~a estatfstlca (P< 0,05)

• Cornell University Extender ** Cornell University - 16

Foram observadas diferenças significativas (P<0,05) ao se comparar

as avaliações na 4 a hora do TT. O sêmen diluído em citrato-gema

demonstrou resultados estatisticamente superiores aos diluentes CUE, CU-

16 e TRIS-gema. O sêmen diluído em leite UHT-gema e glicina-gema

resultou em médias muito baixas de motilidade progressiva,

turbilhonamento e vigor, as quais apresentaram-se com valor zero ou

próximo a zero na 4 a hora de observação, evidenciando inferioridade de

resultados quando comparados aos demais diluentes.

4.1.3 Avaliação da morfologia espermática

Com relação às características morfológicas dos espermatozóides

refrigerados por 8 horas nos 6 diluentes testados quando comparados com

sêmen fresco, não foi observado aumento significativo (P>0,05) na

percentagem de células que apresentaram defeitos maiores após a

refrigeração em quaisquer dos diluentes testados, conforme está

demonstrado na tabela 5.

Ao se analisar a percentagem total de defeitos menores, observou-se

um aumento significativo (P<0,05) de espermatozóides anormais após a

refrigeração nos diluentes CU-16, leite UHT-gema e TRIS-gema em relação

ao sêmen fresco, conforme demonstra a tabela 5. Os diluentes CUE,

citrato-gema e glicina-gema não diferiram significativamente do sêmen

fresco nem dos demais diluentes.

Considerando os defeitos menores que apareceram com maior

freqüência observou-se que o processo de refrigeração não afetou

significativamente os resultados de percentagem de acrossoma

desprendido, (P> 0,05) em todos os diluentes testados, conforme

demonstra a tabela 5.

TABELA 5 - Avaliação da morfologia espermática em sêmen ovino fresco e refrigerado em 6 diluentes por 8 horas à temperatura de 5°C. Curitiba (PR), 1999.

DILUENTE DEF. MENORES (%) DEF. MAIORES

TOTAL DEFEITOS

acrossoma cauda desprendido enrolada outros TOTAL

(%) (%)

FRESCO 3,9 a 2,4 a 3,5 ab 9,8 a 3,1a 12,9

CUE 4,7 a 9,2 bc 3,05 a 16,95 ab 3,4 a 20,35

CU-16 5,85 a 13,15 c 3,85 ab 22,85 b 2,9 3 25,75

glicina-gema 5,75 a 4,05 ab 6 , l b 15,9 ab 3,9 a 19,8

citrato-gema 6 , 1 a 7,55 bc 3,8 ab 17,45 ab 2,95 a 20,3

leite UHT-gema 4,9 a 9,45 bc 4,05 ab 18,4 b 3,15 a 21,55

TRIS-gema 5 , 1 a 9,1 bc 5,2 ab 19,4 b 3,05 a 22,45

NOTA: letras diferentes na mesma coluna indicam diferença estatística significativa (P<0,05).

A análise dos valores obtidos para o defeito menor - cauda

enrolada demonstrou que há diferenças significativas entre as amostras de

sêmen fresco e diluídas nos 6 conservantes testados (P<0,05). Observou-

se que o sêmen fresco apresenta a menor proporção de defeito cauda

enrolada, diferindo de todos os diluentes, à exceção do diluente glicina-

gema. O diluente CU-16 apresenta a maior proporção do referido defeito,

sendo que tal diluente só difere do sêmen fresco e do diluente glicina-

gema. Os demais diluentes citrato-gema, TRIS-gema, CUE e leite UHT-

gema não apresentam diferenças entre si.

Os resultados referentes aos outros defeitos menores (cabeça

estreita, cabeça pequena normal, cabeça gigante ou larga, cabeça isolada

normal e implantação abaxial) foram agrupados e analisados em conjunto.

Entre os defeitos que foram agrupados, o defeito que apareceu com maior

freqüência foi cabeça isolada normal, principalmente no sêmen diluído em

glicina-gema, que se apresentou significativamente inferior às amostras

diluídas em CUE (P<0,05). Os demais diluentes e o sêmen fresco não

apresentaram diferenças significativas entre si, conforme verifica-se na

tabela 5.

Em função dos resultados demonstrados in vitro foram escolhidos os

diluentes que apresentaram melhores condições de preservabilidade do

sêmen refrigerado. Utilizou-se citrato-gema e CUE para verificar a taxa de

prenhez de ovelhas inseminadas com diferentes técnicas e em 2 horários

diferentes.

4.2 TAXAS DE PRENHEZ APÓS INSEMINAÇÃO ARTIFICIAL

Uma vez que a IA em cada grupo experimental foi realizada em 2

parques distintos, utilizou-se o Teste Exato de Fisher e verificou-se que

não houve diferença significativa (P>0,05) entre os resultados obtidos para

os mesmos grupos entre os 2 parques. Por esta razão os dados foram

analisados em conjunto.

As taxas de prenhez de ovelhas inseminadas por via intra-uterina ou

cervical com sêmen refrigerado diluído em CUE comparados com o sêmen

diluído em citrato-gema são apresentados nas tabelas 6 e 7.

TABELA 6 - Taxas de prenhez de ovelhas inseminadas por via intra-uterina com sêmen refrigerado em 2 diluentes por 8 a 10 horas à temperatura de 5°C. Curitiba (PR), 1999.

OVELHAS OVELHAS OVELHAS DILUENTES INSEMINADAS GESTANTES GESTANTES

(N°) (N°) (%)

CUE* 23 16 69,56a

Citrato-gema 21 18 85,71a

TOTAL 44 34 77,27 NOTAS: letras iguais indicam que não houve diferença estatística (P>0,05).

* Cornell University Extender

TABELA 7 - Taxas de prenhez de ovelhas inseminadas por via cervical com sêmen refrigerado em 2 diluentes por 8 horas à temperatura de 5°C. Curitiba (PR), 1999.

DILUENTES OVELHAS OVELHAS OVELHAS INSEMINADAS GESTANTES GESTANTES

(N°) (N°) (%)

CUE* 24 02 8,33 a

Citrato-gema 23 05 21,74 3

TOTAL 47 07 14,89 NOTAS: letras iguais indicam que não houve diferença estatística (P>0,05).

* Cornell University Extender

Apesar da taxa de prenhez ter sido superior no grupo inseminado

com sêmen refrigerado no diluente citrato-gema, não foram observadas

diferenças significativas (P>0,05) entre os 2 diluentes nessas vias de

inseminação.

Na tabela 8 comparam-se os resultados da inseminação pela via

intra-uterina e cervical, util izando-se sêmen refrigerado em citrato-gema e

variando-se o momento de inseminação para a via cervical. Considerando o

local de deposição do sêmen, foi observada diferença estatística

significativa entre os 2 grupos, util izando-se o Teste Qui Quadrado. Os

resultados de prenhez do grupo de ovelhas inseminadas pela via intra-

uterina (P<0,05) foram superiores.

Variando-se o momento de inseminação, na via cervical, após a

retirada dos pessários, verificou-se que o grupo inseminado às 57 ± 1

horas apresentou resultados superiores de fertil idade (P<0,05) quando

comparados aos resultados de prenhez do grupo inseminado às 49 ± 1

horas, utilizando-se a Proporção Binomial de Sucesso.

TABELA 8 - Taxas de prenhez de ovelhas inseminadas com sêmen refrigerado em citrato-gema à temperatura de 5°C, considerando o local de deposição do sêmen e o momento de inseminação. Curitiba (PR), 1999.

LOCAL DE DEPOSIÇÃO DO SÊMEN

MOMENTO DE INSEMINAÇÃO*

(HORAS)

OVELHAS INSEMINADAS

(N°)

OVELHAS GESTANTES

(N°)

OVELHAS GESTANTES

(%)

Útero 55 ± 1 21 18 85,71 a

Cérvice 57 ± 1 32 14 43,75 b

Cérvice 49 ± 1 23 05 21,74 c

NOTÁS: letras diferentes indicam diferença significativa (P<0,05) Número de horas entre a retirada dos pessários e a inseminação

5 DISCUSSÃO

Na tentativa de minimizar as alterações provocadas no sêmen,

durante o processo de preservação, são acrescidas soluções

conservantes que proporcionam condições para a estocagem dos

espermatozóides (CÓRDOVA et a/., 1989).

Verif icou-se neste estudo, que o processo de refrigeração causou

diminuição signif icativa na qual idade espermática, independente do

di luente util izado, quando comparado ao sêmen fresco. Segundo

SALAMON e MAXWELL (1995), a redução e aumento na temperatura,

assim como a manipulação do sêmen durante o processo de conservação

promovem inevitavelmente redução na moti l idade e causam danos

ultraestruturais, bioquímicos e funcionais nos espermatozóides.

Foi possível verif icar na aval iação in vitro, diferenças entre os

di luentes testados quanto a capacidade de conservação do sêmen ovino,

8 horas após o início da refr igeração. Entretanto, PETRUZZI et ai,

(1976), não encontraram diferenças na moti l idade entre as amostras de

sêmen di luídas em TRIS, citrato-gema e leite com ou sem gema, fazendo

avaliações 4 horas após a refr igeração.

O sêmen diluído em citrato-gema demonstrou melhores resultados

nas característ icas avaliadas (moti l idade progressiva + vigor +

turbi lhonamento) após 8 horas de refr igeração em relação aos demais

di luentes testados. Estes dados confirmam os resultados de DAUZIER et

al., (1954) que verif icaram maior longevidade dos espermatozóides

diluídos em soluções de citrato quando comparados com leite. PETRUZZI

et al., (1976), verif icaram maior moti l idade, após 24 horas de

refrigeração, em sêmen diluído com citrato-gema e diluído em TRIS em

relação aos diluentes a base de leite. Apesar destes autores terem

notificado uma semelhança entre os di luentes citrato-gema e TRIS na

avaliação às 24 horas de conservação, a característ ica avaliada foi

motilidade total, ao invés de moti l idade progressiva, vigor e

turbi lhonamento como realizou-se neste exper imento.

As amostras de sêmen diluídas em CUE, CU-16, leite UHT-gema e

TRIS-gema, não apresentaram diferença estat íst ica signif icativa quando

comparadas entre si na aval iação 8 horas após a refrigeração, porém

demonstraram ser inferiores a aquelas di luídas em citrato-gema, nas

característ icas avaliadas. DE KA e RAO, (1980a), obtiveram motil idade

progressiva superior em sêmen ovino di luído em TRIS-gema e leite

integral em relação ao di luente citrato-gema, porém as amostras diluídas

em citrato-gema, mantiveram mais que 50% da moti l idade progressiva

inicial após 72 horas de conservação. Nesse estudo as avaliações foram

feitas somente 24 horas após a refr igeração e baseadas unicamente em

motil idade progressiva.

Os diluentes que continham glicina em sua formulação (CUE, CU-16

e gl icina-gema) não apresentaram vantagens signif icativas, nas

característ icas avaliadas, em relação aos demais di luentes testados.

Porém SCHINDLER e AMIR (1961) observaram maior longevidade dos

espermatozóides nos di luentes acrescidos de gl icina. FLIPSE e ALMQUIST

(1956) explicam que a maior vantagem da gl ic ina é prolongar o tempo

de conservação e que esta pode até reduzir a motil idade durante os

primeiros 7 dias de conservação.

O diluente gl ic ina-gema apresentou resultados inferiores aos

demais diluentes nas observações realizadas 8 horas após a refrigeração

e durante o TT. Esses dados confirmam os resultados de FOOTE e

BRATON (1960) que, com sêmen bovino, verif icaram motil idade inferior

do diluente gl icina-gema, principalmente se comparado ao diluente CUE

e CU-16. Porém AHMED (1955) uti l izando sêmen ovino refrigerado a 4°C,

por até 17 dias, observou escores de moti l idade superiores e o dobro do

tempo de sobrevivência dos espermatozóides di luídos em glicina-gema,

quando comparados aos di luídos em citrato-gema. Esses resultados

confirmam a vantagem de util izar di luentes acrescidos de glicina quando

se deseja a conservação do sêmen refr igerado por tempo prolongado. No

uso por períodos curtos de conservação, como as 8 horas util izadas

neste experimento, não se observou melhora signif icativa da qualidade

espermática quando comparada com os demais di luentes testados.

A avaliação dos di luentes no TT revelou não haver alteração nas

médias de motil idade progressiva, vigor e turbi lhonamento na I a hora de

incubação, porém nas 3 horas subseqüentes ocorreu um declínio médio

por hora de 11,6%; 0,52 e 0,42 na moti l idade progressiva, vigor e

turbi lhonamento respectivamente, demonstrando uma diminuição lenta,

progressiva e linear na média de todas as característ icas avaliadas nos 6

di luentes testados até a última observação, a qual foi realizada na 4 a

hora de incubação. Estes resultados concordam com as aval iações feitas

por PAGANINI et al., (1997) os quais obtiveram decl ínio linear

signif icativo com o avanço do período de estocagem durante o teste de

exaustão. Este fato pode ser expl icado em função dos espermatozóides

uti l izarem mais os seus substratos nutrit ivos e diminuírem sua

viabil idade durante as 4 horas do teste.

Na 4 a hora de avaliação, verif icou-se a morte de todos os

espermatozóides diluídos em gl ic ina-gema e apenas 2,2% de motil idade

progressiva no di luente leite UHT-gema. O di luente citrato-gema

manteve as amostras de sêmen em melhores condições que os demais

di luentes, apresentando 50% de moti l idade na quarta hora, enquanto

que os diluentes CUE, CU-16 e TRIS mantiveram os espermatozóides em

condições semelhantes e s ignif icat ivamente inferiores ao citrato-gema.

PAGANINI et aL, (1997) não observaram diferenças signif icativas entre

os diluentes testados (gl ic ina-gema, gl ic ina- leite-gema e gema-leite) na

motil idade e vigor dos espermatozóides aos 240 minutos do teste.

Com os resultados do TT foi possível determinar, por meio da

avaliação dos espermatozóides, a habi l idade e capacidade de cada

di luente em fornecer um meio de nutrição e manutenção do pH

compatíveis com a sobrevivência dos espermatozóides em temperaturas

que não diminuem seu metabol ismo. Conforme observou LUZ (1991) com

sêmen congelado, há uma correlação entre a moti l idade progressiva no

TT e os resultados de fert i l idade.

O estudo da morfologia espermática, após a refrigeração,

demonstrou não haver aumento signif icat ivo na percentagem de defeitos

maiores após a refrigeração do sêmen. Este resultado era esperado.

Segundo BLOM (1973) os defeitos maiores estão associados a um

suposto distúrbio na espermatogênese.

Observou-se aumento signif icativo na percentagem total de

espermatozóides com defeitos menores após a refrigeração nos diluentes

CU-16, leite UHT-gema e TRIS-gema em relação ao sêmen fresco. Porém

não se verif icaram diferenças entre os di luentes. Dentre os defeitos

menores, o aumento de cauda enrolada foi uma das anormal idades que

mais contribuiu para a diferença signif icativa entre os 3 di luentes acima

citados em relação ao sêmen fresco. Foi signif icativo o aumento de

cauda enrolada em todos os di luentes testados em relação ao sêmen

fresco. PAGANINI et al., (1997) também verif icaram aumento de

anormalidades de cauda quando anal isaram sêmen refr igerado submetido

a 240 minutos ao teste de exaustão. Segundo BARTH e OKO (1989), o

estresse térmico e a hiposmolar idade das soluções conservantes

aumentam a proporção de defeitos de cauda, signif icat ivamente.

DREVIUS (1963), verif icou que soluções hipotônicas induziam os

espermatozóides a movimentos natatórios muito intensivos e com o

aumento da hipotonicidade, as caudas tornavam-se curvas e

posteriormente espiraladas. Para a determinação da causa exata do

aumento das caudas enroladas encontradas neste estudo, faz-se

necessária a determinação da osmolar idade das soluções empregadas.

Quando se avaliou a percentagem de acrossoma desprendido não

foram observadas diferenças signif icativas entre o sêmen fresco e o

sêmen refrigerado. SAXENA e SINGH (1967) aval iando comprimento e

largura de cabeças de espermatozóides conservados em leite-gema,

bicarbonato-gema, citrato-gema e CUE, não encontraram alterações

signif icativas. Porém KARCHE et a!., (1976) observaram que após 72

horas de conservação do sêmen a 5°C nos di luentes testados (citrato,

leite integral e glicina), os espermatozóides apresentavam diminuição

signif icativa do tamanho da cabeça em relação ao sêmen fresco, sendo

no di luente gl ic ina-gema mais evidente. Esta alteração foi atribuída a

uma contração do acrossoma. As di ferenças de resultados deste

experimento com o supra citado podem ter ocorrido devido aos

diferentes tempos de preservação estudados.

PAGANINI et a!., (1997) também observaram aumento nos defeitos

de acrossoma em sêmen refrigerado, porém as amostras foram avaliadas

na 4 a hora do TT, enquanto que neste exper imento aval iou-se o sêmen

fresco e 8 horas após a refr igeração.

Os outros defeitos menores foram agrupados e observou-se

aumento signif icativo de anormal idades no sêmen diluído em glicina-

gema (6,1%) quando comparado ao CUE (3,05%). Esta diferença ocorreu

principalmente devido ao aumento de cabeças isoladas verif icadas nos

espermatozóides conservados em gl ic ina-gema.

Apesar da sensível diminuição da qual idade espermática após o

processo de refrigeração, no momento da inseminação, o sêmen

apresentava-se em boas condições de moti l idade progressiva, vigor e

morfologia espermática. Porém MARTIN (1968) e MAXWELL e WATSON

(1996) explicam que após a di luição e refrigeração, alguns danos

provocados nas células espermáticas não afetam signif icativamente a

motil idade, mas interferem seriamente na sobrevivência e capacidade

fecundante dos espermatozóides no trato genital feminino.

Aval iando sêmen ovino após a descongelação, SALAMON e

MAXWELL, (1995) verif icaram que embora uma alta proporção (40-60%)

de espermatozóides de carneiro preservaram a moti l idade, somente 20 a

30% permaneceram biologicamente sem danos (físicos, bioquímicos ou

funcionais). Um espermatozóide pode estar móvel, mas danificado,

portanto será improvável que penetre no óvulo e o fert i l ize.

Conforme os resultados dos estudos in vitro dos 6 di luentes

testados, foram escolh idos os 2 conservantes que apresentaram as

melhores c lass i f icações nas caracter íst icas aval iadas. C i t rato-gema e CUE

serviram como di luentes para ver i f icar a taxa de prenhez de ovelhas

inseminadas por via intra-uter ina e cerv ica l superf ic ia l e em diferentes

horários após a ret irada dos pessár ios.

Todas as ovelhas submet idas à s incron ização de estro foram

inseminadas, independente da exter ior ização dos sinais de estro.

Segundo MAXWELL (1986) não há d i ferença na fert i l idade de ovelhas que

manifestam ou não estro após o t ratamento hormonal , porém LUZ (1991)

encontrou 51,19% contra 15,20% de fert i l idade para grupos que

manifestaram e não manifestaram estro, respect ivamente.

Os resultados de prenhez nas ove lhas inseminadas com sêmen

refr igerado, ver i f icados neste exper imento, var iaram de 8,33 a 85,71%

conforme o tipo de di luente, o horário de inseminação e pr inc ipalmente

o local de deposição do sêmen. Para CHEMINEAU e COGNIÉ (1991) e

LÓPEZ-BREA, (1996) este e levado grau de var iabi l idade dos resultados

de fert i l idade, ocorre não somente em função das caracter íst icas

estudadas neste exper imento, mas também devido aos inúmeros fatores

que estão envolv idos no processo da inseminação como: situação

reprodutiva, idade, raça, condição corporal dos reprodutores e matrizes,

dose inseminante, ut i l ização de estro natural ou s incronizado, intervalo

entre o últ imo parto e a inseminação, estação do ano, momento de

inseminação e inseminadores, assim como à qual idade do sêmen, que

pode variar de um carneiro para outro ou entre ejaculados do mesmo

carneiro (LAPWOOD et a!., 1972; MARTIN e WATSON, 1976).

Durante a aval iação in vivo dos di luentes, ver i f icou-se maior

número de ovelhas gestantes após inseminação com citrato em relação

ao CUE, tanto na via intra-uter ina quanto na via cervical superf ic ial ,

porém a di ferença não foi estat is t icamente s igni f icat iva (P>0,05).

Os resultados de prenhez no grupo de ovelhas inseminadas por via

intra-uter ina com sêmen refr igerado foram sat is fatór ios para os 2

d i luentes testados. Os grupos inseminados com sémen di lu ído em CUE e

c i t rato-gema apresentaram, respect ivamente 69,56 e 85,71% de ovelhas

gestantes (tabela 8). Apesar do d i luente c i t rato-gema ter apresentado

resultado 16,15% superior em relação ao grupo inseminado com CUE,

não houve di ferença s igni f icat iva (P>0,05).

A taxa de prenhez foi baixa nos grupos inseminados por via

cervical superf ic ial , nos 2 di luentes testados, às 49 ± 1 hora após a

ret irada dos pessários, (tabela 9). A d i ferença no número de ovelhas

gestantes de 8,33% para 21,74% no grupo inseminado com sêmen

refr igerado em CUE e c i t rato-gema, respect ivamente, demonstrou não

haver di ferença s ignif icat iva (P>0,05) entre d i luentes (tabela 7). O maior

número de ovelhas gestantes após a inseminação com c i t rato-gema tanto

por via cervical superf ic ia l quanto intra-uter ina (P>0,05) sugere a

ut i l ização de maior número de animais a serem inseminados em cada

grupo.

Os melhores resultados obt idos nos grupos que foram inseminados

com sêmen refr igerado em di luente c i t rato-gema, demonst ram que os

resultados in vivo apresentaram coerência com os obt idos in vitro, onde

ver i f icou-se também melhor desempenho deste d i luente.

Comparando-se os dados das taxas de prenhez com a ut i l ização de

c i t rato-gema entre 54 e 58 horas após a ret i rada dos pessár ios (tabela

10), a l terando-se o local de depos ição do sêmen, ver i f icou-se que o

grupo de ovelhas inseminadas por via cerv ical superf ic ia l apresentaram

percentual de gestação de 43,75%. Essa taxa foi infer ior (P<0,05) à

85,71% apresentados pelo grupo inseminado por via intra-uter ina. Estes

resultados conf irmam os relatos de SOUZA (1993) e EPPLESTON et ai.,

(1994) os quais af i rmam que o índice de fert i l idade aumenta l inearmente

à medida que a inseminação se processa em maior profundidade no trato

genital da ovelha.

O percentual de gestação de 85,71% no grupo de ovelhas que

foram inseminadas na via intra-uterina por laparoscopia com sêmen

refrigerado, foi satisfatório. Estes resultados concordam com os de

LÓPEZ-BREA (1996), que obteve índices de 50 a 80% de ferti l idade após

inseminação intra-uterina. LUZ (1991) obteve 65,52% de gestações em

inseminação por laparoscopia uti l izando sêmen fresco.

A util ização da laparoscopia para a inseminação intra-uterina em

ovinos torna a técnica mais onerosa e requer mais tempo e mão de obra

para sua execução. Porém a vantagem é que quando o problema da

barreira cervical é resolvido não há diferença na fert i l idade entre sêmen

fresco e congelado, além de permitir a uti l ização de uma dose

inseminante menor, quando comparado a inseminação cervical,

otimizando o uso do doador do sêmen (FUKUI e ROBERTS, 1978). O uso

da inseminação intra-uterina pode estender a vida útil do sêmen

refrigerado para até 6 dias de estocagem (EVANS, 1987). SALAMON et

a!., (1977) uti l izando inseminação intra-uterina por laparotomia,

obtiveram 52,9% de óvulos fert i l izados com sêmen conservado por 8

dias a 5°C em diluente TRIS.

Levando-se em consideração esses relatos e os resultados obtidos,

testes subsequentes na inseminação intra-uterina com sêmen refrigerado

poderão ser reproduzidos uti l izando-se doses inseminantes menores e

tempos maiores de conservação em relação aos uti l izados neste

experimento.

Apesar da l iteratura apresentar alguns bons resultados de

ferti l idade com o uso de sêmen refr igerado uti l izado por via cervical

como no trabalho de LANGFORD et al. (1979), onde foram verif icados

índices de parição de 78% com dupla inseminação e uti l izando 720 X IO6

espermatozóides, comumente os índices de fert i l idade são pobres como

aqueles encontrados por WATSON e MARTIN (1976) 0 a 27,1%,

BUTSWAT et al., (1990) 11,1 a 38,9% e CRUZ (1994) 7,4 a 11,11% em

seus experimentos. As baixas taxas de fert i l idade uti l izando-se sêmen

conservado via cervical em ovinos, têm sido objeto de estudos em vários

países (FUKUI e ROBERTS, 1978; HALBERT, et ai, 1990; EPPLESTON, et

al., 1994) e muitas vezes os baixos resul tados encontrados chegam a

comprometer a v iabi l idade de seu emprego (LÓPEZ-BREA, 1996).

PLATOV apud SALAMON e MAXWELL (1995), baseado em

informações da l i teratura e c lass i f icando a probabi l idade de penetração

do espermatozó ide no sít io de fert i l i zação do óvulo em uma escala de 0

(sem probabi l idade) a 1 (probabi l idade máxima), forneceu valores de 0,8

- 1,0; 0,5 - 0,8 e ,0,4 para sêmen fresco, refr igerado e congelado

respect ivamente, demonstrando que o sêmen refr igerado possui

problemas de fert i l idade semelhantes aos do sêmen congelado em grau

sens ive lmente menor, resul tando em uma capac idade intermediár ia de

fert i l ização.

MAXWELL e WATSON (1996) sugerem que espermatozó ides

conservados requerem menos tempo de capac i tação no trato genital

feminino, e que podem fert i l izar oóci tos prontamente, se depos i tados

próximos ao local de ovulação, como ocorre na fert i l i zação in vitro,

tubárica ou intra-uter ina.

SMITH et al., (1975); SOUZA (1994) e SALAMON e MAXWELL

(1995) t rabalhando com sêmen congelado e SALAMON et al., (1977)

trabalhando com sêmen refr igerado ver i f i caram que os baixos índices de

fecundação de ovelhas inseminadas por via cervical são atr ibuídos às

d i f icu ldades dos espermatozó ides serem transportados através do canal

cervical e à d iminuição da v iab i l idade espermát ica. Estas barreiras

podem ser a causa da morte de grande número de espermatozóides

resultando em quant idade espermát ica insuf ic iente para a fecundação.

As taxas de prenhez obt idas na inseminação cerv ical superf ic ia l

(43,75%) e intra-uter ina (85,71%), conforme demonstra a tabela 10,

seguiram a mesma tendência daqueles apresentados por SALAMON et al.

(1977), os quais observaram 40% e 94,4% de óvulos fert i l izados quando

procederam a inseminação com sêmen refr igerado a 5°C em TRIS por 2

dias em deposição cervical e uterina, respect ivamente. Provavelmente os

resultados de fert i l idade encontrados por estes autores foram superiores

aos deste experimento, porque naquele se uti l izou estro natural e

também não se levou em conta a mortal idade embrionária, uma vez que

os zigotos foram recolhidos 50 a 60 horas após a inseminação.

Segundo LUNSTRA e CHRISTENSON (1981), ovelhas que tiveram o

estro induzido possuem índices inferiores de fert i l idade porque o

tratamento progestágeno mais eCG têm um efeito nocivo no transporte,

sobrevivência e capacidade de fert i l ização dos espermatozóides,

independente da estação do ano em que é uti l izado; assim como

promove aumento na mortal idade embrionária quando comparado com

ovelhas inseminadas em estro natural.

Para EDEY (1969), além do efeito da sincronização, o aumento na

mortalidade embrionária pode ocorrer devido aos processos de

refrigeração ou congelação do sêmen, os quais promovem o

envelhecimento dos espermatozóides que, apesar de promoverem a

ferti l ização, causam aumento no número de mortes de embriões.

LANGFORD et ai, (1979) trabalhando com sêmen congelado

verif icaram taxa de mortal idade embrionária de 33% quando comparada

a 6% ocorrida com sêmen fresco. No Brasil, JOBIM (1987) verif icou

diferença de 10% de ovelhas que não retornaram ao estro dentro de 21

dias após a IA com sêmen refrigerado, e não pariram, sugerindo a

ocorrência de mortalidade embrionária. Em inseminação após 48 horas

de refrigeração com sêmen diluído em água de coco, CRUZ (1994)

obteve 40,74% de gestações em exame ultrassonográf ico realizado aos

53 dias, porém algumas vesículas embrionárias que apresentavam

reduzido tamanho não se desenvolveram e a taxa de nascimento foi de

apenas 11,11%.

Considerando-se os grupos de ovelhas inseminadas por via cervical

superficial, em diferentes horários após a retirada dos pessários, com

sêmen refrigerado em di luente c itrato-gema (tabela 10), foram

observadas diferenças signif icativas (P<0,05), ao se obter 21,74% e

43,75% de prenhez para a inseminação às 49 ± 1 e 57 ± 1 horas,

respectivamente.

A taxa de prenhez obtida às 57 ± 1 horas foi semelhante aos

resultados de BARLOW et a!., (1974) que em inseminação dupla, às 50 e

64 após a retirada das esponjas obtiveram 42% de concepção util izando

sêmen refrigerado a 15°C em di luente c itrato-gl icose-gema.

Considerando que a ovulação ocorre 65,1 ± 2,2 horas após a

retirada das esponjas (SOUZA et a/., 1997), a inseminação mais próxima

ao momento de ovulação (57 horas) apresentou resultados superiores de

prenhez concordando com os resultados de HUNTER et al., (1982), os

quais obtiveram taxas de fert i l ização de 94,4% e somente 20% para

montas realizadas 24 horas e imediatamente após o início do estro,

respectivamente. Por sua vez JONES et al., (1969), obtiveram 51,8% e

29,9% de taxa de não retorno quando uti l izaram sêmen refrigerado via

cervical, às 0 - 14 e 14 - 24 horas após o início do estro natural, não

sinalizando maior fert i l idade quando a inseminação ocorreu mais próxima

da ovulação, que ocorre por volta de 30 horas após o início do estro

(MILLER, 1986). MATTNER e BRADEN (1969) observaram maior número

de espermatozóides na cérvice e útero quando se util izou sêmen fresco

nas primeiras 24 horas após o início do estro natural, explicando que

este fato pode ser atr ibuído à diferença do estado físico do muco

cervical durante o decorrer do estro. Essa discrepância de resultados

pode ser explicada pela variação no momento de ovulação em função da

raça, manejo e ambiente (AGUINSKY e CANABARRO FILHO, 1988)

EVANS et a!., (1986) concluíram que o momento da inseminação é

muito mais crít ico quando se util iza sêmen congelado, uma vez que o

número de óvulos fert i l izados em ovelhas superovuladas inseminadas

com sêmen congelado por via intra-uterina às 64 horas após a retirada

das esponjas foi s ignif icat ivamente maior em relação às 24 ou 44 horas,

não havendo diferença entre os horários de 24, 44 ou 64 horas quando

uti l izaram sêmen fresco.

Menor sobrevivência espermática após congelação foi comprovada

por LOGINOVA e ZHELTOBRYUK (1975) ao constatarem que o sêmen

fresco sobrevivia por mais que 17 horas nos ovidutos enquanto que os

espermatozóides congelados não chegavam a 10 horas.

Portanto, a longevidade dos espermatozóides no trato genital

feminino, a qual está relacionada ao modo de conservação do sêmen,

determina o grau de importância do horário de inseminação sobre a

ferti l idade.

Provavelmente as baixas taxas de gestação das ovelhas

inseminadas por via cervical superficial neste experimento, ocorreram

devido a somatória de fatores sugeridos por CÓRDOVA (1989) como:

redução da capacidade fert i l izante dos espermatozóides durante o

armazenamento, aumento da taxa de mortal idade embrionária e

principalmente pela diminuição da viabi l idade espermática no aparelho

genital feminino.

A conservação do sêmen ovino durante algumas horas pelo

processo de refrigeração pode viabil izar o aumento do uso de bons

reprodutores entre fazendas próximas, dispensando o uso da congelação

do sêmen. Porém para a obtenção de altas taxas de prenhez torna-se

necessária a util ização de inseminação artif icial intra-uterina, uma vez

que a via cervical superficial fornece resultados razoáveis de ferti l idade.

6 CONCLUSÕES

1. 0 citrato-gema apresenta meihor capacidade de preservação para o

sêmen refrigerado ovino que os di luentes CUE, CU-16, gl icina-

gema, leite UHT-gema e TRIS-gema.

2. Meihores taxas de prenhez são obtidas quando se deposita o sêmen

refrigerado por via intra-uterina em relação à deposição cervical

superficial.

3. É possível refrigerar o sêmen ovino por 8 horas, obtendo-se bons

resultados de prenhez com a uti i ização da inseminação artif iciai por

via intra-uterina.

4. A inseminação reaiizada às 57 ± 1 horas após a retirada dos

pessários apresenta taxa de prenhez superior em relação a

inseminação realizada às 49 ± 1 horas.

5. São necessários mais estudos para a determinação das causas que

promovem baixa ferti l idade ao se util izar sêmen conservado por via

cervical em ovinos.

ANEXO 1

FÓRMULA DOS DILUENTES

DILUENTE CUE, segundo FOOTE e BRATTON (1960):

CITRATO DE SÓDIO 2H20 1,45 g

BICARBONATO DE SÓDIO 0,21 g

CLORETO DE POTÁSSIO 0,04 g

GLICOSE ANIDRA 0,3 g

GLICINA 0,937 g

ÁCIDO CÍTRICO 0,087 g

ÁGUA TRIDESTILADA E DEIONIZADA qsp 100 ml

80 PARTES DE DILUENTE PARA 20 PARTES DE GEMA DE OVO

DILUENTE CU - 16, segundo FOOTE e BRATTON ( i960):

CITRATO DE SÓDIO 2HzO 1,45 g

GLICOSE ANIDRA 1,25 g

GLICINA 0,937 g

ÁGUA TRIDESTILADA E DEIONIZADA qsp 100 ml

80 PARTES DE DILUENTE PARA 20 PARTES DE GEMA DE OVO

DILUENTE GLICINA - GEMA, segundo AHMED (1955):

GLICINA 3 g

ÁGUA TRIDESTILADA E DEIONIZADA 100 ml

75 PARTES DE DILUENTE PARA 25 PARTES DE GEMA DE OVO

DILUENTE CITRATO - GEMA, segundo EVANS e MAXWELL (1987):

CITRATO DE SÓDIO 2H20 2,37 g

GLICOSE ANIDRA 0,8 g

GEMA DE OVO 20 ml

ÁGUA TRIDESTILADA E DEIONIZADAqsp 100 ml

DILUENTE LEITE UHT-GEMA, segundo SCHINDLER e AMIR (1961):

LEITE LONGA VIDA DESNATADO8 90 ml

GEMA DE OVO 10 ml

DILUENTE TRIS-GEMA, segundo EVANS e MAXWELL (1987):

TRIS (HIDROXIMETHIL) AMINOMETANO 3,634 g

FRUTOSE 0,50 g

ÁCIDO CÍTRICO 1,99 g

GEMA DE OVO 14 ml

ÁGUA TRIDESTILADA E DEIONIZADA qsp 100 ml

8 B A T A V O - Usina de Beneficiamento - Cooperativa Central de Laticínios do Paraná LTDA.

ANEXO 2

CÁLCULOS ESTATÍSTICOS

Para a comparação do sêmen fresco com o sêmen di luído e os

di luentes entre si foi uti l izada Anál ise de Variância sendo o modelo de

ANOVA escolhido o seguinte:

Yu=m + ai+bJ.+eiJ \ = 0, ... , 6 e j = 1, ... , 23

onde: n = média a = efeito dos di luentes (5 = efeito das datas de colheita (blocos) s = resíduos

Análise de Variância - 8 horas após refr igeração Fontes de Soma de g.l. Quadrado F p-valor Variação Quadrados Médio Diluentes 583,44585 6 97,240975 118,177 0,0000 Datas (bloco) 34,19833 22 1,554469 Resíduo 108,61486 132 0.8228398 Total 726,25904 160

Resultado do Teste de Tukey ( a = 0.05; 1 - 8 horas após refr igeração Diluentes Número Média Resultado do Teste

de Datas gl icina-gema 23 -3.013 X

leite UHT-gema 23 -0.740 X CU-16-gema 23 -0.489 X TRIS-gema 23 -0.232 X

CUE 23 -0.164 X citrato-gema 23 0.657 X

fresco 23 3.872 X

Na construção da Análise de Variância, considerou-se a variável

resposta obtida na análise de componentes principais: variável TT.

O modelo de ANOVA escolhido é dado por:

yij = u + a; + p • + e- i = 0, ... , 4 e j = 1, ... , 7

onde:

[i é uma constante inerente à todas as observações;

aj é o efeito do i-ésimo diluente (tratamentos);

Pj é o efeito da j-ésima data de colheita (blocos)

Ejj é o resíduo referente ao ajuste da observação do i-ésimo diluente

e da j-ésima data ao modelo.

Análise de Variância - TT

Fontes de Variação

Soma de Quadrados

g.l. Quadrado Médio

F Valor-p

Diluentes Datas (bloco) Resíduo

104.64624 92.78271 73.63055

3 34.882079 6 15.463785 18 4.090586

8.527 3.780

0.0010

Total 271.05950 27

Resultado do Teste de Tukey (a = 0.05) - TT Diluentes Número de

Datas Médias Resultado do Teste

TRIS - gema CU - 16

CUE citrato - gema

7 7 7 7

-1.86807 X -1.02437 X -0.31834 X 3.21078 X

Análise de Variância - defeitos maiores

Fontes de Soma de g.l. Quadrado F Valor-p Variação Quadrados Médio Diluentes 7.171429 6 1.1952381 1.045 0.4069 Datas (bloco) 60.317857 9 6.7019841 5.860 Resíduo 61.757143 54 1.1436508 Total 129.24643 69

Observa-se que para o fator defeitos maiores obteve-se valor-

p=0.4069, indicando que não existe diferença entre os diluentes e o

sêmen fresco, ao nível de signif icância de 5%.

Análise de Variância - total de defeitos menores

Fontes de Soma de g.l. Quadrado F Valor-p Variação Quadrados Médio Diluentes 937.88571 6 156.31429 4.478 0.0010 Datas (bloco) 628.41429 9 69.82381 2.000 Resíduo 1885.1857 54 34.910847 Total 3451.4857 69

Resultado do Teste de Tukey (a = 0.05) - total de defeitos menores Diluentes Número de Média Resultado do Teste

Datas Fresco 10 10.05 X

glicina - gema 10 15.90 X X CUE 10 16.95 X X

citrato - gema 10 17.45 X X leite UHT - gema 10 19.30 X

TRIS - gema 10 19.40 X CU -16 10 22.85 X

Análise de Variância - acrossoma desprendido

Fontes de Soma de g.l. Quadrado F Valor-p Variação Quadrados Médio Diluentes 30.93571 6 5.155952 1.296 0.2747 Datas (bloco) 187.07143 9 20.785714 5.226 Resíduo 214.77857 54 3.977381 Total 432.78571 69

Análise de variância para os dados transformados de cauda enrolada

Fontes de Soma de g.l. Quadrado F Valor-p Variação Quadrados Médio Diluentes 27.195383 6 4.5325638 6.547 0.0000 Datas (bloco) 18.419264 9 2.0465849 2.956 Resíduo 37.386994 54 0.6923517 Total 83.001640 69

Resultado do Teste de Tukey (a = 0.05) - cauda enrolada Diluentes Número de Médias Resultado do Teste

Datas Fresco 10 1.43265 X

glicina - gema 10 1.96266 X X citrato - gema 10 2.61350 X X TRIS - gema 10 2.79261 X X

CUE 10 2.86401 X X leite UHT - gema 10 2.95793 X X

CU-16 10 3.44730 X

Análise de Variância - outros defeitos menores

Fontes de Soma de g .1. Quadrado F Valor-p Variação Quadrados Médio Diluentes 71.10000 6 11.850000 2.920 0.0154 Datas (bloco) 515.46071 9 57.273413 14.115 Resíduo 219.11429 54 4.056720 Total 805.67500 69

Resultado do Teste de Tukey (a = 0.05) - outros defeitos menores

Diluentes Número de Médias Resultado do Teste Datas

CUE 10 3.05 X Fresco 10 3.50 X X

citrato - gema 10 3.80 X X CU - 16 10 3.85 X X

leite UHT - gema 10 4.95 X X TRIS - gema 10 5.20 X X

glicina - gema 10 6.10 X

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