institut de pharmacie - apache tomcat
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Institut de Pharmacie
Service de Chimie Analytique Instrumentale & Bioélectrochimie.
Professeur J.-M. Kauffmann
Développement de méthodes électroanalytiques hybrides pour l’étude de la
biotransformation des médicaments.
Bertrand Blankert
Pharmacien
Thèse présentée en vue de l’obtention du grade de Docteur en Sciences Pharmaceutiques.
Février 2006
Remerciements.
Au terme de ce travail de thèse, fin d'un morceau de vie mais début d'un autre chemin, que l’occasion me soit offerte de remercier vivement Monsieur le Professeur Jean-Michel Kauffmann, Directeur du Laboratoire de Chimie Analytique Instrumentale et Bioélectrochimie. Qu'il reçoive ici ma profonde et sincère reconnaissance pour l'opportunité qu'il m'a un jour offerte… Guide chevronné et averti au travers du dédale qu'est le vaste Monde Scientifique, il m'a fait partager sans ambages l'ensemble de ses vastes connaissances. Doublée de qualités humaines indubitables et d'un enthousiasme sans faille, sa personnalité riche mais parfois méconnue aide à surmonter nombre de situations. Mes remerciements s'adressent de manière similaire au Docteur Jean-Claude Viré, il a guidé mes premiers pas d’assistant et m'a donné mes premières notions de pédagogie. Son aide et son humour sont très souvent arrivés à point nommé. Mes pensées vont aussi vers une personne que je n'ai malheureusement connu que trop peu de temps au sein du Laboratoire, le Docteur Guy Quarin. Je remercie également Monsieur le professeur Uwe Karst (University of Twente) pour les travaux de spectrométrie de masse qu’il nous a permis de réaliser et Monsieur le Professeur Robert Sandulescu (Univertatea de Medicina si Farmacie "Iuliu Hatieganu", Cluj-Napoca) pour sa fructueuse collaboration. Je remercie les membres de mon comité d'accompagnement, Messieurs les Professeurs Jacques Dubois et Pierre Duez, pour l'attention qu'ils ont porté à ce travail et leurs judicieux conseils. Les circonstances au cours de ces dernières années m'ont permis de faire la rencontre de nombreux partenaires avec qui nous avons partagé la grande aventure des travaux pratiques. Peu à peu, des liens humains solides se sont noués, et il nous plaît de les entretenir aujourd'hui: Silvia, Marc, Wissam. La vie quotidienne d’un laboratoire s’accompagne également d'un travail collectif, merci à Trésor, Donghui, Stéphanie, David et Liliane pour votre sympathie et aide.
La vie internationale intense du Laboratoire m'a également procuré l'occasion de côtoyer, de travailler, au contact de scientifiques extérieurs. Je remercie intensément pour leur efficace collaboration teintée d'amitié, Ede Bodoki et Olga Dominguez.
Je saisis l’occasion pour remercier mes collègues du Corps Scientifique pour la confiance qu’ils m’ont accordée au cours de ces années, afin de les représenter au sein des diverses instances de l’Institut de Pharmacie et pour leur sympathie: Gilles, Jamila, Pierre, François, Jérôme, Thami, Stéphanie, etc...
Je tiens à remercier la Société Belge de Sciences Pharmaceutiques, le FNRS, et la Communauté Française de Belgique pour leur soutien financier lors des différents congrès scientifiques internationaux.
De manière plus personnelle, j’aimerais adresser toute ma gratitude et reconnaissance à Fabienne & Denis, Aline & Pierre, Ann-Sophie & Olivier pour leur soutien et confiance accordés. Que de nombreuses personnes reçoivent ici l'expression réciproque de leur amitié : Raymond, Karl, Céline, Fred, JF, Pierre, Benoit, Manu, Olivier, Maxime.
Que mes Parents sachent à cet instant l'enthousiasme de mes remerciements pour leur soutien et indéfectible bienveillance.
Merci enfin à Leila pour sa douce présence, patient soutien, nos échanges et nos évolutions...
" À la base de l’activité scientifique se trouve une foi profonde dans le progrès. Cet optimisme est celui
de la vie. Il éclate aussi bien dans la fleur épanouie de l’été que dans la feuille de l’automne, toutes les
deux entraînées par l’éternel devenir vers des rivages inconnus. "
Ilya Prigogine, Prix Nobel de Chimie, ULB.
i
Table des matières.
1 But du travail. ........................................................................... - 1 -
2 Introduction générale............................................................... - 3 -
3 Méthodes expérimentales "in vitro" pour l'étude de la biotransformation de nouvelles molécules à potentialité thérapeutique: état de l'art. .............................................................. - 5 -
3.1 Aspects généraux. ............................................................................... - 5 -
3.2 La famille d’hémoprotéines Cytochrome P450..................................... - 7 -
3.2.1 Origine, propriétés biochimiques et rôle. ..................................................... - 9 -
3.2.2 Cycle catalytique........................................................................................ - 11 -
3.3 Principaux modèles biologiques utilisés "in vitro" pour l’étude de la
métabolisation des xénobiotiques................................................................... - 13 -
3.3.1 Organe isolé perfusé. ................................................................................ - 13 -
3.3.2 Les coupes de foie..................................................................................... - 13 -
3.3.3 Les hépatocytes......................................................................................... - 14 -
3.3.4 Les fractions subcellulaires........................................................................ - 15 -
3.3.5 Les enzymes recombinants. ...................................................................... - 16 -
3.3.6 La peroxydase de raifort. ........................................................................... - 18 -
3.4 Méthodes instrumentales d'identification des métabolites. ................ - 23 -
3.4.1 Couplage de la chromatographie liquide et de la spectrométrie de
masse. .................................................................................................................. - 23 -
3.4.2 Méthodes complémentaires à la CL/SM.................................................... - 24 -
3.4.3 Essais d’inhibition enzymatique................................................................. - 25 -
3.4.4 L'électrophorèse capillaire. ........................................................................ - 25 -
ii
3.5 Apport des méthodes électrochimiques. ............................................ - 27 -
3.5.1 La voltampérométrie. ................................................................................. - 27 -
3.5.1.1 La voltampérométrie cyclique............................................................... - 28 - 3.5.1.2 La voltampérométrie hydrodynamique. ................................................ - 32 -
3.5.2 Les Biocapteurs. ........................................................................................ - 37 -
3.5.2.1 Introduction........................................................................................... - 37 - 3.5.2.2 La reconnaissance biologique. ............................................................. - 38 - 3.5.2.3 Les transducteurs. ................................................................................ - 40 - 3.5.2.4 Techniques d’immobilisation. ............................................................... - 47 - 3.5.2.5 Performances d'un biocapteur.............................................................. - 59 - 3.5.2.6 Biocapteurs et biotransformation de xénobiotiques: tendances et
perspectives . ...................................................................................................... - 68 -
3.5.3 Couplage de l'électrochimie à la chromatographie liquide et à la
spectrométrie de masse. ....................................................................................... - 75 -
4 Molécules étudiées. ............................................................... - 77 -
4.1 Les phénothiazines. ........................................................................... - 77 -
4.1.1 La prométhazine. ....................................................................................... - 78 -
4.1.2 La promazine. ............................................................................................ - 79 -
4.2 Les dibenzoazépines. ........................................................................ - 81 -
4.2.1 La clozapine............................................................................................... - 81 -
5 Matériel et Méthodes.............................................................. - 84 -
6 Résultats. ................................................................................ - 86 -
6.1 Electrochemical, Chemical and Enzymatic Oxidations of
Phenothiazines. .............................................................................................. - 86 -
6.1.1 Introduction. ............................................................................................... - 87 -
6.2 Prediction of clozapine metabolism by on-line
electrochemistry/liquid chromatography/mass spectrometry. ......................... - 92 -
iii
6.2.1 Introduction. ............................................................................................... - 93 -
6.3 Horseradish peroxidase electrode for the analysis of clozapine. ....... - 96 -
6.3.1 Introduction. ............................................................................................... - 97 -
6.4 Horseradish peroxidase immobilised carbon paste electrode based
on peroxidation of clozapine for the study of thiols. ........................................ - 99 -
6.4.1 Introduction. ............................................................................................. - 100 -
7 Résumé et Conclusions....................................................... - 103 -
8 Bibliographie. ....................................................................... - 106 -
iv
Liste des abréviations.
ADME/Tox: absorption, distribution, métabolisation, excrétion et toxicité
ADN: acide désoxyribonucléïque
AIF: Analyse par injection dans un flux
APG: antipsychotiques de première génération
Arg: arginine
BLM: membrane bilipidique
CCM: chromatographie couche mince
CI50: concentration nécessaire pour inhiber 50% de la vitesse initiale
CL: chromatographie liquide
CLZ: Clozapine HCl
Cmax: concentration maximale
CYP450: cytochrome P450
E0:potentiel standard d'oxydoréduction
EC: électrochimie
ECL: électrochimiluminescence
ECZ: électrophorèse capillaire de zone
EPC: électrode à pâte de carbone solide
FET: transistor à effet de champ
GSH: glutathion
His: histidine
HRP: peroxydase de raifort
IR: infrarouge
ISFET: ion selective field effect transistor
IUPAC: International Union of Pure and Applied Chemistry
Ki: constante d'inhibition
Km: constante de Michaelis-Menten
mARN: acide ribonucléique messager
MEKC: électrophorèse capillaire micellaire
MOSFET: metal ion silicon field effect transistor
v
NADH: nicotinamide adénine dinucléotide
NADPH: nicotinamide adenine dinucléotide phosphate
NIR: proche infrarouge
PEG: polyéthylene glycol
Phe: phénylalanine
PHZ: phénothiazine base
PHZQI: phénothiazine quinoneimine
PHZSO: phénothiazine sulfoxyde
PMN: leucocytes polymorphonucléaires
PMTZSO: prométhazine sulfoxyde
PMZ: promazine HCl
PMZT: prométhazine HCl
RMN: résonance magnétique nucléaire
SAM: monocouche autoassemblée
SM: spectrométrie de masse
SPR: résonance plasmonique de surface
t ½vie: temps de demi-vie
TOF SM : temps de vol spectrométrie de masse
UGT: uridine diphosphoglucuronosyl transférase
UV: ultraviolet
UV-VIS: ultraviolet-visible
VC: voltampérométrie cyclique
VH: voltampérométrie hydrodynamique
Vmax: vitesse maximale du métabolisme
Introduction
- 1 -
1 But du travail. L'industrie pharmaceutique revoit chaque jour à la hausse ses besoins et exigences
en terme de techniques analytiques dédiées à l'analyse à haut débit. L'afflux massif
de nouvelles entités chimiques par les moyens modernes de synthèse et de chimie
combinatoire impose la nécessité de posséder des dispositifs d'analyse performants
qui s'adaptent à cet immense flux. Ces outils seront d'autant plus capitaux et décisifs
qu'ils gèreront la variable temps, paramètre essentiel et vital aujourd'hui, par une
intervention le plus en amont possible de la chaîne de développement.
Plusieurs exemples récents et retentissants de retraits de médicaments du marché
justifient l’importance d’intensifier les efforts de recherche en amont en vue d’une
meilleure sélection de molécules à potentialités pharmacologiques et dénuées
d’effets secondaires majeurs. Actuellement, l’élargissement des moyens
d’investigations et l’innovation en matière de test « in silico » constituent des thèmes
prioritaires destinés à prévoir les effets toxiques des entités chimiques à potentialités
thérapeutiques [1].
Notre travail désire mettre en évidence l'exploitation innovatrice de techniques
analytiques ou électroanalytiques, qui associées ou non, autorisent l'élucidation des
mécanismes d'oxydation de molécules d'intérêt pharmaceutique. Une
compréhension nouvelle ou améliorée en profondeur d'un processus oxydatif, peut
en effet clarifier le mode d'action ou expliquer les raisons d'une éventuelle toxicité
d'un candidat médicament. La stabilité métabolique d'un composé neuf constitue un
point névralgique de son devenir; en cas d'instabilité, l'identification des métabolites
se révèle indispensable. Par la génération électrochimique "on line" des produits
d'oxydation de différentes molécules, suivie de leur caractérisation et identification
par spectrométrie de masse, nous tentons d'apporter une réponse à certains défis
posés. Les biocapteurs seront également exploités, dans le but de mettre au point
des outils d'analyse à des fins ultimes de dosage quantitatifs, ou de détermination de
paramètres de cinétique enzymatique à la fois pour le composé cible initial ou
d'éventuels inhibiteurs.
Les molécules envisagées dans notre travail occupent une place importante au sein
du vaste arsenal des molécules psychotropes. Certaines d’entre elles, de la famille
des phénothiazines, connaissent un regain d’intérêt pour d’autres applications et leur
Introduction
- 2 -
biotransformation est intense et complexe. Ces molécules ne sont pas dénuées de
toxicité (risque d’agranulocytose, etc.) et leur devenir métabolique mérite des
investigations plus poussées. Au sein d’une même famille de phénothiazines, des
molécules analogues ont été étudiées de manière comparative dans le but
d’identifier d’éventuelles influences structurelles sur le comportement oxydatif. Les
molécules psychotropes investiguées sont connues pour donner naissance, par
métabolisation, à des formes instables et très réactives.
Les méthodes électrochimiques et les techniques hybrides, misent en œuvre dans
notre travail, permettent des résolutions en temps compatibles avec l’instabilité de
telles espèces.
La présence de thiols dans le milieu réactionnel a également été envisagée dans le
cadre de notre travail. Ceux-ci sont bien présents au niveau physiologique en tant
que substances endogènes protectrices et leur intervention, dans les processus de
conjugaison et de détoxification d’espèces radicalaires ou oxydantes, est largement
décrite dans la littérature.
Notre travail consiste à démontrer, au moyen de l’étude de systèmes modèles,
l’utilité et la complémentarité des techniques électrochimiques, hybrides ou non,
dans la résolution de mécanismes rédox, relativement complexes, de substances
médicamenteuses susceptibles d’intervenir au niveau physiologique.
Introduction
- 3 -
2 Introduction générale.
Chaque jour confrontée aux impératifs requis de sécurité des médicaments à usage
humain, l’industrie pharmaceutique tente d’optimiser ce paramètre par une sélection
améliorée et précoce des nouvelles entités chimiques synthétisées.
Le succès d’une nouvelle molécule amenée sur le marché dépend essentiellement
de ses propriétés d’absorption, de distribution, de métabolisation, d'excrétion et de
toxicité (ADME/Tox). La recherche moderne de nouveaux médicaments donne
aujourd’hui une importance plus grande aux études de métabolisation. Cette
discipline en pleine expansion était cantonnée dans le passé aux seuls laboratoires
universitaires. L’acceptation de la valeur ajoutée de l’approche in vitro de l’étude du
métabolisme de xénobiotiques au regard de l'approche in vivo est somme toute
assez récente. La définition des profils métaboliques et pharmacocinétiques se
réalise aujourd’hui de manière précoce en recherche et développement et non plus
lors des dernières étapes du développement (figure 1.1).
Figure 1.1 Etapes et coût du développement d'un nouveau médicament [2].
Introduction
- 4 -
La grande disponibilité actuelle des technologies in vitro conjuguée à leur simplicité
de mise en œuvre ont définitivement permis leur usage intensif au niveau de
l’industrie pharmaceutique. De manière non exhaustive, elles sont également
d’usage quotidien au sein de compagnies de taille plus restreinte ou dans les
laboratoires académiques. Par ce fait, elles constituent un catalyseur non
négligeable de collaborations fructueuses entre ces différents acteurs [3]. Chacun
d’entre eux aura à jouer un rôle face aux défis engendrés par la foule de nouvelles
molécules issues des différentes voies de recherche contemporaines: chimie
combinatoire, criblage à haut débit, génomique et protéomique. La pléthore de
candidats générés via ces technologies modernes n’a malheureusement pas jusqu’à
présent abouti à l’augmentation considérable du nombre de molécules approuvées et
d’usage thérapeutique. Généralement, la responsabilité en incombe à une toxicité
intrinsèque ou liée aux métabolites. Très récemment encore, les études de toxicité à
un stade précoce du processus de recherche étaient exclues vu la profusion de
molécules, forçant les chercheurs à établir la suite de leur stratégie de
développement sur des données toxicologiques limitées. Par conséquent, une
augmentation importante du nombre de techniques in vitro pour l’étude toxicologique
des nouveaux composés et de leurs métabolites, et mimant de manière ad hoc le
métabolisme humain s’avère primordiale. Celles-ci devront être aptes à soutenir le
rythme dense du criblage à haut débit [4]. Cet antagonisme entre flux important de
candidats thérapeutiques et capacité à fournir des données de qualité à une cadence
soutenue représente souvent le point faible de la chaîne de développement et met
en exergue le besoin crucial de nouvelles méthodes innovantes pour des études
ADME/Tox. Ces essais prédictifs devront se baser essentiellement sur la structure
moléculaire et intégrer la complexité biochimique que subit un xénobiotique [5].
Proposer de nouveaux médicaments, meilleurs et plus sûrs, tel reste l’objectif
principal des compagnies pharmaceutiques, et ce dans un laps de temps le plus
court possible. Une élimination le plus en amont possible du processus de
développement des candidats inadéquats permettra d’épargner temps et argent,
mais aussi animaux de laboratoire [6].
Introduction
- 5 -
3 Méthodes expérimentales "in vitro" pour l'étude de la biotransformation de nouvelles molécules à potentialité
thérapeutique: état de l'art.
3.1 Aspects généraux.
L’étape préclinique, responsable du rejet de 40% des candidats potentiels, demeure
un facteur non négligeable au sein de la chaîne de développement. Cette étape
coûteuse et de longue haleine explique les nombreux efforts consacrés à mettre au
point des tests prédictifs de criblage précoce sûrs, qui limiteront la probabilité
d’insuccès et de rejet d’une molécule candidat médicament [7]. De manière générale,
les méthodes in vitro d’usage courant apportent leur aide pour: (i) définir la stabilité
métabolique, (ii) la génération de métabolites à large échelle, (iii) la génération de
métabolites utilisés en développement bioanalytique, (iv) la comparaison de profils
métaboliques et (v) l'identification de différentes espèces métaboliques. D'un soutien
précieux pour le choix rationnel des espèces animales qui servent de modèles lors
des études toxicologiques, elles fournissent des informations au niveau des essais
cliniques et plus particulièrement pour la prédiction de la variabilité
pharmacocinétique inter-patient et des interactions médicamenteuses. Une
interprétation correcte permet l’économie de tests ou l’anticipation de certaines
interactions médicament-médicament. Une grande diversité de systèmes
enzymatiques sont disponibles sur le marché, et rendent d’autant plus prépondérant
le choix du modèle adéquat. Il s’effectue au cas par cas et seul le système in vitro
idoine, permet d’élucider correctement le métabolisme étudié. Préférence sera
accordée à du matériel d’origine humaine. La prudence est également de mise lors
de l'emploi de test in vivo sur animal ; les informations récoltées divergent
occasionnellement de celles obtenues chez l’humain.
D’usage quasi généralisé au niveau de l’industrie pharmaceutique, ces test in vitro
permettent d’embrasser le double but d’identifier les enzymes impliqués dans le
métabolisme oxydatif d’une nouvelle molécule mais aussi d’établir sa capacité à
induire ou activer le métabolisme d’un autre composé ingéré en prise concomitante.
Indéniablement, l’utilisation de ces tests prévisionnels fournit une aide judicieuse lors
Introduction
- 6 -
de la prise de décision de mise sur le marché d’un nouveau médicament, afin
d’atteindre des objectifs de sécurité plus grands, et ce pour une population humaine
implicitement hétérogène. De nombreuses agences nationales pour la sécurité
médicamenteuse encouragent cette pratique en routine, et intègrent ces essais dans
des recommandations soumises à de fréquentes mises à jour compte tenu de
l'évolution rapide de ces techniques. Le succès de cette nouvelle facette de l’in vitro,
repose sur l’extrapolation de qualité qui peut être définie entre les prédictions in vitro
et les paramètres pharmacocinétiques in vivo connus [3]. En dépit de ces points
positifs, une totale substitution de l'expérimentation animale par ces essais in vitro
semble irréaliste par leur déficit de validation [6, 8]. Force est de reconnaître que
malgré leur mimétisme, les systèmes in vitro demeurent un modèle simplifié en
comparaison de l’environnement in vivo, milieu complexe dans lequel intervient la
biotransformation. La réalisation des études in vivo et in vitro simultanément mettent
en exergue les dissemblances entre les deux situations et jettent les bases de
modèles expérimentaux et théoriques [9]. L’élaboration de modèles mathématiques
ouvre une voie prometteuse afin de définir la nature de l’inhibition et d’estimer des
paramètres cinétiques tels Ki et CI50.
L’éclosion des essais in vitro est à mettre en parallèle avec l’évolution et l’implication
nouvelle de techniques analytiques au sein même de ces tests : plaques multipuits,
extraction en phase solide, spectrométrie de masse,… Leur apport n’élimine
cependant pas certaines contraintes inhérentes à ces technologies qui limitent
parfois leur impact positif : rejets radioactifs, faibles caractéristiques spectrales,
toxicité des solvants, lenteur d’analyse…
De nombreuses voies d’exploration méritent encore d'être creusées, afin d’améliorer,
de parfaire ces modèles in vitro et de rendre leur exactitude plus acérée, comme par
exemple la mise au point d'un essai de prédétermination de la concentration
nécessaire à l'évaluation du potentiel inhibiteur d’une molécule. De nouvelles
avancées relatives aux performances des techniques de détection analytiques et une
implication plus profonde de l’automation apporteront à nouveau un gain en efficacité
de ces outils in vitro. Dans un même ordre d’esprit, l’emploi intensif de l’informatique
et la création de bases de données rendront possible la gestion efficace de
l’ensemble des résultats générés, dans le but de synthétiser et de fournir des
conclusions hautement utiles et directement exploitables [3].
Introduction
- 7 -
3.2 La famille d’hémoprotéines Cytochrome P450.
Machinerie complexe, le métabolisme cellulaire mammifère assure la production
d’énergie indispensable à la vie et garantit la fidélité de la réplication du patrimoine
génétique des individus [10]. Tout xénobiotique introduit dans le corps humain subit
une biotransformation déterminante pour son profil thérapeutique ou toxicologique.
Responsable de la détoxification, de l'élimination ou même de la bioactivation, la
fonction métabolique, passage clef, se divise traditionnellement en trois phases :
Phase I ou biotransformation, elle comporte deux tâches : (i) augmenter l’hydrophilie
via des réactions d’oxydation, de réduction et d’hydrolyse, (ii) accroître l’excrétion par
incorporation d’un groupement fonctionnel polaire dans la structure moléculaire ;
Phase II ou conjugaison, nouvelle amplification de la polarité par modification d’une
fonction. La Phase III implique un dernier aspect essentiel: les mécanismes de
transport intercellulaires [8, 9, 11]. Le tableau 1.1 illustre différents types de réaction
et d'enzymes présents au sein de la cascade métabolique du médicament. La
stabilité métabolique représente l’un des paramètres les plus déterminants dans
l’établissement de la biodisponibilité orale et de l’élimination systémique d’un
composé thérapeutique. Après ingestion orale, celui-ci traverse en tout ou en partie,
l’épithélium intestinal, atteint le système sanguin et aboutit au foie via la veine porte.
Confronté en premier lieu aux enzymes métaboliques de la lumière gastrointestinale,
il subit un métabolisme intestinal ou hépatique avant de rejoindre la circulation
systémique, ce processus est nommé effet de premier passage. La totalité des
processus de métabolisation endurés par le composé déterminera sa concentration
systémique finale ainsi que le temps de résidence au sein de l’organisme (t ½vie). Le
métabolisme oxydatif est la biotransformation la plus répandue au niveau
métabolisme médicamenteux ; il est régulé en ordre principal par la superfamille
d’une hémoprotéine nommée cytochrome P450 [9].
Introduction
- 8 -
Phase I: enzymes
Oxydation Monooxygénase CYP450 Xanthine oxydase
Peroxydase Amine oxydase
Monoamine oxydase Dioxygénase
Réduction Monooxygénase CYP450 Cétoréductase
Glutathion peroxydase
Hydratation Epoxyde hydrolase
Hydrolyse d'ester Carboxyle estérase Amidase
Déshydrogénation Alcool déshydrogénase Aldéhyde déshydrogénase
Superoxydation Dismutase
Phase II: enzymes
Conjugaison Glucuronosyltransférase Sulfotransférase
Glutathion S-transférase Glucosyltransférase
Thioltransférase Synthèse des amides
MéthylationO-méthyltransférase N-méthyltransférase
Synthèse des amides
AcétylationN-acétyltransférase
Acyltransférase
Thiosulfatation Sulfure transférase
Tableau 1.1 Exemples de type de réactions et d'enzymes de phases I et II impliqués
dans le métabolisme des médicaments [12].
Introduction
- 9 -
3.2.1 Origine, propriétés biochimiques et rôle.
Pierre angulaire de l’un de nos principaux systèmes reconnus de protection, le
cytochrome P450 (CYP450), au rôle dominant en phase I, est une hémoprotéine
unique. Elle forme une superfamille de plus de 40 membres chez l’humain, chacun
d’entre eux est une hémoprotéine réactive à l’oxygène (Figure 1.2).
Figure 1.2 Division structurée des familles du CYP450 humain [10].
Leur rôle, capital et fondamental, régit : (i) le métabolisme des xénobiotiques
organiques lipophiles (médicaments, polluants environnementaux, autres), (ii) la
biosynthèse des hormones stéroïdiennes, (iii) l'oxydation des acides gras insaturés
en messagers intracellulaires, (iv) le métabolisme stéréo et régio spécifique des
vitamines liposolubles, etc.
Constitué de 500 acides aminés, le CYP450 comprend un groupement prosthétique
fer-protoporphyrine IX. L’originalité de cette hémoprotéine réside en la présence en
son centre actif, d’un résidu cystéine, proche de l’extrémité carboxylique de la
protéine. Par corollaire, le groupement thiol dès lors présent, agit tel un ligand axial
vis-à-vis de l’hème. Le thiol modifie la densité électronique du noyau porphyrine et de
ce fait crée un centre électronique propice à l’activation de l’oxygène moléculaire. Ce
rôle de ligand est repris chez les autres hémoprotéines mammifères par un azote de
la fonction imidazole d’une histidine. Largement étudié, le CYP450 est impliqué dans
une diversité remarquable de réactions (± 40) et métabolise plus de 1000 substances
Introduction
- 10 -
chimiques. L’extrémité amine de la protéine, riche en acides aminés hydrophobes,
est soupçonnée de former un site de liaison de la protéine aux membranes. Bien que
distribué dans la plupart des organes (reins, poumons, intestin,…) des
concentrations élevées de CYP450 sont constatées dans des tissus tels le foie et
l’intestin. Localisé majoritairement dans le réticulum endoplasmique lisse du foie ou
de tissus extrahépatiques, et confronté à la variabilité infinie des composés lipophiles
auxquels l’organisme humain est exposé, le CYP450 se montre incapable de
présenter un système enzymatique comportant un site spécifique, pour chacun
d’eux. Le système CYP450 déjoue la difficulté par une offre large de spécificités et
de régio-sélectivités aux substrats : la multiplicité des isoformes (ou isoenzymes)
garantit cette adaptabilité d’activité. Une relation certaine existe entre le tissu et
l’isoforme présent. Disséminés au niveau hépatique et extra hépatique, ils
interagissent vis-à-vis de nombreux composés, même un seul de ceux-ci peut subir
l’effet de plusieurs isoformes (Figure 1.3).
Figure 1.3 Distribution tissulaire et subcellulaire de quelques isoformes du CYP450
humain et exemples types de réactions catalysées [10].
Responsables au niveau du foie du métabolisme oxydatif majeur catalysé par le
système CYP450, les isoformes présentent un polymorphisme génétique important
et sont la cause d’une grande variabilité des concentrations plasmatiques pour une
même substance thérapeutique entre deux populations ou plus de patients. Un agent
chimique pourra lui-même induire l’activité d’un type d’isoforme qui lui est attaché. Au
vu de ces caractéristiques, évaluer et prédire le comportement métabolique d’un
Introduction
- 11 -
candidat médicament à l’égard de l’entité CYP450 revêt d’autant plus de pertinence
[9, 10].
3.2.2 Cycle catalytique.
De manière générale, le CYP450 est membre d’une classe d’enzymes nommées
oxygénases, spécifiquement des monooxygénases ou oxydases multifonctionnelles.
Un atome d’oxygène en provenance du dioxygène s'incorpore au substrat, suivi de la
réduction du second atome d’oxygène par deux électrons pour donner de l’eau.
L’équation bilan (Eq. 1) décrit cette conversion oxydative d’un composé chimique.
Les deux électrons indispensables sont fournis via une flavoprotéine par la
nicotinamide adénine dinucléotide phosphate (NADPH) (Eq. 2).
Substrat + O2 + 2e- + 2H+ Substrat (O) + H2O (Eq. 1)
NADPH + O2 + AH2 + H+ NADP+ + AHOH + H2O (Eq. 2)
Comme décrit préalablement, la diversité des isoformes engendre une vaste palette
d’oxydations catalysées. Les plus courantes sont des hydroxylations, époxydations,
oxydations/déalkylations d’hétéroatome, déhalogénations et oxydations alcooliques.
La structure fondamentale commune (Figure 1.4), la fer-protoporphyrine IX liée à une
cystéine (5ième ligand) permet un sixième site de coordination, lieu de liaison et
d’activation de l’oxygène moléculaire.
Figure 1.4 La protopophyrine IX garnie d’une cystéine en temps que cinquième
ligand [13].
CYP450
Introduction
- 12 -
Le cycle catalytique du CYP450 est illustré par la Figure 1.5. Au premier stade,
l’enzyme s'établit dans une conformation six coordinats à l’état ferrique 1, le sixième
ligand est l’eau. Au stade 2 le substrat (R-H) initie le cycle catalytique par son entrée
au sein du site actif, déplacement de la molécule d’eau et obtention d’un état ferrique
à cinq coordinats. La réduction du fer (III) porte le centre actif à l’état ferreux 3. La
réaction entre 3 et le dioxygène donne naissance à un complexe oxyferreux 4a, b. Le
second transfert d’un électron entraîne la formation d’un complexe négativement
chargé : le complexe fer (III)-peroxyde 5. Cette étape est considérée comme
limitante pour la totalité des catalyses du CYP450. La continuité de celle-ci produit
par protonation un complexe hydroperoxyde 6.
Figure 1.5 Cycle catalytique du CYP450 [13].
Introduction
- 13 -
Une seconde protonation et la perte d’une molécule d’eau par clivage de la liaison O-
O génèrent une espèce oxygénée électrophile 7 (hautement oxydante probablement
responsable de l’activité oxydante du système CYP450) et libération du produit
oxydé et de la forme oxydée du cytochrome 1. Enjeu de nombreux débats actuels,
ce radical oxo-ferryle 7 stabilisé par un électron fourni par le noyau porphyrine, serait
l'intermédiaire actif des multiples mécanismes oxydatifs du CYP450 [13]. Deux
étapes clefs de ce cycle exigent l’apport de deux électrons (un à un), le premier crée
le lien avec l'oxygène, le second clive la molécule de dioxygène. Le transfert
d'électrons intervient via des minichaînes transporteuses d’électrons appelées
réductases. Différenciées en fonction de leur origine cellulaire, elles permettent
l’entrée aux électrons au travers du NADPH (le plus couramment) par action
concertée de leurs flavines constitutives [12, 14].
3.3 Principaux modèles biologiques utilisés "in vitro" pour l’étude
de la métabolisation des xénobiotiques.
3.3.1 Organe isolé perfusé. [8]
Représentation idéale de la situation in vivo, l'organe isolé perfusé n'est jamais mis
en œuvre. Extrêmement ardue à mettre en place, cette méthode tombe en
désuétude, par une intégrité fonctionnelle courte (3h) et une reproductibilité faible.
3.3.2 Les coupes de foie. [3, 8]
Cette technique dont les prémices datent du début du 20ième siècle, connut voici une
quinzaine d’années un vif regain d’intérêt. Les progrès technologiques rendirent
possible la production de coupes plus précises, plus fines, plus consistantes et ce
avec un trauma cellulaire minimal. L’apparition conjuguée de nouveaux incubateurs
de tissus et de meilleurs milieux nourriciers, provoqua son intégration dans l’arsenal
des méthodes d’étude du métabolisme médicamenteux. Le monde pharmaceutique
dans son entièreté (universités et industries) publièrent sur ce sujet. D’aucuns
constatèrent des différences en terme de prise en charge et d'élimination du substrat
entre les coupes de foie et les hépatocytes. La prise en charge ou le métabolisme
Introduction
- 14 -
était généralement moindre dans le cas des coupes de foie. Cette constatation
provoqua une diminution de l’intérêt pour l’usage de ce modèle à titre prédictif en
pharmacocinétique. Dès le départ liées à la qualité du foie d'origine, les coupes de
foie conservent leur activité enzymatique de phase I et II durant 48h, stockées à 4°C.
L'affaiblissement de la diffusion des nutriments et de l'oxygène dans le tissu
provoque vraisemblablement la diminution de l'activité du CYP450. Quoi qu’il en soit,
les coupes de foie demeurent un outil précieux largement usité pour des études de
métabolisme de courte durée en vue de l’identification des différents métabolites. La
maîtrise concevable des difficultés rencontrées quant aux cultures, stockage et
maintien de l’activité enzymatique à plus long terme, offre à cette technique un
nouvel essor potentiel par le biais de nouvelles applications actuellement sous
évaluation.
3.3.3 Les hépatocytes. [3, 5, 8]
L'utilisation d’hépatocytes (primaires ou de culture) doit sa popularité à leur forte
ressemblance avec le foie in vivo et à l'élaboration de méthodes de culture cellulaire
à haut rendement. Héritiers des coupes de foie, ils possèdent d’identiques
caractéristiques en termes de viabilité. L'amélioration de leur conservation par
cryogénisation est sujette à de nombreux travaux et les rend aujourd'hui
commercialement disponibles sans perte d'activité enzymatique de phase I et II.
Après décongélation des hépatocytes, les fonctions enzymatiques spécifiquement
hépatiques déclinent, l'importance de cet appauvrissement se présente différemment
selon l'isoforme envisagé. En vue de contrecarrer cet abaissement, de nombreuses
techniques de culture ont été explorées. Par exemple, le maintien en une culture
monocouche allonge le temps de vie des hépatocytes à quatre semaines. Le tissu
hépatique renferme outre les hépatocytes (80%), des autres cellules (cellules de
Kupffer) indispensables au fonctionnement correct des hépatocytes. Leur absence
lors de la mise en culture d'hépatocytes seuls provoque une carence en cofacteurs
nécessaires et constitue un désavantage majeur de cette méthode. Soumis, à l'instar
des coupes de foie, à la qualité du donneur et aux variations interindividuelles, un
mélange d'hépatocytes d'origines multiples reproduit une situation médiane.
Parallèlement aux études de métabolisme et des interactions médicament-
médicament, de nombreuses publications les citent dans l’étude de l’induction
enzymatique hépatique humaine au niveau protéique, mARN et activité enzymatique.
Introduction
- 15 -
Système in vitro Exemple de molécules étudiées
Coupes de foie Oméprazole [8] Chlorzoxazone Dextrométhorphane [15]
Fractions subcellulaires: microsomes Métronidazole Tamoxifène [8] Naproxène [16]
Fractions subcellulaires: cytosol Propofol [8] N-[(2'-diméthylamino)éthyl]acridine-4-
carboxamide [17]
Fractions subcellulaires: S9 Rifalazil [8] Acétaminophène [18]
Hépatocytes Ranitidine Ketotifène [8]
Enzymes recombinants Moclobémide [19] Erythromycine [20]
Tableau 1.2 Exemples d'études de métabolisation de molécules menées selon les différents systèmes in vitro.
3.3.4 Les fractions subcellulaires. [3, 5, 8]
La notion de fractions cellulaires englobe les microsomes, d’autres organelles
cellulaires et homogénat de foie. Les homogénats de foie contiennent l’ensemble des
enzymes de phase I et de phase II. Le perfectionnement des techniques de
centrifugation autorise la séparation des fractions subcellulaires par centrifugation
différentielle.
Les microsomes, vésicules du réticulum endoplasmique hépatique, fournissent une
idée réaliste de la métabolisation par le CYP450. Disponibles pour l'étude
d'isoformes spécifiques en présence d'inhibiteurs spécifiques, ils persistent à être
d’usage le plus largement répandu dans les études de métabolisme in vitro. La
dépendance aux variations interindividuelles permet soit des travaux impliquant une
activité enzymatique représentative obtenue par l'emploi simultané de microsomes
de sources variées, soit l'étude de l'influence de ces variations sur la
biotransformation. Leurs principaux avantages sont : (i) facilité de préparation et
d’usage, (ii) reproductibilité aisée de leur nature même, (iii) concentration
enzymatique et turnover élevés, (iv) stockage et maintenance à long terme sans
difficultés et (v) optimisation simple des conditions d’incubation. Une certaine labilité
et la nécessité de l’addition de cofacteurs afin d’obtenir un activité optimale se
Introduction
- 16 -
placent dans la colonne des désavantages. Principale conséquence, cet
enrichissement de la fraction microsomiale et la non compétition par absence
d'autres enzymes, ne rend réalisable aucune détermination quantitative.
La fraction cytosolique contient les enzymes solubles de phase II et ne comprend
que trois enzymes. Chacune des trois s'exprime séparément en fonction de l'identité
du cofacteur exogène ajouté, par ailleurs indispensable.
La fraction S9, réunion des fractions microsomiale et cytosolique, s'utilise de façon
principale pour la détection de la mutagénécité. L'addition de cofacteurs s'avère
parfois nécessaire.
3.3.5 Les enzymes recombinants.
Le choix du point de vue le plus réductionniste et l'isolement de l'unité la plus petite
possible ouvre une piste pour la compréhension d'un système complexe tel le
métabolisme. Les progrès de la biologie moléculaire permettent aujourd’hui de
mettre à disposition du monde scientifique la majorité des isoformes humains. La
connaissance sans cesse plus approfondie du cytochrome P450 humain (cfr 2.2)
combinée à une grande spécificité obtenue par les enzymes recombinants en font un
outil de choix lors des criblages à haut débit, ou lors des études de métabolisme.
Cette fonction s'exprime au travers d'applications telles: identifier les interactions
substrat/enzyme au niveau du site de liaison (i), déceler l’isoforme responsable du
métabolisme pour un composé (ii), synthétiser une quantité accrue de métabolite (iii),
caractériser une étape d’un mécanisme métabolique complexe (iv) [5, 9].
D’autres enzymes de phase II tel l’uridine diphosphoglucuronosyl transferase (UGT)
sont disponibles et ne peuvent faire l'objet d'aucune omission (et ce pour chacun des
systèmes in vitro discutés). L'élucidation d'une voie de biotransformation n'est menée
à bien qu'au travers de la considération d'une entité globale.
Les modèles in vitro ne substituent en aucun cas le criblage in vivo, ils constituent
des tests prédictifs et d'orientation très utiles au chercheur, et contribuent
positivement à une meilleure compréhension de la biotransformation des
médicaments. Par une sélection plus probante des candidats les plus prometteurs,
ils maximisent l'efficacité des tests in vivo [3, 8]. Le tableau 1.3 récapitule les
avantages et désavantages des différents modèles in vitro couramment utilisés.
Introduction
- 17 -
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2].
Introduction
- 18 -
3.3.6 La peroxydase de raifort (HRP).
Le système HRP/H2O2 est très souvent utilisé comme modèle enzymatique du
CYP450 et peroxydases humaines. Une place particulière de notre travail est
dévolue à la mise en œuvre de cette enzyme [21-25]. Les peroxydases, mises en
évidence au 19ième siècle, s'extraient avec facilité de cellules végétales ou de certains
organes ou tissus animaux. Divisées en trois superfamilles, elles comprennent: (i) les
peroxydases végétales, (ii) les peroxydases animales et (iii) les catalases, réparties
elle-même en classes. La peroxydase de raifort (donneur d'hydrogène, peroxyde
oxydoréductase, E.C.1.11.1.7), membre de la classe III ou peroxydases végétales
secrétées, s'obtient à l'origine par extraction des racines de la plante de Raifort
(Armoracia rusticana, Cruciferae), herbe vivace cultivée dans les régions tempérées
du globe. Cet enzyme hèminique, capable d'oxyder une large gamme de composés
organiques ou inorganiques par le truchement du peroxyde d'hydrogène, comporte
de nombreux isoenzymes qui tous, catalysent une même réaction biochimique mais
se distinguent par leurs particularités physiques, chimiques ou cinétiques. D'un poids
moléculaire total d'approximativement 44 kD, l'HRP se compose d'une chaîne
polypeptidique de 308 acides aminés, d'un hème ferriprotoporphyrine IX1 (Figure
1.6), de deux centres métalliques à ion calcium et de structures carbohydratées.
1 Porphyrine: entité de nature non polypeptidique, ligand organique cyclique constitué de quatre
noyaux pyrrole substitués reliés entre eux et entourant un atome de fer, l'entièreté constitue l'hème.
Le fer complexé à quatre azotes peut se coordonner avec deux autres groupes, à placer au-dessus et
en dessous du plan du cycle porphyrine. Le système forme un anneau aromatique de dix-huit
électrons π délocalisés [26]. Dans le cas de L'HRP, les substituants des pyrroles sont quatre méthyl,
deux vinyls et deux propionates [27].
Introduction
- 19 -
Figure 1.6 Structure de ferriprotoporphyrine IX de l'HRP [27].
Les deux atomes de calcium, un distal et un proximal, remplissent un rôle essentiel
pour la garantie de l'intégrité structurelle et fonctionnelle de la poche héminique.
Habituellement, le fer admet six ligands, incorporé dans une structure enzymatique, il
forme un complexe à cinq ligands. Les positions 1 à 4 occupées par les quatre
azotes des cycles pyrrole établissent un plan. En position 5, située sur l'extrémité
proximale de l'hème, se lie le noyau imidazole d'un résidu histidine (His 170). La
sixième position, vacante chez l'enzyme natif se localise sur l'extrémité distale. La
structure cristalline de l'HRP C (isoenzyme le plus abondant), est illustrée au niveau
de la Figure 1.7.
La poche héminique distale, à l'identique des autres peroxydases, lie de manière
covalente l'hème à l' His 170. Formée par les acides aminés Arg 38, Phe 41 et His
42, elle accueille le peroxyde d'hydrogène, et assure le rôle de donneur/accepteur de
protons. Un vaste réseau de ponts hydrogène maintient le positionnement correct
des résidus clefs.
Introduction
- 20 -
Figure 1.7 Représentation en trois dimensions de la structure cristalline de l'HRP C
(306 acides aminés), les α-hélices ( ), les feuillets β ( ), l'hème ( ) et les ions
calcium ( ) [28].
Catalyseur de l'oxydation de nombreux donneurs d'électrons (phénols, amines
aromatiques,…), l'HRP procède par un cycle de trois étapes (Figure 1.8). Durant la
première, l'enzyme s'oxyde sous l'action de H2O2 en un intermédiaire composé I. Le
clivage de la molécule de peroxyde d'hydrogène entraîne le libération concomitante
d'une molécule d'eau et l'incorporation d'un atome d'oxygène dans le composé I
(contient un groupe oxoferryl (FeIV O), étage d'oxydation +4 et une porphyrine
radical cation π). Le composé I, de haute réactivité vis-à-vis des substrats réducteurs,
implique à ce moment un monotransfert d'électron entre une molécule de substrat et
le radical cation π via la formation d'un second intermédiaire nommé composé II
(contient également un groupe oxyferryl FeIV O). Une seconde molécule de
substrat le réduit en enzyme natif (FeIII) et relâche une seconde molécule d'eau. La
nature non conventionnelle du double lien entre le fer et l'oxygène, demeure à
investiguer. De nombreuses observations expérimentales indiquent une similitude au
lien hème-O2 de l'oxy-hémoglobine.
Introduction
- 21 -
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Composé IIComposé II
Introduction
- 22 -
Figure 1.8 Schéma du cycle catalytique de l'HRP: oxydation (deux électrons inclus)
en une étape de l'HRP natif par H2O2 en composé I et réduction en deux phases (un
électron chacune) en présence de phénol, B représente un groupe protéique de
médiation du transfert du proton phénolique à l' Hist 42 [27, 29, 30].
Un regard plus focalisé sur le site de liaison du substrat nous apprend que les
substrats aromatiques, se fixent non pas à l'oxygène ferryl des composés I ou II mais
à la face exposée de l'hème (comprise entre les carbones C18 méthylé et C20). Le
centre oxo-ferryl caché par l'environnement local peptidique, constitue un bel
exemple d'architecture fermée de l'hème. L'organisation de haute adaptabilité des
différents acides aminés constitutifs de cette région accommode promptement en
vue de l'acceptation d'un substrat. Doté de cette particularité, l'HRP se différencie
d'autres enzymes hèminiques (ex: CYP450) pour lesquelles des modifications du fer
hèminique ou des azotes porphyriques se produisent. Par conséquent, l'efficacité de
catalyse des réactions de transfert d'oxygène diminue [27, 29, 30]. Proches par une
quantité de similarités, les enzymes hèminiques se distinguent cependant par de
petites différences au voisinage du site actif, sources de dissimilitudes marquées de
la réactivité et de la fonction catalytique. Dans chacun des cas, l'intermédiaire actif
est le composé I. Ce véritable caméléon biochimique, modifie ses réponses
chimiques en fonction de l'environnement électronique, par le biais d'une variété de
groupements, de l'accessibilité du substrat, de son type de liaison… [31]
A l'instar de tous les enzymes, la structure secondaire et tertiaire2, gardiens de la
spécificité et de l'activité de l'HRP peuvent être altérées par des températures et des
conditions de pH trop drastiques. Une température supérieure à 45°C entame une
partielle déformation de la structure tertiaire. Un pH inférieur à 4,5 ou supérieur à 6,0
affecte la stabilité de la structure secondaire. Ces deux paramètres induisent une
dénaturation et la perte des propriétés intrinsèques de l'enzyme; les facteurs du
2 La structure primaire d'une protéine définit la séquence des acides aminés de la chaîne. Les motifs
de pliures sous-tendent la structure secondaire, sous forme d'arrangement en feuillets plissés
(configuration β) ou en hélice α. Le plissement, l'enroulement, et autres processus d'agrégation
aboutissent à la structure tertiaire. La structure quaternaire concerne l'imbriquement de deux protéines
en un assemblage plus volumineux [26].
Introduction
- 23 -
milieu de travail les conditionnent aussi: force ionique, nature et force du tampon,
contamination bactérienne, ions métalliques, agents de conservation,… [30, 32]
Sujet d'intensifs et nombreux travaux et/ou applications, la peroxydase de raifort, de
la synthèse organique au secteur biomédical, trouve de vastes domaines d'usage.
Spécificité de réaction, flexibilité opérationnelle, sensibilité de détection, accès aisé à
un coût abordable font de lui, l'enzyme à succès des systèmes analytiques. Son
habilité catalytique épouse les profils de nombre modes de détection:
spectrophotométrie, fluorescence, chemiluminescence, bioréacteurs… Le fondement
même de la réaction (oxydation/réduction) ouvre les portes des procédures
analytiques électrochimiques et plus précisément des biocapteurs [27].
3.4 Méthodes instrumentales d'identification des métabolites.
3.4.1 Couplage de la chromatographie liquide et de la spectrométrie de masse. [9]
La difficulté majeure réside dans la capacité à identifier diverses espèces chimiques
de natures sensiblement différentes, et ce à l’aide d'une méthode générique.
Consécutive aux étapes de purification, la chromatographie liquide (CL) figure au
nombre des techniques les plus abondamment répandues. Le mode de détection
initialement connecté était l’UV. La complexité des chromatogrammes obtenus
couplée à une relativement faible résolution rendait son utilisation ardue.
L’avènement de la spectrométrie de masse (SM) couplée à la CL réussit à résoudre
ce problème et à fournir des résultats basés sur la masse moléculaire du composé
attendu. Lors de tests ultérieurs, suite au passage fructueux des étapes préliminaires
d’un composé candidat, elle autorise des évaluations cinétiques et quantitatives des
métabolites parents. De nombreuses équipes s’emploient désormais à optimiser le
rendement de ces assemblages complexes qui consistent en une série d'étapes
successives : incubation enzymatique, injection, séparation, détection, traitement des
données, émission du rapport. La mise en œuvre d’échantillonneurs automatiques, la
robotisation des procédés d’incubation, et la mise en place de logiciels ultra
performants sont des outils d'investigation de plus en plus couramment utilisés dans
Introduction
- 24 -
le secteur pharmaceutique. Des alternatives aux phases d'incubation/séparation sont
envisagées, comme par exemple le passage de l'échantillon au travers d'une
chambre d’ultrafiltration garnie de microsomes hépatiques et injection en SM. Bien
que performante, cette solution reste encore peu adoptée. Les concepteurs de
détecteurs SM apportent pas à pas leur contribution à l’essor de l’implication de la
SM dans les tests in vitro de criblage précoce : la TOF SM fournit en routine et de
manière rapide un spectre complet avec plus de sensibilité, de plus les métabolites
et les molécules parentes sont détectées simultanément. La mise en place de
détecteurs SM capables de gérer parallèlement plusieurs injections accroît le flux
d'analyse. Outre la possibilité de placer en tandem deux détecteurs SM, quelques
publications relatent l’association chromatographie liquide (CL) et résonance
magnétique nucléaire (RMN). Celle-ci présente l’avantage de définir la structure
moléculaire avec plus d’acuité et d'établir la fonction responsable de l'instabilité
métabolique. Ce mode de détection se voit limité par des besoins en volume
d'échantillons concentrés et purifiés trop inadéquats. Une séparation préparatoire
permet de résoudre ces désagréments. Enfin, la commercialisation d’une chaîne
CL/RMN/SM concoure à résoudre l’ensemble des préoccupations des chercheurs,
mais des interrogations subsistent quant à son implémentation dans une approche
de criblage à haut débit.
3.4.2 Méthodes complémentaires à la CL/SM. [9]
La mise en œuvre des méthodes basée sur la SM dévoile quelques obstacles : (i)
inadéquation entre somme des résultats produits et capacité humaine à les
interpréter, (ii) coût d’achat, de maintenance et d'entretien élevé. Ces arguments
poussent à la recherche d’alternatives. Potentiellement insérables dans une stratégie
de criblage à haut débit, celles-ci doivent encore démontrer leur justesse et leur
fiabilité. Jusqu'à présent ces nouveautés reposent essentiellement sur la mesure de
(i) la consommation d'O2, ou de H2O2, (ii) la diminution de la concentration en
cofacteur (NADPH) ou (iii) la production d’espèces oxygénées (tour à tour acteurs
clefs ou "coacteurs" de la réaction enzymatique). Ces approches innovatrices
suscitent cependant peu d’intérêt pour leur intégration dans un processus à grande
échelle.
Introduction
- 25 -
3.4.3 Essais d’inhibition enzymatique. [9]
Face à la fréquente co-ingestion de deux composés thérapeutiques et l'exposition
subséquente à une interaction croisée, la stabilité métabolique de l'un et de l'autre
détermine leur concentration systémique finale respective et par conséquent leur
action. Dans la majorité des cas, cette interaction intervient via l'inhibition par l'un des
agents pharmaceutiques de l'enzyme responsable de l'élimination de l'autre
composé. Parmi le panel de stratégies envisagées en vue d’estimer le potentiel
inhibiteur vis-à-vis du CYP450 d’un nouveau candidat médicament, outre la CL/SM
évoquée ci-dessus, la fluorescence et le marquage radioisotopique représentent
deux démarches supplémentaires. Dans le premier cas, le principe de base repose
sur une mesure de l’intensité de la fluorescence du métabolite d’un composé après
métabolisation. En présence d’un inhibiteur éventuel, la production moindre de
métabolite fluorescent se traduit par une diminution de l'intensité de fluorescence
enregistrée, et évalue l'impact de l'inhibition. Consommateur moindre de temps et
d’argent en regard des techniques chromatographiques, ce procédé s’adapte
particulièrement facilement pour le criblage à haut débit. Quelques sociétés
planchent résolument en vue d’apporter sur le marché des produits innovateurs
améliorant (i) le rendement de réaction, (ii) la spécificité, (iii) les propriétés
intrinsèques de fluorescence (longueur d’onde d’excitation, décroissance de
fluorescence), (iv) la solubilité aqueuse et diminuant les interférences causées par le
cofacteur (NADPH), les composés testés ou les métabolites. Dans le cas du
marquage isotopique, l’évaluation de l’inhibition s’effectue par la détection d’un
produit marqué libéré lors de la métabolisation. Ce procédé bénéficie d’une
sélectivité et d’un rendement enviables. Toutefois, en raison de l’absolue nécessité
de séparer au préalable les métabolites des composés parents (extraction en phase
solide), son intérêt pour une éventuelle incorporation au sein d’un sassement à haut
débit est faible. A son instar, la CL/SM rencontre par ses étapes consommatrices de
temps (séparation, détection du signal) une difficulté identique.
3.4.4 L'électrophorèse capillaire.
La prise en compte des remarques ci-avant, justifie le besoin indubitable de
techniques analytiques aux performances particulièrement définies en vue d'une
intégration en criblage à haut débit: (i) capacité à séparer des mélanges complexes,
(ii) temps d'analyse minimal, (iii) exigence en termes de volume d'échantillon réduite
Introduction
- 26 -
et (iv) prédisposition à l'automatisation. Dans cet ordre d'idée, l'électrophorèse
capillaire de zone (ECZ), méthode de séparation en plein essor depuis une quinzaine
d'années concentre chacun de ces points prépondérants [33]. Son temps d'analyse
court, sa souplesse d'adaptation aux conditions opératoires rendent possible pour
l'ECZ de séparer conjointement métabolites de phase I et de phase II. La structure
moléculaire extrêmement voisine des composés parents des uns et l'état conjugué
polaire et thermiquement instable des autres, provoquaient de grosses difficultés de
séparation par des méthodes chromatographiques classiques [34]. L'inconvénient
majeur de l'ECZ réside en un déficit de sensibilité pour les échantillons de faible
concentration, lors de l'usage d'un détecteur spectrophotométrique UV-VIS: la faible
longueur du chemin optique parcouru par le rayon lumineux au sein de la cellule de
détection (le capillaire lui-même), en est l'origine. Une injection plus conséquente de
solution échantillon ne contrecarre que médiocrement la chute de sensibilité et
entraîne un élargissement des pics lors de l'élution et une diminution de l'efficacité de
séparation [33, 35]. Coupler l'ECZ à d'autres modes de détection (SM, fluorescence,
électrochimie) ou l'usage de moyens de préconcentration de l'échantillon
(membrane, concentration électrocinétique en tête de zone,…) remédient au manque
de sensibilité [33, 35, 36]. Hautement appréciée pour les études de cinématique
enzymatique, l'ECZ, outre les qualités déjà énoncées, y apporte un avantage
appréciable par la séparation des inhibiteurs (interférents potentiels avec le mode de
détection), des réactifs et des produits. Les mélanges d'incubation peuvent
comprendre aussi bien des microsomes hépatiques que des enzymes recombinants
[37]. Différentes possibilités opératoires s'offrent à l'expérimentateur. Après
incubation du mélange substrat/enzyme hors capillaire, l'ensemble subit une
préséparation et/ou filtration préalable et ensuite est injecté [37-39]. Il est également
envisageable d'introduire le mélange substrat/enzyme directement tel quel dans le
capillaire [40]. Ce dernier point ne peut être envisagé en CL [33]. Bien que l'injection
et l'incubation "on-line" soient des atouts désirables et indéniables dans l'optique d'un
passage vers l'automation et le criblage à haut débit, la présence permanente de
l'enzyme durant toute la durée de la séparation, peut altérer la détection du produit
de réaction et constituer une dépense inutile d'enzyme vu l'unicité, dans ce cas de
figure, de chaque essai. Une solution séduisante à cet écueil se profile par le
placement d'un microréacteur chargé de l'enzyme (ou de microsome) immobilisé,
contigu à l'entrée du capillaire. L'écoulement électroosmotique s'effectue au travers
Introduction
- 27 -
de la matrice. La réaction enzymatique se déroule pendant le passage en son sein
du couple coinjecté substrat/coenzyme, suivie par la séparation et l'identification des
métabolites. Le dispositif permet cette fois, le réemploi du matériel enzymatique. Les
méthodes d'immobilisation, comparables à celles mises en œuvre pour les
biocapteurs (point 3.5.2.4), améliorent la résistance des biomolécules aux pHs
faibles, aux solvants organiques, et maintiennent la structure native pendant un délai
prolongé, sans perte d'activité protéique. De derniers travaux utilisent la méthode
d'immobilisation sol-gel et réduisent, de cette manière, très fortement la
consommation d'enzyme et d'échantillon. [40, 41]. D'autres configurations de
bioréacteurs existent telles que: membrane chargée d'enzyme (i), cultures
d'hépatocytes fixés sur divers supports (ii), micropuces (iii), cellule d'ultra-filtration
(iv). Ces systèmes présentent parfois des exigences négatives en terme de volume
de solution de travail, un faible rendement productif de métabolites et très souvent
sont non couplés en ligne avec la technique de séparation associée. La conception
de systèmes réunissant en ligne la génération des métabolites, leur séparation et
leur identification, représente actuellement un intense sujet de recherche [39]. Un
dernier point fort de l'électrophorèse capillaire réside en sa grande capacité
d'adaptation (par rapport à d'autres techniques chromatographiques) en un système
multiplexé parallèle. L'usage simultané pour un même échantillon de différents types
de tampons de séparation, de capillaires de natures multiples, de conditions
expérimentales variées placent l'ECZ en position de choix dans le cadre de travaux
d'investigation en criblage précoce à haut débit [42].
3.5 Apport des méthodes électrochimiques.
3.5.1 La voltampérométrie.
Cette technique regroupe des méthodes électroanalytiques basées sur
l’enregistrement du courant en fonction de la tension appliquée dans des conditions
favorables à la polarisation de l’électrode de travail. Ce courant est en relation
directement proportionnelle avec la concentration de l’espèce étudiée. Distinction est
donc faite avec les mesures potentiométriques à courant quasi nul et sans
polarisation aucune. La consommation des substances électrochimiquement actives
Introduction
- 28 -
est minime en regard de l’électrogravimétrie ou de la coulométrie. Abondamment
usitée afin de fournir des informations de première ligne relatives aux mécanismes
des réactions d’oxydation et de réduction, ou aux processus d’adsorption ou aux
transferts électroniques, ses potentialités dans le domaine analytique séduisent de
nombreux expérimentateurs. Analysé en terme de concentration ou de cinétique, le
tracé du courant propose une localisation immédiate des potentiels rédox des
espèces en présence, et une évaluation de l’influence du milieu sur le mécanisme
rédox impliqué. Ces aptitudes placent la voltampérométrie parmi les techniques
électrochimiques les plus versatiles et les plus largement utilisées [43-45].
3.5.1.1 La voltampérométrie cyclique (VC).
Caractérisée par un balayage linéaire du potentiel de l’électrode stationnaire de
travail (balayage triangulaire, Figure 1.9), la voltampérométrie cyclique engendre des
courants situés entre le nanoampère et le microampère. Selon le type d’informations
désiré, un balayage simple ou multiple peut être exécuté. Le tracé du courant en
fonction du potentiel appliqué fournit un graphe nommé voltampérogramme cyclique.
Cette configuration impose à l'expérimentateur de manipuler au sein d’une solution
non agitée. Il s’agit à ce moment de distinguer les systèmes réversibles des
systèmes dits irréversibles [45, 46].
En présence seule de la forme réduite (Red) à l’initial, les systèmes réversibles
(Figure 1.10) répondant à la réaction Red Ox + n e- présentent un maximum
caractéristique situé positivement par rapport au E0 du système (balayage aller). Le
potentiostat soumet à tout instant t l’électrode de travail à un potentiel Et variant
linéairement en fonction du temps [Eq. 3].
Figure 1.9 Signal potentiel – temps, voltampérométrie cyclique à balayage linéaire.
Temps
Cycle 1
Aller
Retour
Potentiel
Introduction
- 29 -
Figure 1.10 Voltampérométrie cyclique d’un couple réversible (Fe2+/Fe3+) en milieu
H2SO4 1M [46].
tvEE it .+= (Eq. 3)
Ei : potentiel (V) initial situé dans une zone où aucune réaction d’électrode ne se
manifeste (point a).
v : vitesse de balayage ( V/s).
Ces systèmes, qualifiés de réversibles, répondent en tout point du
voltampérogramme à la relation de Nernst (Eq. 4). De ce fait, Et impose à l’électrode
un rapport défini entre les formes réduite et oxydée.
),0(),0(
log3,2 Re0 tC
tCnF
RTEEOx
d−= (Eq. 4)
E0 étant le potentiel standard du couple rédox, R la constante des gaz (8.314 JK-
1mol-1), T la température exprimée en Kelvin, n le nombre d’électrons échangés, et F
la constante de Faraday (96487 coulombs).
Introduction
- 30 -
Lorsque les coefficients de diffusion (D) des deux formes s’égalisent, les
concentrations en réducteur et oxydant sont identiques. A ce moment E = E1/2, il est
appelé potentiel de demi-vague et correspond au courant égal à la moitié de sa
valeur limite (point b). En relation avec le potentiel rédox standard, il est parfois
utilisé pour identifier des composés (Eq. 5).
Ox
d
DD
nFRTEE Re
2/1'0 ln+= (Eq. 5)
L’origine du maximum provient de la diminution de la concentration en réducteur à la
surface de l’électrode lorsque l’on se déplace vers les potentiels plus positifs,
jusqu’au moment où elle s’annule. Au-delà de ce potentiel, le courant devient
indépendant du potentiel et ne dépend plus que du temps (points a, b, c et d). Le
courant est corrélé quantitativement à la vitesse de transport de Red de la frontière
externe de la couche de diffusion vers la surface de l’électrode. Seule une fonction
tabulée (χσt) permet de relier le courant i aux paramètres expérimentaux (Eq. 6).
t
dd DcAFni σχσπ ....... ReRe= (Eq. 6) i = courant (Ampères), n = nombre d’électrons échangés, A = surface de l’électrode
(cm2), cRed = concentration en Red (mol/cm3), DRed = coefficient de diffusion (cm2/s),
σ = (nF / RT).v, v = vitesse de balayage (V/s), F / RT = 1/0.0259 (V-1) à 25°C.
Au potentiel Epa, indépendant de la vitesse de balayage et dans le cas de l’oxydation,
le courant de pic anodique ipa répond à la relation (Eq. 7).
vDRTnFcAni ddpa ......4463,0 ReRe= (Eq. 7)
Il peut aussi s'exprimer selon l’équation de Randles-Sevcik (Eq. 8).
vDcAni ddpa .....10.69,2 ReRe3 25= (Eq. 8)
Introduction
- 31 -
Pour v constant, et en l'absence de phénomène d'adsorption, le courant de pic ipa est
une fonction linéaire de la concentration et fournit une information analytique quantitative. L'équation 8 souligne la relation linéaire entre le rapport Ipa / CRed et la racine carrée
de la vitesse de balayage. Dans le cas de systèmes réversibles et contrôlés par la
diffusion de l'espèce électroactive.
Durant le balayage retour, et ce à partir d’un potentiel Emax préalablement choisi, le
potentiel revient à Ei, mu par une vitesse de balayage similaire. Le tracé présentera
un second pic issu de la réduction de l’espèce oxydée produite à l’aller et encore
présente dans la couche de diffusion. La loi de Nernst préside toujours à
l’établissement des valeurs de potentiel (points e, f, g, et h). D’autres paramètres
viennent corroborer la réversibilité du système électrochimique.
VnnF
RTEEE pcpap059,0.303,2 ==−=Δ à 25°C.
Le nombre d’électrons échangés est déterminé à l’aide de cette valeur.
2
'0
pcpa EEE
+=
La moyenne des potentiels de pics représente le potentiel rédox E0’ du couple étudié.
Information analytique qualitative.
1=pc
pa
ii
Le rapport des courants anodique et cathodique équivaut à un. Dans le cas d’une réaction Red Ox + n e- à la surface d’une électrode pour un
système irréversible (transfert d’électrons lent), l’équation de Nernst n’est plus
applicable. Le courrant croit de manière exponentielle en fonction du potentiel et du
temps (balayage aller). Par l’accroissement des potentiels, le courant augmente et
un processus de diffusion se met en place. De manière comparable au premier cas,
la concentration en réducteur s’annule à un moment t, la diffusion contrôle le courant.
La courbe courant-potentiel présente un maximum Epa situé plus positivement que
Introduction
- 32 -
E0. Le balayage retour, n’enregistre aucune réduction de l’oxydant formé, le
voltampérogramme ne possède pas de composante dans cette zone (Figure 1.11). A
l’aller comme au retour, pour tout potentiel situé au-delà du pic, le courant est
contrôlé par la diffusion. Le courant de pic ipa pour v constant est une fonction linéaire
de la concentration [45, 46].
Figure 1.11 Voltampérogramme type d’un système irréversible [46].
3.5.1.2 La voltampérométrie hydrodynamique.
Deuxième subdivision parmi les voltampérométries, le mode hydrodynamique diffère
du fait du maintien de la solution sous une agitation constante. Différentes
configurations techniques existent : cellule sous agitation, électrodes tournantes,
analyse par injection dans un flux (AIF) ou CL. Le point crucial des phénomènes
observés réside en l’apport du réactif à la surface de l’électrode. Celui-ci, comme
dans l'ensemble des méthodes voltampérométriques, est régi par trois mécanismes :
la migration, la convection et la diffusion. Migration et convection sont minimisés
respectivement par l’ajout en excès d’un électrolyte de support et une agitation
permanente. L'apport de l'analyte par convection et le maintient de la couche de
diffusion constante procurent des courants limites plus grands que dans le cas de la
VC (Eq. 9) [44, 45].
Potentiel (V)
Courant (µA)
Introduction
- 33 -
OxOx
l cDAFni ....δ
= (Eq. 9)
I = courant limite (Ampères), n = nombre de moles d'électrons par mole d'analyte, F
= le faraday, A = aire de l'électrode (cm2), D = coefficient de diffusion (cm2/s), c =
concentration (mole/ cm3), δ = épaisseur de la couche de diffusion de Nernst (cm).
Proche de la VC, par son approche à la fois quantitative et qualitative, la
voltampérométrie hydrodynamique (VH) s'utilise aussi, au travers de la mise en place
de différentes cellules en série intégrées au sein de systèmes en flux (AIF, CL)
(Figure 1.12). Chacune d’elles est maintenue à un potentiel défini. Les courants
obtenus, au contraire de la VC, sont indépendants du courant de charge, et par là
même, plus représentatifs du processus de transfert d’électron(s) en jeu. D’une
bonne reproductibilité et robustesse, les voltampérogrammes hydrodynamiques
obtenus avec des électrodes en série offrent une source fiable de données
thermodynamiques et cinétiques relatives à la réaction de transfert d’électrons
(Figure 1.13). Outre l’exploitation de l’aspect quantitatif largement répandu, la VH
avec cellules en série, rend compte du potentiel rédox relatif et permet de prédire la
stabilité rédox d’un produit donné. D’autres moyens de détection (UV, SM) peuvent
être montés en parallèle dans divers dispositifs chromatographiques ou non. En
addition des résultats obtenus par d’autres méthodes (résonance magnétique
nucléaire (RMN), CL-SM,…) et usage croisé des bases de données, cette technique
voit son utilité grandir au niveau des étapes les plus précoces en recherche et
développement pharmaceutiques [47-49].
Figure 1.12 Système CL avec détection parallèle par SM et cellules
électrochimiques en série [49].
Introduction
- 34 -
Figure 1.13 Voltampérogramme hydrodynamique typique obtenu au moyen de
cellules électrochimiques en série [50].
Les phénomènes d’oxydation et de réduction profondément impliqués dans le
métabolisme des xénobiotiques (cfr CYP450), dans l’apparition de toxicités
(génération d’espèces réactives), dans la manifestation physiopathologique de
maladies (stress oxydatif), dans l’instabilité chimique (dégradation oxydative) ou plus
positivement comme agent thérapeutique (agents anticancéreux par bioréduction),
constituent de tout évidence un nœud clef dans la vie de tout être vivant [47, 51]. La
voltampérométrie cyclique par sa facilité de mise en œuvre, sa rapidité d'éxécution et
son coût réduit, procure quantité de résultats directement exploitables. Ses atouts
éveillent l’attention de la recherche moderne, inlassablement à l’affût de toute
stratégie qui puisse aider ou/et faciliter la prise de décision au sujet d’un candidat
médicament et ce le plus précocement possible. La VC accepte l’usage d’une vaste
gamme de matériaux au niveau de l’électrode de travail, en adéquation avec
l’analyte étudié. La surface de ces électrodes indicatrices, généralement petite, peut
être renouvelée aisément et de manière reproductible. Les mesures produites
(qualitatives et quantitatives) rencontrent par conséquent les souhaits de
reproductibilité, justesse et précision. Une sensibilité parfois une peu faible et un
domaine d'application restreint aux molécules électroactives lui est toutefois
reprochée [52-56].
Introduction
- 35 -
La voltampérométrie cyclique par son exploration fondamentale du comportement
rédox d’un système donné, s’ouvre les portes de nombreux
domaines d’investigations:
développement pharmaceutique
industrie agro-alimentaire
analyse clinique
environnement
Le nombre d’applications possibles s’en trouve élargi sans cesse :
Elle peut intervenir à différents stades du développement pharmaceutique :
études de stabilité, identification prédictive de métabolites [47, 49],
formulation galénique [57, 58]. Le mimétisme d’un point de vue
électrochimique entre métabolisme et VC répond avec opportunisme au
concept « ressemblance au médicament» en vogue dans les unités de
recherche.
Elle permet l'étude de la capacité antioxydante de divers composés
naturels ou non. Les antioxydants, nouvelles molécules de grand intérêt
tant du point de vue scientifique que commercial de notre mode de vie
moderne, suscitent de nombreuses investigations. Évaluer leur capacité
antioxydante totale, leur mode d’action, leur implication, leur gain en terme
de prophylaxie, constitue nombre de sujets de recherche.
Dans le cas par exemple des antioxydants de faible poids moléculaire,
groupe majeur du système de défense antioxydante physiologique,
quelques équipes utilisent en routine la VC afin d'établir leur présence et
de quantifier leur capacité antioxydante. La corrélation établie entre le
pouvoir réducteur et l'activité antioxydante permet une approche rationnelle
de l'évaluation de ce paramètre par la VC. Par l'analyse de la vague
voltampérométrique, la VC fournit à l'expérimentateur deux types
d'informations: le potentiel du pic d'oxydation et la valeur du courant
associé à ce pic. Le potentiel de pic d'oxydation permet l'estimation de la
propension du composé à se comporter comme un donneur d'électrons
c'est-à-dire comme un agent réducteur. L'intensité du courant évalue sa
concentration et le nombre d'électrons échangés par molécule
électroactive. Remarquons également à ce stade, la possibilité offerte par
Introduction
- 36 -
la VC d'identifier au sein d'un mélange, via la valeur du potentiel de pic
d'oxydation, les divers éléments constitutifs.
En outre, il est communément admis pour les composés phénoliques (par
exemple), que la valeur du potentiel de pic d'oxydation, de par la similitude
entre les réactions de formation de radicaux libres
(ROH RO.
H.
+ ) et d'oxydation (ROH RO.
H++ + e-),
procure une idée approximative du pouvoir antiradicalaire du composé
considéré. La VC fournit aussi des informations thermodynamiques,
cinétiques quant au devenir électrochimique du couple rédox étudié [51-53,
55, 59-64].
Par l'évaluation de la facilité au transfert d'électrons présentée par les
molécules, ou la génération et l'identification d'intermédiaires réactionnels,
la VC se montre apte à l'élucidation de mécanismes rédox et
l'établissement de relations structure-activité. Elle permet la mise en
évidence des sites responsables de l'activité pharmacologique de l'agent
thérapeutique et une meilleure compréhension de son comportement in
vivo [65-68].
La VC se montre également d'un apport précieux lors de la détermination
de paramètres de cinétique enzymatique de biocapteurs enzymatiques en
vue d'apprécier les apports bénéfiques de l'utilisation de médiateurs, de
modifications structurale du site actif de l'enzyme ou d'un procédé
d'immobilisation particulier [69-71].
Elle fournit indirectement des informations quant à l'état des défenses
antioxydantes naturelles ou évalue d'éventuels effets secondaires
engendrés par un traitement ou encore estime le niveau de stress cutané
causé par l'exposition aux irradiations UV [51, 54, 55, 72].
Elle peut participer au contrôle analytique de formes pharmaceutiques.
Enfin elle autorise l'identification et l'élucidation du comportement oxydatif
de nombreux composés électroactifs [73-75].
Bien qu’inexorablement cantonnée au domaine des molécules électrochimiquement
actives, la VC s’applique tant aux molécules endogènes qu’exogènes. D’un apport
limité pour la détermination de structures moléculaires mais constamment en
Introduction
- 37 -
évolution [53], elle possède un rôle complémentaire important parmi la batterie de
techniques analytiques habituellement présentes. [49, 55, 76]
3.5.2 Les Biocapteurs.
3.5.2.1 Introduction.
De manière générale, un capteur chimique permet la transformation d’une
information chimique en un signal analytique exploitable. Fondamentalement, il
contient un système de reconnaissance chimique nommé récepteur et un
transducteur physico-chimique (Figure 1.14). Dans le cas particulier où le
mécanisme de reconnaissance fait intervenir un système biochimique, nous
parlerons de biocapteur. Idéalement, le récepteur confère au biocapteur un haut
degré de sélectivité vis-à-vis de l’analyte recherché. Selon les recommandations
IUPAC, un biocapteur est une entité intégrée, souvent petite, apte à procurer une
information analytique qualitative ou semi quantitative sélective à partir d'un élément
de reconnaissance biologique (récepteur) en contact spatial direct avec un élément
transducteur [77].
Reconnaissance
biologique
Signal
Physico-chimique
Analyte cible Biorécepteur Transducteur Signal
Figure 1.14 Schéma général d’un biocapteur.
Introduction
- 38 -
3.5.2.2 La reconnaissance biologique.
Distinguer les biocapteurs en fonction de la nature du biorécepteur est un mode de
classification largement utilisé. On parle essentiellement de deux classes.
(i) Biocapteur à composante biocatalytique.
Le récepteur est dans ce cas une macromolécule dans son environnement d’origine,
ou isolée, ou synthétisée. Elle engendre une consommation continue du substrat.
Nous dénombrons trois types de biocatalyseurs :
Les enzymes : seul ou multiples, système le plus répandu.
Les cellules : complètes (microorganismes) ou organites cellulaires.
Les tissus : coupe de tissu végétal ou animal.
Les plus étudiés et les plus développés, et ce depuis 1962 par Clark et al., ces
biocapteurs sont gouvernés par une réaction générale de base du type :
S + S’ P + P’ Possibilité existe de suivre le devenir du substrat S selon quatre stratégies (Figure 1.15) :
Détection de la consommation du cosubstrat S’, l’oxygène par exemple. (a) Détection d’un des produits de réaction (P), le peroxyde d’hydrogène par
exemple. (a) Utilisation d’un médiateur, sa haute réactivité vis-à-vis du biocatalyseur et sa
détection aisée par le transducteur concourent à l’élimination de la
dépendance au cosubstrat ou aux interférences d’autres espèces. Cela se
traduit par un plus haut taux de réaction atteint. Le médiateur, molécule
relativement petite, par ses propriétés électrochimiques intrinsèques,
engendre des réactions électrochimiques rapides. En interaction avec le
centre rédox de l’enzyme ou avec un produit de réaction, il est régénéré
totalement après un cycle complet. (b) Transfert direct d’électrons entre le centre actif de l’enzyme et le transducteur.
Une faible fraction d’enzymes possède cette caractéristique. (c)
Biocatalyseur
Introduction
- 39 -
Figure 1.15 Illustration des différentes possibilités de transmission de l’information
chimique entre le biorécepteur et le transducteur (électrode). S = substrat, P =
produit et E = enzyme [30].
Les dernières évolutions en vue d’améliorer les performances des biocapteurs
proposent l’emploi simultané d’enzymes et ce, selon trois schémas :
Cascade enzymatique engendrant un produit final électroactif. Disposition en série: les enzymes régénèrent le cosubstrat du premier enzyme
et atteignent l’amplification du signal par régénération d’un autre cosubstrat du
premier enzyme. Positionnement des enzymes en parallèle afin d'augmenter la sélectivité par
appauvrissement local d’un interférent. (ii) Biocapteurs d'affinité.
Dans cette situation, la reconnaissance est assurée par un ensemble organisé de
macromolécules, isolé ou reconstruit artificiellement. L'interaction réversible entre le
biorécepteur et sa cible se déroule sans aucune consommation d'analyte, se
caractérise généralement par un état d’équilibre stoechiométrique, et la détection des
changements physicochimiques engendrés par un transducteur approprié.
Le phénomène de reconnaissance se décline sous trois formes :
Interaction anticorps/antigène, basé sur une réaction immunochimique. Les
biorécepteurs peuvent être couplés avec un enzyme chargé de mesurer la
quantité de complexe formé et de là accroître la sensibilité. Par les constantes
d’affinité souvent très grandes, ils sont à usage unique.
Introduction
- 40 -
Récepteur membranaire/agoniste/antagoniste, repose sur une affinité
sélective pour un site de nature protéique. Aucun enzyme adjacent n’est
nécessaire pour obtenir la sensibilité désirée.
Hybridation d’oligonucléotides, elle se détecte soit par intercalation d’une
molécule électroactive pendant la formation de l’ADN double brins, soit par
exploitation directe des propriétés électrochimiques de la guanine, ou
d'éventuelles modifications électriques à l'interface transducteur/solution.
Développés dans une moindre mesure en comparaison des biocapteurs basés sur la
biocatalyse, les biocapteurs gouvernés par les phénomènes de biocomplexation sont
aujourd'hui source d'intenses et nombreux progrès. Les difficultés majeures se
situent initialement au niveau des faibles fenêtres de linéarité qu’ils présentent et de
leur difficulté à opérer de manière sélective en milieu complexe [30, 77, 78].
3.5.2.3 Les transducteurs.
Éléments physico-chimiques en charge de la conversion du stimulus biologique en
un signal électrique amplifié par un réseau électronique, les transducteurs peuvent
être de diverses natures : électrode, fibre optique, cristal piézo-électrique, quartz,
thermistor…
3.5.2.3.1 Les transducteurs électrochimiques.
Les électrodes d’or, de platine, de carbone vitreux, ou de graphite conviennent pour
différentes techniques électrochimiques. La plus commune est l’ampérométrie,
combinée fréquemment aux biorécepteurs biocatalytiques. Nous évoquerons aussi
brièvement la potentiométrie, la conductométrie, la mesure d'impédance et la
chronoampérométrie. La nature du transducteur détermine fondamentalement le
mode de détection.
Détection ampérométrique.
L’ampérométrie repose classiquement sur la mesure d’un courant résultant de
l’oxydation ou de la réduction d’une espèce électroactive. Opérée dans un système
conventionnel à trois électrodes (électrode indicatrice, de référence et auxiliaire), un
potentiel constant est imposé à l’électrode de travail à l’aide d’un potentiostat. Le
courant mesuré est en relation directe avec la concentration dans le milieu de
l’espèce impliquée ou de sa production ou de sa consommation. Réalisée en mode
Introduction
- 41 -
hydrodynamique (AIF ou batch), l’ampérométrie, associée à une réaction
biocatalytique d’ordre un, atteint un état de régime stationnaire et non d’équilibre. Le
courant généré, idéalement soumis au transfert de masse est proportionnel à la
concentration de l’analyte cible [30, 45, 77].
Détection potentiométrique.
En potentiométrie, l’information quant à la composition de l’échantillon est obtenue
par la mesure de la différence de potentiel entre une électrode indicatrice et une
électrode de référence et ce à courant nul. La réponse est proportionnelle au
logarithme de l’activité de la molécule étudiée (Eq. 10), reflet d’une situation très
proche de l’équilibre.
(Eq. 10)
E est le potentiel, zi et ai sont respectivement la charge ionique et l’activité ionique de
l’espèce i. La constante K dépend de plusieurs facteurs, influencés par la conception
même du biocapteur. Cette équation de Nikolskii-Eisenman aborde le cas pratique
où l’électrode ne répond pas exclusivement à une espèce donnée. Elle tient compte
des agents interférents via le coefficient de sélectivité (kij), mesure quantitative de
l’habilité de l’électrode à discriminer [30, 45].
Transistors sélectifs à effet de champ.
Application particulière des MOSFETs (metal ion silicon field effect transistor), les
ISFETs (ion selective field effect transistor) possèdent les bénéfices suivants :
Une formidable robustesse et durabilité, les milieux les plus complexes et/ou
agressifs peuvent être abordés sans obstacle. Leur nettoyage est simple et ne
pose aucune difficulté.
Une conservation (stockage) indéfinie à sec, et une exigence de maintenance
très faible.
Une applicabilité possible dans une large gamme de températures et par
corollaire une stérilisation éventuelle en vue d’applications biologiques,
médicales, et pharmaceutiques.
)log(..
..303,2 j
i
zz
jijii
akaFz
TRKE ++=
Introduction
- 42 -
Une influence minime de l’erreur acide ou alcaline dans les valeurs de pH
extrêmes.
Une réponse très rapide, très sensible, une miniaturisation possible (micro-
puces), un volume d’échantillon requis faible, une insertion « on line » ou en
mode batch éventuelle, une impédance électrique faible, un coût peu élevé.
Très appréciés pour leur surface en SiO2 garnie de silanols libres, qui peut accueillir
par liaison covalente des molécules organiques ou des polymères, les ISFETs
réalisent leurs mesures par mode différentiel. La différence de signal est enregistrée
entre un IFSET recouvert du biorécepteur (biocatalytique ou de bioaffinité) et un
second IFSET de référence. L'inconvénient majeur réside en la dérive non
négligeable du signal au cours du temps [30, 44, 77, 79].
Détection conductimétrique.
Les biocapteurs conductimétriques consistent en deux fils de platine ou d’or entre
lesquelles le biorécepteur est immobilisé. Le signal, également différentiel, apparaît
lors d’un changement de conductivité entre les électrodes. Très influencés par la
conductivité du milieu ionique environnant, leur performance est variable et les
résultats imprévisibles [30].
Détection par impédance.
L’impédance du système est mesurée suite à l’application d’une tension sinusoïdale
à l’électrode. L’impédance Z en série est la conjonction de la résistance R et de la
capacité C comme le décrit l’équation (Eq. 11).
s
ss CiRZ.ω
−= (Eq. 11)
i est l’unité dans le complexe plan, ω la fréquence du courant appliqué.
Cette mesure se fonde sur l’analogie possible entre une cellule électrochimique et un
circuit électrique. Elle sera l’instrument de choix pour l’étude de paramètres
cinétiques, aussi bien pour les électrodes nues que dans le cas de biocapteurs
multicouches [30]. Récemment, est apparu une nouvelle génération de
transducteurs, axés sur la seule mesure de la capacité. Toute modification de
l’interface métal/solution mène à un changement de capacité. Dédiés à des besoins
Introduction
- 43 -
spéciaux, ils autorisent : (i) la détermination de l’épaisseur de la membrane, (ii)
l’investigation des processus de formation de la membrane, (iii) l’étude de tout type
de biorécepteur, (iv) la détection et la quantification de petites molécules à de faibles
concentrations [80].
Détection chronoampérométrique.
Une première étape a pour but d’accumuler le produit de réaction, sous agitation.
Après arrêt de celle-ci, un potentiel adéquat tel que la réaction faradaïque puisse
avoir lieu est imposé. Le courant résultant est enregistré en fonction du temps [30].
3.5.2.3.2 Autres transducteurs.
Par la focalisation axée sur l'étude de transducteurs électrochimiques de notre
travail, nous aborderons de manière très succincte les autres transducteurs utilisés
dans les biocapteurs.
Optiques.
En constante évolution, ces biocapteurs sont très amplement associés aux fibres
optiques. Nous distinguons deux catégories : les intrinsèques et les extrinsèques.
La fibre optique joue deux rôles dans le premier cas: transducteur et conducteur de
la lumière transmise. Les altérations des propriétés de propagation de la lumière
provoquées par des modifications (température, pression) correspondent au
paramètre observé et mesuré. Dans le second concept, le transducteur est fixé à
l’extrémité de la fibre, qui tient uniquement lieu de transporteur d'onde. Les
biocapteurs optiques démontrent quelques points positifs : (i) la non nécessité de
contact intime entre le biorécepteur et la fibre optique, permet des stratégies non
invasives, (ii) analyse possible sur de faibles volumes d'échantillon (µL), (iii) aucune
électrode de référence n’est requise, (iv) possibilité de détection simultanée à
plusieurs longueurs d’onde, (v) aucune interférence du bruit électrique. Par contre,
certaines limitations restreignent leur usage : (i) bruit de fond causé par la lumière
ambiante, (ii) domaine de linéarité réduit, (iii) la relation négative entre la taille du
volume d’échantillon et l'intensité du signal limite la miniaturisation, qui elle-même
affecte le temps de réponse. De nombreuses méthodes spectrales sont combinées
aux biocapteurs optiques. Parmi les plus classiques, se trouvent la
spectrophotométrie d’absorption, la réflexion, la fluorescence, la
chimiluminescence,… Certaines dernières avancées suggèrent l’utilisation de
Introduction
- 44 -
l’infrarouge (IR) ou du proche infrarouge (NIR) ou également de la spectroscopie
Raman.
La résonance plasmonique de surface (SPR) jette au début des années nonante les
bases de nouveaux biocapteurs optiques. Ce phénomène optique est basé sur la
modification de l'angle de réflexion pour une valeur minimale de l'intensité d'un
rayonnement lumineux réfléchi à une interface composée d'un film métallique mince,
garni de l'élément de bioreconnaissance, au contact de la solution expérimentale
cible. Les biocapteurs optiques, surtout associés aux biorécepteurs d’affinité, sont
aptes à évaluer une réaction biospécifique au plan qualitatif et quantitatif, et ce en
temps réel. Appréciés pour les études cinétiques, ils supportent leur usage dans des
échantillons bruts, malgré une détection difficile des concentrations très basses. Vu
la valeur très élevée des constantes de liaison des biorécepteurs fixés à leur surface,
un usage unique est préconisé. Ces biocapteurs connaissent un important succès
commercial dans le secteur pharmaceutique [80-83].
En plein essor dans le champ de la chimie analytique, l’électrochimiluminescence
(ECL) apporte de nouvelles perspectives. Son principe, repose sur la mesure de la
fluorescence d’un composé généré électrochimiquement (Figure 1.16). L’absence de
lumière d’excitation (peu de bruit de fond) la rend extrêmement sensible et ce, dans
un domaine de linéarité large et à de faibles concentrations. Offrant un contrôle
spatial accru de la détection de la réaction biosélective, accessible à une vaste
gamme de composés, l’ECL par sa génération in situ rend réalisable la détection
instantanée d’espèces instables. Deux molécules sont particulièrement utilisées en
tant qu’agent électrochimiluminescent : un complexe de ruthénium (tris(2,2’-
bypyridine)ruthéniumII (Ru(bpy)32+) et le luminol. La réactivité intense de ce dernier
avec le peroxyde d’hydrogène consent à un fonctionnement en synergie avec des
enzymes. L’ECL en voie de miniaturisation, trouve aujourd’hui des applications sans
distinction de type de biocapteurs [30, 84]
Introduction
- 45 -
Figure 1.16 Génération d’un signal fluorescent par électrochimiluminescence.
Piézoélectriques ou acoustiques.
Récemment développée dans le champ spécifique des biocapteurs d'affinité, la
détection acoustique combine quelques aspects très attractifs: réponse en temps
réel (i), non nécessité de marquage (ii), simplicité (iii), commodité (iv), possibilité de
multiplexage (v). Le phénomène piézoélectrique intervient du fait de l’apparition d’un
potentiel électrique à la surface d’un cristal si celui-ci subit la moindre déformation
mécanique. De même, ce cristal placé dans un champ électrique oscillant, acquiert
une fréquence de vibration identique. Tout changement de masse (Δm) intervenu à
la surface du cristal entraîne une diminution proportionnelle de sa fréquence de
vibration (ΔF). Cette relation linéaire s'exprime quantitativement par l'équation de
Sauerbrey (Eq 12).
AmF
FQQ
Δ−=Δ .
.2 2
0
ρμ (Eq.12)
F0 représente la fréquence fondamentale, A la surface géométrique, µQ et ρQ
respectivement, le mode de cisaillement et la densité du cristal piézoélectrique.
hυ
e-
E
Introduction
- 46 -
De nombreux matériaux font montre de propriétés piézoélectriques, le plus
communément utilisé en vue d'applications analytiques est le quartz. Hier cantonnés
à l’analyse en phase gazeuse où ils atteignent une sensibilité à l’échelle du
femtogramme, les biocapteurs acoustiques obtiennent actuellement des
performances en solution d'une sensibilité appréciable (ng). Rendue possible par
l'amélioration des circuits électriques mis en place et l'usage d'une seule surface du
cristal de quartz, cette augmentation de sensibilité intervient de par l'appréciation
accrue des variations des propriétés interfaciales (par exemple:densité, viscosité,
conductivité, constante diélectrique) biorécepteur/solution conséquentes à la
formation du complexe d'affinité ligand/récepteur. La détection moléculaire réalisée
par les biocapteurs piézoélectriques, via le simple dépôt d'une couche ou d'une
molécule de bioreconnaissance à la surface du cristal, leur ouvre les portes vers de
nombreuses opportunités d'application au sein de domaines aussi vastes que
l'environnement, l'agroalimentaire et médicopharmaceutique [30, 78, 85, 86].
Thermiques ou calorimétriques.
La réaction enzyme/substrat est classiquement exothermique. Par mesure
différentielle d’un couple de thermistors, il est possible d’évaluer les changements de
température lors de la réaction enzyme/substrat. Adaptable à quantité de
substances, mais sujet à la dissipation rapide de la chaleur et à un bruit de fond
thermique gênant, la sensibilité de ce biocapteur reste insatisfaisante [30, 81, 84].
Magnétiques.
Jeune catégorie de la thématique biocapteurs, les transducteurs à propriétés
magnétiques pourraient apporter une réponse aux soucis posés en général par la
conception de biocapteurs: sensibilité, spécificité, facilité d'emploi, efficacité, coût et
intervention humaine minimale. Différents phénomènes magnétiques sous-tendent la
détection du signal de bioreconnaissance. La perméabilité magnétique relative (µr),
constante spécifique d'un matériel, mesure sa capacité à retenir ou à contribuer à un
champ magnétique externe imposé. Les matériaux aux valeurs de µr très élevées
(>>>1), ou les matrices les contenant sont nommés ferromagnétiques. Le passage
d'un composé ferromagnétique au sein d'une tubulure en serpentin confère une
inductance à la spirale. Tout changement détecté de l'inductance traduit une
modification des propriétés ferromagnétiques, due par exemple à la fixation d'un
Introduction
- 47 -
élément. Très peu influencée par la matrice échantillon, et sans risque d'encrassage
de la surface du transducteur, la méthode montre une sensibilité unique aux
substances ferromagnétiques. Les inconvénients proviennent de la préparation
laborieuse des composants ferromagnétiques et des interférences créées par le bruit
électronique environnant [87]. La transposition d'effets magnétiques directement tirés
de la technologie informatique surmonte les défauts majeurs des premiers
biocapteurs magnétiques: basse sensibilité, taille et surconsommation énergétique.
L'un d'eux est l'effet de magnéto résistivité et équivaut à l'induction d'un changement
de la résistivité d'un matériau par un champ magnétique. En pratique, des microbilles
marquées de la cible ou de l'espèce passent dans le giron d'un transducteur
magnétique garni de biomolécules complémentaires ou non-complémentaires. Les
microbilles provoquent un changement de la résistance du transducteur. Un lavage
approprié élimine les microbilles non liées, le signal résiduel et/ou persistant
témoigne du succès de l'interaction. Les transducteurs magnétiques conviennent
idéalement pour des interactions d'affinité et participent activement au
développement d'immunocapteurs et de puces à ADN [88, 89].
3.5.2.4 Techniques d’immobilisation.
Par référence à la définition d’un biocapteur, l'élément biologique doit être intimement
connecté au transducteur. Pour atteindre ce but, une étape cruciale de la conception
d’un biocapteur constitue l’immobilisation de l’élément de reconnaissance biologique
en une fine couche à la surface du transducteur [30]. Ce point critique et inévitable
doit respecter l’intégrité physique et chimique du biorécepteur choisi. La difficulté de
l’immobilisation enzymatique perdure, bien qu’abondamment documentée. Les
enzymes, très onéreux quant au coût de leur extraction et de leur purification,
montrent parfois une fragilité de leur structure, lorsque isolés de leur environnement
naturel. Conserver un enzyme le plus proche de ses spécificités initiales en solution
et donc le plus efficient possible, telle est la gageure demandée à l’immobilisation.
Par mimétisme de situations in vivo, dans lesquelles les enzymes sont amarrés à la
membrane cellulaire, l'objectif recherché est de stabiliser leur structure et leur
activité. Le concept biocapteur autorise la récupération de l’enzyme, l’usage multiple
ou en routine. L’obtention des conditions optimales d’immobilisation passe
indubitablement par une étape empirique de mise au point, par tentatives
Introduction
- 48 -
fructueuses ou infructueuses successives. Quoi qu’il en soit, les performances de
l’enzyme immobilisé sont altérées, l'activité souvent affaiblie et les paramètres
cinétiques modifiés. Un support, judicieusement choisi, amenuise ces effets. Aucun
support universel idéal n'est connu; le matériau candidat à l'immobilisation, d'origine
organique ou inorganique, naturelle ou synthétique, doit répondre à des
caractéristiques souhaitées [90] :
Haute affinité aux protéines.
Groupes fonctionnels disponibles pour des réactions directes avec les
enzymes ou modifications chimiques.
Hydrophilie
Stabilité mécanique et rigidité.
Aptitude à la régénération.
Facilité de préparation dans diverses configurations géométriques,
perméabilité, disponibilité de la surface pour des biotransformations
subséquentes.
Toxicité et biocompatibilité.
Biodégradable, économique.
L’ensemble des procédures communément employées est subdivisé en deux sous-
groupes : physiques et chimiques (Figure 1.17).
L’innovation dans le domaine des techniques d’immobilisation représente une des
conditions "sine qua non" à l’amélioration permanente des performances des
biocapteurs, si ils veulent répondre aux défis posés par les échantillons complexes
(environnementaux ou cliniques) [80].
Introduction
- 49 -
Méthodes d’immobilisation
Méthodes physiques Méthodes chimiques
Physisorption Membrane Matrice Gel Polymérisation Liaison covalente Réticulation
Figure 1.17 Diagramme des méthodes d’immobilisation.
3.5.2.4.1 Méthodes physiques.
L’immobilisation physique laisse le biorécepteur intact, mais la faiblesse de la liaison
(forces de Van der Waals) peut entraîner une perte de biorécepteur et une sensibilité
élevée aux paramètres physico-chimiques (t°, pH,…).
La physisorption.
L’adsorption a lieu sur un support insoluble par liaisons ioniques, polaires, ponts
hydrogènes, hydrophobiques, interactions d’électrons π, forces de Vanderwaals ou
une combinaison de ces effets. La nature du support est d’origine variable :
inorganique (verre, quartz, graphite,…), macromolécules biologiques (cellulose,
amidon, dextran,…), échangeurs d’ions (amberlite, carboxyméthylcellulose,…),
polymères synthétiques (collodion, polyacrylamide,…) [30, 84].
Piégeage à l’aide d’une membrane.
Cette technique pionnière, décrite par Clark et al. en 1962 pour la réalisation du
premier biocapteur au glucose, consiste à emprisonner à l’aide d’une membrane
semi-perméable, une fraction de solution d’enzyme, de suspension de cellules ou de
tissu en un film mince à la surface du transducteur. Si le processus de diffusion au
travers de la membrane (sécurisée par un O-ring) est dépendant de la concentration,
une relation linéaire peut s’instaurer entre la concentration et les courants générés.
Introduction
- 50 -
Cette méthode maintient le matériel enzymatique en solution, source d’instabilité et
de perte d’activité. Ceci est son principal inconvénient. Le choix de la nature de la
membrane (acétate de cellulose, polycarbonate,…) est prépondérant dans le cas de
biocapteurs implantables, en vue d’assurer la biocompatibilité [30, 84, 91].
Inclusion dans une matrice.
Par mélange d’un conducteur électrique (métal, graphite, carbone vitreux) et d’un
composé non conducteur insoluble (agent liant), liquide (Nujol, huile de silicone,
paraffine liquide) ou solide à température ambiante (époxy, silicone, paraffine solide),
une matrice dite hétérogène est obtenue. L’inclusion du matériel biocatalytique se fait
à hauteur de 5% (m/m) mais n’excédera jamais les 10% (m/m), afin d’éviter toute
altération de la conductivité et de la stabilité de l’électrode. Incorporé sous forme
lyophilisée, l’enzyme, si ajouté en trop grande quantité, provoque un gonflement et
une érosion de la surface de l’électrode accompagnés de fluctuations du bruit de
fond. En opération, ce type de biocapteur fraîchement préparé, voit son signal
décroître. La cause réside en une libération des composants hydrophiles (enzyme et
médiateur si présent) de la surface vers la solution. Cet inconvénient peut être
minimisé par la pose d'une membrane de dialyse [92]. L’agent liant détermine le
rythme auquel la stabilisation est obtenue et la valeur du signal résiduel. Les plus
connues, à base de graphite, sont nommées pâtes de carbone. Utilisées pour
l’inclusion d’enzymes, de cellules ou de tissus, elles interviennent aussi en qualité de
transducteur ou de support de physisorption. Extrêmement faciles de préparation,
par simple mélange des constituants, une homogénéisation optimale de la pâte
assure une bonne reproductibilité. Le renouvellement de la surface, également aisé,
par simple grattage et polissage constitue un autre attrait [30]. Des travaux antérieurs
de notre laboratoire sur les pâtes de carbone ont démontré l'effet et l'incidence du
type d'agent liant sur les caractères des pâtes. Ces résultats ont démontré l'effet
bénéfique de l'incorporation de paraffine solide en lieu et place de la paraffine liquide
exhibant des caractéristiques électroanalytiques et mécaniques améliorées. Le terme
d'électrode à pâte de carbone solide (EPCs) est dès lors usité [93, 94].
Le remplacement de la pâte de carbone par un agent liant type époxy ou téflon
résout le problème d’érosion évoqué plus haut. Cette famille d’électrodes dites
composites, plus résistantes à une usure mécanique, augmente la stabilité du
courant de base. De même, la présence d’un solvant organique n’affecte pas leurs
Introduction
- 51 -
performances. Aptes à accueillir tout type d’enzyme, elles ont la préférence pour
l’incorporation dans un système en flux (CL, AIF). A nouveau, immédiatement après
la mise en opération, une diminution du signal apparaît par l’effet de largage partiel
de l’enzyme. L’addition de microparticules métalliques (Pt, Pd, ir, Rh, Ru) dans la
matrice (agent liant liquide ou solide) apporte un effet catalytique vis-à-vis du
comportement électrochimique du peroxyde d’hydrogène, ces électrodes sont dites
composites consolidées [30].
Ces dernières années, un autre agent liant a connu un vif intérêt de la part des
électrochimistes, les argiles. De nature inorganique, deux classes majeures d’argiles
existent : les cationiques avec des couches d’aluminosilicate chargées négativement
et les anioniques, couches hydroxydes chargées positivement. La neutralité du
matériau est assurée par des ions (cations, anions) propres au type d’argile et situés
dans les espaces intercouches. Particulièrement opportunes pour le développement
de biocapteurs enzymatiques, les argiles facilitent le transfert électronique
hétérogène de la protéine à la surface de l’électrode. Par interactions
électrostatiques, elles positionneraient la protéine dans une orientation spatiale
propice à une réaction rédox hétérogène rapide avec l’électrode. Dans le cas
d’enzymes héminiques, le groupement électroactif (hème Fe(III)/fe(II)) n’est pas
affecté par l’interaction protéine/argile, celles-ci conservent leur structure d’origine
[95].
La chitine, polyaminosaccharide naturel, abondant et renouvelable à la surface du
globe, dont le monomère est la N-acétyl-D-glucosamine, forme une longue chaîne
polymérique insoluble dans l'eau et les solvants organiques. Associée à des sels
minéraux (ex:CaCO3) et des protéines, elle est l'unité structurelle des coquilles de
crustacés, de l'exosquelette des insectes ou des cellules de champignons. Principal
dérivé de la chitine, le chitosan, copolymère de N-acétyl-D-glucosamine et de D-
glucosamine, s'obtient par N-déacétylation en présence d'un alcali (NaOH par
exemple). Tous deux ont fait l'objet de nombreuses attentions dans un passé récent
pour la rétention de biocomposés sous forme de gels. Depuis peu, par l'usage de
l'électrodéposition, l'épaisseur du film membranaire de chitosan à la surface du
biocapteur jouit d'un meilleur contrôle. Le biorécepteur choisi (enzyme, cellule,
antigène, anticorps), par addition des agents appropriés, se voit présenter divers
modes d'immobilisation: adsorption, inclusion, réticulation ou liaison covalente.
Introduction
- 52 -
Connu pour ses indications thérapeutiques ou applications médicales et industrielles,
le chitosan, nouvel outil d'immobilisation, détient les atouts requis pour cet usage
additionnés de biocompatibilité, biodégradabilité. Il favorise l'élaboration de
biocapteurs sophistiqués, et implantables en milieu biologique [90, 96-98].
En constante évolution, les schémas d'immobilisation proposent dernièrement la
gélification du chitosan par la technique sol-gel; des gels hybrides chitosan-
organosilane sont obtenus par ajout d'agents de sylilation ((CH3O)3Si-R-NH2,…),
variante supplémentaire de l'exploitation de la technologie sol-gel. Ce processus
simple de préparation bâtit à température ambiante une matrice d'inclusion de
protéines. L'hydrolyse en milieu acide de précurseurs organiques de faible poids
moléculaire (tetraméthoxysilane, tetraéthoxysilane) en présence d'eau et d'un solvant
mutuel, provoque la formation de groupements silanols (Si-OH) qui, par
condensations successives donnent naissance en premier lieu à des siloxanes (Si-
O-Si), en second lieu à des polymères de siloxanes suivis de l'apparition d'une
suspension colloidale (sol) ou éventuellement d'un gel. Une étape finale de séchage
(définie "état sec" ou xérogel), débarrasse le réseau poreux des molécules de
solvants (Figure 1.18).
R-Si(OMe)3 + 3H2O R-Si(OH)3 + 3MeOH
R-Si(OH)3 (-O-Si-O-Si-O-Si-O-)n
R
OH OH
Hydrolyse
R R
OH
Polycondensation
Figure 1.18 Etapes de la préparation (1. hydrolyse, 2. polycondensation) d'un sol-
gel.
Ces biocéramiques dérivés du verre, incorporent l'élément de bioreconnaissance au
mélange durant la croissance du sol ou du gel. Un réseau tridimensionnel de
polymères de siloxane poreux emprisonne le biorécepteur. Non dénués d'avantages
(simplicité de préparation, à basse température, choix de porosité, inertie chimique,
transparence optique, faible gonflement, et stabilité mécanique et thermique), ces
matériaux s'appliquèrent tout d'abord aux biocapteurs optiques. L'intégration de
Introduction
- 53 -
graphite dans la solution initiale de sol-gel ouvrit le chemin des biocapteurs
électrochimiques. Piégée dans la masse de ce nouveau conducteur, l'activité
enzymatique (ou autre) se voit amplifiée par l'usage de médiateurs ou par la
dispersion de particules métalliques (Pd, Au) par augmentation de la conductivité
[99, 100].
D'autres groupes de travail rapportent l'adjonction d'oxydes métalliques (Nb2O5) au
sol-gel pour le renforcement des qualités citées ci-dessus [101].
La fonctionnalisation des précurseurs organiques engagés dans la réaction de
polymérisation crée une nouvelle catégorie de sol-gel: les ormosils. Modifiés par
des groupes amino, glycidoxy, epoxy-hydroxyl, etc, ils permettent des sites de liaison
spécifique à l'enzyme dans le lacis, proposent une réelle conservation de l'activité du
biocatalyseur et un contrôle judicieux de la balance hydrophile/lipophile. Le signal
électrochimique s'amplifie considérablement par l'insertion d'agents de porosité
(PEG, polyvinylalcool) et de conducteurs (graphite, Pd, Ru) [99]. Un film sol-
gel/copolymère d'alcool polyvinylique et de 4-vinyl pyridine, hybride organique-
inorganique, allie la rigidité des films sol-gel et la biocompatibilité des hydrogels et
gomme leurs imperfections respectives: craquèlement et gonflement [80]. La gélatine
enrichie d'oxydes métalliques (SnO2) a également été préconisée pour former des
matrices sol-gel biocompatibles et moins en proie au craquelures et combinant les
qualités des deux matériaux [102].
Souci permanent, le transfert direct d'électrons entre deux centres rédox dépend
essentiellement de trois facteurs: (a) la rigidité structurelle du composé rédox dans
sa forme oxydée ou réduite d'un point de vue énergétique, (b) la différence de
potentiel entre les deux centres rédox, (c) la distance les séparant. Une stratégie
d'amoindrissement de celle-ci consiste en l'ajout de centres rédox relais, qui mis bout
à bout procèdent, telle une cascade, entre les deux potentiels rédox respectifs. La
synthèse d'hydrogels à partir de monomères modifiés par un médiateur rédox par
liaison covalente propose deux avantages: non modification de la protéine
enzymatique elle-même par les médiateurs envisagés et polymérisation réalisée
dans les conditions optimales. Ces "hydrogels rédox" greffés par soit des
complexes d'osmium ou soit des unités ferrocène, montrent un taux extraordinaire de
transfert d'électrons mais demeurent limités par la profondeur d'enfouissement du
site actif de l'enzyme et la distance du transfert d'électrons. Bien que quelques
Introduction
- 54 -
applications miniaturisées aient vu le jour, ce type de biocapteur repose sur une
procédure de confection principalement manuelle, réel obstacle à une diminution
d'échelle plus poussée et à la production de masse [103].
De nombreuses équipes se sont dirigées vers l'immobilisation par
électropolymérisation. Les films électropolymérisés, à l'inverse des gels ne
souffrent pas d'un manque de reproductibilité et d'un dépôt non spatialement
contrôlé. La conception de la pellicule polymérique, d'épaisseur contrôlée, s'avère
être un modèle de reproductibilité. Cette démarche élégante procède par génération
du film organique uniforme à la surface d'une électrode de travail soumise à un
potentiel judicieusement choisi et plongée dans une solution aqueuse du monomère
et du biorécepteur. Qualifiée "non manuelle", cette méthode piège en une
monocouche les biomolécules situées dans le voisinage immédiat de la surface de
l'électrode et par conséquent incorporées dans le polymère en croissance. Le tissage
d'un véritable réseau polymérique confère une sélectivité aux interférences basée
sur un effet d'exclusion par la taille. Aucune réaction chimique n'affecte le
biorécepteur, ni ne modifie son activité ou son accès; remarquons l'accessibilité de la
technique à tout type de biorécepteur. Un contrôle étroit de l'épaisseur du film
s'effectue par une mesure de la charge électrique délivrée durant la polymérisation.
Cette opération, localement précise, n'oppose aucun refus à se dérouler sur des
surfaces d'électrode très petites et de géométrie complexe et dans des volumes
réduits de solution. Les polymères divisés en deux groupes, comprennent les
conducteurs (polyacétylène, polythiophène, polyaniline, polyindole, polythionine et
polypyrrole) et les non conducteurs (polyphenols, poly(ortho-phénylènediamine, poly
(dichlorophénolindophénol), poly(1,3-diaminobenzène), polypyrrole suroxydé). Les
pellicules de polymères conducteurs, sous accroissement surveillé, montrent une
épaisseur variable selon les desiderata. A l'inverse, les non conducteurs (isolants)
présentent habituellement une couche de polymère mince, moins en proie à
l'encrassement mais jointe à un temps de réponse très rapide et une perméabilité
sélective [30, 103-106]. Inertes chimiquement, les polymères non conducteurs se
génèrent avec une haute reproductibilité et préviennent des interférences anioniques
par une porosité sélective [104, 107].
L'étape de transduction se manifeste fréquemment en tant qu'étape limitante de
pauvre sélectivité. Dans le but de l'accroître, l'établissement de communications
Introduction
- 55 -
électriques supplémentaires favorise la conductivité par insertion de médiateurs
rédox dans la masse polymérique. Cette tentative ponctuée de résultats
insatisfaisants, pour cause d'instabilité opérationnelle ouvrit la voie aux monomères
fonctionnalisés: une première génération ne donna pas satisfaction, la seconde par
greffe de médiateurs (ferrocène, viologène) sur des monomères amphiphiles et
exploitation de leurs propriétés constitue une manière idéale "d'électrification" des
biocapteurs [103, 104].
Certaines équipes rapportent l'usage avantageux de biocapteurs équipés de couches
successives d'un polymère conducteur et d'hydrogel, cumul des atouts de l'un et de
l'autre [103, 108].
A peine âgée de dix ans, une nouvelle technique d'immobilisation acquiert une large
notoriété. Basée sur l'adsorption alternée de couches de charge opposée, cette
innovation, nommée film couche à couche (layer by layer), procure des
assemblages entre 5 et 500nm. A l'aide d'instruments simples, selon une séquence
préétablie de monocouches de substances variées, la génération de ce film
moléculaire organisé se déroule sur divers supports solides. Lames porte objet,
tranches fines de silicone, fibres optiques donnent un nanoassemblage deux
dimensions; les micro ou nano gabarits en latex, les microcristaux de médicaments,
les cellules biologiques ou même les virus produisent des architectures en trois
dimensions. Les forces entre nano particules et les couches lieuses, gouvernent
l'autoassemblage spontané couche à couche de ces films ultrafins. Initialement
électrostatiques et covalentes, ces forces n'excluent pas l'implication d'interactions
de type ponts hydrogènes, hydrophobiques ou autre. Les propriétés finales de
l'ensemble autoassemblé dépendent du choix des "blocs" constitutifs et de leur
intégration mutuelle et organisation rationnelle le long d'un axe perpendiculaire au
support réceptacle.
Ce concept séduisant, sans restriction dans le choix des polyélectrolytes, autorise la
construction de films ultrafins avec une précision d'au moins un nanomètre et de
compositions parfaitement connue. Economiques, leur adaptation à une production à
grande échelle de dispositifs de haute qualité est envisageable [109-111].
La volonté d'assurer à l'élément de bioreconnaisance un espace propice à sa
stabilité et son expression, dirige vers l'utilisation de la structure primitivement la plus
naturelle: les membranes bilipidiques (BLM). L'inclusion de biomolécules y jouit
d'un milieu naturel, en comparaison de toutes les autres matrices d'immobilisation.
Introduction
- 56 -
Ces structures sont assez fragiles et connaissent relativement peu d'applications en
routine [112-117].
Cantonnés aux seules solutions aqueuses pour éviter toute dénaturation protéique,
la mise en œuvre de biocapteurs enzymatiques en phase organique se
développe depuis une dizaine d'années. Basée sur la polyhydroxy-cellulose, la
production de matrices cryohydrogel, organohydrogel autorise le fonctionnement de
biocapteurs en phase organique strictement anhydre. Les cryohydrogels retiennent
dans leur réseau des molécules d'eau qui assurent à l'enzyme son activité par le
microenvironnement aqueux procuré [80, 104].
L'inclusion d'enzymes par microencapsulation appartient également à l'arsenal des
techniques d'immobilisation, soit par coacervation d'un polymère soit par
l'électropolymérisation de microcapsules. L'enzyme emprisonné ne diffuse pas au
travers de la paroi, à l'inverse des substrats et des produits de réaction [30, 104].
3.5.2.4.2 Méthodes chimiques.
Ce type d'immobilisation implique la formation d'une liaison irréversible entre une
fonction organique d'un acide aminé affleurant à la surface de la coque externe des
protéines (non impliqué dans l'activité catalytique) et un groupe réactif d'un agent
d'immobilisation ou du support. Les liaisons covalentes, le plus fréquemment, se
tiennent avec les groupes α- et ε-amino, le cycle phénol de la tyrosine, les groupes β-
et γ- carboxyle, les groupes sulfhydrile de la cystéine, le groupe hydroxyle de la
sérine et le noyau imidazole de l'histidine.
La réticulation.
L'intervention d'agents bifonctionnels provoque l'insolubilisation des protéines par la
formation de liens intermoléculaires. Les agents bifonctionnels sont répartis en deux
groupes: les homobifonctionnels (glutaraldéhyde, acide bisdiazobenzidine-2,2'-
disulfonique, 4,4'-difluoro-3,3'-dinitrodiphényl sulfone, chlorure de phénol-2,4-
disulfonyle, 3-méthoxydiphénylméthane-4,4'-diisocyanate, etc) et les
hétérobifonctionnels (trichloro-o-triazine, 3-méthoxydiphényl méthane-4,4' –
diisocyanate,etc). Par réaction simple avec les amines libres de l'enveloppe
extérieure, ils créent un réseau quasi-cristallin, de haute masse relative, de
propriétés physiques connues. Le problème majeur réside en la sensibilité des
Introduction
- 57 -
protéines à ces agents de couplage, et en la perte partielle ou totale de leur activité
qui s'ensuit. Le mélange concomitant et la coréticulation avec d'autres protéines
inertes (ex: albumine sérique bovine) tendent à amoindrir les phénomènes de
dénaturation par dilution et contribue à la stabilisation de l'ensemble (Figure 1.19). Le
coréticulat s'intègre par mélange intime à une matrice inerte (ex: pâte de carbone
solide) ou se dépose directement à surface solide du transducteur. Cette dernière
solution rencontre plus avantageusement les contraintes de stabilité et de
reproductibilité lorsque la taille du biocapteur impose le dépôt immédiat sur le
transducteur [30, 77, 84, 118].
Figure 1.19 Réseau polymérique après coréticulation entre les éléments constitutifs: l'enzyme, le glutaraldéhyde et l'albumine sérique bovine [30].
Introduction
- 58 -
Immobilisation par liaisons covalentes au support.
La liaison, localisée en surface du support préalablement activé, laisse le
biorécepteur entrer facilement en contact avec son substrat.
De nombreuses surfaces nues de transducteurs de tout type (Pt, Au, graphite, verre,
quartz, etc) conviennent à l'immobilisation. L'activation de la surface consiste en la
création de groupements fonctionnels par oxydation chimique ou chauffage en
présence d'oxygène. La protéine vient s'arrimer aux éventuelles fonctions hydroxyle,
carboxy, etc par réaction chimique [30].
Les thiols, amplement connus pour leur réactivité vis-à-vis des métaux nobles,
forment spontanément une monocouche autoassemblée (SAM) sur une surface
d'or. Les SAM, par une liaison forte de chimisorption avec l'or constituent un
ensemble très bien organisé résistant au lavage. Un réarrangement des chaînes
alkyles "de queue" suit l'adsorption initiale des unités sulfure sur l'or, afin de
maximiser les interactions de Van der Waals. La stabilité et la minceur de ces
monocouches autoassemblées, rehaussée de leur versatilité attractive, les destinent
à de nombreuses applications [103, 119, 120].
Depuis peu, l'exploitation de l'interaction forte biotine – avidine dénote d'un vif intérêt
pour l'attachement de biomolécules à la surface des biocapteurs. Dans le cadre des
SAM, la chaîne alkyl-thiol acquiert, lors d'une étape d'activation, une extrémité biotine
(Figure 1.20). Les immersions successives dans une solution d'avidine et de
biomolécule biotinylée mettent en place un agencement multicouche à discrétion.
Introduction
- 59 -
S S
Or
Chaîne thiol Biotinylée(SAM)
Avidine (n)
Enzyme Biotinylée
Figure 1.20 Agencement d'enzymes biotinylées sur une électrode d'or garnie de
chaîne alkyl-thiol biotinylées.
3.5.2.5 Performances d'un biocapteur.
La création d'un biocapteur "optimal" induit une connaissance adéquate d'un large
nombre de paramètres propres au biocapteur considéré: épaisseur des couches
constitutives, coefficient de partage et de diffusion des espèces impliquées,
distribution et grandeur de l'activité de bioreconnaissance de chacune des strates,
propriétés opérationnelles du transducteur, conditions de préparation, composition
de l'échantillon (pH, température,...), stockage (durée, conditions),... De la globalité
de ces éléments se définit une liste de critères de performance dont une meilleure
compréhension et optimisation s'obtient par l'identification de l'étape limitante:
domaine de linéarité, sensibilité, temps de réponse, sélectivité, reproductibilité,
fiabilité, stabilité et temps de vie.
Dans le cas des biocapteurs électrochimiques à élément de bioreconnaissance
biocatalytique vers lesquels ce travail est plus spécifiquement focalisé, l'amplitude de
la réponse enregistrée traduit la conjonction de cinq phases (Figure 1.21) [77]:
Introduction
- 60 -
Transport du substrat à la surface du biocapteur (a)
Diffusion vers la couche réactive (b)
Réaction analyte/biorécepteur (c)
Diffusion des produits de réaction vers le transducteur et la solution (d)
Détection électrochimique (e)
x e- Electrode
mat
rice
(a)
(b)+ (c)
Cofacteur
Substrat
Enzyme Produit de réaction
H2O2 H+
(d)(e)
(d)
(d)
Figure 1.21 Vue de profil des différentes étapes mécanistiques d'un biocapteur
ampérométrique, d'après [30].
De fait, elle se trouve dépendante de trois facteurs majeurs:
Cinétique de transport de masse
Cinétique enzymatique
Cinétique de la réaction électrochimique
Sous la gouverne de trois mécanismes (diffusion, migration et convection), le
transport de matière vers la surface du biocapteur (discuté au point 3.5.1.2.) régente
l'information électrochimique transmise selon une des modalités exposées au point
3.5.2.2.
Introduction
- 61 -
3.5.2.5.1 Cinétique enzymatique. [12, 121-123]
Au cours du paragraphe consacré à l'immobilisation, nous avons fréquemment
évoqué les effets (positifs ou négatifs) du fait de cette immobilisation sur le
comportement d'un enzyme versus son comportement en solution aqueuse
homogène. La composante enzymatique de la somme des termes d'influence sur la
réponse du biocapteur se pose sous la forme générale de la réaction enzymatique
sise à la Figure 1.22.
+ +
E S ES E P
E S ES E P++k1
k-1
k2
Figure 1.22 Schéma général d'une réaction enzymatique. Dans ce modèle général, le substrat S (unique) se combine en premier lieu
réversiblement à l'enzyme E, ils forment un complexe intermédiaire ES, qui libère
lors d'une étape plus lente et irréversible, l'enzyme E et le produit de réaction P.
Sous la condition que le substrat soit en concentration plus élevée que l'enzyme et si
la concentration du complexe est constante durant la réaction enzymatique (équilibre
entre les constantes de vitesse d'association (k1) et de dissociation (k-1) et la
constante de vitesse catalytique (k2)), l'équation classique de Michaelis-Menten (Eq.
13) rend compte de la relation quantitative entre la vitesse de réaction (v) et la
concentration en substrat.
][].[max
SKSVv
m += (Eq. 13)
Introduction
- 62 -
La constante de Michaelis-Menten (Km), définie et constante pour des conditions
expérimentales précises et un enzyme donné, évalue son affinité pour un substrat
donné. Dans la relation (12), Km équivaut à la concentration en substrat qui
occasionne une réponse égale à la moitié de Vm. L'expression de la vitesse initiale
en fonction de la concentration en substrat correspond à l'équation type d'une
hyperbole. A concentration fixe en enzyme, pour une faible concentration en
substrat, la vitesse de réaction fluctue rapidement et de manière quasi
proportionnelle. Vers les hautes valeurs de concentration, la vitesse s'infléchit,
l'enzyme est saturé en son substrat, la concentration en substrat perd son effet sur la
vitesse qui tend vers une valeur maximale Vm (Figure 1.23).
Figure 1.23 Courbe type de Michaelis-Menten. Dépendance entre vitesse de
réaction et concentration en substrat. Au point C, la vitesse est quasi équivalente à
Vm; au point B, elle vaut exactement la moitié de Vm et au point C, est proportionnelle
à [S] [122].
En ampérométrie, l'équation 13 se représente par
][].[max
SKSII
m += (Eq. 14)
• Cette équation se simplifie pour de faibles concentrations en substrat, [S] << Km,
→ Km + [S] ≈ Km et prend la forme:
Introduction
- 63 -
mKSII ].[max= (Eq. 15)
L'intensité (ici assimilée à la vitesse de réaction initiale), par sa relation directement
proportionnelle à la concentration en substrat, consiste en l'approche généralement
exploitée en analyse quantitative électrochimique.
• Pour de hautes concentrations en substrat, [S] >> Km, ][
][SK
S
m+≈ 1, → I = Imax et se
décrit par: ].[2max TEkII == (Eq. 16)
L'équation (16) met en relation directe [ET], concentration totale en enzyme ([E] +
[ES]) et l'activité catalytique.
Le paramètre Km, combinaison des constantes d'équilibre de formation et de
dissociation du complexe ES, se définit mathématiquement par:
1
12
kkkKm−+
= (Eq. 17)
Usuellement déterminé par la concentration en substrat au point Im/2, la conception
d'un biocapteur enzymatique privilégie les plus petits Km, associés aux Imax les plus
grands.
Le nombre de molécules de substrat converties en produit par seconde pour un
système à un enzyme saturé en substrat se donne par la constante d'ordre1 k2 ou
kcat.
Km et kcat caractérisent un enzyme et servent de point de comparaison. Leur rapport
Km/kcat définit une constante de spécificité et l'efficacité des substrats entre eux [12,
45, 124].
Dans le cas des biocapteurs à enzyme immobilisé, il convient d'utiliser la notion de
Km apparent. Un Km app plus grand que le Km en solution témoigne par exemple de la
présence d'une barrière de diffusion entre l'échantillon et la couche réactive [77].
La quantification de Km et Imax s'effectue plus aisément par la transformation de
Lineweaver-Burk (Eq. 18). La linéarisation de l'équation de Michaelis-Menten par le
Introduction
- 64 -
tracé de l'inverse de I en fonction de l'inverse de [S], extrait les valeurs de Km et Vm
par les interceptes avec les axes x et y (Figure 1.24).
].[
11
maxmax SIK
IIm+= (Eq. 18)
1/Ii
1/[S]
Pente = Km/Imax
-1/Km1/Imax
0
Figure 1.24 Tracé selon Lineweaver-Burk [122]. La nature double réciproque elle-même du tracé de Lineweaver-Burk surpondère les
points de faible concentration et crée une insatisfaction en terme de précision et
justesse. Le modèle graphique de Eadie-Hofstee (Eq. 19) comble ce vide par la mise
en relation de I en fonction de I/[S], et évite les erreurs par considération identique de
chaque point indépendamment du niveau de concentration.
][.
max SIK
II m−= (Eq. 19)
Malheureusement, tant les ordonnées que les abscisses ne sont indépendantes de
la vitesse de réaction, et toute erreur expérimentale se reflète dans chacune d'elles
[124].
Introduction
- 65 -
L'inhibition.
L'inhibition réversible se subdivise en quatre types: compétitif, non compétitif,
anticompétitif et mixte. Selon le diagramme général des mécanismes d'inhibition
réversible (Fig 1.25), l'inhibiteur I se combine avec l'enzyme libre E et forme le
complexe EI ou se lie au complexe ES, et libère le complexe ESI. Les complexes
enzyme-inhibiteur, catalytiquement inactifs, réduisent la vitesse par diminution de la
quantité de E disponible pour réaction avec le substrat S ou du complexe ES produit.
La libération de P demeure l'étape limitante par sa lenteur.
E S ES E P++k1
k-1
k2
I I
ESIEI
++
ki’ki
Figure 1.25 Mécanisme général des inhibitions réversibles simples.
Si l'inhibition est compétitive, celle-ci s'exerce entre l'inhibiteur et le substrat par
homologie structurale pour une fixation sur le même site actif. Deux complexes
réversibles sont formés ES et EI. Ki définit la constante de dissociation du complexe
EI: ][
]].[[EI
IEKi = , également dénommée constante d'inhibition, elle correspond à la
concentration en inhibiteur qui cause un doublement du Km apparent. L'équation de
Michaelis-Menten prend la forme de l'équation (20) où [I] représente la concentration
en inhibiteur libre.
][)/][1.(
].[max
SKIKSVv
im ++= (Eq. 20)
Mieux encore, elle peut s'écrire:
Introduction
- 66 -
][
].[max
SKSVv app
m
app
+= (Eq. 21)
Vmapp et Km
app équivalent aux constantes apparentes de Vm et de Km et le rapport des
deux s'exprime:
)/][1(
/max
max
max
i
mapp
app
KIKV
KV
+= (Eq. 22)
L'inhibition compétitive se traduit par une augmentation du Km apparent par le
facteur )/][1( iKI+ , une diminution du rapport Vm/Km du même facteur, Vm demeurant
inchangé.
Si l'inhibition est anticompétitive, l'inhibiteur se lie au complexe ES (produit ESI, EI n'existe pas,) par d'autres sites de liaison que le site catalytique mais modifie la
structure de l'enzyme.][
]].[['
ESIIESKi = . A nouveau, un seul type de complexe est
engagé, elle affecte Km et Vm de manière identique et n'a donc aucun effet sur leur
rapport.
La présence conjointe des deux concerne les types d'inhibition mixte ou non
compétitive et engendre une diminution de Vmapp.
L'identification du mécanisme en jeu s'effectue par l'observation des transformées de
Linweaver-Burk et de l'allure des droites recueillies en présence et en absence de
l'inhibiteur (Figure 1.26).
1/v
1/[S]
1/Km
1/ Vmax
1/v
1/[S]
1/Km
1/ Vmax
1/v
1/[S]
1/Km
1/ Vmax
Enzyme non inhibé
Figure 1.26 Différents types d'inhibition en représentation de Lineweaver-Burk.
Inhibition compétitive, non compétitive et anticompétitive.
Introduction
- 67 -
L'inhibition compétitive fournit des droites qui possèdent un point d'intersection en
commun sur l'axe des ordonnées pour une valeur de Vm apparent inchangée et un
Km augmenté. Les droites obtenues lors d'une inhibition non compétitive se coupent
en un point situé sur l'axe des abscisses, égal à la valeur de Km constant, Vm
apparent grandit. Le rapport Vm/Km constant, lors d'une inhibition anticompétitive,
dépeint des droites parallèles.
Lors d'une inhibition irréversible, un affaiblissement de l'activité se manifeste au
cours du temps marqué par une diminution de Vm et aucun effet sur Km. L'inhibiteur
se combine à l'enzyme et conduit l'activité vers zéro par la genèse d'une forme
inactive de l'enzyme.
L'appréciation de la puissance d'inhibition s'effectue au travers de deux grandeurs:
la concentration nécessaire pour inhiber 50% de la vitesse initiale (CI50),
extraite du modèle in vitro choisi pour une concentration en substrat, elle
s'extrapole difficilement à l'in vivo. Elle dépend fortement de la concentration
en enzyme totale et de la constante d'inhibition, sous l'influence pour sa part
de la concentration en substrat, de Km et du type d'inhibition.
Ki définit l'affinité de l'inhibiteur pour l'enzyme. De faibles valeurs caractérisent
des inhibiteurs puissants, des élevées des inhibiteurs faibles. Aisément
quantifiée graphiquement par le tracé du rapport Kmapp/Vm
app en fonction de la
concentration en inhibiteur, la valeur de Ki vaut la valeur absolue de
l'intersection de la droite obtenue et de l'axe des abscisses.
3.5.2.5.2 Interférences.
Particulièrement d'intérêt pour les dispositifs destinés à un usage continu et insérés
en milieu très complexe, la recherche des interférents lors de l'analyse des
performance d'un biocapteur concerne l'intégralité des espèces présentes et non pas
les seules susceptibles d'interactions supposées. Parmi elles, trois se rencontrent
fréquemment:
1. L'acide ascorbique: il forme avec son produit d'oxydation l'acide
déhydroascorbique (deux électrons échangés) un couple électrochimique
rédox quasi réversible. En solution aqueuse, il libère deux protons pour des
Introduction
- 68 -
pKa de 4,17 (pKa1) et 11,57 (pKa2), et montre une oxydation aisée à des
potentiels positifs proches de 0,0 V. Interférent classique, il se présente dans
de nombreux fluides biologiques, jus de fruits, produits d'alimentation,
formulations pharmaceutiques… L'emploi de membranes à perméabilité
sélective ou garnies de charges négatives répulsives, ou l'application d'un
prépotentiel d'oxydation dans les systèmes en flux prévient de son effet.
2. L'acide urique: produit de dégradation des protéines, et préférentiellement
présent dans les urines, mais aussi dans le sang et les tissus, il s'oxyde aussi
pour des potentiels positifs de faible valeur; la préservation du biocapteur
s'effectue via des stratégies identiques à l'acide ascorbique.
3. Le paracétamol (acétaminophène): analgésique d'usage courant, présent
dans les fluides biologiques, son oxydation réversible en une quinoneimine a
lieu à des potentiels légèrement supérieurs à l'acide ascorbique et à l'acide
urique, mais possède une plus grande capacité de pénétration au travers des
membranes [30].
3.5.2.6 Biocapteurs et biotransformation de xénobiotiques: tendances et
perspectives .
Face à la demande croissante en techniques modernes à fort potentiel de
développement, les biocapteurs par leur capacité à surmonter certains désavantages
des méthodes conventionnelles constituent une intense veine de recherche [125].
Fusion de la sensibilité et de la spécificité des systèmes vivants et de la puissance
de traitement de la microélectronique, ils fournissent en temps réel des informations
de haute pertinence [126]. Les progrès réalisés à chaque instant dans l'amélioration
de la couche de perception du signal et des modes de transduction pavent la voie
d'une miniaturisation plus poussée encore [80]. Monolithiques par définition, leur
petitesse embrasse la volonté sans cesse accentuée de la réalisation de mesures
bioanalytiques aisées à mettre en oeuvre. Sortir du confinement du laboratoire,
réduire l'espace temps entre le prélèvement de l'échantillon et l'action, constituent les
soucis majeurs des multiples domaines qui exploitent déjà en routine cet outil peu
coûteux, propre et peu exigeant en prétraitement de l'échantillon: diagnostic clinique,
analyse environnementale, contrôle de qualité et sécurité de la nourriture, contrôle
Introduction
- 69 -
des procédés de fermentations et défense militaire. Aucunement confiné au rang
d'unité isolée, les biocapteurs peuvent s'intégrer dans un ensemble instrumental plus
important ou un concept d'analyse plus vaste. En effet, ils s'immiscent depuis
quelques années dans le criblage pharmaceutique. Le besoin vital et accru de
moyens performants (cfr point 2.) d'évaluation de qualité de l'interaction médicament-
récepteur et des données ADME/tox met en lumière les biocapteurs, petits dispositifs
au matériel d'origine biologique incorporé. Confrontés à des molécules de tout
horizon (chimique, naturel, bases de données combinatoires), et à la superposition
de plusieurs disciplines scientifiques (médecine, pharmacie, biologie, chimie) les
biocapteurs destinés au criblage de composés d'intérêt pharmaceutique présentent
une conception plus complexe au regard de ceux utilisés en routine et adressés à
une substance dans une matrice spécifique [83, 126-128].
Les premiers biocapteurs mis en œuvre dans ce but, de nature enzymatique,
exploitent l'ampérométrie. Ils permettent la détermination de composés spécifiques
ou de molécules membre d'une famille plus large tels des dérivés de la pénicilline,
des dérivés cyanogénés, des polyphénols…[83] Deux autres formes récentes de
transductions démontrent un impact considérable en pharmacologie et exploitent des
phénomènes optiques et acoustiques. L'intérêt premier de ces deux méthodologies
intervient par le fait de ne requérir aucun marquage tant du substrat que du récepteur
cible. La première approche repose souvent sur l'exploitation de l'effet de résonance
plasmonique de surface (SPR) tandis que la seconde utilise les propriétés
piézoélectriques d'un quartz vibrant. L'une et l'autre suivent l'interaction entre les
composés en temps réel. Une large gamme d'espèces (bactéries, virus, ADN,…) de
tout poids moléculaire, peut être analysée pour des valeurs d'affinités d'interaction
très basses et ce, sur des faibles volumes d'échantillons. Ils procurent également des
données relatives quant aux caractéristiques de la liaison au récepteur (pourcentage,
force), à la proportion active de l'échantillon, et quant à la description de la voie de
métabolisation. Utilisés en confirmation des essais préliminaires classiques, ils
accélèrent parallèlement le développement in vitro par une aide précieuse dans
l'élucidation du mode d'action. Leur rayon d'action les conduit à l'identification
d'unités pharmacophores, domaine plus général mais tout aussi important en
recherche de nouveaux médicaments. Les barrières physiologiques (tractus gastro-
intestinal/sang, hémato encéphalique), hauts lieux de l'adsorption passive ou active
Introduction
- 70 -
d'un composé, représentent des paramètres à apprécier. L'immobilisation de
vésicules lipidiques ou de membranes cellulaires à la surface de biocapteurs
optiques ou acoustiques permet l'évaluation de la fraction absorbée passivement de
manière comparable aux méthodes traditionnelles. Tout aussi fiables sont les
résultats obtenus du calcul du taux de fixation aux protéines plasmatiques. Cette
variable clef pour la détermination des profils pharmacocinétiques et d'activité
s'obtient de façon rapide (automatisation) et peu consommatrice d'échantillon. Via
ces données, l'expérimentateur détermine le temps de demi vie de la liaison protéine
sérique/médicament et de là une idée de son taux d'élimination. Les profils
ADME/Tox, facteurs critiques pour la biodisponibilité et l'efficacité, provoquent
fréquemment l'échec de nombreux candidats médicaments. Les biocapteurs
connaissent un impact grandissant dans l'estimation de ces paramètres. Bien que
peu de travaux associent biocapteurs optiques/acoustiques et enzymes de
métabolisation, les biocapteurs à quartz piézo-électrique s'adaptent particulièrement
bien aux criblages prédictifs de cytotoxicité [128].
La volonté d'élaborer des biocapteurs propres aux études de métabolisation contient
par essence même l'incorporation d'enzymes de métabolisation au rôle d'élément de
bioreconnaissance. Dès ce moment, vient à l'esprit l'intégration au rang de
biorécepteur, des enzymes de la famille CYP450, hémoprotéine aux nombreux
isoenzymes et responsable majeur de la métabolisation d'un nombre immense de
xénobiotiques et de bioactivation. Le placement d'un isoenzyme CYP450 sur un
biocapteur ampérométrique affronte deux difficultés techniques: (i) la complexité de
la mesure de l'activité enzymatique, (ii) la stabilité de l'enzyme très labile. Durant son
cycle catalytique le CYP450 nécessite la présence d'un donneur d'électron (NADPH
ou NADH), éventuellement d'un régénérateur de ces cofacteurs et d'O2. La première
génération de biocapteurs CYP450 remplit cette condition et mesure la
consommation de l'un des cofacteurs [129]. Les interférents présents ou les
concentrations faibles rendent ardues ces quantifications [130, 131]. Une alternative
consiste à apporter directement les électrons à la partie terminale oxydase par des
médiateurs réduits (type viologène). Leur potentiel rédox négatif les prédispose à
réduire le groupement prosthétique. L'approche ultime propose l'électrode elle-même
comme source immédiate d'électrons vers le centre rédox. Cet apport, libre de
médiateurs ou de partenaires rédox naturels permet de suivre le courant catalytique
Introduction
- 71 -
engendré [131]. Le transfert direct d'électrons rencontre cependant divers obstacles:
(i) immersion d'une protéine à groupement prosthétique et par conséquent
dépendance du transfert d'électrons à l'orientation de la protéine sur la surface de
l'électrode, (ii) dénaturation des protéines sur les surfaces métalliques et formation
d'une protéine isolante opposée à tout échange d'électrons [132]. Modifier
chimiquement la molécule protéique permet de toucher aux propriétés isolantes de la
couche externe et de rendre accessibles les centres rédox très souvent
profondément enfouis. Nombre de techniques d'immobilisation reprises au
paragraphe 2.5.2.4, sont utilisées pour l'immobilisation d'isoenzymes du CYP450 et
décrites abondamment par Bistolas et al. et Shumyantseva et al. [129-132]. Les
phénomènes de transfert d'électrons au travers de ces diverses matrices demeurent
peu clairs et encore un domaine à investiguer. De même, le besoin impératif
d'oxygène durant la réaction catalytique et sa propre réduction en parallèle à
l'électrode rend les mécanismes de réaction complexes à interpréter. L'ajout de
catalase (qui élimine H2O2, sous-produit de réaction) et/ou d'inhibiteurs dégrossit
cette complexité et favorise la compréhension [131]. D'une haute adaptabilité, les
biocapteurs ampérométriques CYP450 fonctionnent au sein de plusieurs dispositifs
électrochimiques: voltampérométrie cyclique, ampérométrie, potentiométrie et
électrolyse suivie d'un examen des produits générés par CL/SM [130, 131].
Aujourd'hui totalement fondues dans le paysage des biocapteurs, les électrodes
sérigraphiées3, attractives par leur faible bruit de fond, leur large gamme de
potentiels opérationnels et leur haute commodité aux modifications chimiques,
constituent l'étape suivante à franchir pour les biocapteurs CYP450 [132, 134] et leur
intégration in extenso dans l'arsenal analytique en sciences pharmaceutiques. Leur
3 Electrodes sérigraphiées: véritables miniaturisations d'un biocapteur, elles autorisent la production
de masse rapide, simple et reproductible de biocapteurs électrochimiques. Cette technique consiste
en la déposition d'encres électrochimiquement actives modifiées sur un support inerte en un film
mince de motif, de taille et d'épaisseur contrôlés. Appelés à un usage unique, ces biocapteurs
manifestent plusieurs avantages: aucun risque de contamination, élimination des problèmes de perte
de réponse liés à un encrassage de l'électrode ou une dénaturation de l'enzyme et prix de revient
faible. Par ces particularités et la foule d'applications concevables, ces électrodes sérigraphiées
rencontrent les défis du criblage haut débit. La réduction d'échelle qu'elles proposent associée à une
réponse en temps réel élargit leur niche d'exploitation au test hors laboratoire, sur site [95, 133].
Introduction
- 72 -
spécificité, non directement dirigée vers un substrat, mais très large, se met
avantageusement à profit pour la production de capteurs multi-canaux via la
technologie de sérigraphie. Les réponses fournies par chacun des canaux adressés
un à un par un isoenzyme autorisera par compilation, la détection simultanée d'un
éventail ample de composés [129].
Dès maintenant estimés pour leurs qualités analytiques (temps de réponse, fenêtre
de calibration, limite de détection, sensibilité, stabilité opérationnelle, temps de vie),
les biocapteurs ampérométriques CYP450 demandent encore des travaux
d'optimisation de la stabilité. L'instabilité propre aux enzymes s'exprime plus
vigoureusement dans le cas du CYP450 et en fonction de son origine (membranaire
microsomial, mitochondrial, bactérien). Malgré l'intervention d'agents de stabilisation
(par ex. le glycérol) ces biocapteurs appartiennent au type de biocapteurs dits à
usage unique, jetables à l'inverse des biocapteurs dits "réutilisables" [129, 132] .
Les biocapteurs moléculaires (enzyme, anticorps, ADN,…) axés sur une molécule
cible peuvent dans certaines situations ne pas déceler des composés voisins. Les
biocapteurs à base de cellules vivantes, surmontent ces limitations. Capables
d'informer à la fois qualitativement et quantitativement de la présence d'un composé
x, l'attrait principal des biocapteurs à base de cellules réside en leur faculté à
procurer une réponse fonctionnelle, et analytique. L'aptitude à transmettre la réaction
induite par un stimulus sur un système vivant trouve de nombreuses zones d'intérêt
(pharmaceutique, cosmétique, agro-alimentaire, environnement) et permet de
répondre à des questions requérant une connaissance de l'effet physiologique
provoqué. Quel est l'effet de tel agent pharmaceutique sur un système physiologique
? Est-il agoniste ou antagoniste ? Est-il toxique ? La réponse en temps réel d'un
biocapteur à base de cellules tient compte avantageusement de la fraction dissoute
du composé cible mais aussi de la partie insoluble et donc conséquemment de sa
biodisponibilité. Le taux d'activité du métabolisme énergétique, véritable caisse de
résonance de toute action sur les cellules, constitue fréquemment l'objet même de la
mesure au travers de divers paramètres tels: pH, consommation d'O2 et production
de CO2, potentiel rédox, production de lactate, microcalorimétrie. Alternative,
l'évaluation d'une caractéristique intrinsèque de certains types de cellules se tient par
mesure du potentiel électrique dans le cas de cellules nerveuses, ou d'une
bioluminescence naturelle ou induite pour des cellules bactériennes par exemple.
Les biocapteurs à base de cellules se soumettent facilement à une miniaturisation (et
Introduction
- 73 -
à l'automation par usinage de plaques multipuits et de dispositifs multicanaux) et
consomment moins d'échantillon et/ou de cellules pour une sensibilité plus grande et
un meilleur temps de résolution [135, 136].
Le dépôt unique [137] ou en très petite quantité de cellules (bactériennes,
champignons, animales, végétales) sur la surface du transducteur exige de leur part
une grande pureté [138]. Les difficultés et défauts initiaux (maintenance et temps de
vie) disparaissent peu à peu par l'effet des progrès réalisés en techniques de
cultures cellulaires. Compromis entre système purement in vitro et organisme
intégral, la (les) cellule(s) représente(nt) une approche plus fidèle de la complexité de
l'environnement in vivo [137]. Les avantages à l'usage de cellules complètes en lieu
et place d'enzymes isolés incluent: (i) apport interne large de biocatalyseur, (ii) usage
d'une voie métabolique complète dans les conditions naturelles optimales, (iii)
stabilité enzymatique accrue, (iv) possibilité d'utiliser des systèmes enzymatiques
non disponibles de manière isolée [139].
Une famille de transducteurs convient particulièrement bien au dépôt d'un système
monocellulaire; les FET (transistor à effet de champ). L'entité cellulaire4 se place sur
la surface du FET, qui accepte dès lors le déroulement de processus biochimiques
complexes (transfert d'électrons, réaction rédox) ou détecte de faibles variations de
pH à l'interface électrode/cellule. Les variations enregistrées sont à mettre en rapport
avec l'activité métabolique des cellules immobilisées [140-142].
L'expérience démontre la possible divergence de comportement entre une
monocouche de cellules cultivées sur la surface d'une électrode et une coupe d'un
même organe. Les cultures tissulaires en trois dimensions connaissent un certain
succès depuis peu, par leur contexte quasi équivalent des conditions physiologiques
(protéines, enzymes, cofacteurs), elles reflètent de manière optimale l'activité
métabolique. Ces tissus autoorganisés, autoactivés, et autonomes fournissent une
réponse directe et voisine de la situation in vivo. Leurs désagréments majeurs
proviennent des difficultés rencontrées à positionner de manière adéquate la culture
3D sur le support, à obtenir un temps de vie satisfaisant et en la possession
suffisante de stocks d'animaux. Un modèle tissulaire multicellulaire sphérique en trois
4 Les cellules nerveuses par leur richesse en récepteurs et en canaux ioniques sont du plus grand
intérêt à des fins de criblage médicamenteux via stimulation ou blocage. Des cellules épithéliales, des
fibroblastes, des lymphocytes T ou B s'emploient également [83].
Introduction
- 74 -
dimensions, mis au point par Thielecke et al., élimine ces inconvénients et offre des
conditions de simulation de la situation in vivo propice à l'étude tant de mécanismes
biologiques (prolifération, différenciation…) que de nouveaux agents thérapeutiques.
La géométrie précisément définie de ces sphères s'insère de façon appropriée dans
un montage capillaire aux bornes duquel l'impédance mesurée témoigne de l'effet
observé. Installé en mode multicanaux, ce dispositif laisse envisager des travaux de
criblage par mise en place de différents tissus (hépatiques par exemple) ou de
substrats [143].
Les métabolites de xénobiotiques (médicaments, polluants lipophiles…) générés par
le cytochrome P450 dans les foies de mammifères provoquent des dommages au
matériel génétique [144]. Les réactions entre ces métabolites et l'ADN conduit à des
changements structuraux, marqueurs potentiels de maladies génétiques ou de la
toxicité d'un xénobiotique nouvellement développé. Adénine et guanine, bases
impliquées dans la réaction d'oxydation, fournissent un signal électrochimique
amplifié dans le cas d'un ADN simple brin ou ADN chimiquement endommagé (perte
de la protection de l'ADN double brin). Récemment, Rusling et al. ont mis en œuvre
des biocapteurs multicouches qui génèrent en premier lieu, au sein de la couche
enzymatique (CYP450), le métabolite toxique, suivi de l'interaction avec la couche
chargée en ADN et détection des dommages éventuels à celui-ci. Dans la majorité
des cas, les détériorations à l'ADN proviennent du métabolite et non de la molécule
parent. Forts de cette caractéristique, les biocapteurs couche à couche
ADN/CYP450 sous réserve de nombreuses optimisations (application à des
échantillons biologiques, meilleure sensibilité, validation), s'apparentent aux
biocapteurs toxicologiques du futur [145, 146].
Introduction
- 75 -
3.5.3 Couplage de l'électrochimie à la chromatographie liquide et à la spectrométrie de masse.
Unies pour la première fois au début des années septante, l'électrochimie (EC) et la
spectrométrie de masse (SM) connurent une lente évolution. L'intention voici quinze
ans de combiner la capacité de l'électrochimie à imiter les réactions de métabolisme
(analogie vis-à-vis de la voie principale de métabolisation; le système cytochrome
P450, particulièrement les réactions de phase I avec oxydation à échange d'un
électron) et les performances analytiques de la spectrométrie de masse, stimula peu
à peu la recherche dans cette voie. Une instrumentation de qualité insuffisante
initialement et l’engouement des scientifiques envers les techniques de biologie
moléculaire rendirent difficile sa popularisation. Les derniers développements
technologiques et les nouveaux défis de la recherche pharmaceutique actuelle
(points 2. et 3.1) revoient à la hausse les techniques instrumentales hybrides dans
l'étude fondamentale des mécanismes de métabolisation [11, 147, 148]. Diverses
équipes proposèrent différents dispositifs électrochimiques d'oxydation du/des
composé(s) sous étude : cellule électrochimique construite "maison", en couche
mince ou Coulochem5 et intégrée dans divers schémas de montage [11, 13, 47, 49,
149]. L'opportunité de combiner "on-line" une cellule électrochimique et la
spectrométrie de masse offre la possibilité de l'identification de produits d'oxydation
avec un maximum de certitude. Un modèle récent de cellule électrochimique en
graphite poreux permet une conversion à un haut degré d'efficience (>95%), elle
supporte les flux de hautes pressions (Figure 1.27) [48]. Différentes associations
alternatives apparaissent: IF-CE-SM, CL-CE-SM, CE-CL-SM [150, 151]. Grâce à un
volume mort faible, un temps de résolution court et la compatibilité avec la
spectrométrie de masse, ces techniques hybrides autorisent l'identification des
produits d'oxydation mais aussi d'éventuelles espèces instables. Les mesures
peuvent être accompagnées ou non d'une séparation chromatographique pré ou post
électrolyse.
5 Coulochem®: dénomination commerciale de différentes cellules électrochimiques de design varié et
pour applications multiples (http://www.esainc.com).
Introduction
- 76 -
Figure 1.27 Dispositif CE/SM avec vue détaillée de l'électrode à haut taux de
conversion en graphite poreux [48].
Technique purement instrumentale, la CE/SM mime de manière assez fidèle les
réactions de phase I : N-déalkylation, oxydation des thiols, des alcools,
déshydrogénation,… Apte à identifier les sites moléculaires sensibles d'oxydation
potentielle, elle ne dispense cependant aucune information quant à la distribution
ortho, méta, para des substituants. L'ajout de glutathion (non électroactif au potentiel
appliqué) dans le milieu rend possible l'étude des métabolites de phase II. En aucun
cas capable de simuler l'intégralité des réactions biologiques, l'association CE/SM
vient se placer en soutien des méthodes existantes d'étude de métabolisme. La
facilité de mise en œuvre, le coût relativement peu onéreux de l'électrochimie et la
rapidité de réponse installent la CE/MS dans une position stratégique en tant qu'outil
de prédiction et de filtration précoce, compétent dans l'établissement et le choix des
directions à suivre pour l'exploration des voies métaboliques inconnues d'un
xénobiotique [11, 47, 48, 147].
Introduction
- 77 -
4 Molécules étudiées.
4.1 Les phénothiazines.
Classe médicamenteuse majeure, les phénothiazines regroupent autour d'un noyau
de base tricyclique quelques dizaines de composés. Cette structure de base
hydrophobe, varie en ordre principal au niveau des positions deux et dix. Différents
substituants peuvent venir se placer sur l'azote (10) et constituer une queue
hydrophile: soit un groupement alkylpipérazine, soit une chaîne aliphatique avec une
fonction amine [152, 153].
Largement utilisées pour de nombreuses indications thérapeutiques, du traitement
des maladies psychotiques (schizophrénie ou autres), jusqu'à l'utilisation en tant
qu'antihistaminique, antiémétique, anesthésique, etc [154] les phénothiazines
suscitent aujourd'hui énormément d'intérêt dans d'autres voies innovatrices. De
manière non exhaustive, l'on note des recherches destinées à identifier (i) une action
antioxydante protectrice par inhibition de la peroxydation lipidique et par voie de
conséquence, thérapie potentielle dans le traitement de la maladie de Creutzfelt-
Jacob régie par le stress oxydatif du prion [155, 156], (ii) des effets cytostatiques in
vitro et in vivo, effet antiprolifératif sur des tumeurs cellulaires, interaction au niveau
de la différentiation cellulaire [157, 158], (iii) une activité anti-inflammatoire [158], (iv)
une alternative dans la lutte contre les (multi)résistances aux antibiotiques par le
biais de propriétés antibiotiques intrinsèques ou par action synergique avec d'autres
agents antibactériens, antimycosiques ou antiparasitaires. Ce dernier aspect peut
s'avérer primordial face à la recrudescence des maladies infectieuses dans le
contexte épidémiologique planétaire du sida et des polyrésistances très souvent
rencontrées face aux molécules antibiotiques conventionnelles [159-165], (v) une
activité antimalarique originale par son mode d'action [166, 167], (vi) une intervention
contre le mal du voyage spatial par élimination des symptômes consécutifs à une
exposition à l'hypogravité. La modification éventuelle des données
pharmacocinétiques pendant ou suite à un vol spatial est également étudiée [168-
170].
Métabolisés intensivement par l'intermédiaire de nombreuses voies, les dérivés
phénothiaziniques retirent, dans la majorité des cas, l'effet clinique escompté via la
forme active que sont leurs métabolites [171]. L'un des principaux chemins
Introduction
- 78 -
métaboliques est le CYP450, il module la N-déméthylation de la chaîne latérale, la sulfoxydation de la position 5 et l'hydroxylation et la N-oxydation du noyau aromatique [172, 173]
Bien que les modes d'action exacts des nouvelles indications citées ci-dessus et les
biomécanismes responsables des toxicités développées ne soient pas encore
pleinement élucidés, l'oxydation du noyau phénothiazine en son radical cation est
communément admis en tant que première étape essentielle de l'oxydation .
Ce radical cation relativement stable donne naissance aux formes sulfoxydes et
hydroxylées [174].
Parmi les effets secondaires les plus souvent cités, nous trouvons:
sédation [170, 172, 174]
hypotension [175]
toxicité cardiaque [175]
blocage des canaux Ca++/ K+ activés [176]
troubles des fonctions endocrine, et reproductive [174]
phototoxicité et photoallergie [177]
tératogènicité [174]
diskynésie, agranulocytose [156]
4.1.1 La prométhazine.
Les phénothiazines se distinguent entre elles par la diversité de leurs substituants,
qui définissent une structure chimique globale et par conséquent une activité
pharmacologique et l'emprunt d'un chemin métabolique en particulier [172]. Souvent
évoquée, la longueur de la chaîne latérale entre les deux azotes semble porter la
responsabilité de comportements différenciés entre les différentes molécules [174,
178]. Nous avons choisi d'étudier les devenirs de deux molécules représentatives de
cette singularité: la prométhazine (deux carbones entre les deux azotes de la chaîne
latérale, Figure 1.28) et la promazine (trois carbones entre les deux azotes de la
chaîne latérale). Isomère de constitution de la promazine, la prométhazine s'utilise en
première intention pour son activité antihistaminique H1 ou sédative.
Introduction
- 79 -
S
N
CH2
HC
NH3C CH3
CH3
76 4
3
2
198
Figure 1.28 Structure de la prométhazine.
Dans le cadre de ce travail, et afin de tenter de généraliser nos observations, une
phénothiazine au profil structural similaire à la prométhazine a fait l'objet des mêmes
investigations: l'éthopropazine qui possède une chaîne latérale:
R= -CH2-CH-N-(CH2-CH3)2
CH3
4.1.2 La promazine.
Bloqueur le plus faible des récepteurs dopaminergiques D2 et sérotoninergiques 5-
HT2 parmi les neuroleptiques phénothiaziniques, la promazine (Figure 1.29), est un
antagoniste fort des récepteurs adrénergiques α1 et histaminiques H1 qui s'utilise
comme neuroleptique modéré dans la thérapie de psychoses d'origines diverses
[172]. Membre éminent de l'avant-garde des neuroleptiques mis en évidence aux
prémices des années cinquante, elle changea l'optique de l'abord de la
schizophrénie sur le plan pharmacologique et révolutionna les voies de recherche et
de synthèse de nouveaux agents thérapeutiques dans ce domaine [179].
Introduction
- 80 -
S
N
CH2
CH2
H3C CH3
CH2
N
Figure 1.29 Structure de la promazine.
Les antipsychotiques classiques ou dits traditionnels réfèrent au terme neuroleptique
par leur action au niveau neuronal. Essentiellement actifs pour les aspects
psychotiques de la schizophrénie ou d'autres psychoses, aucun lien démontré ne
statue d'une relation étroite entre leur activité neuronale et efficacité antipsychotique
[180].
Dans une approche comparable à la prométhazine, une molécule au même nombre
de carbones présents dans la chaîne latérale a été étudiée lors de l'étude de la
promazine: la triméprazine:
R= -CH2-CH-CH2-N-(CH2-CH3)2
CH3
Introduction
- 81 -
4.2 Les dibenzoazépines.
4.2.1 La clozapine.
Tête de pont de la seconde génération d'antipsychotiques, la [8-chloro-11-(4-méthyl-
1-pipérazinyl)5H-dibenzodiazepine] connue sous le nom de clozapine, est un
neuroleptique atypique développé dans les années soixante (Figure 1.30).
N
N
R
Cl
HR = N N H
R = N NCH3
OR = N N CH3
Clozapine
N-desmethyl-clozapine
Clozapine N-oxide
1
43
5
6
8
7
2
910
Figure 1.30 Structure de la clozapine et de ses métabolites majeurs étudiés lors de
notre travail.
Très vite utilisée chez les patients schizophréniques réfractaires aux neuroleptiques
classiques (typiques), par montre d'une efficacité substantiellement accrue vis-à-vis
des symptômes psychopathologiques (symptômes positifs et négatifs)6, cette
molécule démontre moins d'effets secondaires extrapyramidaux que les
antipsychotiques de première génération (APG). Leur qualificatif "atypique" découle
de cette caractéristique. Trente à soixante pour cent des patients qui ne répondent
6 Symptômes positifs: aspect le plus spectaculaire de la schizophrénie, ils s'expriment par une
exacerbation des fonctions normales: idées délirantes, hallucinations et discours désorganisé.
Symptômes négatifs: ils regroupent cinq symptômes cette fois considérés comme réducteurs des
fonctions normales (inexpression émotionnelle, réduction et pauvreté de l'expression orale, manque
de volonté, anhédonie, troubles de l'attention) en fonction de leur origine, soit partie intégrante de la
pathologie schizophrénique ou soit induits par le traitement médicamenteux ils seront dits primaires ou
secondaires [179].
Introduction
- 82 -
pas aux APG connaissent une amélioration lors de l'usage de la clozapine et une
diminution de leurs effets secondaires tels que extrapyramidaux, dyskinésie tardive,
et élévation de la prolactine [181-184]. La clozapine présente un profil
pharmacologique complexe multipliant les interactions avec nombre de récepteurs.
La plus souvent citée est l'activité antidopaminergiques D4 [179, 185]. Par contre, un
point négatif important réside en sa toxicité, avec risque d'apparition d'une
agranulocytose7 aigue. La mise sous traitement du patient nécessite une surveillance
hématologique constante dont la fréquence dépend de la durée du traitement et de la
stabilité de la formule sanguine. D'autres effets secondaires sont connus, dont une
cardiotoxicité potentielle sérieuse. De ce fait l'usage clinique de la clozapine se
restreint aux seuls patients intolérants ou résistants aux neuroleptiques traditionnels.
Cet inconvénient majeur associé à la difficulté d'établir des critères clairs de
réfractivité la conduisent à rester sous-utilisée dans de nombreux pays [180, 181,
188, 189]. La majorité des cas d'agranulocytose survient durant les six premiers mois
du traitement avec un risque plus important endéans les trois premiers mois. Le
mécanisme physiopathologique de cette agranulocytose induite par la clozapine
demeure irrésolu mais quelques suggestions existent: (i) réactions immunologiques,
(ii) un facteur génétique, (iii) cytotoxicité des métabolites [181]. La toxicité ne semble
pas s'exercer de manière directe vers les leucocytes polymorphonucléaires (PMN)
ou leurs précurseurs myéloïdes. La clozapine subit un métabolisme intensif chez
l'homme qui donne naissance à plusieurs espèces dont principalement la N-déméthylclozapine et la clozapine N-oxyde, métabolites stables. L'essentiel de
cette bioactivation se déroule via la voie hépatique et les isoformes du CYP450. La
conversion de la clozapine en espèces chimiques réactives fournit des interférents
potentiels avec les processus cellulaires essentiels. Dans le cas de la clozapine, les
cellules myéloïdes et les PMN sanguins périphériques participent pour une part à la
métabolisation. L'enzyme majoritairement présent dans les PMN est la
myéloperoxidase, apte à métaboliser la clozapine en un ion nitrénium, responsable
putatif de l'agranulocytose par interaction avec les macromolécules cellulaires et par
7 Agranulocytose: chute des polynucléaires neutrophiles circulants (doués d’une activité
antibactérienne) sous une valeur de 1000/mm3. Les agranulocytoses aiguës sont le plus souvent
d’origine médicamenteuse (40% des cas) donc réversibles [181, 186, 187].
Introduction
- 83 -
voie de conséquence d'une toxicité directe ou immunitaire indirecte [188, 190, 191].
Bien qu'il soit difficile d'établir un lien direct, on relie généralement les réactions
idiosyncratiques d'un médicament à une réponse immunitaire provoquée par les
métabolites engendrés in vivo. La cible de l'agranulocytose étant les neutrophiles et
les précurseurs des neutrophiles de la moelle osseuse, on suppose que la clozapine
est probablement oxydée en son métabolite réactif au sein de ces cellules qui induit
alors l'agranulocytose. Cette hypothèse n'exclut en rien une voie de toxicité directe
[192]. Sujet chaque jour de nombreuses publications, la clozapine suscite un intérêt
continu afin d'élucider et d'améliorer la compréhension de son mode d'action
pharmacologique, son métabolisme et les incidences qui en découlent. Son étude
constitue un point de départ à l'élaboration de nouvelles molécules analogues aux
propriétés pharmacologiques identiques mais aux effets secondaires moindres ou
nuls et par conséquent à des médicaments moins dangereux. Dans le cas de la
clozapine, un des objectifs est de synthétiser des analogues dépouillés de l'azote
(telles les molécules loxapine, clotiapine, fluperlapine), qui constitue un pont entre les
deux cycles. Cette innovation donnerait des molécules non métabolisées en ion
nitrénium réactif et non inducteur d'agranulocytose [179, 185].
Matériel et Méthodes
- 84 -
5 Matériel et Méthodes. Les détails méthodologiques des différentes techniques instrumentales utilisées
durant notre travail sont spécifiés dans le paragraphe matériel et méthodes de
chacun des articles publiés ou soumis.
• Electrochemical, Chemical and Enzymatic Oxidations of
Phenothiazines.
B.Blankert, H.Hayen,S.M. van Leeuwen, U.Karst, E.Bodoki, S.Lotrean,
R.Sandulescu, N.Mora Diez, O.Dominguez, J.Arcos, J.-M.Kauffmann.
Electroanalysis 17 (2005) 1501-1510
• Prediction of clozapine metabolism by on-line electrochemistry/liquid chromatography/mass spectrometry.
S.M. van Leeuwen, B.Blankert,J.-M. Kauffmann, U.Karst.
Analytical and Bioanalytical Chemistry 382 (2005) 742-750
• Horseradish peroxidase electrode for the analysis of clozapine. B. Blankert, O. Dominguez, W. El Ayyas, J. Arcos, and J.-M. Kauffmann.
Analytical Letters 37 (2004) 917-928
• Horseradish peroxidase immobilised carbon paste electrode based on peroxidation of clozapine for the study of thiols. B. Blankert, O. Dominguez, E. Bodoki, R. Sandulescu, J. Arcos, J.-M.
Kauffmann.
Electroanalysis, soumis.
Matériel et Méthodes
- 85 -
De manière globale, les principales méthodes utilisées sont:
• Electrophorèse capillaire en milieu micellaire couplée à un détecteur
spectrophotométrique UV-vis. (cfr article 6.1)
• Chromatographie sur couche mince en phases normale et inverse. (cfr
article 6.1
• Voltampérométrie cyclique à balayage linéaire. (cfr articles 6.1, 6.2, 6.3 et
6.4)
• Couplage en ligne : cellule électrochimique (CE)/chromatographie liquide
en phase inversée (CL)/spectrométrie de masse (SM), CL/CE/SM. (cfr
articles 6.1 et 6.2)
• Réalisation, mise au point et optimisation d'un biocapteur ampérométrique.
(cfr articles 6.3 et 6.4)
Résultats
- 86 -
6 Résultats.
6.1 Electrochemical, Chemical and Enzymatic Oxidations of
Phenothiazines.
B.Blankert, H.Hayen,S.M. van Leeuwen, U.Karst, E.Bodoki, S.Lotrean,
R.Sandulescu, N.Mora Diez, O.Dominguez, J.Arcos, J.-M.Kauffmann.
Electroanalysis 17 (2005) 1501-1510
Résultats
- 87 -
6.1.1 Introduction.
L’utilisation de phénothiazines en tant que médiateur rédox de l’enzyme peroxydase
de raifort, nous a montré un comportement très distinct pour deux phénothiazines de
structure similaire [193]. Etant donné le renouveau d’intérêt envers les
phénothiazines sur le plan pharmacologique, il nous a semblé opportun d’étudier
plus en avant le comportement rédox de ces molécules. L’analyse de la littérature
relative à l’oxydation des phénothiazines est bien fournie, cependant des
discordances sont observées quant au mécanisme d’oxydation de la prométhazine. Il
nous a paru dès lors intéressant de réinvestiguer le comportement oxydatif des ces
molécules. Trois modes d’oxydation (électrochimique, chimique et enzymatique), ont
été appliqués à l’étude de cinq phénothiazines de structure moléculaire semblable
(phénothiazine base (PHZ), prométhazine HCl (PMZT), promazine HCl (PMZ),
triméprazine HCl et éthopropazine HCl). La détection et l'identification des produits
générés ont été menées à l'aide de diverses méthodes instrumentales:
voltampérométrie cyclique (VC), électrophorèse capillaire micellaire (MEKC),
chromatographie sur couche mince (CCM) et chromatographie liquide (précédée ou
suivie d'une oxydation électrochimique (EC)) couplée à la spectrométrie de masse
(CL/SM, CL/EC/SM, EC/CL/SM).
L’oxydation chimique a été réalisée en milieu acide acétique en présence de
peroxyde d’hydrogène à 60°C pendant 30 min. Un oxydant puissant tel le persulfate
de potassium a été également mis en oeuvre ainsi que le couple acide
peroxyacétique/iodure de potassium.
L’oxydation enzymatique a été accomplie par immersion d’une bandelette d’acétate
de cellulose imprégnée d’enzyme réticulée (peroxydase de raifort (HRP)) dans la
solution de phénothiazine, en milieu tampon acétate et en présence de peroxyde
d’hydrogène ou par contact direct entre l'enzyme libre en solution et la phénothiazine
étudiée.
L’oxydation électrochimique a été effectuée à partir de microvolumes de solutions
« déposées » sur une électrode de carbone vitreux et, pour des quantités plus
importantes de phénothiazines (mg), sur une électrode de platine de grande surface.
Les oxydations électrochimiques en ligne ont été réalisées à l'aide d'une cellule
électrochimique en carbone poreux fournissant un rendement d'oxydation élevé
(proche de 100%). En fonction du schéma de montage désiré, cette électrode sera
Résultats
- 88 -
placée en amont ou en aval de la colonne de séparation chromatographique. Placée
en amont, une séparation chromatographique des produits de l’oxydation est
obtenue avant la détection par spectrométrie de masse. Cette configuration autorise
des identifications plus fines, mais ne permet pas la mise en évidence de produits
instables. Placée en aval, les produits issus de l’oxydation EC sont directement
injectés dans le spectromètre de masse avec identification possible d’espèces
instables.
La voltampérométrie cyclique de la prométhazine (PMZ) donne une courbe classique
d’oxydation d’une phénothiazine telle que décrite dans la littérature. Nous observons
un pic d’oxydation réversible à +0,50 V correspondant à l’arrachement d’un premier
électron avec formation du radical cation, suivie d’une seconde oxydation irréversible
à + 0.80 V, liée à la formation du dication qui très rapidement donne le sulfoxyde par
fixation d’une molécule d’eau. Des balayages multiples ne laissent entrevoir aucun
nouveau pic d’oxydation ou de réduction. Nous nous attendions au même
comportement en ce qui concerne la prométhazine (PMTZ), mais celle-ci fournit
durant le premier cycle un pic d’oxydation irréversible à +0,59 V et un épaulement à
+ 1,2 V. La haute amplitude du premier pic d'oxydation de PMTZ laisse supposer un
mécanisme plus complexe qu’un simple transfert monoélectronique avec
vraisemblablement plusieurs étapes d'oxydation. Durant le second cycle, en sus des
pics déjà mentionnés, deux nouveaux pics rédox réversibles sont détectés à -0,065
V et +0,36 V.
En vue de déterminer l’origine possible de ces deux nouveaux pics rédox, une
voltampérométrie cyclique de la PMTZ et de la PMZ a été réalisée en absence et en
présence de phénothiazine base. L’addition de phénothiazine base produit une
amplification des pics correspondants au couple rédox de la PMTZ. Cette
amplification est particulièrement marquée pour le pic d’oxydation qui présente un
profil caractéristique d’un pic d’adsorption. Dans le cas de la PMZ, l’addition de PHZ
donne naissance au couple rédox caractéristique à +0,36/-0,065V mais qui ne
correspond à aucun pic enregistré dans le cas de PMZ seule. Cette nette différence
des profils voltampérométriques entre la PMTZ et la PMZ ne peut être attribuée qu’à
la structure de la chaîne latérale. Nous pouvons donc suspecter, à ce stade du
travail, que l’oxydation de la PMTZ procède par une rupture de la chaîne latérale
avec libération de la phénothiazine base faiblement soluble (d’où l’allure du pic
d’adsorption) qui subit l’oxydation dans le pic de PMTZ (d’où une plus grande
Résultats
- 89 -
intensité du pic de PMTZ). L’électrooxydation de la PMZ n’induit pas la cassure de la
chaîne latérale, vu qu’aucune formation de phénothiazine base n’est remarquée au
niveau de la VC, elle fournit le seul sulfoxyde correspondant (voir ci-après).
L'électrophérogramme des solutions issues des oxydations électrochimique,
chimique et enzymatique comporte au moins deux pics attribuables à la molécule de
départ et au sulfoxide correspondant (PMZSO et PMTZSO). Nous notons également,
et en accord avec les observations en VC, l'apparition après oxydation
électrochimique et enzymatique de la solution de PMTZ, de deux nouveaux pics
identifiés à la PHZ et son sulfoxide (PHZSO).
L’analyse par CCM des produits issus des diverses oxydations permet également de
mettre en évidence un comportement de migration distinct. Les dérivés constitués du
seul noyau phénothiazinique (c'est-à-dire sans chaîne latérale) migrent dans la partie
supérieure de la plaque chromatographique. Les dérivés ayant conservé leur chaîne
latérale sont décelés dans la partie inférieure de la CCM résultat d’une interaction
forte entre l'azote tertiaire de la chaîne latérale et les groupements silanols de la
phase stationnaire. L'intégralité des spots appartenants aux solutions oxydées de
PHZ se situe dans la partie supérieure de la plaque et met en évidence deux
composés PHZSO et PHZQI (rose). La prométhazine, fournit des taches plus
nombreuses et partagées selon les deux structures décrites ; PMTZ et PMTZSO
dans la partie basse et PHZ, PHZQI et PHZSO dans la partie haute. La promazine
ne montre qu'un seul spot, probablement PMZSO, dans la partie basse de la plaque
chromatographique.
L’analyse du spectre de masse des produits d’oxydation électrochimique à +0,8V de
chacune des phénothiazines sans séparation chromatographique (EC/SM), montre
distinctement un profil simple dans le cas de la promazine : présence du sulfoxyde et
de promazine résiduelle. La prométhazine montre un schéma plus complexe : de
nombreux nouveaux composés apparaissent : la PMTZ résiduelle; le PMTZ
sulfoxyde ; le radical cation de la phénothiazine base (PHZ·+); la phénothiazine
quinone imine (PHZQI) ; la phénothiazine base sulfoxyde (PHZSO). Le couplage
EC/LC/SM permet de mettre en évidence le caractère plus hydrophile du sulfoxyde.
La PMZ produit uniquement son sulfoxyde. L’oxydation de PMTZ donne différentes
espèces bien séparées et attribuables à : PMTZ résiduelle, PMTZSO, PHZQI, et
PHZSO. Le radical cation (PHZ) n’est pas détecté car vu son instabilité, il est
décomposé durant le cheminement chromatographique.
Résultats
- 90 -
Les résultats relatifs à l’ensemble des molécules étudiées nous ont permis de
proposer un mécanisme d’oxydation général des phénothiazines en fonction de la
structure de la chaîne latérale. Ce processus d'oxydation peut être qualifié de
relativement complexe, il est à la fois pH et potentiel dépendant et fonction du
pouvoir oxydant des réactifs. D'une manière générale, nous avons dans un premier
temps, formation du radical cation et du dication très réactif. Ensuite, en fonction du
nombre de carbones situés entre les deux azotes, deux voies possibles se
présentent :
La voie A correspond aux molécules dont le modèle est la PMZ avec 3C entre les 2
azotes. La fixation d’une molécule d’eau donne naissance au sulfoxyde
correspondant.
La voie B correspond aux molécules type PMTZ avec 2C entre les deux azotes, et
comprend deux chemins parallèles: (i) d’une part la formation partielle du sulfoxyde
correspondant, d’autre part (ii) la rupture de la chaîne latérale, accompagnée de la
libération de PHZ, à son tour oxydée.
En conclusion, la combinaison de nombreuses techniques analytiques modernes
nous a permis d'affiner la compréhension des chemins d'oxydation clairement
différents entre les phénothiazines comportant 2 ou 3 carbones au sein de leur
chaîne latérale. Les résultats obtenus par VC, CCM, EC et couplage CE/SM ou
CE/LC/SM sont concordants et confirment le fait que : la PMTZ (2C) subit une
oxydation qui donne bien lieu à une rupture de la chaîne latérale avec libération de
phénothiazine base. Cette observation capitale est peu décrite dans la littérature et
nullement dans la littérature électrochimique. Il est difficile de comprendre les causes
réelles de l’éclatement de la molécule de PMTZ selon les conditions d’oxydation,
mais nous émettons l’hypothèse d’un encombrement stérique au niveau de la chaîne
latérale. Le caractère volumineux de celle-ci et sa proximité par rapport au noyau
tricyclique dans le cas de PMTZ par rapport PMZ pourrait en effet expliquer la
différence de comportement. Il est connu que l’oxydation des phénothiazines passe
par le stade radical cation coplanaire impliquant un mouvement de « flip flop » des
noyaux benzéniques. Celui-ci pourrait être empêché par des encombrements
stériques dans les cas des phénothiazines 2C ? La possibilité d’observer une rupture
in vivo de chaîne latérale des phénothiazines 2C et l’impact sur les propriétés
pharmacologiques et les effets secondaires très contrastés des phénothiazines nous
Résultats
- 91 -
semble être un domaine à ré-explorer à la lumière des résultats « in vitro » mis en
évidence dans notre travail.
Full Paper
Electrochemical, Chemical and Enzymatic Oxidations ofPhenothiazines
B. Blankert,a H. Hayen,b S. M. van Leeuwen,b U. Karst,b E. Bodoki,c S. Lotrean,c R. Sandulescu,c N. Mora Diez,d
O. Dominguez,e J. Arcos,e J.-M. Kauffmann*a
a Universite Libre de Bruxelles, Institut de Pharmacie, Laboratory of Instrumental Analysis and Bioelectrochemistry,Boulevard du Triomphe, Campus de la Plaine, CP 205/6, 1050 Bruxelles, Belgium*e-mail: [email protected]
b University of Twente, Department of Chemical Analysis and MESAþ Institute for Nanotechnology, P. O. Box 217,7500 AE Enschede, The Netherlands
c Universitatea de Medicina si Farmacie “Iuliu Hatieganu” Cluj-Napoca, Romaniad Universidade de Extremadura, Chemistry Department, Badajoz, Spaine Universidade de Burgos, Chemistry Department, Burgos, Spain
Received: December 16, 2004Accepted: January 10, 2005
AbstractThe oxidation of several phenothiazine drugs (phenothiazine, promethazine hydrochloride, promazine hydrochloride,trimeprazine hydrochloride and ethopropazine hydrochloride) has been carried out in aqueous acidic media byelectrochemical, chemical and enzymatic methods. The chemical oxidation was performed in acetic acid withhydrogen peroxide or in formate buffers using persulfate. The enzymatic oxidation was performed in acetate orammonium formate buffer by the enzyme horseradish peroxidase in the presence of H2O2. Molecules with, in thelateral chain, two carbon atoms (2C) separating the ring nitrogen and the terminal nitrogen, showed two paralleloxidation pathways, that is (i) formation of the corresponding sulfoxide and (ii) cleavage of the lateral chain withliberation of phenothiazine (PHZ) oxidized products (PHZ sulfoxide and PHZ quinone imine). Molecules with threecarbon atoms (3C) separating the two nitrogens were oxidized to the corresponding sulfoxide. The chemical oxidationof all the studied molecules by hydrogen peroxide resulted in the corresponding sulfoxide with no break of the lateralchain. Oxidation by persulfate yielded, for the 3C derivatives, only the corresponding sulfoxide, but it producedcleavage of the lateral chain for the 2C derivatives. The origin of the distinct oxidation pattern between 2C and 3Cmolecules might be related to steric effects due to the lateral chain. The data are of interest in drug metabolismstudies, especially for the early search. In the case of 2C phenothiazines, the results predict the possibility of an in vivocleavage of the lateral chain with liberation of phenothiazine oxidized products which are known to produce severaladverse side effects.
Keywords: Promethazine, Promazine, Phenothiazine, Oxidation, Voltamperometry, HRP, TLC, MEKC, LC/EC/MS
1. Introduction
Phenothiazines represent an important group of drugsuseful in the treatment of various diseases in human andveterinary medicines. Hundreds of compounds derive fromthe fundamental phenothiazine skeleton (PHZ). Pheno-thiazines are used for their antiemetic, antihistaminic,sedative, antipsychotic, neuroleptic, antiparkinson, analge-sic, local anesthetic, or preoperative anesthetic effects [1].The field of their applications is constantly growing withmany research pointing out new properties such as inhib-itory effect on lipid peroxidation [2], in vitro and in vivocytostatic effects, antiproliferative effect on many tumorcells, immunosuppressive properties, interaction with thecellular differentiation [3, 4], anti-inflammatory activity [4],intrinsic antibiotic activity or in synergy with existentantibiotics [5 – 7] and antimalarial activity [8]. The NASAuses phenothiazines to combat space motion sickness and isstudying any eventual modified pharmacokinetic behaviorin space [9, 10].
Phenothiazines, however, are known to induce variousadverse effects, such as endocrine alterations and cardiacand reproductive toxicity [11, 12]. The exact biochemicalmechanism(s) responsible for the development of toxicityphenomena is not clearly understood [13]. It is believed tobe related to the oxidation of the phenothiazines by removalof one electron at the nitrogen atom (N10)with formation ofa relatively stable cation radical [13, 14]. Phenothiazines areextensively metabolized by cytochrome P-450 isoforms inhuman liver giving rise mainly to ring-hydroxylated, S-oxidized and N-demethylated metabolites [15 – 17].The in vitro oxidation mechanism of these compounds,
particularly of the molecules promethazine (PMTZ) andpromazine (PMZ), by chemical [18, 19] electrochemical[20 – 25] and enzymatic [24 – 28] methods has been quiteextensively investigated. The oxidation pattern was report-ed to be dependent on the number of the carbon atomsseparating the twonitrogenatoms in the lateral side chain.Acleavage of the lateral chain was seldom reported during thechemical and enzymatic (HRP) oxidations of promethazine
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Electroanalysis 2005, 17, No. 17 I 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH&Co. KGaA, Weinheim DOI: 10.1002/elan.200403253
i.e., a molecule which possesses two carbons in the lateralchain separating two nitrogens (2C phenothiazines) [18].Actually parallel oxidation pathways were postulated withformation of PMTZ sulfoxide along with breaking of thelateral chain [18]. This was, however, not reported to occurby electrochemical oxidation, but aromatic ring hydroxyla-tion was suggested and PMTZ sulfoxide formation was notdetected [21, 22]. Other groups identified breaking of thelateral chain but no PMTZ sulfoxide formation [24].In the search for redox mediators for electrochemical
biosensor development, we identified several phenothia-zines as good substrates for electron transfer mediationbetween the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and theelectrode surface [28]. During these investigations, wenoticed the distinct behavior of PMTZ compared to itsstructurally related isomer PMZ.In the present work, taking into account the different
literature data and with the help of powerful hyphenatedinstrumental techniques [23], we reinvestigate the oxidationreaction mechanisms of several structurally related pheno-thiazines (Fig. 1). The molecules were oxidized by enzy-matic, chemical and exhaustive voltammetric means. Thedetection and identification of the products were performedby cyclic voltammetry (CV), micellar electrokinetic capil-lary electrophoresis (MEKC), thin-layer chromatography(TLC), liquid chromatography coupled to mass spectrom-etry (LC/MS), LC coupled to electrochemistry, and massspectrometry (LC/EC/MS) and electrochemistry coupled tomass spectrometry (EC-MS).
2. Experimental
2.1. Reagents
Phenothiazine (PHZ), promethazine hydrochloride(PMTZ), promazine hydrochloride (PMZ), trimeprazine
hydrochloride (TMP) and ethopropazine (EPP) hydro-chloride (Fig. 1) were from Sigma-Aldrich (Bornem, Bel-gium). The standard solutions of the compounds wereprepared at a concentration of 1.0� 10�3 M in 0.1 M acetateor formate buffer. The 0.1 M acetate buffer was preparedusing 0.1 M sodium acetate (Acros, Belgium) and 0.1 Macetic acid (Carlo Erba, Devos-FranÅois, Belgium). Thestandard solutionofPHZwasprepared at a concentrationof1.0� 10�3 M in methanol (Acros-Belgium) and diluted tothe adequate concentration with a borate buffer (0.05 M,pH 9.0) containing 10 mM sodium dodecylsulfate (SDS) forMEKC.The borax salt and SDSwere fromAcros (Belgium)and the hydrochloric acid fromMerck (Belgium).Hydrogenperoxide 30%w/v was fromVel (Leuven, Belgium). All thebuffers were prepared with doubly distilled and purifiedwater (Milli Q, Millipore system) and filtered through0.45 mm hydrophilic polypropylene membrane filters (Gel-man Sciences, Michigan, USA) before use. The solutionswere kept in the dark. Ammonium formate was fromAldrich Chemie (Steinheim, Germany) and formic acidfrom Fluka (Buchs, Switzerland) in the highest qualityavailable. Solvents for LC were acetonitrile “LiChroSolvgradient grade” from Merck (Darmstadt, Germany) andwater from Merck eurolab (Briare le Canal, France).Peroxyacetic acid (32% solution in dilute acetic acid;caution: strong oxidizer, dilute with water before mixingwith organic substances) was purchased from Sigma (De-isenhofen, Germany).
2.2. Apparatus
Cyclic voltammetry (CV) was performed in a conventionalthree-electrode system. A glassy carbon electrode (geo-metric active area: 3 mm diameter) served as workingelectrode, a platinum wire as auxiliary and a Ag/AgCl 3 MKCl reference electrode (BAS, West Lafayette IN-USA).The glassy carbon electrode (GCE) was manually polishedbefore use with an alumina suspension of 0.01 mm (BDH,England) and washed with doubly distilled and filteredwater. A universal potentiostat programmer Model 175(EG&G) and a polarographic analyser Model 174A(EG&G) connected to a graphical recorder Servogor XY(BBC GOERZ, Princeton, NJ, USA) were used for all thecyclic voltammetric studies. The pH of the investigatedsolutions was controlled by a pH-meter (Tacussel Minisis6000-France)Capillary electrophoresis was performed using a Spec-
traPHORESIS 100 system equipped with a modular in-jector, a high voltage power supply and a UV/vis spectro-photometric detector (Thermo Separation Products, Bel-gium) connected to a chart recorder Servogor 120 (BBCGOERZ). A fused silica capillary (75 mm i.d.) with a totallength of 65 cm was fromAlltech Associated, Inc, Belgium.The detector was placed 35.5 cm from the anode end of thecapillary.Absorbancewasmeasured through the capillary ata wavelength of 254 nm. Samples were introduced into thecapillary at the anodic end by a hydrodynamic injection forFig. 1. Schematic structures of the investigated phenothiazines.
1502 B. Blankert et al.
Electroanalysis 2005, 17, No. 17 I 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH&Co. KGaA, Weinheim
0.5 s. The temperaturewas kept constant at 25 8C. InMEKC,the capillary was first washed during 5 min with 1 Mphosphoric acid (Acros, Belgium). At the beginning ofeach day, the capillary was washed, during 5 min withpurified water and finally during 10 min with the boraterunning buffer. A separation voltage of 20 kV was applied.In order to improve repeatability, the capillary was rinsedafter each experiment with the running buffer during 5 min.All the solutions were filtered through Spartan 13/0.2 mmfilters (Devos-Francois, Belgium) before injection.Thin layer chromatography (TLC)was realizedwith 20�
20 cmplates of Kieselgel 60 F 254 S; layer thickness 0.5 mm,concentration zone 4� 20 cm (Merck, Belgium). Amixtureof acetone :ammonia 6 M (100 :2) served as the mobilephase for the separation of PHZ and PMTZ, and acetoni-trile :ammonia 6 M (100 :2) served for the separation ofPMZ and its oxidation compounds. The chromatographicchamber was saturated for a period of 30 min and one-dimensional ascending development was performed. Thevisual detection of the separated compounds was achievedusing a UV lamp (254 nm).For LC/MSmeasurements, the following equipment from
Shimadzu was used: SCL-10Avp controller unit, DGU-14Adegasser, two LC-10ADvp pumps, SIL-10A autosampler,SPD10AV UV/vis detector, LCMS QP8000 single quadru-pole mass spectrometer with electrospray ionization (ESI)and atmospheric pressure chemical ionization (APCI)probes, and Class 8000 software Version 1.20. As stationaryphase, a base deactivated Discovery RP-18 column fromSupelco (Deisenhofen, Germany) was used. Column di-mensions were 150� 3.0 mm (APCI-MS) and 150� 2.1 mm(ESI-MS). Particle size was 5 mm and pore size 100 S. Flowrates of the mobile phase were 0.6 mL/min (APCI-MS) and0.3 mL/min (ESI-MS). A binary gradient consisting ofacetonitrile andaqueous buffer (formic acid andammoniumformate with appropriate pH)with the following profile wasused:
time (min) 0.01 0.5 9 12 15 16 20
c (CH3CN) (%) 20 25 50 95 95 20 stop
The concentration of the organic phasewas not raised above95% to ensure the presence of a sufficient concentration ofthe base electrolyte. The injection volume was set to 10 mL.TheMS conditions were as follows. For all measurements,
the curved desolvation line (CDL) voltage �5 V, CDLtemperature 280 8C, deflector voltages 40 V and detectorvoltage 1.65 kV were used. The APCI experiments werecarried out with probe voltage 3 kV, nebulizer gas flow rate2.5 L/min and probe temperature 500 8C. The ESI param-eters were probe voltage 3 kV and nebulizer gas flow rate4.5 L/min.
2.3. Exhaustive Electrolysis
Batch electrochemical oxidation (ECOx) was performed ina microdroplet of sample by running multiple cyclicvoltammetric scannings at theGCE inupsidedownposition.The reference electrode was a Ag/AgCl wire and a Pt wireserved as auxiliary electrode and both dipped into thesample droplet. The electrolysis was carried out in 20 mL of5.0� 10�4 M phenothiazine derivative until the peak de-creased considerably (approximately 20 cycles). Aftermicroelectrolysis, 15 mL of solution were sampled with amicropipette and studied by TLC or MEKC. The samplewas diluted 10 times (PMTZ and PMZ), and 5 times (PHZ),using borate buffer and was homogenized by sonicationbefore analysis by MEKC.On-line electrochemical oxidation (EC) coupled to liquid
chromatography (LC) with photometric and mass spectro-metric detection was performed as follows: The electro-chemical instrumentation from ESA, Inc. (Chelmsford,MA, USA) comprised a GuardStat potentiostat and aModel 5021 conditioning cell and a Model 5020 guard cell.The conditioning cell was used for postcolumn oxidation.The guard cell was designed to withstand high pressures andwas used for the exhaustive oxidation of the injected sampleplug prior to liquid chromatographic separation. The work-ing electrode material was porous glassy carbon with a Pdcounter and a Pd/H2 reference electrode. For protection ofthe working electrode, a PEEK in-line filter (ESA, Inc.) wasmounted ahead of the electrochemical cell. Subsequentliquid chromatographic separation and diode array detec-tion (EC/LC/DAD) were performed on a Shimadzu (Duis-burg, Germany) HPLC-system consisting of: two LC-10ASpumps, a SUS mixing chamber (0.5 mL volume), a GT-154degasser unit, a SIL-10A autosampler and a CBM-10Acontroller unit with Class LC-10 software Version 1.6. and aSPD-M10Avp diode array detector. The guard cell wasmounted ahead of the LC column with a 3 cm PEEK line.Postcolumn electrochemical derivatization (LC/EC/MS)
was accomplished by inserting the conditioning cell betweenthe column and the interface of the mass spectrometer asdescribed earlier for the oxidation of ferrocene derivatives[34]. For precolumn oxidation, the guard cell was placedahead of the LC column.
2.4. Chemical Oxidation
An amount of 20.0 mg of phenothiazine (PHZ) was trans-ferred into a 10.0 mL, graduated flask. The molecule wasdissolved (suspended) in 1 mL of 15% v/v H2O2 methanolicsolution and 0.2 mL of acetic acid 0.1 M. After a reactiontime of 30 min in a water bath at 60 8C, the reaction mixturewas diluted to 10 mL with methanol. This solution wasdiluted 200 times with borate running buffer for MEKCanalysis, and diluted 100 times with 0.01 M acetate bufferpH 4.6 for CVanalysis.An amount of 32.3 mg of PMTZ or PMZ was transferred
into a 10.0 mL graduated flask. The PMTZ or PMZ was
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Electroanalysis 2005, 17, No. 17 I 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH&Co. KGaA, Weinheim
dissolved in 1 mLof 15%H2O2 solution and 0.2 mLof aceticacid. After a reaction time of 30 min in a waterbath at 60 8C,the reaction mixture was diluted to 10 mL with water. Thissolutionwas diluted 200 timeswith borate running buffer forMEKC analysis.The oxidation of promazine and promethazine (2.8� 10�4
M) with persulfate was performed in formate buffers atroom temperature and was monitored by visible spectro-photometry at 520 nm(PyeUnicam,PU86650, Philips-NL).The molecules were also oxidized in acetic acid 0.1 M in thepresence of hydrogen peroxide (15% v/v) at 60 8C and atroom temperature.The oxidation of the phenothiazines was also performed
by the couple peroxyacetic acid/ potassium iodide (PAA/KI) as follows: 0.4 mL phenothiazine derivative stocksolution (5 mM) was diluted to 1.6 mL buffer (20 mMammonium formate) and reacted in the presence of18.5 mM PAA and 7.5 mM KI [35]. The oxidation productswere identified by MS and LC-MS.
2.5. Enzymatic Oxidation
The enzymatic oxidation (ENZOx) of the phenothiazineswas performed with horseradish peroxidase (HRP) type II(Sigma-Aldrich) and with a HRP (EC 1.11.1.7) fromArthomyces rhamosus (Sigma) in the presence of hydrogenperoxide. The former enzyme was used immobilized onto acellulose acetate strip. Enzyme immobilizationwasmade bycross-linkingHRPwith 2.5%v/v glutaraldehyde (GA) fromAldrich in the presence of bovine serum albumin (BSA)from Merck. Briefly, two mg HRP and one mg BSA weredissolved in 50 mL of 0.1 M acetate buffer by mixingthoroughly and spreading on a glass plate. After additionof 50 mL of GA, the cellulose acetate strip was dipped in themix that was left at 5 8C for 1 h. Then 50 mL glycine solution(0.01 M;Merck) was added andmixed in order to react withany excess of GA. After the last rinsing with acetate buffer,this enzyme preparation was left at room temperature untildryness. The enzymatic oxidation was achieved by dippingthe strip in a solution of 2.0 mL5.0� 10�3 MPHZ(orPMTZor PMZ), 8.0 mL acetate buffer and 15 mL of H2O2 3% v/v.The oxidation by HRP from Arthomyces rhamosus was
performed as follows: 2 mL phenothiazine derivative stocksolution (5 mM) was diluted with 10 mL buffer (20 mMammonium formate pH 3) then addition of 0.1 mL of HRP(1 mg/L) and 12 mL of a 3% v/v H2O2 solution and stirringfor 30 min prior injection into the EC/MS setup.
3. Results and Discussion
3.1. Cyclic Voltammetry (CV)
All voltammograms started at 0.0 V towards positivedirection and reversing scan direction at 1.0 V. A 1.0�10�4 M solution of the analytes showed no significantdifferences using formate or acetate buffer as the supporting
electrolyte. In Figure 2, typical voltammograms for PMZ(Figure 2A) and PMTZ (Figure 2B) are reported.The oxidation of promazine (PMZ) showed, in the
investigated acidic media (pH 2 – 5), a well known electro-chemical behavior with removal of one electron to thecorresponding cation radical (peak O1) and subsequentremoval of a second electron giving the phenazothiazoniumion and formation of the sulfoxide PMZSO (peak O2). Athigher potentials (above 1.0 V), further oxidation of
Fig. 2. A) Typical CV of 1.0� 10�4 M PMZ, 0.01 M acetatebuffer, pH 4.6; methanol 10% v/v. GCE vs. Ag/AgCl 3 M KCl.Initial potential 0.0 V, positive potential scanning direction, scanrate 50 mV/s. First and second cycles. Third cycle¼ in the presenceof PHZ (1� 10�5 M) in the solution (dotted line). B) Typical CVof 1.0� 10�4 M PMTZ, 0.01 M acetate buffer, pH 4.6; methanol10% v/v. GCE vs. Ag/AgCl 3 M KCl. Initial potential 0.0 V,positive potential scanning direction, scan rate 50 mV/s. First andsecond cycles. Third cycle¼ in the presence of PHZ (1� 10 �5 M)in the solution (dotted line).
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PMZSO (likely at the tertiary nitrogen of the lateral chain)was inferred. By reversing the scan direction at 1.0 V, thereversible character of peak O1 was noticed (peak R1). Nonew peak formation was detected bymultiple scanning. Thesame CV pattern was observed for trimeprazine (TMP).The oxidation of promethazine (PMTZ) occurred atmore
positive potentials (ca. 150 mV more positive than proma-zine oxidation) showing only one irreversible peak (peakO5) (Figure 2 B curve 1). The high magnitude of the latter(higher than for a 2 electron process) suggests a complexprocess with subsequent oxidation steps. By reversing thescan direction at 1.0 V, two new reduction peaks (R4 andR3)and their corresponding oxidation peaks (O4 andO3, dashedline) were detected at potentials lower than oxidation peakO5. These new peaks correspond to molecules generated bythe oxidation of PMTZ (at O5) and which are more readilyoxidized than PMTZ. The same CV pattern was observedfor ethopropazine (ETPZ). This CV behavior of PMTZwasalready reported in the literature, with the new redox peakspostulated to be the di- (O3) and mono-(O4) hydroxylatedstructures of PMTZ [21, 22]. The formation of PMTZsulfoxide was not reported by these authors in the pH rangestudied, i.e., from 2 to 7 [22].Taking into account literature data mentioning the break
of the lateral chain during PMTZ chemical and enzymaticoxidations [18, 24], we initially performed the CV on thePMTZ solution (Figure 2B curves 1 and 2), then on the samesolution but spiked with PHZ (Fig. 2B curve 3 dotted line).Experiments were performed at the GCE in acetate bufferof pH 4.6 in the presence of 10% v/v methanol due to poorsolubility of PHZ. The addition of PHZ (1� 10�5 M) gaverise to a substantial increase of the intensity of the couplesO4/R4 andof peakO5 (Fig. 2B curve 3dotted line). The slight40 mV peak shift of peak O4 by raising the PHZ concen-tration is explained by the adsorptive characteristic of thePHZoxidationpeak. Spiking ofPHZwas also performedona PMZ solution (Fig. 2A curve 3). A new reversible peakwas detected at lower potentials than O1 and O2 whichcorresponded to PHZ behavior. The evolution of peakpotentials (O5, O4 and O3) was studied as a function of pH(formate buffer, pH range between 2 and 5) for PMTZ andEPP (Figures not shown). The oxidation peak O5 shiftedtowards less positive potentials by raising the pH (approx-imately 30 mV/pH). A good matching was obtained be-tween theCVpeaks of a pure solution of PHZand the peaksO3 and O4, suggesting that the latter corresponded to theredox pattern of phenothiazine (PHZ). A good matchingwas also obtained between the oxidation potential (O5) ofPMTZ and ETPZ suggesting a similar oxidation pattern forthe two derivatives.From these results, and considering our previous obser-
vation at carbon paste electrodes [28], we may infer thatPMTZ oxidation likely induced a breaking of the lateralchain with liberation of the phenothiazine nucleus (PHZ)giving rise to the redox couples O3/R3 (3-H-phenothiazine-3-one (PHZQI), see below) and O4/R4 (PHZ). Thishypothesis differs, however, from the electrochemical path-way reported in the literature [21, 22] but is in agreement
with literature data on the chemical and enzymatic oxida-tions of PMTZ [18, 24]. The electrooxidation of PMZ gaveno lateral chain breaking, since no formation of thephenothiazine molecule was detected by CV.
3.2. MEKC Identification of Oxidation Products
The nature of the oxidized products was elucidated fromtheir retention time ratio between standard compounds(PHZ, PMTZ, PMZ) and the resulting products.
3.2.1. Exhaustive Electrochemical Oxidation (ECOx)
The electropherogram of a 1.0� 10�4 M PHZ solutionissued from “micro”exhaustive ECOx at the glassy carbonelectrode in acetate buffer pH 4.5 gave two peaks. The firstpeak corresponded to phenothiazine sulfoxide (PHZSO),and the second to residual PHZ. With the PMTZ solution,four peaks were identified, namely, PHZSO, PHZ, prom-ethazine sulfoxide (PMTZSO), and residual PMTZ.Following PMZ oxidation, only two peaks were obtained,namely, promazine sulfoxide (PMZSO) and residualPMZ.
3.2.2. Oxidation by Hydrogen Peroxide (CHEMOx)
With PHZ, three peaks were detected in MEKC. Theycorresponded to residual H2O2, PHZSO, and residual PHZ.For a PMTZ solution, two peaks were obtained namelyresidual H2O2 and PMTZSO. Peaks corresponding to PHZand its oxidation products were not observed. PMZSO andH2O2 were the two peaks obtained for the PMZ oxidizedsolution.
3.2.3. Enzymatic Oxidation (ENZOx)
The same electropherogram profile as for the CHEMOxwas observed in the case of the PHZ solution. The PMTZsolution, gave three peaks namely, PHZSO, PHZ, andresidual PMTZ (no PMTZSO was detected). PMZSO andresidual PMZwere the two peaks detected after ENZOx ofthe PMZ solution.
3.3. TLC Identification of Oxidation Products
Twogroups of compoundsmigratedwith their spots situatedat the opposite sides of the TLC plate. The molecules withonly the PHZ nucleus (i.e., without lateral side chain) wereobserved in the upper part, while the PMTZ or PMZderivatives (i.e., with lateral chain) were in the lower part(Fig. 3). The strong retention of the latter was most likelydue to the basic tertiary nitrogen atom in the alkyl sidechain, which interacted with the free silanol groups of thestationary phase.By enzymatic oxidation of PHZ (PHZ, ENZ), two spots
attributed to PHZQI (red) and PHZSOwere observed. The
1505Oxidations of Phenothiazines
Electroanalysis 2005, 17, No. 17 I 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH&Co. KGaA, Weinheim
same was obtained after electrochemical oxidation (PHZ,EC), but some residual PHZ was still detected.Regarding PMTZ, in the lower part, a group of spots
corresponding to PMTZ (residual), and likely PMTZSO,was noticed for the three oxidationmodes. In the upper part,for EC and ENZ oxidations, spots due to PHZQI (red) andPHZSO were noticed. The EC row additionally showed aPHZ spot, because multiple EC cycling regenerated partlyPHZ from its cation radical. Interestingly, and in agreementwith previous results, the CHEM oxidation of PMTZ byhydrogenperoxide gave no visual color development andnospots in the upper part (i.e., no fission of the lateral chain).Only a pale, stable pink color was noticed by performing theperoxidation at 60 8C (Figure 4). Oxidation of PMTZ bypersulfate gave a pink color which intensified drasticallywith time to give a stable red color. This was followed at520 nmas a function of pH (Fig. 4) showing a high amount ofthe red species in acidic media (pH 3.2), in agreement withliterature [18]. In order to try to identify the nature of the redspot the scratched zone of the spot was dissolved in fewmicroliters of formate buffer of pH 4.5 and analyzed by CVat the GCE. The voltammogram gave one quasi reversibleredox peak near 0.0 volt corresponding to the couple O3/R3
(not shown). This behavior, along with the color of themolecule, are in favor of a quinoneimine structure i.e.,PHZQI [18, 29].Regarding PMZ oxidation by hydrogen peroxide (both at
60 8C and at room temperature), the solution became pinkbut the color vanished rapidly with time (behavior attrib-uted to the cation radical of PMZ) and only one spot was
Fig. 3. Thin layer chromatography of phenothiazine (PHZ) andpromethazine (PMTZ). Enzymatic (ENZ), electrochemical (EC)and hydrogen peroxide (CHEM) oxidation products.
Fig. 4. Absorbance of the promethazine solution after oxidation by persulfate (room temperature oxidation, ^) and hydrogenperoxide (oxidation at 60 8C, ~) as a function of pH. Formate buffer.
1506 B. Blankert et al.
Electroanalysis 2005, 17, No. 17 I 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH&Co. KGaA, Weinheim
detected in TLC likely corresponding to PMZSO. This peakwas not migrating due to the strong interaction of the basicside chain with the stationary phase (TLC data not shown).Oxidation of PMZ by persulfate gave a pink color (cationradical) which gradually disappeared.
3.4. EC/MS, EC/LC/MS, and EC/LC/DAD
These hyphenated techniques allow on-line oxidation andmass spectrometric detection (EC/MS), or on-line oxida-tion, separation, and detection (EC/LC/MS, and EC/LC/DAD).Experiments were realized in acidic formate buffers. The
studiedphenothiazineswith basic side chains (pKa around9)were protonated under the experimental conditions, allow-ing their detection under electrospray conditions in thepositive ionmode (ESI (þ)). Mass spectra recorded on-line,following EC oxidation at 0.8 V (vs. Pd/H2) are shown forPMZ (Fig. 5A) and for PMTZ (Fig. 5B). A more complex
pattern was noticed for PMTZ than for PMZ. The massspectrum contained many species which could readily beidentified by comparison with the oxidation of the moleculephenothiazine [23]. Under identical experimental condi-tions the latter gave, by EC/MS at all pH values, thecorresponding sulfoxide (m/z¼ 216.0), the cation radical(m/z¼ 199.0), the 3-H-phenothiazine-3-one (m/z¼ 214.0)plus a dimer of PHZwithm/z¼ 395.0 [23, 25]. The chemicaloxidation (PAA/KI) of PHZ produced at all pH values thePHZSO plus a small amount of 3-H-phenothiazine-3-one.The HRP oxidation in the presence of hydrogen peroxidegave the same species as for the EC/MS assay, except thatthe comparably instable cation radical at m/z¼199.0 wasnot detected.Figure 6 illustrates typical EC/LC/MS recordings for
PMZ (Fig. 6A) and PMTZ (Fig. 6B). The total ion current(TIC) and the extracted mass traces of the protonatedphenothiazines are shown. As noticed in Figure 6A, thePMZ electrooxidation produced the corresponding sulfox-ide (m/z¼301.1; Rt¼ 4.8 min) with some residual PMZ
Fig. 5. ESI-MS spectra of 50 mM PMZ (A) and 50 mM PMTZ (B) following on-line EC conversion. Formate buffer 20 mM, pH 3.
Fig. 6. LC/EC/APCI-MS chromatogram of 50 mM PMZ (A) and 50 mM PMTZ (B). Formate buffer 20 mM, pH 3.
1507Oxidations of Phenothiazines
Electroanalysis 2005, 17, No. 17 I 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH&Co. KGaA, Weinheim
(m/z¼285.1; Rt¼ 10.0 min)). PMTZ electrooxidation gaverise to several species, namely PMTZSO (m/z¼301.1;lmax¼ 235, 270, 300, 335 nm ; Rt¼ 4.6 min), residual PMTZ(m/z¼285.1; lmax¼ 240, 300 nm; Rt¼ 10.0 min), PHZSO(m/z¼216.0; lmax¼ 260, 320 nm; Rt¼ 7.3 min), 3-H-pheno-thiazine-3-one (m/z¼214.0; lmax¼ 225, 290, 380, 520 nm;Rt¼ 10.8 min) as well as an unidentified peak atm/z¼283.1(Rt¼ 9.0 min). The phenothiazine cation radical nucleuswas detected by applying EC/MS, but could not be detectedby EC/LC/MS as it was not stable enough and decomposedduring the LC separation. With the EC setup used, theconversion efficiency at the porous working electrodeshould typically be above 90% and residual PMZ orPMTZ should be low. Here, however, the amount ofdetected residual molecules was quite high (see peaks at285.1 in Figure 5A and B) and this fact is likely attributed tothe well-known disproportionation of the phenothiazinescation radical into the parent compound and the corre-sponding sulfoxide [21, 26].The detection of the PHZ nucleus by both EC/MS and by
EC/LC/MS excludes the possibility that this molecule couldoriginate from fragmentation of PMTZ during APCIionization. Thermal degradation of the sulfoxide in theAPCI interface (loss of oxygen,M-16)was observed since, atthe retention time of the sulfoxide, the m/z of the parentcompound was also obtained. This effect was not observedwith the ESI(þ) ionization mode as the thermal stress islower. These results are in agreement with the MEKC andTLC data above and confirm the fact that part of PMTZsuffered from lateral chain breaking and that part of PMTZwas oxidized to its corresponding sulfoxide.The molecules PMZ and PMTZ were studied by EC/MS
as a function of pH (3, 5 and 7) and at different appliedpotentials (results not shown).Both molecules were totally oxidized above 0.6 V. The
amount of PMZ sulfoxide was higher at pH 3, then it
decreased on raising the pH. Regarding the PMTZ oxida-tion, its sulfoxide formationwas higher at pH 3 than at pH 7.The cleavage of the lateral chain, as inferred from thedetection of phenothiazine sulfoxide (PHZSO), was higherat pH 7 than at pH 3. These results were in agreement withliterature data suggesting that hydroxide ions catalyze thechain cleavage [18]. The amount of quinoneimine (PHZQI)was slightly higher at pH 3 than 5 or 7. The PHZ cationradical was only detected at pH 3 because it is too unstableabove this value.Table 1 summarizes different oxidation modes applied to
the studied molecules and the resulting products identifiedby LC/MS. For TMP and PMZ, the three oxidation modesshowedonlyPMZSO(plus residualPMZ)at all investigatedpHvalueswith a slightly higher conversion rate at higher pHvalues. The chemical oxidation (PAA/KI) of PMZ pro-duced, at all investigated pH values, the correspondingsulfoxide and dioxygenated species, probably the sulfones,at long reaction times (several hours). The chemicaloxidation of PMTZ and ETPZ by hydrogen peroxide(PAA/KI) generated quasi quantitatively their correspond-ing sulfoxide i.e., no cleaved specieswasobtained,with smallamounts of dioxygenated species (most likely the sulfones)at longer reaction times. The enzymatic oxidation (by HRPin the presence of hydrogen peroxide) showed low con-version rates at pH 2 but higher rates at pH 3 and 4. Thecorresponding sulfoxides were obtained for TMP and PMZ.For PMTZ, the corresponding sulfoxide plus cleavedproducts (PHZSO, PHZQI plus an unknown species withm/z¼283.1) were obtained. The same pattern was obtainedfor ethopropazine (ETPZ) althoughananalogous substancetom/z¼283.1 was not observed. Electrochemical oxidationof the studied phenothiazines gave the same products as fortheHRPoxidation. TheEC/MSallowed the detection of theunstable PHZ cation radical (m/z¼199.0) for PMTZ andETPZ.
Table 1. Mass-to-charge ratios of the oxidation products identified by mass spectrometry (l: large peak, m: medium peak, s: small peak)
Method Trimeprazine (TMP)M¼ 298 Da
Promazine (PMZ)M¼ 284 Da
Promethazine (PMTZ)M¼ 284 Da
Ethopropazine (ETPZ)M¼ 312 Da
HRP 315 (l)299 (s)
301 (l)285 (s)283 (s)
301 (m)216 (m)283 (s)285 (m)214 (m)
329 (m)216 (m)313 (m)214 (m)
PAA/KI 315 (l)331 (s)
301 (l)317 (s)
301 (l)317 (s)
329 (l)345 (s)
EC/LC/MSESI(þ)
315 (l)299 (s)
301 (m)285 (m)
301 (m)216 (m)283 (s)285 (m)214 (m)
329 (m)216 (m)313 (m)214 (m)
LC/EC/MSESI(þ)
315 (l)299 (s)
301 (m)285 (m)
301 (m)216 (m)283 (s)285 (m)214 (m)199 (s)
329 (m)216 (m)313 (m)214 (m)199 (s)
1508 B. Blankert et al.
Electroanalysis 2005, 17, No. 17 I 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH&Co. KGaA, Weinheim
The present data, and some of our previous results on thevoltammetric oxidation of a 2C phenothiazine derivative,clearly point out a distinct pattern for the 3C and 2Cphenothiazine species [30]. The oxidation process is rathercomplex since it is pH and potential dependent, i.e., theoxidation products may be different depending on theoxidation power of the reagents used. The unique on-linecoupling between EC andMS allowed a better understand-ing of the oxidation pattern of phenothiazine derivativessince noextraction stepswith risks of loss anddegradationofproducts were encountered. It is clear that the 3Cmoleculesgave no removal of the lateral chain under the differentoxidation modes and pH studied, in agreement withliterature data, but produced mainly the correspondingsulfoxide [22, 24]. The 2C species, however, showed uponenzymatic and electrochemical oxidation two possibleparallel mechanisms, i.e., (i) fission of the lateral chain and(ii) formation of the corresponding sulfoxide. The latter,however, was not observed in the literature [24]. In the timescale of the experiments, we found no significant ringhydroxylation of the studied phenothiazines in agreementwith the HRP oxidation mechanism [24] and in contrast tocyclic voltamperometric interpretations [22]. The literaturedata on enzymatic oxidation are quite confusing andpostulate only sulfoxidation of PMTZ [2] or products issuedonly from cleavage of the PMTZ lateral chain [24]. The factthat the chemical oxidation of PMTZ (and ETPZ) byhydrogen peroxide gave no fission of the lateral chain but
formation of the sulfoxide could be attributed to a loweroxidation power of hydrogen peroxide (E8¼ 1.776 V vs.NHE) in contrast to persulfate (E8¼ 2.01 V vs. NHE). Ourresults point out promethazine sulfoxide formation andcleavage of the lateral chain thanks to the biocatalytic actionof the enzyme (HRP) in the presence of H2O2.It appears thus, that both cleavage of the lateral chain and
PMTZ sulfoxide formation may occur in parallel withdifferent kinetics and product ratios, depending on the pHand oxidation strength of the method.Figure 7 illustrates the general trends regarding the
oxidation of phenothiazines taking into account literaturedata and our results.Deprotonation of the terminal nitrogenof PMTZduring oxidationwas postulated as a phenomenonfacilitating the cleavage of the lateral chain during oxidationof 2C phenothiazine derivatives [22, 24]. In addition to thedeprotonation, the cleavage might be attributed to stericproblems due to the lateral chain [19, 31]. Actually, the arylrings of phenothiazine behave like butterfly wings [32]giving rise, by oxidation, to planar structures of the radicalcation and the phenazothionium ion (Fig. 7 pathway A).From three dimensional images of PMZ and PMTZ (notshown), we postulate that this movementmight be hinderedto some extent by the bulky tertiary nitrogen of C2derivatives. Oxidation of the latter would be possible,though, with the removal of the lateral chain via thephenazothiazonium mesomeric form (Fig. 7 pathway B).This might explain why the oxidation potential of PMTZ
Fig. 7. Schematic drawing of the postulated oxidation pattern of promethazine and promazine.
1509Oxidations of Phenothiazines
Electroanalysis 2005, 17, No. 17 I 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH&Co. KGaA, Weinheim
and EPP was higher by approx. 150 mV than the oxidationof TMP and PMZ and why stronger oxidizing reagentsresulted in cleavage of the alkylamine chain and generatedlow amounts of PMTZSO. The oxidation products identi-fied in our study of PMTZ are in close agreement with themechanisms reported by Underberg on the thermal degra-dation of PMTZ in the presence of oxygen, except that wecould not detect 10-methylphenothiazine [18].
4. Conclusions
The combination of a diversity of analytical approaches haspermitted new insight on the oxidation pattern of 2C and 3Cphenothiazines. The former are oxidized to the correspond-ing sulfoxide but may also suffer from a break of the lateralchain, depending on the oxidation strength of the techniqueand reagents used. Most importantly, our results havepermitted a reinterpretation of the cyclic voltammetry ofpromethazine and of the 2C phenothiazines in general. The3C derivatives yielded, upon oxidation, the correspondingsulfoxide and no cleavage of the lateral chain was observed.Surprisingly, except by one group [29, 33], the in vivoremoval of the aminoalkyl side chain of promethazine wasnot reported. It would be of great value to check for suchmetabolites since the generated species (phenothiazine,phenothiazine sulfoxide and 3-H-phenothiazine-3-one)have no psychotropic activity, but are physiologically andtoxicologically active [14]. We should also recall that the 2Cphenothiazines develop antihistaminic activity and show nopsychotropic activity in contrast to the 3C phenothiazines.Although the toxicological and pharmacological significan-ces of these in vitro findings remain to be established, it isworth evaluating if promethazine and ethopropazine chaincleavage occurs in vivo as well.
5. Acknowledgements
H. H., S. M. v. L. and U. K. thank the Nederlandse Organ-isatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO, The Ha-gue, The Netherlands) and the Fonds der ChemischenIndustrie (Frankfurt/Main, Germany) for financial support.
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1510 B. Blankert et al.
Electroanalysis 2005, 17, No. 17 I 2005 WILEY-VCH Verlag GmbH&Co. KGaA, Weinheim
Résultats
- 92 -
6.2 Prediction of clozapine metabolism by on-line
electrochemistry/liquid chromatography/mass spectrometry.
S.M. van Leeuwen, B.Blankert,J.-M. Kauffmann, U.Karst.
Analytical and Bioanalytical Chemistry 382 (2005) 742-750
Résultats
- 93 -
6.2.1 Introduction.
L'étude du comportement électrooxydatif de composés d'intérêt pharmaceutique à
l'aide de la voltampérométrie cyclique, délivre des données de haute utilité d'un point
de vue mécanistique. L'opportunité de combiner en ligne une cellule électrochimique,
la spectrométrie de masse et la chromatographie liquide offre aujourd'hui la
possibilité d’identifier les produits d'oxydation avec un maximum de certitude.
Différentes combinaisons sont possibles: FI-EC-MS, LC-EC-MS, EC-LC-MS. Par un
volume mort faible, un temps de résolution court et la compatibilité avec la
spectrométrie de masse, ces techniques hybrides autorisent l'identification des
produits d'oxydation mais aussi des espèces instables. Les mesures peuvent être
accompagnées ou non d'une séparation chromatographique pré ou post électrolyse.
Ces couplages EC/MS sont mis en œuvre dans ce chapitre pour l’étude in vitro du
comportement électrooxidatif de la clozapine (CLZ). Une bonne connaissance des
mécanismes oxydatifs peut en effet apporter des éclaircissements quant au devenir
métabolique des molécules et permet une recherche et une identification plus aisées
des différents métabolites. Dans le cas de la clozapine, les données de la littérature
mettent en évidence des effets secondaires hématologiques dangereux
(agranulocytose) liés à l’apparition d’une forme oxydée réactive (ion nitrénium).
Nous avons également envisagé d'étudier le comportement d'oxydation de cette
molécule en présence d'un composé thiol, le glutathion (GSH). Celui-ci est en effet
décrit comme un agent protecteur vis-à-vis de l’effet toxique de la clozapine, par son
action piégeante du cation nitrénium.
L’analyse du spectre de masse des produits d’oxydation électrochimique de la
clozapine sans séparation chromatographique montre clairement qu'à un potentiel
électrochimique bas (0,0V) seule la clozapine est présente (ionisation mais pas de
fragmentations dans l’appareil SM). Pour un potentiel appliqué de +0,4 V, des pics
supplémentaires sont observés : l'un correspondant à l’ion nitrénium ; l'autre à
l’hydroxy-clozapine. La séparation chromatographique en phase inversée (C8) des
produits d’oxydation électrochimique permet d’identifier, en plus de la clozapine,
différents produits tels : l’ion nitrénium (faible pic), la nor-clozapine, et l’hydroxy-
clozapine. La N-oxyde clozapine, un des métabolites majeurs, n’est pas décelée car
le temps de rétention du pic m/z =343 ne correspond pas aux temps de rétention du
standard utilisé. Une oxydation à + 0,7 V fournit un profil spectral quasi identique. La
Résultats
- 94 -
différence majeure s'observe au niveau du pic SM beaucoup plus intense de la nor-
CLZ. Ceci s’explique par le fait que la déméthylation électrochimique se trouve
facilitée à des potentiels plus positifs.
Sous des conditions expérimentales identiques, le GSH est inactif
électrochimiquement ce qui est particulièrement intéressant pour l’étude du
comportement électrooxydatif de la clozapine en présence de GSH.
Le spectre de masse montre pour un potentiel de 0,0 V, les seuls pics de la CLZ et
du GSH. Par contre, après électrooxydation réalisée à 0,4 V, un nouveau pic
apparaît, en sus de ceux du cation nitrénium, et de l'hydroxy-CLZ. Ce nouveau pic
est identifié au produit résultant de la conjugaison du GSH avec la CLZ (réaction de
Michael). La séparation chromatographique met en évidence outre les pics déjà
mentionnés, un groupe de pics reliés à trois isomères d'une forme hydroxylée de GS-
CLZ. A nouveau, nous excluons la formation de GSH-N-oxyde CLZ car les temps de
rétention ne correspondent pas aux standards. L'origine de ces pics pourrait être soit
un dérivé hydroxylé de GSH-CLZ ou comme rapporté dans la littérature, l'oxydation
de site thioether. L'application d'un potentiel plus positif (+0,7 V) favorise une
génération facilitée des dérivés déméthylés.
La voltampérométrie cyclique de la clozapine nous montre, durant le premier cycle,
un pic d’oxydation réversible à +0,450 V et un pic de réduction non identifié. Durant
le second cycle, en sus des pics déjà mentionnés, nous observons un pic
d’oxydation (+0,300 V) lié au pic de réduction relaté ci avant. Les données de la
littérature et le caractère stable de l’ion nitrénium à pH 7,4, (t1/2 = 1 min) nous
permettent d’attribuer le pic d’oxydation réversible à la formation de cet ion nitrénium.
En s'appuyant sur les résultats de CE/CL/SM, l’apparition du second couple rédox,
pourrait être attribué à l'oxydation d'un dérivé hydroxylé de la CLZ en une structure
quinone imine. La présence de GSH dans le milieu réactionnel entraîne la disparition
des pics de réduction de chacun des couples cités. Ces observations confirment que
le glutathion piège rapidement, et de manière homogène en solution, les espèces
oxydées de la CLZ en donnant des formes réduites de CLZ et conjuguées (GSH-
CLZ) qui sont oxydables à des potentiels plus positifs que la clozapine.
.
En conclusion, nous pouvons affirmer que la conjonction des résultats issus des
techniques électrochimiques et de la spectrométrie de masse permet d’identifier de
métabolites de phase I et II (en absence et en présence de GSH) de la clozapine
Résultats
- 95 -
mais non de manière exhaustive. L’ion nitrénium distinctement déterminé et espèce
hautement réactive vis-à-vis des réactifs nucléophiles, suggère des voies
d’explication de la toxicité connue de la clozapine. Ce type d'application
technologique apparaît réellement attractive et ce en particulier au niveau de la
recherche pharmaceutique prédictive, par son exploration mimétique des voies
d'oxydation métaboliques.
ORIGINAL PAPER
Suze M. van Leeuwen Æ Bertrand Blankert
Jean-Michel Kauffmann Æ Uwe Karst
Prediction of clozapine metabolism by on-line electrochemistry/liquidchromatography/mass spectrometry
Received: 15 October 2004 / Revised: 13 December 2004 / Accepted: 23 December 2004 / Published online: 28 April 2005
� Springer-Verlag 2005
Abstract Combining electrochemical conversion, liquidchromatography and electrospray ionization massspectrometry (EC/LC/ESI-MS) on-line allows the rapididentification of possible oxidation products of cloza-pine (CLZ) in the absence and in the presence of glu-tathione. CLZ is, depending on the applied potential,oxidized to various products in an electrochemical flow-through cell using a porous glassy carbon workingelectrode. Several hydroxylated and demethylated spe-cies are detected on-line using LC/MS. While hydroxy-CLZ is most abundant at a potential of 400 mV,demethylation occurs more readily at higher potentials(at around 700 mV versus Pd/H2reference). In thepresence of glutathione (GSH), various isomeric gluta-thione adducts and respective products of further oxi-dation can be identified. The thioadducts arecharacterized by tandem MS. Mono-GSH and bis-GSHderivatives can be seen in the chromatograms. The re-sults correlate well with the cyclic voltammetric profileof CLZ. The data are relevant from a pharmacologicalpoint of view, since similar metabolites (phases I and II)have been reported in the literature. The EC/LC/MSand EC/MS methods should be valuable tools that canbe used to anticipate and understand the metabolizationpatterns of molecules of pharmacological interest and topoint out reactive intermediates.
Keywords Clozapine Æ Oxidation Æ Electrochemistry ÆLC/MS Æ Metabolism
Introduction
Clozapine (CLZ) is an atypical antipsychotic drug,useful in the treatment of refractory schizophrenia.However, the use of CLZ is hampered by the relativelyhigh rates of incidence of agranulocytosis, an acuteblood disease, and neutropenia associated with the drug.Ever since these side-effects became apparent, variousgroups have undertaken studies aimed at obtainingfurther insights in the CLZ metabolism and the sub-sequent activation of the disease. Fischer et al [1] con-cluded from studies with human myeloperoxidase andhorseradish peroxidase (HRP) that CLZ activationpossibly yields free radical metabolites. Maggs et al [2]studied the generation of chemically reactive metabo-lites, expressed by the covalent binding and formation ofthioether adducts, both in vitro and in vivo. They foundthe bioactivated reactive intermediate of CLZ (left) to beeither a radical cation or the nitrenium ion (below).
At the same time, investigations by Liu and Uetrecht[3] resulted in further evidence for the intermediate beinga nitrenium ion in which the positive charge was highlydelocalized, thus explaining the formation of thioetheradducts at different positions in the aromatic ring. Giventhis fact, the groups of Park and Uetrecht have furtherinvestigated the cytotoxicity of this nitrenium interme-diate to human leukocytes and neutrophils, both in vitroand in vivo [4–7].
Besides the phase I (oxidation/reduction/hydrolysis)metabolites N-desmethyl-CLZ (nor-CLZ) and CLZ-
S. M. van Leeuwen Æ U. Karst (&)Department of Chemical Analysis and MESA+Institute for Nanotechnology,University of Twente, P.O. Box 217,7500 AE Enschede, The NetherlandsE-mail: [email protected]: +31-53-4894645
B. Blankert Æ J.-M. KauffmannDepartment of Instrumental Analysis and Bioelectrochemistry,Universite Libre de Bruxelles, ULB 205/6,Campus Plaine, 1050 Brussels, Belgium
Anal Bioanal Chem (2005) 382: 742–750DOI 10.1007/s00216-005-3053-3
N-oxide, other phase I and II (conjugation) metaboliteshave been identified as substitution products from thereaction of (activated) CLZ in the presence of water,glutathione, glucuronic acid or sulfate. Although thesubstitutions mainly occur at the 6 and 9 positions of thechlorinated aromatic ring, they also occur in thenon-chlorinated aromatic ring [2, 8, 9]. On-line electro-chemistry/mass spectrometry (EC/MS) has been intro-duced as a faster and cheaper alternative for early-stagemetabolite discovery, and its ability to anticipate bio-logical oxidation patterns is currently being exploredsince it allows fine tuning of the applied oxidation po-tential and mass identification of the oxidized species.
Electrochemical reaction models for cytochromeP-450, the main enzymatic system involved in xenobioticmetabolisms, were investigated 15 years ago by Hanzlikand coworkers [10, 11]. They particularly focused onN-demethylation and compared electrochemical oxida-tions with the enzymatic mechanism. In the same period,Getek et al [12] used on-line EC/MS for the formationand detection of glutathione and cysteine conjugates ofacetaminophen, using a ‘‘coulometric’’ flow-throughsystem based on a porous glassy carbon working elec-trode with large surface area. A comparable set-up, butemploying a thin-layer electrochemical flow cell, wasbuilt by Deng and Van Berkel [13] to study the redoxreactions of dopamine and follow-up reactions withbenzene thiol acting as a surrogate biogenic nucleophile.Further studies on dopamine and thioether conjugationwith glutathione and N-acetylcysteine were performed inoff-line electrochemical set-ups [14, 15]. Gamache et al[16] used on-line coupled coulometric flow cells with(electrospray ionization) mass spectrometry for rapidelectrochemical studies of biologically relevant redoxreactions, including both phase I oxidations and phase IIconjugations. However, as biological metabolism com-prises more than just N-demethylation, hydroxylation oroxygenation and thioether conjugation, these individualspecific experiments alone do not give a complete over-view of the potential of electrochemistry to mimic thehuman metabolism. Therefore, Bruins and coworkers[17, 18] set up a series of systematic EC/MS studies ondifferent classes of compounds and came to well-definedconclusions about which types of P-450 catalyzed reac-tions are mimicked accurately by the electrochemicalset-up.
Although all of these studies provided valuableinformation on the oxidative metabolism of pharma-ceuticals, investigating further details, such as thesimultaneous formation of different isomers, is not pos-sible using current set-ups. More detailed informationcan be obtained by coupling EC to liquid chromatogra-phy/mass spectrometry (LC/MS). Studies with this set-up have been performed and reviewed by the group ofBrajter-Toth [19] for various analytes, but not for phar-maceuticals. Recent work in this field has been summa-rized recently by Hayen and Karst [20] and Karst [21].
Recently, Hayen and Karst [22] have coupled EC, LCand MS in order to study the metabolites of phenothi-
azine and its derivatives. Earlier data by other groups[23–27] on the formation of direct oxidation productsand further reaction products with water and methanolwere readily confirmed by this method.
As the oxidation of CLZ leads, according to data inthe literature [2, 8, 9], to a large number of differentreaction products and adducts, including isomers, theEC/LC/MS approach appears to be a promising tool forthe rapid and convenient study of primary electro-chemical oxidation products and glutathione adducts.The on-line separation of conjugation products is ofparticularly great importance, as, to our best knowledge,no such studies have been reported yet. Hence, suchinvestigations are described within this paper.
Experimental section
Chemicals
CLZ, nor-CLZ (N-desmethyl-CLZ) and CLZ-N4-oxide(CLZ-Nox) were purchased from Sigma-Aldrich ChemieGmbH (Steinheim, Germany). ReducedL-glutathionewas ordered from Fluka Chemie GmbH (Buchs, Swit-zerland). Formic acid and acetic acid (both p.a. grade)were obtained from Merck (Darmstadt, Germany).Ammonium hydroxide (p.a. grade) was ordered fromFluka Chemie GmbH (Buchs, Switzerland). Ammoniumformate and ammonium acetate were purchased fromAldrich Chemie (Steinheim, Germany) at the highestquality available. The solvents used for the LC wereacetonitrile and water, both LC/MS grade, purchasedfrom Biosolve LTD (Valkenswaard, The Netherlands).
Instruments
The electrochemical system from ESA Inc. (Chelmsford,MA, USA) used for flow-injection EC/MS and on-lineEC/LC/MS comprised a CouloChem II electrochemicaldetector and a model 5020 guard cell, containing aglassy carbon working electrode, a Pd counter electrodeand a Pd/H2 reference electrode. An in-line polyether-etherketone (PEEK) filter was placed upstream of theguard cell inlet. For the LC/MS set-up, an AgilentTechnologies (Waldbronn, Germany) HP1100 liquidchromatograph consisting of a binary gradient pump(model G1312A), an autosampler (model G1313A), adiode array detector (model G1315B) and Hystar 2.3control software (Bruker Daltonics, Bremen, Germany)was coupled to an esquire 3000 plus ion trap massspectrometer from Bruker Daltonics, equipped with anelectrospray ionization (ESI) source and Esquire Con-trol software.
Cyclic voltammetry was performed with a potentio-stat (model 175; EG&G, Gaithersburg, MO, USA) anda polarographic analyzer (model 174A; EG&G, Gai-thersburg, MO, USA) connected to a Servogor XY
743
recorder (BBC GOERZ, Princeton, NJ, USA). A solidcarbon paste electrode (sCPE) served as working elec-trode, a Ag/AgCl, KCl (3 M) as the reference, and aplatinum wire as counter electrode.
Analysis
Aqueous buffers and acetonitrile were the mobile phasesused in the EC(/LC)/MS set-up. Buffers with concen-trations of 20 mM were prepared in different pH ranges,using ammonium formate/formic acid (pH 3), ammo-nium acetate/acetic acid (pH 5) and ammonium acetate/ammonium hydroxide (pH 7). Electrochemical conver-sion was performed at potentials varying from 0 to1800 mV versus Pd/H2 in 100 mV intervals. Althoughthe reference electrode is pH-dependent and experimentswere carried out at different pH values, 400 mV versusPd/H2 was selected since CLZ showed significant elec-trochemical conversion at each pH tested at this po-tential.
Separation of the electrochemically generated prod-ucts was performed on a Discovery C8 column (Supelco,Zwijndrecht, The Netherlands) with dimensions of15 cm · 2.1 mm and 5 lm particle size, combined with a2 cm · 2.1 mm guard column containing the samematerial. Table 1 shows the solvent gradient of aceto-nitrile (B) in aqueous buffer (A) that was applied:
Ionization of the analytes was achieved in the ESIinterface in the positive ion mode with 30 psi nebulizergas, 8 L dry gas/min of 365 �C and -5000 V on thecapillary inlet. The scan range was m/z=50–1000, withthe target mass (smart parameter settings, sps—auto-matic ion optic tuning for a given target mass) at m/z=325 for phase I oxidation experiments and m/z=632for phase II conjugation experiments and ion countcumulating (ICC) targets of 20,000. Tandem MSexperiments were carried out in the auto fragmentation
mode with sps for the precursor ion, ICC targets of 5000and fragmentation amplitudes of 1.00 V.
Results and discussion
Although the goal of this work was to develop an on-lineEC/LC/MS system, initial experiments were carried outwith only EC/MS, for two reasons: (i) the complexity ofthe system is reduced, and optimization of the electro-chemical and MS parameters can be realized more rap-idly, (ii) the ternary combination of EC, LC and MS isable to detect reaction products with lifetimes of theorder of several minutes (so short-lived intermediates arenot detected as they react to more stable products duringthe chromatographic run). Direct EC/MS allows thedetection of less stable compounds with lifetimes of atleast a few seconds.
The oxidation of CLZ is monitored in EC/MS by theinjection of CLZ solution into the carrier stream via anautosampler. The sample flows through a commerciallyavailable electrochemical cell containing a workingelectrode of porous glassy carbon. The latter may pro-vide up to quantitative electrochemical conversiondepending on the conditions, such as nature of theanalyte, flow rate and pH. Experiments indicated thatthe most interesting results are obtained for potentials of0, 400 and 700 mV. At voltages of 1000 mV and above,exhaustive electrochemical degradation is observed. InFig. 1, the mass spectra of CLZ without (0 mV) andwith (400 mV) electrochemical oxidation are compared.It is obvious that without applied voltage, only the[M+H]+ at an m/z=327 is observed. The isotopicpattern of the peaks correlates well with theory. Uponoxidation, more peaks are detected, with m/z=325 beingmost abundant. This mass could refer to the nitreniumion of CLZ (Fig. 2), which had been observed previouslyby other researchers [3]. The m/z=327 peak in this caseis mostly the 37Cl satellite of m/z=325, which indicatesthat CLZ was consumed (almost) quantitatively in thesemeasurements. The peak of m/z=343 indicates mo-nooxygenation, with the formation of CLZ-N-oxide orhydroxy-CLZ being the most likely products. For rea-sons discussed later, only the hydroxy-CLZ is shown inFig. 2. Similarly, methoxy-CLZ with m/z=357 was
Table 1 The solvent gradient of acetonitrile (B) in aqueous buffer(A) that was applied
Time (min) 0 1 8 12 18 19 24CB (%) 18 18 60 80 80 18 Stop
Fig. 1a–b MS spectra ofelectrochemical CLZ oxidationin 30% acetonitrile/70%20 mM aqueous ammoniumacetate/ammonium hydroxidebuffer of pH 7 at a 0 mV andb 400 mV
744
observed when the reaction was performed with meth-anol instead of acetonitrile in combination with aqueousbuffer (data not shown).
The separation of the reaction products on a base-deactivated reversed phase column with a mobile phaseconsisting of acetonitrile and aqueous ammonium ace-tate buffer pH 7 was then performed. With the electro-chemical cell switched off, only a signal from the nativeCLZ is observed. At an applied potential of 400 mVversus Pd/H2, several additional products are observed.A typical chromatogram is presented in Fig. 3. The totalion current (TIC) trace shows several peaks, some ofwhich are not well resolved. A significantly higheramount of protonated CLZ is found in comparison withthe EC/MS measurements at m/z=327. A possibleexplanation for this phenomenon is that the intermedi-ate with m/z=325 is relatively unstable (half-life �1 minin phosphate buffer [2]) and is reversibly transformedinto CLZ during the separation step. The fact that them/z=325 peak is smaller by a factor of 100 in compar-ison with the m/z=327 peak is related to the highreactivity of the nitrenium cation. The latter is assumedto be a charged compound, and its retention time shouldbe shorter than that of CLZ, yet the peak of m/z=325
Fig. 2 Reaction scheme of theelectrochemical oxidation andsubsequent glutathioneconjugation of CLZ
Fig. 3 LC/MS chromatogram of CLZ (4.3·10�5 M) after electro-chemical oxidation at 400 mV, pH 7, with mass traces of hydroxy-CLZ (m/z=343), nor-CLZ (m/z=313), the reactive nitreniumintermediate (m/z=325) and CLZ (m/z=327)
745
elutes exactly at the retention time of CLZ. Therefore, itis concluded that this m/z=325 peak of low magnitudein the EC/LC/MS experiment is exclusively generated bythe oxidation of CLZ in the ESI interface. This ‘‘inter-fering’’ effect from the electrospray emitter acting as anelectrochemical cell has been discussed in detail by VanBerkel et al [28]. It is furthermore confirmed by the factthat a closer look at the chromatogram without priorelectrochemical conversion also shows a peak intensityratio of approximately 100:1 for the mass traces ofm/z=327 and 325, respectively. One additional smallerpeak with a retention time of more than 20 min is ob-served as well. This clearly indicates that an unknownreaction product of very low polarity is formed. A smallpeak of m/z=313 relates to the formation of nor-CLZ(Fig. 2), which was already detected in the literature [2,7–9], and which could be expected to be generatedelectrochemically as well, as N-dealkylation is frequentlyobserved [18, 29, 30]. The reduced retention time incomparison with CLZ is attributed to its higher polarity,but also to its lower basicity, which may result in re-duced adsorption to residual silanol groups on the sta-tionary phase. The broad range of peaks at m/z=343 ischaracterized by two groups of maxima, between whichthe intensity does not reach baseline level over a periodof several minutes. This may indicate an equilibriumreaction between the peaks of the first and the secondgroup. In principle, the observed mass could be due tothe formation of CLZ-N-oxide or hydroxy-CLZ (bothprotonated). The formation of CLZ-N-oxide can beexcluded as the retention time and retention behavior ofthe peaks at m/z=343 were distinct from the CLZ-N-oxide standard, which eluted at 12.5 min. Also, datafrom the literature do not provide evidence for theelectrochemical formation of N-oxides [18], although theN-oxide is one of the main metabolites formed of CLZin vivo. For hydroxy-CLZ, at neutral pH this species ispartly deprotonated to the phenolate form which elutessignificantly earlier due to its permanent charge, but isstill detected mass spectrometrically due to (re-)proton-ation in the positive ion mode. This phenol/phenolateequilibrium could well explain the broad peak patternobserved at neutral pH. The formation of only one peakwith much shorter retention time at pH 3 at this m/zratio (data not shown), possibly because of protonationof the basic piperazine ring, provides further evidencefor this assumption. The observation of several peaktops in each group (at both sides of the equilibrium) atpH 7 may be explained by the fact that several isomersof hydroxy-CLZ are formed, including those in positions6, 7 and 9 of the chlorinated ring, but possibly also thosein positions 1–4 in the other aromatic ring (Fig. 2), al-though position 2 may be the preferred position out ofthese, as indicated by the voltammetric data (see below).Actually, the nitrenium ion with m/z=325 has the abilityto delocalize its electrons widely over the named posi-tions, preferably in the diazepine nitrogens and thechlorobenzenoid ring [2], thus allowing a large numberof isomeric substitution products to be formed. Addi-
tionally, a peak with m/z=301 is observed (not shown),which is attributed to a protonated ethylenediaminederivative (Fig. 2) described in the literature [9]. TandemMS experiments on several products did not yieldinformation such that product identification was sup-ported or the interpretation as mentioned above wasfurther proven.
Increasing the potential to 700 mV versus Pd/H2
leads to a similar situation (Fig. 4), with the major dif-ference being that the peak of nor-CLZ (m/z=313) issignificantly larger than at lower potentials, while theother major peaks are slightly smaller. This is explainedby the fact that the electrochemical demethylation oc-curs at high potentials [31].
Further experiments were performed under identicalexperimental conditions but in the presence of gluta-thione (GSH), a tripeptide of the amino acid sequenceglycine, cysteine and glutamic acid, which is known toform adducts with activated pharmaceuticals via its thiolgroup [1–5, 8, 9]. On-line EC/MS was realized withoutseparation at a potential of 400 mV and with the elec-trochemical cell switched off. Only the peaks atm/z=308 (protonated glutathione) and m/z=327
Fig. 4 LC/MS chromatogram of CLZ (4.3·10�5 M) after electro-chemical oxidation at 700 mV, pH 7, with mass traces of hydroxy-CLZ (m/z=343), nor-CLZ (m/z=313), the reactive nitreniumintermediate (m/z=325) and CLZ (m/z=327)
Fig. 5a–b MS spectra of electrochemical oxidation products ofCLZ (4.3·10�5 M) in the presence of glutathione (2.0·10�5 M) in30% acetonitrile/70% 20 mM aqueous ammonium acetate/ammo-nium hydroxide buffer of pH 7 at a 0 mV and b 400 mV
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(protonated CLZ) are observed with the electrochemicalcell switched off (Fig. 5). At 400 mV versus Pd/H2,several additional peaks are formed, including those ofthe intermediate at m/z=325 (see above) and of hy-droxy-CLZ at m/z=343. Interestingly, previouslyunobserved peaks, which indicate the formation of GSHadducts, are detected as well. The peak at m/z=632resembles the protonated adduct of GSH and CLZ(Fig. 2), while m/z=446 may be explained as a fragmentof the GSH adduct (see below).
EC/LC/MS assays with the electrochemical cellswitched off lead to the detection of the protonated GSHand CLZ peaks (data not shown). At a potential of400 mV versus Pd/H2, large groups of peaks of hydroxy-CLZ derivatives (m/z=343), desmethyl-CLZ (m/z=313), and the nitrenium ion of CLZ at m/z=325 areobserved (Fig. 6). However, the group of peaks withretention times between 8 and 9 min proves that at leastthree isomers of a GSH-CLZ adduct are formed, in asimilar way to the hydroxylated isomers (Fig. 2). For-mally, the peak at m/z=648 may be a result of a mo-nooxygenation of the GSH-CLZ adduct. The oxidationat the tertiary N atom leading to the formation of the N-oxide was excluded, however, since data obtained fromthe oxidation of synthetic CLZ-N-oxide in the presenceof glutathione (not shown) gave retention times of therespective glutathionyl conjugates that do not fit tothose shown in Fig. 6 or 7. Furthermore, hydroxy-GSH-CLZ was also excluded because this molecule would givea less dramatic shift in the retention time. The last op-tion is the S-oxidation at the thioether site. It is knownfrom the literature that organic sulfides can be oxidizedeasily, and that the resulting sulfones are much more
polar, thus giving rise to strongly reduced retentiontimes [32, 33]. A more detailed inspection of the chro-matograms also provided evidence for the formation ofthe bis-GSH adduct to CLZ. With two highly polarchains on the CLZ molecule, the bis-GSH adduct elutesat around 2 min and is predominantly found in itsdoubly-charged state with m/z=469. Two badly sepa-rated peaks are observed, one being rather sharp, andthe other broader and with lower intensity. As for thebis-GSH adduct, several isomers may occur, and inparticular the broader second peak may contain morethan one isomer. It should be mentioned that no di-hydroxylated CLZ species were observed.
At a potential of 700 mV versus Pd/H2, some changesoccur in the chromatograms, as presented in Fig. 7. Thepeak intensities of most oxidation products are slightlylower than at 400 mV, but the increased concentrationof demethylated products at m/z=313 (protonated nor-CLZ, see above) and m/z=618 (protonated isomers ofGSH-nor-CLZ) confirms the above statement thatdemethylation occurs to a greater extent at higher po-tential. At this potential, a group of three peaks withvery similar retention times (around 8 min) are observedfor m/z=648. It is assumed that these peaks are asso-ciated with the formation of hydroxylated GSH-CLZadducts, although the effect of hydroxylation on reten-tion time is much weaker here than for CLZ itself.However, this may be easily explained by the smallereffect of the hydroxyl group on the total polarity in thepresence of the covalently-bound glutathione chain thanin its absence. The formation of isomeric GSH-CLZ-N-oxides can be excluded based on the comparison ofthe retention times with the analogous data on
Fig. 6 LC/MS chromatogramof CLZ (4.3·10�5 M) afterelectrochemical oxidation at400 mV, pH 7 and in thepresence of glutathione(2.0·10�5 M). Mass traces ofglutathione (m/z=308),hydroxy-CLZ (m/z=343), nor-CLZ (m/z=313), the reactivenitrenium intermediate (m/z=325), CLZ (m/z=327),glutathionyl-CLZ (m/z=632),glutathionyl-nor-CLZ (m/z=618) and hydroxylatedglutathione conjugates of CLZ(m/z=648)
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CLZ-N-oxide oxidation in the presence of GSH (datanot shown).
The glutathione adducts were analyzed by tandemmass spectrometry as well to further confirm theiridentity. In Fig. 8, we present the mass spectrum of theGSH-CLZ adduct after oxidation at 400 mV versus Pd/H2 (a, isomer II) as well as MS/MS spectra of isomers II
and III with m/z=632 as precursor ion (b, c). The tan-dem MS spectra of isomers I and IV resemble those of IIand III, respectively. Most major peaks in the daughterspectra can be explained, as is depicted in Fig. 9. Themain dissociation pathways include loss of water (m/z=614), dissociation of glutamic acid from the peptidechain (m/z=503) and cleavage of the glutathionyl moi-ety, either with (m/z=359) or without (m/z=327) thesulfur atom. For most daughter ions, cleavage of thepiperazine ring under release of C3H7N (M-57) is ob-served as well. The same product ions, with exception ofm/z=327 and the subsequent loss of C3H7N, were ob-served in previous studies [2] for the 6-CLZ-GSH and 9-CLZ-GSH substitutes. Although a large variety ofdaughter ions are observed, the differences in the dis-sociation patterns of the individual isomers of the ad-duct are comparably small and do not allow theirunambiguous identification.
In order to obtain complementary information aboutthe electrochemical oxidation pattern, cyclic voltamme-try of CLZ was realized at a solid carbon paste electrode[34] in the absence and presence of gluthathione atpH 7.4 (Fig. 10). Starting at 0.0 V and scanning in thepositive direction, CLZ is readily oxidized atEp=+0.450 V versus Ag/AgCl, KCl (3 M) (peak O1),with a high oxidation wave (shoulder) at high potentials(near solvent evolution) as illustrated in Fig. 10a. Byreversing the scan direction, a reduction peak atEp=+0.390 V is observed (R1) as well as a second peakat +0.075 V (R2). The peaks O1 and R1 are related,which suggests a reversible oxidation process, yetthe magnitude of the reduction peak is lower than theoxidation peak at the scan rates investigated
Fig. 7 LC/MS chromatogramof CLZ (4.3·10�5 M) afterelectrochemical oxidation at700 mV, pH 7 and in thepresence of glutathione(2.0·10�5 M). Mass traces ofglutathione (m/z=308),hydroxy-CLZ (m/z=343), nor-CLZ (m/z=313), the reactivenitrenium intermediate (m/z=325), CLZ (m/z=327),glutathionyl-CLZ (m/z=632),glutathionyl-nor-CLZ (m/z=618) and hydroxylatedglutathione conjugates of CLZ(m/z=648)
Fig. 8a–c MS spectra obtained after electrochemical oxidation ofCLZ in the presence of glutathione at 400 mV. a MS spectrum ofthe glutathionyl CLZ precursor ion with m/z=632 (isomer II), andMS/MS daughter ion spectra of m/z=632 of b isomer II andc isomer III
748
(20–200 mV/s). This is attributed to a chemical reactionsubsequent to the CLZ oxidation with formation of anew species reduced at R2. Upon repetitive cycling, anew oxidation peak appears (O2). The quasi-reversiblecouple O2/R2, located at less positive potentials than theparent molecule (O1/R1), corresponds to the redox pat-tern of a molecule more easily oxidized than CLZ and,based on the EC/LC/MS results, it can probably beattributed to hydroxylated CLZ derivatives oxidized to aquinone imine structure, with the hydroxyl groupspreferably located at position 2, which makes formationof the quinone imine structure easiest. The pattern ofpeaks O1/R1 is attributed to the reversible oxidationof CLZ to give the nitrenium cation. A similar cyclic
voltammetric profile is obtained for N-desmethyl-CLZand CLZ-N-oxide. At higher potentials, the oxidationwave is attributed to oxidation at the distal tertiarynitrogen of the piperazine moiety, as inferred from lit-erature data on aliphatic tertiary nitrogen oxidation [29–31] and from the present EC/LC/MS results. In thepresence of glutathione, and for the three CLZ deriva-tives investigated, the reduction peaks R1 and R2 can bemade to gradually disappear by increasing the GSHconcentration (Fig. 10b). These peaks disappear totallyin the presence of a ten-fold excess of GSH. From thiscyclic voltammetric profile it appears that, in the pres-ence of an excess of GSH, hydroxylation is observed to alesser extent, in agreement with EC/LC/MS interpreta-
Fig. 10a–b Cyclicvoltammograms of CLZ(1.0·10�5 M) in Britton-Robinson buffer of pH 7.4;scan rate 50 mV/s: a withoutglutathione and b in thepresence of glutathione(2.0·10�5 M)
Fig. 9 Fragmentation schemeof the protonated glutathionyl-CLZ conjugate with m/z=632
749
tions. Interestingly, upon raising the GSH concentra-tion, two new oxidation peaks, which are marked witharrows in Fig. 10b, appear at potentials more positivethan O1. These peaks likely correspond to the oxidationof thioadducts of CLZ identified by EC/LC/MS. It isworth mentioning that glutathione oxidation is poorlydefined and occurs at potentials higher than 0.9 V versusAg/AgCl, KCl (3 M).
Conclusions
The EC/MS and EC/LC/MS studies reported in thiswork bring clear confirmations of data reported in theliterature on the in vitro and in vivo oxidation of CLZ.The successful generation and identification of phase Iand II metabolites of CLZ was performed by studyingCLZ alone and in the presence of glutathione, for whichon-line LC-coupling has shown particular applicability.Several, but not all, oxidative metabolic pathways ofCLZ are mimicked. The current state of the art does notidentify further metabolites that may be formed, forexample, in an enzyme-catalyzed reaction. Future workwill be directed at coupling enzyme or living cell mic-roreactors to the MS and LC/MS systems for on-lineenzymatic conversion and identification.
Acknowledgements Financial support by the Nederlandse Organ-isatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO, The Hague, TheNetherlands) is gratefully acknowledged.
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(2004) Anal Lett 37:917–928
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6.3 Horseradish peroxidase electrode for the analysis of clozapine.
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6.3.1 Introduction.
Une meilleure connaissance de l’oxydation "in vitro" de la clozapine, en absence et
en présence de glutathion, acquise précédemment (point 6.2) et la mise en évidence
de l'espèce instable et hautement réactive du cation nitrénium de la clozapine, nous
a stimulé à entreprendre la réalisation d’un biocapteur ampérométrique comprenant
l’enzyme peroxydase de raifort (HRP). La littérature nous renseigne que la clozapine
subit des oxydations métaboliques via le système CYP450 et le couple
myéloperoxidase/H2O2 et il nous a semblé intéressant de considérer un biocapteur
HRP/H2O2 dans le cadre du concept de systèmes prédictifs de la biotransformation
de médicaments. La peroxydase de raifort est préalablement réticulée en présence
de glutaraldéhyde et d’albumine sérique bovine, puis emprisonnée physiquement au
sein d’une électrode à pâte de carbone. Une membrane de dialyse recouvre le
biocapteur afin de minimiser les pertes d’enzyme dans la solution à analyser. Les
mesures voltampérométriques relatives à l’oxydation électrochimique de la clozapine
nous ont permis d’identifier deux pics cathodiques attribuables à la réduction
d’espcèes oxydées de la clozapine à savoir, le cation nitrénium correspondant et une
forme semiquinone de la clozapine. Par l’application d’un potentiel bas, proche de
zéro volt, il est possible de détecter l’apparition de ces espèces générées au niveau
du biocapteur. Les tracés ampérométriques à l’aide du biocapteur, réalisés en
tampon phosphate pH 7,4, montrent successivement un pic de réduction du
peroxyde d’hydrogène puis un large courant de réduction lié à l’ajout de la clozapine.
Ce tracé peut être expliqué tenant compte que l’ajout d'H2O2 provoque l’oxydation de
HRP à l’interface électrode-solution et qu’une faible proportion de HRPox est
susceptible d’être directement réduite à l’électrode. L’ajout de la clozapine provoque
la formation du cation nitrénium de la clozapine qui est réduit électrochimiquement
au potentiel appliqué. Ce biocapteur permet l’étude de la clozapine dans un domaine
linéaire de concentration compris entre 1 et 10 µM. Toutes les mesures ont été
réalisées au sein d’un tampon phosphate (PB pH 7,4) en présence de peroxyde
d’hydrogène (0,1 mM) à température ambiante et sous agitation constante. Nous
avons comparé la détermination quantitative de la clozapine au sein d'une forme
pharmaceutique comprimée réalisée à l'aide du biocapteur aux résultats par
électrophorèse capillaire. Aucune différence statistiquement significative n'a été
décelée entre les deux méthodes ainsi qu'avec la valeur déclarée.
Résultats
- 98 -
Le biocapteur EPC/HRP constitue un outil analytique pour la détermination
quantitative de la clozapine mais également pour étudier le comportement des
molécules susceptibles d'inhiber la réponse du biocapteur.
CHEMICAL AND BIOSENSORS
Horseradish Peroxidase Electrode for theAnalysis of Clozapine
B. Blankert,1 O. Dominguez,2,# W. El Ayyas,1
J. Arcos,2 and J.-M. Kauffmann1,*
1Pharmaceutical Institute, Universite Libre de Bruxelles,
Brussels, Belgium2Department of Chemistry, University of Burgos,
Spain
ABSTRACT
A horseradish peroxidase (HRP) immobilized electrode was developed
for the assay of the antipsychotic compound clozapine (CLZ). The
biosensor was made of HRP crosslinked with glutaraldehyde and bovine
serum albumin (BSA) and blended in the electrode matrix. The latter was
a carbon paste based on solid paraffin and graphite particles. A dialysis
membrane was secured at the tip of the enzyme based electrode. Cyclic
voltamperometry at the solid carbon paste electrode (sCPE) permitted
to point out a reversible pattern for CLZ electrooxidation attributed to
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DOI: 10.1081/AL-120030286 0003-2719 (Print); 1532-236X (Online)
Copyright # ????? EQ1www.dekker.com
EQ1: Your signed copyright release form has not been received. Please return it or we
cannot publish your article.
#On leave from the University of Burgos.*Correspondence: J.-M. Kauffmann, Pharmaceutical Institute, Universite Libre de
Bruxelles, Campus Plaine, CP 205/6, 1050 Brussels, Belgium; E-mail: jmkauf@ulb.
ac.be.
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ANALYTICAL LETTERS
Vol. 37, No. 5, pp. 917–928, 2004
a relatively stable nitrenium ion. The formation of the latter and of a
newly generated species, was inferred at the biosensor. The electro-
reduction of these generated species was performed at the biosensor at an
applied potential of 0.0 V vs. Ag/AgCL 3 M KCl. Several experimental
parameters influencing the biosensor response were studied such as
pH, buffer composition, and detection potential. The resulting biosensor
offered, at pH 4.5 in Britton–Robinson buffer (BRb) in the presence
of 0.1 mM H2O2 and at 0.0 V vs. Ag/AgCl, a linear response in the
concentration range comprized between 1.0 � 1026 M and 1 � 1025 M
with a detection limit of 1.7 � 1027 M and a quantification limit of
5.6 � 1027 M. In addition to the mechanistic information provided,
the biosensor was found useful for the determination of CLZ in tablets.
The accuracy of the assay was checked by capillary electrophoresis
(CZE).
Key Words: Clozapine; Peroxidase; Electrode; Antipsychotic drugs;
Cyclic voltamperometry.
INTRODUCTION
Clozapine (CLZ) is a dibenzodiazepine derivative with atypical anti-
psychotic properties.[1] It exhibits good efficacy in schizophrenic patients
and presents a low incidence of extrapyramidal side effects.[2] However, CLZ
can cause dose dependent epileptic seizures[3] and reversible, but potentially
fatal agranulocytosis.[4] Dose adjustments eventually result in relief from
these side effects and periodic blood monitoring is a requirement for CLZ
prescription renewal. Several instrumental methods may be implemented
for CLZ determination such as spectrophotometry,[5] voltamperometry,[6,7]
and separation methods for assays in biological fluids.[6,8 – 10] Clozapine is
extensively metabolized in human liver with formation of two principal
metabolites namely N-desmethyl-CLZ and CLZ N-oxide (Fig. 1). The
initial oxidation stage is reported to correspond to the oxidation at the single
nitrogen bridge between the two aromatic rings and formation of a relatively
stable nitrenium ion (half life ca. 1 min in phosphate buffer).[11 – 13] The latter
is also readily generated in vitro by the horseradish peroxidase (HRP)/H2O2
system.[14 – 16] Based on our interest in developing electrochemical biosensors
for the analysis of compounds of pharmaceutical interest[17,18] and consi-
dering the biooxidation pattern of CLZ it was of interest to develop a HRP
immobilized electrode and investigate its performances for the analysis
of CLZ.
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EXPERIMENTAL
Reagents
Horseradish peroxidase (EC 1.11.1.7. Type II, 240 mg purpurogallin
U/mg), CLZ N-desmethyl-CLZ CLZ N-oxide, and glutaraldehyde were
from Sigma (Bornem, Belgium). Hydrogen peroxide 27% m/v was from Vel
(Leuven, Belgium). All reagents were of analytical grade and the solutions
were prepared with doubly distilled and purified water (Milli Q, Millipore
system). A 0.04 M Britton–Robinson buffer (BRb) pH 2 served as stock
solution for subsequent buffer preparation by additions of 0.2 M sodium
hydroxide till the desired pH value. Some cyclic voltamperometric experi-
ments were performed in 0.1 M formate buffer obtained by mixing formic acid
and ammonium formate in an appropriate ratio. The pH was controlled by
a pH-meter (Tacussel Minisis 6000). Solid paraffin and BSA were from
Merck (Overijse, Belgium). Graphite powder was obtained from Connexw
(Conmetal, Celle, Belgium).
Apparatus
Chronoamperometric experiments with the biosensor were performed in a
conventional three electrode system. During the measurements, the solution
Figure 1. Chemical structures of CLZ, CLZ N-oxide, and N-desmethyl-CLZ.
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HRP Electrode for CLZ Analysis 919
(10.0 mL) was gently stirred with a magnetic bar. The potentiostat was a
Bruker E 230 LC detector (Bruker, Brussels, Belgium) connected to a Y/t
Kipp and Zonen B111 recorder. Cyclic voltamperometry was performed using
a potentiostat model 175 (EG&G) and a polarographic analyzer model 174A
(EG&G) connected to a XY recorder Servogor (BBC GOERZ, Princeton, NJ,
USA). The solid carbon paste electrode (sCPE) served as working electrode, a
Ag/AgCl KCl 3 M as reference, and a platinum wire as counter electrode. All
experiments were made at room temperature (228C + 18C).
Capillary electrophoresis was performed with a SpectraPhoresis 100
(Thermo Separation Product, Belgium) comprising a UV/Visible detector.
The analysis was realized using an untreated fused silica capillary (Alltech
Associated, Inc., Belgium) with a total length of 65 cm (effective length
30 cm) � 75mm i.d. The background electrolyte (BGE) was a 50 mM phos-
phate buffer pH 2.5. The sample was injected by depression during 3 sec at the
anodic end of the capillary and the separation was achieved by applying a
potential of 15 kV (detection at 240 nm). The capillary was thermostatted
at 218C. At the beginning of each day the capillary was rinsed with water
(Milli Q) during 5 min, then with 0.1 M NaOH (3 min), Milli Q water
(6 min), and finally with the BGE (20 min). After each electrophoretic run, the
capillary was flushed wth the BGE for 3 min. At the end of the day the capillary
was washed for 2 min with Milli Q water, 3 min with 1 M HCl, 3 min with
Milli Q water, 5 min with methanol, and finally 5 min with Milli Q water.
Biosensor Preparation
The enzyme immobilization was realized by cross-linking HRP and
BSA with glutaraldehyde (2.5% v/v).[17] The protein mix was left at 58Cfor 1 hr and then rinsed with a glycine solution (0.01 M). After a final wash
with acetate buffer, the enzyme preparation was left at room temperature
until dry.
The HRP immobilized solid carbon paste was prepared as previously
described.[17] The paste was pressed into the well (3 mm diameter) of the
electrode body. The surface of the HRP-sCPE was smoothed manually on a
soft clean paper before use. The electrode tip was covered by a dialysis
membrane (m.w. cutoff: 12,000 Da). The latter was secured to the electrode
body by a O-ring rubber. The biosensor was stored dipped into the BRb pH 4.5
buffer at 58C when not in use. All the amperometric experiments were made
in BRb and in the presence of 1.0 � 1024 M hydrogen peroxide. All data are
the average of at least three assays.
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Assay of Clozapine in Tablets
The declared composition of the tablets was: CLZ 25 mg—acid.sillicic.
coll.–magnes.stearas–talc–amyl.maydis–polyvidon.–lactos. Pro comp.uno.
The mass average (0.0954 g) of one tablet was weighed from the powder
resulting from the crushing of 10 tablets of Leponexw (Novartis). This mass
was transferred into a 100.0 mL volumetric flask filled with BRb or BGE
for the biosensor and CZE assays, respectively. Twenty microliters of this
“Leponex” solution was spiked in the electrochemical cell containing 10.0 mL
of buffer and H2O2 (1.0 � 1024 M). The working potential of the biosensor
was set at 0.0 V. Quantification was performed by the method of standard
addition. For CZE, the “Leponex” solution was diluted 10 times, and the
obtained suspension was filtrated under pressure through a syringe comprizing
a filter in order to eliminate the excipients. Four vials were filled with 1.6 mL
of filtrated solution and spiked with 0, 10, 20, and 30mL of a 4.0 mg/mL fresh
stock solution of CLZ, respectively. The electropherogram showed one peak
at tmig ¼ 253 sec (RSD 3%, N ¼ 14).
RESULTS
The cyclic voltamperometric curve was performed with a scan rate of
50 mV/sec on a solution of CLZ with a final concentration of 1.0 � 1025 M in
BRb pH 4.5. As shown in Fig. 2, and in agreement with our previous results,[7]
CLZ is readily oxidized giving one peak at Ep þ 0.545 mV vs. Ag/AgCl 3 M
KCl. The molecule is further oxidized at higher potentials giving less
defined waves at potentials close to solvent oxidation. The first oxidation peak
behaved reversibly giving, on the reverse scan, a related reduction peak (Ep ¼
þ0.470). A second reduction peak is observed at less positive potentials
(Ep ¼ þ0.120) which behaved quasi-reversibly as detected by its corresponding
oxidation peak on the second scan (Ep ¼ þ0.445). The presence of this redox
couple at less positive potentials than the parent molecule can be attributed to the
formation of a new compound after oxidation of CLZ and this new compound
is more readily oxidized than the parent compound. The exact nature of the
newly formed molecule is currently under investigation by coupling on-line
electrochemistry to mass spectrometry EC-MS (to be published). We may
already suggest that it corresponds to the redox behavior of a hydroxylated form
of CLZ giving a quinone imine structure of CLZ after oxidation. This was
inferred because the redox profile (peak potential and peak separation) matched
adequately with the redox pattern, realized under identical cyclic voltammetry
conditions, of the molecule amodiaquin which has in its structure an amino-
phenol group giving by oxidation a quinone imine structure (not shown).
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Regarding the oxidation mechanism of the first peak, it likely corresponds to the
formation of a relatively stable radical cation obtained by removal of one
electron from the amino function between the two aromatic cycles giving
rise, by subsequent removal of one proton, to a nitrenium ion.[12,19] The cyclic
voltammetry of the investigated CLZ metabolites (N-desmethyl and N-oxide
derivatives) exhibit a similar pattern as CLZ with respect (i) to the first oxidation
peak magnitude and potential value and (ii) to the formation of a new redox
couple at less positive potential than the parent molecule. It should be noted,
however, that experiments must be carefully controlled as the molecules inves-
Figure 2. Typical cyclic voltamperogram of CLZ 1.0 � 1024 M in 0.04 M BRb pH
4.5. Scan rate 50 mV/sec, sCPE vs. Ag/AgCl 3 M KCl.
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tigated and especially N-desmethyl-CLZ tend to spontaneously accumulate at the
(hydrophobic) electrode surface. A slightly distinct pattern was observed among
the three investigated molecules regarding the poorly defined waves detected at
more positive potentials (not shown). From these results and taking into account
literature data on CLZ electrooxidation[7,20] and biotransformation[12,19] we may
recognize two oxidation sites at the CLZ; the tricyclic ring and the piperazine
moiety, and point out a similar oxidation behavior for CLZ and the N-desmethyl
and N-oxide metabolites regarding the oxidation pattern of the tricyclic ring.
It was inferred that the nitrenium ion and the quinoneimine derivative of
CLZ, eventually generated by HRP, may be readily detected by amperometry
at the HRP immobilized sCPE at approximately 0 V vs. Ag/AgCl 3 M KCl.
Different pH values were investigated in cyclic voltammetry to check
for the highest reduction peaks (i.e., highest generation of reactive oxidized
species). As shown in Fig. 3, pH 4.5 was found optimal and BRb was
preferred over the formate buffer (the latter was selected as it was compatible
with further planned EC-MS experiments).
Amperometric experiments using the HRP immobilized electrode were
performed at different pH and applied potential values. Different calibration
curves were realized in the concentration range of CLZ comprized between
1 � 1026 and 6 � 1026 M. From the data in Table 1 we may infer that reactive
species are generated at the HRPs-CPE both at pH 4.5 and 7.4 and that they
are readily detected at the biosensor. We may also notice that the potential of
Figure 3. Variation of intensity of reduction peaks of CLZ as a function of pH. Cyclic
voltamperograms of CLZ 1.0 � 1024M, 0.04 M, BRb pH 4.5 or 0.1 M format buffer
pH 4.5. Scan rate 50 mV/sec, sCPE vs. Ag/AgCl 3 M KCl.
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HRP Electrode for CLZ Analysis 923
0 V would be a good compromize in terms of analytical performances (slope,
intercept, and low background current). The resulting biosensor offered, at pH
4.5 in BRb in the presence of 0.1 mM H2O2 and at 0.0 V vs. Ag/AgCl 3 M KCl,
a linear response in the range comprized between 1.0 � 1026 and 1 � 1025 M
with a detection limit of 1.7 � 1027 M and a quantification limit of
5.6 � 1027 M. The molecules generated by HRP and detected by reduction
at the electrode interface have not been identified in this work, but from the
literature data we may readily postulate that they correspond to the nitrenium
ion and likely a CLZ quinoneimine derivative. A schematic drawing may help to
illustrate the principle of detection at the biosensor/solution interface (Fig. 4) in
relation to a typical chronoamperometric recording (Fig. 4 insert). As shown,
the biosensor gave a very small response by addition of hydrogen peroxide
(0.1 mM in the analyzed solution), attributed to the reduction of some HRPox
located in close proximity to the graphite particles. Subsequent additions of
CLZ (final concentration: 6mM) produced a substantial signal increase due to
the reduction of CLZ oxidized species generated by HRPox entrapped in the
solid paraffin (but not in close contact to graphite particles). It was assumed that
the electroreduction of HRPox in close contact (and properly oriented) with the
graphite particles is faster than its reduction by CLZ.
The assay of CLZ was performed in tablets by means of the biosensor and
the data were compared with those obtained by capillary electrophoresis. The
results obtained by the biosensor (24.3 mg/tablet, RSD 2%, n ¼ 9) and by
capillary electrophoresis (24.9 mg/tablet, RSD 0.2%, n ¼ 4) are in agreement
with the declared value (25 mg/tablet) and the data from both techniques
are not statistically different at the 95% confidence level (student’s t-test:
texp ¼ 0.59, tthe ¼ 2.2).
In conclusion the HRPs-CPE represents a useful analytical tool allowing
the quantitative determination of CLZ, the investigation of its redox pattern and
the study of molecules influencing the biosensor response. The latter is of
interest from a pharmacological point of view and was briefly investigated. It
was found that ascorbic acid (AA) and excess of glutathione GSH (10 fold)
Table 1. Variation of slope and intercept as a function of pH and applied potential.
pH Potential (V) Equation Slope Intercept
4.5 0 y ¼ 6.0 � 106x þ 6.78 6.0 � 106 6.54
4.5 20.1 y ¼ 5.0 � 106x þ 15.07 6.7 � 106 16.5
4.5 20.2 y ¼ 3.0 � 106x þ 4.66 3.0 � 106 4.66
4.5 þ0.1 y ¼ 3.0 � 106x þ 3.13 3.0 � 106 3.13
4.5 þ0.2 y ¼ 3.0 � 106x þ 0.12 3.0 � 106 0.12
7.4 0 y ¼ 4.0 � 106x þ 7.59 4.0 � 106 7.59
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Blankert et al.924
totally inhibited the biosensor response. This phenomenon is well reported in the
literature and attributed to the radical scavenging action of GSH and AA.[12,21]
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Figure 4. Schematic drawn of the biosensor response and typical chronoampero-
metric recording. (View this art in color at www.dekker.com.)
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HRP Electrode for CLZ Analysis 925
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Blankert et al.926
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Received October 10, 2003
Accepted December 1, 2003
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HRP Electrode for CLZ Analysis 927
Résultats
- 99 -
6.4 Horseradish peroxidase immobilised carbon paste electrode
based on peroxidation of clozapine for the study of thiols.
B. Blankert, O. Dominguez, E. Bodoki, R. Sandulescu, J. Arcos, J.-M. Kauffmann.
Biosensors and Bioelectronics, soumis.
Résultats
- 100 -
6.4.1 Introduction.
La clozapine (CLZ) est une dibenzoazépine fréquemment utilisée dans le domaine
psychiatrique en raison de ses propriétés neuroleptiques particulièrement
intéressantes et ce surtout chez les cas réfractaires. Toutefois l'usage de la molécule
est restreint par un risque élevé d'effets secondaires de type agranulocytose.
L'étiologie exacte de ce problème hématologique demeure irrésolu, mais est très
souvent attribuée à la formation d’une structure nitrénium lors du processus de
métabolisation oxydative. Cette structure est très réactive vis-à-vis des fonctions
thiols telles que rencontrées dans le glutathion (GSH) et dans la plupart des
macromolécules protéiques.
Mettre en application le biocapteur décrit précédemment (cfr Point 6.3) en vue de
simuler la biotransformation de la CLZ nous est apparu intéressant dans l’optique
d’étudier des dérivés capables potentiellement d’inhiber la réponse de la CLZ. Nous
avons fortement focalisé notre attention sur les molécules à fonctions thiols
(glutathion, cystéine,…) qui, comme il est décrit dans la littérature, piègent par
addition nucléophile, l’ion nitrénium. Celui-ci est également généré à l'interface du
biocapteur par la peroxydase de raifort en présence de peroxyde d’hydrogène. Le
biocapteur peut donc servir de modèle expérimental pour étudier certains facteurs
interférant au niveau de la peroxydation de la clozapine.
Les thiols, groupe essentiel de molécules, jouent des rôles multiples dans les
systèmes physiologiques. Ils procurent à la cellule un mécanisme de défense contre
les stress oxydant et lui permettent de cette façon de conserver son intégrité. Un
épuisement en dérivés thiol de la cellule est à l'origine de nombreuses affections. La
détermination de cette catégorie de composés peut s'avérer d'une grande pertinence
pour le clinicien en vue d'un diagnostic précoce. De nombreuses procédures
analytiques ont été décrites, mais présentent souvent de lourdes mises en œuvre
instrumentales ou de préparation. Les techniques électroanalytiques par leur
simplicité opérationnelle, constituent une alternative séduisante vis-à-vis des
biomolécules électroactives.
Une série de molécules connues pour leur réactivité vis-à-vis de l’ion nitrénium a été
étudiée au moyen du modèle expérimental développé: glutathion, N-acétyl-cystéine,
cystéine et captopril.
Résultats
- 101 -
Toutes les mesures ont été réalisées en tampon phosphate pH 7.4 en présence de
peroxyde d’hydrogène (0,1 mM) à température ambiante et sous agitation constante.
Suite à l’observation antérieure (cfr 6.2), par voltampérométrie à une électrode à pâte
de carbone (EPC) de la disparition totale des pics de réduction de la CLZ en
présence d’une concentration en GSH 10 fois supérieure à la CLZ, nous avons
étudié l’influence de potentiel appliqué à l’EPC/HRP. Trois potentiels différents ont
été testés (0 ; 0,15 et 0,2 V), une réponse identique est fournie à 0 et 0,15 V. Un
signal plus faible est obtenu à 0,2 V. Par relation avec nos travaux en CL/EC/SM,
ces pics de réduction correspondent vraisemblablement à la réduction des produits
d’oxydation formés : l’ion nitrénium et une forme quinoneimine. L’action du GSH
additionné s’exerce par addition de GSH sur l’ion nitrénium pour former un adduit
GS-CLZ (forme réduite) et entraîne la disparition des pics de réduction. En vue
d’obtenir le meilleur signal possible lors de l’ajout de GSH, nous avons étudié
l’influence de la concentration initiale en CLZ (entre 5,0 x 10-6 M et 1,0 x 10-4 M).
Celle-ci n’a relativement que peu d’influence jusqu’à une concentration de 6,0 x 10-5
M à partir de laquelle l’inhibition du signal diminue fortement et disparaît totalement
pour une concentration de 1,0 x 10-4 M en CLZ. Nous avons dès lors réalisé
l’ensemble des travaux expérimentaux sous une concentration initiale en CLZ de 3,0
x 10-5 M et à un potentiel de +0,15 V.
Dans ce chapitre, nous avons pu mettre en évidence une relation linéaire entre la
diminution de courant de réduction et la concentration en inhibiteur introduit et ce
pour un domaine de linéarité compris entre 5,0 x 10-6 M et 4,0 x 10-5 M pour chacun
des dérivés étudiés. Le biocapteur est fraîchement préparé au départ de chaque
essai, il offre un temps de réponse (t90) rapide (150s)
Nous avons également déterminé certains paramètres de cinétique enzymatique par
l'exploitation des courbes de calibration exprimées en pourcentage d'inhibition en
vue de l'évaluation de la constante d'inhibition (Ki) et de IC50. Le NAC a démontré les
meilleures dispositions quant à l’inhibition du signal du biocapteur, observation
intéressante du point de vue de la mise en œuvre d’un antidote contre l’intoxication
par la clozapine.
Nous avons déterminé le type d'inhibition enzymatique qui entre en jeu par
l'établissement de courbes ampérométriques de la clozapine à l'EPC/HRP en
absence ou présence d'un dérivé thiol et détermination du Km apparent. Cette
constante ne varie pas en présence de l’inhibiteur et permet de postuler une
Résultats
- 102 -
inhibition non compétitive comme déjà rapporté dans la littérature dans le cas de
systèmes similaires mais pour d’autres substrats. Cette interprétation confirmerait
l’action supposée des thiols, non pas envers le site enzymatique, mais directement
sur l’ion nitrénium.
Nos résultats permettent de mettre en évidence l’intérêt de la mise en œuvre
d’électrodes enzymatiques en tant que modèle de biotransformation oxydative de
molécules d’intérêt pharmaceutique telle la clozapine. Ce biocapteur permet entre
autre une approche quantitative pour la détermination des thiols et autorise leur
classification en terme d’efficacité d’inhibition. L’amélioration et l’optimisation de
différents paramètres constitutifs, rendent possible une utilisation de tels biocapteurs
pour des études de biotransformation en criblage rapide.
1
Horseradish peroxidase immobilised carbon paste electrode based on
peroxidation of clozapine for the study of thiols.
Bertrand Blankert 1, Olga Dominguez 2, Ede Bodoki 3, Robert Săndulescu 3, Julia
Arcos 2, Jean-Michel Kauffmann 1*. 1Université Libre de Bruxelles, Institute of Pharmacy, Laboratory of Instrumental Analysis &
Bioelectrochemistry, Boulevard du Triomphe, Campus Plaine, CP205/6, 1050 Brussels, Belgium.
2 Universidade de Burgos, Science Faculty, Chemistry Department, Analytical Chemistry, Burgos, Spain.
3 Universitatea « Iuliu Hatieganu », Faculty of Pharmacy, Department of Analytical Chemistry, Cluj-
Napoca, Romania.
______________________________________________________________________
Abstract
In the present study, an HRP based biosensor is presented as an in vitro experimental
model mimicking the hepatic enzyme CYP450 isoforms, for the screening and assay of
molecules potentially able to affect the clozapine response at the biosensor. The
amperometric signal corresponds to the reduction, at the electrode surface, of an
electroactive species generated by HRP in the presence of clozapine and hydrogen
peroxide. This reactive form is a relatively stable nitrenium cation generated also via the
CYP450 system. The nitrenium form of clozapine has been reported to be involved in
problematic in vivo side effects such as agranulocytosis. Thiol derivatives such as
glutathione have been reported to protect living cells from CLZ deleterious effects by
conjugation to the reactive nitrenium structure. The present contribution proposes to
investigate in a comparative manner the inhibition properties of four known thiols
compounds, namely: glutathione, N-acetyl cysteine, cysteine and captopril. Influences
of the applied potential and initial clozapine concentration have been studied.
Experiments were performed at + 0.15 V in phosphate buffer solution pH 7.4, in the
presence of hydrogen peroxide 0.1 mM, at room temperature. The biosensor response is
linearly related to the studied inhibitor in the concentration range comprised between
5.0 x 10-6 and 4.0 x 10-5 M. The response time (t90) is 150 s. From the calibrations
curves, the parameter IC50 is extracted which allows to classify the four investigated
thiols compounds in terms of signal inhibition efficiency. Respective Kmapp, is
2
calculated from the Lineweaver-Burk plot. The presence of the inhibitor did not
significantly affect the Kmapp and inhibition is thus assumed to be non competitive.
______________________________________________________________________
1. Introduction
The quantitative determination of the psychotropic drug clozapine (CLZ) was
previously performed by amperometry with a horseradish peroxidase (HRP)
immobilized biosensor (Blankert et al., 2004). The amperometric signal corresponded to
the reduction, at the electrode surface, of an electroactive species generated by HRP in
the presence of hydrogen peroxide. In the literature devoted to clozapine oxidative
biotransformation, a relatively stable nitrenium cation was postulated to be the reactive
form generated via the CYP450 (Pirmohamed et al., 1995) and the myeloperoxidase-
hydrogen peroxide systems (Liu et al., 1995; Frimat et al., 1997). This reactive form
along with other oxidized species of CLZ was also recently identified by an integrated
set up coupling on-line, electrochemistry, liquid chromatography and mass spectrometry
(van Leeuw et al., 2005). The nitrenium form of clozapine has been reported to be
involved in problematic in vivo side effects such as agranulocytosis (Liu et al., 1995;
Uetrecht et al., 1997; Williams et al., 1997). The application of a HRP based biosensor
as in vitro experimental model mimicking the hepatic enzyme CYP450 isoforms
(Fischer et al., 1991; Maggs et al., 1995), was found to be of interest in the present
study for the screening and assay of molecules potentially able to affect the clozapine
response at the biosensor. The investigation of different thiols was of particular concern
since a thiol derivative such as glutathione has been reported to protect living cells from
CLZ deleterious effects by conjugation to the reactive nitrenium structure (Liu et al.,
1995; Rover et al., 2001; Huang et al., 2002; White et al., 2002; Sezginturk et al., 2004;
Ruiz-Diaz et al., 2005). Inhibition of the amperometric signal was therefore expected to
occur due to interaction of the added thiol with the nitrenium ion generated at the HRP
based biosensor.
Experimental
Apparatus
Amperometric measurements were carried out by means of a μAutolab of type II
potentiostat (Eco Chemie, BV, Utrecht) using a conventional three-electrode
configuration comprising a solid carbon paste as working electrode (sCPE) with a
3
diameter of 3mm, a Ag/AgCl 3 M KCl as reference and a platinum wire as auxiliary
electrodes. The analysed solution was gently stirred with a magnetic bar during the
recordings. All experiments were made at room temperature (22 ± 1ºC). The pH of the
solutions was measured with a Crison Model 2002 (Barcelona, Spain) pH meter. Cyclic
voltamperometry was performed using a potentiostat model 175 (EG&G) and a
polarographic analyser model 174A (EG&G) connected to a XY recorder Servogor
(BBC GOERZ).
Reagents
All reagents were of analytical grade and the solutions were prepared with Milli-Q
quality water. Horseradish peroxidase (EC 1.11.1.7), glutathione (GSH), glutathione
disulfide (GSSG) and captopril (CAP) were from Sigma (Steinheim, Germany).
Clozapine (CLZ), N-acetyl cysteine (NAC) and the dialysis membrane were from
Sigma (Bornem, Belgium). Cysteine (CYS), cystine is purchased from (Merck,
Darmstadt, Germany). Hydrogen peroxide 30% m/v was from Panreac (Barcelona,
Spain).
Buffer solutions were prepared from sodium dihydrogen phosphate (Panreac,
Barcelona, Spain) and sodium hydrogen phosphate (Merck, Darmstadt, Germany).
Appropriate volumes of 0.2 M solution of each phosphate salt were mixed in order to
obtain phosphate buffers (PB) with the desired pH value. Solid paraffin and BSA were
from Sigma (Steinheim, Germany). Graphite powder was obtained from Connex®
(Conmetal, Celle, Belgium).
Enzyme immobilization and solid carbon paste electrode preparation
The enzyme immobilization was performed as described in our previous papers realized
by cross-linking HRP and BSA in the presence of 2.5 % (v/v) aqueous solution of
glutaraldehyde (GA) (Razola et al., 2000; Blankert et al., 2004). The HRP immobilized
solid carbon paste was obtained by blending, in a mortar at 45°C, the obtained HRP-
GA-BSA crystal powder (5% m/m), solid paraffin (33% m/m) and graphite particles
(62% m/m). After solidification and homogenisation at room temperature, the paste was
pressed into the hollow of the electrode body. The surface of the modified electrode was
smoothed manually on a soft clean paper and the electrode tip was covered with a
dialysis membrane (m.w.cutoff: 12000 Da) secured to the electrode body with an O-ring
rubber. The biosensor was stored dipped in phosphate buffer pH 4.5 at 5ºC when not in
4
use.
Kmapp determination
Calibrations curves of CLZ were realized in the absence and in the presence of the
studied inhibitor (Blankert et al., 2004). Three inhibitor concentrations were
investigated namely, 4.97, 7.44 and 9.89 x 10-6 M. Kmapp was obtained by plotting 1/I
against 1/[S] (Lineweaver-Burk plot) for each calibration curve.
Inhibition study
The biosensor was placed in the electrochemical cell containing 10.0 ml of phosphate
buffer solution, pH 7.4. Once a stable baseline established, hydrogen peroxide (final
concentration 0.1 mM) was added giving a small response due to the direct
electroreduction of some HRPox located in close proximity to the graphite particles at
the biosensor/solution interface (Blankert et al., 2004) (Fig. 1). The subsequent addition
of clozapine (final concentration: 3.0 x 10-5 M) produced a large reduction current with
a plateau corresponding to the steady-state response. Defined volumes of the inhibitor
(thiol) stock solution were added stepwise when a plateau current was reached (Fig.1).
The inhibition was quantitatively evaluated by determining the ratio of the current
change between the initial steady-state current and the steady state current resulting
from the addition of an aliquot of the inhibitor stock solution (I), versus the original
current I0.
5
-8.0E-08
-7.0E-08
-6.0E-08
-5.0E-08
-4.0E-08
-3.0E-08
-2.0E-08
-1.0E-08
0.0E+00
0 800 1600 2400 3200
time (s)
Cur
rent
(A)
[CLOZAPINE] = 3 x 10-5 M
[GSH] = 1 x 10-6 M
[GSH] = 3 x 10-6 M
[GSH] = 8 x 10-6 M
[GSH] = 1.3 x 10-5 M
[H2O2] = 0.1 mM [GSH] = 3.3 x 10-5 M
[GSH] = 2.3 x 10-5 M
[GSH] = 4.3 x 10-5 M
Figure 1: Typical chronoamperometric recordings at the HRP-sCPE, Eapp = + 0.15 V,
phosphate buffer pH 7.4. (1) addition of H2O2, (2) addition of CLZ (final concentration
3.0 x 10-5 M) and (3) successive injections of aliquots of a 1.0 x 10-3 M GSH solution
Results
Influence of the applied potential
Glutathione was used as a reference inhibitor in the amperometric and cyclic
voltamperometric experiments of CLZ at the HRP biosensor and at the sCPE,
respectively. The latter showed in PB 7.4, by reversing the scan direction after the
oxidation peak of clozapine (10 µM), reduction peaks at + 0.350 V and + 0.100 V (Fig.
2A). Addition of GSH to this solution suppressed totally these reduction peaks for a
GSH concentration ten times higher than CLZ (Fig. 2B). Amperometric assays were
performed with the HRP biosensor in the presence of 0.1 mM H2O2 and 1.5 x 10-5 M
CLZ in PB pH 7.4. Three different potentials were studied; 0.0, + 0.15 and + 0.20 V. No
significant difference was observed between potentials + 0.15 V and 0.0 V. At + 0.20
V, a smaller response was clearly obtained.
(1) (2)
(3)
6
10
40
30
20
10
40
30
20
A B
Figure 2. (A) Typical cyclic voltamperograms of CLZ 10 µM at the solid carbon paste
electrode. PBS pH 7.4; scan rate: 50 mV/s; Ag/AgCl KCl 3M. (B) Same as in (A) but
after GSH addition: 3.0 x 10-5 M (dotted lines = second scan).
Based on the interpretation of the LC-EC-MS data (van Leeuw et al., 2005), the
reduction peaks at + 0.350 V and + 0.100 V corresponded most likely to the reduction
of the nitrenium cation and to some quinoneimine form of CLZ, respectively. We may
infer that the GSH effect in both experiments was due to the conjugation of GSH to the
CLZ nitrenium cation giving rise to the GS-CLZ adduct with CLZ back to its reduced
state following eq.1:
Eq.1 Schematic mechanism of clozapine oxidation by HRP/H2O2, with subsequent
formation of GSH adducts on the nitrenium ion.
N
N C l
H
N
NCH 3
1
43
5
6
8 7
2
910
N
NCl
N
NCH 3
1
43
5
6
8
7
2
910
N
N Cl
H
N
NCH 3
1
43
5
6
8
7
2
910
H R P
H 2O 2
+G S
G S
GSH
GS
7
Results from the literature suggested that one or more GSH molecules may be linked to
CLZ (Maggs et al., 1995; van Leeuw et al., 2005). Subsequent experiments were
performed at + 0.15 V i.e. in the diffusion current of the nitrenium cation.
Influence of CLZ concentration
In order to determine the influence of CLZ on the sensitivity of the biosensor response
towards added thiols, several CLZ concentrations in the range 5.0 x 10-6 - 1.0 x 10-4 M
were investigated. It was found that the concentration of CLZ had little influence on the
calibration curve expect for CLZ concentrations above 6.0 x 10-5 M where the inhibition
signal was substantially lower and no inhibition response was detected above 1.0 x 10-4
M.
Analytical figures of merit
As summarized in Table 2, the biosensor response was linearly related to the inhibitor in
the concentration range comprised between 5.0 x 10-6 and 4.0 x 10-5 M (RSD calculated
from the slope of the calibration curves). A typical calibration curve is illustrated in Fig.
3 in the case of GSH. Results were obtained with a freshly built biosensor for each
assay (n = 3). The response time (t90) was 150 s. It was checked that the addition of the
thiol molecules produced no amperometric signal at the HRP/H2O2 biosensor in the
absence of CLZ in the analyzed solution. Likewise, addition of GSSG produced no
inhibition of the CLZ signal.
Inhibitor R2 Linear range RSD
on slope
IC50
(10-5
M)
Km
(10-4 M)
Glutathione 0.9994 1.0 x 10-6 - 4.3 x 10-5 M * 2.9 2.3 1.9 ± 0.3
N-acetyl
cysteine (NAC) 0.9889 4.8 x 10-6 - 3.3 x 10-5 M 18.0 1.5 2.0 ± 0.3
Cysteine 0.9857 3.0 x 10-6 - 5.0 x 10-5 M 6.6 2.3 2.7 ± 0.3
Captopril 0.9962 4.8 x 10-6 - 4.2 x 10-5 M 16.0 3.5 1.5 ± 0.3
Table 2. Analytical figures of merit for different tested thiols at the HRP sCPE (n=3 and
8
* see in Figure 3 n=5). Experimental conditions as in Fig.1
0.0%
10.0%
20.0%
30.0%
40.0%
50.0%
60.0%
70.0%
80.0%
90.0%
100.0%
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
[GSH]/µM
Inh
%
Figure 3. Typical calibration curve for GSH (n=5). Percentage of inhibition as a
function of glutathione concentration (Eapp.: 0.15 V; pH 7.4)
Inhibition with thiols
The concentration of inhibitor giving 50% inhibition of the CLZ response (3 x 10-5 M)
was extracted from the inhibition calibration curve (Fig. 3). Among the four thiol
compounds investigated, NAC appeared to be the best inhibitor i.e lowest IC50 (Table
1). This result would be potentially of interest for the selection of NAC as an antidote
candidate in CLZ intoxication. The Kmapp, calculated from the Lineweaver-Burk plot
and determined from the calibration curves in the absence and in the presence of the
inhibitor are reported in Table 2. The presence of the inhibitor did not significantly
affect the Kmapp and inhibition was thus assumed to be non competitive. This has also
been observed in the literature (Ochoe de Aspuru et al., 1999) with the GSH/HRP/H2O2
system, though the substrate they utilized was guaiacol. This would confirm that GSH
and the other thiols derivatives do not act on the enzymatic site but react thoroughly
with the generated CLZ nitrenium cation. It is worth mentioning that thiol derivatives
may be oxidized by the HRP/H2O2 system (Rao et al., 1990) but from the above
9
obtained results this was not inferred with the present HRP/H2O2 biosensor likely due to
the readily peroxidation of clozapine.
Conclusion
The amperometric biosensor based on immobilized HRP, in the presence of dissolved
H2O2, can be regarded as a useful model system to reproduce clozapine bioactivation
and to generate clozapine reactive species such as the CLZ nitrenium cation. Since the
latter was electroactive at low applied potentials, the biosensor signal can be
advantageously exploited for inhibition studies by nucleophilic reagents such as
sulfhydryl species (thiols) which form stabilized thiol clozapine conjugates not
electroactive at the applied potential. The developed biosensor allowed both the
sensitive quantification of thiol species and their classification in terms of signal
inhibition efficiency. Different electrode configurations may be considered for the rapid
screening of inhibitors of clozapine drug biotransformation in general.
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Conclusion
- 103 -
7 Résumé et Conclusions.
Le thème principal de notre travail consistait en la mise en exergue de l'efficience de
la mise en œuvre de techniques hybrides associant l’électrochimie à l’élément
biologique (biocapteur) ou l’électrochimie aux performances de la spectrométrie de
masse (couplage EC-MS). Les informations fournies, jointes aux résultats des
mesures en voltampérométrie sur électrodes solides, permettent une bonne
compréhension mécanistique quant au devenir oxydatif de substances
médicamenteuses.
Notre champ d'investigation s'est plus spécifiquement focalisé sur deux familles de
molécules psychotropes (les phénothiazines, et une dibenzoazépine). Celles-ci
connaissent un usage thérapeutique intensif et un regain d’intérêt pour des
applications nouvelles, mais leur utilisation optimale souffre de l’existence d'effets
secondaires physiopathologiques importants et dont l’étiologie est encore mal
connue.
En premier lieu, les résultats de la voltampérométrie cyclique et les différentes
modulations en ligne d'une cellule électrochimique couplée à la détection par
spectrométrie de masse, nous ont permis de mettre en évidence des différences
essentielles dans le devenir des phénothiazines quant aux produits d'oxydations
générés. Plus précisément, un comportement clairement distinct entre les
phénothiazines garnies de deux (2C) ou trois carbones (3C) entre les deux azotes au
niveau de leur chaîne latérale a pu être mis en évidence. Les phénothiazines 3C
s'oxydent de manière classique en leur sulfoxyde correspondant. Par contre, les
phenothiazines 2C, conjointement à la formation de leur sulfoxyde, souffrent dans
des conditions énergiques d’oxydation (persulfate, potentiel élevé) d'une rupture de
la chaîne latérale et libèrent la phénothiazine base aisément oxydable et donc
subissant elle-même une oxydation. Au vu des structures moléculaires en trois
dimensions, nous émettons l’hypothèse que volume trop important de la chaîne
latérale des phénothiazines 2C empêcherait le déploiement aisé des structures
aromatiques en un radical cation coplanaire lors du phénomène d'oxydation. Les
tensions intrastructurelles apparues conduiraient au bris de la chaîne latérale.
Différents modes d'oxydation (chimique, électrochimique, enzymatique) ont été
utilisés et laissent chacun apparaître la dépendance directe entre la puissance de
Conclusion
- 104 -
l'agent oxydant appliqué et les produits d'oxydation obtenus. Chaque technique de
détection, de manière individuelle, a bien confirmé la dualité entre les deux groupes
de molécules. La mise en commun des divers résultats nous a permis l'identification
irrévocable des espèces intermédiaires instables et des composés finaux. Par
corollaire, nous avons pu postuler un schéma général d'oxydation pour les dérivés
phénothiaziniques. Il nous paraît intéressant de transposer nos résultats aux
biotransformations des phénothiazines car les produits identifiés ne possèdent pas
l'activité pharmacologique du composé parent mais présentent un profil toxicologique
bien répertorié dans la littérature. Nos résultats suggèrent d’approfondir les études
de biotransformation afin de déterminer si ‘l’éclatement’ oxydatif des phénothiazines
2C est également observé in vivo. Une relation cause/effet de ces métabolites
pourrait ainsi être établie.
En deuxième point, au travers de l'association CE/SM ou CE/CL/SM, nous avons
étudié l’électroxydation de la clozapine. La génération et l'identification des
principaux métabolites de phases I et II, illustre un mimétisme certain avec le
CYP450, et nous a permis de confirmer de nombreuses données de la littérature
quant à l'oxydation in vivo et in vitro de la clozapine. L'oxydation électrochimique ne
génère cependant pas l'ensemble des réactions de métabolisation prises en charge
par le système CYP450. Lors de la combinaison CE/SM, par l'absence de séparation
chromatographique dans cette configuration, le spectre de masse présente un pic
correspondant à un intermédiaire à demi-vie courte, difficilement et rarement mis en
évidence: l'ion nitrénium. Cette espèce hautement réactive envers les fonctions thiols
des petites molécules et des protéines, se trouve très régulièrement tenue pour
responsable majeur de la toxicité avérée de la clozapine.
L'apparition plus abondante de dérivés déméthylés démontre l'influence du potentiel
appliqué à l'électrode de travail lors de l'oxydation électrochimique. En effet, les
processus de déméthylation nécessitent des potentiels élevés pour être observés.
En présence de glutathion, aux différents pics antérieurement identifiés, des pics
supplémentaires relatifs à la formation d'adduits de GSH sur la CLZ apparaissent.
Les courbes voltampérométriques réalisées sur la clozapine suggèrent la
distinctement la formation de l'ion nitrénium et d'une nouvelle espèce aisément
électroréduite, probablement une structure quinone imine. L'addition de GSH
provoque la disparition des pics de réduction de la CLZ. Ces comportements en VC
corroborent les interprétations issues des mesures par couplage EC/CL/SM.
Conclusion
- 105 -
La dernière partie de notre travail a consisté en la construction d'un biocapteur à pâte
de carbone solide avec inclusion au sein de cette matrice de peroxydase de raifort.
Basé sur la capacité reconnue de l'HRP à reproduire in vitro des produits d'oxydation
similaires à la métabolisation in vivo, nous avons exploité un tel biocapteur pour
l'analyse de la clozapine et de composés thiols. Une compréhension fine du
mécanisme opérationnel intrinsèque du biocapteur a pu être suggérée. La génération
à la surface de l'électrode de l'ion nitrénium par oxydation enzymatique de la
clozapine par l'HRP, suivie de sa réduction immédiate fournit un courant
ampérométrique substantiel. Sous des conditions de pH optimales, ce courant de
réduction autorise la détermination quantitative de la clozapine dans un domaine de
linéarité compris entre 1 x 10-5 M et 1 x 10-6 M. L'addition de composés thiols dans le
milieu occasionne une chute de courant par action de ceux-ci sur la structure radical
cation ou nitrénium par addition nucléophile. La disparition de l'ion nitrénium et la
formation d'un adduit GSH-CLZ inhibent tout processus de réduction à l'électrode du
biocapteur. Cette diminution de courant proportionnelle aux concentrations en thiols
introduits, permet la détermination quantitative de dérivés thiols. Les courbes de
calibration exprimées en pourcentage d'inhibition conduisent facilement à l'évaluation
de la constante d'inhibition (Ki) et de CI50. L'étude de la réponse ampérométrique de
la clozapine à l'EPC/HRP en l'absence ou présence d'un dérivé thiol envisagé
permet la détermination de Km et de caractériser le type d'inhibition qui entre en jeu.
De tels paramètres cinétiques nous ont habilités à classer les thiols considérés en
fonction de leur puissance réactionnelle envers les substances oxydées de la
clozapine.
Au terme de ce travail, nous espérons avoir illustré, par l’étude de quelques
molécules modèles, l’intérêt de la mise en œuvre des techniques électrochimiques
couplées à l’élément biologique ou à la spectrométrie de masse. Des améliorations
au niveau de la cellule électrochimique sont envisageables par l’emploi d’électrodes
modifiées, elles laissent entrevoir la possibilité de mimer totalement le système
CYP450.
Les résultats fournis par ces techniques hybrides et par voltampérométrie cyclique
sont complémentaires, ils procurent un éventail d'informations d'une utilité estimable
pour une application dans des études prédictives précoces de candidats
médicament.
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