institute of biotechnology national ilan university master...

國立宜蘭大學生物技術研究所

碩士論文

Institute of Biotechnology

National Ilan University

Master Thesis

液態靈芝發酵產物對離乳仔猪生長與免疫的影響

Effects of fermentative products from Ganoderma lucidum on growth

performance and immunity in weanling piglets

指導教授:

Yeong-Hsiang Cheng, Ph. D.

Su-Der Chen, Ph.D.

研究生：謝孟真

Meng-Chen Hsieh

中華民國九十五年六月

鄭永祥博士

陳淑德博士

I

摘要

靈芝的二次代謝物中具有許多生理活性物質，其中靈芝多醣具有抗腫

瘤、降血糖與抗 HIV 等活性。靈芝多醣中具有 β-葡聚醣螺旋狀結構可為動

物體內的免疫細胞辨識進而激發免疫活性。本論文研究之目的分為兩個部

份，第一個部份為液態培養靈芝發酵液和市售靈芝粉末的多醣和葡聚醣定

量分析；第二部份為動物試驗，研究不同劑量的葡聚醣餵食離乳仔猪後的

生長表現以及對免疫反應和抵抗猪環狀病毒二型（Procine Circovirus；

PCV-2）能力的評估。首先將液態靈芝發酵液和商業靈芝粉以酚硫酸法測多

醣產量，再以螢光分析(Aniline blue)方法進行葡聚醣定量。

商業產品經由測定後多醣和 β-1,3-葡聚醣含量分別約佔 4.7~14.3%、

1~7.25%。發酵液中添加的 3%黃豆粉、2%玉米粉及 5%葡萄糖之 A 配方可

在第二天達 19515µg/mL 最高產量，遠較只含 5%葡萄糖培養液多醣產量

多，以饋料方式對靈芝多醣合成沒有顯著影響。利用三週齡離乳仔猪分別

在飼料中添加 0、50、100 及 150 ppm β-1,3-葡聚醣進行四週的動物生長試

驗，其中動物試驗以飼料中添加 50 ppm 的 β-1,3-葡聚醣劑量生長表現最好，

平均每日增重最多且和飼料效率也最佳，而血清中血紅素結合蛋白的濃度

會隨著添加 β-1,3-葡聚醣劑量增加而提高，此外，仔猪之血清猪瘟抗體力價

於各處理組間並無顯著差異，但已有保護效果。由血液生化學分析結果發

現，餵食不同種劑量的 β-1,3-葡聚醣會可降低血液中的血糖濃度，但對肝功

II

能指標的 ALT、AST，腎功能指標的肌酸酐 (creatinine) 均無明顯影響。

仔猪攻毒試驗結果顯示，在餵食四週 50 ppm β-1,3-葡聚醣離乳仔猪均

無 PCV-2 病毒殘留，脾臟、鼠蹊淋巴結與肺門淋巴結偵測細胞激素 IL-1、

IL-2、IL-4、IL-8、TNF-α 基因表現量，各組間差異不顯著。仔猪的組織切

片發現除脾臟未受損外，對照組的仔猪之鼠蹊淋巴結與肺門淋巴結均有淋

巴流失及週邊出血病變發生等明顯 PCV-2感染情形，可見餵食 50 ppm β-1,3-

葡聚醣離乳仔猪對 PCV2 攻毒離乳仔猪具有保護效果。

III

Abstract

The metabolites of Ganoderma lucidum bearing with many bioactive

materials, especially the polysaccharide. β-Glucan is a component of

Ganoderma polysaccharide, and it could stimulate certain immune response.

The objectives of this study are to analyze the polysaccharide and glucan

contents of Ganoderma lucidum fermented products, and to investigate the

growth performance, PCV-2 challenge of weanling pigs by different β-Glucan

dosages in feeds.

The polysaccharide and glucan contents were analyzed by phenol-sulfuric

acid method and aniline blue dye fluorescence assay, respectively. The first

animal experiment, four Ganodrma β-1,3-glucan dosages (0, 50, 100 and

150ppm) were carried out on 3 weeks age weanling piglets feeding with for 4

weeks. The growth performance parameters, such as average daily weight gain,

feed intake, blood biochemistry analyses, and CSFV (previously called hog

cholera virus) antibody titer were evaluated. The second experiment was carried

out on 3 weeks age of weanling pigs which were challenged with PCV-2 and

feeded with 50ppm with or without Ganoderma β-1,3-glucan. Pigs were

sacrificed after four week feeding, and spleen, groin lymphoid and hilum

lymphoid nodes were sampling to evaluate resistance of PCV-2 by cytokines

IV

detection and PCV-2 nucleic acid by RT-PCR and PCR, respectively. The

sections of lymphoid tissues histopathology were also examined.

The results showed that polysaccharide and β-1,3-glucan contents in

commercial Ganoderma lucidum fermented products were 4.7~14.3% and

1~7.25%, respectively. The ratio of β-1,3-glucan to polysaccharide in the dried

products were 14.60~50.70%. Added 3% soybean and 2% corn as major carbon

and nitrogen resources in Ganoderma fermented culture raised culture with

fermentative products can raise polysaccharide level up to 19515µg/mL, which

was more than fermentative culture with only 5% glucose carbon source. There

were no effects on polysaccharide production to feed glucose as fed-batch.

The animal experiment results also showed that pigs fed with 50ppm

β-1,3-glucan had better average daily weight gain and the lowest feed efficiency

than the other treatments.The 150ppm feeding group has the lowest feed intake.

Blood biochemistry analyses showed that lower glucose level in pigs fed with 50

ppm, however, there were no effects on CSFV antibody titer production.

PCV-2 challenge trial, PCV-2 nucleic acid were not detected from pig fed

with 50 ppm β-1,3-glucan by PCR, and cytokines mRNA expression for IL-1、

IL-2、IL-4、IL-8、TNF-α were identified on spleen, groin lymphoid and hilum

lymphoid, but there were no significantly difference between two groups. The

V

sections indicated that there were no lesions on spleen, however, lymphocyte

depletion, and peripheral bleeding were observed in lymphoids node in control

group. Summarized our findings suggest that incorporation of 50ppm

β-1,3-glucan from Ganoderma lucidum could protect early weanling pigs from

PCV-2 infection.

VI

誌謝

轉眼間順利的完成了碩士學位，首先非常感謝我的指導教授─ 鄭永祥

老師與陳淑德老師。感謝鄭老師於繁忙的公務及教學之餘，傾盡心力指導

我，並引領我進行實驗規劃、研讀期刊等，甚至讓我有機會前往別的實驗

室學習；此外，淑德老師給予我生活上許多關懷，並啟發我另類的邏輯思

考方式，使我在思考上有煥然一新的感覺，在其訓練下，也使我能更有自

信面對一切事物。兩位老師無論白天、晚上或假日都堅守崗位，使我能隨

時獲得協助，兩年的共同指導下，也帶領我邁向成長與進步的道路，在此

獻上無限的感恩之心。

同時亦感謝東華大學翁慶豐老師、屏東科技大學邱明堂老師、與嘉

義大學張明煌老師、及宜蘭醫院朱金池主任等，皆於實驗中給予無限的

幫忙與指導。此外，宜蘭大學陳威戎老師更提供研讀室，使班上同學能一

起撰寫論文並討論實驗；最後，論文要特別感謝口試委員張讚昌老師仔細

的修改指正，並藉由老師們求學問的風範、態度領受下，逐漸踏入知識的

殿堂。

宜蘭就像我第二個家庭，要從這裡畢業十分的不捨，求學期間與班上

同學相處也很融洽: 好麻吉摯友繁星-嘉琦，分享了我很多生活上的快樂憂

傷，使我開朗許多；同實驗室一起打拼實驗的小猴-后妍，也常互相鼓勵與

修課；再者就是 Honda 與小安帶我認識了許多宜蘭好玩的地方，讓我於寫

VII

論文期間不至於太過煩悶；最後我要感謝實驗室一起打拚的學弟妹，尤其

是靈芝小隊食品學弟妹：從開始實驗系統建立的晉毅、易如、鴻銘，到現

在優秀認真的學弟妹-偉仲、玉婷等，讓我在最後論文階段倍感溫馨;動物試

驗期間，動物系的學弟妹-昆彥、小蛙、至豪等的幫助，讓我不至於分身乏

術；還有同家研一的達偉、羽橙及秀芸都給我許多體諒與幫助，其他如東

海的大學好友-卡菲兒、兔子、荒、cindy、阿使、煙大俠、屎墨等好友的精

神支持，還有疼愛我的爸媽，支持並關懷我。碩士班期間的友情、親情、

愛情都讓我無限感動，滿滿的愛讓我能夠在挫折的時候重新站起、並順利

完成論文。最後我相信在兩位恩師的帶領下，未來實驗室將會是最強、最

有向心力的團隊，還有我最愛的靈芝小隊隊員們，雖然不能一一提及，但

希望你們知道我是最愛你們的，以後有任何困難我都會義不容辭的幫忙，

要努力永續經營下去阿!!

VIII

總目錄

中文摘要…………………………………………………………………I

英文摘要…………………………………………………………...........III

誌謝……………………………………………………………………..VI

總目錄…………………………………………………………………..VIII

表目錄………………………………………………………………….XIV

圖目錄…………………………………………………………………..XV

壹、前言...……………………………………………………………………….1

貳、文獻回顧……………………………………………………………….1

ㄧ、靈芝簡介…………………………………………………………...1

(一 )靈芝發展史…………………………………………………………1

(二 )靈芝分類與特徵……………………………………………………2

(三 )靈芝生活史…………………………………………………………3

(四 )靈芝的栽培…………………………………………………………6

(五 )靈芝的生理活性……………………………………………………6

1. 抗腫瘤及抗癌活性…………………………………………………7

2. 抗血管新生…………………………………………………………8

3. 抑制血小板凝集和降血壓作用……………………………………8

4. 降血糖與降低膽固醇作用…………………………………………9

IX

5. 抗真菌………………………………………………………………9

6. 抗發炎………………………………………………………………10

7. 抗病毒………………………………………………………………10

8. 抗氧化………………………………………………………………11

9. 靈芝多醣免疫機制…………………………………………………11

二、靈芝液態發酵培養因子……………………………………………14

(一)培養基..................................................................................................14

(二)培養液成份..........................................................................................14

1.碳源……………………………………………………………………14

2.氮源……………………………………………………………………15

3.碳氮比…………………………………………………………………15

(三)溫度…………………………………………………………………18

(四) pH 值..................................................................................................18

(五)接種量………………………………………………………………18

(六)通氣量………………………………………………………………18

(七)轉速…………………………………………………………………19

三、β-葡聚醣............................................................................................20

(一) 結構…………………………………………………………………20

(二) 分子量………………………………………………………………24

X

(三) 檢測…………………………………………………………………24

1. 萃取.......................................................................................................24

2. 多醣分析……..………………………………………………………24

3. 螢光呈色法(Aniline blue assay)……………………………………..25

4. Glucan-specific limulus amebocyte lysate (LAL) assay (Fungitec G

test)…………………………………………………………………..28

5. 免疫螢光分析法(Immunoassays)………………………..………….28

(四)免疫機制……………………………………………………………28

(五)腸道免疫……………………………………………………………32

(六)生物活性及功能……………………………………………………33

1. β-葡聚醣抵抗細菌和病毒的能力…………………………………………33

2 .改善牙周病… … … . . … … … … … … … … … … … … … … … … … … 3 6

3. β-葡聚醣於飼料之應用………..….………………………………………36

叁、以飼料基質發酵生產靈芝多醣的研究……………………………39

ㄧ、摘要…………………………………………………………………39

二、前言…………………………………………………………………39

三、材料方法……………………………………………………………41

3.1 菌種維持及培養..................................................................................41

3.2 不同液態發酵培養基.........................................................................41

XI

3.3 饋料方式..............................................................................................41

3.4 多醣分析..............................................................................................42

3.5 螢光分析法定量 β-1,3-葡聚醣………………………………………42

3.6 統計分析……………………………………………………………43

四、結果與討論…………………………………………………………43

靈芝發酵產品與離乳仔猪飼料多醣和 β-1,3-葡聚醣分析…………………43

批式發酵將不同培養液配方進行七天培養之多醣濃度變化…………44

以葡萄糖當作饋料對第二天多醣及 β-1,3-葡聚醣濃度的影響………45

肆、液態靈芝發酵之 β-1,3-葡聚醣對仔猪生長性能的影響…………47

ㄧ、摘要…………………………………………………………………47

二、前言…………………………………………………………………47

三、材料與方法…………………………………………………………49

3.1.動物以及實驗設計……………………………………………………49

3.1.1.品系…………………………………………………………………49

3.1.2.飼養週數……………………………………………………………49

3.1.3.飼料…………………………………………………………………49

3.2. 抗體力價及血液生化學分析..........................................................49

3.2.1 血液收集與分析…………………………………………………49

3.2.2 血紅素結合蛋白…………………………………………………49

XII

3.2.3 猪瘟中和抗體力價的檢測………………………………………50

3.2.4 血液生化學分析…………………………………………………51

3.3 資料統計分析………………………………………………………52

四、結果與討論…………………………………………………………52

伍、液態靈芝發酵之 β-葡聚醣對 PCV-2 攻毒仔猪之保護效果………56

ㄧ、摘要…………………………………………………………………56

二、前言…………………………………………………………………57

三、材料方法……………………………………………………………59

3.1.動物以及實驗設計…………………………………………………59

3.1.1.β-1,3-葡聚醣定量…………………………………………………59

3.1.2.PCV-2 攻毒…………………………………………………………59

3.2. PCV-2 的偵測………………………………………………………60

3.2.1. DNA 萃取…………………………………………………………60

3.2.2.猪環狀病毒多重引子聚合酶連鎖反應…………………………60

3.3.細胞激素基因表現偵測……………………………………………61

3.3.1. RNA 萃取…………………………………………………………61

3.3.2.反轉錄聚合酶連鎖反應…………………………………………61

3.4.組織切片的觀察……………………………………………………62

3.5.統計資料與分析……………………………………………………62

XIII

四、結果與討論…………………………………………………………62

陸、參考文獻……………………………………………………………94

XIV

表目錄

表一、靈芝液態發酵培養基組成...........................................................17

表二、不同真菌來源的β-葡聚醣 .………………………………………21

表三、至目前為止所發現各種菇蕈纇中的機能性多醣體種類…………22

表四、呼吸風暴所產生的超氧陰離子…………………………………35

表 1-1 培養液主要碳氮源………………………………………………68

表 1 - 2 以饋料方式添加葡萄糖當作碳源於飼料培養液……… 6 9

表 1-3 市售飼料及靈芝產品之多醣和 β-1,3-葡聚醣含量之分析……74

表 1-4 靈芝發酵液和菌絲體之多醣分布……………………………75

表 2-1、飼糧中添加不同劑量的 β-1,3-葡聚醣的離乳仔猪血液生化值影

響................................................................................................81

表 3-1 猪環狀病毒多重引子聚合酶連鎖反應鎖使用引子及 DNA 產物

大小 …………………………………………………………….82

表 3-2 多重引子聚合酶連鎖反應偵測 PCV 條件……………………83

表 3-3 細胞激素基因引子序列…………………………………………84

表 3-4 反轉錄聚合酶連鎖反應所使用條件…………………………….85

XV

圖目錄

圖一、靈芝的生活史……………………………………………………5

圖二、β-D-葡聚醣生物反映修飾劑的免疫機制……………..……………13

圖三、β-葡聚醣構型……………………………………………………23

圖四、以 Curdlan 當作 β-1,3-葡聚醣標準曲線……………………………27

圖五、β-葡聚醣可藉由細胞膜上的受體 Dectin-1 傳遞訊息…………31

圖六、哺乳動物細胞中經由氧化酵素和氧化氮合成酵素代謝產生活性氧和

氮的中間產物……………………………………………………34

圖 1-1 以葡萄糖溶液當作為多醣標準曲線……………………………66

圖 1-2 以 Curdlan 溶液作為 β-1,3-葡聚醣標準曲線……………………68

圖 1-3 以批式發酵將不同培養液配方進行七天培養之多醣濃度變化..70

圖 1-4 培養液 A 配方進行批式發酵於第二日、第七日多醣、β-1,3-葡聚醣含

量之變化…………..………………………………………………71

圖 1-5 饋料、批式發酵對多醣含量的影響……………………………72

圖 1-6 饋料、批式對 β-1,3-葡聚醣含量的影響………………………73

圖 2-1 飼糧中添加不同劑量的 β-1,3-葡聚醣對於離乳仔猪平均日增重的影

響…………………………………………………………………… 76

圖 2-2 飼糧中添加不同劑量的 β-1,3-葡聚醣對於離乳仔猪採食量的影

響…………………………………….…………………………………77

XVI

圖 2-3 飼糧中添加不同劑量的 β-1,3-葡聚醣對於離乳仔飼料效率的影

響……………………………………………………………………78

圖 2-4 飼糧中添加不同劑量的 β-1,3-葡聚醣對於離乳仔血清中血紅素結合

蛋白的影響……………………………………………………………79

圖 2-5 離乳仔猪初始的猪瘟抗體力價…………………………………80

圖 2 - 6 仔猪在添加不同劑量的 β - 1 , 3 -葡聚醣四週的猪瘟抗體力

價………………………………………….……………………………80

圖 3-1 以 Multiplex PCR 檢測脾臟、鼠蹊淋巴結、肺門淋巴結 PCV2 病毒

…………….…………………………………………………………86

圖 3-2 脾臟細胞激素 mRNA 表現量…………………………………87

圖 3-3 鼠蹊淋巴結細胞激素 mRNA 表現量…………………………88

圖 3-4 肺門淋巴結細胞激素 mRNA 表現量…………………………89

圖 3-5 不同視野下觀察 H&E 染色之添加 0 ppm β-1,3-葡聚醣組肺門淋巴結:

A. 肺門淋巴結 (H&E, 120×)，出現周邊出血; B.肺門淋巴結(H&E,

300×)，呈現淋巴流失的情形………………………………….…90

圖 3-6 不同視野下觀察 H&E 染色之添加 50 ppm β-1,3-葡聚醣組肺門淋巴

結: C. 肺門淋巴結 (H&E, 120×), D.肺門淋巴結 (H&E, 300×)…91

圖 3-7 不同視野下觀察 H&E 染色添加 0 ppm β-1,3-葡聚醣組鼠蹊淋巴結: E.

門淋巴結 ( H & E , 1 2 0 × ) , 出現周邊出血 ; F. 鼠蹊門淋巴

XVII

(H&E,300×) ，呈現淋巴流失的情形…………………………………92

圖 3-8 不同視野下觀察 H&E 染色之添加 50 ppm 葡聚醣組鼠蹊淋巴結:

G.鼠蹊淋巴結 (H&E, 120×), H.鼠蹊淋巴結 (H&E, 300×)…93

1

壹、前言

靈芝(Ganoderma lucidum)屬於擔子菌亞門、非褶蕈目的靈芝菌科靈芝

屬(Ganoderma)。靈芝在幾個世紀以來都廣泛地用於東方國家，為中國自古

以來珍貴稀有的藥用真菌之ㄧ。由於固態靈芝子實體的收成約需三至六個

月，液態醱酵只需一至三週即可產生菌絲體，故經由液態醱酵可有效率的

生產靈芝代謝物。目前在靈芝代謝產物中以多醣具有提升免疫力和抗癌活

性，靈芝多醣中 β-葡聚醣的研究最深入，尤其是能夠被免疫細胞辨認而提

升免疫能力，由於 β-葡聚醣為真菌細胞壁的主成分，且從酵母菌或其他藻

類來源的 β-葡聚醣對於禽畜、水產業的飼養應用，顯示具抗細菌性、抗病

毒或是增進生長表現的成效。故本研究將不同劑量靈芝多醣中的 β-葡聚醣

定量後添加於離乳仔猪飼料，觀察其對離乳仔猪生長及抵抗病毒能力的影

響，以期可解決離乳猪緊迫症。

貳、文獻回顧

一、靈芝簡介

大部分靈芝屬的子實體為一年生，皆具有蕈傘（蓋）和蕈柄。蕈蓋呈

半圓形、腎形、貝殼形等，表面有同心環紋或放射狀縱紋，除樹舌類（G.

applanatum）外大部分具有漆樣光澤，顏色有灰白、黃褐、紫紅、紫黑等，

有時在蕈蓋上因生長成熟之程度不同而同時存在數種不同顏色之區域，一

般而言，其生長區域位於菌蓋的最外緣，因此顏色最淡而向內則顏色漸深。

2

蕈柄亦具有漆樣光澤，顏色與蕈蓋相同或較深 (周, 2001)。

(一) 靈芝發展史

靈芝的藥草名稱始自於中國，此名稱首次出現於『抱朴子』一書。在

歷史故事中，秦史皇命術士徐福往日本尋找仙藥，靈芝可能是其一 (近畿大

學久保道德研究室, 1987)。在東方國家，不僅將靈芝視為有藥效的菌類，且

受古印度的影響，將靈芝視為是與神名有關的神草。在日本『日本書紀』

天武帝的單元中記載:『紀伊國獻供莖長三十公分的芝草(靈芝)』，而『繼日

本紀』裡記載神龜三年(西元七二六年)三月十五日，曾因為了慶祝玉來(靈

芝)生長於大內，敕令全國達官貴人到庶民作詩來歌頌靈芝 (梶本義衛,

1991)。

漢武帝時，神農本草經將三百六十五品目分為上品、中品、下品三種

類。對上品的描述如下:『以養命為目的，無毒，不具副作用。此等藥材能

輕身，滋補元氣，防止老化，有延命效果。』上品所列舉的一百二十品目

中，包括青芝、赤芝、黃芝、白芝、黑芝、紫芝這六種靈芝 (近畿大學久保

道德研究室, 1987) 。

(二) 靈芝分類與特徵

真菌分類系統中，靈芝應是屬於真菌界(Myceteae)、無鞭毛菌門

（ Amastigomycota ）、擔子菌綱 (Basidiomycetes) 、無蕈褶目

（ Aphyllopharales ）、多孔菌科(Polyporaceae)中的靈芝屬（Ganoderma）

3

(Ainsworth, 1973) 。靈芝屬是1881 年芬蘭植物學者Karsten 根據菇體具有

發亮的表皮建立的，並以靈芝中的赤芝Ganoderma lucidum 為此屬的代表

種。而後靈芝屬的定義經Donk、Murrill、Furtado、Steyaert 等的研究，認

為靈芝屬的主要特徵為其具有雙層細胞壁的擔孢子；靈芝屬的擔孢子皆呈

卵圓形，外層細胞壁較薄且透明，內層細胞壁較厚呈黃褐色並有疣狀凸起。

一般所謂的靈芝，是一些大型真菌的總稱，具有「卵形」、「雙層細胞壁」、

「黃褐色」的擔孢子為靈芝屬現今廣被接受的主要特徵 (Alexopolus and

Mims, 1979) ，並非以菇體（子實體）的外觀形態或顏色可以加以辨別的。

野生靈芝子實體因環境條件的影響，在外觀上常有同種，但性狀卻差

異的現象。台灣地區常見的靈芝根據學者 (王, 1990) 的分類分為十群，主

要特徵是產生橢圓雙壁的厚膜孢子，生長適溫偏高，於30℃至 34℃之間。

靈芝為木材白腐菌，主要棲息地為死亡樹林及受傷健全活樹的莖基部與根

部，因其可分泌ligninase 、cellulase 、endo-polygalacturonase (endo-PG)、

endo-pectin methyl transeliminase (endo-PMTE) 等酵素進而水解木材之木質

素 (lignin) 及纖維素 (cellulose) ，使得樹木木材及其根部腐朽 (王, 1990)。

(三) 靈芝生活史

靈芝生長菌落顏色為乳白至黃褐色，解剖顯微鏡下可以看到氣生菌絲

粉生的現象，此為靈芝特有的鹿角菌絲部份，可藉其與其他菌絲區分 (王,

1989) 。

4

靈芝屬於擔子菌亞門，與其他多孔菌最大的不同在於其擔孢子

(basidiospore) 具有雙層壁，外壁呈現透明，內壁黃褐色且多具有疣狀小刺。

子實體呈現假漆狀的光亮外皮，且其由蕈傘 (Pileus; Cap) 、蕈褶 (Lamella;

Gills) 、蕈柄 (Stipe; Stalk) 這三大部分所組成，高等真菌類是以有無隔膜

來區分，其中擔子菌亞門 (Basidiomycotina) 和子囊菌亞門 (Ascomycota) 相

似，菌絲中每一節有一個細胞核之單核體 (monokaryon) ，此時為一次菌絲;

菌絲長到12µm後菌絲產生分支，正負型菌絲交錯融合，進行細胞質融合，

形成一個隔膜裡有兩個細胞核 (Dikaryon) ，此時為二次菌絲，亦為發酵時

最常利用的階段。

二次菌絲較為潔白強壯，生長更為迅速，而分解有機物質和利用營

養物質的能力更強。在自然界中，這種菌絲體可以在溫暖潮濕的環境生

長，而造成樹木心材或根部木材的腐朽，人工培養時，可將其培養在培

養基、木塊、木屑和營養液中。雙核的接合子 (zygote) 經過減數分裂之

後再度形成單倍體、形成成熟的孢子臺 (basidium) 附著於蕈褶之上，形成

單倍體 (haploid) 的擔孢子，直到風將其吹離，此時為擔孢子，如圖一所示。

5

圖一、靈芝的生活史

Fig.1. The life cycle of G. lucidum.

(http://www.botany.hawaii.edu/faculty/wong/Bot201/Basidiomycota/Mushr

oom_Lifecycle.htm)

6

(四) 靈芝的栽培

靈芝的來源可分為野生與人工栽培，野生靈芝在台灣的平地及高海拔

山區皆有分佈，常常生於闊葉樹、相思樹及豆科植物，大部分為一年生的

子實體。而目前因研究及市場需求迫切，而利用段木、木屑培養瓶或太空

包的人工固態栽培法和液態發酵出現。

子實體栽培分為兩大類，段木栽培是將靈芝的生長菌絲接種在櫟木或

是枹木的枯木段上，而木屑培養瓶或太空包栽培則是在廣口瓶或太空包中

填裝木屑與生長培養基，將靈芝菌絲接入後塞上棉塞培養，在30℃栽培

70~90天即可採收子實體 (張, 1983; 王, 1990)。

由於靈芝子實體的固態培養一般要3~6個月的時間，而且從開始到採收

相當費力，且野生靈芝不易取得，一般液態發酵僅需7~14天即可採收菌絲

體，將靈芝菌絲培養於液態培養基中，給予足夠的氧氣，使菌絲生長、繁

殖並可生產累積有效物質，如:靈芝多醣、靈芝酸(Yang et al., 2000; Fang et al.,

2002; Tang and Zhong, 2002)。

(五) 靈芝的生理活性

靈芝有效的生理功能有抗腫瘤(Sone et al., 1985）、降低血壓(Hikino et al.,

1985) 、抗 HIV-1 (El-Mekkaway et al., 1998) 、降低膽固醇的合成與吸收

7

(Berger et al., 2004) 、抗病毒、抑制血小板凝集等功能。此由於靈芝在生長

過程中所產生的代謝產物具有許多活性，其中包含多醣、蛋白醣、三萜類、

靈芝酸、超氧歧化酵素等成分。

1.抗腫瘤及抗癌活性

Peng 等人 (2003) 取 Ganoderma tsugae 菌絲藉由 DEAE-Sepharose

CL-6B管柱沖滌得到粗胞外多醣 (Crude extracellular polysaccharide; CEP)

及粗胞外多醣中的雜多醣EPF1、EPF2進行抗腫瘤活性實驗。先把Sarcoma

180 cells (1×10 5cells/ml)皮下注射到八周齡的BALB/c公鼠24小時每十天為

一個單位、將CEP, EPF1, EPF2溶於PBS進行腹腔注射，對照組則只注射

PBS，發現CEP,EPF1,EPF2均有抑制固態腫瘤Sarcoma 180的活性，尤以粗胞

外多醣最佳。由靈芝G. lucidum的乙醇萃取物含多醣或其中的三萜類，其可

藉由產生毒殺活性 (Cytotoxic activity) 來抵抗腫瘤細胞 (Lin and Zhang,

2004)。

Sone 等人 (1985) 亦發現以熱水從G. lucidum萃取之子實體多醣與培

養菌絲體外多醣有相似的多醣結構，主幹是呈螺旋構造的β-1,3-D-葡聚醣和

具β-1,6-D-醣基分支(分支度分別為 3.1:1 和 2.7:1)，且其對於老鼠體中的

Sacroma 180的腫瘤有抑制效果，分別為97.7% 和 91.6%，且抑制腫瘤效果

隨其分支程度上升而增加，並具有調節免疫的能力 (Sone et al., 1985)。

在臨床上，後期癌症病患 (advanced-stage cancer patients)每天餐前服用

8

靈芝多醣1800mg，一天共三次，口服12 週後發現血漿中的細胞激素IL-2、

IL-6、IFN-γ濃度增加，增加CD3+、CD4+、CD8+細胞數目，此可增加自然

殺手細胞活性，雖此劑量可使癌症後期病患有免疫反應，然而多醣服用致

毒劑量仍待繼續研究 (Gao et al., 2003) 。藉由靈芝刺激癌症病患的細胞免

疫反應及裂質原活性 (mitogenic reactivity) ，發現約65%的肺癌患者在有改

善，故靈芝可作為一健康食品來協助癌症病人健康 (Yuen and Gohel, 2005)。

2.抗血管新生作用

血管新生作用 (angiogenesis) 和腫瘤的生長和轉移有相關，血管新生除

了在傷口修補及女性的生殖週期中扮演角色外，在正常人身上很少發生，

體內抑制血管新生的物質較多，因此血管新生很少發生；反之，在腫瘤患

者身上，因促進血管新生物質的分泌，以及抑制血管新生物質的減少，而

促使血管新生，已有許多體內、體外試驗證明靈芝可直接毒殺腫瘤細胞及

抑制血管新生的作用 (Yuen and Gohel, 2005)。

3.抑制血小板凝集和降血壓作用

血小板受到凝血酵素 (thrombin) 、膠原蛋白、ADP等刺激時，會引起

形態變化 (shape change) 、黏附反應 (adhesion)、凝集反應 (aggregation)、

分泌反應 (secretion) 等。這些反應原為血小板止血機制上的必要過程，同

時亦成為高血壓患者產生腦血管、冠狀血管血栓或動脈硬化的重要原因。

靈芝成分中羊毛固烷 (lanostane) 之衍生物及某些三萜類化合物可以抑制

9

血管收縮素轉化酵素 (Angiotensin Angiotensinconcerting enzyme) 而達到降

血壓之目的 (水野卓和川合正允, 1997)。靈芝成分中ganodermin可抑制血液

凝集反應 (Wang and Ng, 2006)，Shimizu等 (1985) 在靈芝子實體熱水萃取

物中水溶性部分具有血小板凝集作用，經結構鑑定為adenosine。

4. 降血糖與降低膽固醇作用

靈芝多醣成分中的 ganoderan A、ganoderan B、ganoderan C具降血糖、

降血脂作用，能將血清、膽固醇、甘油三酯和 β－酯蛋白做不同程度的降

低 (水野卓川和正允, 1997)。靈芝酸具有降血壓活性 (Hikino et al., 1985)。

靈芝的三萜類衍生物可抑制肝細胞合成膽固醇，將添加5%靈芝於飼料餵食

倉鼠，可以降低總膽固醇，且可降低肝臟中的HMG-reductase活性 (Berger et

al., 2004) 。

Zhang等人 (2004) 利用靈芝多醣對禁食的正常小鼠在腹腔注射不同濃

度的25，50，100mg/kg靈芝多醣後，並偵測小鼠血清在0、3、6小時的葡萄

糖濃度，結果顯示血糖濃度會隨注射多醣濃度升高而降低。此外，口服靈

芝多醣100mg/L的小鼠，1小時後可提升胰島素濃度，體外試驗靈芝多醣處

理於5.6mmol/L葡萄糖濃度培養胰島細胞，可刺激其釋放出胰島素，故藉由

偵測其胰島素的釋出的含量與濃度，發現靈芝多醣具降低小鼠血糖的效應

(hypoglycemic effect)，而其降低血醣的其ㄧ的機制作者認為是藉由Ca2+流入

胰島 β細胞而產生釋放胰島素的活性 (insulin-releasing activity)。

10

5. 抗真菌

Wang等人 (2006) ，從靈芝中藉由DEAE-cellulose, Affinity-gel blue

gel, CM-Sepharose和 Superdex 75分離出15-kDa的抗真菌蛋白Ganodermin。

發現抗真菌蛋白分別能抑制灰黴菌 (Botrytis cinerea) , 莖腐病(Fusarium

oxysporum) 和囊孢殼菌 (Physalospora piriclola) ，抑制真菌50%生長所需

濃度(IC50) 分別為15.2µM, 12.4µM, 18.1µM。

6.抗發炎

靈芝萃取物對於誘發人類直腸癌細胞株HT29發炎反應時期，具有誘導

產生細胞凋亡 (Apoptosis) 、抗發炎和使不同種細胞激素分化表現，在靈芝

萃取物濃度10,000 µg/ml時具毒殺活性 (cytotoxicity)，使用靈芝萃取物濃度

500 and 5000 µg/ml處理HT29細胞時，發現可降低IL8、巨噬細胞發炎蛋白

(macrophage inflammatory protein 1-delta)、血管上皮生長因子、和血小板因

子的減少，結果顯示其具有能使癌細胞凋零 (pro-apoptosis)以及抗發炎

(anti-inflammatory)功能 (Hong et al., 2004)。

7.抗病毒

以甲醇萃取 G. lucidum 子實體，分離出十二種已知化合物，利用

2D-NMR 確定其化合物結構、發現 Ganoderiol F 和 ganodermanontriol 可以

抑制 HIV-1 (Anti-human immunodeficiency virus) 生長及 HIV-1 蛋白酶活

性，0.17-0.23mM 濃度的靈芝酸(ganoderic acid) B，C1，H，α和 Ganoderiol

11

A、B 等可以抑制 HIV-1 蛋白酶 50%活性 (El-Mekkawy et al., 1998)。G.

luciduml 孢子中分離出三萜類 lucidumol A 及 ganoderic acid B 和其他三萜類

混合於濃度 20-90mM 濃度下可以抑制 HIV-1 蛋白酶 50%活性 (Min et al.,

1998)。

8.抗氧化

靈芝萃取物可以藉由調節 iNOS (inducible nitric oxide synthase) 來調節

巨噬細胞參與身體對外來病原菌反應時產生 NO 的產量，但過高的 NO 對身

體會產生毒性。利用脂多醣處理人類巨噬細胞 24 小時後，在比較使用靈芝

萃取物 100µg/ml 濃度處理，和未處理靈芝萃取物的對照組，處理組所產生

的 iNOS mRNA 的表現量和活性較對照組高，其產生 NO 濃度和分別為

169.5%、150%，故靈芝萃取物可降低超氧化陰離子濃度，具有抗氧化功能

(Woo et al., 2005)。

9.靈芝多醣免疫機制

從靈芝純化的靈芝多醣體可以藉由人類血液中單核球受體 TLR4 (toll

like receptor-4)接收後訊息傳入細胞核內核轉錄因子（NF-κB）和 p38 mitogen

活化蛋白質基酶，使得 T 細胞釋放出細胞激素 IL-10、刺激血液中的單核球

樹突狀細胞（monocyte）成熟 (Lin et al., 2005) 。許多文獻均歸納出，大

部分的菇蕈類多醣具有抗腫瘤及免疫調節作用的主要來源為多醣，靈芝亦

不例外，其為一種生物學反應調節劑（Biological Response Modifier, BRM），

12

長期服用可提高免疫力 (Wasser and Weis, 1999)。Berovic 等(2003)由靈芝菌

絲體的熱水萃取物，其主要多醣為 β-D-葡聚醣，經由促進 TNF-α 及 IFN-γ

分泌的實驗證實其具有免疫調節能力。Wasser (2002) 針對靈芝多醣成分中

具 β-1,3 鍵結的葡聚醣進行深入的探討，發現這些物質多醣的生理活性受到

其組成、分支度、分子量以及鍵結的影響。

圖二為 β-D-葡聚醣在生物體內可能的免疫機制，多醣中的 β-D-葡聚醣

可藉由多型性白血球、巨噬細胞及淋巴球等免疫細胞上的接受體結合，形

成抗原呈獻細胞 (antigen presenting cell; APC)，此時巨噬細胞會分泌細胞激

素 IL-1、TNF-α輔助型助手 T 細胞 (helper T cell; TH)，接著 TH 細胞會再分

泌 IL-2 間接的活化毒殺型 T 細胞 (cytotoxic T cell; Tc)和 B 細胞。B 細胞再

大量增殖、分化成漿細胞 (plasma cell) 及免疫球蛋白 (immunoglobulin:

IgA、IgE、IgG、IgM)、自然殺手 (natural killer) 細胞分泌干擾素 IFN-γ等。

當外來抗原入侵或腫瘤細胞產生時，靈芝多醣可藉由專一性的免疫細胞的

辨識作用產生細胞激素進而活化免疫反應，可直接殺滅腫瘤細胞、癌細胞

或外來病原菌 (Wasser,2002; Lin and Zhang, 2004)。

13

(Wasser et al., 2002)

圖二、β-D-葡聚醣生物反應修飾劑的免疫機制

Fig. 2. Possible immune mechanism: β-D-glucan biological response

modifier (BRM)

14

二、靈芝液態發酵培養因子

液態培養是生產靈芝多醣的有效方式，而子實體栽培得到的靈芝產品

可獲得較高含量之三萜類 (tripene)，又稱為靈芝酸 (ganoderic acid)，以液

態發酵培養所得的產品雖三萜類含量較少，但多以靈芝多醣為主要訴求(周,

2001;許, 2005)。以菌絲體、總多醣和(1,3)-β-葡聚醣含量不同之發酵濾液作

免疫研究，靈芝發酵液具間接抑制U937細胞的效果，具有調節免疫力的功

效(李, 2003)。而已有許多研究是藉由液態培養並將具有生理活性的(1,3)-β-

葡聚醣為標的，並研究最適的培養基組成與發酵條件對於菌絲的生長與多

醣產量影響 (張, 2001; 李, 2004; 林, 2005; 許, 2005)。

(ㄧ)培養基

Kim 等 (2002) 利用不同培養基對 19 種食用性菇類菌絲體生長及胞外

生物聚合物 (exo-biopolymer) 的產量作探討，其中比較靈芝菌在 PMP

(patato malt peptone medium)、MCM (mushroom complete medium)、YM(yeast

malt extract medium)培養基: 其中靈芝品系中的 Ganoderma lucidum No. 1

使用 PMP 培養基時效果最好，胞外聚合物產量可達 1170 mg/L，故培養基

成分會影響靈芝代謝物之產量。

(二)培養液成份

1.碳源

碳源為提供菌體生長與能源所需，許多真菌類利用單糖類、多醣類、

15

有機酸或自然界中所得的木質素與纖維素等，作為生長所需之碳源，不同

的碳源對菌體生長與代謝物生成有不同的影響，一般使用量為 1~10%，若

給予太高濃度的碳源，對菇蕈類的生長反而會抑制，且不符經濟效益 (黃，

1998)。Tang 等 (2002) 利用饋料批式法液態培養靈芝菌，當培養液中給予

蔗糖、乳糖、麥芽糖、葡萄糖四種不同種類的醣，發現以蔗糖生產胞外多

醣效果最好；而生產胞內多醣，則以乳糖為最適碳源，且對於細胞生長較

有助益。添加不同種的脂肪酸發現棕櫚酸對於多醣產量最有助益，唯有添

加亞麻油酸 (0.1g/100mL) 對於菌絲成長和多醣合成都有抑制作用(Yang et

al., 2000)。培養基組成與發酵條件對於菌絲的生長與多醣產量有顯著性的影

響，許 (2005) 利用豆科基質 (黑豆與黃耆) 明顯分別增加多醣與 β-1,3-葡

聚醣產量分別為 3220µg/mL 和 1520µg/mL。

2.氮源

為提供靈芝合成蛋白質及核酸的主要成分，有機氮源如酵母萃取物、

蛋白腖、酪蛋白，比使用無機氮源如 NH4NO3、NH4Cl 造成菌絲生長速度較

快並達到較高的菌絲密度。而氮源以 5g/L yeast extract 與 5g/L peptone 同時

使用，可達較大的菌絲生長量 6.24 d.w./L/day; 及胞外多醣量 0.81g/L，最適

合細胞及代謝物生長 (Fang and Zhong, 2002)。

3.碳氮比

碳源和氮源組合的比率會影響菌絲體對培養基利用情況，李 (2004) 以

16

靜置培養的方式發酵，沒有震盪通氣等機械性因子影響，因此靈芝生長情

況完全受控於培養基組成，比較五種不同的培養基 (表一) ，利用 YM 培養

基 (YM broth, yeast malt broth) 為真菌常用的培養基和其他五種配方比較:

A 為李 (2003) 所選擇為最適合靈芝產生 ( 1, 3)-β-D-葡聚醣之培養基，B 為

常用培養靈芝菌的培養基，C 配方和 B 配方相似，但葡萄醣的含量提高為 2

倍，D 培養基為蕭 (1994) 用在較長時間靜置菌絲體液態培製備分析三萜類

樣品之配方， E 培養基配方為仿商業性發酵生產，利用農產品及農業廢棄

物添加置培養基中做二次利用，將上述配方經 21 天培養之樣品發現培養基

中碳氮比分布在 16~142，隨碳氮比越高，菌絲體量由 0.35g/dL 降至

0.17g/dL，多醣分布在 23~139mg/dL，β-(1,3/1,6)-D 葡聚醣佔多醣中的比率

在 34.5~9.9% (李, 2004)。於葡萄糖和氯化銨合成培養基中，C/N=30 至 60

都可以得到較高之菌絲生長量，C/N 比值越高對多醣量的產生越有利，而

以 C/N=80 所得到之多醣量為最高 (Yang and Hwang, 1998)。而賀 (2003) 提

及碳氮比是十分重要的控制因子，除了會影響到菌絲體中蛋白質含量和脂

質含量，C/N 以 5:1 到 25:1 為宜，高於此值時，菌絲體脂質含量會過多而

蛋白質含量明顯下降而影響到其營養價值。故 C/N 比隨培養基組成不同而

有不同的條件，Wagner 等 (2003) 整合了深層培養靈芝的發酵條件，不同

的條件針對不同的發酵產物做最適的發酵指標。

17

表一、靈芝液態發酵培養基組成。

Table 1. composition of culture media of G. lucidim.

Concentration g/L

Cultivation Medium Glucose Malt

extract

Yeast

extract

Peptone Black

bean

Static YM 10 3 3 5 ---

Static A 20 --- 6 2 ---

Static B 4 10 4 1 ---

Static C 8 10 4 1 ---

Static D 30 20 --- 1 ---

Fermentor* A 20 --- 6 2 ---

Fermentor* E 20 --- --- --- 60

(李, 2003)

18

(三)溫度

靈芝液態培養的溫度約從 25~35℃，大部分以 30℃進行培養 (Wagner et

al., 2003)。溫度介於 30~35℃能提高多醣與菌絲生長效率，但若不再此範

圍便會顯著的降低 (Yang and Liau, 1998)。而王等 (1989) 提出靈芝最適生

長溫度為 26℃至 30℃之間，菌絲生長速率約為 0.4cm/天，當溫度低至 14℃

或高達 38℃時即不利於靈芝的生長。

(四)pH 值

靈芝最適生長 pH 值為 3.5-6.5 之間，pH4-4.5 最利多醣生成 (Yang and

Liau, 1998)。pH 值的控制會影響到菌絲體生長及胞外多醣生成，利用氣舉

式發酵槽藉由兩階段控制 pH 值，可以促進靈芝菌絲體生長，在一開始的對

數生長期 (exponential growth phase) 將 pH 由 3 調整至 6，可促進細胞生長

及胞外多醣產量由 4.1 g/L 提升為 20.1 g/L (Lee et al., 1999)。

(五)接種量

接種密度的控制對於細胞生長型態、多醣產量和靈芝酸的生成是很重

要的。因為 Fang 等人 (2002) 比較從 70-670 mgDW/L 的接種量，發現大量

的接菌可產生較多的多醣、較少的靈芝酸。

(六)通氣量

靈芝屬於好氧真菌，在生長及代謝過程中需要氧氣，因此進行液態發

酵培養時，會給予通氣量，觀察發酵過程中溶氧量變化來監控靈芝利用氧

19

氣的情形。通氣量的增大會使得氧氣傳遞係數(KLa)和溶氧量(DOT)增加，

KLa 值在 78.2 h-1 時可獲得最大胞內多醣產量，DOT~10%氧飽和度時比在

DOT~25%氧飽和度有較多的胞外多醣產量 (Tang et al., 2003)。入料操作

上，利用攪拌式醱酵槽以饋料批式 (fed-batch) 搖瓶後再放入攪拌式醱酵

槽、控制其醱酵中溶氧(dissolved oxygen)，再給予合適的碳源和培養基所含

碳源的初濃度，可生產大量多醣 (Tang et al., 2002)。李 (2003) 觀察通氣量

對於發酵過程溶氧量變化的影響，在不同通氣量條件下，發酵液中多醣並

無顯著變化; 給予高通氣量 1.5vvm 下發酵液的通氣量達 100%，菌絲體顯

著性增加。

(七)轉速

攪拌和通氣是影響多醣釋出的重要因子，其中轉速在150rpm時，能夠

合成最高量多醣濃度為，而太高轉速能夠增進混合的效率和多醣的釋出卻

會造成高剪切力 (shear force) 會影響菌絲生長以及合成 (Yang and Liau,

1998)。

20

三、 β-葡聚醣

(ㄧ)結構

β-葡聚醣是由六碳糖的小分子葡萄糖，由第一個碳和第三個碳串聯起來

的直鏈狀構型、或以直鏈狀的 1→3 鍵結為主鏈，1→6 為側鏈的構型，如圖

三所示。像是酵母菌 (Saccharomyces cerevisiae)，日本香菇(Letinan edodes)，

舞菇(Grifola frondosa)，裂褶菌（Ｓchizophyllum commune）等皆含有 β-葡聚

醣(Brown and Gordon, 2003)，如表二所示。因為真菌細胞壁約含 50~60%的

葡萄醣聚合體(Herre et al., 2004; Young et al., 2001)，有時會和蛋白質、脂

質、甘露醣（mannan）、幾丁質（chitin）鍵結。

β-葡聚醣除了以 β-1,3 鍵結為主鏈主的直鏈狀構型、也有以 β-1,3 鍵結

為主鏈，β-1,6 分支為側鏈的最具免疫活性，而以 β-1,6 為主鏈者較少活性。

此種型態的葡聚醣多存於菇蕈類中，請見下表三整理。

21

表二、不同真菌來源的 β-葡聚醣

Table 1. Commonly used biologically active glucans and their fungal

sources.

(Brown and Gordon, 2003)

Sclerotinia sclerotiorumSSG-Glucan

Grifola frondosa (Maitake mushrooms)grifolan

Sclerotium glucanicumscleroglucan

Schizophyllum communeschizophyllan

Lentimus endodes (Shiitake mushroom)letinan

Saccharomyces cerevisiaePGG-Glucan

Saccharomyces cerevisiaeglucan phosphate

Saccharomyces cerevisiaezymosan

Source (common name)β-glucan

Sclerotinia sclerotiorumSSG-Glucan

Grifola frondosa (Maitake mushrooms)grifolan

Sclerotium glucanicumscleroglucan

Schizophyllum communeschizophyllan

Lentimus endodes (Shiitake mushroom)letinan

Saccharomyces cerevisiaePGG-Glucan

Saccharomyces cerevisiaeglucan phosphate

Saccharomyces cerevisiaezymosan

Source (common name)β-glucan

22

表三、至目前為止所發現各種菇蕈類中的機能性多醣體種類。

Fig. 3. The kinds of functional polysaccharides of various mushrooms.

菇蕈名稱機能性 (抗腫瘤) 多醣種類

裂褶菌 β -(1,3/1,6)-D 葡聚醣 (Schizophyllan, SPG)

巴西磨菇 β-(1,3/1,6)-D 葡聚醣-蛋白質 (AB-P)、葡萄糖甘露聚醣-蛋白質

(ATOM)、甘露聚醣-蛋白質 (AB-FP)

靈芝 β-(1,3/1,6)-D 葡聚醣、雜聚醣 β-1,3-D 葡聚醣

冬蟲夏草 1,3- 雜聚醣

雲芝 β-(1,3)-D 葡聚醣、β-(1,3/ 1,6)-D 葡聚醣-蛋白質、β-(1,4/ 1,6)-D

葡聚醣-蛋白質 (Krestin,PSK)

樟芝雜聚醣-β-D 葡聚醣

桑黃 α-(1,4)-酸性異質甘露聚醣-蛋白質, β-(1,6)-酸性異質甘露聚醣-

蛋白質 (結構與其他菇蕈完全不同之多醣體)

珊瑚菇 α-(1,3)-D 葡聚醣

香菇 β-(1,3/ 1,6)-D 葡聚醣 (Lentinan)、α-甘露聚醣 (KS-2)、雜聚醣

-蛋白質 (LEM, LAP)

23

柳松菇 α-(1,3)-D 葡聚醣

舞茸 β-(1,3/ 1,6)-D 葡聚醣、酸性異質多醣體、異質多醣蛋白複合體

鴻喜菇 β-(1,3)-D 葡聚醣異質多醣蛋白複合體

(陳, 2004)

(Herre et al.,2004)

圖三、β-葡聚醣構型。

Fig. 3. Glucans consist of major component of fungal cell walls and

bearing linear (1,3 linked) or branched (1,6 linked) configuration.

24

(二)分子量

通常體外試驗都會以比較大分子量(MW)之葡聚醣進行實驗，像是酵母

聚醣(zymosan)可以直接活化白血球，引起一連串的吞噬、毒殺及抗微生物

的作用甚至產生超氧化合物 (Nathan and Shiloh, 2000)，此外也會產生一些

初級發炎反應的細胞激素 IL1-β、IL-6、TNF-α 及趨化酵素。像是分子量＜

5000-1000MW 的海藻聚醣(laminarin)便沒有生物活性，甚至可變成拮抗劑

(antagonists) (Bohn and Bemiller, 1995)。

(三)檢測

1.樣品萃取

先用熱水萃取菇蕈類的粉末，離心取上清液。取 1 倍體積加入四倍體

積 95%高濃度酒精，即可快速沉澱出菇蕈多醣。原理是利用醇類與水的氫

鍵作用力遠大於菇蕈多醣溶於水的凡得瓦力，而將菇蕈多醣從水溶液分離

出來 (陳, 2004)。

2.多醣分析

多醣總醣的測定是利用酚硫法，用硫酸將多醣分解為小分子的葡萄

糖，再帶入葡萄糖的檢量線中做比較。多醣的分析採酚-硫酸法 (張等,

2004)，方法為取 1ml 樣品再加入 1ml 5％ phenol 試劑和 5mL 濃硫酸，均

25

勻混合在 80℃熱水浴中加熱 30 分鐘，然後利用冰浴冷郤 2 分鐘，在波長

為 488nm 下測定吸光值。

3.螢光呈色法(Aniline blue assay)

在 β-1,3-葡聚醣的定量，使用放射線標定和螢光呈色法兩種比較，傳統

的放射線方法是用 UDP-[14C]Glc 的葡萄糖標定，而螢光呈色法則是使用商

業用的螢光染劑 Aniline blue 和 1,3-葡聚醣形成穩定的螢光化合物質再行測

定。Aniline blue 於 1890 年為法國植物學家 Mangin 所發現，其為一種

sulfonated triarylmethane dye，color index 編號為 C.I. 42755，其可對高等植

物或某些真菌組織之中的癒創多醣(callose)進行專一性的染色。其結構中的

可與 β-1,3-葡聚醣專一作用的螢光機團物(flurochrom)，結構為 sodium4,4’-

【carbonylbis-（benzen-4,1-diyl）bis（ imino）】 isobenzen-sulphonate，稱

為”sirofluor”，本身僅發出微弱螢光，只有在與 β-1,3-葡聚醣作用發出藍色

螢光，進而分析多醣樣品中 β-1,3-葡聚醣含量(林, 2005)。

使用螢光呈色法除了成本上比較便宜(比放射線法約節省超過 100 倍

的成本)、安全外、也省去不少洗滌和過濾的步驟 (Shedletzky et al.,

1997)。使用螢光呈色法定量食物中 β-1,3-葡聚醣的含量，萃取方法可採

用連續式的冷水、熱水、冷鹼及熱鹼來獲得可溶的部份，其採用 Curdlan

當作標準溶液來建立標準曲線；在線性 14µg/mL 範圍下對照 β-1,3-葡聚醣

濃度，研究也發現在蔬菜、塊莖類和菇蕈類食物中均富含 β-1,3-葡聚醣

26

(Ko and Lin, 2004)。此方法是利用強鹼 6N NaOH 先破壞葡聚醣的三級結

構，使其變成較具活性的一級結構 (Young et al., 2000) ，加熱反應後，

再加入深藍色 aniline blue 染劑反應，室溫下鍵結呈色，不是 1→3 鍵結

的葡聚醣顏色會消失，之後利用 398nm 激發光、並於 502nm 放射光下測

吸光值 (Ko and Lin, 2004)，本研究便以此方法來快速定量 β-1,3-葡聚醣，

以 β-1,3-葡聚醣鍵結方式的 Curdlan 當作標準曲線如圖四。

27

(Ko and Lin,2004)

圖四、以 Curdlan 當作 β-1,3-葡聚醣標準曲線。

Fig. 4. Aniline blue dye-binding saturation curve of curdlan (β-1,3-glucan)

standard.

28

4.Glucan-specific limulus amebocyte lysate (LAL) assay (Fungitec G test) (Foto

et al., 2004)

其特點如下 : 其使用的試劑為 Limulus amebocyte lysate-reactive

materials(LAL-RM)，為敏感性高、較具專一性，為一間接檢測的方法，也

可檢測內毒素，像是革蘭氏陰性 Gram(-) 菌細胞壁所含的脂多醣。LAL 試

驗使用凝膠法供定性測定革蘭氏陰性細菌性內毒素之用。根據美國藥典

(USP Bacterial Endotoxines Test)及美國 FDA公佈之LAL試驗指引(U.S. FDA

Guideline for LAL testing)提供標準的方法供確效 LAL 試驗以供替代兔子熱

原 (Pyrogen) 試驗。

5 免疫螢光分析法(Immunoassays)

競爭型抑制酵素連結免疫分析法是將待測的含β-1,3-葡聚醣的樣品和

純化的兔子抗葡聚醣的抗體競爭鍵結附著於微定量盤 (microtiter plate)

(Douwes et al., 1996)。而三明治法(sandwich ELISA): 使用capture reagents和

專一性抗β-1,3-D-葡聚醣的抗體當作試劑反應 (Milton et al., 2001) ，比LAL

分析法敏感性低，但是花費較便宜。

(四)免疫機制

靈芝多醣具有免疫調節的活性，具有 β-（1,6）葡萄醣基分支的 β-(1,3)-D

29

聚葡醣已被證實是靈芝子實體熱水萃取物中，含量最多且其活性的多醣 (李,

2004) 。而此種構型可讓動物體內具有能辨識的免疫細胞(單核球、噬中性

球、巨噬細胞) ，或非免疫細胞(Langerhans 細胞、紅血球、纖維母細胞、

內皮細胞、肺泡上皮細胞辨識而激發免疫反應 ( Herre et al., 2004;Brown and

Gordon, 2003) 。

β-葡聚醣為真菌細胞壁主要成分，尤其是由酵母菌衍生出來的酵母聚糖

(zymosan)富含 β-葡聚醣的顆粒，可藉由辨識具 β-葡聚醣專一性的受體

Dectin-1 產生免疫反應（Brown and Gordon., 2001;Brwon et al., 2002; Brwon

et al., 2003; Brown et al., 2003; Brown et al., 2005; Herre et al., 2004），脊椎哺

乳動物可能辨認葡聚醣的接受體還有 Scavenger receptors， CR3 ，

Lactosylceraminde，還有 TLR 接受體 (Toll-like receptors family）(Roeder et al.,

2004)。其分佈於單核球、巨噬細胞、嗜中性球 (Taylor et al., 2002) 或纖維

母細胞等的細胞膜表面。Dectin-1 的成分為醣蛋白，在細胞膜外具有類似凝

集素的辨識區 (lectin-like domain)，細胞膜內具有能被磷酸化 ITAM

(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif)，與 β-葡聚醣結合的 Dectin-1

會產生吞噬活性 (吳, 2004; Chen et al., 2003) 、氧化風暴 (oxidative burst)

(Jung et al., 2004)、殺菌活性、嗜中性球去顆粒化產生 β-glucuronidase、產

生細胞激素 (cytokines) 及細胞趨化因子 (chemokines) ( Lowry et al.,2005;

LeBlanc et al., 2006) 。利用光學顯微鏡觀察螢光標定後的 zymosan 可在巨

30

噬細胞膜上的 Dectin-1 和 TLR 部位結合而使其具有吞噬活性，如圖五所示

(Brown et al., 2003)。非脊椎動物對於 β-葡聚醣誘發的反應則是利用蛋白質

酵素一連串的反應 (Protease cascades) 活化啟動初級免疫反應抵抗外來微

生物，其中初級免疫防禦系統最主要的酵素為前酚類氧化酵素

(Prophenoloxidase) (Cerenius et al., 2004)。

31

(Brown and Gordon, 2003)

圖五、β-葡聚醣可藉由細胞膜上的受體 Dectin-1 傳遞訊息。

Fig. 5. The receptor dectin-1 mediates the biological effects of β-glucan.

32

酵母菌 Saccharomyces cerevisiae 含有 50~57% β-1,3-葡聚醣，其 zymosan

(酵母聚醣)常被用來當作免疫調節劑，可以誘發發炎反應產生。Zymosan 誘

發巨噬細胞傳遞訊號的分子間機制是由核轉錄因子 NF-κB(為 hetrodimer 由

兩個次單位 p65 和 p50 組成) 傳遞到細胞核內 TNF-α promoter 結合位，活

化後轉錄細胞激素 TNF-α後由巨噬細胞釋放出來、繼續活化 T 細胞來對抗

外來微生物或者藥劑，可做為初期發炎的細胞激素指標 (Young et al., 2001;

Kuo et al., 2006)。吞噬作用 (Phagocytosis) 為初級免疫反應(innate immune)

保護身體的非專一性屏障之ㄧ。巨噬細胞和顆粒細胞會受到 T 細胞分泌的

細胞激素 (Cytokines) 和調理素 (Opsonin) 刺激，而增強吞噬的能力

(Reichner et al.,2001)。添加 β-葡聚醣多醣體培養的吞噬細胞，其吞噬能力均

會顯著增加。注射 β-葡聚醣多醣體入小白鼠的腹腔內或是皮下，會使血液

中 INF-γ 和 IL-2 增加，增加腹腔內吞噬細胞吞噬能力卻不會增加吞噬細胞

的個數(吳, 2004)。Xiao 等人 (2004) 認為水溶性 β-葡聚醣可能較不溶性 β-

葡聚醣較具抗病毒能力(Xiao et al., 2004)。

(五)腸道免疫

於腸道中沒有分解 β-1,3-葡聚醣結構的酵素，無法代謝 β-1,3-葡聚

醣，在人體中能夠存留在肝和脾臟一個月以上 (Suda et al., 1992)。每天每

33

隻老鼠口服 25mg β-葡聚醣，發現能夠顯著的增加腸道中的淋巴細胞，且

其能自發性的產生 INFγ 和 IL-4 且腸道內皮表現 CD8 抗原的接受體 αβT

細胞和 γδT 細胞均顯著增加，此研究顯示 β-葡聚醣對於消化道黏膜的免

疫調節具有調節能力(Tsukada et al.,2003)。

(六)生物活性及功能

1. β-葡聚醣抵抗細菌和病毒的能力

主要是靠活化哺乳動物的巨噬細胞 (macrophage) 或嗜中性球白血

球，以增加其吞噬能力促進初級免疫 (圖六) 。在被活化巨噬細胞吞噬作用

中，有一個代謝路徑為呼吸風暴可產生具活性之氧和氮之中間產物

(respiratory burst)，造成結合於細胞膜上的氧化酵素 (phagocyte oxidase 和

nitric oxide synthase) 將氧還原成過氧化陰離子 (speroxide anion) ，可產生

毒性及攝入微生物。這種超氧化陰離子也可產生很強的氧化劑 (如: 氫氧自

由基和過氧化氫)。

另一方面，除了巨噬細胞和嗜中性球外，有些超氧陰離子是由溶小體

(lysosome) 產生的，其融合成吞噬體 (phagosome) 後，可從過氧化氫及氯

離子產生 ClO- (表四) 。

呼吸風暴中的一氧化氮也具抗微生物活性，能和超氧陰離子結合而產

生更多具有抗微生物活性的物質。即巨噬細胞有很多抗微生物如: 抗細菌、

真菌、寄生蟲、原生動物的活性。

34

(Nathan and Shiloh, 2000)

圖六、哺乳動物細胞中經由氧化酵素和氧化氮合成酵素代謝產生活性

氧和氮的中間產物。

Fig. 6. ROI and RNI production in mammalian cells via phagocyte oxidase

and nitric oxide synthase.

35

表四、呼吸風暴所產生的超氧陰離子

Table 4 Reactive oxygen intermediates and reactive nitrogen intermediates

from respiratory burst.

(Nathan and Shiloh, 2000)

Oxidative burst

Oxygen-dependent killing

Reactive oxygen intermediates

O‧

2¯(superoxide anion)

OH‧

(hydroxyl radicals)

H2O2

Cl¯(hypochlorite anion)

Reactive nitrogen intermediate

NO(nitric oxide)

NO2(nitrogen dioxide)

HNO2(nitrous acid)

Others

NH2CL(monochloramine)

36

2.改善牙周病

使用牙線先將 Wistar 老鼠牙齒綁起來實驗結束第三十五天確定均造成

牙周病，然後實驗組中每天於水中添加 10mg β-1,3/1,6-葡聚醣連續餵食十四

天，對照組則無添加。再用脂多醣攻毒，此會刺激下視丘-腦下垂體-腎上腺

軸 (HPA, hypothalamic-pituitary-adrenal)系統分泌 TGF-1β (Transforming

growth factor-1β)、細胞激素 IL-10 上升。經 X 光分析其上顎骨臼齒的變化，

以 β-葡聚醣實驗組的齒槽骨質流失較對照組老鼠來的少 (Breivik et al.,

2005)。

3. β-葡聚醣於飼料之應用

對每隻離乳仔猪每天餵食 β-葡聚醣 50mg，餵食 3 天，之後用猪流行性

感冒病毒攻毒，將其肺泡沖洗液進行分析發現其 NO 含量顯著提高、細胞

激素 INF-γ濃度上升，具有抵抗感染的效果 (Jung et al., 2004)。離乳仔猪飼

糧添加 1000 ppm 的 β-葡聚醣 (Dritz et al., 1995) 對生長沒影響、添加 300

ppm β-葡聚醣於飼糧中對生長和抵抗猪呼吸道疾病(PRRS)並沒有顯著相關

性(Hiss and Sauerwein, 2003)，但是血漿中的初級發炎反應的的生物指標急

性蛋白 hapotoglobin，均顯著上升 (Dritz et al., 1995; Hiss and Sauerwein,

2003)。猪隻疾病中猪環狀病毒屬於環狀病毒科，為單股環狀 20 面體的 DNA

病毒。第一型的猪環狀病 (PCV1) 是由腎臟細胞 PK-15 分離出來的、不具

37

病原性。1997 年，從離乳仔猪消耗症候 (PMWS) 猪隻中分離出具有病原性

的第二型環猪狀病毒 (PCV2) ，主要感染 6 到 16 週齡的猪隻，罹患病猪會

呈現發燒、漸進性消瘦、皮膚蒼白、黃疸、呼吸困難、下痢等症狀 (Quintana

et al., 2001) ，並使其免疫器官受損。台灣區本已有本病入侵，猪隻感染的

比例約為 70~85% (邱, 2004)。故本研究之目的為藉由添加具有 β-葡聚醣的

液態靈芝發酵產物於仔猪飼糧中，觀察其抵抗猪第二型環狀病毒(PCV2)的

保護作用。

對水產養殖來說，免疫調節劑的使用是非常重要的，因為其可以減少

勞力的支出、疫苗的消耗以及保護魚類免於某些緊迫。每隻鯉魚攝食 100µg

β-葡聚醣，在施打 Aeromonas hydrophila 細菌感染後，會使鯉魚的腎臟的

IL-1 mRNA 表現上升、超氧陰離子和殺菌能力都顯著增加 (Selvaraj et al.,

2005)。飼料中添加 1000ppm 葡聚醣，餵食亞洲鯰魚一週，短期餵食即可使

其達到抵抗 Clariaa bactrachus (L.) 的能力 (Kumari and Sahoo., 2006)，此外

口服 100ppm β-葡聚醣，連續餵食蝦子 20 天，可提升蝦子抗白點病病毒

(WWSV) 能力(Chabg et al., 2003); 另外飼料中添加 β-葡聚醣可提升田間蛙

類 Rana rugulosa (Duadin) 抵抗細菌性疾病、存活率顯著提高 (Crumlish et

al., 1999)。

家禽中並沒有嗜中性球，其是利用異嗜球 (heterophil) 解顆粒產生酵素

glucanase 而產生殺菌能力。針對未成熟小雞飼料添加 β-葡聚醣，並使用沙

38

門氏桿菌攻毒 (Salmonella enterica serovar Enteritidis) 發現其異嗜球

(hetrophil) 的吞噬活性、殺菌能力和呼吸風暴(oxidative burst) 能力均顯著

增加，顯著提升其抗菌能力(Lowry et al., 2005)。蛋雞飼料中添加 400 ppm

的 β-葡聚醣，發現其 CD8 和 TCR 1 細胞顯著增加，且添加 β-葡聚醣對於

生長表現較未添加的好 (Chae et al., 2006)。

39

参、以飼料基質發酵生產靈芝多醣的研究

ㄧ、摘要

以酚硫法和螢光分析(aniline blue)法測定市售樣品及靈芝飼料培養液中

多醣及 β-1,3-葡聚醣。商業產品經由測定後多醣和 β-1,3-葡聚醣含量分別約

佔 4.7~14.3%、1~7.25%。比較三種不同配方經過七天的發酵培養對靈芝多

醣的影響，其中以含黃豆、玉米飼料培養液配方 A 第二天可達最高多醣濃

度約 19515 µg/mL，而配方 C 可於第一天多醣濃度多醣濃度達 16526µg/mL，

於不同時間以饋料添加葡萄糖方式觀察其對多醣及 β-1,3-葡聚醣含量的影

響，發現添加黃豆及玉米的飼料培養液，具有提高靈芝多醣效果，以葡萄

糖饋料發酵對於靈芝多醣合成沒有顯著影響，反而使得 β-1,3-葡聚醣含量顯

著減少。

關鍵詞: 靈芝、多醣、β-1,3-葡聚醣、饋料。

二、前言

野生靈芝不易取得，而靈芝子實體的固態培養一般需3~6個月的時間，

而且從開始到採收相當費力，然而一般液態發酵僅需7~14天即可發酵完

成，將靈芝菌絲培養於液態培養基中，給予足夠的氧氣，使菌絲生長、繁

殖並可生產累積有效活性物質，如:靈芝多醣、靈芝酸(Yang et al., 2000; Fang

et al., 2002; Tang and Zhong, 2002)。

ㄧ般培養基以碳源以單糖或麥芽萃取物 (malt extract) 當作碳水化合

40

物的碳源，氮源以蛋白腖或酵母萃取物提供所組成的培養基，觀察靈芝發

酵液中的多醣含量約在1000µg/mL左右 (張, 2001; 李, 2003; 李, 2004; Fang,

2002, Yang,1998)，其中李 (2003) 利用小型發酵槽以含豆科作為發酵基質樣

品，此可大幅提高靈芝的菌絲體及多醣含量約為 570µg/mL，但 β-1,3-葡聚

醣卻非常稀少，只佔 1.3%。許 (2005) 曾利用的豆科基質黑豆與黃耆可明

顯增加多醣與 β-1,3-葡聚醣產量，使其濃度分別可高達 3220µg/mL 和

1520µg/mL，另外 Hsieh (2005) 等利用不溶酒糟以水洗滌過濾得到酒糟濾

液，用以溶解葡萄糖、NH4Cl 當作碳氮源，在 30℃，150rpm 培養七天，可

產生多醣濃度約 7500µg/mL，故培養基組成與發酵條件對於靈芝菌絲的生

長與多醣產量有顯著性的影響。

靈芝多醣具有免疫調節的活性，且具有 β- 1,6 葡萄醣基分支的 β-1,3-D

葡聚醣已被證實是靈芝子實體熱水萃取物中，含量最多的活性的的多醣(李,

2004)。而此種構型可讓動物體內具有能辨識的免疫細胞 (單核球、噬中性

球及巨噬細胞) 、或非免疫細胞 (Langerhans 細胞、紅血球、纖維母細胞、

內皮細胞及肺泡上皮細胞) ( Herre et al., 2004; Brown and Gordon, 2003) 所

辨識進而激發免疫反應。

而本研究進行靈芝液態發酵的方式，以飼料中的黃豆、玉米添加入原

本僅有含 5%葡萄糖作為主要碳源的配方中，探討培養液中添加黃豆、玉米

及葡萄糖饋料方式對於靈芝多醣產量的影響。

41

三、材料方法

3.1 菌種維持及培養

使用菌株為生物資源保存及研究中心 Ganoderma lucidum BCRC36123

(食品工業發展研究所，新竹)，使用 YM (YM broth, yeast malt broth) 斜面培

養基，此為一般真菌常用的培養基，先接種 Ganoderma lucidum BCRC36123

菌於 30℃下斜面培養基中培養，接入滅菌的不同培養基，每瓶約 150mL 培

養液於 500ml 有溝槽之三角錐瓶在轉速 175rpm，溫度 30℃進行三至七天培

養。

3.2 不同液態發酵培養基

本研究培養液基礎配方為 5﹪glucose、0.1﹪yeast extract、0.05%

K2HPO4、0.05﹪MgSo4．7H2O，並於基礎培養液中再另外添加 3%大豆粉和

2%玉米粉，為批式發酵的飼料發酵液配方 A，此作為對照組和其他配方 B、

C 比較，如表 1-1 所示，以葡萄糖作為饋料的培養基，配方代號為 D、E、F，

如表 1-2。將不同的培養液置於 500mL 有溝槽之三角錐瓶含 150ml 培養液，

並於 121℃下殺菌 20 分鐘，冷卻後，將經 YM 斜面培養七日的菌種加入 5ml

無菌水，以利將 YM 斜面培養基上的菌絲洗下來。將菌液接種於三角錐瓶，

並於 30℃恆溫下，轉速控制在 175rpm，培養 2-7 天。

3.3 饋料方式

葡萄糖饋料添加量和添加的時間點如表 1-2 所示，以探討其對多醣及葡

42

聚醣生成的影響，配方中主要以 3%黃豆和 2%玉米當作主要碳氮源，以批

式發酵的配方 A 分別和以葡萄糖為饋料的配方 D、E、F 作比較。饋料實驗

組: 配方 D: 2.5%葡萄糖於初始已加入，但另外的 2.5%葡萄糖於第一天後加

入，配方 E: 饋料時間分別於初始，第 0.5 天，第 1 天各饋料加入 2.5%葡萄

糖，配方 F 為第 1 天饋料加入 5%葡萄糖。

3.4 多醣分析

多醣總醣的測定是利用酚硫法，用硫酸將多醣分解為小分子的葡萄

糖，再帶入葡萄糖的檢量線中做比較，如圖 1-1。多醣的分析採酚-硫酸法 (張

等, 2004)，方法為取 1mL 樣品再加入 1mL 5％酚試劑和 5mL 濃硫酸，均

勻混合在 80℃熱水浴中加熱 30 分鐘，然後利用冰浴冷卻 2 分鐘，在 488nm

下測定吸光值。

3.5 螢光分析法定量 β-1,3-葡聚醣

此測定方法為依照 Ko and Lin (2004)等人分析方法，先以純的 β-1,3-葡

聚醣 Curdlan 當作標準品，作出標準曲線，同時與培養液萃取出來的多醣使

用 1N NaOH 當溶劑稀釋，之後分別將標準品與多醣稀釋液各取 0.3mL 置入

玻璃小管，之後加入 6N NaOH 每管各 30µL，馬上置入 80℃水浴槽反應 30

分鐘，目的為破壞葡聚醣的三級結構螺旋結構，使 β-1,3-葡聚醣結構成為較

具活性的一級螺旋結構，冰浴後加入 aniline blue 染劑於 50℃反應 30 分鐘，

取出後於室溫冷卻半小時，最後於激發光 398nm 及放射光 502nm 下偵測其

43

螢光強度，如圖 1-2。

3.6 統計分析

每個處理數值以平均±標準偏差的方式表現，以 t 檢定成對，和非成對

母體平均數差異檢定第二天和第七天的培養液中多醣、β-1,3-葡聚醣含量比

較，最後以 ANOVA 單因子變方分析法後，以鄧肯式新多變域性分析法必

較饋料方式對多醣、β-1,3-葡聚醣的影響。

四、結果與討論

靈芝發酵產品與離乳仔猪飼料的多醣和 β-1,3-葡聚醣分析

以酚硫法和螢光法定量市售飼料及靈芝產品之多醣與 β-1,3-葡聚醣含

量，如表 1-3 所示，a、b、c、d 四種市售的靈芝發酵產品，β-1,3-葡聚醣和

多醣所佔百分比分別為 1~7.25%、4.71~14.30%，其中以市售靈芝發酵產物

a 分別定量 50~150 ppm β-1,3-葡聚醣添加於離乳仔猪飼料 g、h; g、h 分別為

離乳仔猪飼養期間前兩週及後兩週所供給飼料，可以發現 g、h 兩組雖然多

醣所佔的百分比分別約為 23.05%、33.09%很高，但是多醣中的 β-1,3-葡聚

醣所佔百分比卻很少約各佔 0.48%、0.53%，β-1,3-葡聚醣佔多醣的百分比範

圍卻很低約只佔 1~2.08%，而以以配方 A 經搖瓶產的液態靈芝發酵產物之

靈芝發酵菌液和菌絲體多醣分布，如表 1-4 所示，其發酵液重量百分比約佔

78.31%，同時多醣分布亦佔發酵菌液約 77.47%，將冷凍乾燥後之配方 A 靈

芝發酵產物 β-1,3-葡聚醣和多醣定量後，除了比市售靈芝產品 d 所佔的比例

44

低之外，皆比其他市售靈芝發酵產品高，其菌液、菌絲體之 β-1,3-葡聚醣約

各佔 2.17%、1.10%，多醣約佔 19.08%及 16.27%，而 β-1,3-葡聚醣佔多醣的

比例約 11.37%、6.76%，如表 1-3 之 e、f。前述市售靈芝發酵產品測定後 β-1,3-

葡聚醣和多醣含量分別約佔 1~7.25%、4.7~14.3%，如表 1-3 所示; 其 β-1,3-

葡聚醣佔多醣的比例約 14.60~50.70%; 多醣中具生物活性的 β-1,3-葡聚醣含

量差異達 3.47 倍，故不同靈芝發酵產品所含靈芝多醣中 β-1,3-葡聚醣比例

有所不同，其原因可能與發酵基質、溫度、培養時間及有無填充劑使用有

關。

批式發酵將不同培養液配方進行七天培養之多醣濃度變化

分別比較批式發酵配方 A、B、C 對於靈芝多醣生成的影響，配方如表

1-1 所示，對照組 A 配方以飼料級的 3%黃豆粉、2%玉米粉及含 5%葡萄糖

的基礎發酵液配方，或添加 3%黃豆粉、2%玉米粉飼料培養液 C 配方及 B

配方只添加 5%葡萄糖當作碳源的飼料培養液，如圖 1-3 所示，發現若以配

方 C，生成靈芝多醣濃度非常低約在 70~340µg/mL，比較均添加 3%黃豆粉、

2%玉米粉的飼料培養液之配方 A、配方 C，差別在於配方 C 的第一天即可

產生很高的多醣濃度為 16526µg/mL，但是第二天開始多醣濃度變降為第一

天的 21%，之後濃度的變動不大;而配方 A，第一天所測得的多醣濃度也同

樣升高至 15160µg/mL，第二天的多醣濃度可達最高 19515µg/mL，之後多

醣濃度慢慢的下降，故此後的靈芝多醣生成時間以第二天當作基準，將第

45

二天的靈芝菌液收集進行定量分析或者在二天之添加葡萄糖饋料，且配方A

於第四天之後多醣濃度約為第二天的 24%，濃度變動不大，和配方 C 相較

可得知添加 5%葡萄糖、黃豆粉及玉米粉當作碳氮源具有加乘效果，可以使

靈芝菌利用後產生較多量的靈芝多醣，而僅添加 3%黃豆粉、2%玉米粉飼

料培養液配方 C，僅於第一天能夠產生大量的多醣便下降了，無法持續產

生靈芝多醣，而若只添加 5%葡萄糖，和另外兩種飼料配方相比，無法有效

產生大量多醣其多醣含量低於 350µg/mL。本研究與許 (2003) 在靜置培養

樣品結果顯示，培養基中加入豆科發酵基質和未加豆科基質發酵樣品相

比，明顯增加多醣與 β-1,3-葡聚醣產量，結果相似。

許多靈芝液態培養發酵的研究，培養時間約為 1 到 3 週 (Yang et al.,

2000; Fang et al., 2002; Tang and Zhong, 2002)，而本實驗批式發酵 3%黃豆

粉、2%玉米粉及含 5%葡萄糖飼料培養液配方 A 第二天多醣濃度顯著比第

七天為高 (p

46

源，饋料實驗組: 配方 D: 2.5%葡萄糖於初始已加入，但另外的 2.5%葡萄糖

於第一天饋料加入，配方 E: 饋料時間為於初始，第 0.5 天，第 1 天各饋料

加入 2.5%葡萄糖，配方 F 為第 1 天饋料加入 5%葡萄糖。

Tang and Zhong (2002)，曾比較蔗醣、麥芽醣、乳醣、葡萄糖當作碳源

對液態發酵靈芝胞外多醣的影響，其結果顯示蔗醣能可產生最高的胞外多

醣，而利用於培養第 8、10、12 天饋料加入乳醣可提高胞外多醣濃度第 20

天達約 960 µg/mL，相較於批式約 400µg/mL，可得知添加饋料可能提高靈

芝多醣生成。然而本研究以葡萄糖作為饋料之結果發現饋料處理組和對照

組的靈芝多醣濃度無顯著差異(p>0.05)，如圖 1-5 所示，但對於靈芝 β-1,3-

葡聚醣則具有顯著的差異，其中批式發酵之主飼料發酵液顯著可得到最高

的 β-1,3-葡聚醣濃度 (p

47

肆、液態靈芝發酵之 β-1,3-葡聚醣對仔猪生長性能的影響

ㄧ、摘要

本研究主要實驗動物為 3 週齡離乳仔猪，共 24 隻，隨機分為四實驗組，

每實驗組 6 隻，分別添加靈芝 β-1,3-葡聚醣 0 ppm、50 ppm、100 ppm 及 150

ppm 於飼料中，連續飼養 4 週，每兩週秤一次重，作為評估生長表現的指

標。且於第 2 週開始施打猪瘟疫苗，並於初始及第 4 週對離乳仔猪頸靜脈

採血進行猪瘟抗體力價及血液生化學分析。結果顯示，添加靈芝多醣 50 ppm

組仔猪平均每日增重最多且飼料利用效率也最佳，而血清中血紅素結合蛋

白的濃度會隨著添加 β-1,3-葡聚醣劑量增加而提高。此外，仔猪之血清猪瘟

抗體力價於各處理組間並無顯著差異，且已有保護效果。根據血液生化學

分析結果發現，餵食不同種劑量的 β-1,3-葡聚醣會降低血液中的血糖濃度，

但對肝功能指標的 ALT、AST，腎功能指標的肌酸酐 (creatinine) 均無明顯

影響，故添加 50 ppm 靈芝葡聚醣於飼料中可使離乳仔猪獲得最佳生長性能

之表現。

關鍵詞: 靈芝、多醣、β-1,3-聚葡醣、離乳仔猪、生長性狀。

二、前言

由於社會大眾擔心將抗微生物性生長促進因子 (anti-microbial growth

promoters) 添加動物飼料所可能衍生之抗藥性菌株與藥物殘留等公共衛生

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難題。世界各國分別制定飼料添加劑使用準則 ( Witte, 1998; Berend et al.,

2001) 中，規範飼料添加劑之使用劑量期間與停藥期，歐洲各國 2006 年起

全面停用抗生素類飼料添加劑，台灣亦訂定各種添加劑停用時間表。由於

靈芝長久以來就是東方人的天然藥品和保健食品，具有許多生理活性與功

效，大部分的菇蕈類多醣具有抗腫瘤及免疫調節作用，靈芝亦不例外，其

為一種生物反應調節劑（Biological Response Modifier, BRM）長期服用可提

高免疫系統 (Wasser and Weis, 1999)。尤其多醣中 β-1,3 鍵結的葡聚醣更具

免疫調節功效，可和人類血液中的免疫細胞如: 淋巴球、單核球細胞上特殊

的受體辨識而產生活性。

許多研究顯示添加不同添加物之劑量來評估對離乳仔猪的影響，並對

離乳仔猪的生長性狀如: 日增重、採食量及飼料利用效率等作為評估之依

據。Dritz 等人(1995)發現飼糧中添加 250 ppm β-葡聚醣可顯著增加離乳仔猪

平均日增重 (ADG) (p

49

影響，以期克服仔猪離乳症候群。

三、材料與方法

3.1 動物及實驗設計

3.1.1.品系: 實驗動物由藍瑞斯 (L) 和約克夏 (Y) 的兩品種雜交母系及公

系杜洛克 (D) 交配所得 3 品種雜交的三週齡離乳仔猪 (L×Y)×D，共

24 隻，隨機分為四群，每群組各 6 隻。

3.1.2.飼養週數: 連續飼養 4 週，每兩週秤一次重，作為評估生長表現的指

標。第 2 週開始施打猪瘟抗體疫苗，並於初始及第四週對離乳仔猪頸

靜脈採血進行猪瘟中和抗體力價檢測。

3.1.3.飼料: 添加靈芝 β-1,3-葡聚醣於人工乳 (福昌公司)、高哺仔猪 (福昌公

司) 飼料中，利用螢光分析法定量 β-1,3-葡聚醣 (Ko and Lin, 2004)，分

別添加靈芝 β-1,3-葡聚醣於四個實驗組為 0, 50 ppm, 100 ppm 及 150

ppm。

3.2. 抗體力價及血液生化學分析

3.2.1.血液收集與分析

將仔猪進行前腔靜脈採集之血液，靜置 6 小時後，以高速離心機離心

後，取血清，先貯存於-20℃冰箱，供抗體及血液生化值分析。

3.2.2.血紅素結合蛋白

血紅素結合蛋白為急性蛋白，可作為發炎時期的生物指標。其檢測方

50

法是採用 (Dritz et al., 1995) 改良 (Makimura and Suzuki, 1982)的測血漿中

急性蛋白 (Acute phase protein)中的血紅素結合蛋白 (hapotoglobin) 分析方

法。此方法的分析原理是利用游離血紅素結合蛋白會在酸性下及37℃時，

血紅素結合蛋白會與血紅素 (hemoglobin) 形成血紅素結合蛋白-血紅素複

合物 (hapotoglobinhemoglobin) 並具有過氧化酶活性，游離的血紅素在此種

環境卻會失去活性，而可利用已知的血紅素來對血紅素結合蛋白定量。

血紅素結合蛋白的測法是取20µL血清，加入5ml O-dianisidine試劑

(Sigma, USA)，在pH4.1、37℃之下，反應45分鐘，再加入50µl 的200 mM H2O2

室溫下靜置1小時。

血紅素結合蛋白濃度，可藉由形成多少變性血紅素蛋白來決定。另外

將胎牛血紅素變性蛋白 (mgHgb, Bovine methemoglobin , Sigma, USA) 當作

標準品，先配置胎牛血紅素變性蛋白10 mg/mL (methemoglobin stock solution

) 連續稀釋配成7.5、5、1.5及0 mg/mL標準溶液，再各取20µl如同上述步驟

ㄧ樣與血清反應，最後於分光光度計450 nm波長下測吸光值。

3.2.3.猪瘟中和抗體力價的檢測

由於猪瘟病毒感染細胞後，並沒有細胞病變情形 (cytopathic effect；

CPE) ，故使用猪瘟間接螢光標示抗體染色法 (IFA) 進行檢測，判定方法為

藉由離乳仔猪所產生猪瘟中和抗體經由螢光標定具有病毒猪瘟特異性螢

51

光，代表該猪隻曾經感染猪瘟病毒或曾經接種過猪瘟疫苗，再由稀釋倍數

當作為抗體力價加以評估疫苗的猪瘟疫苗的保護效果。

中和抗體力價之檢測方法為將待測之 25µl 猪抗血清加入 75µl MEM

（minimum essential medium；MEM）培養液，接種於 96 孔細胞培養盤內，

接著以連續稀釋的方式，分別連續稀釋為 8 倍、32 倍、64 倍、128 倍、256

倍和 512 倍。稀釋後之血清再加入等量的病毒液 200 TCID50，於 37℃下在

含 5%二氧化碳之溼性培養箱內感作 2 小時，感作後每孔分別接種入 0.5 mL

PK15 細胞 2×105 體積 50µL，培養箱培養三天，用以中和病毒未被中和的

病毒可以繼續感染病毒，抽去培養液並以 0.01 M 磷酸鹽緩衝液清洗細胞面

一次，待乾後於每孔加入 80~100µL 中性福馬林，在室溫中固定 20 分鐘，

再以 0.01 M 磷酸鹽緩衝液清洗三次，以除去固定液，之後於每孔加入經適

當稀釋之猪隻抗猪瘟病毒抗血清 (一抗) ，置於 37℃，感作 40 分鐘後以 0.01

M 磷酸鹽緩衝液清洗三次，去除未作用抗體。每孔加入經適當稀釋之山羊

抗猪免疫球蛋白Ｇ(IgG)螢光標示 (FITC) 抗體 (二抗)，置於 37℃感作 30

分鐘後，以 0.01 M 磷酸鹽緩衝液清洗三次，去除未作用螢光標示抗體，於

每孔加入 300µL 甘油磷酸緩衝液後，於倒立螢光顯微鏡下觀察有無猪瘟特

異性螢光。稀釋的有效倍數為猪瘟抗體中和力價，而對照組則無特異性螢

光產生，此為猪瘟陰性，其結果以 log2為單位表示。

3.2.4.血液生化學分析

52

血液生化值，將仔猪血液經 2654×g 離心 10 分鐘，並以全自動血液生

化分析儀 (HITACHI 7150) 測定天門冬氨酸氨基轉移酶(AST, EC 2.6.1.1)、

丙氨酸氨基轉移酶 (ALT, EC 2.6.1.2)活性、肌酐酸(creatinine)、葡萄醣

(glucose)、膽固�

institute of biotechnology national ilan university master...

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