INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS

EFECTO ANTIFÚNGICO IN VITRO E IN SITU DEL QUITOSANO Y ACEITES ESENCIALES SOBRE Rhizopus stolonifer (Ehrenb.:Fr.) Vuill.

TESIS

QUE PARA OBTENER EL GRADO DE MAESTRIA EN CIENCIAS

EN

MANEJO AGROECOLÓGICO DE PLAGAS Y ENFERMEDADES PRESENTA

ALEJANDRA MARÍA ALVARADO HERNÁNDEZ

YAUTEPEC, MORELOS, NOVIEMBRE DE 2009

Este trabajo se realizó en el

Laboratorio de postcosecha, del Departamento de Interacción planta-insecto en el

Centro de Desarrollo de Productos Bióticos del Instituto Politécnico Nacional bajo la

asesoría de la Dra. en C. Laura Leticia Barrera Necha y el Dr. en C. Miguel Velázquez Del

Valle Para la realización de los estudios se conto con el apoyo económico de CONACyT

(becario No. 236967) y del Programa Institucional de Formación de Investigadores de la

Secretaría de investigación y Posgrado (SIP) del IPN. La investigación fue realizada con el

financiamiento otorgado por los proyectos de la SIP (No. 20090225) y CONACYT (No.

089675).

AGRADECIMIENTOS

Le estoy inmensamente agradecida a la M. en C. Leticia Bravo Luna por toda la paciencia

que ha tenido para conmigo, por su atención, y todos los conocimientos que me ha

compartido y que me atrevo a decir que no solo encontré a una maestra si no también a

una gran amiga.

Al Dr. Montes porque me enseño muchas cosas, porque me ha brindado su apoyo y me ha

otorgado confianza, gracias por los conocimientos que ha compartido conmigo.

A la Maestra Ely le agradezco las enseñanzas en el laboratorio, el apoyo, la confianza y sus

puntos de vista que siempre me hacían discernir.

A mis compañeros y amigos Claudia, Saúl, Erika, Edith y Areli que compartieron conmigo,

por el apoyo que recibí de ellos, por las experiencias vividas y las cosas que me enseñaron

durante mi estancia en el CeProBi.

Al Dr. Miguel y a la Dra. Laura, que me permitieron realizar mi trabajo de tesis y me

dieron la oportunidad de alcanzar uno de mis objetivos profesionales.

A mis sinodales, la Dra. Gaby Trejo, la Dra. Kalina, la M. en C. Lety, la Dra. Laura Barrera,

el Dr. Miguel, a la Dra. Silvia, por las aportaciones hechas al trabajo.

Dedicado con cariño:

A mi familia en general: Porque han creído siempre en mí, me han alentado a seguir el camino que he

elegido, me han apoyado en todos los aspectos, han hecho que mi vida sea más placentera y llena de cosas

buenas, además por que sin ellos yo no estuviera donde ahora estoy.

A mi madre; Juventina Aine, que nunca ha dejado de consentirme con sus caricias, que me ha dado

confort con sus palabras, que siempre está atenta a mis quejas y festeja mis aciertos, porque es un ejemplo

de vida que siempre llevaré en mi corazón.

A mi padre; Alejandro, porque siempre está al pendiente de mí, porque me saca de apuros, me escucha, me

orienta, por que ha sido uno de mis grandes pilares y le estaré inmensamente agradecida.

A mi hermana Dulce María, por mantenerme con los pies en la tierra, saber escuchar y decir siempre con

acierto lo que me hace seguir adelante, por que además es mi amiga y mi psicóloga, por su atención aunque

muchas veces no me la merezca.

A mi hermana Diana María, que es la niña mas latosa que he conocido, pero que si no fuera por eso

muchas cosas en mi vida no tendrían sentido, porque a pesar de sus regaños, siempre me ha apoyado, ha

sido atenta conmigo y porque es uno de mis tesoros.

A mi pequeña hermana Ana María, que con tan solo 3 años de edad, ha sido el angelito que me inspira

para salir adelante, por sus juegos y sus alegrías que comparte a diario conmigo, porque creo que sin ella

las cosas nunca serian como son.

Al amor de mi vida Juan Manuel, por ser paciente, por darme todo ese amor que me ha dado y porque

siempre ha creído en mi.

I

ÍNDICE

Capítulo Contenido

pág.

INDICES Índice de cuadros

IV

Índice de figuras V RESUMEN VII ABSTRACT VIII

1. INTRODUCCIÓN 1 2. ANTECEDENTES 4

2.1. Importancia de los productos hortofrutícolas. 4

2.2. Causas de las pérdidas postcosecha. 5

2.3. Condiciones que favorecen a las enfermedades postcosecha 7

2.4. Principales enfermedades postcosecha. 8

2.5. Control de las enfermedades postcosecha. 9

2.6. Rhizopus stolonifer como agente causal de la pudrición blanda. 12

2.6.1. Condiciones óptimas de crecimiento. 12

2.6.2. Características morfológicas de R. stolonifer. 13

2.6.3. Mecanismos de infección de R. stolonifer. 14

2.6.4. Síntomas de la pudrición blanda causada por R. stolonifer. 15

2.6.5. Control de R. stolonifer. 17

2.7. El jitomate como producto de interés en México. 18

2.7.1. Producción de jitomate en el estado de Morelos. 19

2.7.2. Generalidades del jitomate. 20

2.7.3. Importancia nutricional del jitomate. 21

2.8. Aceites esenciales. 23

2.8.1. Aceite esencial de canela. 24

2.8.2. Aceite esencial de clavo. 25

2.8.3. Aceite esencial de tomillo. 26

2.9. Quitosano. 26

2.10. Efecto antifúngico del quitosano y de los aceites esenciales. 27

3. JUSTIFICACIÓN 30

4. OBJETIVOS 31

4.1. Objetivo general. 31

II

ÍNDICE

Capítulo Contenido

pág.

4.2. Objetivos particulares. 31

5. MATERIALES Y MÉTODOS 32

5.1. Material biológico. 33

5.2. Evaluación del quitosano y los aceites esenciales in vitro. 33

5.2.1. Elaboración de los medios de cultivo. 33

5.2.2. Evaluación de diferentes concentraciones de aceites esenciales. 35

5.2.3. Crecimiento micelial. 35

5.2.4. Esporulación. 38

5.2.5. Germinación. 38

5.2.5.1. Elaboración de la suspensión de esporas. 39

5.2.5.2. Evaluación de la germinación. 39

5.3. Evaluación del quitosano y de los aceites esenciales in situ. 41

5.3.1. Prueba de patogenicidad de R. stolonifer cepa R3. 41

5.3.2. Evaluaciones en jitomate. 43

5.3.3. Elaboración de los tratamientos empleados in situ. 43

5.3.4. Acondicionamiento de los frutos de jitomate para el bioensayo. 44

5.3.5. Almacenamiento. 45

5.3.6. Desarrollo de la escala de daño para evaluar índice de severidad. 47

5.3.7. Índice de severidad. 48

5.3.8. Porcentaje de infección. 48

5.3.9. Pérdida de peso. 48

5.4. Análisis estadístico. 49

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 50

6.1. Evaluación de diferentes concentraciones de aceites esenciales. 50

6.2. Crecimiento micelial. 51

6.3. Esporulación. 59

6.4. Germinación. 62

III

ÍNDICE

Capítulo Contenido

pág.

6.5. Evaluación del quitosano y de los aceites esenciales in situ. 74

6.5.1. Escala de daño. 74

6.5.2. Evaluaciones en jitomate. 75

6.5.3. Porcentaje de infección e índice de severidad. 77

6.5.4. Pérdida de peso. 86

7. CONCLUSIONES 89

8. PERSPECTIVAS 90

9. LITERATURA CITADA 91

IV

No. ÍNDICE DE CUADROS Pág.

1 Principales enfermedades postcosecha causadas por hongos. 8

2 Composición química por cada 100 g de jitomate crudo. 22

3 Tratamientos individuales y combinados de quitosano y aceites

esenciales para evaluar el efecto in vitro sobre el crecimiento micelial,

esporulación y germinación de R. stolonifer.

37

4 Tratamientos individuales y combinados de quitosano y aceites

esenciales aplicados in situ contra R. stolonifer.

43

5 Tasa de crecimiento e índice antifúngico de R. stolonifer con los

tratamientos individuales.

55

6 Tasa de crecimiento e índice antifúngico de R. stolonifer con los

tratamientos combinados.

57

7 Porcentaje de germinación de las esporas de R. stolonifer con los

tratamientos individuales y las combinaciones de quitosano a 2 y 10

mg mL-1 con los AE a 100 µg mL-1.

66

8 Porcentaje de infección e índice de severidad en jitomates inoculados

con R. stolonifer después de la aplicación de quitosano combinado

con los aceites esenciales de clavo, canela y tomillo a 300µg mL y

dicloran.

79

V

No. ÍNDICE DE FIGURAS Pág.

1 Morfología microscópica y colonial de R. stolonifer. 16

2 Esquema general del trabajo experimental. 32

3 Capacidad infectiva de R. stolonifer al inicio del experimento. 42

4 Capacidad infectiva de R. stolonifer después de 72 h de incubación. 42

5 Sistema de almacenamiento empleado para el bioensayo 45

6 Crecimiento micelial de R. stolonifer después de 48 h de la aplicación

de los aceites esenciales a tres concentraciones.

50

7 Dinámica de crecimiento micelial de R. stolonifer al ser incubado en

quitosano y Aceites esenciales a 28°.

53

8 Crecimiento micelial de R. stolonifer después de 48 h de incubación

con los tratamientos combinados de quitosano y aceites esenciales.

59

9 Esporulación de R. stolonifer con los tratamientos individuales. 60

10 Esporulación de R. stolonifer con los tratamientos combinados de

quitosano y los AE a 100 µg ml-1.

62

11 Germinación de las esporas de R. stolonifer con los tratamientos

individuales a las 9 h de incubación.

64

12 Germinación de las esporas de R. stolonifer con los tratamientos

combinados a las 9 h de incubación.

68

13 Germinación de las esporas de R. stolonifer con los tratamientos

combinados a las 9 h de incubación.

69

14 Escala de daño propuesta para determinar el índice de severidad. 75

15 Frutos de jitomate en dos estados de madurez infectados por

R. stolonifer a las 96 h de incubación.

76

16 Desarrollo de la pudrición blanda durante la incubación. 78

VI

No. ÍNDICE DE FIGURAS Pág.

17 Daño ocasionado a las 96 h de incubación por la infección de

R. stolonifer con los aceites esenciales a 300µg mL -1 y los controles.

81

18 Daño ocasionado a las 96 h de incubación por la infección de

R. stolonifer con las diferentes combinaciones de quitosano con los

aceites esenciales a 300 µg mL-1 y dicloran.

82

19 Pérdida de peso de los frutos de jitomate inoculados con R. stolonifer,

después de aplicar quitosano a 10mg mL-1 y las combinaciones de

quitosano con aceites esenciales de clavo, canela y tomillo a 300 µg

mL-1.

87

VII

RESUMEN

El jitomate es uno de los cultivos hortícolas más importante en México. Sus frutos son

afectados por hongos como Rhizopus stolonifer agente causal de la pudrición blanda,

enfermedad postcosecha que ocasiona pérdidas económicas importantes. Durante varios

años los fungicidas sintéticos han sido utilizados para controlar las enfermedades

postcosecha; sin embargo, diversos estudios han demostrado que los compuestos

empleados en estos fungicidas representan un riesgo potencial para el ambiente y la salud

humana. Por lo tanto, ha aumentado la búsqueda de alternativas naturales de control. El

objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto antifúngico del quitosano y de los aceites

esenciales de clavo, canela y tomillo individualmente y combinados sobre R. stolonifer. Se

evaluó quitosano a dos concentraciones 2 y 10 mg mL-1, aceites esenciales a 100 y 300 μg

mL-1 y combinaciones de quitosano con los aceites esenciales sobre el desarrollo in vitro

de R. stolonifer (crecimiento micelial, esporulación y germinación). Se utilizaron frutos de

jitomate para evaluar el efecto antifúngico del quitosano y los aceites esenciales in situ

(porcentaje de infección, índice de severidad y pérdida de peso). Los resultados de los

experimentos in vitro demostraron que los tratamientos más efectivos fueron obtenidos

con los aceites esenciales (clavo, canela y tomillo) a 300 μg mL-1 y con quitosano a 10 mg

mL-1, así como las combinaciones de estos en donde se observó un efecto aditivo en la

mayoría de los tratamientos y un efecto sinérgico en la combinación de quitosano con el

aceite esencial de tomillo. Los experimentos in situ mostraron que el quitosano a 10 mg

mL-1 fue el tratamiento más efectivo para reducir la pudrición fúngica y la pérdida de peso

de los frutos de jitomate. In situ no se observó efecto sinérgico con ninguna combinación

de quitosano y aceites esenciales, mientras que in vitro se presentó efecto aditivo e

incluso en algunos casos hasta sinérgico. Los resultados mostraron que el quitosano

ofrece una alternativa natural a los fungicidas sintéticos para controlar la pudrición blanda

en frutos de jitomate.

VIII

ABSTRACT

The tomato is one of the most important horticultural crops in Mexico. Fruits are affected

by fungi such as Rhizopus stolonifer causal agent of soft rot, postharvest disease that

causes important economic losses. During a number of years synthetic fungicides have

been used to control postharvest diseases; however, several studies have been shown

that the compounds used in these fungicides representing a potential risk for the

environment and human health. Therefore, the search of natural alternatives for the

control has been improved. The aim of this work was to evaluate the antifungal effect of

chitosan and essential oils of clove, cinnamon and thyme, individually and in combination

on Rhizopus stolonifer. Two chitosan concentrations 2 and 10 mg mL-1, essential oils at 100

and 300 μg mL-1 and combinations of chitosan with essential oils were evaluated on the in

vitro development of R. stolonifer (mycelial growth, sporulation and germination). Tomato

fruits were used to evaluate antifungal effect of chitosan and essential oils in situ

(percentage of infection, severity index and weight loss). The results of the in vitro

experiment demonstrated that the most effective treatments were obtained with the

essential oils (clove, cinnamon and thyme) at 300 μg mL-1 and with chitosan at 10 mg mL-1,

as well as the combinations of these where it was observed an effect additive in the

majority of the treatments and a synergic effect in the combination of quitosano with the

essential oil of thyme. The in situ experiment established that chitosan at 10 mg mL-1 was

the most effective treatment to reduce fungal decay and weight loss of tomato fruits. In

vitro no synergistic effect was observed with any combination of chitosan and essential

oils. Results show that chitosan offers a natural alternative to synthetic fungicides to

control soft rot in tomato fruits.

1

1. INTRODUCCIÓN

México es uno de los países con alto potencial agrícola, produciendo una amplia gama de

frutas y verduras en diferentes épocas del año. La actividad hortícola es una de las más

dinámicas en la agricultura mexicana y con mayor capacidad de exportación (Carrillo,

2004), México se considera como uno de los más importantes exportadores al mercado

estadunidense, el cultivo de jitomate es uno de los productos hortícolas que sobresale

(SAGARPA 2006, 2007). Este producto tiene importancia para la salud del humano, ya que

de ellos se obtienen nutrientes esenciales, vitaminas y minerales; además de proveer

compuestos antioxidantes y un alto contenido de agua (Spadaro y Gullino, 2004;

Candelas-Cadillo et al., 2005; De la Torre-Ibarra et al., 2008).

El jitomate es uno de los productos económicamente más importantes en México, se

producen más de 2 millones de toneladas y de éstas se exportan más de 900 000

(SAGARPA, 2006a), sin embargo, se ha reportado que 30% de la cosecha se pierde

primordialmente por pudriciones causadas por microorganismos fitopatógenos; el 80% de

estas pérdidas son ocasionadas por Rhizopus stolonifer (Ehrenb.:Fr.) Vuill. y Alternaria

alternata (Nees) (Hahn, 2006).

R. stolonifer causa la enfermedad denominada pudrición blanda, afectando al jitomate así

como a una gama de productos hortofrutícolas, generando pérdidas económicas

considerables en poco tiempo (Bonaterra et al., 2003; Zhang et al., 2004 y Hahn, 2006).

Estas pérdidas se producen en un periodo de aproximadamente 4 a 6 días, debido a que

este hongo tiene un crecimiento rápido y es de fácil transmisión por heridas producidas

2

durante la manipulación del fruto, principalmente en frutos maduros (Northover y Zhou,

2002; Bonaterra et al., 2003; Hahn, 2006; Hernández-Lauzardo et al., 2008; Velázquez

del Valle et al., 2008). Tradicionalmente se han usado fungicidas químicos sintéticos como

dicloran (Botran), iprodione, fludioxonil (Scholar 50WP), tebuconazol (Elite) entre otros,

para controlar las pudriciones causadas por R. stolonifer con los beneficios y riesgos que

implica el uso de los mismos (Adaskaveg et al., 2005). Actualmente, se buscan alternativas

naturales que no afecten la salud del humano y al medio ambiente; algunas de ellas son el

uso de quitosano y aceites esenciales (AE), los cuales se han utilizado de manera individual

en diferentes áreas (Bautista-Baños et al., 2006; Lárez, 2006). Algunos estudios han

demostrado que ambos productos por separado presentan actividad antifúngica; en el

caso de quitosano se ha probado contra Botrytis cinerea Pers.:Fr., Aspergilus flavus Link,

Rhizoctonia solani Kûnh, Fusarium oxisporum Link: Fr., Colletotrichum gloeosporioides

(Penz.) Penz. & Sacc. In Penz, Penicillum spp entre otros (El Ghaouth et al., 1992a; Barrera-

Necha et al., 2008; Barrera-Necha y García-Barrera, 2008). Mientras que los AE se han

evaluado sobre el desarrollo de hongos como B. cinerea, Fusarium spp, A. flavus,

Alternaria spp., Curvularia spp., Cercospora spp. y Monilinia fructicola Honey (El Ghaouth

et al., 1992b; Rabea et al., 2003; Tripathi et al., 2004; Kishore y Pande, 2007; Xu et al.,

2007). Sin embargo, el efecto que han tenido sobre estos hongos no ha sido suficiente

para su control, por lo que en este trabajo se pretendió aumentar el efecto de los

productos empleados, mediante la combinación de quitosano y aceites esenciales para

combatir a R. stolonifer y evitar la pudrición blanda en frutos de jitomate. El objetivo de

3

este trabajo fue determinar el efecto del quitosano y de los aceites esenciales de clavo,

canela y tomillo de manera individual y combinada sobre el crecimiento micelial, la

esporulación y la germinación de R. stolonifer así como evaluar el porcentaje de infección,

el índice de severidad y la pérdida de peso en frutos de jitomate.

4

2. ANTECEDENTES

2.1. Importancia de los productos hortofrutícolas.

Además de la importancia económica, los productos hortofrutícolas tienen una gran

relevancia en la salud del humano. Se considera que tanto frutas como verduras, son

parte importante en la dieta, porque de ellas se obtienen nutrientes esenciales, vitaminas

y minerales; además de proveer otro tipo de compuestos como los antioxidantes (Spadaro

y Gullino, 2004; De la Torre-Ibarra et al., 2008), la mayoría de estos productos son

reconocidos como alimentos básicos, que al consumirlas contribuyen al buen estado de

salud, reforzando el sistema inmunológico, reduciendo el daño celular por efectos de

radicales libres, además de reducir el riesgo de sufrir enfermedades crónico-degenerativas

como cardiopatías, cáncer, diabetes y obesidad (Zhuang y Barth, 2003; Albert et al., 2002;

Pomerleau et al., 2004).

Las hortalizas contienen gran cantidad de agua, generalmente entre el 85% y el 95% de su

peso total y que su valor calórico suele ser bajo, pues no supera las 50 calorías por cada

100 g de parte comestible. También se consideran una fuente importante de vitaminas, ya

sean hidrosolubles (vitamina B y C) o liposolubles (Vitaminas A, D, E y K) y de minerales

como potasio, magnesio, sodio, calcio, hierro, fósforo, yodo, cromo, selenio entre otros

(Anaya y Romero, 1999; Zhuang y Barth, 2003; Salinas-Hernández, 2007; Bautista-Baños et

al., 2008).

Debido a estas características, las hortalizas son altamente consumidas; es por eso que

resulta importante que estos productos sean totalmente inocuos. Sin embargo, la mayoría

5

de los productos hortícolas son afectados por una gran cantidad de microorganismos a lo

largo de la cadena postcosecha, debido a la susceptibilidad que presentan por sus

características nutrimentales, por su alto contenido de agua o bien por un mal manejo

postcosecha (Agrios, 2007).

2.2. Causas de las pérdidas postcosecha.

Las frutas y hortalizas frescas son los alimentos más perecederos debido a sus

características relacionadas al contenido de agua y a su actividad metabólica aún después

de la cosecha, generando pérdidas postcosecha que es uno de los principales problemas

para que estos productos lleguen a los consumidores y aunque estas pérdidas no pueden

ser calculadas con precisión, se estima que el 25 % del total de los productos en países

industrializados se pierden durante el almacén, el transporte y la comercialización;

mientras que en países subdesarrollados las pérdidas exceden del 50% (Spadaro et al.,

2004). Se cree que la mayor causa de las pérdidas identificadas se debe a una mala

manipulación y/o mala aplicación de tecnologías postcosecha así como la clasificación y

conservación de los productos (Vero et al., 2002; Neri et al., 2006).

El deterioro de los productos hortofrutícolas se clasifican de acuerdo al tipo de alteración

que se presenta en los productos, que pueden ser alteraciones fisiológicas o patológicas.

Las alteraciones fisiológicas son determinadas por anomalías en los procesos metabólicos

ya sea por el mismo proceso de envejecimiento del vegetal, que incluye sus actividades

metabólicas, como la respiración, la transpiración, la biosíntesis de etileno o bien por

6

factores exógenos como temperaturas inadecuadas, nutrición, evaporación,

almacenamiento etc. (Zaccari, 2003)

Las alteraciones físicas son aquellas producidas por agentes mecánicos, que provocan

machucones, heridas, así como el manejo inadecuado que causa aberturas en los

productos, entre otras circunstancias. Y las alteraciones patológicas que son originadas

por agentes bióticos como hongos, bacterias, virus, ácaros e insectos (Spadaro y Gullino,

2004; Rivera, 2008; Zaccari, 2003). Se debe destacar que las alteraciones físicas favorecen

la manifestación de las alteraciones patológicas, ya que se sabe que diversos hongos

principalmente se ven favorecidos por las lesiones físicas que sufren los productos

ocasionando lesiones más graves, hasta producir enfermedad en dichos productos

(Zaccari, 2003).

Es importante resaltar que el mayor porcentaje de pérdida de los productos postcosecha

se debe a las alteraciones patológicas, primordialmente a las pudriciones causadas por

hongos y bacterias fitopatógenas (Vero et al., 2002). El grado de daño depende de la

especie hortícola, de los organismos patógenos y de las condiciones del almacenamiento;

lo que causa una gama diferente de enfermedades (Agrios, 2007).

Los hongos fitopatógenos son los que generan mayor cantidad de pérdidas en los

productos hortofrutícolas, hasta ahora se conocen más de 100 especies responsables de la

mayoría de las enfermedades postcosecha (Tripathi y Dubey, 2004).

7

2.3. Condiciones que favorecen las enfermedades postcosecha.

Diversos hongos de la fase postcosecha están presentes en los productos desde antes de

la cosecha, sin que éstos presenten algún signo o síntoma referente al patógeno que les

invade, esto sucede porque en la mayoría de las ocasiones las condiciones ambientales se

vuelven favorables para el patógeno (Rivera, 2008).

Los productos hortícolas cambian su metabolismo a lo largo de su vida, sobre todo en la

fase postcosecha, generando metabolitos secundarios que al ser secretados pueden

favorecer que el patógeno invada al producto; o bien el simple envejecimiento natural

puede disminuir las defensas naturales que se presentan durante su estado inmaduro. Las

condiciones ambientales cambian cuando los productos son recolectados, lo que da lugar

a una tasa de respiración más alta, una transpiración elevada, pérdida de agua etc. La

temperatura de almacenamiento es determinante para que se presente la enfermedad, ya

que la mayoría de los hongos pueden desarrollarse a temperaturas ambientales con

condiciones de alta humedad.

Los hongos causantes del deterioro postcosecha muestran crecimiento óptimo de 20 a 25

°C. En general, las temperaturas máximas que toleran los hongos para su crecimiento

fluctúan entre los 32 a 38°C y la temperatura mínima es de 15° C ya que por debajo de

esta, usualmente se inhibe el desarrollo de los hongos fitopatógenos aunque existen

algunas excepciones como Penicillium spp. y B. cinerea que pueden crecer a temperaturas

de 4° C (Rivera, 2008).

8

2.4. Principales enfermedades postcosecha.

Los hongos más comunes que causan enfermedades postcosecha en una variedad de

productos son; A. alternata, B. cinerea, Fusarium oxisporum, Geotrichum spp., Penicillium

spp, Sclerotinia spp., C. gloesporiodes y R. stolonifer (cuadro 1).

Cuadro 1. Principales enfermedades postcosecha causadas por hongos

Pudriciones Hongo Producto postcosecha Literatura citada -Pudrición de los limones -Pudrición negra -Pudrición de los tomates -Pudrición de los tubérculos

Alternaria alternata Limón, naranja, tomate, pimientos, berenjenas, manzanas, pepinos, calabaza, melones, col, cerezas, uva y fresas. Papa, camote, etc.

-Agrios, 2007 -Bruton, 1996 -Maass, 1998 -Hahn, 2006

-Pudrición del moho gris

Botrytis cinerea Fresa, cebolla, lechuga, vid, manzana, peras, manzanas, cítricos, tomates, cebollas entre otros.

-Adaskaveg et al., 2005 -Bartz, 2003. -Chu et al., 2001 -El Ghaouth et al., 1992ª

Pudrición café (mohos rosados)

Fusarium oxysporum Naranjas, limones, papá, bulbos de ornamentales, raíces, cucurbitáceas y tomates.

-Barrera-Necha et al., 2009.

Pudriciones ácidas Geotrichum spp. Tomates, zanahorias, entre otros frutos y hortalizas.

-Bruton, 1996

-Pudrición del moho azul -Pudrición del moho verde

Penicillium digitatum Penicillum expansum

Todo tipo de cítricos; manzanas, peras, membrillos, uvas, cebollas, melones, higos, camotes etc.

-Neri et al., 2006

-Palou, 2007

-Pudrición algodonosa -Pudrición blanda aguanosa

Sclerotinia spp. Limones Frijol, crucíferas, cucurbitáceas, fresas, entre muchas más.

-Bruton, 1996 -Maass, 1998

Antracnosis Colletotrichum gloeosporioides

Papaya, berenjena, tomate, cucurbitáceas , mango, plátano

-Bautista-Baños et al., 2003.

Pudrición blanda R. stolonifer Fresas, camotes, duraznos, cerezas, papaya, cacahuates, maíz, tomate, jitomate, melón, zanahoria, sandía, frijol, chícharo, berenjena, ciruela, plátano, mango, aguacate, uva etc.,

-Abd Alla et al., 2008 -El Ghaouth et al., 1992ª -Hahn, 2006 -Mari et al., 2004 -Zhang et al., 2004

9

Los diferentes tipos de pudriciones que se presentan en los productos hortofrutícolas

causan las pérdidas de mayor importancia. Uno de los principales hongos fitopatógenos

que causa pudrición es R. stolonifer ya que afecta a una gama amplia de productos

hortofrutícolas, como son ciruela, uva, plátano, mango, frijol, melón, zanahoria, por

mencionar algunos productos, así como jitomate (Bonaterra et al., 2003; Zhang et al.,

2004 y Hahn, 2006). Los cuales pueden ser afectados en poco tiempo por las

características del hongo, originando la pérdida total del producto y por consecuente

pérdidas económicas considerables.

En México se calcula el 30 % de la cosecha de jitomate se pierde debido a las

enfermedades postcosecha y aproximadamente el 80% del total de las pérdidas se deben

primordialmente a dos hongos; Alternaria alternata y R. stolonifer (Hahn, 2006).

2.5. Control de las enfermedades postcosecha

La pérdida de productos por las enfermedades postcosecha, genera pérdidas económicas

importantes, por lo que el hombre ha tratado de evitar este tipo de problemas usando

diferentes métodos de conservación, uno de ellos es el uso de compuestos químicos

sintéticos que se utilizan como un método principal. Anualmente se aplican 23 millones de

Kg de estos compuestos a frutas y verduras (Tripathi et al., 2004), que son incorporados

comúnmente antes y durante la cosecha, por lo que el hombre está directamente

expuesto a estos productos, siendo una de las razones más importantes para evitar el uso

de fungicidas químicos sintéticos, ya que presentan efectos nocivos a la salud como; la

carcinogénesis, la teratogénesis así como toxicidad residual cuando se consumen frutas y

10

verduras que han sido expuestas y prontamente consumidas, como es el caso de los

productos para el consumo en fresco, siendo una problemática la aplicación de

agroquímicos que resulta especialmente importante durante la fase postcosecha, ya que

es cuando el producto está más próximo al consumidor; además se han desarrollado

cepas fúngicas resistentes y han ocasionado contaminación ambiental (Bautista-Baños et

al., 2000; Cia et al., 2007; Spadaro et al., 2004, Tripathi et al., 2004; Vero et al., 2002).

Por lo que actualmente se buscan alternativas que sean menos riesgosas para la salud y el

medio ambiente, pero efectivas para el control de las enfermedades postcosecha.

Muchos estudios postcosecha sugieren el empleo de métodos físicos como el curado, la

irradiación, la conservación frigorífica, el uso de atmósferas controladas, entre otros;

algunos más proponen el control biológico o bien el uso de sustancias naturales o de

síntesis química, que presenten los mínimos efectos secundarios sobre el medio ambiente

y los seres vivos (Burt, 2004; Hussain et al., 2008; Kordali et al., 2008; Spadaro y Gullino,

2004; Lurie, 2001; Wisniewski et al., 2001; Tripathi y Dubey, 2004 y Vero et al., 2002 ).

Esto ha dado lugar a que se estudien sustancias presentes de forma natural tanto en

plantas como en animales e incluso de microorganismos. Las sustancias naturales

obtenidas de las plantas, son primordialmente metabolitos secundarios obtenidos como

extractos vegetales, aceites esenciales, fitoalexinas y compuestos aromáticos, entre otros.

Ya que se ha observado que éstos presentan efectos fungicidas e insecticidas (Win et al.,

2007; Kordali et al., 2008; Domingo y López-Brea, 2003). Con lo que respecta a las

sustancias obtenidas de los animales podemos mencionar a algunos péptidos

11

antimicrobianos, proteínas, e incluso polímeros como el quitosano que presentan

actividad antifúngica contra diversos patógenos postcosecha (González-Candela et al.,

2001).

El uso de los diferentes métodos antes mencionados difícilmente cubre el espectro de

acción, los niveles de efectividad y la persistencia que proporcionan los fungicidas

químicos sintéticos convencionales. Así que actualmente se dedican esfuerzos para

evaluar la integración de varios métodos o tratamientos que sean compatibles o

complementarios entre sí. Buscando dos tipos de efecto; un efecto sinérgico o aditivo

(efecto curativo) y un efecto persistente (efecto preventivo) haciendo que el tratamiento

combinado controle las infecciones en el momento y a lo largo de la cadena postcosecha

(Palou, 2007). Lo que contribuiría a disminuir el uso de los fungicidas químicos sintéticos y

así reducir su efecto nocivo y residual; y poder integrar los tratamientos combinados a un

manejo de tecnología postcosecha.

De manera que en este trabajo se emplea la combinación de dos sustancias naturales

como el quitosano (de origen animal) y los aceites esenciales (origen vegetal), para inhibir

la pudrición blanda causada por R. stolonifer en jitomate, de los cuales se sabe que tienen

efecto fungicida, que no causan daño a la salud del humano ni al medio ambiente de

acuerdo a Velázquez del Valle et al. (2008).

12

2.6. Rhizopus stolonifer como agente causal de la pudrición blanda

Rhizopus stolonifer, significa “Que en el pie de la raíz lleva un vástago”, su significado

proviene del griego rhíza ριζα (raíz) y poûs πους (pie) y del latín stolo-onis (vástago,

retoño) y fero (portar) (Pontón et al., 2002).

Se encuentra clasificado dentro del Phylum: Zygomycota; Orden: Mucorales; Familia:

Mucoraceae; Género: Rhizopus; Especie: Rhizopus stolonifer (Pontón et al., 2002; Agrios

2007).

R. stolonifer es conocido también como moho negro del pan, se considera como un hongo

que provoca una importante enfermedad postcosecha en frutos maduros, en todas las

áreas de producción alrededor del mundo. Se han registrado pérdidas desde un 50 hasta

el 100 % en el área de producción (Ogawa, 1995). Además de que es un hongo que se

encuentra ampliamente distribuido en la naturaleza (Northover y Zhou 2002; Zhang et al.,

2004). Comúnmente vive como saprófito y en ocasiones como parásito (Carlile y

Watkinson 1994). A pesar de eso puede afectar a un gran número de productos agrícolas.

2.6.1. Condiciones óptimas de crecimiento.

R. stolonifer es uno de los mucorales más frecuentes que tiene una distribución amplia en

todo el planeta. Su temperatura de crecimiento varía desde los 10 hasta los 33° C, con una

temperatura óptima de 25° C. Este hongo se ve afectado severamente por temperaturas

menores de 5° C. Con frecuencia se encuentra en suelos con arena, en la composta, en el

polvo de las casas, en la pulpa de la madera, estiércol, panales de abejas, nidos y plumas

de aves, así como en diferentes frutos y semillas (Pontón et al., 2002). Las esporas de R.

13

stolonifer no son abundantes en el aire libre, aunque su frecuencia aumenta en lugares

donde hay humedad y se acumula vegetación muerta (Velázquez del-Valle et al., 2008).

Cuando se establece en los productos agrícolas aprovecha las lesiones que provocan

algunos insectos o que fueron provocadas por el mal manejo de los productos. Una vez

establecido, el hongo coloniza rápidamente a su hospedero dando lugar al

establecimiento y desarrollo de la enfermedad, lo que provoca que de 4 a 6 días se hayan

contaminado la mayoría de los productos y se tengan considerables pérdidas postcosecha

(Velázquez-del Valle et al., 2008).

2.6.2. Características morfológicas de R. stolonifer.

R. stolonifer es un hongo filamentoso, presenta un micelio que carece de septos y

produce esporangióforos largos, aéreos sin ramificar (Carlile y Watkinson 1994; Agrios,

2007), de color pardo oscuro que nacen de un nudo de rizoides bien desarrollado, hasta

formar en la punta los esporangios, que son esféricos pequeños con columnela y

contienen en su interior a las esporangiosporas (Figura 1), que pueden ser de diferentes

formas como; elipsoidales, globosas y angulares, en la superficie presenta

ornamentaciones, que son estriadas y lisas, se encuentran a lo largo de la espora y son de

color oscuro (Bartz, 2003; Hernández-Lauzardo et al., 2006). Cuando estos

esporangiosporas se encuentran sobre una superficie que mantiene las condiciones

adecuadas para la germinación y desarrollo del hongo, las esporas germinan y se forman

los estolones que son hifas que se adaptan a la superficie y que junto con los rizoides

14

forman puntos de contacto con la superficie y se da lugar a la formación de más estolones

que se desarrollan en todas direcciones (Villanueva, 2004; Agrios, 2007).

Produce esporas sexuales denominadas, zigosporas que tienen una pared celular gruesa,

rugosa y de color negro, representan la etapa latente o invernante del hongo, que

cuando germina forma el esporangióforo, esporangio y gran cantidad de esporas (figura

1e). Generalmente lo esporangióforos se unen en grupos de tres (figura 1a y 1b)

(Villanueva, 2004; Agrios 2007). Actualmente se conocen 13 especies del género Rhizopus,

algunos saprófitos y otros parásitos de frutas y otros órganos vegetales (Smith, 1992; Abe

et al., 2006; Jennessen et al., 2008).

2.6.3. Mecanismos de infección de R. stolonifer

Generalmente la infección por R. stolonifer en frutos y vegetales ocurre primordialmente

durante la fase postcosecha, dado que en esa fase los productos sufren lesiones que

permiten la entrada del hongo (Bartz, 2003; Bautista-Baños et al., 2008). Es importante

que las heridas sean recientes para que las esporas germinen. Una vez germinadas las

esporas se producen hifas, estas secretan enzimas pectinolíticas que degradan y disuelven

las sustancias pécticas de la lámina media en las células, dando lugar a la perdida de

cohesión entre ellas, provocando que las rodee una sustancia líquida, lo que da como

resultado la pudrición blanda. Posteriormente, secreta enzimas celulolíticas que

provocan la completa desintegración de las células de los tejidos vegetales (Maass, 1998;

Barkai-Golan, 2001).

15

2.6.4. Síntomas de la pudrición blanda causada por R. stolonifer

Una vez que el hongo se ha establecido en el producto, la zona de infección se torna

oscura, como si estuviese embebida en agua, por consecuencia se torna blanda y acuosa.

Mientras las células vegetales no hayan muerto el micelio crece intercelularmente sin

invadirlas hasta que mueran, los productos infectados rápidamente se colapsan y

derraman un líquido claro, de lo que resulta una grave contaminación para los productos

vecinos cuando alcanzan su maduración, así la pudrición avanza con gran rapidez (Maass,

1998; Bartz, 2003; Abd Alla et al., 2008).

En poco tiempo las hifas del hongo crecen hacia fuera a través de las heridas del fruto y

cubren las zonas afectadas con la producción de esporangióforos; el hongo se extiende

hasta la superficie de las porciones sanas de los frutos afectados; al principio se desprende

un olor ligeramente agradable y posteriormente un olor a rancio; finalmente los órganos

vegetales se momifican, se degradan o desintegran formando una masa aguanosa (Ogawa

et al., 2004; Agrios 2007).

16

Figura 1. Morfología microscópica (40 X) y colonial de R. stolonifer. 1a) esporangióforos (Es)

aéreos agrupados en tres, 1b) Esporangios de color negro (Eo), 1c) Columnela (Co), 1d) Rizoides

(Ri), 1e) Zigosporas (Z), 1f) Esporangiosporas (Ep) y 1g) Colonia de R. stolonifer ocupando toda la

superficie de una caja con PDA.

17

2.6.5. Control de R. stolonifer

Se sabe qué R. stolonifer es capaz de afectar a una gran cantidad de frutas y hortalizas,

como ya se ha mencionado anteriormente, por lo que para su control se debe tomar en

cuenta el tipo de fruta u hortaliza que está siendo afectado. En el caso del durazno se han

empleado tres prácticas principales, primero el tratamiento pre cosecha con un fungicida

químico sintético aplicado en aerosol, posteriormente puede emplearse la cosecha

temprana o bien un tratamiento pre almacenamiento y en tercer lugar un tratamiento en

frío después del almacenamiento, tratando los frutos conjuntamente con cera antes del

embalaje (Northover y Zhou, 2002). En otras frutas y hortalizas como camote, papaya

jitomate entre otros se han aplicado las dos primeras prácticas de control. Los fungicidas

químicos comúnmente utilizados son el dicloran, iprodione, fludioxonil y tebuconazol

(Adaskaveg et al., 2002).

El dicloran ha sido considerado muy eficaz contra la pudrición causada por R. stolonifer, se

ha utilizado tanto en la fase pre cosecha en forma de aerosol (ajo, algodonero, apio,

batata, berenjena, cacahuate, calabacín, cebolla, endibia, fresa, frutales de hueso, frutas de

caña, girasol (para multiplicación de simiente), judía, lechuga, ornamentales, patata, pepino,

pimiento, tomate, vid, zanahoria, etc.), como en la fase postcosecha sumergiendo los frutos

(ciruela, tomates, jitomates, nectarinas, duraznos, cítricos, fruta de hueso y pepita etc.) en

una solución con este agente químico; aunque es un fungicida residual, lo que da lugar a

que los frutos tratados presenten residuos color amarillo que hace que a la vista del

consumidor tengan un mal aspecto. El iprodione también es considerado como un

18

fungicida eficaz contra R. stolonifer. En Canadá ha sido utilizado durante la pre cosecha

con resultados aceptables. Se considera que el tebuconazol y el propiconazol (Orbit) son

tan represivos contra este fitopatógeno, como el iprodione y el dicloran durante 6 días,

pero su control es inferior después de 8 días de incubación a temperaturas de 16-26° C

(Adaskaveg et al., 2002; Northover y Zhou, 2002).

También se ha utilizado la combinación de dos o más fungicidas químicos sintéticos,

siendo que en la actualidad se ha registrado la resistencia de las cepas a los diferentes

tratamientos químicos antes expuestos, además de que la mayoría son residuales y por lo

tanto pueden causar efectos secundarios en el consumidor. Por esto se han hecho varios

estudios para combatir a R. stolonifer de manera natural. Esto incluye el uso de métodos

físicos como son las atmósferas controladas, tratamientos con calor y las radiaciones.

También se han usado alternativas naturales como control biológico usando algunas

levaduras propias de los frutos o productos hortícolas (Qing y Shiping, 2000). De la misma

manera se ha evaluado el uso de sustancias provenientes de plantas que presentan

características fungicidas, como algunos extractos, aceites esenciales, acetaldehído, etc.

así como el quitosano (Northorver y Zhou, 2002; Hernández-Lauzardo et al., 2007; Abd

Alla et al., 2008).

2.7. El Jitomate como producto hortícola de interés en México.

A nivel mundial el jitomate ocupa el segundo lugar entre las hortalizas; y aunque México

ocupa el décimo lugar en producción, le corresponde el tercero en comercialización del

fruto. En México el jitomate es considerado como la segunda especie hortícola más

19

importante por la superficie sembrada y como la primera por su valor de producción

(Arrellano y Gutiérrez, 2006).

En el periodo comprendido a los años 2000-2005 la producción de jitomate fue de dos

millones 160 mil toneladas (SAGARPA 2006a; Martínez-Romero et la., 2008), de las cuales

se exportaron a los mercados internacionales más de 902 mil 515 toneladas de esta

hortaliza, lo que representó divisas por el orden de mil 131 millones de dólares durante el

2005 (SAGARPA, 2006b). En el 2007, México exportó jitomate a EU con un valor cercano a

los 1,200 millones de dólares, lo que representó el 8% de las exportaciones totales de

productos agropecuarios del país que equivale al 80% del jitomate que importa EU

(Martínez-Romero et al., 2008). Finalmente la rentabilidad del cultivo está en función

entre otros factores de la vida postcosecha, pues de ella depende el éxito de

comercialización, que es generalmente largo y el consumidor es exigente (Arellano y

Gutiérrez, 2006). Igualmente el jitomate es la hortaliza más importante para

procesamiento en términos de valor, volumen y actividad, que redunda en la generación

de empleos (Chauvet y Massieu, 1996).

2.7.1. Producción de jitomate en el estado de Morelos

En el estado de Morelos, el jitomate se produce a cielo abierto; ya sea en temporal o de

riego y en invernadero; su producción representa 2 mil 591 hectáreas cultivadas a cielo

abierto en el ámbito estatal, con una derrama económica de 170 mil pesos por ha. Con

base en los registros realizados por el Distrito de Desarrollo Rural Zacatepec-Galeana en el

20

año 2002, en el estado de Morelos se produce jitomate en 18 municipios, entre los que

destacan: Atlatlahuacan con 1 502 hectáreas, Tepoztlán (136 ha), Cuautla (69 ha) y

Cuernavaca (51 ha). En estos cuatro municipios se encuentra el 80% de la superficie

sembrada y se obtiene el 80% de la producción de jitomate del estado (León y Guzmán,

2004). La producción de jitomate bajo condiciones de riego se localiza en los Municipios

de Cuautla (69 ha), Ayala (47 ha) Tepalcingo (47 ha) y Coatlán del Río (35 ha),

principalmente. La diferencia con las zonas de temporal es más marcada en rendimiento

por hectárea que en el precio de venta; en este sentido, en algunos municipios se

registran rendimientos mayores hasta en 100% con respecto a la producción en temporal

(Morelos-POA, 2008).

En el estado de Morelos, la producción de jitomate se mantiene durante todo el año, con

incrementos en los meses de agosto, septiembre y octubre; tiempo en que se cosecha el

jitomate que se produce a cielo abierto (León y Guzmán, 2004; Morelos-POA, 2008;

SAGARPA, 2003c).

2.7.2. Generalidades del jitomate

El jitomate o “tomate rojo” es una planta originaria de América tropical, cuyo origen se

localiza en la región de los Andes (Chile, Colombia, Ecuador, Bolivia y Perú), en donde

encuentra la mayor variabilidad genética y abundancia de tipos silvestres (Peralta y

Spooner, 2007). México al igual que Perú se considera a nivel mundial como el centro más

importante de domesticación del jitomate. Esta hortaliza fue llevada a Europa en 1554

21

empezando a comercializarse en Estados Unidos hacia el año 1835 (Peralta y Spooner,

2007).

El jitomate se clasifica en el orden Solanales, familia Solanaceae; género Solanum y

especie Solanum lycopersicum L. , también conocido como Lycopersicum esculentum Mill.,

es una planta herbácea perenne que produce una baya que va de un color amarillo hasta

rojo y que por sus características nutritivas es altamente consumida alrededor del mundo

(Peralta y Spooner, 2007).

La palabra jitomate procede del náhuatl xictli, ombligo y tomātl, tomate, que significa

tomate de ombligo. Como una curiosidad, debe notarse que aunque la palabra tomate

viene del náhuatl tomatl, en el sur de México el tomate es conocido como jitomate,

mientras que se le llama tomate al tomatillo o tomate verde (Physalis ixocarpa L.).

2.7.3. Importancia nutricional del jitomate.

El jitomate es un alimento con escasa cantidad de calorías, la mayor parte del peso del

fruto es agua y el segundo constituyente en importancia son los hidratos de carbono, los

que le confieren un sabor dulce, también contiene algunos ácidos orgánicos que le

proporcionan el sabor ácido característico; el jitomate es una fuente importante de

minerales como el potasio y el magnesio, tienen vitaminas como la B1, B2, B5 y la

vitamina C, también presenta carotenoides como el licopeno (pigmento rojo). La vitamina

C y el licopeno son excelentes antioxidantes que pueden tener una función protectora

para el organismo (Ejechi-Bernard et al., 1998; Gebhardt y Thomas, 2002). Este último es

22

un compuesto que además de poseer propiedades antioxidantes, actúa protegiendo a las

células humanas del estrés oxidativo, producido por la acción de los radicales libres que

son uno de los principales responsables de las enfermedades cardiovasculares, del cáncer

y del envejecimiento. Además, actúa modulando las moléculas responsables de la

regulación del ciclo celular y produciendo una regresión de ciertas lesiones cancerosas

(Gebhardt y Thomas, 2002).

Cuadro 2. Composición química por cada 100g de jitomate crudo

Componente Cantidad Componente Cantidad

Agua 94g Carbohidratos 4.3 g

Calcio 7.0 mg Sodio 1.2 mg

Magnesio 10 mg Fibra 0.5 g

Fierro 0.4 mg Grasa 0.2 g

Fósforo 23 mg Proteínas 0.9 g

Potasio 204.0 mg

Acido ascórbico 17.6 mg Provitamina A 0.38 mg

Glúcidos 2.8 g Vitamina B1 0.06 mg

Vitamina B2 0.04 mg Vitamina B6 0.11 mg

Vitamina C 0.7 mg Energía 19.0 Kcal

Fuente: Ensmigner et al., 1995

Se sabe que por cada 100 g de tomate se consumen solamente 18 Kcal. En el cuadro 2 se

provee información sobre los principales constituyentes nutritivos del jitomate.

Por otro lado, el jitomate inmaduro contiene solanina que resulta ser tóxica para el

humano, por lo que no debe consumirse en ese estado de madurez (Peralta y Spooner,

23

2007). Aunque el jitomate en estado maduro es altamente recomendable para el

consumo humano además de que se puede consumir fresco y procesado.

2.8. Aceites esenciales

Los aceites esenciales son líquidos oleosos, aromáticos, volátiles, obtenidos de diferentes

partes de la planta, como tallos, flores, hojas, raíces, semillas, frutos etc. Pueden

obtenerse por diferentes métodos pero el más común es por destilación utilizado

primordialmente para la producción (Burt, 2004; Al-Bayati, 2008). Se estima que

aproximadamente se conocen más de 3000 aceites esenciales y que 300 de ellos tienen

importancia comercial, ya que se usan en diferentes productos ya sean de belleza, en

alimentos, como condimentos o sabores entre otros usos (Burt, 2004; Maguna et al.,

2006; Tullio et al., 2007). Se sabe que algunos aceites esenciales tienen efecto

antibacteriano, antifúngico, antiviral, insecticida y además poseen propiedades

antioxidantes así como antiinflamatorias (Chericoni et al., 2005; Kordali et al., 2008;

Inoyue et al., 2006; Maguna et al., 2006; Matan et al., 2006).

Los aceites esenciales están constituidos por una mezcla compleja de compuestos,

principalmente terpenos, alcoholes fenólicos como es el caso del timol, carvacrol,

eugenol; alcoholes no fenólicos como el geraniol, linalol, aldehídos, cetonas, ácidos y

ésteres, entre otros y cada planta puede tener hasta 100 sustancias químicas distintas en

diferentes cantidades y que en conjunto proporcionan al aceite esencial características

propias (Tripathi et al., 2004; Ortuño, 2006). Se considera que de manera natural juegan

24

un papel importante en los mecanismos de defensa de la planta en contra de

microorganismos fitopatógenos, algunos tienen efecto antifúngico; reducen el

crecimiento de las hifas, inducen la lisis provocando la evacuación citoplásmica del hongo

e involucra cambios en la composición de la célula, ruptura de la membrana plasmática,

desorganización estructural de la mitocondria e interferencia de las reacciones

enzimáticas de la membrana mitocondrial (Kishore y Pande, 2007). Además de que los

aceites esenciales son compuestos naturales y por consecuencia son biodegradables, no

son residuales y no afectan al ambiente (Tripathi et al., 2004).

De ahí la importancia del uso de los aceites esenciales para el control de enfermedades

fúngicas. En este trabajo se evaluaron los aceites esenciales de canela (Cinnamomum

zeylanicum Blume), tomillo (Thymus vulgaris L.) y clavo (Syzygium aromaticum L.), los

cuales se eligieron por su capacidad antifúngica mostrada con diferentes hongos de

acuerdo a Barrera-Necha et al. (2008).

2.8.1. Aceite esencial de canela.

La canela es de la familia Lauraceae, del género Cinnamomum que comprende

aproximadamente 250 especies, él árbol es nativo de la India e Indochina, las tres especies

importantes de donde se obtienen AE de interés son C. zeylanicum, C. cassia Blume y C.

camphora L. La canela tiene efectos biológicos como la analgesia, es antiséptico,

antiespasmódico, afrodisiaco, astringente, carminativo, hemostático, insecticida y

parasiticida (Jayaprakasha et al., 2003; Santos et al., 2008).

25

El aceite de esta especie se puede extraer de la hoja, del tallo o de la raíz, lo que da lugar

a diferencias en sus características de aroma, sabor y composición química principalmente

(Jayaprakasha et al., 2007). El uso más común es la perfumería, así como saborizantes en

la industria de los alimentos, en farmacéuticos, preparaciones dentales y bebidas, entre

otros productos, además, se caracteriza por que tiene un aroma dulce, picante y de gran

alcance (Kubeczka y Formacek, 2002; Santos et al., 2008).

Dentro de los principales constituyentes del aceite de canela se tienen al cinnamaldehído,

linalol, eugenol y en menor cantidad terpenos hidrocarbonados, varios aldehídos

aromáticos y ésteres (Jayaprakasha et al., 2006; Santos et al., 2008).

2.8.2. Aceite esencial de clavo.

El clavo (Syzygium aromaticum) es un árbol tropical, originario de las islas Molucca, las

islas Zanzíbar y en las islas vecinas de Bemba, pertenece a la familia Myrtaceae, se cultiva

en muchas ciudades de clima tropical, es una especie herbolaria muy conocida, por su

amplio uso como condimento, principalmente en el arte culinario o bien para elaborar

productos como cremas, jabones, perfumes así como en el área médica (Santos et al.,

2008; García-González y Vázquez-Sánchez, 2006).

El clavo comprende de un 14-21% de aceite esencial, el cual es más denso que el agua y

fácilmente se oscurece al contacto con el aire, además tiene un olor fuerte, aromático y

picante. El aceite esencial de clavo comprende principalmente fenoles (78-98%), como el

eugenol y el acetileugenol, también contiene sesquiterpernos, algunos ésteres, cetonas y

alcoholes (Kubeczka y Formacek, 2002; García-González y Vázquez-Sánchez, 2006).

26

2.8.3. Aceite esencial de tomillo.

El tomillo es de la familia Lamiaceae, es un arbusto herbáceo perenne, es una planta

nativa de la región del mediterráneo pero es cultivada en distintas regiones como España,

Grecia, Italia, algunas ciudades del centro de Europa, Turquía, Israel, Norte América solo

por mencionar algunas; en Irak es usado como expectorante, antibroncolítico,

antiespasmódico, antihelmíntico, carminativo y como antidiurético (Al- Bayati, 2008).

El tomillo es una especie comúnmente usada de diversas maneras, una de ellas es como

aceite esencial el cual es ampliamente utilizado como saborizantes de alimentos,

preparación farmacéutica, enjuagues, desinfectantes además algunas veces como

perfumes (Ortuño, 2006).

El aceite esencial contiene como componentes principales al timol y carvacrol; en menor

cantidad es el p-cimeno, limoneno, carvacrol, linalol carbolifeno, etc. (Murray, 2000;

Tripathi et al., 2004).

2.9. Quitosano

La quitina (del griego tunic, envoltura) se encuentra ampliamente distribuida en la

naturaleza y después de la celulosa es el segundo polisacárido de mayor abundancia, sus

fuentes principales son el exoesqueleto de muchos crustáceos, alas de insectos, paredes

celulares de hongos, algas etc., de la quitina se deriva el quitosano que a su vez se puede

encontrar de forma natural en paredes celulares de algunas plantas y hongos. Sin

embargo, su fuente más importante a nivel industrial lo constituye la quitina, mediante el

proceso de desacetilación química o enzimática se ha producido a gran escala. El

27

quitosano, polímero constituido fundamentalmente por unidades de glucosamina (2-

amino-2-desoxi-D-glucosa) con uniones β (1-4), presenta propiedades policatiónicas que le

confieren características únicas de funcionalidad, además de ser biodegradable y no

tóxico, aspectos que le dan un gran potencial de aplicación en diferentes áreas; en la

agricultura, en la medicina, tratamientos de aguas, cosméticos, biosensores, etc. (Bautista-

Baños et al., 2006; Lárez, 2006).

El quitosano se ha empleado como película comestible siendo una alternativa de

conservación en cultivos agrícolas durante la fase postcosecha (Hernández-Muñoz et al.,

2006).

2.10. Efecto antifúngico del quitosano y de los aceites esenciales.

El quitosano y los aceites esenciales nos interesan principalmente por una de sus

características; su efecto fungicida. Se sabe que estos productos presentan actividad

contra diferentes microorganismos. A continuación se describen algunas investigaciones

realizadas con los productos de interés para este trabajo, con la finalidad de conocer

cómo se comportan el quitosano y los aceites esenciales (AE).

Recientemente, Hernández-Lauzardo et al. (2008) estudiaron el efecto del quitosano con

diferentes pesos moleculares sobre el desarrollo in vitro de R. stolonifer; los autores

reportaron que el quitosano de bajo peso molecular fue más efectivo para inhibir el

crecimiento micelial, mientras que el quitosano de alto peso molecular afectó la

producción y germinación de las esporas. Por otra parte, se analizó el efecto del quitosano

en el control de la pudrición blanda producida por R. stolonifer en jitomates almacenados

28

a 14° C durante 48, 72 y 96 h, observándose que la presencia de este polímero retrasó el

desarrollo de la pudrición (Bautista-Baños y Bravo-Luna, 2004). Asimismo, el

recubrimiento con quitosano en fresas y cerezas durante su almacenamiento, mostró no

sólo reducción en la enfermedad, sino que incrementó la actividad de algunas enzimas

relacionadas con la inducción de resistencia vegetal (quitinasas y 1-3 glucanasas) (Zhang

y Quantick, 1998).

De todos los AE que se han estudiado, destacan los aceites de clavo (Syzygium

aromaticum), canela (Cinnamomum zeylanicum) y tomillo (Thymus vulgaris); entre otros

como los de epazote, menta, ajo, lima y eucalipto, observándose que los últimos tres

aceites mencionados inhibieron el crecimiento micelial y la esporulación de los conidios de

C. gloeosporioides, a concentraciones de 200, 250 y 300 µg mL-1. De la misma manera, se

observó un efecto inhibitorio sobre el desarrollo de Fusarium oxisporum f. sp. gladioli

(Massey) Snyder and Hansen, con los mismo AE a las mismas concentraciones (Barrera-

Necha et al., 2008; Barrera-Necha et al., 2009). García-Camarillo et al. (2006), evaluaron el

efecto del AE de canela sobre A. flavus utilizando una dosis mínima de 100 ppm y una

máxima de 500 ppm. Dimitra-Daferera et al. (2003), observaron que el aceite de tomillo

presentó uno de los mejores efectos inhibitorios sobre Fusarium spp. y B. cinerea, así

como en el control de la pudrición por moho gris en fresas (Chu et al., 1999) y en el

control de la pudrición café causado por M. fructicola (Chu et al., 2001).

Rasooli y Razzaghi (2004), reportaron a nivel in vitro la actividad fungicida e inhibitoria de

la producción de aflatoxinas en A. parasiticus Speare con el AE de tomillo; Plotto et al.

29

(2003), determinaron el efecto de varios AE, incluyendo tomillo y canela para el control de

enfermedades en tomate y observaron que el AE de canela fue uno de los mejores para el

control de B. cinerea. Tsao y Zhou (2000), reportaron que el timol (constituyente del AE de

tomillo) presenta actividad fungistática sobre B. cinerea y M. fructicola.

30

3. JUSTIFICACIÓN

Los productos hortofrutícolas son afectados por pudriciones postcosecha que

tradicionalmente se han controlado mediante el empleo de fungicidas sintéticos con los

beneficios y riesgos que implica el uso de los mismos. Actualmente, se buscan alternativas

naturales que no afecten a la salud del humano y al medio ambiente. Hasta el momento

los AE y el quitosano se han utilizado de manera individual y se ha visto que presentan

resultados favorables en contra de hongos postcosecha, sin embargo, se busca amplificar

el efecto para tener el control de estos hongos, evitando grandes pérdidas postcosecha.

De manera que el quitosano y los aceites esenciales utilizados de forma individual o

combinada representan alternativas interesantes para inhibir in vitro e in situ el desarrollo

de R. stolonifer. Además de que no existen reportes previos del uso de esta combinación

(quitosano-aceites esenciales) para inhibir el desarrollo de R. stolonifer in vitro o en frutos

de jitomate.

31

4. OBJETIVOS

4.1. Objetivo general

Determinar in vitro e in situ el efecto antifúngico del quitosano y de los aceites esenciales

de clavo, canela y tomillo, de manera individual y combinada sobre Rhizopus stolonifer.

4.2. Objetivos particulares

Evaluar in vitro el efecto del quitosano y de los aceites esenciales de tomillo, clavo y

canela sobre el crecimiento micelial, esporulación y germinación de R. stolonifer

Evaluar in vitro el efecto antifúngico de las combinaciones de quitosano-aceites esenciales

de clavo, canela y tomillo sobre el crecimiento micelial, esporulación y germinación de R.

stolonifer.

Evaluar el efecto antifúngico del quitosano y aceites esenciales de manera individual y

combinada contra R. stolonifer en frutos de jitomate.

32

5. MATERIALES Y MÉTODOS

Figura 2. Esquema general del trabajo experimental. El cual se divido; in vitro, en donde se evaluaron al

quitosano y a los AE utilizados individualmente y combinados; e in situ donde se evaluaron los mejores

tratamientos obtenidos in vitro

33

5.1. Material biológico

Se empleó la cepa de R. stolonifer R3 aislada de frutos de jitomate (Lycopersicon

esculentum) del tipo “Saladette” provenientes de Yautepec, Morelos (Hernández-Lauzardo

et al., 2006).

Los aceites esenciales para las evaluaciones con R. stolonifer, se obtuvieron de forma

comercial en la compañía de aceites y esencias S.A. de C.V., México, D.F.; se utilizaron tres

aceites esenciales que son tomillo, canela, y clavo.

Se utilizaron frutos de jitomate del tipo “Saladette”, los cuales fueron seleccionados con

las siguientes características; tamaño uniforme, estado rojo maduro, sin lesiones y

ausencia de enfermedad, los frutos fueron cultivados y cosechados en Tlayacapan,

Morelos en una huerta familiar.

5.2. Evaluación del quitosano y de los aceites esenciales in vitro

5.2.1. Elaboración de los medios de cultivo.

Los medios de cultivo, Papa Dextrosa Agar (PDA) y Caldo de Papa Dextrosa (PDB) se

elaboraron de acuerdo a las condiciones indicadas por el fabricante (Bioxon). Se utilizó

quitosano de bajo peso molecular para los medios de PDA adicionados con quitosano los

cuales se prepararon a dos concentraciones 2 y 10 mg mL-1. Para ello se elaboró una

solución stock de quitosano a una concentración de 20 mg mL-1; se pesaron 2 g de

quitosano y se disolvieron en 2 mL de ácido acético glacial, con 50 mL de agua destilada,

se agitó durante 24 h posteriormente se ajustó el pH a 5.6 con NaOH 0.1 N (Hernández-

34

Martínez, 2005), finalmente la solución se aforó a 100 mL con agua destilada. Para

obtener las concentraciones de 2 y 10 mg mL-1, se diluyó el quitosano con el medio de

cultivo, no sin antes haberlos esterilizado por separado a 15 lb pul2 durante 15 min,

finalmente en condiciones controladas de esterilidad se mezclaron y se vaciaron en cajas

Petri de 100X 15 mm.

Por separado se pesaron los aceites esenciales de clavo, canela y tomillo para obtener las

concentraciones de 100, 200 y 300 µg mL-1 a evaluar y se disolvieron en 1 mL de agua

destilada con tween 20 (Aldrich) en una relación 1:6 (1 parte de tween en 5 partes de

aceite); posteriormente, por separado se llevaron a un volumen final de 150 mL de medio

de cultivo (PDA) y se esterilizaron a 15 lb pul2 de presión durante 15 min, finalmente se

vaciaron en cajas Petri de 100 X 15 mm.

Para los medios combinados, se colocó el quitosano en un matraz de 50 mL y se esterilizó

a 15 lb pul2 durante 15 min. Por otro lado los aceites esenciales se pesaron y se diluyeron

con tween en 1 mL de agua destilada, posteriormente se agregaron por separado al PDA y

se esterilizaron (Kumar et al., 2008). Finalmente se mezcló el quitosano con el PDA

adicionado con los aceites esenciales, todo en condiciones de esterilidad y contínua

agitación, el medio combinado se vació en cajas Petri de 100 X 15 mm y se dejaron

solidificar. Una vez solidificados los medios con los tratamientos se sometieron a prueba

de esterilidad, la cual consistió en dejarlos en incubación a 25° C durante 24 h.

35

5.2.2. Evaluación de diferentes concentraciones de aceites esenciales.

Las concentraciones de AE de canela, clavo y tomillo utilizadas en los ensayos, se

determinaron a partir de tres diferentes concentraciones evaluadas, que fueron 100 µg

mL-1, 200 µg mL-1y 300 µg mL-1, las cuales presentan antecedentes de efecto antifúngico,

que ya han sido descritos anteriormente en este trabajo.

Los AE se incorporaron al medio de cultivo PDA como se describió en el punto 6.2.1.,

después de la prueba de esterilidad se colocó un inoculo de R. stolonifer de 6 mm de

diámetro, en la parte central de la caja Petri, durante la incubación se determinó el

crecimiento micelial con ayuda de un Vernier cada 8 h durante 48 h de incubación.

Finalmente se eligieron solo dos concentraciones; 100 µg mL-1 y 300 µg mL-1, que fueron

utilizadas en los ensayos posteriores.

5.2.3. Crecimiento micelial

A partir de un cultivo de R. stolonifer con 72 horas de incubación se obtuvieron discos de

6 mm de diámetro con un horadador, los discos se colocaron en el centro de las cajas Petri

con los diferentes tratamientos (referidos en el punto 5.2.1.). Las cajas Petri con PDA

fueron utilizadas como control positivo y las cajas con PDA más dicloran a 1 mg mL-1

representaron al control negativo. Aquí cabe mencionar que se preparó una solución

Stock de dicloran a 10 mg mL-l de acuerdo a las condiciones del fabricante (Gowan)

posteriormente se diluyó con agua destilada hasta obtener una concentración de 1 mg ml-

1. Las cajas con PDA más tween, se utilizaron como control para descartar que el tween

36

tenga efecto sobre el hongo. Para los tratamientos combinados también se utilizaron

controles con tween al adicionarlo a los medios con quitosano.

Se utilizaron seis cajas por cada tratamiento y se hicieron 3 repeticiones por experimento,

teniendo finalmente 14 tratamientos individuales y 17 tratamientos combinados (Cuadro

3), es importante mencionar que primero se hizo el experimento con los tratamientos

individuales y posteriormente el experimento con los tratamientos combinados. Los

medios inoculados se incubaron a temperatura ambiente (25-28° C), registrando cada 8 h

la lectura del diámetro de la colonia con un Vernier digital, hasta que el control positivo

cubrió por completo la superficie de la caja. De cada lectura obtenida del diámetro de la

colonia se restaron 6 mm del diámetro del inoculo inicial.

Con los datos obtenidos de crecimiento micelial, se calculó el índice antifúngico para cada

tratamiento con la siguiente fórmula (Guo et al. (2006):

(IA) = 1-(Da/Db) X 100

Donde IA es índice antifúngico, Da es el diámetro de la zona de crecimiento de R.

stolonifer en los tratamientos probados y Db es el diámetro de la zona de crecimiento de

R. stolonifer en la caja control.

También con los datos de crecimiento micelial se obtuvo la tasa de crecimiento de R.

stolonifer con cada uno de los tratamientos e incluso con los controles.

37

Cuadro 3. Tratamientos individuales y combinados de quitosano y aceites esenciales (a

diferentes concentraciones), para evaluar el efecto in vitro sobre el crecimiento micelial,

esporulación y germinación de R. stolonifer.

Tratamientos individuales Tratamientos combinados

PDA (control) PDA (control)

PDA-Tween 1 mg mL -1 PDA-Tween

Quitosano 2 mg mL-1 (Q2) Q2-Ca100

Quitosano 10 mg mL-1 (Q10) Q2- Cl100

Canela 100 μg mL-1 (Ca100) Q2 -To100

Clavo 100 μg mL-1 (Cl100) Q2-Ca 300

Tomillo 100 μg mL-1 (To100) Q2- Cl300

Canela 200 μg mL-1 (Ca200) Q2-To300

Clavo 200 μg mL-1 (Cl200) Q2-Tween

Tomillo 200 μg mL-1 (To200) Q10-Ca100

Canela 300 μg mL-1 (Ca300) Q10-Cl100

Clavo 300 μg mL-1 (Cl300) Q10-To100

Tomillo 300 μg mL-1 (To300) Q10-Ca 300

Dicloran 1 mg mL -1 (D 1) Q10-Cl300

Q10-To300

Q10-Tween

D 1

38

5.2.4. Esporulación

Una vez evaluado el crecimiento micelial se continuaron incubando las cajas de Petri hasta

72 h para evaluar la esporulación, se utilizaron las seis cajas procedentes del ensayo

anterior, cada una de ellas con sus respectivos tratamientos, posteriormente se les

adicionó 10 mL de agua destilada estéril y las colonias se rasparon con una varilla de

vidrio acodada para recuperar todas las esporas posibles. La suspensión de esporas

obtenida se colocó sin filtrar en un matraz de 50 mL, a esta se le adicionaron siete gotas

de lactofenol para evitar que las esporas germinaran y se hizo el conteo de esporas para

cada tratamiento, tomando de cada matraz previamente agitado una alícuota de 20 µl de

la suspensión de esporas que se colocaron en la cámara de Neubauer y se cubrió con un

cubreobjetos. Se contaron las esporas de los cuatro cuadrantes de las esquinas de la

cuadrícula y el cuadrante central de la cámara. Con los datos obtenidos se hicieron los

cálculos correspondientes y se obtuvo el número de esporas por mL para todos los

tratamientos. Las suspensiones que no se contaron inmediatamente se guardaron a 4° C

para posteriormente hacer su conteo.

5.2.5. Germinación

La germinación se evaluó en PDB adicionado con quitosano, con cada uno de los aceites

esenciales o con dicloran, según el tratamiento evaluado; como control positivo se utilizó

simplemente PDB. Los tratamientos utilizados fueron los mismos que se evaluaron para

crecimiento micelial y esporulación, colocados en tubos Eppendorf de 1 mL. Para esta

39

evaluación se requirió de una suspensión de esporas de R. stolonifer de concentración

conocida.

5.2.5.1. Elaboración de la suspensión de esporas

A partir de tres cajas Petri con R. stolonifer de 72 h de incubación se hizo la suspensión de

esporas; a cada caja se le agregaron 10 mL de agua destilada estéril y se raspó la colonia

con una varilla de vidrio acodada, de manera que todas las esporas posibles fueran

colectadas. Los lavados resultantes de las tres cajas se recogieron en un matraz de 50 mL,

que se mantuvo en constante agitación. Posteriormente, las esporas se contaron en la

cámara de Neubauer y a partir de ahí la suspensión se diluyó hasta ajustarla a una

concentración de 1X106 esporas por mililitro. Esta suspensión de esporas se hizo en el

momento en que se realizó el experimento, para evitar que las esporas ya estuviesen

germinadas.

5.2.5.2. Evaluación de la germinación

Una vez obtenida la suspensión de esporas, se tomaron alícuotas de 50 μL y se colocaron

en los tubos Eppendorf que contenían 450 μL de PDB y PDB más cada uno de los

diferentes tratamientos. Los tubos se agitaron en un vórtex y se incubaron en agitación a

100 rpm a temperatura ambiente (25 ± 3° C). Para cada tratamiento se utilizaron seis

repeticiones por tratamiento. Después de la incubación se tomaron alícuotas de 10 µL, de

cada tubo Eppendorf previamente agitado en un vórtex, la alícuota se colocó en un

portaobjetos y se le agregó una gota de lactofenol, posteriormente se cubrió con un

cubreobjetos y se contaron 100 esporas bajo el microscopio óptico con el objetivo 40X.

40

Esto se repitió a las 0, 3, 6, 9, y 12 h después de la inoculación de las esporas, se tomo una

alícuota por repetición es decir, 6 alícuotas por tratamiento. Se consideró a una espora

germinada cuando el tubo germinal fue igual o mayor al tamaño de la espora (El Ghaouth,

1992). También se hicieron observaciones a las 9 h de incubación de la forma de las

esporas de R. stolonifer.

Con estos datos se obtuvo el porcentaje de esporas germinadas para cada tratamiento.

% de germinación= Esporas totales X Esporas germinadas

100

41

5.3. Evaluación del quitosano y de los aceites esenciales in situ.

5.3.1. Prueba de patogenicidad de R. stolonifer cepa R3

Se evaluó la capacidad de esta cepa para infectar frutos de jitomate del tipo “Saladette”.

Se preparó una suspensión de esporas de R. stolonifer (1X106 esporas mL.1) de acuerdo al

punto 6.2.4.1., se colocó dentro de un atomizador y se mantuvo en agitación hasta la

inoculación de los frutos. 20 frutos de jitomate se lavaron y se desinfectaron con

hipoclorito de sodio al 1% durante 15 min, se enjuagaron tres veces y se dejaron secar a

temperatura ambiente (25 ± 3° C) sobre papel absorbente. Posteriormente en condiciones

de esterilidad se lesionaron con una aguja de disección, en la parte ecuatorial del fruto, el

tamaño de la lesión fue de 2 mm de diámetro por 2 mm de profundidad. Se asperjaron

diez frutos con la suspensión de esporas de R. stolonifer, los otros diez no fueron

asperjados (Figura 3). Todos los frutos se colocaron de manera individual en cámaras con

alto contenido de humedad, con entrada y salida de aire. Se incubaron a temperatura

ambiente durante 48 a 72 horas y se determinó el porcentaje de infección. El experimento

se repitió 2 veces.

La cepa de R. stolonifer R3 fue recuperada a partir de frutos de jitomate infectados

artificialmente con la misma cepa. Al inicio del experimento los frutos de jitomate

presentaban un estado de madurez rojo maduro, sin lesiones y sin presencia de alguna

enfermedad. Al final del experimento (96 h) los frutos presentaron signos de la pudrición

blanda causada por R. stolonifer y con un daño visual importante (figura 3 y 4). A partir de

los frutos infectados, se volvió a aislar la cepa R3 y con esta se infectaron nuevamente

42

frutos de jitomate; se requirieron varias reinfecciones de la cepa R3 a los fruto, para que

finalmente nueve de diez frutos inoculados artificialmente con R. stolonifer se infectaran,

y la cepa recuperara su patogenicidad. Posteriormente, se volvió a purificar y a verificar

las características morfológicas de la cepa R3 de acuerdo a lo reportado por Hernández-

Lauzardo et al. (2008) correspondientes a R. stolonifer (cepa R3).

Figura 3. Capacidad infectiva de R. stolonifer al inicio del experimento. 3A) Jitomates inoculados

con 1X105 esporas mL-1. 3B) Jitomates sin inocular.

Figura 4. Capacidad infectiva de R. stolonifer después de 72 h de incubación. 4A) Jitomates

inoculados con 1X105 esporas mL-1. 4B) Jitomates sin inocular. Al final del experimento

43

5.3.2. Evaluaciones en jitomate

Se utilizaron por separado jitomates ¾ sazón y jitomates totalmente maduros, se lavaron

con agua corriente y jabón, se desinfestaron con hipoclorito de sodio al 1% durante 15

min, se enjuagaron con agua destilada tres veces y se dejaron secar a temperatura

ambiente (25 ± 3° C), cada uno de los frutos fueron marcados y pesados en una balanza

digital. En cada tratamiento se emplearon 10 frutos como unidad experimental y tres

repeticiones de cada una. Los tratamientos aplicados se observan en el cuadro 4.

Cuadro 4. Tratamientos individuales y combinados de quitosano y aceites esenciales

aplicados in situ contra R. stolonifer.

Tratamientos individuales Tratamientos combinados

Agua destilada estéril Agua destilada estéril

Quitosano 2 mg mL-1 (Q2) Q10- Cl300

Quitosano 10 mg mL-1 (Q10) Q10 –To300

Canela 300 μg mL-1 (Ca100) Q10-Ca 300

Clavo 300 μg mL-1 (Cl100) Dicloran 1 mg mL-1

Tomillo 300μg mL-1 (To100)

Dicloran 1 mg mL-1

5.3.3. Elaboración de los tratamientos empleados in situ

Para los tratamientos individuales se procedió de la siguiente manera; a partir de una

solución stock de quitosano de 20 mg mL-1 se obtuvo quitosano a una concentración de 10

44

mg mL-1 que se diluyó con agua destilada a un volumen final de 500 mL. Los aceites

esenciales se pesaron para obtener una concentración de 300 μg mL-1 y se diluyeron con

Tween (1:6) en 1 mL de agua destilada posteriormente se llevaron a un volumen final de

500 mL. Todos los tratamientos se esterilizaron a 15 lb pul2 durante 15 min.

Con respecto a los tratamientos combinados se preparó la cantidad de quitosano

necesaria para tener una concentración de 10 mg mL-1 y los aceites diluidos con tween se

colocaron en el agua destilada. Todas las soluciones se esterilizaron y después se

mezclaron para tener un volumen final de 500 mL. Se dejaron enfriar a temperatura

ambiente en matraces de 1 L, de la misma manera se hizo una solución de dicloran a 1 mg

mL-1.

5.3.4. Acondicionamiento de los frutos de jitomate para el bioensayo.

Las soluciones preparadas se colocaron en vasos de precipitado y finalmente se procedió a

tratar los frutos. Los frutos lavados y desinfestados se hirieron en la parte ecuatorial del

jitomate con una aguja de disección en condiciones de esterilidad, la lesión fue de 2 mm

de profundidad por 2 mm de ancho. Posteriormente se sumergieron los diez frutos de

cada tratamiento, uno por uno en el vaso de precipitado que contenía el tratamiento a

evaluar, de manera que quedaran totalmente cubiertos con la solución durante 5

segundos e inmediatamente se retiraron. Posteriormente se colocaron en una superficie

lisa dentro de la campana de flujo laminar se dejaron secar durante 5 minutos y se

asperjaron con la solución de esporas. Lo mismo se hizo con el control negativo en donde

los frutos no fueron inoculados, pero si fueron sumergidos en agua destilada estéril al

45

igual que el control positivo a diferencia de que este último fue lesionado y asperjado con

la suspensión de esporas. Una vez tratados y asperjados los frutos con las esporas de R.

stolonifer se incubaron.

5.3.5. Almacenamiento.

El bioensayo in situ se realizó en un sistema de almacenamiento que permitió de manera

práctica el desarrollo del experimento, el cual se llevo completamente al azar, además

facilitó que todos los tratamientos tuvieran las mismas condiciones de iluminación,

temperatura, humedad, favoreciendo de la mejor manera las condiciones del bioensayo

(figura 5).

Figura 5. Sistema de almacenamiento empleado para el bioensayo con los frutos de jitomate, el

cual consistió en a) unidades que se podían estivar una sobre otra, b) a cada agrupación se le

colocó una malla y c) cada unidad contenía una cama de polipapel, una cama de algodón y una

cama de papel absorbente.

46

Este sistema consistió de contenedores individuales que se estibaron, por lo que facilitó el

manejo de cada una de las unidades para hacer las mediciones correspondientes.

Los frutos tratados se colocaron dentro de los contenedores de plástico previamente

dispuestos para cada tratamiento, como se muestra en la figura 5. En cada contenedor se

colocaron diez jitomates del mismo tratamiento a una distancia de 2 a 3 cm. En total se

tenían diez contenedores, cada uno con un tratamiento diferente. Cada tratamiento se

hizo por triplicado por lo que finalmente se tuvieron 30 contenedores. Todos estos se

colocaron con las mismas condiciones de luz, temperatura, humedad y se dispusieron al

azar. Se hicieron las observaciones cada 24 h hasta las 96 h de incubación a temperatura

ambiente (25-28°C), monitoreando la fluctuación de la temperatura mediante mediciones

continuas con un termómetro de mercurio y manteniendo constante la humedad al

humedecer frecuentemente las camas de algodón, además las unidades se cambiaron de

posición durante el experimento para igualar las condiciones en todos los tratamientos.

Durante este periodo de incubación se evaluó el porcentaje de infección, índice de

severidad y pérdida de peso.

47

5.3.6. Desarrollo de la escala de daño para evaluar índice de severidad.

Se desarrolló una escala de daño en frutos de jitomate, que permitió evaluar el índice de

severidad. Se emplearon 20 jitomates completamente maduros, se lavaron y se

desinfestaron con hipoclorito de sodio al 1%, se dejaron secar a temperatura ambiente,

después a todos los frutos se les hizo una lesión de 2 mm de profundidad por 2 mm de

ancho en la parte ecuatorial del fruto, con una aguja de disección previamente

esterilizada. Solo diez frutos fueron asperjados con una suspensión de esporas con 1X105

esporas por mL, estos se colocaron en un contenedor de plástico con las condiciones de

humedad, luz y temperatura adecuadas para que se favoreciera la infección. De la misma

manera todos los frutos no asperjados se colocaron en otro contenedor, en las mismas

condiciones. Ambos se incubaron a temperatura ambiente. Se hicieron observaciones en

los frutos a las 0, 12, 24, 36, 48 56, 64 y 72 h de incubación.

Se midieron los diámetros de las lesiones presentadas en los diez frutos asperjados a los

diferentes tiempos de incubación. De las diez repeticiones se obtuvieron los valores

máximos y mínimos así como la media para cada tiempo observado y se hizo una relación

con respecto al daño presentado y el tamaño total de cada fruto. A partir de esos datos se

obtuvo la escala de daño en porcentaje, además se realizó un diagrama pictográfico que

se utilizó en cada experimento (Figura 14).

48

5.3.7. Índice de severidad

Para el cálculo de índice de severidad (IS), se empleó la escala de daño establecida en el

punto 5.3.6. la cual presenta las siguientes categorías; 0= 0%, 1= 1-5%, 2= 6-15%; 3= 16-

45%, 4= 46-75% y 5= 76-100% de daño visual por fruto y se determinó el índice de

severidad mediante la siguiente ecuación (Pérez et al., 1995):

Índice de severidad = Xi (0) + Xi (1) + Xi (2) + Xi (3) + Xi (4) + Xi (5) /N

En donde

Xi = Número de frutos enfermos por cada grado de daño

0, 1, 2, 3, 4, 5= Grado de daño en la escala utilizada

N = Número de frutos por unidad experimental

5.3.8. Porcentaje de infección

Para determinar el porcentaje de infección se contaron los frutos infectados a lo largo del

periodo de incubación, registrando el número de frutos infectados por día durante 4 días,

tomando en cuenta que el 100 % corresponde al número total de frutos que se evaluaron

en cada tratamiento.

5.3.9. Pérdida de peso

Se pesaron todos los frutos individualmente en una balanza digital al inicio y al final del

experimento, se calculó la diferencia entre esas dos mediciones y se obtuvo la pérdida de

peso de cada fruto durante los 4 días de incubación.

49

5.4. Análisis estadístico

En todos los experimentos se utilizó un diseño experimental completamente al azar en

arreglo simple. En los ensayos in vitro los datos obtenidos de crecimiento, micelial y

esporulación se analizaron de acuerdo a un ANOVA de una vía y la comparación de medias

se hizo con la prueba de Tuckey utilizando el programa Sigma Stat 3.5. , cabe destacar que

se analizaron todos los datos diferentes de cero.

También se calculó la tasa de crecimiento en mm h-1 a partir de los datos de crecimiento

micelial; mediante regresión lineal de cada una de las repeticiones (6 repeticiones), se

obtuvo la F, para cada tratamiento.

En los ensayos in situ mediante un análisis de varianza (ANOVA) a excepción del índice de

severidad para el cual se hizo la prueba de Kruskal wallis con el programa Sigma Stat

versión 3.5. Cabe destacar que se analizaron todos los datos que fueron diferentes de

cero.

50

6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

6.1. Evaluación de diferentes concentraciones de aceites esenciales.

De acuerdo con los resultados, se observo que a 100 µg mL-1 se presentó el mayor

crecimiento micelial del hongo con respecto a las otras dos concentraciones. Mientras que

a 300 µg mL-1 no hubo crecimiento micelial y a 200 µg mL-1 se presentó un efecto

intermedio (figura 6).

Figura 6. Crecimiento micelial de R. stolonifer después de 48 h de la aplicación de los aceites

esenciales a tres concentraciones. Cl= clavo, Ca=canela y To= tomillo a 100 µg mL-1 (1), 200 µg mL-

1 (2) y 300 µg mL-1 (3).

También se observó que conforme aumentó la concentración de los AE, el efecto de

inhibición sobre el crecimiento micelial es mayor, esto significa que se presentó un efecto

dependiente de la concentración. Esto coincide con los resultados obtenidos por Barrera-

Necha et al., (2008) que utilizaron los AE de clavo, canela y tomillo a concentraciones de

51

100, 150, 200, 250 y 300 µg mL-1 sobre C. gloeosporioides, observando que conforme

aumentó la concentración de los AE la inhibición del crecimiento micelial fue mayor.

García-Camarillo et al. (2006), observaron que existe una relación entre el incremento de

la concentración del AE y la inhibición en la producción de aflatoxinas por A. flavus, en

nuez pecanera.

Con los resultados de este ensayo se decidió utilizar solo las concentraciones de 100 y 300

µg mL-1. La concentración de 300 µg mL-1 se utilizó para asegurar que en las

combinaciones de quitosano con los AE, el efecto sobre el hongo fuera significativo;

inclusive se potenciara el efecto y se presentara un efecto fungicida; mientras que la

concentración de 100 µg mL-1 permitiera ver el efecto aditivo o sinérgico al hacer las

combinaciones de los AE con el quitosano.

6.2. Crecimiento micelial

Los resultados mostraron que R. stolonifer fue susceptible a casi todos los tratamientos, ya

sean individuales o combinados. Se observó que el crecimiento micelial dependió de la

concentración de cada tratamiento, se destaca que en los tratamientos más concentrados

así como en las combinaciones de AE con quitosano, el crecimiento micelial de R.

stolonifer en algunos fue escaso, mientras que con otros tratamientos no se presentó

crecimiento micelial.

En la figura 7A, se observa el comportamiento del crecimiento micelial de R. stolonifer

con los tratamientos individuales, en donde se incluye el tratamiento con tween 20, el

cual no tuvo ningún efecto sobre el crecimiento micelial de R. stolonifer. Con esto se

52

descarta la posibilidad de un efecto fungicida del tween y se tiene la certeza de que el

efecto presentado se debió al quitosano y a los AE.

En casi todos los tratamientos se inhibió el crecimiento micelial de R. stolonifer con

diferencias estadísticas (P ≤ 0.001) respecto al control, la inhibición de crecimiento se

observó desde el inicio del experimento. Para cada tratamiento se presentó un

comportamiento diferente, principalmente a causa de la concentración del quitosano y de

los AE, destacando que conforme aumentó la concentración, el efecto inhibitorio sobre el

crecimiento micelial fue mayor (figura 7). De manera que con los AE a 300 µg mL-1 y el

dicloran, se observó una inhibición total del crecimiento micelial durante el periodo de

incubación, teniendo un índice antifúngico del 100 %. En la figura 7A solo es posible

visualizar la línea que representa al tratamiento con dicloran y el efecto obtenido con los

AE 300 µg mL-1.

En los tratamientos combinados de quitosano con los AE a 300 µg mL-1, no hubo

crecimiento micelial, por lo que solo se representan los datos obtenidos de las

combinaciones de quitosano con los AE a 100 µg mL-1. En la figura 7B se muestra una

disminución considerable del crecimiento micelial de R. stolonifer, aún mucho menor que

con los tratamientos individuales a concentraciones mayores (quitosano a 10 mg mL-1 y AE

a 300 µg mL-1).

Existen diversos estudios con AE de diferentes especies vegetales, que muestran que a

mayores concentraciones hay mayor efecto sobre el crecimiento del hongo, como es el

53

caso de A. parasiticus con el AE de tomillo, en donde este afecta el crecimiento del hongo,

la producción de aflatoxinas, y el desarrollo de las esporas a una concentración de 250

ppm (Rasooli y Owlia, 2005).

Figura 7. Dinámica de crecimiento micelial de R. stolonifer al ser incubado en quitosano y AEs a

28° C. 7A) Tratamientos individuales. 7B) Tratamientos combinados de quitosano con los AE a 100

µg mL-1. Media de seis repeticiones.

B

A

54

En el caso de A. flavus y A. parasiticus se observó un resultado similar con el AE de anís a

500 mg mL-1 (Bluma et al., 2007). Destacando que en ambos estudios a mayor

concentración de los AE mayor fue el efecto sobre el hongo.

La tasa de crecimiento y el índice antifúngico se obtuvo solo de los tratamientos en donde

aún hubo crecimiento micelial de R. stolonifer, que incluyó al quitosano en sus dos

concentraciones (2 y 10 mg mL-1) y los AE a 100 µg mL-1, de estos, la menor tasa de

crecimiento fue con quitosano a 10 mg mL-1 (Q10) con 0.05 mm h-1, mientras que la tasa

de crecimiento con canela a 100 µg mL-1 (Ca 100) no presentó diferencias con respecto al

control (0.24 mm h-1), siendo el IA bajo comparado con los demás tratamientos (cuadro 5).

Con los AE a la concentración de 300 µg mL-1, R. stolonifer no presentó crecimiento, su

tasa de crecimiento fue de cero y su IA fue del 100%. Seguido de estos tratamientos

destacó el quitosano a 10 mg mL-1 (Q10) con un 77% de IA, mientras que el quitosano a 2

mg mL-1 (Q2) y los AE de clavo (Cl) y tomillo (To) a 100 µg mL-1 presentaron los IA más

bajos, aún con diferencias respecto al control. Se destaca el AE de tomillo de los otros dos

AE, ya que tuvieron más del 30% de IA a 100 µg mL-1, mientras que los AE de clavo y

canela a la misma concentración presentaron un menor porcentaje de inhibición del

crecimiento micelial.

55

Cuadro 5. Crecimiento micelial, tasa de crecimiento e índice antifúngico de R. stolonifer

con los tratamientos individuales; quitosano (2 y 10 mg mL-1) y aceites esenciales (100

µg mL-1).

Letras diferentes en la misma columna representan diferencias estadísticas.

F= 839.62 gl= 5, 30 P<0.001. n=6

Suhr y Nielsen (2003), observaron que los aceites de clavo, canela y tomillo afectaron el

crecimiento de A. flavus, Endomyces fibuliger Lidner, Penicillum roqueforti Thom, P.

corylophilum Diercks y Eurotium spp. de manera significativa a la mayor concentración

empleada en su estudio (250 µL L-1), empleando un sistema de volatilización a diferentes

tiempos de incubación del hongo. Además se observó que el AE de tomillo a 250 µl L-1

presentó un 70 a un 100 % de IA, dependiendo del hongo fitopatógeno. Mientras que en

este estudio se utilizó el AE de tomillo a 300 µg mL-1, obteniendo un IA de 100%. De la

misma manera se observó que los AE de clavo, canela y tomillo presentaron una inhibición

significativa en hongos como Aspergillus spp., Erotium spp., Penicillum spp. A. alternata y

Tratamiento Crecimiento micelial

(mm)

Tasa de crecimiento

(mm/h)

F Índice antifúngico

(%)

Control 78 a

0.24 648.8 0

Canela (Ca) 74.60±2.61 a 0.22 1786.186 4.4

Clavo (Cl) 69.75±0.97 b 0.20 2816.397 10.6

Tomillo (To) 52.08±3.83 c 0.15 801.839 32.4

Quitosano 2 47.90 ± 2.07d 0.13 1016.842 38.6

Quitosano 10 17.63±0.90 e 0.05 167.825 77.4

56

Botryodiploidia entre otros; destacando especialmente el efecto del AE de tomillo sobre el

desarrollo de los hongos (Guynot et al., 2003; Kumar et al., 2008) incubados en cajas con

agar flúor por 48 días a 25° C, con mejor efecto a concentraciones altas pero menores que

los demás AE utilizados.

En la figura 7B, se aprecia un efecto aditivo del crecimiento micelial de R. stolonifer entre

las combinaciones de quitosano con los AE, incluso se puede hablar de un efecto sinérgico

en el caso del quitosano y el AE de tomillo. Ya que el crecimiento micelial de R. stolonifer

en quitosano a 2 mg mL-1 fue de 42.6 mm a las 48 h con un IA de 45.4 %, mientras que en

la combinación de quitosano a esta concentración con el AE de tomillo a 100 µg mL-1 se

presentó menos de 30 mm de crecimiento micelial, una valor parecido al obtenido con las

demás combinaciones con canela y clavo, mientras que con los tratamientos individuales

de los AE se obtuvo un crecimiento micelial parecido al control de PDA (cuadro 5).

De los tratamientos combinados el máximo crecimiento micelial, se observó con

quitosano a 2 mg mL-1 en combinación con el AE de tomillo a 100 µg mL-1, en donde el

crecimiento fue de 23.7 mm de diámetro (Cuadro 6). Y aunque no existen reportes de las

combinaciones de quitosano con AE, estos resultados se esperaban, debido que a los

resultados de los tratamientos individuales, indican que existe un efecto antifúngico. Así

como en la mayoría de los estudios previos con quitosano y AE, que proponen que las

combinaciones de éstos con diferentes métodos o productos podrían resultar un mejor

método para controlar enfermedades por fitopatógenos, ya que la mayoría de los estudios

utilizan estos productos por separado obteniendo resultados favorables, sin embargo se

57

cree en la posibilidad de que haya un mejor efecto al combinar los diferentes productos

evaluados, como extractos vegetales, aceites esenciales, métodos físicos e incluso control

biológico (Spadaro y Gullino, 2004; Tripathi y Dubey, 2004; Palou, 1991).

Cuadro 6. Crecimiento micelial, tasa de crecimiento e índice antifúngico de R. stolonifer

con los tratamientos combinados (quitosano 2 y 10 mg mL-1 más los AE a 100 µg mL-1)

que aun presentaron crecimiento micelial del hongo.

Las letras diferentes en la misma columna representan diferencias estadísticas significativas

F= 806.406, gl= 8,45 P<0.001. n=6

Con las combinaciones de quitosano a 10 mg mL-1 y los AE a 100 µg mL-1 se observó

crecimiento micelial pero en menor proporción que con las combinaciones anteriores a 2

Tratamiento

Crecimiento micelial

(mm)

Tasa de crecimiento

(mm/h)

F

Índice antifúngico

(%)

PDA

78 a 0.23 613.70 0

Q2

42.60 ± 2.07 b 0.13

1016.84

45.4

Q2To100

23.70 ± 2.12 cd 0.07 336.38

69.7

Q2Ca100

23.20 ± 2.56 c 0.07 196.01

70.3

Q2Cl100

19.50± 1.86 de 0.06 228.35

75.0

Q10

18.27 ± 0.95 e

0.05

167.82

76.6

Q10C100

8.77 ± 2.48 f 0.01 345.76

88.8

Q10Ca100

2.88 ± 3.16 g 0.03 72.62

96.5

58

mg mL-1. En los tratamientos en los que no hubo crecimiento micelial fue en la mezcla con

el AE de tomillo a 100 µg mL-1 y en el tratamiento con dicloran.

Por consecuencia la tasa de crecimiento de R. stolonifer en los tratamientos combinados

con los AE a 100 µg mL-1 es mucho menor que en los tratamientos individuales, ya que el

valor más alto de la tasa de crecimiento obtenido fue con la combinación de quitosano a 2

mg mL-1 con el aceite de tomillo y canela (0.07 mm h-1) y el valor más bajo fue con la

combinación de quitosano a 10 mg mL.1 con tomillo a 100 en donde no hubo crecimiento.

De manera que si comparamos estos resultados con los obtenidos por quitosano a 10 mg

mL-1 observamos que al combinarse ambos productos aumenta el potencial antifúngico

con respecto al control y a los tratamientos individuales y que esto depende del AE y las

concentraciones utilizadas. Estas combinaciones son la referencia de que al combinar al

quitosano con los AE puede haber un efecto aditivo o sinérgico.

Para corroborar que a mayores concentraciones el comportamiento fue similar se

probaron las combinaciones de quitosano a 2 y 10 mg mL -1 con los AE a 300 µg mL-1, las

cuales presentaron el 100 % de IA (Figura 8) al igual que dicloran. En estas combinaciones

no se pudo evaluar el efecto aditivo, debido a que los AE individuales a concentraciones

de 300 µg mL-1 presentaron el 100 % de IA.

59

Figura 8. Crecimiento micelial de R. stolonifer después de 48 h de incubación con los

tratamientos combinados de quitosano a 2 y 10 mg mL-1 (Q2 yQ10) y los aceites esenciales de

clavo (Cl3), canela (Ca3) y tomillo (To3) a 300 µg mL-1.

6.3. Esporulación

En la mayoría de los tratamientos se presentó una disminución en la producción de

esporas, en los tratamientos en los que no hubo crecimiento micelial no se logró evaluar

la esporulación, estos incluyó a los tres tratamientos con AE a 300 µg mL-1, las

combinaciones de quitosano a 2 y 10 mg mL-1 con los tres diferentes AE 300 µg mL-1 y la

mezcla de quitosano 10 mg mL-1 con el AE de tomillo a 100 µg mL-1. De los tratamientos

individuales, los AE de clavo y canela a 100 µg mL-1 (2.4 X10 6 esporas mL-1) no

presentaron diferencias con respecto al control (R3) con 3.0 X10 6 esporas mL-1 (figura 9).

60

Se sabe que el AE de clavo afecta la producción y germinación de esporas de diferentes

hongos, esto se examinó en medio líquido utilizando diferentes concentraciones y

diferentes intervalos de tiempo, destacando la concentración al 10% de AE de clavo

después de 24 h de incubación, además de causar lisis y deformación de los orgánulos

(observado mediante microscopia) especialmente la mitocondria en hongos como A.

alternata, F. chlamydosporum, Helminthosporium oryzae Breda de Haan y Rhizoctonia

bataticola (Taubenh) Butler (Zafar y Ahmad, 2002).

Figura 9. Esporulación de R. stolonifer con los tratamientos individuales. Control, Quitosano 2

(Q2) y 10 mg mL-1 (Q10), los aceites esenciales de canela (Ca), Clavo (Cl) y tomillo (To) a 100 µg

mL-1 y dicloran (D). Letras diferentes indican diferencias estadísticas significativas. gl =7,40 F=

317.705 P=<0.001.

El AE de tomillo a 100 µg mL-1 redujo notablemente la producción de esporas (3.3X10 4

esporas mL-1) con un resultado similar al que se obtuvo con quitosano a 10 mg mL-1

61

(3.8X104 esporas mL-1) y con diferencias significativas con respecto al control. El quitosano

a 2 mg mL-1 también redujo la cantidad de esporas (2.9X105 esporas mL-1) y aunque en

menor cantidad también fue diferente al control (3X106 esporas mL-1), estos tratamientos

no fueron diferentes entre sí además de que fueron muy parecidos al dicloran.

Los resultados obtenidos en este trabajo con respecto al quitosano son similares a los

presentados por Hernández-Lauzardo et al., (2008), y coinciden en el efecto sobre la

esporulación y germinación de las esporas de R. stolonifer con quitosano de bajo peso

molecular a 2 mg mL-1 así como la inhibición del crecimiento micelial. En otros estudios el

quitosano de bajo peso molecular a concentraciones menores del 1 % afectan el

crecimiento micelial y la esporulación B. cinerea y P. expansum Link. disminuyendo la

cantidad de conidios considerablemente (Liu et al., 2007). También existen reportes con C.

gloeosporioides en donde se observó que el quitosano concentración presentó un efecto

significativo sobre la disminución del número de conidios (Bautista-Baños et al., 2005).

En las combinaciones de quitosano a 10 mg mL-1 y los AE a 100 µg mL-1, no se observó

esporulación del hongo, aunque hubo crecimiento micelial. Estos resultados indican que el

efecto sobre el hongo está dado por las dosis empleadas, por los tipos de compuestos que

se utilizan y por el microorganismo que se quiere controlar.

En todas las combinaciones de quitosano a 2 mg mL-1 y los AE a 100 µg mL-1 se observó

esporulación. Todos los tratamientos fueron estadísticamente diferentes (P ≤ 0.001) al

control (figura 10). De estos tratamientos, las combinaciones con el AE de canela y tomillo

62

respectivamente, no presentaron diferencias entre sí con una producción de esporas en el

orden de 10 3 esporas mL -1, mientras que el control presentó 3 X10 6 esporas mL -1.

Figura 10. Esporulación de R. stolonifer con los tratamientos combinados de quitosano (2 y 10

mg mL-1) y los aceites esenciales a 100 µg mL-1. Letras diferentes indican diferencias estadísticas

significativas. gl =8,4 F= 508.404 P=<0.001. Comparación de medias con prueba de Tuckey. Media

de seis repeticiones.

Se considera que al combinar a los tratamientos se presentó un efecto aditivo,

potencializando el efecto fungicida sobre el desarrollo de las esporas de R. stolonifer y se

deduce que al haber menor número de esporas, la incidencia del hongo puede ser menor

y por lo tanto con menos posibilidades de sobrevivir.

6.4. Germinación

Todos los tratamientos tantos individuales como combinados afectaron la germinación de

las esporas de R. stolonifer. En los tratamientos con quitosano las esporas presentaron un

63

engrosamiento, sobre todo a la concentración de 10 mg mL-1, estas observaciones son

parecidas a los resultados obtenidos por Hernández-Lauzardo et al. (2008) que reportaron

que las esporas de R. stolonifer se deformaron al ser tratadas con quitosano de bajo peso

molecular (visto en microscopio electrónico de transmisión). Se sabe que la deformación

de las esporas no solo depende de la concentración de quitosano empleada sino también

del tipo de hongo, como lo reportaron Hernández-Lauzardo et al. (2007) en donde el

quitosano no deformó las esporas de Mucor spp. pero si las de R. stolonifer a la misma

concentración utilizada (2 y 1.5 mg mL-1), lo cual lo observaron en microscopio óptico a

40X. Otros autores indicaron que el quitosano deforma las esporas a concentraciones

mayores y que los cambios morfológicos son proporcionales a la concentración empleada

de quitosano (El Ghaouth et al., 1992a; Bautista-Baños y Bravo-Luna, 2004). Aunque

nuestros resultados concuerdan con los antes señalados, se observó que en los

tratamientos con quitosano a 2 y 10 mg mL -1 combinados con los AE a 300 µg mL-1 no se

presentaron esporas germinadas; a diferencia de las combinaciones de quitosano con los

AE a la concentración de 100 µg mL-1 en donde se observó engrosamiento de las esporas

de R. stolonifer (figura 11). De manera que los AE a concentraciones altas (300 µg mL-1),

evitan la germinación y deformación de las esporas.

64

Figura 11. Germinación de las esporas de R. stolonifer con los tratamientos individuales a las 9 h

de incubación. Quitosano 2 y 10 mg mL-1 (Q2 y Q10) To= tomillo, Ca= canela, Cl= clavo y Q=

quitosano a 100 y 300 µg mL-1. Microscopio óptico en aumento de 40X

Todos los tratamientos presentaron un patrón diferente en la germinación de las esporas

de R. stolonifer, en la figura 11 se muestra el comportamiento de la germinación para los

tratamientos individuales a las 9 h de incubación.

Con el tratamiento de quitosano a 2 mg mL-1, solo algunas esporas germinaron

presentando un tubo germinal muy pequeño, de manera que el número de esporas

germinadas fue estadísticamente diferente (P ≤ 0.001) con respecto al control. Además la

65

mayoría de las esporas germinadas y no germinadas se deformaron. Esto sugiere que se

atraso la germinación al mismo tiempo que se inhibió. El número de esporas germinadas

con quitosano a 2 mg mL-1 es muy parecido al número de esporas germinadas con los AE a

100 µg mL-1 (cuadro 7), sin embargo, el tamaño del tubo germinal observado fue mayor

con los AE, incluso igual al tamaño del tubo germinal presentado en el control. Por lo que

los AE no retrasaron la germinación, pero si provocaron una disminución en el número de

esporas germinadas. Los porcentajes de germinación en ambos tratamientos son

diferentes con respecto al control ya que en este último fue de 87.5%. Es importante

mencionar que de los AE empleados individualmente destacó el AE de tomillo ya que a

100 µg mL-1 presentó un 22% de esporas germinadas y fue diferente estadísticamente (P ≤

0.001) de los AE de clavo y canela.

Con los AE a 300 µg mL-1 se inhibió completamente la germinación de las esporas,

mientras que con quitosano a 10 mg mL-1 la germinación fue casi nula. Estadísticamente

no fue diferente a la germinación observada en los tratamientos con los AE, pero si con

respecto al control. De manera que los tratamientos a las concentraciones mayores son

los que resultaron ser los mejores para inhibir la germinación de las esporas de R.

stolonifer.

66

Cuadro 7. Porcentaje de germinación de las esporas de R. stolonifer con los

tratamientos individuales y las combinaciones de quitosano a 2 y 10 mg mL-1 con los AE

a 100 µg mL-1

Tratamiento

Individual

Germinación

(%)

Tratamiento

Combinado

Germinación

(%)

Control 87.5 a Control 87.5 a

Q2 22.0 c Q2 22.0 b

Q10 0.83 d Q10 0.83 d

Ca100 26.0 b Q2Ca100 21.8 b

Ca300 0.0 d Q2Cl100 21.3 b

Cl100 34.2 b Q2To100 6.8 c

Cl300 0.0 d Q10Ca100 2.0 d

To100 22.5 c Q10Cl100 0.0 d

To300 0.0 d Q10To100 0.0 d

Dicloran 0.0 d

gl =9,50 F=958.341 P = <0.001

gl =9,50 F=1205.947 P = <0.001

Letras diferentes representan diferencias estadísticas significativas. n= 6

Los resultados obtenidos con respecto al porcentaje de germinación son parecidos con los

reportados por Plotto et al. (2003), que observaron que a 500 µg mL-1 el AE de tomillo

inhibió al 100% la germinación y esporulación de B. cinerea y Alternaria, mientras que a R.

stolonifer solo lo inhibió en un 80%. En este trabajo la dosis máxima empleada fue de 300

µg mL-1 y se inhibió al 100% la germinación, el crecimiento micelial y la esporulación de R.

stolonifer.

Barrera-Necha et al. (2008), reportaron que los aceites esenciales de clavo y canela

disminuyeron considerablemente la germinación de los conidios de C. gloeosporioides

67

destacando sobre los demás aceites evaluados a concentraciones de 250 µg mL-1, también

reportaron que el AE de tomillo no presentó efecto sobre la germinación de C.

gloeosporioides, mientras que en este estudio el AE de tomillo destacó sobre los AE de

clavo y canela, al provocar el menor porcentaje de germinación, esporulación y

crecimiento micelial de R. stolonifer.

De acuerdo con los resultados obtenidos en los tratamientos combinados, se observó que

el quitosano con los aceites esenciales a 100 µg mL-1, redujeron considerablemente el

porcentaje de germinación sobre todo con quitosano a 10 mg mL-1 ya que no hubo

esporas germinadas, todas presentaron deformaciones y un tubo germinal pequeño

(figura 12). Mientras que con quitosano a 2 mg mL-1 más los AE a 100 µg mL-1 la

germinación de las esporas fluctuó entre 6 y 22.5 % de germinación (cuadro 7). Es

importante destacar que estos resultados presentaron el mismo patrón que los resultados

obtenidos con los tratamientos individuales, es decir que las combinaciones a las

concentraciones mayores, mostraron un efecto mayor sobre la germinación de las

esporas, que con las combinaciones a concentraciones menores. Cabe señalar, que todos

los tratamientos son diferentes estadísticamente al control. En este caso también

destacaron las combinaciones con el AE de tomillo.

68

Figura 12. Germinación de las esporas de R. stolonifer con los tratamientos combinados a las 9 h

de incubación. Quitosano a 2 y 10 mg mL-1 con los AE a 100 µg mL-1 (Canela Ca, Clavo Cl y Tomillo

To). Microscopio óptico 40X

Los resultados obtenidos con los tratamientos combinados presentaron un bajo efecto

aditivo ya que el porcentaje de germinación es parecido al de los tratamientos

individuales, principalmente con los AE de canela y clavo así como con las combinaciones

con estos aceites. El único tratamiento combinado en donde se observó un efecto

sinérgico fue con la mezcla de quitosano a 2 mg mL-1 y el AE de tomillo a 100 µg mL-1 con

un porcentaje de germinación de 6.8%, mientras que el AE de tomillo a 100 µg mL-1

69

empleado de manera individual presentó un 22.5% de germinación y el quitosano a 2 mg

mL-1 presentó un 22 %.

En las combinaciones con quitosano a 10 mg mL-1 y los AE a 100 µg mL-1 no hubo

germinación de las esporas, pero la deformación fue bastante visible con respecto al

control (figura 12).

Figura 13. Germinación de las esporas de R. stolonifer con los tratamientos combinados a las 9 h

de incubación. Quitosano a 2 y 10 mg mL-1 con los AE a 300 µg mL-1 (Canela Ca, Clavo Cl y Tomillo

To). Microscopio óptico 40X.

70

Mientras que con los tratamientos combinados de quitosano a 2 y 10 mg mL-1 con los AE a

300 µg mL-1 tampoco se presentó germinación de las esporas, además de que en ninguna

de estas combinaciones se detectó engrosamiento de las esporas, comparado con las

combinaciones con los AE a 100 µgmL-1 (figura 13).

Los resultados antes expuestos indican que efectivamente tanto el quitosano como los AE

de clavo, canela y tomillo, presentan un efecto antifúngico contra R. stolonifer, afectando

de manera importante el desarrollo del hongo en las diferentes fases de crecimiento, así

como se ha observado con otros hongos. Existe un reporte de Rabea et al. (2005), en

donde demuestran que el quitosano genera efectos inhibitorios sobre B. cinerea y

Pyricularia grisea (Cooke) Sacc., sin embargo señalan que a una concentración del 0.1%

reduce el crecimiento de muchos hongos a excepción de los de la clase zygomicetes,

debido a que en su pared celular contienen quitina y quitosano. En este trabajo se

demostró que el quitosano a concentraciones de 2 y 10 mg mL-1, presentó efecto

antifúngico sobre R. stolonifer a pesar de pertenecer esta clase. También comprobamos

que conforme aumentó la concentración del quitosano, el efecto que se presentó sobre el

hongo fue mayor, como se observó con quitosano a 10 mg mL-1, con una tasa de

crecimiento, esporulación y germinación de esporas menor que con quitosano a 2 mg mL-

1.

Otro dato relevante con respecto a la concentración de quitosano, es que se ha

distinguido que el crecimiento de diferentes hongos como F. oxysporum, P. digitatum, C.

gloeosporioides incluso R. stolonifer, pueden ser inhibidos completamente por quitosano

71

a la concentración del 3 % (Bautista-Baños et al., 2003; Bautista-Baños et al., 2006),

mientras que en otro estudio a 0.5 % no presentó un efecto antifúngico contra F.

oxysporum f. sp. vasinfectum Fov y A. solani Sorauer (Guo et al., 2006, 2008). La actividad

antifungica del quitosano está estrechamente relacionada con la naturaleza policatiónica

del quitosano ya que está característica le confiere mayor interacción con la membrana

del hongo que está cargada negativamente, la longitud de la cadena de este polímero que

aumenta la superficie catiónica en contacto con el hongo y el efecto inhibitorio en la

síntesis de enzimas macerantes producidas por hongos, como la poligalacturonasa, liasa y

celulasa; también por la producción de compuestos fenólicos como el ácido clorogénico,

ac. caféico y la formación de barreras estructurales que impiden la penetración de los

hongos en el hospedero (Bautista-Baños et al., 2005).

En estudios realizados por Palma-Guerrero et al., (2009) con Neurospora crassa Shear & B.

O. Dodge, se observó que el quitosano es capaz de permeabilizar la membrana plasmática

de forma importante en conidios de este hongo lo que aumenta la salida de calcio,

además provocan que los conidios se encojan y presenten vacuolas.

Además se observó que dependiendo del tipo de célula (hifa, tubo germinal, conidio etc.),

será la sensibilidad al quitosano, como en el caso de la hifa en donde la salida de calcio

ocurre más lento y en menor grado que en los conidios, después de ser tratadas con

quitosano, alterando significativamente la homeóstasis y produciendo la lisis de las células

fúngicas.

72

Estos datos son relevantes, ya que pueden explicar los efectos observados sobre la

germinación y el crecimiento micelial de R. stolonifer con los tratamientos de quitosano

que fueron empleados en este trabajo, ya que se observó que se redujo el crecimiento

micelial, y en diferente medida se disminuyó el número de esporas así como el patrón de

germinación.

Con respecto a los AE aplicados individualmente, observamos que los mejores resultados

se presentaron con los AE a 300 µg mL-1 con un efecto antifúngico importante contra R.

stolonifer, primordialmente sobre el crecimiento micelial y la esporulación de las esporas,

mientras que a concentraciones más bajas el aceite que mejor efecto antifúngico presentó

contra R. stolonifer fue el AE de tomillo.

La mayoría de los autores que trabajan con AE destacan a los aceites de clavo, canela y

tomillo (Velluti, 2003; Tzortzakis, 2007), sobre todo a este último, sin embargo también

existen algunos reportes en los que el AE de tomillo no presenta ningún efecto sobre

algunos hongos (Barrera-Necha et al., 2008).

Aunque existen muy pocos reportes del uso de los AE de clavo, canela y tomillo contra R.

stolonifer, los que existen concuerdan que los tres AE presentan efectos antifúngicos

importantes. Una de las ventajas que presenta el uso de los AE, es que a bajas

concentraciones presentan inhibición en el desarrollo de diferentes hongos, como lo

reportan Ranasinghe et al. (2002), que los AE de clavo y canela evaluados in vitro fueron

efectivos a bajas concentraciones 0.03 % - 0.11 % contra los fitopatógenos L. theobromae,

73

C. musae, F. proliferatum que afectan al plátano. No obstante la relativa actividad de los

aceites esenciales pueden no correlacionar con un solo componente pero si con la mezcla

de componentes presentes en estos aceites.

Es importante señalar que el efecto que se ha observado sobre los hongos fitopatógenos

inclusive con R. stolonifer depende de muchos factores, que incluyen la naturaleza de los

componentes de los AE en este caso para los aceites de clavo, canela y tomillo abundan

compuestos fenólicos, como es el timol y carvacrol (tomillo), eugenol (clavo y canela),

entre otros compuestos que se sabe presentan una actividad antifúngica importante

(Guynot et al., 2003; Jayaprakasha et al., 2006).

A pesar de que no existen reportes de las combinaciones de quitosano con los AE, los

resultados obtenidos fueron los esperados, en base a lo que se observó con los

tratamientos individuales. Aunque el efecto antifúngico de la mayoría de los tratamientos

fue aditivo, es decir la sumatoria de los efectos presentados de manera individual. Este

efecto se visualizó mejor con las combinaciones de quitosano a 2 y 10 mg mL-1 más los AE

a 100 µg mL-1. Mientras que las combinaciones de quitosano con los AE a 300 µg mL-1

presentaron el mejor efecto antifúngico.

Por lo tanto los tratamientos individuales o combinados con el mejor efecto antifúngico se

utilizaron para la evaluación in situ (ver inciso 5.3.2). Con la hipótesis de que; al haber

presentado un efecto antifúngico estadísticamente diferente al control en la fase in vitro,

estos tratamientos podrían inhibir la pudrición blanda en jitomate (in situ).

74

6.5. Evaluación del quitosano y de los aceites esenciales in situ.

6.5.1. Escala de daño

De acuerdo con los resultados, se observó que en las primeras horas de incubación, el

hongo creció lentamente y que el primer síntoma de infección (ablandamiento del tejido

alrededor de la lesión) ocurrió después de las 26 h de la inoculación. Después de las 48 h

el hongo presentó un crecimiento acelerado, afectando más de la tercera parte del fruto

infectado. Entre las 72 a 96 h de incubación se observó la fase estacionaria del crecimiento

del hongo.

Con estos datos se estableció la escala de daño tomando en cuenta que los porcentajes

presentados en cada nivel se representan como daño visual y que el fruto completo

representa el 100% de daño observado. En la figura 14, se muestra el seguimiento de la

enfermedad y el porcentaje de daño considerado para cada tamaño de lesión durante el

periodo de incubación. Esta escala fue utilizada para determinar el índice de severidad

presentado en cada tratamiento de este trabajo.

El establecimiento de la escala de daño fue parte importante para determinar de manera

precisa el daño presentado en los frutos de jitomate. Sobre todo porque fue una escala

específica para este modelo de estudio, lo que permitió que los errores que pudieran

haberse presentado se minimizaran.

75

Figura 14. Escala de daño propuesta para determinar el índice de severidad. Consta de 6 niveles

de acuerdo al progreso de la enfermedad durante 72 h de incubación.

6.5.2. Evaluaciones en jitomate

En la mayoría de los estudios realizados con frutos de jitomate, se han empleado

jitomates de ¾ de sazón como es el caso de Hernández-Lauzardo et al., 2007, en donde

no se presentó ningún inconveniente al realizar el experimento. En otros estudios,

reportan que los jitomates de ¾ de sazón se infectan más rápidamente con R. stolonifer y

en mayor porcentaje que los frutos maduros, al evaluar extractos acuosos de guamúchil

(Bautista-Baños et al., 2002), estos son datos que no concuerdan con los presentados en

este trabajo, aunque no se sabe con certeza a que se debió este efecto, pero se entiende

76

que los frutos maduros se encuentran en condiciones óptimas para que se desarrolle el

hongo, debido a que presenta menos barreras físicas, así como mayor cantidad de

azúcares disponibles para el hongo. Además de que en el mercado la pudrición blanda

predomina en frutos maduros.

Figura 15. Frutos de jitomate en dos estados de madurez infectados por R. stolonifer a las 96 h

de incubación. 15A) Frutos maduros con 90% de infección. 15B) Frutos ¾ de sazón con 20% de

infección.

Al inicio del experimento se usaron frutos de jitomate en dos estados de madurez; ¾ de

sazón y maduros. Pero solo los jitomates en estado maduro respondieron a la infección

mientras que los frutos de ¾ de sazón no permitieron la reproducibilidad de la

enfermedad ocasionando resultados poco confiables (Figura 15).

Se observó que la mayoría de los frutos con ¾ de sazón no presentaron la enfermedad, a

pesar de haber transcurrido las 96 horas de incubación, mientras que con los frutos

maduros el 80% de ellos se infectaron y resultaron considerablemente dañados.

77

6.5.3. Porcentaje de infección e Índice de severidad

De acuerdo con la figura 16 A que representa al control positivo, se observó que en las

primeras 24 h el fruto no presentó daño, sino 26 h después de la inoculación, pero a partir

de las 48 h de incubación cuando la enfermedad progresó rápidamente, y a las 72 h el

daño fue más aparente observándose una lesión más severa en el fruto, de manera que al

final del experimento (96 h) la lesión abarcó la mayoría del fruto dejándolo casi

totalmente macerado, además de que el hongo ya se encontraba en la fase de

esporulación. Mientras que en la figura 16 B se muestra el testigo negativo en donde no se

observó daño alguno, y el fruto presentaba una apariencia saludable.

Los frutos del control positivo inoculados artificialmente, presentaron un 80% de infección

con un índice de severidad igual a 3.8. Este valor correspondió al máximo daño producido

por R. stolonifer 96 h después de haber sido inoculado.

El desarrollo de la enfermedad en todos los tratamientos tuvo la misma tendencia, al

principio lento y al final el desarrollo fue más rápido. A pesar de eso en algunos

tratamientos el número de frutos infectados fue bajo. Como es el caso del quitosano a 10

mg mL-1 en donde se presentó el menor porcentaje de infección (23 %). Mientras que el

mayor porcentaje de infección se presentó con canela a 300 µg mL-1 con un 56.7 % de

infección. Lo que indica que casi todos los tratamientos estuvieron por debajo del 50 % de

infección.

78

Figura 16. Desarrollo de la pudrición blanda durante la incubación. A) Control positivo, B) Control

negativo. 1=0 h, 2=24 h. 3=48 h, 4=72 h y 5= 96 h, después de la inoculación.

Esto da lugar a decir que la mayoría de los tratamientos redujeron considerablemente la

pudrición blanda causada por R. stolonifer, sin embargo, el único tratamiento que

presentó diferencias estadísticas con respecto al control positivo fue quitosano a 10 mg

mL-1. Quitosano a 10 mg mL-1 redujo la pudrición, presentando el mejor efecto antifúngico

con respecto al control positivo y a los demás tratamientos, incluyendo las combinaciones

de quitosano con los AE (cuadro 5).

También se observó que en casi todos los tratamientos el índice de severidad fue muy

bajo comparado con el testigo sin tratamiento ya que todos los tratamientos presentaron

un índice de severidad entre 0.67 a 1.8

2

5

3 4

A B

2

3 4

1

5

1

79

Cuadro 8. Porcentaje de infección e índice de severidad en jitomates inoculados con R.

stolonifer después de la aplicación de quitosano combinado con los aceites esenciales

de clavo, canela y tomillo a 300 µg mL-1 y dicloran.

Tratamientos Porcentaje de infección Índice de severidad

Control + 80±5.77 c 3.47±0.35c

Control - 0±0 a 0±0a

Dicloran 46.66±8.82 ab 1.33±0.29 ab

Q10 23.33±8.82 ab 0.67±0.23 ab

Ca 300 43.33±12.02 abc 1.11±0.26 ab

Cl 300 56.67±3.33 bc 1.80±0.33 bc

To 300 53.33±16.70 bc 1.80±0.33 bc

Q10 Ca300 46.67±3.33 abc 1.33±0.29 ab

Q10 Cl300 36.67±3.33 abc 1.03±0.28 ab

Q10 To300 50.00±8.82 bc 1.37±0.28 ab

gl= 20,9 P>0.050 H=66.82 P>0.001

Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas

Además con lo que respecta al índice de severidad, la mayoría presentaron diferencias

estadísticas con respecto al control, el quitosano destaca ya que fue el tratamiento con

menor índice de severidad 0.67% (Cuadro 8). Mientras que los AE de clavo y canela no

presentaron diferencias estadísticas con respecto al control.

En las figuras 17 y 18 se ilustra el daño causado por R. stolonifer en los frutos de jitomate

con cada tratamiento, al final del experimento. Como ya se había mencionado en la fase in

vitro, se esperaba un efecto aditivo o sinérgico al mezclar el quitosano y los AE, lo cual no

80

sucedió, ya que el único tratamiento que presentó un efecto importante fue quitosano a

10 mg mL-1, inclusive fue mejor que el tratamiento con dicloran, lo que indica que es más

conveniente el uso del quitosano de forma individual.

Los AE no presentaron el efecto esperado, esto pudo deberse a su naturaleza debido a

que poseen una gama amplia de compuestos volátiles (Guynot et al., 2003), lo que

probablemente con el paso del tiempo permitió que disminuyeran sobre la superficie del

fruto, sobre todo para clavo y tomillo ya que el aceite de canela presentó mejor efecto

que los otros dos AE; se considera esto porque los frutos tratados permanecieron a

temperatura ambiente y se colocaron en recipientes que fácilmente permitieron la

entrada y salida de aire. Lo que pudo aumentar la volatilización de los compuestos con

efecto antifúngico de los aceites. Esta pudo ser una de las razones por las cuales no se vio

el efecto esperado.

81

Figura 17. Daño ocasionado a las 96 h de incubación por la infección de R. stolonifer con los

aceites esenciales a 300µg mL -1 y los controles. A) Control positivo, B) Control negativo, C) Clavo,

D) Canela y E) Tomillo.

E

D C

B A

82

Figura 18. Daño ocasionado a las 96 h de incubación por la infección de R. stolonifer con las

diferentes combinaciones de quitosano (Q10) con los aceites esenciales (Ca, Cl, y To) a 300 µg

mL-1 y dicloran (D). A) Control positivo, F) Q10Cl3, G) Q10Ca3, H) Q10To3, I) Q10 y J) D.

J

I

H

G

F A F

A

J

83

Además hay que tener en cuenta de que existen diferentes factores que intervienen sobre

el efecto de los AE. Uno de ellos es el pH, ya que de acuerdo a Juven et al., (1994) se sabe

que la actividad antimicrobiana del AE de tomillo se ve favorecida a pH bajo, facilitando su

paso por la membrana de las bacterias, de manera que es posible que el pH del ambiente

en el que actúa el AE, (que en este caso sería el fruto o la solución de quitosano) pueda

modificar su mecanismo de acción en los diferentes microorganismos.

Otros datos que concuerdan con lo anterior, son referidos por Burt (2004) y Gutiérrez et

al. (2009), que dan a conocer que el mejor efecto antimicrobiano de los AE se presenta a

temperaturas bajas, a un pH aproximado de cinco y a bajas condiciones de oxígeno, así

como la presencia de los azúcares simples presentes en el medio.

Estos estudios sugieren que los tratamientos empleados en esta investigación pudieron

verse afectados, primero porque la temperatura utilizada en los ensayos in vivo fue a

temperatura ambiente (25 ± 3° C), además el pH en el caso de las combinaciones con

quitosano fue mayor de cinco. Con respecto al contenido de oxígeno, que no fue medido

en esta investigación, pero que se considera no es el que se recomienda, ya que los frutos

estuvieron en recipientes que permitieron el contacto directo con el ambiente. Por lo que

se sugiere que en estudios posteriores se tomen en cuenta estas condiciones.

Es importante recalcar que las condiciones in situ empleadas son completamente

diferentes a las de la fase in vitro, pues las condiciones fueron más controladas con

respecto a la humedad, el contenido de nutrientes, la atmosfera y la temperatura;

84

mientras que in situ las condiciones cambiaron, primordialmente por el modelo utilizado

(jitomate) y la diferencia del ambiente.

Además en otros estudios se ha observado que los medios de cultivo tienen un mayor

contenido de agua, lo que favorece el efecto de los aceites, mientras que en los frutos el

contenido de agua puede ser menor, lo que obstaculiza el efecto de los AE (Smith-Palmer

et al., 2001).

Existen reportes en los que los AE por si solos son capaces de contrarrestar enfermedades

postcosecha, como es el caso de la aplicación de los AE de clavo y canela que fueron

efectivos contra C. musae, Lasiodiplioidia theobrome Pat y F. proliferatum (T.

Matsushima) Nirenberg en frutos de plátano (Ranasinghe et al., 2002, 2005). A diferencia

de los resultados de este trabajo en donde los AE de clavo y tomillo no presentaron

diferencias estadísticas con respecto al control. En otro estudio con el AE de clavo, se

observó un efecto antifúngico significativo, pero este efecto no fue mayor al del fungicida

químico sintético utilizado.

De acuerdo a estos resultados con respecto al dicloran, se observó que difieren de los

resultados previamente encontrados por Bautista-Baños y Bravo-Luna (2004), que

reportaron que el dicloran redujo de manera efectiva la pudrición blanda en frutos de

jitomate en comparación con el quitosano a 2.0%. No obstante, existe concordancia con

lo reportado por Badawy y Rabea (2009) en donde demostraron que el quitosano aplicado

85

en concentraciones de 2 a 4 mg mL-1 pudo controlar de manera efectiva infecciones

fúngicas en frutos de jitomate dañados e inoculados con B. cinerea.

Existen algunos reportes en donde el quitosano fue combinado con otros compuestos

como los extractos. Sus resultados concuerdan con los nuestros ya que la combinación de

quitosano con extractos acuosos de papaya no presentó un efecto sinérgico como se

esperaba, ya que el mejor efecto se presentó al utilizar quitosano de manera individual

(Bautista-Baños et al., 2003).

Cuando el quitosano se combinó con calcio se encontró un efecto positivo sobre las

fresas, ya que aumento la calidad en sabor y tamaño (Hernández-Muñoz et al., 2006). De

la misma manera Romanazzi et al. (2007) encontró que al combinar al quitosano con

etanol a dosis reducidas, se presentó un efecto aditivo, o hasta sinérgico contra el moho

gris de las uvas de mesa y que los resultados obtenidos fueron mejores que cuando se

aplicaron de manera individual.

Las combinaciones empleadas en este trabajo no resultaron como se esperaba, lo cual no

significa que el quitosano no se pueda combinar con otros compuestos para tener un

mejor control de la pudrición blanda. Sin embargo, en este estudio se encontró que el

quitosano usado de manera individual a concentraciones de 10 mg mL-1 puede combatir

de manera eficiente la pudrición blanda.

Y aunque no se conoce cuál es el efecto del quitosano sobre los frutos, se infiere que el

quitosano disminuye la producción de enzimas pectinolíticas o el incremento de

E

D

A

86

hidrolasas fúngicas (Zhuang y Quantick, 1998), por lo que se favorece el efecto antifúngico

del quitosano.

Estudios previos demuestran que la aplicación del quitosano como control de

enfermedades pre y post cosecha ha mejorado la calidad de frutas y vegetales, lo que da

lugar a una alternativa viable que no causa toxicidad en mamíferos, el medio ambiente y

además es un medio seguro para el control (Badawy y Rabea, 2009; Dutta et al., 2008).

6.5.4. Pérdida de peso

En el control positivo que es el que se inoculó con esporas de R. stolonifer se observó la

mayor pérdida de peso y un grado de infección importante, lo contrario a lo que sucede

en el control negativo en donde por no haber sido infectado, se esperaría que la pérdida

de peso fuera menor en todos los tratamientos; sin embargo, la menor pérdida de peso

se presentó con quitosano a 10 mg mL-1.

Aunque la pérdida de peso de los frutos no se encuentra separada del desarrollo de la

enfermedad, aquí se hace énfasis al respecto ya que como se observa en la figura 19 el

único tratamiento que presentó diferencias con respecto al control, fue quitosano a 10 mg

mL-1. Queda claro que además de ser diferente con respecto al control positivo se observó

que presenta menor pérdida de peso que los frutos sin tratamiento y sin enfermedad

(control negativo). Estos datos confirman que el quitosano es capaz de mantener los

frutos reduciendo las alteraciones fisiológicas por la madurez del fruto, es decir que puede

retardar la senescencia del fruto, como confirman Bautista-Baños et al. (2005), quienes

87

reportan que el quitosano es capaz de formar películas semipermeables cuando se aplican

sobre frutas y verduras permitiendo que estos tengan una mayor vida de

almacenamiento, que la maduración se retrase y se prevenga la pérdida de agua por

efecto de transpiración y por lo tanto retarda la senescencia.

Figura 19. Pérdida de peso de los frutos de jitomate inoculados con R. stolonifer, después de

aplicar quitosano a 10mg mL-1 y las combinaciones de quitosano con aceites esenciales de clavo,

canela y tomillo a 300 µg mL-1. N= 10. Las letras diferentes significan diferencias estadísticas

significativas.

Como ya se menciono anteriormente las combinaciones no presentaron efecto aditivo o

sinérgico en la aplicación sobre los frutos, ya que solo se observó que disminuyeron el

daño presentado por los frutos pero no el número de frutos infectados y mucho menos

presentaron un efecto significativo en la pérdida de peso del fruto.

c

bc

a

bc bc bc bc

bc

bc b

88

Por lo que se cree que ambos productos, pueden presentar cierta incompatibilidad ya que

en las combinaciones a pesar de tener quitosano, no se observó un efecto parecido al

presentado por quitosano utilizado de manera individual, sino que en las combinaciones

el porcentaje fue mayor y no menor al presentado con los AE y quitosano empleado de

forma individual, aunque esto no concuerda con lo observado en la fase in vitro. Sin

embrago es importante recalcar que el comportamiento presentado in vitro puede ser

distinto cuando se lleva a cabo en los organismos vivos, como lo reportan Juven et al.

(1994), que los compuestos fenólicos de los aceites esenciales (como el caso del timol,

eugenol, carvacrol) reaccionan con los aminoácidos de los medios de cultivo, y esta

reacción reduce la efectividad de estos compuestos fenólicos, como sería el caso del timol

en este trabajo. Si tomamos en cuenta que los aceites esenciales de clavo y tomillo

presentan compuestos fenólicos como eugenol y timol respectivamente, que para estos

AE son los principales componentes y que en el quitosano en disolución se protonan los

grupos aminos (Orozco, 2007), es muy probable que exista una reacción parecida a la

mencionada por Juven et al. (1994) lo que en este trabajo provocó que el efecto de los

aceites esenciales fuera menor en la fase in situ.

Finalmente, se observó que los resultados in vitro no fueron reproducibles en la fase in

situ de este trabajo, ya que se esperaba que los tratamientos combinados resultaran ser

un mejor tratamiento para combatir la pudrición blanda en jitomate, no obstante el mejor

tratamiento fue el empleo de quitosano a 10 mg mL-1 inhibiendo el desarrollo de R.

stolonifer, incluso redujo considerablemente la pérdida de peso de los frutos de jitomate.

89

7. Conclusiones

El quitosano a 10 mg mL-1 y los aceites esenciales de clavo, canela y tomillo a 300 µg mL-1

de manera individual presentaron el mejor efecto antifúngico in vitro, inhibiendo el

crecimiento micelial, la esporulación y la geminación de las esporas de R. stolonifer.

En condiciones in vitro las combinaciones de quitosano y los aceites esenciales de clavo,

canela y tomillo presentaron un efecto aditivo e incluso sinérgico sobre el crecimiento

micelial, la esporulación y la germinación de esporas de R. stolonifer.

En la fase in situ las combinaciones de quitosano y los aceites esenciales no presentaron

un efecto antifúngico en contra de R. stolonifer.

El quitosano a 10 mg mL-1 resultó ser el mejor tratamiento en la fase in situ para inhibir la

pudrición blanda y disminuir la pérdida de peso de los frutos de jitomate.

90

8. Perspectivas

Evaluar el tiempo que dura el efecto del quitosano sobre los frutos de jitomate y

determinar que tan rentable es el uso del quitosano para combatir la pudrición

blanda.

Investigar los mecanismos de acción del quitosano sobre R. stolonifer in situ.

Determinar si los frutos de jitomate sufren alteraciones organolépticas al aplicarles

quitosano a concentraciones de 10 mg mL-1.

91

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