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Evaluación de un Proceso Cromatográfico para la Obtenciónde Extractos Fenólicos de Tomillo (Thymus vulgaris)

Libres de Sustratos de Polifenoloxidasa-Edición Única

Title Evaluación de un Proceso Cromatográfico para la Obtenciónde Extractos Fenólicos de Tomillo (Thymus vulgaris) Libres deSustratos de Polifenoloxidasa-Edición Única

Issue Date 2003-12-01

Publisher Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey

Item Type Tesis de maestría

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http://hdl.handle.net/11285/567571

INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOSSUPERIORES DE MONTERREY

CAMPUS MONTERREY

DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURAPROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA

“EVALUACIÓN DE UN PROCESO CROMATOGRÁFICO PARA LAOBTENCIÓN DE EXTRACTOS FENÓLICOS DE TOMILLO (Thymus

vulgaris) LIBRES DE SUSTRATOS DE POLIFENOLOXIDASA”

TESIS

PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENEREL GRADO ACADÉMICO DE:

MAESTRO EN CIENCIASCON ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGÍA

POR:

OSCAR ALEJANDRO AGUILAR JIMÉNEZ

MONTERREY, N.L. DICIEMBRE DE 2003

INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOSSUPERIORES DE MONTERREY

CAMPUS MONTERREY

DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURAPROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA

“EVALUACIÓN DE UN PROCESO CROMATOGRÁFICO PARA LAOBTENCIÓN DE EXTRACTOS FENÓLICOS DE TOMILLO (Thymus

vulgaris) LIBRES DE SUSTRATOS DE POLIFENOLOXIDASA”

TESIS

PRESENTADA COMO REQUISITO PARCIAL PARAOBTENER EL GRADO ACADÉMICO DE:

MAESTRO EN CIENCIASCON ESPECIALIDAD EN BIOTECNOLOGÍA

POR:

OSCAR ALEJANDRO AGUILAR JIMÉNEZ

MONTERREY, N.L. DICIEMBRE DE 2003

INSTITUTO TECNOLÓGICO Y DE ESTUDIOS SUPERIORES DEMONTERREY

CAMPUS MONTERREY

DIVISIÓN DE INGENIERÍA Y ARQUITECTURA

PROGRAMA DE GRADUADOS EN INGENIERÍA

Los miembros del comité de tesis recomendamos que el presente proyecto de tesispresentado por el Lic. Oscar Alejandro Aguilar Jiménez sea aceptado como requisitoparcial para obtener el grado académico de Maestro en Ciencias con especialidad en:

BIOTECNOLOGÍA

Comité de Tesis:

Carmen Hernández Brenes, Ph.DAsesor

Marco Antonio Rito Palomares, Ph.DSinodal

Mario Moisés Álvarez, Ph.DSinodal

Federico Viramontes Brown, Ph. D.Director del Programa de Graduados en Ingeniería

Diciembre de 2003

Aprobado:

I

RESUMEN

Las antocianinas han despertado interés debido a sus propiedades nutracéuticas

además de la amplia variedad de colores que despliegan en soluciones acuosas en función del

pH, en aplicaciones en alimentos, para el reemplazo de colorantes de origen sintético. Sin

embargo, una de las limitaciones para el uso de las antocianinas es su baja estabilidad, debido

a su estructura química, factores ambientales y a la presencia de otros fitoquímicos en

solución. El establecimiento de estrategias para la estabilización de estos pigmentos en

soluciones acuosas ha conducido al uso de sustancias llamadas copigmentos, los cuales

tienen la capacidad de incrementar el poder de tinción de estas moléculas de color, por

modificación de sus propiedades espectrales. El empleo de copigmentos como estabilizadores

de antocianinas tiene la desventaja de que la polifenoloxidasa es capaz de usar algunas

moléculas de copigmento como sustratos, conduciendo a la degradación de los mismos y de

las antocianinas, con la consecuente pérdida de las propiedades nutracéuticas del alimento. En

el presente trabajo se planteó como objetivo, obtener un extracto de tomillo (Thymus vulgaris)

libre de sustratos de polifenoloxidasa y con capacidad de copigmentación similar a la de los

copigmentos obtenidos a través del proceso comercial original para ser empleado en ensayos

copigmentación de jugo de fresa (Fragaria anannassa).

Se probaron dos resinas, una aniónicas una fuerte y una débil para modificar el

proceso comercial de obtención de extractos de tomillo, lo que condujo a la obtención de un

nuevo extracto con una reducida capacidad de ser usado como sustrato de polifenoloxidasa,

(extracto fuerte) en comparación con el extracto original en ensayos modelo. En el segundo

estudio, se concluyó que el extracto tratado con la resina fuerte, poseía una capacidad de

copigmentación mayor que el extracto tratado con la resina aniónica débil, incluso mayor que el

extracto original.

El efecto de las resinas aniónicas sobre el extracto de tomillo se evaluó en el tercer

estudio, donde se determinó la composición química de los extractos por cromatografía de

líquidos de alta resolución con detector de fotodiodos. Se determinó que el efecto de ambas

resinas aniónicas fue en la remoción de compuestos que participan del contenido de fenólicos

totales de los extractos, sin embargo en el caso de la resina aniónica fuerte se logra disminuir

selectivamente la concentración de compuestos específicos susceptibles a la oxidación por

acción de la polifenoloxidasa del sistema, mejorando a su vez las propiedades de dicho

extracto para ser usado como copigmento en jugos de fresa.

II

DEDICATORIA

A mis padres, a quien les debo todo lo que soy y lo que seré…….. son un

verdadero ejemplo de dedicación y esfuerzo constante, siempre viendo por el

bienestar de sus hijos.

Con todo mi cariño. Muchas Gracias

Mis evidencias convencen al ignorante, y las evidencias delsabio me convencen a mí. Pero aquel cuyo razonamiento se

halla a la mitad del camino entre la sabiduría y la ignorancia, nipuedo convencerle yo a él, ni puede convencerme él a mí.

Khalil Gibran– Máximas Espirituales –

III

AGRADECIMIENTOS

A mi asesora, la Dra. Carmen Hernández, por dedicarme su tiempo en una etapa muy

especial de su vida. Felicidades.

A mis sinodales, sin duda un apoyo para la elaboración de este documento, y los

maestros, que de una u otra forma dejan su huella en mi formación durante este año y medio.

A mis amigos y compañeros de viaje……. Helena, Balta, Nidya, Ana, Oscar, Jorge y

Benito…….. mucha suerte.

A Isabel, Mayra, Gaby, Armando…… y a todo el mundo ya!! Mil gracias

IV

LISTA DE CONTENIDO

RESUMEN ....................................………………….............………………..…...........….…....…

DEDICATORIA .........................................................…………....…………………............…......

AGRADECIMIENTOS...……....…………………………….....................................…............…..

TABLA DE CONTENIDO .....……....…................................................................…...…...........

LISTA DE TABLAS…...….........................……………………………………………...….............

LISTA DE FIGURAS ……..……….....…………………….................……………......…..............

LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................................

CAPITULO 1 – REVISIÓN DE LITERATURA............................................................................

1.1 ANTOCIANINAS..................................................................................................................

1.1.1 Estructura Química.....................................................................................................

1.1.2 Importancia y Ocurrencia en la Naturaleza................................................................

1.1.3 Análisis de Antocianinas por Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución............

1.1.4 Factores que Afectan su Estabilidad..........................................................................

1.1.4.1 pH.....................................................................................................................

1.1.4.2 Temperatura ....................................................................................................

1.1.4.3 Oxígeno y Ácido Ascórbico ..............................................................................

1.1.4.4 Enzimas ............................................................................................................

1.1.4.5 Iones Metálicos..................................................................................................

1.1.4.6 Copigmentos......................................................................................................

1.2 FLAVONOIDES Y ÁCIDOS FENÓLICOS............................................................................

1.2.1 Clasificación y Estructura Química.............................................................................

1.2.2 Ocurrencia de Flavonoides y Ácidos Fenólicos en Tomillo.........................................

1.2.3 Características Espectrales........................................................................................

1.2.4 Fraccionamiento de Extractos Fenólicos....................................................................

1.2.5 Función como sustratos de polifenoloxidasa..............................................................

1.3 COPIGMENTACIÓN............................................................................................................

1.3.1 Tipos de copigmentación............................................................................................

1.3.1.1 Autoasociación..............................................................................................

1.3.1.2 Copigmentación Intramolecular.....................................................................

1.3.1.3 Copigmentación Intermolecular.....................................................................

1.3.1.4 Copigmentación con iones metálicos............................................................

I

II

III

IV

VII

VIII

IX

1

1

1

4

5

8

8

9

9

11

12

13

14

14

18

19

20

20

21

21

21

22

23

24

V

1.3.2 Uso de extractos fenólicos como estabilizadores de antocianinas.............................

CAPITULO 2. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS DE TOMILLO LIBRES DE SUSTRATOS DE

POLIFENOLOXIDASA Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA.......................................................

2.1 INTRODUCCIÓN.................................................................................................................

2.2 MATERIALES Y MÉTODOS...............................................................................................

2.2.1 Materiales..................................................................................................................

2.2.2 Estudio 1. Obtención del extracto acuoso de tomillo y modificación al proceso

comercial...................................................................................................................

2.2.2.1 Obtención del extracto acuoso de Tomillo....................................................

2.2.2.2 Modificación del proceso de extracción comercial........................................

2.2.2.3 Caracterización espectrofotométrica de extractos fenólicos.........................

2.2.2.3a Determinación de Fenólicos totales por el método de Folin-

Ciocalteau......................................................................................

2.2.2.3b Determinación del perfil de compuestos fenólicos por el método de

Glories............................................................................................

2.2.2.4 Evaluación de los extractos modificados como sustratos de PPO................

2.2.3 Estudio 2. Evaluación de la capacidad de copigmentación de los extractos

fenólicos de tomillo en jugo de fresa.....................................................................

2.2.3.1 Obtención del jugo de fresa...........................................................................

2.2.3.1a Clarificación enzimática...................................................................

2.2.3.1b Determinación de antocianinas monoméricas totales por el método

de pH diferencial............................................................................

2.2.3.1c Determinación de antocianinas por HPLC-PDA..............................

2.2.3.2 Sistemas de Copigmentación........................................................................

2.2.3.3 Caracterización de la copigmentación...........................................................

2.2.3.3a Propiedades espectrales.................................................................

2.2.3.3b Método de pH diferencial.................................................................

2.2.3.3c Color instrumental............................................................................

2.2.3.3d Índice de degradación, color polimérico y porcentaje de color

polimérico......................................................................................

2.2.3.4 Copigmentación con sales metálicas............................................................

2.2.4 Estudio 3. Caracterización química detallada de los extractos de tomillo por

cromatografía de líquidos de alta resolución con detector de arreglo de diodos.

2.2.4.1 Método de separación cromatográfica por HPLC..........................................

2.2.4.2 Identificación y cuantificación de compuestos fenólicos individuales............

2.2.4.3 Procedimiento de interpretación espectros UV-Visible..................................

24

26

26

28

28

28

28

29

30

30

30

30

31

31

31

32

32

32

33

33

33

33

33

34

34

35

35

VI

2.2.5 Análisis Estadístico.................................................................................................

2.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN............................................................................................

2.4 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES......................................................................

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................................

ANEXOS....................................................................................................................................

VITA...........................................................................................................................................

36

37

63

65

70

79

VII

LISTA DE TABLAS

Tabla 1.1 Estructura de las antocianidinas................................................................................

Tabla 1.2. Características estructurales y espectrales de las antocianidinas en función de su

patrón de hidroxilación................................................................................................................

Tabla 1.3 Principales clases de flavonoides conocidos..............................................................

Tabla 1.4 Compuestos fenólicos en Thymus vulgaris................................................................

Tabla 1.5 Espectro de absorción de varias clases de compuestos polifenólicos......................

Tabla 2.1 Programa de elución por gradiente para separación cromatográfica de flavonoides.

Tabla 2.2 Perfil de compuestos fenólicos del extracto acuoso de tomillo (Thymus vulgaris) de

acuerdo con el método de Glories..............................................................................................

Tabla 2.3 Contenido de fenólicos totales en extractos de tomillo crudo y modificado por

cromatografía aniónica...............................................................................................................

Tabla 2.4 Velocidades de formación de producto por la acción enzimática de polifenoloxidasa

sobre extractos de tomillo y catequina.......................................................................................

Tabla 2.5 Efecto de la adición de extractos fenólicos de tomillo sobre las propiedades

espectrales del jugo de fresa (Fragaria ananassa)....................................................................

Tabla 2.6 Coordenadas de color instrumental en escala CIEL*C*h* (D65/10º

iluminador/observador) para jugo de fresa (Fragaria ananassa) adicionado con tres tipos de

extracto de tomillo......................................................................................................................

Tabla 2.7 Efecto de la adición de los extractos fenólicos de tomillo (Thymus vulgaris) sobre las

determinaciones de antocianinas, densidad de color, color polimérico y porcentaje de color

polimérico del jugo de fresa (Fragaria anannassa)....................................................................

Tabla 2.8 Coordenadas de color instrumental en escala CIEL*C*h* (D65/10º

iluminador/observador) para jugo de fresa (Fragaria ananassa) adicionado con iones aluminio.

Tabla 2.9 Efecto de la adición de iones aluminio sobre las propiedades espectrales del jugo de

fresa (Fragaria ananassa)..........................................................................................................

Tabla 2.10 Identificación de picos cromatográficos en extracto de tomillo crudo por HPLC-PDA

Tabla 2.11a Análisis comparativo de la composición fenólica de extractos de tomillo por HPLC-

PDA............................................................................................................................................

2

6

15

18

20

35

38

39

41

45

y

47

6

50

50

t

51

51

55

58

VIII

Tabla 2.11b Análisis comparativo de la composición fenólica de extractos de tomillo por HPLC-

PDA. (continuación)...................................................................................................................

Tabla 2.12 Concentraciones molares necesarias de copigmento y pigmento para los 5 niveles

de copigmentación.....................................................................................................................

Tabla 2.13 Volúmenes de jugo, copigmento y solución reguladora de citratos necesarios para

cada nivel de copigmentación con los tres extractos.................................................................

Tabla 2.14 Volúmenes de jugo, solución de aluminio y solución reguladora de citratos

necesarios para cada nivel de copigmentación.........................................................................

59

72

73

73

IX

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1 Equilibrio de antocianinas.........................................................................................

Figura 1.2 Efecto generalizado del pH en el equilibrio de las antocianinas...............................

Figura 1.3 Estructuras químicas de las principales clases de polifenoles.................................

Figura 1.4 Subclases de flavonoides.........................................................................................

Figura 2.1 Esquema general de modificación de extractos de tomillo por cromatografía

aniónica. Flujo de 4 mL/min.......................................................................................................

Figura 2.2 Actividad enzimática de sistemas modelo formulados con extractos de tomillo con

polifenoloxidasa (300U/mL) y catequina 5mM @420 nm, 30ºC, pH 6.5....................................

Figura 2.3 Cambio en la apariencia del jugo de fresa después de la clarificación....................

Figura 2.4 Cromatograma HPLC-PDA de antocianinas presentes en jugo de fresa (Fragaria

anannassa) a 520 nm.................................................................................................................

Figura 2.5 Cambios visuales causados por la adición de extractos fenólicos de tomillo sobre

jugo de fresa (Fragaria ananassa).............................................................................................

Figura 2.6 Cromatograma HPLC-PDA del extracto de tomillo crudo recolectado a tres

longitudes de onda.....................................................................................................................

Figura 2.7 Comparación entre cromatogramas HPLC-PDA de extracto de tomillo crudo con los

tratamientos con resinas aniónicas a 335 nm............................................................................

Figura 2.8 Efecto batocrómico por la adición de extractos fenólicos de tomillo sobre las

propiedades espectrales del jugo de fresa (Fragaria ananassa)...............................................

Tabla 2.9 Efecto hipercrómico por la adición de extractos fenólicos de tomillo sobre las

propiedades espectrales del jugo de fresa (Fragaria ananassa)...............................................

Figura 2.10 Espacio de color CIELAB.......................................................................................

Figura 2.11 Disco de tonalidades de acuerdo a su valor de ángulo de color (hue)..................

Figura 2.12 Modificación en la concentración de cuatro compuestos por efecto del tratamiento

con resinas aniónicas.................................................................................................................

3

8

16

17

29

41

43

43

46

54

y

57

6

74

t

75

76

77

78

X

LISTA DE ABREVIATURAS

ε Absortividad molar de la antocianina de interés∆%Abs Cambio porcentual en absorbancia de las antocianinas copigmentadas(-) Levógiro(+) Dextrógiroµm Micrómetrosλmax Longitud de onda de máxima absorbanciaλmax A Longitud de onda de máxima absorbancia de las antocianinas sin

copigmentarλmax AC: Longitud de onda de máxima absorbancia de las antocianinas

copigmentadas½O2 Medio mol de oxígeno1H-RMN Resonancia magnética nuclear de ion hidrógeno2R Posición de carbono quiral dextrógiro3S Posición de carbono quiral levógiroA AbsorbanciaAλ�max Absorbancia en la longitud de onda máxima de las antocianinas sin

copigmentarAλ�max Absorbancia a la longitud de onda máximaA440 Absorbancia a 440 nanómetrosA700 Absorbancia a 700 nm a pH 1 y pH 4.5AAλ�max Absorbancia en λmax de las muestras tratadas con aguaAA420nm Absorbancia a 420 nm de las muestras tratadas con aguaAA700 Absorbancia a 700 nm de las muestras tratadas con aguaACλ�max Absorbancia en la longitud de onda máxima de las antocianinas

copigmentadas.Al3+ Ion aluminioAlCl3 Cloruro de aluminioAMT Antocianinas monoméricas totalesANOVA Análisis de VarianzaAp Apigeninidinaarctan ArcotangenteAu AurantinidinaAvis-max Absorbancia a 700 nanómetrosBHT Hidroxitolueno butiladoC CarbonoCλ�max Absorbancia de los copigmentos en la longitud de onda máxima de las

antocianinas copigmentadas.C* Saturación de color ó ChromaC.V. Capital VariableC18 Resina de 18 carbonosCA CaliforniaCAT CatequinaCD3OD Metanol deuteradoCIE Commission Internationale de l’EclairagesCo CompanyCp CapensinidinaCy CianidinaD65 Fuente de iluminación luz de díaDp DelfinidinaE –Cu2+ Enzima-ion cobre(II)E.C. Enzyme Commission

XI

E.U.A. Estados Unidos de AméricaEa Energía de activaciónEAG Equivalentes de ácido gálicoEc. EcuaciónEt al. Y otrosEu EuropinidinaFD Factor de dilucióng GramoGa3+ Ion galioH Hidrógenoh* Ángulo de color ó HueH2O AguaHCl Ácido clorhídricoHPLC Cromatografía de Líquidos de Alta ResoluciónHs HirsutidinaI Fuerza iónicain PulgadaInt InternationalKAl(SO4)2 Alumbrekg KilogramokJ/mol Kilojoules por molL LitroL* LuminosidadLt LuteolinidinaM MolarMA MassachusettsMB Manitobamg MiligramoMg2+ Ion magnesiomeq miliequivalentesMI Mississippimin MinutosmL MililitroMv MalvidinaN NormalNaCl Cloruro de sodioNaOH Hidróxido de sodioNC Carolina del NorteNH4OH Hidróxido de amonioNL Nuevo Leónnm NanómetrosO OxígenoºC Grados centígradosºF Grados FahrenheitOH Grupo hidroxiloOMe Grupo metoxiloPA PennsylvaniaPA308 Resina aniónica fuertePDA Photodiode ArrayPg PelargonidinapH Potencial de hidrógenopKa Función p de la constante de disociación ácidaPl PulchelidinaPM Peso molecular

XII

Pn Peonidinappm Partes por millónPPO PolifenoloxidasaPt PetunidinaPTFE PolitetrafluoroetilenoR1 Sustituyente 1R2 Sustituyente 2RPLC Cromatografía liquida en fase reversarpm Revoluciones por minutoRs RosinidinaRx RadicalS.A. Sociedad AnónimaSAλ�max Absorbancia en λmax de las muestras tratadas con bisulfitoSA420nm Absorbancia a 420 nm de las muestras tratadas con bisulfitoSA700 Absorbancia a 700 nm de las muestras tratadas con bisulfitoseg SegundosSO2 Dióxido de azufreSt SaintTr TricetinidinaU/mL Unidades por mililitroUV UltravioletaWA30 Resina aniónica débil

NUTRACÉUTICOS Y ALIMENTOS FUNCIONALES

1

CAPITULO 1

REVISIÓN DE LITERATURA


1.1 ANTOCIANINAS

El color juega un papel muy importante en nuestra apreciación de la calidad en

alimentos y bebidas; es apreciado desde un punto de vista estético, así como para el

aseguramiento de calidad. A este respecto, el color nos proporciona claves visuales para la

identificación de sabor, influenciando el gusto por el alimento, su aceptabilidad y por último, la

elección por parte del consumidor (Bridle y Timberlake, 1996).

Las antocianinas comprenden el grupo mas grande de pigmentos solubles en agua en

el reino vegetal, y son especialmente características de las plantas angiospermas. Están

ampliamente distribuidas en al menos 27 familias, 73 géneros y multitud de especies (Bridle y

Timberlake, 1996). En el tejido vegetal, las antocianinas son pigmentos naturales, de la familia

de los polifenoles, responsables de los colores rojos, azules y púrpuras que se encuentran en

muchas flores y frutos. Al estar presentes en los hollejos de la uva, le dan color a los vinos

tintos (Escribano-Bailón y Brouillard, 1996).

1.1.1 Estructura Química

La estructura de una antocianina comparte el esqueleto de carbono C6C3C6 de otros

flavonoides naturales y el mismo origen biosintético (Jackman y Smith, 1996). Son glicósidos

con el esqueleto de una antocianidina. Las agliconas son raramente encontradas en productos

vegetales frescos (Clifford, 2000), y difieren de otros flavonoides naturales por su característica

de absorber fuertemente la luz visible. El rango de colores asociados con las antocianinas

resulta de su habilidad de formar estructuras resonantes a partir del núcleo principal C6C3C6 y

varios factores a su alrededor (Jackman y Smith, 1996). En la naturaleza se encuentran en la

forma de glicósidos dieciocho diferentes antocianidinas, siendo estas derivados

polihidroxilados y polimetoxilados de las sales del ion 2-fenilbenzopirilio (ion flavilio) (Tabla 1.1)


2

Tabla 1.1 Estructura de las antocianidinas.1

Grupos funcionales presentesAntocianidina

3 5 6 7 3’ 5’Color

Pelargonidina (Pg) OH OH OH OH H H NaranjaCianidina (Cy) OH OH OH OH OH H Naranja-RojoDelfinidina (Dp) OH OH OH OH OH OH Azul-RojoPeonidina (Pn) OH OH OH OH OMe H Naranja-RojoPetunidina (Pt) OH OH OH OH OMe OH Azul-RojoMalvidina (Mv) OH OH OH OH OMe OMe Azul-RojoApigeninidina (Ap) H OH OH OH H H NaranjaLuteolinidina (Lt) H OH OH OH OH H NaranjaTricetinidina (Tr) H OH OH OH OH OH RojoAurantinidina (Au) OH OH H OH H H Naranja6-hidroxi-Cy (6OHCy) OH OH H OH OH H Rojo6-hidroxi-Dp (6OHDp) OH OH H OH OH OH Azul-RojoRosinidina (Rs) OH OH OH OMe OMe H RojoHirsutidina (Hs) OH OH OH OMe OMe OMe Azul-Rojo5-metil-Cy (5MCy) OH OMe OH OH OH H Naranja RojoPulchelidina (Pl) OH OMe OH OH OH OH Azul-RojoEuropinidina (Eu) OH OMe OH OH OMe OH Azul-RojoCapensinidina (Cp) OH OMe OH OH OMe OMe Azul-Rojo

1(Jackman y Smith, 1996)

Paradójicamente, la mayoría de las antocianinas, se tornan en compuestos incoloros

cuando se extraen de su medio natural y se disuelven en una solución acuosa de acidez

comparable. De hecho, el ion flavilio, que proporciona la principal forma coloreada de las

antocianinas, sufre un ataque nucleofílico en las posiciones 2 y 4 (Ver Tabla 1.1) por parte del

agua y se convierte de forma reversible en un hemiacetal incoloro, de acuerdo a una reacción

química conocida como hidratación del ion flavilio (Escribano-Bailón y Brouillard, 1996).

Las antocianinas se hallan en las vacuolas como un equilibrio de cuatro especies

moleculares (Figura 1.1). La estructura primaria de todas las antocianinas, la cual es pH

dependiente, es el catión flavilio, del cual derivan las estructuras secundarias, ya sea por

transferencia de protones para producir las azuladas bases quinoidales y sus correspondientes

bases quinoidales ionizadas, ó por hidratación para formar pseudobases carbinol incoloras, las

cuales se pueden tautomerizar a pseudobases chalconas incoloras (Bridle y Timberlake, 1996).

R5

R7

R3

R5’

R3’

OH6’

5’4’

3’

2’2

3

4

6

7

8

5

1+ 1’

R6

+


3

Las estructuras terciarias resultan de asociaciones moleculares de estructuras primaria

y secundaria, ya sea consigo mismas (auto-asociación) ó con otras moléculas en solución

(copigmentación intermolecular). La estructura cuaternaria resulta de lo efectos del medio

(disolvente) en el color de cualquiera de las estructuras previamente descritas, esto es de

particular importancia sobretodo en las propiedades de las bebidas alcohólicas (Bridle y

Timberlake, 1996).

Se conocen varios cientos de antocianinas, las cuales difieren principalmente en el

esqueleto básico de la antocianidina (el número y posición de los grupos hidroxilo y metoxilo);

la identidad, número y posición en que se encuentra unido el ó los azúcares al esqueleto

principal; y el grado de acilación del azúcar y la identidad del agente acilante (Clifford, 2000).

Las clases mas comunes de glicósidos son los 3-monósidos, 3-biósidos, y 3-triósidos, así

como 3,5-diglicósidos, y más raramente los 3,7-diglicósidos (Strack y Wray, 1989). El residuo

glicósido encontrado más comúnmente es la glucosa, aunque un gran número de diferentes

monosacáridos (ramnosa, galactosa, xilosa, arabinosa, o fructosa), disacáridos (principalmente

rutinosa, sambubiosa, o soforosa, lathyrosa, gentobiosa o laminariobiosa con menor

frecuencia), o trisacáridos (homo- ó heteroglicanos) pueden encontrarse entre los residuos de

azúcares (Jackman y Smith, 1996).

Los residuos de azúcares adheridos a las antocianinas, se hallan con frecuencia,

acilados con ácidos aromáticos, como el p-cumárico, caféico, ferúlico, sinápico, gálico ó p-

Figura 1.1 Equilibrio de antocianinas. (A) catiónflavilio; (B) base quinoidal; (C) pseudobase carbinol;(D) chalcona (Iversen, 1996).

CA

B D


4

hidroxibenzoico, y/o ácidos alifáticos como malónico, acético, málico, succínico, ú oxálico

(Jackman y Smith, 1996).

1.1. 2 Importancia y Ocurrencia en la Naturaleza

Las antocianinas juegan un papel definitivo como factores de polinización, coloración

de flores y frutos para atraer insectos, aves y animales vectores, por lo cual asisten la

reproducción en plantas. Sin embargo la función de las antocianinas y otros compuestos, como

las betalaínas, en tejidos vegetales no está bien definida. Su acumulación en tejidos dañados y

heridas de la planta que las sintetizan sugiere que funcionan como fitoalexinas, esto significa

que ayudan en la defensa en contra de infecciones virales y microbianas. Cuando se

encuentran asociados a las proteínas, estos pigmentos funcionan como fotorreceptores de luz

verde. Además debido a que su mayor pico de absorción está entre 465-560 nm, cuando se

encuentran en grandes concentraciones, pueden actuar como filtros de luz verde y por lo tanto

contrarrestar la represión del crecimiento en las plantas, que se ha reportado es inducida por la

luz verde. Debido a que estos pigmentos también absorben intensamente la luz UV, se sugiere

que juegan un papel protector contra los efectos adversos de la luz UV (Jackman y Smith,

1996).

Las principales fuentes alimenticias de antocianinas pertenecen a las familias Vitaceae

(uva) y Rosaceae (cereza, ciruela, frambuesa, fresa, zarzamora, manzana y durazno). Otras

familias que contienen plantas comestibles pigmentadas con antocianinas incluyen las

Solanaceae (tamarillo, berenjena), Saxifragaceae (grosella roja y negra), Ericaceae

(arándanos, mora azul) y Cruciferae (col roja). Las antocianinas que se hallan con mayor

frecuencia tienen como núcleo principal, la cianidina, seguida de pelargonidina, peonidina y

delfinidina, luego por petunidina y malvidina. Los 3-glicósidos ocurren aproximadamente dos y

media veces con mas frecuencia que los 3,5-diglicósidos, siendo la mas frecuente la cianidina

3-glucósido (Jackman y Smith, 1996).

La pelargonidina-3-glucósido, la cual es la principal antocianina presente en las fresas

(Fragaria anannassa), es la responsable del atractivo color rojo brillante de esta fruta. En

algunos cultivares de origen español, comúnmente se halla presente en pequeñas cantidades

la cianidina-3-glucósido además de la pelargonidina-3-rutinósido (García-Viguera, et al., 1996).

Bakker (1992) reporta la presencia de antocianinas de fresa de las cuales el 79%

corresponden a pelargonidina 3-glucósido y 5% de cianidina 3-glucósido, además de otros

cinco compuestos coloreados de los cuales cinco fueron identificados como derivados de

pelargonidina, en cantidades de 0.5 a 5 % (Bakker et al., 1992). Numerosos autores han


5

demostrado que la segunda antocianina presente en las fresas es la cianidina 3-glucósido.

Sondheimer y Kertesz (1956) reportaron la presencia dos pigmentos en una proporción de 1:1

en fresas salvajes, y de 20:1 en fresas cultivadas. Las cantidades relativas de estos pigmentos,

tienen diversos efectos en el color. La cianidina 3-glucósido en solución 0.01 % HCl en metanol

absorbe a 527 nm y tiene un color rojo, mientras que la pelargonidina 3-glucósido tiene una

absorción a 510 nm y es naranja-roja, las diferencias en la proporción de estos pigmentos

puede provocar diferencias en mediciones de color instrumental (Wrolstad et al., 1970).

1.1.3 Análisis de Antocianinas por Cromatografía de Líquidos de Alta

Resolución

En años recientes, la Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC), ha

surgido como herramienta extremadamente poderosa para la cuantificación de fenólicos y

antocianinas de diversas fuentes. Cuando se dispone de un detector de arreglo de fotodiodos

(PDA), es posible la identificación de los picos así como el establecimiento de la pureza de los

mismos por medio del análisis del espectro UV-Visible completo de cada pico (Parley, 2001). El

análisis de antocianinas por HPLC se realiza empleando columnas para cromatografía de fase

reversa, donde la fase estacionaria es usualmente un polímero de C18 enlazado a un soporte

de sílice, o recientemente soportes poliméricos que son estables sobre un amplio rango de pH

(Hong y Wrolstad, 1990). El pequeño tamaño de partícula de alrededor de 4-5 µm del

empacado asegura un alto número de platos teóricos, y por lo tanto una buena eficiencia y

resolución. La fase móvil es usualmente un gradiente de soluciones basadas, en agua, un

ácido y un modificador orgánico. El tipo más común de modificadores orgánicos es el metanol

o el acetonitrilo. La acidificación es necesaria para prevenir la ionización de los grupos ácidos

de los compuestos fenólicos, y en el caso de las antocianinas, el pH debe ser bajo para evitar

lo mas posible la interferencia de las antocianinas con estructuras diferentes a la forma del ion

flavilio. Los ácidos más comúnmente empleados son fosfórico, acético, perclórico y fórmico

(Parley, 2001).

La detección de las antocianinas ocurre a los 520 nm, debido a que todas las formas

del ion flavilio tienen un máximo en la vecindad de ese valor, y no hay interferencia de muchos

otros compuestos a esa longitud de onda. En la mayoría de los casos, la única preparación que

se necesita previa a la inyección y al análisis por HPLC, es una etapa de concentración de los

analitos de interés por medio de columnas de micro-extracción en fase sólida, además de la

filtración a través de filtros de 0.45µm. Se pueden obtener importantes propiedades

estructurales a partir del análisis de los datos espectrales de las antocianinas, obtenidos por

HPLC, incluyendo la naturaleza de la aglicona (antocianidina), la posición de enlace de la


6

molécula de azúcar, e información referente a la acilación por ácidos aromáticos. Típicamente

el espectro de las antocianinas, así como de otros flavonoides se obtienen en metanol con un

0.01% de HCl. Debido a que las características espectrales de las antocianinas son

dependientes tanto del pH como de la naturaleza del disolvente, la comparación directa de las

propiedades espectrales con aquellas publicadas en la literatura puede resultar inapropiada

cuando se trabaja con solventes distintos o en otros valores de pH (Hong y Wrolstad, 1990).

Tabla 1.2. Características estructurales y espectrales de las antocianidinas en función de supatrón de hidroxilación.

SustituyentesAglicona

R1 R2

Espectro visibleλmax. (nm)

Pelargonidina H H 494 (naranja)

Cianidina OH H 506 (naranja-rojo)

Delfinidina OH OH 508 (azulado-rojo)

Peonidina OMe H 506 (naranja-rojo)

Petunidina OMe OH 508 (azulado- rojo)

Malvidina OMe OMe 510 (azulado-rojo)

1(Jackman y Smith, 1996)

En soluciones metanólicas las soluciones de pelargonidina-3-glucósido exhiben una

longitud de onda de máxima absorbancia (λmax) alrededor de 505 nm, la cianidina y peonidina-

3-glucósidos tienen una λmax 520-526 nm, y los derivados de la delfinidina muestran una λmax a

532-537 nm. La longitud de onda de máxima absorbancia esta muy relacionada al patrón de

hidroxilación de la antocianidina, como se puede ver en la Tabla 1.2. Se ha reportado en

bibliografía, información contradictoria respecto al efecto que tiene la naturaleza de la

sustitución de azúcar. Según Guisti, et al., (1999), las características espectrales de las

antocianinas se ven modificadas por el efecto que surte el solvente en el que se encuentran y

la naturaleza de la glicosilación. Estos autores han reportado como una característica general

que un incremento en el número de sustituciones es acompañado por un incremento en la

absortividad molar del catión flavilio cuando se compara con sus similares mono y diglicósidos.

Harborne (1998) reporta que la naturaleza de las sustituciones en la estructura de las

antocianinas (glicosilaciones y acilaciones), impactan en los tiempos de retención y en la


7

hidrofobicidad de la molécula. De acuerdo con Hong y Wrolstad (1990), las moléculas análogas

eluirán en un sistema cromatográfico en el siguiente orden (en términos de retención

cromatográfica en HPLC de fase reversa), galactósido, más rápido que glucósido, éste a su

vez mas rápido que arabinósido.

El sistema de solventes empleado para el aislamiento de las antocianinas ejerce su

influencia sobre la estructura cuaternaria de la molécula, y se cree que tienen un gran impacto

en el color de las estructuras primaria, secundaria ó terciaria. (Dangles y Brouillard, 1993). Este

efecto del solvente es dependiente de la estructura química del pigmento. Los pigmentos no

acilados muestran los mayores efectos en sus características espectrales con un drástico

cambio no solo en la dimensión de su absortividad molar, sino también un marcado cambio en

la λmax. Un ejemplo es el metanol, el cual provoca cambios batocrómicos de alrededor de 10

nm en la λmax cuando se compara con el mismo pigmento en solución buffer (Guisti, et al.,

1999).

La presencia de grupos acilo unidos a los residuos azúcares, como los ácidos

cinámicos, provocan desplazamiento en la longitud de onda de máxima absorbancia de los

pigmentos, con un ligero corrimiento hacia el azul (Jackman y Smith, 1996; Dangles et al.,

1993; Harborne, 1967). Los fenoles simples y los ácidos fenólicos tienen una o dos bandas

fuertes entre 230 y 290 nm, mientras que los ácidos hidroxicinámicos muestran un máximo

distintivo a 310 y 332 nm (Strack y Wray, 1989).

Hay dos usos importantes de la espectroscopía en la identificación estructural de las

antocianinas, uno es para la determinación estructural de la posición de los azúcares, y otro es

la investigación de la posible presencia de acilos aromáticos. Para la estimación del primero de

estos factores, se emplea la relación de absorbancia a 440 nm entre la absorbancia de la

muestra a la λmax: %=(A440/Avis-max)*100. Los porcentajes obtenidos son específicos para cada

tipo de sustitución en cada antocianina, permitiendo identificar entre una sustitución en la

posición 3 y una disustitución 3,5 para una misma antocianidina. La presencia de una acilación

en las antocianinas se puede reconocer por la presencia de la banda de absorción

característica de los ácidos hidroxicinámicos entre 310 y 330 nm. Mediante la razón de

absorbancias entre esta banda de absorción y la banda máxima, se obtiene información de la

razón molar de antocianina:ácido hidroxicinámico, con valores de 50-60 % y 90-100 % para

razones 1:1 y 1:2 respectivamente (Strack y Wray, 1989).


8

1.1.4 Factores que Afectan su Estabilidad

La principal desventaja para el uso de antocianinas como colorantes para alimentos es

su baja estabilidad. De hecho la estabilidad del color de las antocianinas depende de la

combinación de varios factores, entre ellos la estructura y concentración de las antocianinas,

pH, temperatura, presencia de agentes acomplejantes (fenoles, iones metálicos), oxígeno, luz,

enzimas, interacción con componentes del alimento, etc. (Markakis, 1982; Malien-Aubert, et al.

2001; Jackman y Smith, 1996).

1.1.4.1 pH.

La presencia del ion oxonio adyacente al C2 de las antocianinas le da su característica

naturaleza anfotérica. Como se menciona anteriormente, las antocianinas existen como un

equilibrio de cuatro formas moleculares, las cuales se interconvierten por ganancia o pérdida

de un protón (Figura 1.1). Por lo cual las antocianinas se comportan como indicadores de

acidez, y existen como ácidos o como bases, en función del pH. El efecto global del pH en las

antocianinas se ilustra en la Figura 1.2 (Clifford, 2000).

En medios altamente ácidos (pH<2) el rojo catión flavilio es esencialmente la única

especie de antocianina presente. Con el incremento en el pH el ion flavilio se transforma en

base quinoidal por la rápida pérdida de un protón. En valores de pH de alrededor de 3 a 6, la

adición nucleofílica de agua a la posición C-2 del catión flavilio lentamente conduce a la

formación de un hemiacetal incoloro ó pseudobase. Con el incremento en el pH, los extractos

de antocianinas se transforman al punto en el que pueden parecer incoloros, antes de cambiar

por último a color azul o púrpura en pH>6 (Jackman y Smith, 1996).

Figura 1.2 Efecto generalizado del pH en elequilibrio de las antocianinas (Clifford, 2000).

Estómago Humano

pH de 2 a 5

Pseudobase Incolora

PH de sangre humana approx 7 Intestino delgado pH 7.5-8.0 Catión Flavilio

Chalcona Incolora

Base Quinoidal Azul

Po

rce

nta

je d

e A

nto

cia

nin

as

To

tale

s

pH


9

1.1.4.2 Temperatura

La relativamente rápida deterioración del atractivo color rojo en conservas de fresas

frescas, ha sido un problema persistente en la industria del procesado de este alimento a

través de los años. Kertesz y Sondheimer (1948) estudiaron las relaciones tiempo-temperatura

en la deterioración del color, y determinaron que 65ºF (19ºC) como la temperatura crítica, por

encima de la cual ocurría una acelerada pérdida del color rojo y un subsiguiente

obscurecimiento (Jackman y Smith, 1996).

En general, los factores que mejoran la estabilidad al pH (metoxilación, glicosilación y/o

sustituyentes acilo), también conducen a una mayor estabilidad térmica. La desprotonación del

catión flavilio por el solvente es de carácter exotérmica, mientras que la hidratación del catión y

la apertura del anillo de pirilio son ambos procesos endotérmicos. Por lo tanto, la formación de

chalconas esta favorecida por el incremento de la temperatura (durante el almacenamiento y el

procesado) a expensas de las formas quinoidal, hemiacetal y el ion flavilio (Jackman y Smith,

1996).

Con pocas excepciones, la degradación de las antocianinas sigue una cinética de

primer orden, el mecanismo de esta degradación es termo-dependiente. Se han reportado

energías de activación y valores z de alrededor de 70 kJ/mol y 25ºC, respectivamente, a

temperaturas de almacenamiento (<40ºC), y a temperaturas de proceso (<70ºC) valores de Ea

de 95 a 113 kJ/mol y valores z de alrededor de 28ºC. El valor z es el cambio de temperatura

requerido para producir un cambio en el tiempo de destrucción térmica por un factor de diez y

refleja la dependencia de la destrucción térmica con la temperatura. La concentración de

pigmentos poliméricos se ha demostrado que se incrementan con al temperatura y el tiempo

de almacenamiento, como en el caso de los jugos y vinos, y contribuyen a su coloración.

Algunos autores han sugerido tiempos de proceso cortos con alta temperatura para alcanzar

una máxima retención de pigmentos y evitar una degradación significativa de las antocianinas

y/o transformación a productos incoloros como las chalconas (Jackman y Smith, 1996).

1.1.4.3 Oxígeno y Ácido Ascórbico

Desde hace tiempo es conocido que las antocianinas y el ácido ascórbico (vitamina C)

son mutuamente destructivos en presencia del oxígeno. Las condiciones que favorecen la

oxidación del ácido ascórbico en un jugo de fresa, se ha encontrado que causan la máxima

pérdida de antocianinas (Sondheimer y Kertesz, 1953). Se ha reportado un efecto sinérgico

entre el oxígeno y el ácido ascórbico en la degradación de los pigmentos (Bakker et al., 1992).

Esta degradación mutua no es inesperada, ya que la vitamina C se ve considerablemente


10

afectada durante el procesado, debido a su tendencia a reaccionar con el oxígeno para formar

ácido dehidroascórbico y otros productos (Garzón y Wrolstad, 2002). Muchos de los estudios

son realizados a altas temperaturas (90, 88 y 38ºC) y los productos de la degradación del ácido

ascórbico como el peróxido de hidrógeno y el hidroximetilfurfural, parecen ser los principales

contribuyentes a este efecto degradador de antocianinas (Wrolstad, et al., 1970).

Bajo condiciones aeróbicas, la adición de metales de transición como el cobre,

aceleran la destrucción mutua del ácido ascórbico y las antocianinas; se cree que la causa de

ello es la formación de peróxido de hidrógeno producido por el rompimiento del ácido ascórbico

catalizado por los iones cobre (Timberlake, 1960a,b). La presencia de productos de ruptura en

sistemas decolorados muestra, según Iacubucci y Sweeny (1983), que el blanqueado de las

antocianinas por el ácido ascórbico ocurre por rompimiento oxidativo del anillo de pirilio. Estos

resultados divergen de aquellos publicados por Poei-Langston y Wrolstad (1981), estos autores

notaron que el color característico de las antocianinas se pierde más rápidamente en sistemas

libres de oxígeno (con nitrógeno) que bajo condiciones de oxigenación, favoreciendo un

mecanismo de condensación directa entre la antocianina con el ácido ascórbico para explicar

la pérdida de color observada.

El ion flavilio del núcleo de las antocianinas es deficiente de electrones, por lo tanto es

altamente reactivo, inestable y susceptible al ataque de agentes nucleofílicos. La distribución

de carga del ion flavilio indica que es más susceptible al ataque nucleofílico en la posiciones 2

y 4. Timberlake y Bridle (1968) estudiaron los posibles efectos estéricos en la estabilidad del

color en estudios sobre las sales del ion flavilio, demostrando que la sustitución en la posición 4

era un factor clave en la resistencia de las antocianinas al blanqueado por el dióxido de azufre.

Jurd (1972) postuló una reacción de condensación basado en el conocimiento de que las sales

de flavilio pueden condensarse con diversos compuestos conduciendo a la pérdida de la

pigmentación; entre ellos la dicetona dimedona, la cual es estructuralmente similar al ácido

ascórbico, por lo que sugirió un mecanismo similar. El autor concluyó que el ácido ascórbico se

podía condensar en la posición 4 del núcleo del ion flavilio, de manera análoga a la reacción

con el ion bisulfito.

Los resultados publicados por García-Viguera y Bridle (1999) sin embargo, dan

evidencias de que el mecanismo de condensación sugerido es poco probable de llevarse a

cabo por diversas razones, entre ellas que la pérdida de color es lenta, en lugar de ser una

reacción instantánea como ocurre con el SO2, adicionalmente y el color no regresa

inmediatamente con al acidificación, por otro lado No se observaron por HPLC nuevos


11

compuestos formados, debido a que no hubo cambios en λmax que indicaran lo contrario, y el

ácido ascórbico posee efecto degradador sobre el ion flavilio incluso cuando la posición 4 se

encuentra sustituida. Por lo tanto parece ser que ésta degradación es más probable que ocurra

por el mecanismo de radicales libres que por condensación directa en la posición 4. Se ha

comprobado que las antocianinas tienen capacidad de absorber radicales libres, lo cual les

confiere poder como antioxidantes (Wang, et al., 1997), esto nos conduce a soportar la teoría

de la reacción de oxidación, en la que el ácido ascórbico actúa como un activador del oxígeno

molecular, produciendo radicales libres, los cuales rompen el anillo de pirilio, como lo

postularon originalmente Iacobucci y Sweeny (1983).

1.1.4.4 Enzimas

Se han identificado diversas enzimas involucradas en la degradación de antocianinas y

en la correspondiente pérdida del color. La mayoría de estas enzimas son endógenas en

muchos tejidos vegetales. Estas enzimas se han llamado genéricamente ‘antocianasas’, pero

basados en sus distintas actividades, se han identificado dos grupos principales, las

glicosidasas, las cuales hidrolizan los enlaces glicosídicos de las antocianinas para producir

azúcares libres y agliconas, la inestabilidad de éstas últimas, resulta en su degradación

espontánea, vía la formación de chalconas incoloras; y las polifenoloxidasas (PPO), las cuales

actúan sobre las antocianinas en presencia de o-difenoles vía un mecanismo de oxidación

acoplado (Jackman y Smith, 1996).

El procesado de frutas frescas, viene acompañado siempre por un consecuente

rompimiento celular y estrés por daño a los tejidos. La actividad de muchas enzimas se

incrementa como una consecuencia del incremento en la permeabilidad que resulta de la

disrupción de tejidos y el mezclado de enzimas y sustratos, que en tejidos intactos, se

encontrarían secuestrados en vacuolas y otros compartimentos celulares (Lamikanra y

Watson, 2001). La enzima polifenoloxidasa, es dependiente de la presencia de iones cobre y

está ampliamente distribuida en plantas, y puede catalizar varias reacciones: entre ellas la

hidroxilación de monofenoles a o-difenoles (actividad cresolasa), la oxidación de o-difenoles a

o-quinonas (actividad catecolasa) y la oxidación de monofenoles a o-quinonas. Las quinonas

formadas pueden polimerizarse para formar pigmentos cafés, los cuales causan decoloración

en muchas frutas y vegetales durante las operaciones de poscosecha. Este oscurecimiento

enzimático afecta la aceptabilidad y es una de las principales causas de la disminución de la

calidad. En muchas frutas, incluida la fresa, la actividad de PPO es responsable de la pérdida

de color rojo, debido a la degradación de antocianinas (Serradell, et al., 2000).


12

La degradación de antocianinas no o-difenólicas en presencia de sustratos o-

difenólicos y PPO ha sido estudiada con anterioridad por varios autores. La degradación de

antocianinas no o-difenólicas ha sido establecida como un mecanismo en dos etapas, que

involucran primero la oxidación enzimática de los sustratos o-difenólicos en sus

correspondientes o-quinonas, seguido de la reacción de estas quinonas con las antocianinas.

(Kader, et al., 1999). Wesche-Ebeling y Montgomery (1990) estudiaron la degradación de

pelargonidina 3-glucósido por PPO de fresas. En sistemas modelo con pelargonidina 3-

glucósido, la PPO muestra una ligera pérdida de pigmento (5%), pero en presencia de

catequina, la pérdida fue de un 50% después de 24 horas (Kader, et al., 1999). Ellos sugieren

que las quinonas y los productos intermediarios de reacción formados como resultado de la

acción de la actividad de polifenoloxidasa, son suficientes para iniciar las reacciones de

oxidación y polimerización que conducen a la pérdida de las antocianinas (Bakker, et al., 1992;

Wesche-Ebeling y Montgomery, 1990). Los autores propusieron un mecanismo de degradación

por incorporación de las antocianinas en productos de la reacción de condensación entre

catequina y fenoles. De acuerdo a estos autores, este mecanismo se lleva a cabo con

antocianinas o-difenólicas, tales como los derivados de la cianidina (Kader, et al., 1999).

1.1.4.5 Iones Metálicos

En los sistemas vivos, las antocianinas se encuentran asociadas con otros

compuestos, como iones metálicos, flavonoides (glicosilados y/o acilados) y quizá con

polisacáridos macromoleculares. Todas estas asociaciones afectan el espectro de absorción

de las antocianinas involucradas, lo queda pie a muchos mecanismos que explican la gran

variedad de colores en las plantas (Elhabiri, et al. 1997).

A diferencia de los copigmentos polifenólicos, los iones metálicos, que pueden estar

presentes en el medio natural de las antocianinas son raramente relacionados con la

estabilización del color. Sin embargo, se ha reportado que iones metálicos pequeños altamente

cargados, como el Mg2+ y Al3+, pueden actuar como reforzadores de la interacción entre

pigmento-copigmento. En particular, se ha propuesto que el color azul desplegado por algunas

flores, es el resultado de la interacción pigmento-copigmento-ion metálico (Elhabiri, et al.

1997). Dangles, Elhabiri y Brouillard, (1994) reportaron el acomplejamiento de sales de

aluminio con antocianinas, proveyendo información respecto al mecanismo de

acomplejamiento que se lleva a cabo. Los análisis de 1H-RMN en CD3OD, han confirmado la

conversión de la forma roja del ion flavilio de la antocianina a la forma quinoidal de color azul

intenso, mediante el acomplejamiento con el ion Al3+ (Elhabiri, et al. 1997).


13

Desde hace tiempo se conoce la reacción de los iones metálicos como el aluminio(III) y

el hierro(III) con el sistema flavilio, y ha sido empleada como prueba cualitativa para demostrar

la presencia de un grupo catecol en las antocianinas derivadas de plantas. La prueba se basa

en la observación de un cambio de color, o cambio batocrómico, en la λmax, con la adición de

iones aluminio(III) en la forma de AlCl3. A partir de cálculos moleculares, parece ser que para la

sal de cloruro de 3-deoxiflavilio, la densidad de carga en la posición C-3 del complejo flavilio-

Al3+ o flavilio-Ga3+ se correlaciona con la longitud de onda máxima de estos compuestos en

solución metanólica. Se deduce que la sustitución en la posición 3 es de gran importancia para

las antocianinas copigmentadas con iones metálicos (Elhabiri, et al. 1997).

1.1.4.6 Copigmentos

La copigmentación fue descrita por primera vez por Robinson y Robinson en 1931 y

estudiada posteriormente en sistemas modelo. Cuando un copigmento se agrega a una

solución acuosa ácida, produce un incremento en la intensidad de color debido a la formación

de agregados coloridos (Baranac, 1996). Es bien sabido hoy en día, que los polifenoles

incoloros (flavonas, flavonoles, ésteres de ácidos cinámicos y benzóicos, taninos) son capaces

de formar complejos empalmes moleculares no covalentes con los núcleos de ion flavilio,

planos y ricos en electrones π (Elhabiri, et al. 1997).

Las interacciones hidrofóbicas eficientemente protegen los cromóforos contra el ataque

nucleofílico del agua, desplazando al mismo tiempo el equilibrio total entre las formas coloridas

e incoloras, (Figura 1.1) hacia las formas coloridas y acomplejadas. Este fenómeno es

conocido como copigmentación y además puede operar de manera intramolecular en

antocianinas más complejas que poseen ácidos cinámicos o benzoicos en sus grupos

glicosídicos produciendo soluciones estables coloreadas a valores de pH ligeramente ácidos

(Elhabiri, et al. 1997). El equilibrio de copigmentación puede ser escrito como sigue:

Antocianinas libres + Copigmentos Antocianinas copigmentadas

Un incremento en la concentración de copigmentos conduce a la intensificación del

color, debido a que desplaza las formas incoloras de las antocianinas a favor de las formas

coloridas. Los copigmentos incluyen una gran variedad de compuestos estructuralmente

relacionados y no relacionados, como los flavonoides, fenólicos no flavonoides, aminoácidos y

ácidos orgánicos (Darias-Martín, 2001). Este efecto estabilizador se discutirá en detalle en

secciones posteriores.


14

1.2 FLAVONOIDES Y ÁCIDOS FENÓLICOS

En términos muy generales, un compuesto fenólico o polifenol, puede ser

químicamente definido como una sustancia que posee un anillo aromático conteniendo un

grupo hidroxilo, incluyendo sus derivados funcionales (ésteres, metil éteres, glicósidos, etc.).

Los fenólicos derivados de plantas, provienen biogenéticamente de dos rutas principales, la

ruta del shikimato, la cual directamente provee de fenilpropanoides, como los ácidos

hidroxicinámicos y las cumarinas; y la ruta del acetato-malonato, la cual produce fenoles

simples y también muchas quinonas (Harborne, 1989).

El grupo más importante de fenólicos son los flavonoides, y estos a su vez se

subdividen en varios grupos, como se indica en la Tabla 1.3. Los ácidos hidroxicinámicos se

distribuyen en grupos amplios de combinaciones, más que ningún otro grupo de polifenoles. El

ácido caféico por ejemplo, se puede hallar en asociación con ácidos carboxílicos derivados del

ciclohexano, azúcares, ácidos orgánicos, aminas, lípidos, y también unido a otros fenoles. El

flavonoide más comúnmente encontrado , el flavonol quercetina, se ha encontrado en 135

asociaciones diferentes. La mayoría de éstas son O-glicósidos, pero hay O-sulfatos, con

azúcares acilados con ácidos alifáticos o aromáticos (Harborne, 1989).

Una de las funciones indiscutibles de los flavonoides y fenólicos relacionados es su

función como agentes protectores de las plantas en contra de la invasión microbiana. Debido a

su amplia habilidad para inhibir la germinación de esporas de patógenos de plantas, se ha

propuesto su uso contra patógenos fúngicos en el hombre (Harborne, 1989).

1.2.1 Clasificación y Estructura Química

Las principales clases de polifenoles se definen de acuerdo a la naturaleza de su

esqueleto carbonado: ácidos fenólicos, flavonoides, y en menor medida, estilbenos y lignanos

(Figura 1.3) (Scalbert y Williamson, 2000). La química de los compuestos fenólicos es

complicada por el hecho de que la mayor parte de los compuestos que están presentes en

plantas, están en su forma conjugada, principalmente con un residuo de azúcar enlazado a

través de uno o más de los residuos fenólicos. Los monosacáridos asociados con los fenólicos

incluyen glucosa, galactosa, arabinosa, rhamnosa, xilosa, manosa, apiosa, alosa, ácido

glucurónico y galacturónico, y con la complejidad de que algunos de estos azúcares pueden

estar en su forma de di-, tri- o tetrasacáridos (Harborne, 1989).


15

Tabla 1.3 Principales clases de flavonoides conocidos.1

Clase Número de EstructurasConocidas Propiedades biológicas

Antocianinas 256 Pigmentos de rojo al azul

Chalconas 197

Auronas 29Pigmentos amarillos

Flavonas, flavonoles, ysus O-glicósidos 1660

Copigmentos en flores;protectores UV en las hojas

C-glicosilflavonoides 303

Flavanonas 319

Dihidrochalconas 71Algunas tienen sabor amargo

Dihidroflavonoles 110Con frecuencia presentes enmaderas

Flavanos, leucoantocianinas yproantocianidinas 309

Sustancias Astringentes conpropiedades de taninos

Biflavonoides 134

Isoflavonoides 630 Estrogénicos y fungitóxicos

Neoflavonoides 70

Estructuras misceláneas 100

1(Harborne, 1989)

Los flavonoles, flavonas y flavanoles o catequinas, constituyen tres de las principales

subclases de flavonoides (Figura 1.4). Los flavonoles y las flavonas tienen una estructura

anular similar, con un doble enlace entre los carbonos 2 y 3. Las flavonas, opuestos a los

flavonoles, carecen de un grupo hidroxilo en la posición 3. Los principales flavonoles son la

quercetina (3,5,7,3’,4’-pentahidroxiflavona), kaempferol (3,5,7,4’-tetrahidroxiflavona), miricetina

(3,5,7,3’,4’,5’-hexahidroxiflavona), isorhamnetina (3,5,7,4’-tetrahidroxi-3’-metoxiflavona). Las

flavonas mas abundantes en las plantas son la luteolina (5,7,3’,4’-tetrahidroxiflavona) y

apigenina (5,7,4’-trihidroxiflavona) (Hollman y Arts, 2000).


16

O

O

O

OH

OH

H

H OH

OH

H

OH

OH

OH

OH

OH

CH3OH

OH

OH

OOH

OH O

OH

OH

OHOOH

OH

OH

OH

OH

OOH

OH OOH

OOH

OH O

OH

H

OCH 3

O+

OH

OH

OH

OH

OH

OH

OH

CH3OC

CO

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CO

CO

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

CH3

OC

O

O

O

O

O

O

OOH

OH

OH

OH

OH

OOH

OH

OH

OH

OH

OOH

OH

OH

OH

OH

resveratrol(estilbeno)

enterodiol(lignano)

ácido clorogénico(ácido fenólico)

quercetina(flavonol)

(+)-catequina(flavanol)

genisteína(isoflavona)

hesperetina(flavanona)

cianidina(antocianidina)

casuarictina(elagitanino)

trimero de procianidina(flavanol)

Figura 1.3 Estructuras químicas de las principales clases de polifenoles (Scalbert,2000).


17

La característica estructural que tienen los flavanoles, que es una característica en

común con las antocianinas, es la ausencia del grupo ceto en la posición 4 del anillo C (Figura

1.4). La falta de un doble enlace entre la posición 2 y 3, y la presencia de un grupo hidroxilo en

la posición 3, crea dos centros de asimetría. Los flavanoles con una configuración 2R, son los

que se encuentran mayoritariamente en la naturaleza. Los flavanoles que predominan son (+)-

catequina (2R,3S-3,5,7,3’,4’-pentahidroxiflavano), (–)-epicatequina (2R,3R-3,5,7,3’,4’-

pentahidroxiflavano), (+)-galocatequina (2R,3S-3,5,7,3’,4’,5’-hexahidroxiflavano) y

epigalocatequina (2R, 3R-3,5,7,3’,4’,5’-hexahidroxiflavano) y los correspondientes ésteres de

ácido gálico: galato de (–)-epicatequina y galato de (–)-epigalocatequina. En el pasado a este

tipo de compuestos, flavanoles, se les hacia referencia como flavan-3-oles o catequinas

(Hollman y Arts, 2000).

Los flavonoles y flavonas se encuentran usualmente en plantas unidos a azúcares

como O-glicósidos. Las flavonas pueden encontrarse como C-glicósidos. La forma glicosídica

Figura 1.4 Subclases de flavonoides. La clasificación estábasada en las diferencias en el anillo heterocíclico C(Hollman y Arts, 2000).

O

OOH

OH

CH3

OH

CH3

O

OOH

OH

CH3

OH

CH3

OH

O

OH

OH

CH3

OH

CH3

OH

O

OOH

OH

CH3

OH

CH3

O+

OH

OH

OH

OH

OH

OH

O

OH

OH

CH3

OH

CH3

O

Flavona Flavonol

Flavanona

Antocianidina

Flavanol

Isoflavona


18

es una característica general de los flavonoides, con excepción de los flavanoles, en donde

esta presentación es rara. La forma de aglicona de los flavonoles y flavonas no se halla

presente en plantas frescas, pero pueden encontrarse como resultado del procesado de los

alimentos. Los residuos de azúcar se pueden enlazar en varias posiciones de la estructura de

un flavonoide, sin embargo hay preferencia por la posición 3 (Hollman y Arts, 2000).

1.2.2 Ocurrencia de Flavonoides y Ácidos Fenólicos en el Tomillo

En muchas plantas, los principales flavonoides constituyentes, son las agliconas, como

la quercetina, miricetina, kaempferol y sus glicósidos (Zheng y Wang, 2001). Algunas especies

como el tomillo (Thymus vulgaris) y el romero (Rosmarinus officinalis) son conocidas por tener

alta capacidad antioxidante, y algunas flavonas metiladas fueron aisladas del tomillo como

antioxidantes. En el aceite esencial de tomillo, el timol y el cravacol fueron reconocidos como

los principales componentes que mostraron una alta actividad antioxidante y antimicrobiana

(Zheng y Wang, 2001). Zheng y Wang, (2001), reportan compuestos bifenilos, dímeros del

timol, y flavonoides aislados de tomillo, que mostraron actividad antioxidante tan fuerte como el

BHT. Además los autores reportan altos contenidos de ácido rosmarínico (91.8 mg/100g peso

fresco) y luteolina (39.5 mg/100g peso fresco) hallados en extractos de tomillo.

Varios autores han reportado el contenido de los flavonoides más abundantes en

tomillo, por su importancia como potentes antioxidantes. Entre los compuestos comúnmente

reportados se encuentran aquellos extraídos con soluciones acuosas reguladoras (Tabla 1.4).

Tabla 1.4 Compuestos fenólicos en Thymus vulgaris1

Compuesto Fenólico Concentración2

Ácido caféico 11.7 ± 1.04

Luteolina 39.5 ± 1.53

Ácido rosmarínico 91.8 ± 2.75

Hispidulina 20.8 ± 0.961(Zheng y Wang, 2001), 2 Expresado en mg/100g de peso fresco.

Existen reportes de tres flavonas alquiladas, las cuales tienen un residuo de ácido p-

hidroxibenzoico enlazado al C-8 de la apigenina, luteolina y diosmentina, estos fueron aislados

con los correspondientes derivados de quercetina y kaempferol de partes aéreas de Thymus

hirtus. Este es uno de los primeros reportes de sustitución a través de enlaces C-C (Harborne y

Williams, 1998).


19

Los principales compuestos fenólicos reportados en extractos de Tomillo, aparecen en

la Tabla 1.4, sin embargo, se ha reportado también la presencia de algunos otros ácidos

fenólicos como el ácido clorogénico, ácido cinámico, ferúlico, gálico, vainíllico y p-

hidroxibenzoico. La presencia de estos compuestos es altamente dependiente de las

condiciones de crecimiento de la planta, así como la especie y variedad de Thymus sp. de la

que se trate (Duke, 2003).

1.2.3 Características Espectrales

La cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) en fase reversa (RPLC), es la

técnica más popular y confiable para el análisis de fenólicos. El perfil de elución es típico para

RPLC, esto es, los compuestos polares, (como los ácidos fenólicos) eluyen primero, seguidos

por aquellos de polaridad decreciente. Por lo anterior, se puede establecer un orden de elución

como sigue: ácidos fenólicos < ácidos cinámicos < flavonoides. Aunque pueden presentarse

empalmes entre miembros individuales de diferentes clases debido a la diversidad de

compuestos. El orden de elución de los flavonoides con similar patrón de sustitución se puede

establecer como flavanona-glicósido, seguido de flavonol y flavona glicósidos, seguidos por la

aglicona libre en el mismo orden. En ácidos cinámicos y fenólicos, la polaridad se incrementa

principalmente por los grupos hidroxilos en al posición 4, seguidos por aquellos en la posición 3

y en la posición 2. Los grupos metoxi y acrílicos reducen la polaridad y por lo tanto incrementan

los tiempos de retención (Robards, et al., 1999).

La detección es usualmente basada en la absorción en el rango ultravioleta, o en

menor medida a varias longitudes de onda del rango visible que son características de ciertas

clases de compuestos fenólicos. (Ver Tabla 1.5). La mayoría de los compuestos fenólicos

exhiben dos principales bandas de absorción; la Banda I en la región de 320±385 nm que

representa la absorción del anillo B y la Banda II en la región de 250±285 que representa la

absorción el anillo A (Robards, et al., 1999). Los cambios hacia la longitud de onda del rojo son

debidos a un incremento en el número de grupos hidroxilo, por ejemplo, 367 nm en kaempferol,

a 371 nm, en quercetina, y 374 nm en miricetina. Por esta razón la banda I en las flavonas es

usualmente a una longitud de onda mas corta, por 20 a 30 nm que en los flavonoles

equivalentes (Robards, et al., 1999).


20

Tabla 1.5 Espectro de absorción de varias clases de compuestos polifenólicos (Robards, et al.,1999).

Tipo de compuesto Banda UV II a Banda UV I a Visible a

Ácidos benzóicos 270-280Ácidos cinámicos (290-300)b 305-330Antocianinas 240-280 (315-325)c 450-560Flavonoles 250-270 (300)b 350-380Flavanoles 270-280Coumarinas 220-230 310-350Flavonas 250-270 330-350Flavanonas, Flavanoles 270-295 (300-330)b

Chalconas 220-270 (300-320)b 340-370Auronas 240-270 340-370Isoflavonas 245-270 300-340

aEl solvente usual es metanol, excepto para antocianinas que es metanol-HCl. bHombro; cEn el caso deacilación por ácidos cinámicos

1.2.4 Fraccionamiento de Extractos Fenólicos

En estudios recientes, Guillén, et al. (1997) reportaron un procedimiento de

fraccionamiento de fenólicos de interés enológico empleando dos cartuchos de extracción en

fase sólida, el primero de C18, seguido de una resina de intercambio aniónico. Esta estrategia

de separación les permitió la separación de compuestos cargados negativamente como ácidos

fenólicos, de aquellos compuestos neutros como aldehídos fenólicos y catequinas.

Seleccionando el pH del medio en el cual la muestra fue inyectada en la resina aniónica, en

función el pKa promedio de los ácidos fenólicos, los autores efectuaron la separación de los

compuestos fenólicos en las dos familias, neutros y cargados negativamente. Empleando un

pH de 6.5 se aseguraron que las especies ácidas se encontraran en la forma ionizada para

poder ser retenidas en la resina aniónica.

El fraccionamiento de compuestos fenólicos también se puede llevar a cabo mediante

el uso de solventes orgánicos, para la elución de polifenoles adsorbidos en cartuchos de C18.

Sin embargo la selectividad de dichos solventes no es suficiente para lograr una separación en

función de sus características químicas (Covarrubias, 2001).

1.2.5 Función como Sustratos de Polifenoloxidasa

Varias sustancias, como el ácido clorogénico, quercetina-5’sulfonato, morina, rutina,

quercetina, etc, han sido identificados como buenos copigmentos (B�kowska, et al., 2003). Sin

embargo se han identificado compuestos que actúan como sustratos de polifenoloxidasa,

principalmente ácidos fenólicos como ácido caféico, protocatecoico y clorogénico (Stauffer,

1999).


21

La enzima polifenoloxidasa, es dependiente de la presencia de iones cobre como

cofactor además de oxígeno disuelto en el sistema; la reacción de oxidación puede ser

representada por la ecuación (1) de manera general.

OH

OH

O

O

Catecol o-benzoquinona

Algunos compuestos fenólicos no intervienen directamente en el obscurecimiento

enzimático, pero pueden actuar como sinergistas o inhibidores de polifenoloxidasas. Se sabe

que el ácido p-coumárico es un inhibidor no competitivo de la PPO de manzana, y que cataliza

la degradación de ácido clorogénico (Shahidi y Naczk, 2003). Dincer y otros (2002) por otro

lado reportan el uso de 4-metilcatecol como el sustrato ideal para la PPO extraída de plantas.

Al parecer, este tipo de PPO tiene un sitio de unión con una alta afinidad por pequeños o-

difenoles como el catecol o el 4-metilcatecol y menor afinidad por o-difenoles voluminosos

como la epicatequina.

1.3 COPIGMENTACIÓN

1.3.1 Tipos de copigmentación

1.3.1.1 Autoasociación

Cuando la concentración de pigmentos es relativamente alta, las antocianinas mismas,

pueden actuar como copigmentos y participar en reacciones de auto-asociación. En estudios

sobre el equilibrio de las antocianinas en solución acuosa, se ha observado que no se sigue la

Ley de Lambert-Beer, excepto para soluciones muy diluídas. Asen et al. (1972) encontraron

que un incremento en la concentración de cianidina-3,5-diglucósido a pH 3.16 provocaba

incrementos no proporcionales en la absorbancia de la solución. Este efecto fue atribuido a la

auto-asociación de moléculas de antocianinas. Estudios subsecuentes de la auto-asociación

de malvidina-3-glucósido por RMN, mostraron que tanto la forma de ion flavilio como la forma

quinoidal, pueden formar apilamientos verticales con un giro en el sentido de las manecillas del

reloj, y se mantienen juntos gracias a interacciones electrostáticas e hidrofóbicas (Hoshino,

1992).

+ E –Cu2+ + ½O2 + E–2Cu2+ + H2O Ec. (1)


22

1.3.1.2 Copigmentación Intramolecular

Estudios recientes sugieren que el acomplejamiento molecular de las antocianinas con

otros fenoles, denominados copigmentos es el responsable de la estabilización del color en las

plantas (Davies et al., 1993; Brouillard et al., 1989; Mazza y Brouillard, 1990).

La copigmentación consiste en el apilamiento de moléculas de copigmento sobre el

núcleo plano de las formas coloridas de las antocianinas. De esta forma, el ataque nucleofílico

del agua en la posición 2 del núcleo de pirilio, que conduce a las formas incoloras de

hemiacetal y chalconas, es prevenido parcialmente (Figura 1.1) (Dangles y Amiot, 2001). La

copigmentación en un fenómeno ampliamente distribuido en la naturaleza y puede ocurrir en

productos derivados de frutas y verduras, como jugos y vinos. Este fenómeno se vuelve más

eficiente cuando el pigmento y el copigmento se encuentran unidos a través de un espaciador.

Tal es el caso de las antocianinas, en las que las glicosilaciones se encuentran aciladas

(frecuentemente en la posición 6-OH) por ácidos fenólicos. Dentro de estas moléculas

aciladas, la copigmentación consiste en un arreglo conformacional de los grupos acilo sobre el

núcleo del ion flavilio (copigmentación intramolecular) (Dangles et al., 1993).

Los residuos de azúcares unidos a las antocianinas pueden encontrarse acilados con

ácidos aromáticos como p-cumárico, caféico, ferúlico, gálico o por ácidos p-hidroxibenzoicos,

y/o por ácidos alifáticos como malónico, acético, málico, succínico, etc. También se han

reportado antocianinas que tienen dos o más grupos acilos, como la cianodelfinidina,

rubrocinearina, ternatinas y lobelinas, etc. (Jackman y Smith, 1996). Esta acilación posee un

efecto estabilizante en las antocianinas, a través de la copigmentación intramolecular, esto es

a través del apilamiento tipo sándwich de los grupos acilo, con el anillo de pirilio de la molécula

de antocianina y este efecto es más aparente para el caso de las moléculas con acilos

aromáticos. Hay que mencionar que las antocianinas monoaciladas, por lo general no

presentan el efecto estabilizador de las antocianinas di, tri o poliaciladas, indicando que al

menos dos grupos acilo son necesarios para una buena estabilidad y retención de color en

medios ligeramente ácidos ó neutros (Jackman y Smith, 1996). Las antocianinas aciladas, son

particularmente prometedoras como colorantes de alimentos, debido a su gran estabilidad de

color en el rango de pH de 4-5, donde las antocianinas no aciladas son casi incoloras. En la

industria de alimentos, algunas fuentes comunes de estas antocianinas son Tradescantia

pallida, Zebrina pendula, zanahoria morada y col roja (Dangles y Amiot, 2001).


23

1.3.1.3 Copigmentación Intermolecular

La adición de compuestos no coloreados (copigmentos), en soluciones de antocianinas

ligeramente ácidas, produce un incremento en la longitud de onda de máxima absorbancia

(λmax), conocido como cambio batocrómico, y un incremento en la absorbancia en el espectro

visible, llamado cambio hipercrómico, por un mecanismo análogo a la autoasociación. La

magnitud del efecto del copigmento en tales soluciones es dependiente de la estructura así

como de la cantidad de antocianina y molécula de copigmento presente, del pH, la

temperatura, y la composición de la solución empleada como solvente (Mazza & Brouillard,

1990).

Estas modificaciones en las propiedades espectrales probablemente apuntan al hecho

de que la molécula de copigmento interactúa con al antocianina en su primer estado excitado

(transiciones electrónicas en el rango visible) mas fuertemente que con su estado basal (Alluis

et al., 2000).

Robinson y Robinson (1931) describieron por primera vez la copigmentación

intermolecular con diferentes compuestos, y su capacidad de copigmentar soluciones de

malvidina 3-glucósido. Los tipos de moléculas que pueden actuar como copigmentos exógenos

para antocianinas incluyen flavonoles, flavan-3-oles, ácidos fenólicos, alcaloides, aminoácidos,

y en el caso de la auto-asociación, las antocianinas (Asen, 1972). Los mejores copigmentos

encontrados son por mucho, los flavonoles, sin embargo el principal prerrequisito de un

copigmento es que contenga un anillo plano rico en electrones π, lo cual permite un

solapamiento π-π con el anillo de pirilio del ion flavilio (Brouillard y Dangles 1994).

La concentración de ambos, las antocianinas, y las moléculas de copigmento,

influencian la magnitud del efecto de la copigmentación (Mazza y Brouillard, 1990). Al

incrementar al concentración de antocianinas, se incrementa la absorbancia así como el

cambio batocrómico. Sin embargo, la magnitud del incremento en la absorbancia es

dependiente de la proporción copigmento:pigmento para una determinada antocianina. El

incremento en esta proporción, también incrementa la magnitud de los cambios hipercrómicos

y batocrómicos (Covarrubias 2001, Del Follo, 2003).

En estudios sobre antocianinas de uva muscadina Talcott, y otros (2003) demuestran

la dependencia de los cambios hipercrómicos y batocrómicos con la concentración de

compuestos fenólicos provenientes de extractos acuosos de romero (Rosmarinus officinalis).


24

En su estudio, el color de los jugos de uva muscadina se incrementa en un 120% con la

adición de dichos extractos.

1.3.1.4 Copigmentación con iones metálicos

La cianidina, la cual posee dos grupos hidroxilo adyacentes, tiene la propiedad de

acomplejar metales como el aluminio en solución metanólica acidificada, lo que provoca una

modificación en el máximo de absorción a 567 nm mientras que la pelargonidina 3-glucósido

no es afectada, debido a la ausencia de hidroxilos en posición orto (Wrolstad et al., 1970).

Se ha estudiado con anterioridad el papel que juega el ácido cítrico, que es el principal

ácido orgánico presente en las fresas, y se sabe que preferentemente reacciona con iones

metálicos, dejándolos no disponibles para el acomplejamiento previamente descrito. Jurd y

Asen (1966) estudiaron la copigmentación de cianidina 3-glucósido con quercetina, ácido

clorogénico y metil-galato, y hallaron que la presencia de sales metálicas era esencial para al

formación del copigmento en soluciones acuosas. El ácido cítrico, al estar acomplejado con el

metal, impide la formación del complejo copigmento-metal-antocianina, responsable de un

indeseable corrimiento hacia el azul de algunas variedades de fresas congeladas. Aunque el

ácido cítrico es el principal ácido presente en la fresas, también se encuentran el málico,

shikímico, succínico, glicérico, glicólico y aspártico. La magnitud de dicho efecto depende del

tipo de ácido orgánico presente (Wrolstad et al., 1970).

1.3.2 Uso de extractos fenólicos como estabilizadores de antocianinas

En ausencia de mecanismos estabilizadores de color, las formas coloridas de las

antocianinas, se hallan en menor proporción en soluciones acuosas ligeramente ácidas. Como

una consecuencia de esto, se deduce que la gran variedad de colores naturalmente

expresados por las antocianinas, debe ser estrictamente controlado por la copigmentación y el

acomplejamiento metálico (para el caso de las antocianinas con un grupo 1,2-dihidroxibenceno

en el anillo B) (Dangles y Amiot, 2001). Es sabido desde hace tiempo que los flavonoides están

comúnmente asociados con las antocianinas en las plantas, por lo que se ha sugerido el uso

de algunos de estos compuestos para mejorar la estabilidad de pigmentos como las

antocianinas en alimentos (Lenoble, 1999). Por ejemplo, se ha demostrado la eficacia de

extractos acuosos de romero (Rosmarinus officinalis), el cual es rico en flavonoides en la

estabilización del color proveniente de antocianinas (Covarrubias 2001; Del Follo, 2003;

Talcott, et al., 2003).


25

La formación de complejos entre las antocianinas y los copigmentos en condiciones

ácidas, mejora las cualidades visuales y la estabilidad del color en los alimentos que los

contienen. La estabilidad de las antocianinas copigmentadas en presencia de ácido ascórbico

fue conocida recientemente, y actúa proporcionando un efecto quimoprotector durante el

procesado de los alimentos (Talcott, et al., 2003).

Del Follo (2003) reporta la copigmentación de las antocianinas en el jugo de uva con

extractos fenólicos de romero y tomillo, como un medio efectivo para la protección contra la

reacción de blanqueado con bisulfitos, y este efecto estabilizador, es más efectivo para un

extracto derivado del tomillo. Talcott, y otros, (2003) reportaron incrementos batocrómicos de

10 a 27% por la adición de extractos de romero en jugo de uva, dichos incrementos son

dependientes de la concentración de extracto agregada. Sin embargo, la problemática sigue

siendo la capacidad de estos extractos fenólicos para ser usados como sustratos de

polifenoloxidasa; por lo cual, surge la necesidad de contar con extractos fenólicos que sin

perder su capacidad de actuar como buenos copigmentos, no contribuyan al incremento de

agentes oxidantes que mermen la concentración de antocianinas y de otros fitonutrientes, es

decir, que no puedan ser usados como sustratos por la polifenoloxidasa.

MATERIALES Y MÉTODOS

26

CAPITULO 2

OBTENCIÓN DE EXTRACTOS DE TOMILLO LIBRES DE SUSTRATOS DE

POLIFENOLOXIDASA Y CARACTERIZACIÓN QUÍMICA.

2.1 INTRODUCCIÓN

La mayoría de los alimentos que se consumen en la actualidad son procesados de

alguna forma antes de llegar a manos del consumidor, y en ocasiones los fabricantes se ven

en la necesidad de reemplazar el color perdido durante dicho procesado, o colorear los

productos, para incrementar su aceptabilidad. Con la creciente preocupación pública respecto

a la seguridad de los colorantes sintéticos, los pigmentos de origen natural están tomando gran

importancia (Bridle y Timberlake, 1996). Se ha observado un incremento paulatino en el

desarrollo de colorantes naturales, así como de alimentos funcionales en años recientes, no

solo debido a las preferencias del consumidor por los pigmentos naturales, sino también por

sus beneficios relacionados con la salud y propiedades nutracéuticas (Clifford, 2000; Del Pozo-

Insfran, et al., 2003). Una de las limitaciones para el uso de las antocianinas como reemplazo

a los colorantes sintéticos es su baja estabilidad, debido a su estructura química, factores

ambientales y a la presencia de otros fitoquímicos en solución. La presencia de polifenoles

incoloros en sistemas con antocianinas conduce a una mayor estabilidad de los pigmentos, por

formación de complejos empalmes moleculares no covalentes con los núcleos de ion flavilio,

planos y ricos en electrones π. Estas interacciones hidrofóbicas protegen los cromóforos contra

el ataque nucleofílico del agua, desplazando al mismo tiempo el equilibrio total entre las formas

coloridas e incoloras hacia las formas coloridas y acomplejadas (Elhabiri, et al. 1997). Además

como ya se mencionó en secciones anteriores, el efecto de la adición de compuestos no

coloreados (copigmentos), en soluciones de antocianinas ligeramente ácidas, produce un

incremento en la longitud de onda de máxima absorbancia (λmax), conocido como cambio

batocrómico, y un incremento en la absorbancia en el espectro visible, llamado cambio

hipercrómico, debidos a estas interacciones electrónicas.

Iacobucci y otros, (1983) reportaron el empleo de soluciones de quercetina-3-rutinósido

como copigmento para disminuir el efecto degradador de la luz solar utilizando soluciones

modelo de cianidina-3-glucósido. Una de las dificultades para el uso de este tipo de estrategias

de estabilización, es que los procedimientos de aislamiento de flavonoides en su forma pura y

en grado alimenticio es un proceso caro y con múltiples operaciones unitarias. Debido a lo

anterior, se sugiere el empleo de extractos fenólicos semi-purificados derivados de plantas, los

cuales contienen una mezcla compleja de polifenoles. En estudios previos, Del Follo (2003),


27

trabajando sobre estabilidad de antocianinas en jugo de uva, demostró que la adición de

extractos fenólicos de romero y tomillo, provoca incrementos porcentuales en absorbancia de

490 % y 377 % respectivamente con relaciones molares copigmento:pigmento de 100:1, y

cambios batocrómicos del orden de varias decenas de unidades de longitud de onda. Este tipo

de resultados son, en todos los casos, dependientes de la concentración de compuestos

fenólicos. Los tipos de moléculas que se han identificado como eficientes copigmentos incluyen

flavonoles, flavan-3-oles, ácidos fenólicos, alcaloides, aminoácidos, y en el caso de la auto-

asociación, las propias antocianinas (Asen, 1972).

Sin embargo el uso de extractos fenólicos como agentes estabilizadores de

antocianinas, tiene la desventaja de que algunos de estos compuestos actúan como sustratos

de enzimas como la polifenoloxidasa (Del Follo, 2003). La degradación enzimática de

antocianinas ha sido establecida como un mecanismo en dos etapas, que involucran primero la

oxidación enzimática de los sustratos o-difenólicos en sus correspondientes o-quinonas,

seguido de la reacción de estas quinonas con las antocianinas (Kader, et al., 1999).

A partir de estos estudios, surge la necesidad de contar con agentes estabilizadores

más efectivos, que conserven su capacidad para actuar como copigmentos pero con una

reducida capacidad de servir como sustratos de PPO. En el presente estudio se planteó como

hipótesis que la introducción de una etapa de cromatografía aniónica al proceso

comercial de obtención produce extractos fenólicos de tomillo (Thymus vulgaris L.)

libres de sustratos de polifenoloxidasa y con capacidad de copigmentación similar a la

del extracto obtenido a través del proceso comercial original.

A partir de esta hipótesis se generó el objetivo general de este proyecto que fue

evaluar la efectividad de un proceso de cromatografía aniónica para la obtención de extractos

fenólicos de tomillo (Thymus vulgaris) libres de sustratos de polifenoloxidasa y evaluar su

desempeño como copigmentos para antocianinas.

Para el cumplimiento de este objetivo, la estrategia experimental que se siguió se

dividió en tres estudios. Primero la obtención del extracto de tomillo a través de un proceso

comercial (descrito en secciones posteriores) y la introducción de una etapa de cromatografía

aniónica para modificar su perfil fenólico. Después se evaluó su capacidad para actuar como

copigmento en jugo de fresa (Fragaria anannassa) y por último, su caracterización química y

cuantificación por cromatografía de líquidos de alta resolución con detector de arreglo de

diodos (HPLC-PDA).


28

2.2 MATERIALES Y MÉTODOS

2.2.1 Materiales

El procedimiento de extracción de compuestos fenólicos de Tomillo (Thymus vulgaris)

se realizó empleando las hojas secas de la especie, obtenida a granel en un supermercado

local. Los estándares para calibración así como el reactivo de Folin-Ciocalteau se obtuvieron

de Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO., E.U.A.) y Fluka Chemie GmbH (Buchs, Suiza). Los

reactivos y solventes empleados se obtuvieron de diversas marcas como Fermont-Productos

Químicos Monterrey S.A. de C.V. (Monterrey, NL., México), Merck Co. (Darmstadt, Alemania),

BioRad (Hercules, CA., E.U.A.), Desarrollo de Especialidades Químicas, S.A. de C.V. (San

Nicolás de los Garza, N.L., México), Fisher Scientific Int. (Winnipeg, MB., Canadá). Los

cartuchos Sep-Pak ® de resina C-18 empleados para microextracción en fase sólida fueron de

la marca Waters Co. (Milford, MA., E.U.A.). Las dos resinas de intercambio aniónico

empleadas se obtuvieron de la marca Supelco (Bellefonte, PA., E.U.A.).

2.2.2 Estudio 1. Obtención del extracto acuoso de tomillo y modificación al procesocomercial.

2.2.2.1 Obtención del extracto acuoso de Tomillo

Para la obtención del extracto acuoso de tomillo se siguió el procedimiento descrito por

la patente No. 5,908,650 de Lenoble (1999). Las hojas secas de tomillo (1 kg) se colocaron en

17 L de agua bidestilada, y se mantuvieron en ebullición a una temperatura de 95ºC durante un

periodo de 8 horas, bajo agitación continua y manteniendo el volumen de agua constante.

Posteriormente se dejó enfriar a temperatura ambiente y se separaron los sólidos por filtración

con tela Miracloth (EMD Biosciences Inc., Darmstadt, Alemania). Se ajustó el pH del extracto a

2 con HCl 12 M. Dicho extracto se centrifugó a 6300 rpm por 24 minutos a 4ºC en una

centrífuga Beckman modelo AVANTI J-25 I (Fullerton, CA., E.U.A.). El líquido decantado se

filtró con vacío a través de membranas Millipore de 5µm (Bedford, MA., E.U.A.). La solución

filtrada se pasó por columnas de C-18 Sep-Pak (Waters Co., Milford, MA., EUA.) con

capacidad de 20 mL y 5 g de adsorbente, para retener los compuestos fenólicos del extracto.

Dichas columnas fueron activadas previamente con dos volúmenes (40 mL) de metanol grado

HPLC con 0.01% v/v HCl 12 M y posteriormente con dos volúmenes de agua grado HPLC con

0.01% v/v HCl 12 M. Los compuestos adsorbidos en la columna C-18 fueron lavados con dos

volúmenes (40 mL) de agua ácida, en la concentración antes mencionada. Se pasó aire

aproximadamente por un minuto a través de la columna para secar el agua y por último los


29

compuestos fenólicos se eluyeron de la resina C-18 con 10 mL de metanol acidificado grado

HPLC. Los extractos metanólicos resultantes se sometieron a evaporación a presión reducida

en un rotavapor Büchi (Flawil, St. Gallen Canton, Suiza) a 45°C y –25 in Hg para eliminar el

solvente orgánico. Al final se agregó un 10 % de metanol para facilitar la disolución del extracto

en el agua residual. El producto acuoso final se almacenó a –86ºC para su posterior utilización.

2.2.2.2 Modificación del proceso de extracción comercial

Para el fraccionamiento del extracto de tomillo se emplearon dos tipos de

intercambiadores aniónicos marca Supelco, una resina débil Diaion® WA30 (identificada en lo

sucesivo como WA30) con grupo funcional alquilamina tipo RxNH3OH, donde Rx es la matriz

polimérica de la resina y otra resina Diaion® PA308 (identificada en lo sucesivo como PA308)

con grupo funcional benciltrimetilamina tipo RxNR3OH. Ambas fueron previamente hidratadas

con agua bidestilada por 15 minutos, y activadas con solución reguladora de fosfatos pH 6.5,

I=0.05 con agitación constante durante 30 minutos. Se cargaron dichas resinas en columnas

de polipropileno de 1.5 mL con 1.3 g de resina hidratada y activada. Se realizó una dilución de

5 g del extracto de tomillo en 50 mL de buffer de fosfatos pH 6.5, I=0.05 y se pasaron 6 mL a

través de cada columna por acción de la gravedad en un flujo promedio de 4 mL/min, el

efluente se colectó para ser empleado en los sistemas de copigmentación (esquema general

en la Figura 2.1). La determinación de la concentración de fenólicos en dichos extractos, antes

y después del tratamiento se describe en la siguiente sección. El proceso de regeneración de

las resinas sugerido por el fabricante, es emplear soluciones de HCl ó NaCl 1 N para la resina

fuerte y NaOH ó NH4OH 1N para la resina débil.

Figura 2.1 Esquema general de modificación de extractos de tomillo por cromatografíaaniónica. Flujo de 4 mL/min.

Extracto crudode Tomillo

Resinaaniónica débilWA30 (1.3 g)

ExtractoWA30

ExtractoPA308

6 mL 6 mL

Resinaaniónica fuertePA308 (1.3 g)


30

2.2.2.3 Caracterización espectrofotométrica de extractos fenólicos

2.2.2.3a Determinación de Fenólicos totales por el método de Folin-Ciocalteau

La determinación del contenido de fenólicos totales en los extractos de tomillo se

realizó mediante una modificación reportada por Vinson et al. (2001) del método de Folin-

Ciocalteau (Swain y Hillis, 1959). Siguiendo dicho método se adicionó a 0.1 mL de muestra, 1

mL de una dilución 1:9 en agua bidestilada del reactivo de Folin-Ciocalteau, se agitó y se dejó

reposar por 20 minutos a temperatura ambiente. Inmediatamente se realizaron lecturas de

absorbancia a 750 nm. en un espectrofotómetro marca Beckman modelo DU 650 (Fullerton,

CA., E.U.A.). La conversión de absorbancia a concentración se obtiene mediante la ecuación

de regresión de la curva de calibración efectuada con ácido gálico, los fenólicos totales se

expresan como equivalentes de ácido gálico (EAG).

2.2.2.3b Determinación del perfil de compuestos fenólicos por el método de Glories

Una determinación parcial del perfil de compuestos fenólicos presentes en el extracto

de tomillo se llevó a cabo a través del método de Glories reportado por Mazza, et al. (1999) en

el cual se mide la absorbancia de la muestra a las longitudes de onda promedio para los

diferentes tipos de compuestos fenólicos. El método consistió en colocar 0.25 mL de muestra o

estándar en un tubo con 0.25 mL de HCl 0.1 % en metanol 95 % y 4.5 mL de HCl 2 %, se

mezcló y dejó reposar por 15 minutos antes de realizar mediciones de absorbancia en un

espectrofotómetro marca Beckman modelo DU 650 (Fullerton, CA., E.U.A.) a 280 nm para

fenólicos totales, 320 nm para flavonas, y 360 nm para flavonoles. La calibración del método se

realizó empleando ácido gálico como estándar para fenólicos totales, ácido caféico para

flavonas y quercetina para flavonoles, los primeros dos preparados en soluciones de metanol

10 % y el último en metanol 100%.

2.2.2.4 Evaluación de los extractos modificados como sustratos de PPO

La medición de la capacidad de los copigmentos de actuar como sustratos de

polifenoloxidasa, fue determinada por medición espectrofotométrica de la actividad de dicha

enzima usando una modificación del ensayo descrito por Stauffer (1989) y Worthington (1993).

En una celda espectrofotométrica de 3 mL de capacidad se colocaron 2.8 mL de buffer de

fosfatos pH 6.5, I= 0.05 y 0.1 mL de la solución de copigmento a probar; esta disolución se

mantuvo en un baño a temperatura controlada a 30ºC para equilibrar su temperatura durante 5

minutos. Se utilizó un extracto de polifenoloxidasa comercial (E.C. 1.14.18.1) con una actividad

de 300 U/mL, la cual se colocó en el baño a 30ºC para equilibrar su temperatura un minuto

antes de realizar el ensayo. Se empleó un espectrofotómetro marca Beckman modelo DU 650


31

(Fullerton, CA., E.U.A.), equipado con portacelda para control de temperatura a 30ºC. La celda

fue colocada en el espectrofotómetro y se añadió 0.1 mL de la solución de enzima. Las

lecturas de absorbancia fueron realizadas a 420 nm por un periodo de 5 minutos en intervalos

de 15 segundos entre mediciones. La actividad enzimática se determinó empleando la

pendiente de la recta obtenida de las gráficas de absorbancia contra tiempo. La unidad de

actividad enzimática se definió como un cambio de 0.001 en el valor de la absorbancia por

minuto, bajo las condiciones del ensayo (Rocha y Morais, 2001).

2.2.3 Estudio 2. Evaluación de la capacidad de copigmentación de los extractos

fenólicos de tomillo en jugo de fresa.

2.2.3.1 Obtención del jugo de fresa

El jugo de fresa (Fragaria anannassa) se obtuvo a partir de fresas congeladas La

Huerta (Aguascalientes, AGS., México), adquiridas en un supermercado local. Las fresas

fueron descongeladas e inmediatamente sometidas a homogenización en una licuadora marca

Hamilton Beach 7Blend Master (Washington, NC., E.U.A.) durante 15 minutos a temperatura

ambiente. Se eliminó gran parte de la materia sólida con centrifugaciones sucesivas en una

centrífuga refrigerada marca IEC modelo Centra MP4R (Needham Heights, MA, U.S.A.),

primero durante 5 minutos a 4500 rpm y 4ºC, para eliminar semillas y material grueso,

posteriormente durante 45 minutos a la misma velocidad y temperatura.

2.2.3.1a Clarificación enzimática

Posterior a la centrifugación, el jugo de fresa crudo obtenido se sometió a clarificación

con enzimas pectinasas para eliminar la turbidez debida a la pectina en suspensión. El

protocolo NZFCH13 de Novozymes® (2003) para la depectinización de jugo de manzana, fue

empleado como guía para establecer las condiciones experimentales. Se agregaron 10µL de

extracto enzimático por mL de jugo de fresa, y se colocó en un baño de agua con temperatura

controlada a 45ºC durante 15 minutos. Los flóculos resultantes se precipitaron con ayuda de

una centrífuga IEC modelo HN-SII (Needham Heights, MA, U.S.A.), a 3500 rpm por 5 minutos y

se eliminaron por decantación. Se empleó la prueba del alcohol para corroborar la eliminación

de la pectina soluble tomando jugo clarificado (1 mL) y se agregó en tubos de ensayo con 2 mL

de isopropanol, se agitó por inversión y se dejo reposar por 4 minutos. La ausencia de

precipitado en el tubo de ensayo indica la eliminación de la pectina. Inmediatamente después

de la clarificación, el jugo se almacenó a –86ºC hasta su posterior uso para los sistemas de

copigmentación.


32

2.2.3.1b Determinación de antocianinas monoméricas totales por el método de pH

diferencial

El método de pH diferencial fue reportado por Wrolstad (1976) para la determinación

del contenido de antocianinas monoméricas basado en la transformación estructural reversible

que sufren las antocianinas con un cambio en el pH del medio. Siguiendo el protocolo del

método, se realizaron diluciones de la muestra con dos soluciones reguladoras, una de acetato

de sodio (0.4 M) de pH 4.5 y la otra de cloruro de potasio (0.025 M) de pH 1.0, con un factor de

dilución que permitiera absorbancias en un rango de 0.4 a 0.8. Se dejaron equilibrar durante 15

minutos a temperatura ambiente, se realizaron barridos espectrales para determinar la longitud

de onda de máxima absorbancia (λmax) en un espectrofotómetro marca Beckman modelo DU

650 (Fullerton, CA., E.U.A.), además se realizaron mediciones a 700 nm para corregir la

absorbancia por la turbidez para ambos valores pH. El contenido de antocianinas se calculó

utilizando el coeficiente de extinción molar y el peso molecular de la pelargonidina-3-glucósido,

antocianina presente en mayor proporción en el jugo de fresa (Anexo 1, Ec. 3 y 4).

2.2.3.1c Determinación de antocianinas por cromatografía de líquidos de alta

resolución con detector de arreglo de diodos

La caracterización y cuantificación de las antocianinas presentes en el jugo de fresa

(Fragaria anannassa L.) usado para este estudio, se realizó empleando el método descrito en

el Estudio 3 (Sección 2.2.4.1) pero a 520 nm. Como preparación de la muestra previo a la

inyección en el HPLC, se concentraron las antocianinas a partir de 6 mL de jugo de fresa

clarificado pasándolo a través una columna de C18, posteriormente se eluyeron las

antocianinas con 2 mL de metanol grado HPLC con 0.01% v/v HCl 12 M. Esta solución se pasó

a través de acrodiscos de PTFE de 0.45 µm marca Gelman (Ann Arbor, MI., E.U.A.).

2.2.3.2 Sistemas de copigmentación

De acuerdo a estudios previos (Del Follo, 2003 y Covarrubias, 2001) se decidió

formular relaciones molares de copigmento:pigmento en niveles de 0, 25, 50, 75 y 100. Estas

relaciones estuvieron basadas en la concentración de antocianinas monoméricas totales en el

jugo de fresa determinado por el método de pH diferencial y expresados como pelargonidina-3-

glucósido, así como en el contenido de fenólicos totales del extracto de tomillo, determinados

por el método de Folin-Ciocalteau, y expresados como equivalentes de ácido gálico, como se

describió previamente. Los sistemas de copigmentación fueron formulados con 3 mL de jugo

de fresa clarificado y un volumen de copigmento tal que proporcionara la relación molar antes


33

indicada de acuerdo con su concentración de fenólicos totales, y se completaron a un volumen

total de 10 mL con buffer de citratos (0.02 M) de pH 3.5 (Anexo 2).

2.2.3.3 Caracterización de la copigmentación

2.2.3.3a Propiedades espectrales

Las características espectrales de los sistemas de jugos de fresa copigmentados con

extractos de tomillo, se determinaron mediante barridos espectrales de las muestras en un

espectrofotómetro marca Beckman modelo DU 650 (Fullerton, CA., E.U.A.), determinando los

cambios hipercrómicos y batocrómicos que tienen lugar en el jugo, en un rango de 420 a 700

nm de acuerdo con el método descrito por Baranac y otros (1996). Dichos cambio se expresan

como % de incremento en absorbancia máxima y numero de nanómetros que se desplaza la

longitud de onda de máxima absorbancia (λmax) para cada muestra en relación con el jugo sin

copigmento. (Anexo 1, Ec. 1 y 2)

2.2.3.3b Método de pH diferencial

El método empleado para la determinación del contenido de antocianinas

monoméricas en los sistemas copigmentados fue el de pH diferencial, reportado por Wrolstad

(1976) descrito en la sección 2.3.1b.

2.2.3.3c Color instrumental

Las determinaciones de los cambios visuales en los jugos copigmentados se midieron

a través de los parámetros de color instrumental: luminosidad (L*), saturación de color (C*) y

ángulo de color (h*). Éstos parámetros fueron obtenidos utilizando un colorímetro Minolta

Chroma Meter CR-300 Series (Minolta Co. Ltd., Osaka, Japón) en la escala CIEL*C*h con una

fuente de iluminación D65 y un observador estándar de 10°, utilizando un plato de calibración

blanco como fondo reflejante para las celdas.

2.2.3.3d Índice de degradación, color polimérico y porcentaje de color polimérico

Los parámetros empleados para medir la degradación de las antocianinas en el jugo

de fresa fueron los reportados por Wrolstad (1976) basado en la asociación que sufren las

antocianinas monoméricas con el bisulfito conduciendo a productos incoloros, dejando a las

antocianinas poliméricas intactas. Siguiendo el protocolo reportado, se determinó el factor de

dilución que proporcionara absorbancias menores a la unidad, así como la longitud de onda de

máxima absorbancia (λmax). De acuerdo con este factor, se realizaron diluciones del jugo de

fresa en agua por duplicado. Se tomaron 2.8 mL de cada una de estas diluciones, se les


34

agregó 0.2 mL de una solución de metabisulfito de sodio 20 % p/v a una de ellas, y 0.2 mL de

agua bidestilada a la otra. Las soluciones se estabilizaron por 15 minutos a temperatura

ambiente y se determinó su absorbancia a 420 nm, λmax, y 700 nm en un espectrofotómetro

marca Beckman modelo DU 650 (Fullerton, CA., E.U.A.). Las relaciones empleadas para el

cálculo la densidad de color, color polimérico y % de color polimérico se detallan en el Anexo 1

(Ec. 5, 6 y 7).

2.2.3.4 Copigmentación con sales metálicas

Adicionalmente a los estudios de copigmentación con extractos fenólicos de tomillo, se

realizaron pruebas de copigmentación empleando soluciones de alumbre como copigmento.

Se empleó alumbre grado alimenticio (KAl(SO4)2.12H2O; McCormick, Valley, MD, E.U.A.) y los

sistemas de copigmentación se evaluaron en rangos de concentración de 0, 50, 100, 200, 400

y 600 ppm de iones aluminio. Los sistemas de copigmentación fueron formulados con 3 mL de

jugo de fresa clarificado y un volumen de solución madre de copigmento (10000 ppm) tal que

proporcionara la concentración de iones aluminio antes indicada, y se completaron a un

volumen total de 10 mL con solución reguladora de citratos (0.02 M) de pH 3.5 (Anexo 2).

2.2.4 Estudio 3. Caracterización química detallada de los extractos de tomillo por

cromatografía de líquidos de alta resolución con detector de arreglo de diodos

2.2.4.1 Método de separación cromatográfica por HPLC

Para la caracterización de los extractos fenólicos de tomillo, el sistema de separación y

detección empleado fue un cromatógrafo de líquidos de alta resolución Waters Co. (Milford,

MA., E.U.A.) equipado con detector de fotodiodos Waters 2996 y automuestreador Waters 717

plus. Como preparación de la muestra para el análisis, se tomaron 0.5 mL de extracto y se

agregaron 0.5 mL de una solución HCl 1.2 M en metanol puro grado HPLC, quedando la

solución final, aproximadamente en 75% metanol y 0.6 M de HCl; esta solución se pasó a

través de acrodiscos de PTFE de 0.45 µm marca Gelman (Ann Arbor, MI., E.U.A.). La

operación del equipo se realizó empleando las condiciones cromatográficas reportadas por Del

Pozo-Insfran y otros (2003).

En este método se emplearon dos fases móviles consistentes de agua (fase A) y

metanol 60% (fase B), ambas ajustadas a pH 2.4 con ácido ortofosfórico. La columna

empleada fue una columna en fase reversa Symmetry C18 Waters Co. (Milford, MA., E.U.A.)

de 4.6 mm x 250 mm, 5µm, con un guarda columna Novapak C18 de 5µm Waters Co. (Milford,


35

MA., E.U.A.). El programa de elución con gradiente con el que corrió el método se detalla en la

Tabla 2.1. Al final de cada gradiente de 45 minutos se estableció un gradiente en reversa de 15

minutos, para volver a las condiciones iniciales de 100 % de fase A y 0 % de fase B, el tiempo

total por corrida queda en 60 minutos. El flujo se estableció a 0.8 mL/min a lo largo de toda la

corrida (Del Pozo-Insfran, et al., 2003).

Tabla 2.1 Programa de elución por gradiente para separación cromatográfica de flavonoides1.

Tiempo (min.) Fase A (%) Fase B (%)

0 a 3 100-70 0-30

3 a 8 70-50 30-50

8 a 25 50-30 50-70

25 a 30 30-20 70-80

30 a 35 20-0 80-100

35 a 45

45 a 60

0

100

100

01(Del Pozo-Insfran, et al., 2003)

2.2.4.2 Identificación y cuantificación de compuestos fenólicos individuales

Se creó una biblioteca de espectros UV-Visible a partir de estándares comerciales

grado analítico, de los cuales se prepararon soluciones madre de 500 ppm empleando metanol

75% con HCl 1.2 M como disolvente. Posteriormente se prepararon los estándares de trabajo

para inyección en el HPLC en concentración de 50 ppm en quedando al final en un medio con

metanol 75 % y HCl 0.6 M. El método cromatográfico empleado fue el mismo que se describió

en la sección 2.4.1. Para la cuantificación se realizaron curvas de calibración por volumen de

inyección en un rango de 12.5 a 250 partes por millón. Los estándares empleados fueron ácido

rosmarínico, luteolina, kaempferol, quercetina, hesperidina, miricetina, catequina, epicatequina,

ácido clorogénico, apigenina, ácido caféico, ácido ellágico, ácido vainíllico, ácido gálico,

naringina, naringenina, ácido p-hidroxibenzoico, ácido protocatechuico, ácido p-cumárico,

rutina, así como estándares de las antocianinas pelargonidina-3-glucósido, cianidina-3-

glucósido, malvidina-3-glucósido, petunidina-3-glucósido, peonidina-3-glucósido y delfinidina-3-

glucósido.

2.2.4.3 Procedimiento de interpretación espectros UV-Visible

La identificación de los componentes de las muestras analizadas, se realizó por tres

métodos, i) mediante comparación directa del espectro de absorción UV-Visible de cada pico

con los estándares auténticos de la biblioteca de espectros; ii) por interpretación espectral de


36

los máximos de absorción y comparación con espectros reportados en bibliografía y iii) por

tiempo de retención. Los cromatogramas obtenidos se analizaron en 3 longitudes de onda

seleccionadas de acuerdo al tipo de compuestos de interés, 280 nm para ácidos fenólicos, 335

para flavonas y 380 para flavonoles.

2.2.5 Análisis Estadístico

La modificación del extracto por medio de cromatografía aniónica se llevó a cabo por

triplicado en columnas separadas. El diseño experimental para la evaluación de la

copigmentación fue generado utilizando cinco relaciones molares copigmento/pigmento (0, 25,

50, 75 y 100) y tres tipos de extracto de tomillo (Crudo WA30 y PA308). Las diferencias en la

concentración de cada compuesto específico se calcularon usando los datos recolectados para

cada longitud de onda. El análisis estadístico de la información generada se llevó a cabo

utilizando el paquete estadístico JMP versión 5.0 (SAS Institute Inc. Cary, NC., EUA.)

mediante el análisis de varianza (ANOVA), y la separación de medias se llevó a cabo utilizando

la prueba de LSD (p<0.05). Además se evaluaron las correlaciones de Pearson entre las

concentraciones de cada compuesto identificado en los extractos y las variables de respuesta

de cambio hipercrómico, cambio batocrómico y actividad enzimática. Todos los tratamientos y

análisis se llevaron a cabo por triplicado

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

37

2.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Como resultado del tratamiento del extracto de tomillo con las dos resinas aniónicas,

se obtuvieron dos nuevos extractos (WA30 y PA308), los cuales se sometieron a una

caracterización espectrofotométrica en el primer estudio de este proyecto para determinar el

efecto de dicho tratamiento sobre la composición fenólica de los extractos. Una vez evaluado el

efecto de las resinas aniónicas sobre los perfiles fenólicos los tres extractos fueron sometidos a

pruebas en un segundo estudio, para determinar su capacidad de copigmentar jugo de fresa e

incrementar la estabilidad de las antocianinas del mismo. Por último, con la intención de

elucidar los cambios en la composición química de los extractos causados por el tratamiento

con resinas aniónicas, se llevó a cabo un tercer estudio, en el cual se llevó a cabo un análisis

detallado por HPLC-PDA para la identificación y cuantificación de los principales componentes

de los extractos. Esto último con el objetivo de explicar las diferencias encontradas en sus

propiedades de copigmentación y capacidad de servir como sustratos de PPO.

Estudio 1. Obtención del extracto acuoso de tomillo y modificación al proceso comercial

De acuerdo con el procedimiento descrito en la patente No. 5,908,650, como resultado

de la evaporación del metanol, se obtuvo un extracto de tomillo de alta viscosidad, debido al

contenido de agua residual de las operaciones de lavado en el procedimiento de extracción en

fase sólida con columnas de C18. Se obtuvieron un total de 100 mL del extracto crudo con un

peso de 128.8 g de fuerte olor pungente y color café oscuro, que representa un 12.9 % en peso

con respecto al material vegetal de partida. La materia prima de la que se partió se obtuvo a

granel, lo cual introduce la dificultad de certificar su origen y conocer la variedad de Thymus

vulgaris que se empleó, así como de las condiciones de crecimiento de la planta, las cuales se

sabe, influencian el contenido de ciertos compuestos en la especie. Por esta razón se empleó

un solo lote de especie, adquirida en un supermercado local, para la obtención del extracto

para todo el estudio, y evitar así el efecto de la variabilidad de la materia prima. El primer

análisis realizado al extracto, fue su contenido de fenólicos totales, resultando una

concentración de 0.6464 M ± 1.88 expresados como equivalentes de ácido gálico (EAG). Una

caracterización parcial de la distribución de compuestos fenólicos en el extracto de tomillo se

realizó mediante el método de Glories (Mazza, et al. 1999), dando como resultado el perfil de

compuestos reportado en la Tabla 2.2.


38

Tabla 2.2 Perfil de compuestos fenólicos del extracto acuoso de tomillo (Thymus vulgaris) deacuerdo con el método de Glories1.

Concentración (Molal)2

FenólicosTotales3 Flavonas4 Flavonoles5

Extracto deTomilloCrudo 1.296 ± 0.0216 0.526 ± 0.008 0.233 ± 0.004

1Reportado por Mazza, et al. (1999). 2Concentración expresada en moles de equivalentes por kilogramo de extractoobtenido. 3Expresados como equivalentes de ácido gálico. 4Expresados como equivalentes de ácido caféico.5Expresados como equivalentes de quercetina. 6Error estándar calculado a partir de tres mediciones.

Para la determinación de fenólicos totales se empleó el método de Folin-Ciocalteau

como un parámetro más exacto que el barrido espectral efectuado por el método de Glories,

debido a que por tratarse de una mezcla rica en componentes, la concentración estimada a

través de dicho método resulta más alta, esto es debido a la absorbancia proveniente de

compuestos no fenólicos en ese rango de longitud de onda. Por lo anterior, este método solo

puede ser empleado como una estimación primaria de la distribución de compuestos fenólicos

en una muestra. El método proporcionó información preliminar de la distribución de

compuestos fenólicos en el extracto. Las concentraciones de los tres tipos de compuestos

resultan ser mayores que las estimadas por Del Follo (2003) para tomillo, en las que se reportó

una concentración de fenólicos totales de 0.835 M, 0.288 M para flavonas y 0.142 M para

flavonoles. Esta variación puede deberse a diferencias en el método de extracción de los

compuestos fenólicos (temperatura, tiempo, agitación, etc) así como a la variabilidad de la

materia prima empleada.

Modificación al proceso comercial de obtención de extractos de tomillo

Mediante el uso de la patente comercial de Lenoble (1999), se obtienen

industrialmente extractos con las características descritas anteriormente para el tomillo, sin

embargo uno de los objetivos de este estudio, fue ir mas allá y lograr un refinamiento mayor del

contenido de compuestos fenólicos en dicho extracto mediante una modificación ó

incorporación de pasos adicionales al procedimiento descrito en la patente con el propósito de

superar limitaciones técnicas para la aplicación industrial de este tipo de aditivos.

El extracto original de tomillo (extracto crudo) fue pasado a través de una columna

empacada con una resina aniónica débil, obteniéndose una solución (extracto WA30) con un

contenido de fenólicos totales menor. De la misma forma, el contenido de fenólicos totales del

extracto crudo disminuyó al ser tratado con la resina aniónica fuerte PA308 (en adelante

extracto PA308). Los resultados se muestran en la Tabla 2.3.


39

Tabla 2.3 Contenido de fenólicos totales en extractos de tomillo crudo y modificado porcromatografía aniónica.

Extracto deTomillo

1Fenólicos Totales

(Molal)2 Error Estándar

CRUDO 0.81153

± 0,0061

WA30 0.6144 ± 0,0074

PA308 0.6992 ± 0,00101CRUDO= sin tratamiento con resina aniónica, WA30= extracto tratado con resina aniónica débil, PA308= extracto

tratado con resina aniónica fuerte. 2Expresados en moles de fenólicos totales como equivalentes de ácido gálico porkg de tomillo

3Promedio calculado a partir de tres determinaciones.

El empleo de resinas aniónicas para el fraccionamiento de extractos fenólicos para

aplicaciones en alimentos no ha sido reportado antes en un proceso comercial. Sin embargo,

había sido reportado con anterioridad por Guillén et al (1997) como una etapa de preparación

analítica de muestra. Los autores emplearon dichas resinas para el fraccionamiento de

fenólicos cargados y neutros en vino blanco como una etapa previa a su análisis por HPLC.

Uno de los factores clave para el fraccionamiento empleando este tipo de resinas de

intercambio, es la forma iónica de las especies de interés, en este caso los polifenoles

ionizables del extracto de tomillo. La activación previa de las resinas de intercambio, asegura

que la especie química del soporte se encuentre en la forma deseada, en este caso, se empleó

un buffer de fosfatos con un pH de 6.5 y fuerza iónica (I) de 0.05 para asegurar que las aminas

terciarias y cuaternarias de las resinas aniónicas se encontraran cargadas positivamente. De la

misma manera, el extracto de tomillo crudo preparado como solución base para el

fraccionamiento fue ajustado a pH de 6.5, con el fin de tener las formas disociadas de los

ácidos fenólicos e hidroxicinámicos, los cuales tienen rangos de pKa de 3 a 5 (García-Conesa,

1999).

Como se mencionó anteriormente, el empleo de las resinas aniónicas para el

fraccionamiento de los extractos de tomillo tuvo un efecto directo en la concentración de

fenólicos totales (como EAG), disminuyendo la concentración de éstos en un 24.3 % para el

caso de la resina débil WA30 y un 13.8 % para el caso de la resina fuerte PA308. El análisis

posterior de cada uno de estos extractos por HPLC-PDA permitió obtener un perfil de

compuestos fenólicos mas detallado, como se describirá en secciones posteriores. Esta

disminución en el contenido de fenólicos totales influyó en primera instancia en el cálculo de

las relaciones molares empleadas para los sistemas de copigmentación. La concentración

molar de compuestos fenólicos totales del extracto de tomillo se empleó como base para el

cálculo del volumen de copigmento necesario para alcanzar las relaciones

copigmento/pigmento establecidas para este estudio, y debido a esta disminución, fue


40

necesario incrementar los volúmenes de copigmento necesarios para alcanzar la

concentración de fenólicos requerida (Anexo 2).

Evaluación de la capacidad de los extractos de tomillo de servir como sustratos de PPO

Se ha observado anteriormente que la adición de extractos de tomillo disminuye la

degradación de antocianinas y vitamina C en jugos procesados por altas presiones con alta

actividad residual de polifenoloxidasa, debido a sus propiedades de copigmentación y

propiedades antioxidantes (Del Follo, 2003). Sin embargo, la actividad enzimática residual

sigue siendo responsable de una buena parte de la excesiva degradación que sufren las

antocianinas copigmentadas durante el procesado y almacenamiento, y esto es debido a que

algunos compuestos fenólicos presentes en el extracto crudo de tomillo actúan como sustratos

enzimáticos de la polifenoloxidasa. Debido a esta limitante, un parámetro importante medido

para cada uno de los copigmentos modificados en el presente estudio, fue su actividad frente a

enzimas como la polifenoloxidasa (E.C. 1.14.18.1) con en fin de evaluar si el tratamiento del

extracto de tomillo con resinas aniónicas tuvo efecto sobre la capacidad del mismo de servir

como sustrato de la polifenoloxidasa. Para el ensayo enzimático se emplearon sistemas

modelo de 3 mL, empleando PPO comercial en solución reguladora de pH 6.5 y un volumen

fijo de solución de copigmento crudo y tratado con resinas aniónicas, estos sistemas de prueba

se mantuvieron siempre a una temperatura de 30ºC. En la Figura 2.2 se muestra gráficamente

la variación de la absorbancia en la solución con respecto al tiempo, de la cual, tomando la

sección lineal, se desprende el valor de la pendiente para cada extracto, la cual expresa el

cambio en la absorbancia con respecto al tiempo (∆A/∆t) en seg-1. Las pendientes de estas

gráficas fueron transformadas en velocidades iniciales de formación de producto considerando

la formación de o-quinonas y empleando su absortividad molar (ε= 5x103 M-1cm-1) reportada

para soluciones reguladoras de fosfato (Stauffer, 1989) (Tabla 2.4).


41

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 10 25 40 55 70 85 100 115 130 145 160 175 190 205 220 235 250 265 280 295 310

Tiempo (seg)

Ab

sorb

anci

a @

420

nm

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

3,0

Ab

sorb

anci

a (C

AT

) @

420

nm

Tabla 2.4 Velocidades iniciales de formación de producto por la acción enzimática depolifenoloxidasa sobre extractos de tomillo y catequina.

Extracto deTomillo1

ConcentraciónMolar de Fenólicos

Totales2

Velocidad inicial deformación de producto

en µmol/min3

Error Std.de las

velocidades5

Crudo 0.0954 0.1505 b4 ± 0.0031

WA30 0.0574 0.1706 b ± 0.0042

PA308 0.0614 0.0406 c ± 0.0017

Catequina(CAT)

0.0444 0.5676 a ± 0.02481Muestras tomadas a partir de los extractos de tomillo crudo y modificado con resinas aniónicas para copigmentación.2Expresados como equivalentes de ácido gálico (EAG) en los extractos de prueba 3Expresada como µmol/minuto, yobtenido a partir de la pendiente de la gráfica de absorbancia contra tiempo, considerando la absortividad molar (ε) delas quinonas en regulador de fosfatos como 5x103 M-1cm-1 (µmol/min) y un volumen de ensayo de 3 mL. 4Los valorescon letras diferentes entre una misma columna indican que son significativamente diferentes (LSD test, P<0.05).5Obtenido a partir del promedio de tres determinaciones.

Figura 2.2 Actividad enzimática de sistemas modelo formulados con extractos de tomillo conpolifenoloxidasa (300U/mL) y catequina 5mM @420 nm, 30ºC, pH 6.5.

1Los datos de catequina están graficados en eje secundario del lado derecho 2Los valores con letras diferentes entrelíneas de tendencia indican que poseen pendientes significativamente diferentes (LSD test, P<0.05). 3 [FenólicosTotales]=0.0271M en equivalentes de ácido gálico. 4[Fenólicos Totales]=0.0205 M en equivalentes de ácido gálico.5[Fenólicos Totales]=0.0233 M en equivalentes de ácido gálico.

Catequina (CAT)1

Extracto crudo3

Extracto WA304

Extracto PA3085

Líneas de tendencia

c

b

b2 a


42

El análisis de las velocidades de formación de producto (método de las velocidades

iniciales) utilizando los diferentes extractos de tomillo como sustratos mostró que no existe

diferencia significativa entre el extracto crudo y aquel tratado con resina aniónica débil WA30,

contrario a lo que sucede con el extracto tratado con la resina aniónica fuerte, la cual presenta

una disminución del 73 % en la actividad de la enzima (Tabla 2.4). Los valores de velocidad de

formación de producto altos sugieren que la enzima dispone de mayor cantidad de sustrato, o

que dispone de los cofactores necesarios para llevar a cabo su actividad enzimática. Los

resultados obtenidos indican que la resina aniónica fuerte podría estar removiendo compuestos

que son sustratos identificados de PPO, como catequina, epicatequina, ácido caféico, ácido p-

cumárico, ácido gálico y otros (Stauffer, 1999). Otra posible explicación a este comportamiento

sería que la remoción de compuestos activadores de la enzima que pudieran haber quedado

retenidos en la resina aniónica. Con el propósito de ofrecer una explicación a lo observado se

llevó a cabo la caracterización detallada de la composición fenólica de los extractos, resultados

que se discutirán en una sección posterior.

Estudio 2. Evaluación de la capacidad de copigmentación de los extractos fenólicos de

tomillo en jugo de fresa

Una vez efectuados los tratamientos del extracto de tomillo con resinas aniónicas, y

llevados a cabo los ensayos para probar su capacidad para funcionar como sustratos de PPO

(Estudio 1), fue necesario determinar que dichos extractos, aun conservaban su capacidad

para ser empleados como copigmentos e incrementar la estabilidad de las antocianinas

presentes en el jugo de fresa. El contenido de antocianinas monoméricas en las fresas

empleadas para este estudio, determinado por el método de pH diferencial, fue de 16 mg ±

0.12 por cada 100 g de fruta, expresados como pelargonidina-3-glucósido. Este contenido de

antocianinas en las fresas empleadas para producir el jugo, se encuentra dentro del rango de

14.8-41.8 mg/100 g reportado por Wrolstad et al. (1970) para 18 variedades de fresas. La

clarificación del jugo con enzimas pectinasas eliminó el material suspendido (Figura 2.3), así

como la pectina en disolución evitando introducir errores en las determinaciones

espectrofotométricas por la turbidez del sistema, además de ser una práctica común en la

producción industrial de jugos de frutas para evitar la formación de geles que dificultan su

fluidez así como para obtener jugos translúcidos.


43

Adicionalmente se realizó un análisis de las antocianinas específicas presentes en el

jugo de fresa por cromatografía de líquidos de alta resolución y mediante el uso del detector

PDA se estableció la identidad de cada una de las especies identificadas (Figura 2.4). García-

Viguera y otros (1996) reportaron que el contenido de antocianinas en fresas, consiste

primordialmente de pelargonidina-3-glucósido, así como pequeñas cantidades de cianidina-3-

glucósido y pelargonidina-3-rutinósido. Otros autores han reportado análisis de las

Figura 2.3 Cambio en la apariencia deljugo de fresa después de la clarificación.(A) jugo clarificado con pectinasas,15minutos a 45ºC, (B) jugo sin clarificar.

A B

520 nm

1

2

3

1 2 3

Figura 2.4 Cromatograma HPLC-PDA de antocianinas presentes en jugo de fresa (Fragariaanannassa L.) a 520 nm. El espectro UV-Visible de cada pico mostrado en la parte superior delcromatograma, confirma su identidad química. Identificación de picos: (1) cianidina-3-glucósido; (2) pelargonidina-3-glucósido; (3) probable pelargonidina-3-rutinósido.

Ab

sorb

anci

a

Minutos

10.4 %

72.3 %

17.3 %


44

antocianinas presentes en jugo de fresa, y coinciden en que mas del 70 % de éstas

corresponden a pelargonidina-3-glucósido y pequeñas cantidades de cianidina-3-glucósido,

además de otros pigmentos derivados de la pelargonidina (Bakker, 1992; Sondheimer y

Kertesz, 1956; Garzón y Wrolstad, 2002). El aislamiento y caracterización de las antocianinas

del jugo de fresa empleado en este estudio dio como resultado que el 72.3 % de las

antocianinas totales del jugo de fresa corresponden a pelargonidina-3-glucósido, el 10.4 %

corresponden a cianidina-3-glucósido, mientras que el 17.3 % se trata de otro glicósido de

pelargonidina, posiblemente rutinósido como lo reportaron García-Viguera y otros (1996).

Cambios espectrales en jugos copigmentados con extractos de tomillo

De acuerdo con estudios previos sobre la estabilidad de antocianinas copigmentadas

con extractos fenólicos realizados por Del Follo (2003) y Covarrubias (2001) se formularon

relaciones molares de 0 a 100 en la copigmentación llevada a cabo con jugo de fresa. Con

base en la concentración de antocianinas del jugo de fresa empleado se calcularon los

volúmenes de copigmento que mantuvieran dichas relaciones. Los estudios de Dimitri�-

Markovi� et al. (2000) demostraron el efecto de la variación de la relación molar

copigmento/pigmento sobre las propiedades espectrales de malvidina-3,5-diglucósido

copigmentada con ácidos caféico y ferúlico, empleando como parámetros de medición la

magnitud de los cambios hipercrómicos y batocrómicos en dichos sistemas. Los cambios

hipercrómicos, son comúnmente expresados como el incremento porcentual en la absorbancia

a la longitud de onda de máxima, mientras que los cambios batocrómicos se expresan en

función del número de nanómetros que se desplaza dicha longitud de onda máxima producto

de la adición de copigmentos. Estos cambios hipercrómicos y batocrómicos, se emplearon

como variables de respuesta para determinar la capacidad de los extractos de tomillo

modificados de servir como copigmentos. Los resultados de dichas determinaciones se

muestran en la Tabla 2.5. En el caso de los cambios batocrómicos que tiene lugar en el jugo de

fresa, se observa claramente que la adición de copigmento al jugo de fresa provoca cambios

batocrómicos máximos en el nivel de 75, después del cual en el nivel de 100 no existe

diferencia significativa. Una visualización gráfica de estos resultados puede ser apreciada en el

Anexo 3. Este tipo de comportamiento de aparente saturación ha sido reportado por muchos

autores como Dimitri�-Markovi� (2000); Ansen et al. (1972); Davies y Mazza (1993); Baranac

et al. (1996); Covarrubias (2001); Del Follo (2003). Para el caso de los cambios hipercrómicos,

el comportamiento es diferente; la magnitud del cambio porcentual presentó un máximo de

saturación en el nivel 50 para el extracto crudo, en 75 para el extracto WA30 y en 100 para el

extracto PA308. Independientemente de la relación molar en la que se observa la saturación,

es en este último tratamiento con el extracto PA308 donde se observó un incremento


45

significativamente mayor en la absorbancia, lo que es altamente deseable debido a que indica

que el extracto tiene mejor capacidad de copigmentación y potencialmente mayor capacidad

estabilizante del pigmento.

Tabla 2.5 Efecto de la adición de extractos fenólicos de tomillo sobre las propiedadesespectrales del jugo de fresa (Fragaria ananassa).

RELACIÓN MOLAR COPIGMENTO/PIGMENTO1Extracto deTomillo 0 25 50 75 100

Crudo 0,0 C2 8,0 B a2 13,0 A a 13,3 A b 14,0 A b

WA30 0,0 D 8,0 C a 11,3 B a 13,7 A ab 12,7 AB bCambio

Batocromico3

PA308 0,0 D 9,3 C a 12,0 B a 15,3 A a 16,7 A a

Crudo 0,0 C 47,0 A ab 50,2 A b 30,4 B c 33,6 B b

WA30 0,0 C 32,5 B b 48,8 AB b 53,7 A b 40,2 AB bCambioHipercrómico4

PA308 0,0 E 56,8 D a 73,0 C a 98,5 B a 116,8 A a1Definido como la relación molar de la concentración de copigmento expresado en equivalentes de ácido gálico entre laconcentración molar de antocianinas en el jugo de fresa expresada como equivalentes de pelargonidina-3-glucósido.2Valores con letras minúsculas diferentes entre una misma columna indican que son significativamentediferentes, y valores con letras mayúsculas diferentes en una misma fila indican que son significativamente diferentes(LSD test, P<0.05). 3Calculado por diferencia con la λmax del jugo de fresa de nivel 0 que fue 498 nm. 4Calculado comoel incremento porcentual en la absorbancia máxima del jugo de fresa copigmentado con respecto al jugo de fresa (ensu valor de λmax), carente de extractos de tomillo.

Como se mencionó en la discusión de resultados del estudio 1 (pagina 38), la

disminución en el contenido de fenólicos totales con el tratamiento con resinas aniónicas

implicó un incremento en el volumen de copigmento necesario para alcanzar las mismas

relaciones molares copigmento/pigmento para los tres tratamientos, este incremento fue de 31

% para el copigmento WA30 y de 15 % para el copigmento PA308, a pesar de que las

concentraciones de fenólicos totales añadidos al sistema de copigmentación son equivalentes.

Este aumento en el volumen de copigmento, podría resultar en la presencia de mayor cantidad

de compuestos específicos en el sistema, debido a diferencias en la respuesta ante el reactivo

de Folin-Ciocalteau por parte de los compuestos individuales. Sin embargo, al realizar una

comparación entre los tres tratamientos, se puede ver que este incremento significativo de 116

% en la absorbancia para el copigmento PA308, no se da en el caso del tratamiento con la

resina WA30. Estos resultados indican que los cambios batocrómicos observados no pueden

ser explicados por los incrementos de volumen, debido a que se esperaría un mayor

incremento para el caso del extracto WA30 al tener mayores volúmenes de copigmento. Con

base en los resultados de la copigmentación, es evidente que el enriquecimiento de la fracción

PA308 con algún compuesto flavonoide específico, podría explicar este comportamiento. Por

otro lado, la remoción de algunos compuestos, como los ácidos fenólicos, también permitiría un

mayor apilamiento de los compuestos con estructuras planares de tipo flavonol o flavona,


46

permitiendo una mejor interacción entre las regiones con electrones π, provocando

incrementos mayores en la absorbancia de las antocianinas.

Cambios colorimétricos en jugo de fresa causados por la adición de extractos de tomillo

Además de los cambios espectrales que se describieron en la sección anterior, la

adición de copigmentos causó cambios significativos en las propiedades visuales de los

sistemas con antocianinas (Figura 2.5). Originalmente Robinson y Robinson (1931)

describieron la copigmentación como ‘el fenómeno en el cual el color de las antocianinas se

torna mas azul, mas brillante y mas estable’. Este efecto de corrimiento hacia el azul era

interpretado como una consecuencia del cambio batocrómico que afecta la banda de absorción

en el rango visible, mientras que el incremento en el color ó intensidad era el término común

para describir el subsiguiente efecto hipercrómico. Sin embargo una correcta descripción del

color, de manera objetiva, requiere de tres atributos, el ángulo de color hue (h*, ó también

llamada tonalidad cromática), la saturación de color o chroma (C*, ó también conocida como

pureza del color) y la luminosidad (L*, ó escala de blanco a negro) (Gonnet,, 1998). En la Tabla

2.6 se puede observar el efecto de la adición de extractos de tomillo sobre los valores de

colorimetría instrumental de sistemas de jugo de fresa. Estas determinaciones se realizaron en

los mismos sistemas a los cuales se les midieron sus características espectrales.

Figura 2.5 Cambios visuales causados por la adiciónde extractos fenólicos de tomillo sobre jugo de fresa(Fragaria ananassa). Las razones molarescopigmento:pigmento empleadas fueron de 0, 25, 50,75 y 100, calculadas en base al contenido deantocianinas totales, expresadas como equivalentesde pelargonidina-3-glucósido y fenólicos totales delextracto crudo expresados como equivalentes deácido gálico.

0 25 50 75 100


47

Tabla 2.6 Coordenadas de color instrumental en escala CIEL*C*h* (D65/10ºiluminador/observador) para jugo de fresa (Fragaria ananassa L.) adicionado con tres tipos deextracto de tomillo.

RELACIÓN MOLAR COPIGMENTO/PIGMENTO1Color

Instrumental4Extracto deTomillo 0 25 50 75 100

Crudo 39,1 A2 30,5 B a3 28,1 C a 26,1 D a 25,1 E a

WA30 37,5 A 28,7 B b 25,9 C b 22,0 D c 21,7 D cLuminosidad

(L*)PA308 38,6 A 28,7 B b 25,9 C b 24,2 D b 23,6 E b

Crudo 48,9 A 39,8 B a 34,8 C a 26,2 D a 22,0 E a

WA30 48,8 A 36,2 B b 28,8 C c 20,0 D b 19,4 D bSaturación de

Color (C*)PA308 50,4 A 40,5 B a 33,1 C b 26,4 D a 22,2 E a

Crudo 41,2 A 25,7 B b 22,7 C b 20,8 D b 19,7 E c

WA30 41,6 A 24,6 B c 21,5 C c 20,8 D b 20,3 D bÁngulo deColor (h*)

PA308 43,0 A 27,3 B a 24,2 C a 21,8 D a 21,2 E a1Definido como la relación molar de la concentración de copigmento expresado en equivalentes de ácido gálico, entrela concentración molar del pigmento en el jugo de fresa, expresada como equivalentes de pelargonidina-3-glucósido.2Los valores con letras minúsculas diferentes entre una misma columna indican que son significativamente diferentes(LSD test, P<0.05). 3Los valores con letras mayúsculas diferentes en una misma fila indican que son significativamentediferentes (LSD test, P<0.05). 4Los resultados se expresan como unidades adimensionales de luminosidad (L*),saturación de color (C*) y ángulo de color (h*) empleando un plato de calibración blanco como fondo reflejante para lasceldas.

La adición de extractos de tomillo con incremento gradual en la relación

copigmento/pigmento, provocó a su vez un decremento sucesivo en el valor de luminosidad

para los sistemas. Estas observaciones se deben posiblemente a la aportación que hace el

copigmento al color total del sistema, debido al intenso color café del extracto de tomillo

empleado para preparar los sistemas de copigmentación. La disminución de los valores de

saturación de color, indican una disminución en la pureza ó vividez del color, la cual puede ser

también atribuible a la aportación de color hecha por el copigmento, provocando una

disminución de dichos valores. Los estudios realizados por Gonnet (1999) mostraron un

comportamiento similar a los observados, y confirman que los cambios en la llamada

“intensidad” del color ó hipercromismo, corresponden a las variaciones que provienen de la

modificación de dos atributos del color, la luminosidad (L*) y la saturación del color (C*).

Los cambios en el valor del ángulo de color, siguen una evolución similar al de los

otros dos parámetros, con una disminución gradual que es proporcional al incremento en la

razón molar copigmento:pigmento. El ángulo de color se ubica en un círculo cromático que

corre contrario a las manecillas del reloj (Anexo 4), cuyos valores van de 0 a 360 (magenta),

con extremos de 90 para el amarillo, 180 para el verde-azul y 270 para el azul. Las tonalidades

básicas intermedias son nombradas de acuerdo a su valor de ángulo de color calculados y


48

pueden ser ubicadas en el disco de distribución de colores del espacio de color del sistema

CIELAB (Anexo 4). El valor para el ángulo de color en los tratamientos evaluados se desplazó

en promedio desde 42, en la zona del color naranja para el sistema sin copigmento, hasta

valores promedio de 20.4 en la zona de los colores rojos. La comparación entre los diferentes

extractos mostró que el extracto PA308 logró una disminución ligeramente menor del ángulo

de color, lo cual sería deseable desde el punto de vista del rendimiento del extracto, debido a

que valores menores en dicho ángulo indican que lo cambios visuales por intensificación del

color rojo, se pueden lograr con cantidades más bajas de copigmento. En general, los cambios

en el valor del ángulo de color proporcionan una mejor idea de la magnitud de los cambios

visuales que sufre el jugo de fresa con la adición del copigmento; es en cierta forma, un mejor

parámetro para describir el “resultado visual” de la modificación de las características

espectrales causadas por la copigmentación. En esta serie de tratamientos se repitió el

comportamiento observado por otros autores con anterioridad (Gonnet, 1999, Del Follo, 2003)

determinándose que a mayor cantidad de copigmento agregado, mayores fueron los efectos

globales sobre el color instrumental.

Antocianinas monoméricas totales, color polimérico y densidad de color

El método de pH diferencial, fue reportado por Wrolstad (1976) como una forma de

determinar con precisión la concentración de antocianinas monoméricas y es de gran utilidad

en la industria de alimentos, al igual que otras técnicas espectrofotométricas auxiliares como el

blanqueado con SO2 y el índice de color, empleadas industrialmente para medir la extensión de

la polimerización de antocianinas y el obscurecimiento enzimático.

Con la adición de extractos de tomillo con incremento gradual en la relación

copigmento/pigmento, se provocó a su vez un decremento sucesivo en el valor de antocianinas

monoméricas totales para los sistemas (Tabla 2.7). Este fenómeno ha sido observado en

estudios previos por Del Follo (2003) para la copigmentación de jugo de uva con extractos de

tomillo. Los sistemas de copigmentación evaluados en este estudio, sin embargo presentaron

una aparente estabilización del contenido de antocianinas monoméricas totales para el caso

del nivel de copigmentación 75 con el extracto tratado con la resina fuerte PA308. La

comparación entre resinas mostró una disminución de la concentración de antocianinas

monoméricas totales en el nivel 100 con respecto al nivel 0, de 28.6 % para el extracto crudo,

16.2 % para el extracto WA30 y 13.6 % para el extracto PA308. La formación de compuestos

por asociación de las antocianinas con moléculas presentes en los extractos podría ser una

causa por la cual la cantidad de antocianinas monoméricas disminuyeron con la presencia de


49

los extractos, debido a la formación de enlaces covalentes antocianina-copigmento, los cuales

han sido reportados con anterioridad (Escribano-Bailón, et al., 1996), impidiéndose la

copigmentación y disminuyendo la concentración de antocianinas monoméricas totales en el

jugo. Las concentraciones de compuestos fenólicos, al estar en proporción mucho mayor que

las antocianinas en los sistemas de copigmentación, podrían también estar influenciando las

determinaciones espectrofotométricas si sus absorbancias están dentro del rango de la

absorbancia máxima de las antocianinas.

La densidad de color se determinó en las muestras sin tratamiento con bisulfitos ó

soluciones reguladoras, y corresponde a la suma de las absorbancias en la longitud de onda

de máxima absorbancia de las antocianinas (λmax) y en la longitud de onda máxima de los

pigmentos poliméricos (420 nm) (Tabla 2.7). Este parámetro mostró un comportamiento inverso

al de las antocianinas monoméricas totales, debido a que la adición de copigmentos en niveles

cada vez mayores, incrementó la densidad de color del sistema. Debido a que esta medición

se trata de la sumatoria de las absorbancias en el jugo de fresa copigmentado empleando

agua bidestilada como solvente, era un comportamiento predecible, encontrar densidades de

color ascendentes conforme se incrementaba la concentración de compuestos fenólicos en el

sistema, por solapamiento entre absorbancias máximas de las antocianinas o compuestos

poliméricos con componentes de los copigmentos.

El color polimérico se determinó de manera similar a la densidad de color pero

empleando los sistemas de copigmentación tratados con bisulfito, causando la decoloración de

las antocianinas presentes por un mecanismo atribuido a la formación de estructuras sulfónicas

incoloras en las posiciones 2 y 4 del catión flavilio de las antocianinas (Jackman y Smith,

1996). Con el incremento gradual en la concentración de compuestos fenólicos, provocados

por la adición de los extractos de tomillo, se incrementó también el color polimérico. Este

efecto, podría explicarse por el efecto protector que tiene sobre las antocianinas el

solapamiento π que sufren con los copigmentos, haciéndolas resistentes al blanqueado.

Además de la presencia de reacciones de asociación entre el copigmento y la antocianina, de

manera similar a lo que ocurre en la determinación de antocianinas monoméricas totales.


50

Tabla 2.7 Efecto de la adición de los extractos fenólicos de tomillo (Thymus vulgaris L.) sobrelas determinaciones de antocianinas, densidad de color, color polimérico y porcentaje de colorpolimérico del jugo de fresa (Fragaria anannassa L.).

Niveles de copigmento1Tipo deExtracto 0 25 50 75 100

Crudo 85,28 A2 78,72 B b2 73,67 C b 62,27 D b 60,89 D b

WA30 94,47 A 92,11 A a 83,71 B a 80,11 BC a 79,12 C aAntocianinasMonoméricas

Totales3PA308 94,76 A 82,04 B ab 80,77 B a 79,56 B a 81,86 B a

Crudo 1,91 E 3,10 D c 4,36 C b 5,63 B a 7,12 A a

WA30 2,14 D 3,49 C a 5,13 B a 5,79 B a 6,83 A aDensidad de

Color4

PA308 1,79 E 3,22 D b 4,41 C b 5,84 B a 7,15 A a

Crudo 0,35 E 1,02 D a 1,67 C a 2,77 B a 3,95 A a

WA30 0,37 D 1,08 C a 2,15 B a 2,47 B a 3,30 A bColor

Polimérico5

PA308 0,47 E 1,03 D a 1,75 C a 2,68 B a 3,27 A b

Crudo 18,64 E 32,81 D a 38,34 C a 49,18 B a 55,51 A a

WA30 17,08 D 30,88 C a 41,62 B a 42,71 AB b 48,37 A b% de ColorPolimérico6

PA308 26,40 C 31,90 C a 39,72 B a 45,90 A ab 45,77 A b1Definido como la relación molar de la concentración de copigmento expresado en equivalentes de ácido gálico entre laconcentración molar del pigmento expresada como equivalentes de pelargonidina-3-glucósido. 2Los valores con letrasminúsculas diferentes entre una misma columna y para una misma medición indican que son significativamentediferentes, y los valores con letras mayúsculas diferentes en una misma fila indican que son significativamentediferentes (LSD test, P<0.05). 3Expresado en equivalentes de pelargonidina-3-glucósido. 4Calculado como la suma delas absorbancias a 420 nm y a la longitud de onda de máxima absorbancia de las muestras tratadas con agua. 5

Calculado como la suma de las absorbancias a 420 nm y a la longitud de onda de máxima absorbancia de lasmuestras tratadas con bisulfitos. 6Calculado a partir de la relación de absorbancias entre las muestras tratadas conbisulfitos y muestras tratadas con agua.

Copigmentación con sales metálicas

La prueba de copigmentación con sales de aluminio da resultados desalentadores en

cuanto a su uso potencial como agente estabilizador de color en jugo de fresa. Las

coordenadas de color instrumental (Tabla 2.8) indican que como resultado de la adición

progresiva de iones aluminio, se presenta un obscurecimiento gradual del jugo, al disminuir su

valor de luminosidad. La saturación de color que sufren los sistemas es prácticamente nula, y

solo se presenta un cambio para la concentración de 100 ppm. La disminución en el ángulo de

color presentada es progresiva con relación al incremento en la concentración de iones

metálicos, sin embargo, no llega a niveles comparables con los observados para el caso de la

adición de copigmentos de tipo fenólico.


51

Tabla 2.8 Coordenadas de color instrumental en escala CIEL*C*h* (D65/10ºiluminador/observador) para jugo de fresa (Fragaria ananassa L.) adicionado con ionesaluminio.

CONCENTRACIÓN1

Color Instrumental3 0 100 200 400 600

Luminosidad (L*) 43,48 a2 42,28b 41,38c 40,20d 39,69d

Saturación de Color (C*) 51,8 c 55,8 a 53,4 b 53,5 b 52,7 bc

Ángulo de Color (h*) 49,7 a 48,4 b 46,7 c 46,2 d 45,5 e1Definido como la concentración en partes por millón de iones aluminio en solución. 2Los valores con letras diferentesen una misma fila indican que son significativamente diferentes (LSD test, P<0.05). 3Los resultados se expresan comounidades adimensionales de luminosidad (L*), saturación de color (C*) y ángulo de color (h*) empleando un plato decalibración blanco como fondo reflejante para las celdas.

Peculiarmente los cambios batocrómicos observados en la soluciones de jugo de

fresa-copigmento con iones aluminio, presentan retrocesos en el valor de longitud de onda de

máxima absorbancia (λmax), en relación con el valor de λmax en el jugo de fresa con iones

aluminio, este comportamiento indica que este tipo de copigmento provoca corrimientos de la

longitud de onda máxima hacia la zona azul del espectro visible, que es el lado opuesto del

espectro con respecto a la longitud de onda de los colores rojos. Sin embargo esta diferencia

no llega a ser significativa entre los niveles probados (Tabla 2.9). La magnitud de los cambios

hipercrómicos es comparable con la provocada por la adición de copigmentos de tipo fenólico,

sin embargo, como se pudo ver en los resultados del análisis colorimétrico, los cambios

visuales que sufren los sistemas son mínimos.

Tabla 2.9 Efecto de la adición de iones aluminio sobre las propiedades espectrales del jugo defresa (Fragaria ananassa L.).

CONCENTRACIÓN1

0 100 200 400 600

CambioBatocromico3

0,0 a2 -2,0 a -1,0 a -0,7 a -2,3 a

CambioHipercrómico4

0,0 d 55,2 c 76,5 b 89,1 a 93,6 a1Definido como la concentración en partes por millón de iones aluminio.2Valores con letras diferentes entre una mismafila indican que son significativamente diferentes (LSD test, P<0.05). 3Calculado por diferencia con la λmax del jugo defresa de concentración 0 que fue 498 nm. 4Calculado como el incremento porcentual en la absorbancia máxima deljugo de fresa copigmentado con respecto al valor de λmax del jugo de fresa de concentración 0, carente de copigmento.

El comportamiento observado en el jugo de fresa copigmentado con soluciones de

aluminio puede explicarse considerando del mecanismo propuesto para este tipo de

asociaciones entre las antocianinas y los iones metálicos. Elhabiri y otros (1997), sugieren que

una copigmentación efectiva con iones metálicos implica la intervención de grupos hidroxilo en

posición orto en el anillo B de la antocianina, los cuales actúan como donadores de pares

electrónicos para una reacción de formación de un complejo denominado metalocianina. Esta


52

reacción de acomplejamiento es un proceso suficientemente estable para inducir cambios de

color de rojo hasta el púrpura, los cuales se deben a la conversión de las formas incoloras de

las antocianinas en un quelato colorido, en el cual los pigmentos adoptan una estructura

quinoidal. Este mecanismo propuesto explica el poco poder de copigmentación que la solución

de iones aluminio tiene sobre las antocianinas del jugo de fresa, debido a que como se

muestra en el análisis HPLC-PDA realizado al jugo (Figura 2.4), casi el 90 % de las

antocianinas presentes son derivados de pelargonidina, la cual carece de hidroxilos en

posición orto requeridos para una copigmentación efectiva con iones metálicos. Los cambios

observados por la adición de iones aluminio en los sistemas de copigmentación, fueron

debidos al efecto de los iones metálicos sobre los derivados de cianidina presentes, la cual si

posee hidroxilos en posición orto, sin embargo, estos cambios son poco perceptibles por efecto

de su concentración.

Estudio 3. Caracterización química detallada de los extractos de tomillo por

cromatografía de líquidos de alta resolución con detector de arreglo de diodos (HPLC-

PDA)

Con el objetivo de poder justificar los resultados obtenidos en los dos estudios

anteriores, en donde se comparó la respuesta de los tres extractos tanto para copigmentar

como en los ensayos de actividad enzimática de PPO, se llevó a cabo la caracterización

química de los extractos de tomillo por medio de cromatografía de líquidos de alta resolución

con detector de arreglo de diodos. Esto con el fin de determinar los cambios sufridos por efecto

del tratamiento con las resinas aniónica fuerte y aniónica débil con respecto al extracto de

tomillo sin tratar. Como resultado de los dos estudios anteriores, se determinó que hubo una

disminución considerable en la actividad enzimática del extracto de tomillo tratado con la resina

PA308, así como una notable capacidad de dicho extracto para provocar cambios espectrales

y colorimétricos importantes en jugo de fresa en comparación con los respectivos extractos

crudo y aquel tratado con resina WA30. Los resultados obtenidos de este tercer estudio de

caracterización le arrojarán una posible explicación a estos cambios.

La determinación de la composición química de los extractos de tomillo, se llevó a

cabo empleando el método descrito en la sección de materiales y métodos, en el cual se

emplea un gradiente de polaridad descendente y con solventes acidificados a pH 2.4 con el fin

de lograr una separación de los componentes de la compleja mezcla por un equilibrio de

afinidades entre la fase estacionaria (columna empacada con resina C18) y la fase móvil cuya

polaridad cambia con el tiempo. La ventaja del empleo del detector de arreglo de diodos es la


53

posibilidad de obtener un barrido de longitudes de onda a través del tiempo, además de las

lecturas de absorbancia contra tiempo.

El extracto de tomillo, una vez sometido a tratamiento con las resinas aniónicas, se

trató como se describe en la sección 2.4.1 de materiales y métodos previamente a la inyección

en el equipo de separación cromatográfica. Las áreas recolectadas se cuantificaron en

equivalentes de tres estándares comerciales, para las tres longitudes de onda seleccionadas.

Se utilizó 280 nm para la identificación y cuantificación de ácidos fenólicos, 335 nm, para las

flavonas y 380 nm para los flavonoles (Markham, 1982). Los resultados en partes por millón

(ppm) se expresaron como equivalentes de ácido gálico, equivalentes de luteolina y

equivalentes de quercetina, respectivamente. En la Figura 2.6 se muestra el cromatograma

obtenido para el análisis del extracto del tomillo crudo a las tres longitudes de onda

mencionadas.

Para la identificación de los picos cromatográficos, y asignación de identidad química

tentativa, se emplearon tres métodos, por comparación directa con los espectros de la

biblioteca de fenólicos creada para este estudio (Método A), por comparación de espectros de

cada pico, con los espectros reportados en bibliografía (Método B), así como por comparación

de los tiempos de retención para cada pico con los tiempos de retención de los compuestos de

la biblioteca de fenólicos (Método C). La coincidencia en los tres métodos de identificación,

incrementa al certeza de la identidad tentativa reportada en la Tabla 2.10. Cabe mencionar que

la identificación de todos los componentes de la mezcla no fue posible debido a que algunos

de los picos presentan solapamiento de varios espectros de absorción, indicando que se trata

de mas de un compuesto eluyendo al mismo tiempo de retención, dicha co-elución no permite

identificar los máximos de absorbancia para los compuestos individuales. La Tabla 2.10

muestra los valores de longitud de onda de máxima absorbancia de los espectros PDA para

cada uno de los picos empleados en su identificación. La asignación de la identidad también

consideró la comparación de dichos valores con máximas reportadas en literatura, y la

interpretación de los cambios en el espectro de absorción causados por sustituyentes

específicos. Los cambios en el patrón de hidroxilación en esqueletos hidrocarbonados

similares se ven reflejados en el desplazamiento de las bandas de absorción de los

compuestos (Robards, et al. 1999).


54

Como guía general, Markham (1982) reporta una serie de lineamientos para elucidar la

identidad química a partir de la interpretación del espectro UV-Visible, partiendo de una

primera clasificación del compuesto desconocido en uno de los grandes grupos en los que se

subdividen los compuestos fenólicos (Figura 1.4). Como se puede notar en la tabla de

identificación (Tabla 2.10), algunos de los compuestos se repiten, en ocasiones mas de una

vez, esto se debe a la presencia de formas glicosiladas de los compuestos. Los tiempos de

retención resultan siempre menores en glucósidos debido al aumento de la polaridad de la

molécula, lo que los hace tener menos afinidad por los grupos hidrofóbicos de la columna C18,

y por lo tanto pasan a una mayor velocidad a través de ella.

Figura 2.6 Cromatograma HPLC-PDA del extracto de tomillo crudo recolectado a treslongitudes de onda. (A) 280 nm; (B) 335 nm; (C) 380 nm. Identificación tentativa de picos: (1)glicósido de apigenina ó kaempferol-3,7-O-glucósido; (2) compuestos co-eluyendo; (3)Apigenina-8-C-glucósido; (4) Naringenina; (5) Apigenina glicosilada en anillo B; (6) Apigenina;(7) Luteolina glicosilada en anillo A; (8) Posible flavona; (9) Hesperetina; (10) Probable di-glicósido de 17; (11) Derivado de ácido rosmarínico; (12) Desconocido, probable co-elución;(13) Naringenina; (14) Luteolina; (15) Ácido rosmarínico; (16) Glicósido de 17; (17) Posibleflavona; (18) Posible flavona.

A

1

2

3

4

5 67

8

9

10

11

12

13

14

15

16 17 18Ab

sorb

an

cia

Minutos

B

C

280 nm

335 nm

380 nm

Tabla 2.10 Identificación de picos cromatográficos en extracto de tomillo crudo por HPLC-PDA.

Número de pico (Tiempode retención, min.)1

λmax. (nm) de las bandasde absorción2 Identificación tentativa Método de identificación3

1 (16.5) 268.7, 349.5Kaempferol-3-glucósido ó probable 3,7-O-

glicósidoA, B

2 (17.72) 297.1, 325.1 Co-elución de dos compuestos A

3 (18.57) 216.8, 273.4, 335.2, Apigenina-8-C-glucósido A, B

4 (23.44) 216.8, 282.9, 330.4h Derivado de Naringenina A, B

5 (25,64) 268.7, 335.2 Apigenina glicosilada en anillo B A, B

6 (27.67) 268.7, 340.0 Apigenina A, B

7 (28.54) 268.7, 349.5 Luteolina sustituida en anillo A A, B

8 (29.83) 282.9, 335.2 Posible Flavona

9 (30.44) 282.9, 335.2 Hesperetina A, C

10 (32.9) 282.9, 340.0 Probable di-glicósido del pico 17

11 (33.93) 330.4 Derivado de ácido Rosmarínico A, B

12 (36.62) 287.6, 325.7 Desconocido, probable co-elución

13 (37.48) 287.6 Naringenina A, B, C

14 (38.26) 254.5, 349.5 Luteolina A, B, C

15 (39.17) 330.4 Ácido Rosmarínico A, B, C

16 (40.96) 282.9, 340.0 Glicósido del pico 17

17 (41.52) 282.9, 340 Posible Flavona

18 (43.97) 287.6, 344.7 Posible Flavona

1Número de pico asignado de acuerdo al orden de aparición en el cromatograma (Figura 2.6). 2Tomadas a partir del espectro de absorción de cadapico en el cromatograma, h=hombro. 3Método empleado para determinar la identidad de cada pico: (A) Identificación por comparación directa delespectro de absorción UV-Visible del pico con los estándares auténticos de la biblioteca de espectros; (B) Identificación por interpretación espectralde los máximos de absorción y comparación con las máximas reportadas en bibliografía (Markham, 1982; Harborne, 1989; Markham, 1989) y (C)Identificación por comparación de tiempo de retención con estándares auténticos.


56

En la asignación de la identidad química se observó que varios picos coincidieron con

el espectro de absorción reportado para la apigenina en diferentes tiempos de retención (Tabla

2.10, picos 3, 5 y 6), la presencia de formas glicosiladas para el mismo compuesto permite

este fenómeno, y las diferencias entre los espectros de estos compuestos son pequeños

desplazamientos de los máximos en alguna de las bandas de absorción, en función del anillo y

de la posición en la que se sitúa la glicosilación.

En la Figura 2.7 se muestra una comparación entre cromatogramas de los tres

extractos empleados en los estudios de copigmentación a una longitud de onda de 335 nm, fue

a esta longitud de onda en la que la mayoría de los picos mostraban un máximo de

absorbancia. Se puede apreciar que la diferencia en el perfil de los tres cromatogramas es

mínima, salvo en lo que se refiere a la altura de los picos, y por consiguiente al área de cada

uno de ellos. Como fue mencionado anteriormente, la concentración de cada uno de estos

compuestos identificados, se realizó usando un estándar comercial como equivalente para

cada corte de longitud de onda empleado; ácido gálico a 280nm, luteolina a 335nm y

quercetina a 380 nm (Tablas 2.11a y 2.11b). Las concentraciones de cada uno de los picos se

calcularon utilizando la ecuación de regresión de la calibración efectuada para cada uno de los

tres estándares.

La cuantificación de cada pico en los extractos mostró pocas diferencias significativas

para el caso de los primeros tres picos, lo que confirmó los resultados obtenidos por el método

espectrofotométrico de Folin-Ciocalteau, en el que se observó una disminución en la

concentración de compuestos fenólicos producto del tratamiento con resinas. Un punto

importante a notar son las diferencias significativas observadas para la naringenina (Tabla

2.8a, pico 4) a 380 nm, que indican que el extracto PA308 (resina fuerte) posee una mayor

concentración de este compuesto que el extracto WA30 (resina débil), aunque ambos tienen

menor concentración que el extracto crudo. Es importante recordar esta pequeña diferencia

debido a que se hará mención de ella en la discusión posterior.


57

La determinación de Hesperetina (Tabla 2.11a, pico 9) en los extractos arroja un

fenómeno interesante, que se repite para varios de los picos en el cromatograma (picos 14, 15

y 16). Se puede observar que existe una disminución significativa entre su concentración en el

extracto WA30 con respecto al extracto crudo, lo cual no sucede con el extracto PA308, esta

tendencia parece indicar que la resina aniónica está siendo selectiva en la remoción de

compuestos específicos. Estos resultados pueden visualizarse gráficamente en el Anexo 5.

Esta diferencia es importante considerarla debido a que se trata de un compuesto que se

encuentra en concentraciones que son similares significativamente en el extracto crudo y el

extracto PA308, y que sugieren que el compuesto no se ve afectado por el tratamiento con la

resina aniónica fuerte. Esto implicaría que dicha resina, es capaz de remover compuestos

específicos y aumentar la concentración relativa de ciertos compuestos con relación a otros

que si se ven disminuidos en su concentración por efecto del tratamiento.

Figura 2.7 Comparación entre cromatogramas HPLC-PDA de extracto de tomillo crudo con lostratamientos con resinas aniónicas a 335 nm. (A) Extracto Crudo; (B) Extracto resina aniónicadébil (WA30); (C) Extracto resina aniónica fuerte (PA308). Identificación de picos: (1) glicósidode apigenina ó kaempferol-3,7-O-glucósido; (2) compuestos co-eluyendo; (3) Apigenina-8-C-glucósido; (4) Derivado de Naringenina; (5) Apigenina glicosilada en anillo B; (6) Apigenina; (7)Luteolina glicosilada en anillo A; (8) Posible flavona; (9) Hesperetina; (10) Probable di-glicósidode 17; (11) Derivado de ácido rosmarínico; (12) Desconocido, probable co-elución; (13)Naringenina; (14) Luteolina; (15) Ácido rosmarínico; (16) Glicósido de 17; (17) Posible flavona;(18) Posible flavona.

A

B

C

1 2

34

5 6

78 9 10

11

12 13

14

15

161718

Minutos

Ab

sorb

an

cia

Tabla 2.11a Análisis comparativo de la composición fenólica de extractos de tomillo por HPLC-PDA.

Concentración (ppm)2Número de pico(Tiempo de

retención, min.)1Identificación tentativa

Tipo deextracto

280 nm 335 nm 380 nm

1 (16.5)Kaempferol-3-glucósido óprobable 3,7-O-glicósido

CrudoWA30PA308

80.665.6064.20

a3

bb

65.3251.2651.36

abb

47.9438.8740.97

acb

2 (17.72)Co-elución de dos

compuestos

CrudoWA30PA308

64.5345.9748.43

abb

57.1437.1536.51

abb

3 (18.57) Apigenina-8-C-glucósidoCrudoWA30PA308

413.27339.71354.59

abb

486.67391.18403.87

abb

173.76139.47147.31

abb

4 (23.44) Derivado de NaringeninaCrudoWA30PA308

2359.311957.732030.78

abb

441.44252.00370.91

aaa

33.1023.7828.47

acb

5 (25,64) Apigenina glicosiladaCrudoWA30PA308

127.31116.78120.97

abab

126.6299.04

101.66

abb

45.6534.8738.08

acb

6 (27.67) ApigeninaCrudoWA30PA308

155.91103.34106.05

abb

157.83114.8794.43

abb

56.0033.7135.14

abb

7 (28.54)Luteolina glicosilada

en anillo A

CrudoWA30PA308

290.76247.85253.47

abb

329.82267.45274.54

abb

215.90175.39183.08

abb

8 (29.83) Posible FlavonaCrudoWA30PA308

123.48128.09121.01

aaa

76.24174.99153.19

baa

155.02131.34114.74

aaa

9 (30.44) HesperetinaCrudoWA30PA308

512.91427.85441.44

abab

Tabla 2.11b Análisis comparativo de la composición fenólica de extractos de tomillo por HPLC-PDA (continuación).

1Número de pico asignado de acuerdo al orden de aparición en el cromatograma (Figura 2.6); 2Concentraciones determinadas como equivalentes deácido gálico para la determinación a 280 nm, como equivalentes de luteolina para la determinación 335 nm y como equivalentes de quercetina a 380nm. 3Los valores con letras diferentes entre una misma columna para un mismo compuesto, indican que son significativamente diferentes, (LSD test,P<0.05).

Concentración (ppm)2Número de pico(Tiempo de

retención, min.)1Identificación tentativa

Tipo deextracto

280 nm 335 nm 380 nm

10 (32.9)Probable glicósido del

pico 17

CrudoWA30PA308

242.00188.12286.59

a3

aa

118.8967.7689.03

abb

46.1829.8946.50

aaa

11 (33.93)Derivado del ácido

rosmarínico

CrudoWA30PA308

764.05480.15481.03

abb

1142.70654.17647.78

abb

100.0962.5562.06

abb

12 (36.62)Desconocido, probable

co-elución

CrudoWA30PA308

257.68167.82189.73

abb

234.52130.54136.72

abb

43.8121.5014.61

abb

13 (37.48) NaringeninaCrudoWA30PA308

319.76217.74254.16

acb

83.7657.2963.18

abb

13.126.376.77

abc

14 (38.26) LuteolinaCrudoWA30PA308

278.34261.99293.99

abba

341.20318.16360.13

abba

239.10222.30254.09

abba

15 (39.17) Ácido RosmarínicoCrudoWA30PA308

421.97365.47442.53

aba

573.03477.38604.61

aba

73.1755.4964.01

abab

16 (40.96) Glicósido del pico 17CrudoWA30PA308

224.39203.48209.71

abab

184.63159.31162.43

abb

74.9556.7157.82

abb


81.17116.94119.76

baa

41.4571.5269.36

baa

24.9917.6618.55

aaa


137.02137.51140.35

aaa

122.06106.52106.60

abb

76.7662.6147.99

aaa

1Número de pico asignado de acuerdo al orden de aparición en el cromatograma (Figura 2.6); 2Concentraciones determinadas como equivalentes deácido gálico para la determinación a 280 nm, como equivalentes de luteolina para la determinación 335 nm y como equivalentes de quercetina a 380nm. 3Los valores con letras diferentes entre una misma columna para un mismo compuesto, indican que son significativamente diferentes, (LSD test,P<0.05).


60

En cuanto al ácido rosmarínico, es notable como su derivado (Tabla 2.11b, pico 11) no

muestra diferencias entre los tratamientos con resinas aniónicas, sin embargo el ácido

rosmarínico como tal (Tabla 2.11b, pico 15) se encuentra en concentraciones

significativamente menores en los extractos pasados por la resina WA30. Sin embargo al igual

en el caso de la hesperetina, el contenido de ácido rosmarínico no es diferente entre el extracto

crudo y el pasado por la resina PA308, incluso se observa un efecto concentrador por parte de

esta última resina, que aunque no tiene significancia estadística mayor podría influir en la

capacidad del extracto de copigmentar en jugo de fresa, como se discutirá mas adelante.

El efecto selectivo de la resina aniónica fuerte (con tendencia concentradora) discutido

para el caso del ácido rosmarínico, se repite, ahora para el pico 14 (Tabla 2.11b) identificado

como luteolina, solo que en este caso, el efecto es más notorio, se observó que en las tres

longitudes de onda medidas, el extracto tratado con resina aniónica PA308 mostró una

concentración de luteolina mayor que en el extracto WA30 e incluso levemente mayor que en

el copigmento crudo de partida (Ver Anexo 5). Éste efecto selectivo no fue observado para el

caso del pico 7, que fue identificado como un derivado de la luteolina, donde solo se presentó

una disminución de la concentración por el tratamiento del extracto con resinas aniónicas. Es

notorio como este aparente efecto concentrador, no fue experimentado por las especies

identificadas como derivados glicosilados del mismo compuesto, lo que probablemente indique

algún efecto, quizá de impedimento estérico, ó de disponibilidad de cargas, ó incluso de

polaridad, en la selectividad de la resina aniónica.

El análisis comparativo de los cromatogramas por sobreposición (Figura 2.7 A, B y C),

mostró que en lo que se refiere al perfil de elución de los compuestos, las diferencias son

mínimas entre los tratamientos, e imperceptibles a simple vista, sin embargo, la cuantificación

de cada uno de estos picos, evidenció diferencias importantes. Un fenómeno que hay que

resaltar es que, en comparación con el extracto crudo, la mayoría de los compuestos en los

tratamientos presentaron una disminución en su concentración (Tabla 2.11a y b). Esto

explicaría la disminución en el valor de fenólicos totales determinados por el método de Folin-

Ciocalteau (Tabla 2.3). La excepción a este comportamiento, se presentó en algunos

compuestos con tiempos de retención altos (Tabla 2.11a y b, picos 8, 10 y 18), en los cuales

no hubo diferencias significativas entre los tratamientos en relación al extracto crudo.

Una característica importante que se pudo apreciar por comparación de las

concentraciones entre tratamientos, es que algunos de los compuestos que están identificados

como buenos copigmentos (luteolina y ácido rosmarínico), con tiempos de retención altos no


61

se vieron afectados por el tratamiento con la resina aniónica fuerte (como se mencionó

anteriormente). Lo anterior explica el porqué los extractos modificados, no pierden su

capacidad de actuar como copigmentos, sino al contrario se incrementa, comportamiento

observado en los ensayos de copigmentación (Tabla 2.5). La remoción de compuestos

específicos efectuada por las resinas, sin afectar la concentración de otros también presentes

en los extractos podría explicar este comportamiento. Al disminuir la concentración de ciertos

compuestos en el extracto, la competencia de las moléculas de copigmento por la antocianina

disminuye, dando mas oportunidad de copigmentar a moléculas con una mejor capacidad de

efectuar apilamientos π-π y de esta forma provocar cambios hipercrómicos y batocrómicos

mayores, es decir, una copigmentación más eficiente.

La aseveración anterior respecto a la competencia de las moléculas de copigmento por

la antocianina, puede ser respaldada mediante el análisis de correlación de Pearson, donde se

comprobó que la disminución en la concentración de algunos compuestos esta relacionada con

una mayor capacidad de copigmentar de los extractos. Por ejemplo el pico 13 identificado

como naringenina, ve disminuida su concentración por efecto del tratamiento con resinas

(Tabla 2.11b), esto a su vez podría estar contribuyendo al incremento en la capacidad de los

extractos para copigmentar antocianinas (r = -0.92 para cambio hipercrómico en nivel 100),

además, esta disminución en su concentración esta relacionada con la disminución de la

actividad enzimática de PPO del extracto PA308 (r = 0.89). De manera similar, el pico 10 que

no pudo ser identificado plenamente, pero que se trata de un glicósido de flavona, presenta

relaciones del mismo tipo; al disminuir su concentración, la capacidad de copigmentar del

extracto se ve mejorada (r = -0.83), a su vez que disminuye la actividad enzimática de PPO (r =

0.72).

Un comportamiento peculiar es el presentado por el pico 14, identificado como

luteolina. Se ha reportado con anterioridad que la presencia de algunos compuestos fenólicos

en sistemas con PPO puede resultar en efectos inhibitorios de la actividad enzimática

(Shannon y Pratt, 1967). La concentración de luteolina, como se mencionó con anterioridad no

se ve afectada por el tratamiento con la resina fuerte PA308, esto significa que si la luteolina

puede ejercer un efecto inhibitorio sobre la PPO, esta concentración relativamente alta en el

extracto PA308, en comparación con el extracto WA30, explicaría en parte la disminución en

actividad de PPO, la cual no se presenta con el extracto WA30. Esto aunado a la remoción de

sustratos como los dos mencionados en el párrafo anterior, y la disminución en la

concentración de fenólicos totales, explica la diferencia en actividad entre el extracto crudo y el

extracto PA308.


62

Existen compuestos que se encuentran en el punto medio de este comportamiento, ya

que son sustratos de PPO, y a su vez tienen buena capacidad para copigmentar antocianinas,

entre ellos el ácido rosmarínico (pico 15), el cual al disminuir su concentración, disminuye la

actividad de la PPO en el ensayo (r = 0.70), sin embargo, su disminución también afectaría la

capacidad del extracto para copigmentar (r = 0.58). El tratamiento del extracto con la resina

aniónica fuerte no tiene efecto sobre la concentración de este compuesto y por lo tanto no

contribuye ni a la disminución de actividad enzimática, ni al incremento en la capacidad de

copigmentar del extracto PA308.

En general, la capacidad del extracto PA308 para copigmentar mejor que el extracto

crudo y el extracto WA30 y su menor actividad en ensayos modelo con PPO, se deben a una

serie de factores combinados, entre ellos, la remoción de fenólicos totales y de compuestos

específicos que actúan como sustratos, la disminución en la competencia de los copigmentos

por la antocianina así como la presencia de compuestos que no se ven afectados por el

tratamiento con la resina aniónica y que además de servir como buenos copigmentos, podrían

estar ejerciendo efecto inhibitorio sobre la enzima.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

63

2.4 CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

La modificación del proceso comercial para la obtención de extractos fenólicos de

tomillo mediante la introducción de una etapa posterior de cromatografía aniónica, condujo a la

obtención de un extracto con mejoras sustanciales en cuanto a su capacidad de

copigmentación y de ser usado como fuente de sustratos de PPO, en comparación con el

extracto de partida.

El significativo incremento en la capacidad de copigmentación del extracto crudo al ser

tratado con la resina aniónica fuerte PA308 se debió principalmente a la selectividad de dicha

resina para remover compuestos específicos, cuya capacidad de copigmentar es menor que la

de aquellos que no se ven afectados por este tratamiento. De esta forma se logran

incrementos de hasta 117 % en los cambios hipercrómicos en relación con un 34 % logrados

con el extracto crudo.

La caracterización de los extractos obtenidos mediante cromatografía de líquidos de

alta resolución con detector de fotodiodos permitió determinar los cambios en la composición

de dichos extractos. Se logró establecer que la remoción de compuestos específicos afectó

positivamente la efectividad del extracto PA308 para copigmentar, pero también tuvo efecto en

su capacidad de ser usado como sustrato de polifenoloxidasa, debido a la disminución en la

concentración de compuestos específicos y la permanencia de compuestos que podrían

ejercer efecto inhibitorio sobre la enzima. Se piensa que los beneficios en la capacidad de

copigmentación son debidos a una disminución en la competencia entre las moléculas del

copigmento por la antocianina. Además, se pudo comprobar que el tratamiento con resinas

aniónicas, no afecta significativamente la concentración de especies con capacidad conocida

para actuar como buenos copigmentos entre ellas la luteolina y el ácido rosmarínico.

Los cambios hipercrómicos mayores se presentaron en la relación molar de 100, sin

embargo existe la posibilidad de que en relaciones molares mayores, los cambios sean aun

mayores. Un obstáculo para la aplicación de estos copigmentos en niveles altos es su intenso

olor, considero que es necesario implementar una estrategia de eliminación (o por lo menos de

disminución) de el aroma. Industrialmente son comunes las operaciones de desodorización,

especialmente en este tipo de materia prima, una etapa previa podría ser someter el tomillo

crudo a una etapa de destilación por arrastre con vapor de agua, que es un método sencillo de

remoción de aceites esenciales, los cuales además tienen valor comercial. Posteriormente

evaluar el impacto de esta operación en el copigmento.

CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES

64

Como áreas de oportunidad futuras, se recomienda evaluar la capacidad de las resinas

aniónicas empleadas para este tipo de aplicaciones y asegurarse de esta forma que no se esta

sobrepasando su capacidad química para llevar a cabo la separación cromatográfica. De esta

forma se pueden establecer condiciones de proceso adecuadas para el escalamiento

comercial de este proceso, al determinar la concentración máxima de fenólicos que la resina

puede soportar antes de saturarse por completo. Esto implicaría quizá la exploración de

nuevas resinas, con grupos funcionales diferentes con una mayor capacidad en meq./g de

resina y probar así su eficiencia y obtener extractos con nuevos perfiles fenólicos.

De la misma forma, el análisis completo del proceso de intercambio iónico implicaría

analizar la fracción de compuestos fenólicos retenidos en la resina, con el fin de diseñar una

mejor estrategia de separación, ó métodos de elución selectiva. Las soluciones de elución

recomendadas por el fabricante quizá sean efectivas para las aplicaciones para las que fueron

diseñadas estas resinas, sin embrago debido a la alta concentración de fenólicos en los

extractos, estos métodos no resultan muy efectivos. Sería recomendable probar otras

soluciones salinas ó soluciones ácidas en varios rangos de pH para seleccionar la mas

adecuada. Todo esto con el objetivo de lograr la regeneración de la resina aniónica para que

pueda ser utilizada en mas de una ocasión, y que el proceso de modificación de extractos

fenólicos con intercambiadores aniónicos sea factible económicamente.

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ANEXO

70

ANEXO 1

Caracterización Espectral y Fisicoquímica de la Copigmentación

El cambio porcentual en absorbancia (cambio hipercrómico) y el cambio batocrómico

entre los niveles de copigmentación se calculó como se indica en las ecuaciones 1 y 2

(Baranac y otros 1996).

∆%Abs. = (Ec. 1)

Cambio batocrómico = (Ec. 2)

Donde:

∆%Abs: Cambio porcentual en absorbancia de las antocianinas copigmentadas ó

cambio hipercrómico

ACλ�max: Absorbancia en la longitud de onda máxima de las antocianinas

copigmentadas.

Cλ�max: Absorbancia de los copigmentos en la longitud de onda máxima de las

antocianinas copigmentadas.

Aλ�max: Absorbancia en la longitud de onda máxima de las antocianinas sin

copigmentar.

λmax AC : Longitud de onda de máxima absorbancia de las antocianinas copigmentadas

λmax A : Longitud de onda de máxima absorbancia de las antocianinas sin copigmentar

Las antocianinas monoméricas totales (AMT), en el jugo de fresa y en los sistemas

copigmentados se calcularon de acuerdo a la ecuación 3 y 4 (Wrolstad 1976).

A= (Aλ�max – A700)pH 1.0 – (Aλ�max – A700)pH 4.5 (Ec. 3)

AMT = (Ec. 4)

ACλmax - Cλmax

Aλ�max

A x PM x FD x 1000ε x 1

λmax AC - λmax A

ANEXO

71

Donde:

A: Absorbancia total de las antocianinas

Aλ�max: Absorbancia a la longitud de onda máxima

A700: Absorbancia a 700 nm a pH 1 y pH 4.5

AMT: Antocianinas monoméricas totales en mg/L

FD: Factor de dilución

PM: Peso molecular de la antocianina de interés

ε : Absortividad molar de la antocianina de interés

Para este estudio se calcularon concentraciones como equivalentes de pelargonidina-3-

glucósido por lo que se emplearon los valores de 433.2 gr/mol y 22400 M-1cm-1 para las variables

PM y ε respectivamente.

La densidad de color, el color polimérico y el % de color polimérico se calcularon de

acuerdo a las ecuaciones 5, 6 y 7 (Wrolstad 1976).

Densidad de color = [(AA420nm – AA700) + (AAλ�max – AA700)] x FD (Ec. 5)

Color polimérico = [(SA420nm – SA700) + (SAλ�max – SA700)] x FD (Ec. 6)

% de color polimérico = (color polimérico/densidad de color) x 100 (Ec. 7)

Donde:

AA420nm: Absorbancia a 420 nm de las muestras tratadas con agua

AA700: Absorbancia a 700 nm de las muestras tratadas con agua

AAλ�max: Absorbancia en λmax de las muestras tratadas con agua

SA420nm: Absorbancia a 420 nm de las muestras tratadas con bisulfito

SA700: Absorbancia a 700 nm de las muestras tratadas con bisulfito

SAλ�max: Absorbancia en λmax de las muestras tratadas con bisulfito

FD: Factor de dilución

ANEXO

72

ANEXO 2

Sistemas de Copigmentación

Los sistemas de copigmentación de jugo de fresa con extractos de tomillo para el

Estudio 2 se prepararon en un volumen total de 10 mL empleando una dilución del copigmento

crudo (5 g en 50 mL) y los copigmentos modificados con resinas aniónicas, de acuerdo a la

siguiente esquema:

Concentración de antocianinas monoméricas totales del jugo de fresa: 0.423 M como

equivalentes de pelargonidina-3-glucósido.

Concentración de fenólicos totales del extracto de tomillo crudo: 0.0812 M

Concentración de fenólicos totales del extracto de tomillo WA30: 0.0618 M

Concentración de fenólicos totales del extracto de tomillo PA308: 0.0703 M

De acuerdo con las relaciones molares copigmento/pigmento establecidas en este

estudio de 0, 25, 50, 75 y 100 y para un volumen de 5 mL de jugo en 10 mL de dilución total,

las concentraciones de las especies involucradas quedan especificadas en la Tabla 2.12.

Tabla 2.12 Concentraciones molares necesarias de copigmento y pigmento para los 5 nivelesde copigmentación.

Concentraciones

Copigmento (M) Pigmento (M)

0,000000 2,116x10-04

0,005291 2,116x10-04

0,010583 2,116x10-04

0,015874 2,116x10-04

0,021165 2,116x10-04

Considerando las concentraciones de fenólicos totales en los copigmentos, así como el

contenido de antocianinas en el jugo de fresa, se calcularon los volúmenes necesarios para

alcanzar cada nivel de copigmentación con cada uno de los tres extractos, y se detallan en la

Tabla 2.13.

ANEXO

73

Tabla 2.13 Volúmenes de jugo, copigmento y solución reguladora de citratos necesarios paracada nivel de copigmentación con los tres extractos.

Volúmenes en mLExtracto1 Nivel2

Jugo CopigmentoRegulador de

citratos (pH 3.5)

0 5 0,000 5,000

25 5 0,652 4,348

50 5 1,304 3,696

75 5 1,956 3,044

CRUDO(0.0812 M)

100 5 2,608 2,392

0 5 0,000 5,000

25 5 0,856 4,144

50 5 1,713 3,287

75 5 2,569 2,431

WA30(0.0618 M)

100 5 3,426 1,574

0 5 0,000 5,000

25 5 0,753 4,247

50 5 1,505 3,495

75 5 2,258 2,742

PA308(0.0703 M)

100 5 3,010 1,9901CRUDO= sin tratamiento con resina aniónica, WA30= extracto tratado con resina aniónica débil, PA308= extracto

tratado con resina aniónica fuerte; concentración de fenólicos totales expresada como equivalentes de ácido gálico.2Definido como la relación molar de la concentración de copigmento expresado en equivalentes de ácido gálico entre laconcentración molar de antocianinas en el jugo de fresa expresada como equivalentes de pelargonidina-3-glucósido.

La copigmentación con sales de aluminio se llevó a cabo empleando una solución de

alumbre grado alimenticio con una concentración de iones aluminio de 10000 ppm. Se

formularon sistemas con 3 mL de jugo de fresa y 6 niveles de concentración de iones aluminio

en un volumen total de 10 mL completados con solución reguladora de citratos. Los volúmenes

de cada especie se detallan en la Tabla 2.14.

Tabla 2.14 Volúmenes de jugo, solución de aluminio y solución reguladora de citratosnecesarios para cada nivel de copigmentación.

Volúmenes en mL

Nivel1 JugoCopigmento

CrudoRegulador de

citratos (pH 3.5)

0 3 0.0 7.050 3 0,301 6,699

100 3 0,602 6,398200 3 1,204 5,796400 3 2,409 4,591600 3 3,613 3,387

1Expresado en partes por millón de iones aluminio en el sistema.

ANEXO

74

ANEXO 3

1Calculado por diferencia con el valor de λmax del jugo de fresa de nivel 0 que fue 498 nm. 2Valores con letras diferentesentre grupos de columnas indican que son significativamente diferentes (LSD test, P<0.05). 3Definidos como la relaciónmolar de la concentración de copigmento expresado en equivalentes de ácido gálico entre la concentración molar deantocianinas en el jugo de fresa expresada como equivalentes de pelargonidina-3-glucósido.

Figura 2.8 Efecto batocrómico por la adición de extractos fenólicos de tomillo sobre laspropiedades espectrales del jugo de fresa (Fragaria ananassa)

Efecto Batocrómico de la Copigmentación de jugo de fresa con extractos de Tomillo

a

a bb

a

a

abb

a

a

a

a

0,0

2,0

4,0

6,0

8,0

10,0

12,0

14,0

16,0

18,0

25 50 75 100

Niveles de Copigmentación

Cam

bio

en

λ m

ax. (

nm

)

Crudo

WA30

PA308

1

2

3

1

ANEXO

75

1Calculado como el incremento porcentual en la absorbancia máxima del jugo de fresa copigmentado con respecto aljugo de fresa (en su valor de λmax), carente de extractos de tomillo. 2Valores con letras diferentes entre grupos decolumnas indican que son significativamente diferentes (LSD test, P<0.05). 3Definidos como la relación molar de laconcentración de copigmento expresado en equivalentes de ácido gálico entre la concentración molar de antocianinasen el jugo de fresa expresada como equivalentes de pelargonidina-3-glucósido.

Figura 2.9 Efecto hipercrómico por la adición de extractos fenólicos de tomillo sobre laspropiedades espectrales del jugo de fresa (Fragaria ananassa)

bc

bab

b

b

b

b

a

a

a

a

0,0

20,0

40,0

60,0

80,0

100,0

120,0

25 50 75 100

Niveles de Copigmentación

% d

e in

crem

ento

en

ab

sorb

anci

a m

áxim

a

Crudo

WA30

PA308

1

2

3

ANEXO

76

ANEXO 4

Colorimetría Instrumental

La escala CIELAB toma su nombre del espacio de color que usa para describir la

localización tridimensional precisa de un color, dentro de un espacio de color visible. CIE son

las siglas de Commission Internationale de l’Eclairages un organismo internacional de

científicos del color que establecen estándares para comunicar información relativa al color de

manera precisa. El parámetro L describe la luminosidad relativa; a representa un punto entre la

escala de rojo a verde; y b representa un punto entre la escala de amarillo a azul.

Los colores se pueden describir y localizarse en el espacio de color usando un método

alternativo especificando sus coordenadas L* C* y h* en el cual L toma los mismos valores que

en el espacio LAB, mientras que C* y h* se calculan de acuerdo a los valores de a y b por

medio de las ecuaciones 8 y 9.

C* = √(a2 + b2) Ec. (8)

h* = arctan(b/a) Ec. (9)

L* representa la coordenada en luminosidad, al igual que en la escala Lab; C*

representa el croma ó saturación de color, la distancia perpendicular del eje L; y h* ó ángulo de

color (hue) expresado como ángulo en el plano formado por los ejes a y b (Figura 2.10). En la

Figura 2.10 Espacio de color CIELAB. (Gonnet, 1998)

ANEXO

77

Figura 2.11 se muestra un ejemplo de la distribución de tonalidades de acuerdo a su valor de

ángulo de color para un determinado valor de luminosidad.

Figura 2.11 Disco de tonalidades de acuerdo a su valor de ángulo de color (hue).

ANEXO

78

ANEXO 5

1Picos asignados de acuerdo a su aparición en el cromatograma (Figura 2.6). 2Expresado enpartes por millón. 3Los valores con letras diferentes entre columnas para un mismo compuesto,indican que son significativamente diferentes (LSD test, P<0.05).

Figura 2.12 Modificación en la concentración de cuatro compuestos por efecto del tratamientocon resinas aniónicas.

0

100

200

300

400

500

600

HESPERETINA LUTEOLINA AC. ROSMARINICO GLICÓSIDO DE 17

CRUDO

WA30

PA308

1

a

b ab

ab ab

a

a

a

b

b

ab

2

3

instituto tecnolÓgico y de estudios superiores de … · 2.2.4.3 procedimiento de interpretación...

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