instr tecnicas 6 - embrapa · a construção de uma matriz de substituição pam co-meça, como no...

InstruçõesTécnicas ISSN

Dezembro, 2001Campinas, SP

6

Entendendo e Interpretando

os Parâmetros Utilizados

por BLAST

O advento da tecnologia de obtenção rápida de se-qüências de DNA, em meados dos anos 70, provo-cou uma explosão de informações sobre seqüênciasbiológicas (Altschul et al., 1994). Desde então, o nú-mero de seqüências têm aumentado a uma veloci-dade cada vez maior, principalmente com osurgimento dos projetos Genoma, que visam obteras seqüências de todos os genes de um organismocompleto. A maioria destas seqüências encontram-se organizadas em forma de bancos de dados, mui-tos de acesso público tais como Genebank (TheNational Center For Biotechnology Information,2001b) e EMBL (European Molecular BiologyLaboratory, 2001) para DNA, Swiss Prot (SwissInstitute of Bioinformatics, 2001) e PIR (MunichInformation Center for Portein Sequences, 2001) paraproteínas. Cabe observar que o termo banco de da-dos, aqui, refere-se apenas a um conjunto usualmen-te grande de seqüências catalogadas e as respectivasanotações, não existindo qualquer vínculo com Siste-mas Gerenciadores de Bancos de Dados (SGBDs).

Atualmente, esses bancos de dados constituem-seem ferramenta de trabalho essencial para biologis-

Roberto Hiroshi Higa1

tas moleculares. Isto porque, baseado na observa-ção de que genes ou proteínas com seqüências simi-lares ou com regiões similares têm grande chancede possuírem funções similares, as primeiras infor-mações para determinação da função de um gene,cuja seqüência foi recentemente obtida, quase sem-pre são obtidas pela busca de similaridades entre anova seqüência e seqüências de proteínas ou famíli-as de proteínas conhecidas (Altschul et al., 1990).

Entretanto, para que essa tarefa de busca de seqüên-cias similares possa ser efetivamente realizada é ne-cessário que os biologistas moleculares tenham à suadisposição uma ferramenta computacional que osauxiliem. Neste sentido, diversos algoritmos parabusca em banco de dados de seqüências foram cria-dos. Abordagens baseadas em algoritmos de progra-mação dinâmica, tais como o algoritmo de Smith-Waterman (Durbin et al., 1998; Setubal & Meidanis,1997) são proibitivos devido ao custo computacional.Isto, então, levou ao desenvolvimento de métodosheurísticos para esta tarefa, tais como BLAST eFASTA (Altschul et al., 1990; Altschul et al., 1997).

1 Mestre em Engenharia Elétrica, Pesquisador da Embrapa Informática Agropecuária, Caixa Postal 6041, Barão Geraldo –13083-970 – Campinas, SP. ([email protected])

Entendendo e Interpretando os Parâmetros Utilizados por BLAST2

BLAST – Basic Local Alignment Search Tool é, hoje,o método mais utilizado para realizar buscas de se-qüências similares em bancos de dados de seqüên-cias, sendo que suas implementações mais conheci-das são a do NCBI – National Center for BiotechnologyInformation e o da University of Washington, conhe-cido como WU-BLAST.

O BLAST oferecido pelo NCBI é, na verdade, umafamília de serviços, onde o usuário possui diversasopções, dependendo da seqüência de entrada, se elaé constituída de nucleotídeos ou aminoácidos, se obanco de dados alvo é de nucleotídeos, aminoácidosou está restrito a um tipo de organismo, além dosparâmetros relacionados ao algoritmo de busca.

Uma vez que nem sempre estes parâmetros são deentendimento direto, nesta instrução alguns aspec-tos relacionados à teoria que suporta BLAST sãoapresentados, visando proporcionar uma melhor uti-lização deste método através do melhor entendimen-to dos parâmetros envolvidos.

O Método BLAST para Determinação

de Similaridades entre Seqüências

Biológicas

BLAST é uma heurística que tenta privilegiar a efi-ciência computacional ao mesmo tempo em queotimiza uma medida de similaridade específica(Altschul et al., 1997). Para que as heurísticas utiliza-das no algoritmo de busca de BLAST possam serentendidas, é preciso que alguns conceitos e resul-tados da teoria estatística que suporta BLAST sejamapresentados.

Score e matrizes de substituição

Para que seja possível estabelecer um alinhamento,buscando similaridades, entre duas seqüências é pre-ciso que um esquema de score seja estabelecido. Adiscussão que se segue considera apenas esquemasde score utilizados para comparação de proteínas,uma vez que os esquemas para comparação de DNAsão mais simples, e está baseada no exposto em(Ewens & Grant, 2001).

Ao alinhar duas seqüências de aminoácidos, deseja-se que um par alinhado (um aminoácido de cada se-qüência) contribua para o score total do alinhamen-

to com um score tanto maior quanto for a probabili-dade de se encontrar essa substituição em seqüên-cias biologicamente relacionadas. A abordagem uti-lizada em comparação seqüenciais de proteínas é autilização de matrizes de substituição, sendo que asduas matrizes de substituição mais utilizadas sãoconhecidas como PAM e BLOSUM.

Determinação de Matrizes

de Substituição BLOSUM

A construção de uma matriz BLOSUM (BLOcksSUbstitution Matrices) começa com a obtenção deum conjunto de seqüências protéicas oriundas debases de dados públicas e que foram agrupadas emfamílias. Daí, seguem-se os seguintes passos:

� a partir dessas seqüências, são extraídos blocosde seqüências alinhadas, onde blocos são ali-nhamentos sem gap de uma região altamenteconservada da família protéica. Observe quepara obter o alinhamento múltiplo é necessárioutilizar um esquema de score. Como isto é exa-tamente o que se pretende, nesta fase é atribuí-do score 1 para um par alinhado constituído domesmo aminoácido e 0 caso contrário (matriz desubstituição unitária);

� para cada bloco, são determinados clusters deseqüências, tal que cada seqüência em umcluster possua identidade X% (ex.: 85%) parapelo menos uma seqüência naquele cluster na-quele bloco. As freqüências calculadas nos pas-sos seguintes são medidas com relação ao nú-mero de cluster e não de seqüências. A motiva-ção para este passo é o fato desejável de quecada par de seqüências em um bloco tenha umaquantidade de “distância evolucionária” equiva-lente. O valor percentual X caracteriza a matriz,de forma que dependendo do seu valor têm-sematrizes BLOSUM62, BLOSUM85, etc.;

� é medida a freqüência de ocorrência no conjun-to de blocos de cada aminoácido, denominada

⇒ fi, p/ 1 ≤ i ≤ 20.

� é medida a freqüência de ocorrência no conjun-to de blocos de cada par de aminoácidos (x,y),denominada

⇒ fxy

, p/ 1 ≤ x,y ≤ 20.

Entendendo e Interpretando os Parâmetros Utilizados por BLAST 3

� para cada par de aminoácidos, determina-se a ra-zão das probabilidades2 de ocorrência do alinhamen-to dos aminoácidos ao acaso, dado a freqüência nosblocos, pela proporção observada nos blocos

� Os scores da matriz de substituição são obtidosfazendo-se

Onde o operador ROUND faz o arredondamento do

valor passado como parâmetro.

Para compensar a utilização da matriz de substitui-ção unitária no primeiro passo do procedimento, oprocesso é repetido mais duas vezes utilizando a novamatriz de substituição.

Determinação de matrizes

de substituição PAM

Um PAM ou “Point Accepted Mutations” é a substi-tuição de um aminoácido em uma proteína e que é“aceito” pela evolução, no sentido de que na espé-cie em questão, a mutação não só apareceu, mas dis-seminou-se em praticamente toda a espécie.

A construção de uma matriz de substituição PAM co-meça, como no caso da matriz BLOSUM, pela obtençãode um conjunto de alinhamentos múltiplos de proteí-nas fortemente relacionadas arranjadas em blocos (ali-nhamento sem gap). Estes blocos são, então, utilizadospara construir um modelo evolucionário, a partir do qualos parâmetros da matriz PAM são obtidos. Os passos aserem seguidos são:

� Para cada bloco de seqüências, é construída umaárvore filogenética utilizando o método de máximaparcimônia (Setubal & Meidanis, 1997; Durbin et al.,1998; Ewens & Grant, 2001). Este algoritmo constróiuma árvore com as seqüências originais nas folhase as seqüências inferidas nos nós internos, tal que onúmero de substituições na árvore é mínimo. Asarestas desta árvore representam a mutação em umaúnica posição que relaciona as duas seqüências nosnós que ele liga. Finalmente, observe que mais deuma árvore podem resultar do algoritmo.

� Para cada bloco, a árvore filogenética correspon-dente é utilizada para fazer uma contagem do

.20,1/

y x se ,f

ff

y x se ,f

ff2

xy

yx

xy

yx

≤≤

≠

== yxp

⇒ Sxy = ROUND (- 2 log 2 (exy)), p / 1 ≤ x, y ≤ 20 .

⇒ exy

número de mutações para cada par deaminoácidos j e k da seguinte forma:

⇒ Cada aresta contribui com 1 para a mutaçãoj-k se j π k.

⇒ Cada aresta contribui com 2 para a mutaçãoj-k se k = k.

⇒ Se um bloco possui mais uma árvorefilogenética associada, as mutações sãocontabil izadas para todas as árvoresfilogenéticas e a contagem final é divididapor n, onde n é o número de árvoresfilogenéticas associadas ao bloco.

� Totalize a quantidade de mutações j-k, Ajk, paratodos os blocos.

� Definindo a quantidade

as seguintes quantidades podem ser definidas:

Note que esta equação implica em 1=∑kjkp .

Assim, se a constante c for suficientemente peque-na para que cada pjj seja não negativo, a matriz P ={Pjk} tem as propriedades de uma matriz de transi-ção de uma cadeia de Markov.

� Denotando pj como a freqüência observada doaminoácido j, considerando as seqüências asso-ciadas aos blocos, a proporção de aminoácidosque sofreram mutação após uma interação dacadeia de Markov definida pela matriz de transi-ção P é dada por:

⇒

Se a proporção de mutações esperada é fixadaem 1%, o valor de c é dado por

⇒

A matriz de transição obtida, considerando-seessa proporção de mutações esperada,corresponde a uma distância evolucionária de 1PAM e é denotada por M1. De modo geral, amatriz correpondente a uma distânciaevolucionária de n PAM é obtida pela n-ésimapotência da matriz M1 e é denotada por Mn.

� Denotando-se o elemento da matriz Mn por mjk(n),

a matriz PAMn é dada por:

∑=

m

jm

jk

A

A

.20,1/,k j se ,ca1

k j se ,ca≤≤

=−≠

= ∑ ≠

kjpjk

jk

jk

pjk

ajk

.20,1/, ≤≤= ∑ ∑∑∑ ≠≠kjpapcpp

j jkkjj

jkjk

jj

.20,1/,01.0 ≤≤=

∑ ∑kjp

apj k

jkj

c

___________________2 O termo correto, em inglês é likelihood. Quando a massa de dados é suficientemente grande seu valor aproxima-se da

probabilidade. Aqui, toma-se a liberdade de utilizar o termo probabilidade indistintamente.


.20,1/log)(

≤≤

= kjp

p

mC

k

jkn

ou, denotando q(j,k) como a probabilidade con-junta de que o aminoácido j ocorra em uma dadaposição no tempo 0 e o aminoácido k ocorranesta mesma posição n passos depois, de acor-do com a cadeia de Markov definida pela matrizM1, q(j,k) = pjmjk

(n) e

Observe que a constante C não é importante e refe-re-se à escala do score.

Resultados da Teoria Estatística de

Comparação Local de Seqüências

Seja um alinhamento entre duas seqüências protéicasde comprimento N, obtidas ao acaso. Este eventopode ser modelado como um processo aleatório de-nominado caminhada aleatória, um caso particularde cadeia de Markov e fornece a teoria de probabili-dade básica que suporta BLAST (Ewens & Grant,2001). Da análise desse alinhamento, os seguintesparâmetros estatísticos são obtidos (Ewens & Grant,2001):

� O número esperado de HSP (High-scoringSegment Pair) com score maior ou igual a umvalor específico S é estimado por:

⇒ E(S) = NKe-λS

Onde N é o comprimento das seqüências, K éuma constante obtida através de séries geomé-tricas convergentes que dependem apenas doscore s(j,k) e das probabilidades pj e p´k, as pro-babilidades de ocorrência dos aminoácidos j ek, e λ é obtida através da seguinte expressão,também dependente apenas da matriz de subs-tituição utilizada s(j,k) e das probabilidades pj ep´k. A notação pj e p´k indicam que os doisaminoácidos j e k alinhados em posição específicaforam gerados por mecanismos independentes.

⇒

� A probabilidade que, neste alinhamento, existaum HSP maior que S é dado por:

⇒ P(Y > S) = 1 – e-E(S)

Essa probabilidade é o P-value para a fdp asso-ciada a Y. Essa, por sua vez pode ser aproxima-

⇒ Sjk

.20,1/,),(

log ≤≤

= kjp

pp

kjqC

kj

⇒ Sjk

.20,1/,1´ ),( ≤≤=∑ ∑ kjpeppJ k

kjSkj

λ

da por uma fdp conhecida como Extreme ValueDistribuição (EVD) dada por (Durbin et al., 1998):

⇒

Todos estes resultados foram obtidos considerando-se um alinhamento entre duas seqüências de tama-nho fixo (N). Entretanto, BLAST manipula alinhamen-tos entre seqüências de tamanhos variáveis. Nenhu-ma teoria que estenda os resultados mencionadosfoi desenvolvida, mas diversos trabalhos de simula-ção têm mostrado sua validade, com pequenas adap-tações, para o caso geral quando as seqüências nãopossuem o mesmo comprimento (Altschul et al.,1990; Altschul et al., 1994; Ewens & Grant, 2001).Assim, as equações apresentadas podem ser rees-critas da seguinte forma:

⇒ E(S) = MNKe-λS

⇒ = 1, 1≤ j,k ≤20

⇒ P(Y > y) ≅ e (-KMNe )

Onde M e N são os comprimentos das seqüências

alinhadas.

Além disso, devido a melhoramentos nas heurísticasutilizadas por BLAST e a inclusão de tratamento paragaps nas seqüências (Altschul et al., 1997), os

parâmetros K e λ não podem mais ser obtidos ana-liticamente. Eles, agora, são estimados através de

processos de simulação executados previamente.

Com relação à probabilidade de que exista pelo me-nos um HSP com escore S ou mais, para compara-ções entre uma “seqüência query” e uma base dedados de seqüência, desde que a base de dados in-teira é D/N vezes mais longa que a seqüência de in-

teresse, a seguinte correção é aplicada:

⇒ Expect = (1 – e-E(S) )

Este valor é conhecido como Expect ou E-value e éapresentado no relatório do BLAST para avaliação

da significância do alinhamento obtido.

Finalmente, no relatório BLAST também é apresen-tado um score normalizado, denominado Bit Scoree definido da seguinte forma:

⇒ 2ln

ln´

KSS

−= λ

A relação entre o “bit score” S´e o E-value é dadopor

⇒ E = MN2-S´

)( )(

)(µλ −−≅>

xKNeeyYP

λ(x−µ)

∑ ∑J k

kjSkj epp ),(´ λ

DN


Dessa forma, ao contrário do que ocorre quando se ava-lia a significância de um alinhamento a partir do score

S, em que é preciso conhecer os valores de M, N, λ e K,conhecendo-se o “bit score” S´, é necessário conhecerapenas os valores do espaço de busca M e N.

O Algoritmo Usado por BLAST

O algoritmo utilizado por BLAST pode ser resumidonos seguintes passos (Setubal & Meidanis, 1997) ebaseia-se na idéia de que bons alinhamentos locaisprovavelmente contém pequenos segmentos de iden-tidades (Durbin et al., 1998):

� Compilar uma lista de segmentos de alto score(word no jargão de BLAST). Para proteínas, essalista é formada por todas as palavras com wcaracteres (w-mer) com score no mínimo T comalgum w-mer da seqüência query.

� Procurar por hits na base de dados (cada hitcorresponde a uma semente). Um hit é um pe-queno segmento alinhado onde cada posição doalinhamento corresponde a uma identidade (asduas seqüências possuem o mesmo aminoácidona posição correspondente).

� Estenda as sementes. Essa extensão é realizadanos dois sentidos; inicialmente era realizada semconsiderar gaps (Altschul et al., 1990), masatualmente, as extensões são feitas com gaps eo processo para estender uma semente só é dis-parado se o seu score for maior que um limiar T,ela possuir outra semente a uma certa distânciamáxima entre elas e se o score da extensão comgaps que elas geram excede a um dado limiar

Sg. (Altschul et al., 1997).

Observe que, para o cálculo dos scores, é utilizado umamatriz de substituição tal como PAM ou BLOSUM. Naverdade, diferentes versões dessas matrizes estão dis-

poníveis como parâmetro para o usuário.

Finalmente, a estratégia adotada para penalizar gapsé uma função linear do comprimento do gap.

⇒ pengap

(x) = a + bx

Onde a é o valor da penalidade pelo gap e b é a pe-nalidade por cada unidade de gap.

NCBI-BLAST

A implementação de BLAST (The National Center ForBiotechnology Information, 2001a) mais largamenteutilizada atualmente é o serviço mantido pelo NCBI.Nesta seção, apresentaremos brevemente o funcio-namento deste serviço e as várias opções disponí-

veis para o usuário.

Dependendo do tipo de busca que se queira realizar,pode-se utilizar o BLAST através de uma das seguin-tes formas:

� blastp para comparação de seqüências deaminoácidos em bancos de dados de proteínas;

� blastn para comparação de seqüências denucleotídeos em bancos de dados de DNA;

� blastx para comparação de uma seqüência denucleotídeos transladada em todos os ORFs(Open Reading Frames) com bancos de dadosde proteínas;

� tblastn para comparação de seqüência de pro-teína com um banco de dados de seqüências denucleotídeos dinamicamente transladados emtodos os seus ORFs; e

� tblastx para comparar os ORFs de uma seqüên-cia de nucleotídeos com os ORFs de todos osnucleotídeos em um banco de dados de

nucleotídeos.

Além disso, ao formular um query para busca, pode-se delimitar o espaço de busca de várias formas:

� o banco de dados a ser utilizado na busca;

� o resultado de uma query Entrez3 sobre um ban-co de dados ou

� um organismo específico.

Os formatos aceitos para especificação da seqüên-cia query compreendem:

� o formato FASTA;

� identificadores, normalmente códigos para aces-so aos bancos de dados mantidos pelo NCBIcomo o GenBank.

3 Entrez é o Sistema de recuperação e busca sobre os diversos bancos de dados mantidos pelo NCBI (The National Center ForBiotechnology Information, 2001b).

__________


� seqüências puras, que podem ou não ser inter-caladas por caracteres brancos ou numéricos.

BLAST oferece valores default para uma série deparâmetros utilizados pelo algoritmo de busca, en-tretanto todos são configuráveis pelo usuário:

� o valor de Expect a ser utilizado como valor decorte para a busca. Este é um valor importante,pois indica o nível de significância a partir doqual os resultados podem ser incluídos no rela-tório de respostas;

� o tamanho da palavra a ser utilizada nas duasprimeiras etapas do algoritmo;

� a matriz de substituição a ser utilizada e a fun-ção de penalidades para gap. Matrizes do tipoPAMn e BLOSUMn estão disponíveis para o usu-ário, sendo a matriz BLOSUM62 é a default. Esteparâmetro é importante, pois dependendo dadistância evolucionária desejada uma matrizpode ser mais adequada que outra. Observe ain-da que para a matriz PAM, maior n corresponde amaior distância evolucionária, enquanto que paramatrizes BLOSUM mantém-se a relação inversa; e

� opções para filtragem de segmentos de baixacomplexidade que poderiam levar à obtenção deseqüências que, apesar de apresentarem um altoscore e estatisticamente significativo, não pos-

suem significado biológico.

Existem ainda diversas opções para formatação do re-

latório da busca, incluindo formatos ASN.1, texto e html.

Finalmente, duas variantes importantes incorporadasao algoritmo BLAST devem ser destacadas:

� PHI-BLAST (Pattern-Hit Initiated BLAST): estavariante do BLAST utiliza uma expressão regu-lar para selecionar regiões para busca de HSP,ou seja, dada uma seqüência protéica S e um aexpressão regular P, PHI-BLAST procura por se-qüências que satisfaçam P e sejam homólogasa S na vizinhança das ocorrências dos padrões.

� PSI-BLAST (Position Specific InteractiveBLAST): esta variante realiza uma buscainterativa, onde as seqüências resultantes deuma interação são utilizadas para construção deum modelo de score específico por posição(profile). PSI-BLAST não utiliza uma matriz desubstituição, mas constrói, a cada iteração, umamatriz QxA, onde Q é o tamanho da seqüência e

A o tamanho do alfabeto (20). Além disso, a cadainteração o usuário pode remover algumas dasseqüências do conjunto de respostas dainteração anterior, bem como salvar o profilecorrente. Estudos comparativos têm mostradoque PSI-BLAST é mais sensível para detectarrelações distantes que o BLAST tradicional(Altschul et al., 1997).

Exemplo de Busca

Neste exemplo, a base de dados utilizada é a basede seqüências não redundantes de aminoácidos doGenBank (nr) e a seqüência de aminoácidos utiliza-da como query é o ORF (Open Reading Frame) cor-respondente à proteína ainda não caracterizadaMJ0577 do Methanococcus Jannaschii (The NationalCenter For Biotechnology Information, 2001c):>gi|2501594|sp|Q57997|Y577_METJA PROTEIN MJ0577MSVMYKKILYPTDFSETAEIALKHVKAFKTLKAEEVILLHVIDEREIKKRDIFXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXGIPHEEIVKIAEDEGVDIIIMGSHGKTNLKEILLGSVTENVIKKSNKPVLVVKRKNS

As posições na seqüência indicadas com “X” infor-mam ao BLAST que estas posições devem ser igno-radas durante o processo de busca. Esta região apre-senta um tipo de composição de baixa complexida-de que não é detectado pelos filtros de BLAST, um“Coiled-Coil”. O algoritmo utilizado para realizar estáanálise é o COILS (Lupas, 1997). O valor de Expectutilizado para corte foi “1”, a matriz de substituiçãoutilizada foi o BLOSUM62 e os valores para penali-dade por gap foram a=11 (para existência do gap) e

b=1(para a extensão do gap).

As Fig. 1, 2 e 3 apresentam, a representação gráfica,as seqüências ordenada por score e os alinhamen-tos entre as seqüências que retornaram da busca e aseqüência query. A partir da Fig. 1, observa-se queexistem diversas seqüências relacionadas à seqüên-cia query por um score relativamente alto. A linharosa, que se estende por toda a seqüência represen-ta a própria seqüência query. Olhando o correspon-dente alinhamento, verifica-se tratar-se de seqüên-cias associadas à determinação da estrutura daMJ0577. Os alinhamentos que se estendem por todaa seqüência representam possíveis homólogos daMJ0577 (parólogos em Pyrococcus horikoshii,Methanobacterum Thermoautotrophicum eAgrobacterium tumefaciens), sendo que à medidaque o valor do score decai (e o correspondente Expectaumenta), mais distante é a seqüência homóloga.


Observando as Fig. 2 e 3, procura-se por seqüênciasanotadas próximas à MJ057. As primeiras seqüênci-as com anotação encontradas são aquelas com en-trada no GeneBank gi|15887843 e gi|15155425, comscore 51.2 e Expect 3 e-06. Trata-se, portanto, de umalinhamento bastante significativo, o que indica quea proteína MJ057 está provavelmente associada à

família de proteínas USP (Universal stress protein).

>gi|15887843|ref|NP_353524.1| (NC_003062)

AGR_C_878p [Agrobacterium tumefaciens]

[Agrobacterium tumefaciens str. C58 (Cereon)]

gi|15155425|gb|AAK86309.1| (AE007985)

AGR_C_878p [Agrobacterium tumefaciens str. C58

(Cereon)]

Length = 160

Score = 51.2 bits (121), Expect = 3e-06

Identities = 42/158 (26%), Positives = 62/158 (38%),

Gaps = 11/158 (6%)

Query: 2 SVMYKKILYPTDFSETAEIALKHVK

AFKTLKAEEVILLHVIDER

EIKKRDIFXXXXXXXX 61

Fig. 1. Visualização gráfica do resultado de busca.

+VM+K IL PTD S A+IA+ A +V ++ V +

+ D+

Sbjct: 14

NVMFKHILIPTDGSPLAQIAIDQGFALAREAGA

KVTVVTVSEPFHVIASDV---------- 64

Query: 62

XXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXXX

XXXXXXXXXXXXXXXXXXGIPHEEIVK

IAEDEGV 121

G P E I++IA+ G

Sbjct: 65 —EDIAAIAEEEFHRCEEAEHLL

RDTQAHAAAMGLDCEALLARAGRPDEA

IIEIADRTGC 122

Query: 122

DIIIMGSHGKTNLKEILLGSVTENVIKKSNK

PVLVVKR 159

D+I M SH + + E+LLGSVT V+K S PVLV ++

Sbjct: 123

DLIAMASHRRRSFIEMLLGSVTAKVLKNSKI

PVLVYRQ 160


Fig. 2. Resultado de busca: seqüências com expect menor que o limite estipulado.


Fig. 3. Resultado de busca: alinhamentos.


Caso esta entrada não estivesse na base de dados,ou para reforçar a homologia detectada, o exame dosalinhamentos deveria prosseguir até o nível de simi-laridade (score e Expect) que se julgasse adequado.Neste caso, encontraríamos as seguintes seqüênci-as anotadas (até o l imiar onde seguramente

homologias podem ser detectadas – Expect ≈ 0.1),que reforçam a suposição de que a seqüência sobanálise pertence à família USP:

>gi|17988589|ref|NP_541222.1| (NC_003318)

Universal stress protein family [Brucella melitensis]

gi|17984389|gb|AAL53486.1| (AE009663) Universal

stress protein family [Brucella melitensis]

Length = 148


Identities = 20/51 (39%), Positives = 34/51 (66%)

>gi|13541477|ref|NP_111165.1| (NC_002689)

Nucleotide-binding protein (UspA-related)

[Thermoplasma

volcanium]

gi|14324861|dbj|BAB59787.1| (AP000993)

hypothetical protein [Thermoplasma volcanium]

Length = 150



>gi|17229756|ref|NP_486304.1| (NC_003272) Na+/

H+-exchanging protein [Nostoc sp. PCC 7120]

gi|17131355|dbj|BAB73963.1| (AP003588) Na+/H+-

exchanging protein [Nostoc sp. PCC 7120]

Length = 543

Score = 41.2 bits (95), Expect = 0.004


>gi|18313304|ref|NP_559971.1| (NC_003364)

universal stress protein family [Pyrobaculum

aerophilum]

gi|18160828|gb|AAL64153.1| (AE009873) universal

stress protein family [Pyrobaculum aerophilum]

Length = 137


Identities = 36/152 (23%), Positives = 59/152 (38%),

Gaps = 18/152 (11%)

>gi|17986386|ref|NP_539020.1| (NC_003317)

Universal stress protein family [Brucella melitensis]

gi|17981977|gb|AAL51284.1| (AE009453) Universal

stress protein family [Brucella melitensis]

Length = 149



>gi|13541547|ref|NP_111235.1| (NC_002689)

Nucleotide-binding protein (UspA-related)

[Thermoplasma

volcanium]

gi|14324932|dbj|BAB59858.1| (AP000993)

hypothetical protein [Thermoplasma volcanium]

Length = 142



>gi|15608774|ref|NP_216152.1| (NC_000962)

hypothetical protein Rv1636 [Mycobacterium

tuberculosis

H37Rv]

gi|15841091|ref|NP_336128.1| (NC_002755)

universal stress protein family [Mycobacterium

tuberculosis CDC1551]

gi|7444951|pir||B70560 hypothetical protein Rv1636 -

Mycobacterium tuberculosis (strain

H37RV)

gi|2113920|emb|CAB08889.1| (Z95554) hypothetical

protein Rv1636 [Mycobacterium tuberculosis

H37Rv]

gi|13881306|gb|AAK45942.1| (AE007031) universal

stress protein family [Mycobacterium

tuberculosis CDC1551]

Length = 146



>gi|16122525|ref|NP_405838.1| (NC_003143)

putative stress protein [Yersinia pestis]

gi|15980297|emb|CAC91106.1| (AJ414151) putative

stress protein [Yersinia pestis]

Length = 318



>gi|2507515|sp|P44195|YDAA_HAEIN Protein

HI1426

Length = 309



Para fins de ilustração, a Fig. 4 apresenta o resulta-do da busca utilizando a mesma seqüência query,mas utilizando a matriz PAM70. O Resultado é essen-cialmente o mesmo e a hipótese final criada seria amesma. Entretanto, observa-se que as seqüênciasapresentam um score menor e as similaridades en-contradas uma extensão menor, o que indica que autilização desta matriz apresenta uma sensibilidademenor, o que pode prejudicar a detecção de similari-dades mais fracas. As matrizes PAM foram utilizadascomo default por BLAST por muito tempo, mas atu-almente a matriz recomendada como default é amatriz BLOSUM62. Caso nenhum resultado signifi-cativo ser obtido, recomenda-se a utilização da ma-triz BLOSUM30.


Comentários Finais

Nesta instrução foram apresentados conceitos e resul-tados teóricos que suportam BLAST e sua utilização foiexemplificada através do serviço mantido pelo NCBI.

BLAST constitui-se, hoje, numa ferramenta de fun-damental importância para biologistas moleculares,pois permite que, no estudo de uma seqüência, se-qüências potencialmente homólogas sejam encon-tradas, fornecendo ainda medidas estatísticas para aavaliação da significância da similaridade detectada.

Entretanto, a decisão sobre se uma similaridade de-tectada representa uma homologia passa obrigato-riamente pela interpretação biológica do alinhamen-to obtido por BLAST. Assim, BLAST por si só não ésuficiente para revelar uma homologia, mas consti-tui-se num primeiro passo fundamental neste senti-do. Porisso a importância da correta interpretaçãode seus parâmetros e resultados.

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Fig. 4. Visualização gráfica do resultado de busca utilizando matriz PAM70.


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