interactions gÉnÉtiques et ÉpigÉnÉtiques des …(activation de la transcription) - l’acide...
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Manuel MARK, Institut d’Embryologie
Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et CellulaireHôpital Universitaire de Strasbourg
INTERACTIONS GÉNÉTIQUES ET
ÉPIGÉNÉTIQUES DES SUBSTANCES
TÉRATOGÈNES
Différenciation
D’après Niemann et coll., 2008, Reproduction 135: 151
MECANISME D’ACTION DES MOLECULES TERATOGENES
Renouvellement
Stress oxydatif : altérations moléculaires multiples (ADN, ARN, protéines, lipides )Ex: thalidomide…
Liaison directe à l’ADN: tératogènes génotoxiques
Modification d’une voie de signalisation Ex: ligands de récepteurs nucléaires: rétinoïdes, œstrogènes de synthèse, certains polluants environnementaux
Altération de l’épigénome- Méthylation de l’ADNEx: arsenic - Modifications post-traductionnelles des histones Directe : acide valproïqueIndirecte: acide rétinoïque
C. soucheC. souche
C. C. «« ddééterminterminééeses »»
C. C. terminalementterminalementdiffdifféérencirenciéées es
Parman et al., (1999) Nat. Med. 5: 582; Hansen et coll, 2002, J Pharmacol Exp Ther. 300:768; Knobloch et Rüther, 2008, Cell Cycle 7: 1121
La thalidomide induit la formation de radicaux libres qui perturberaient l’équilibre complexe des facteurs paracrines / de transcription impliqués dans la différenciation du membre
exacerbation de l’apoptose
EMBRYOPATHIE A LA THALIDOMIDE
Anion superoxyde
Peroxyde d’hydrogène
Radical hydroxyl
Le stress oxydatif est évoquécomme mécanisme d’action de nombreux tératogènes…incluant les rétinoïdes
Hansen, 2006,Birth Defects Research 78:293
- Codent pour des facteurs de transcription- 39 gènes chez les mammifères, regroupés en 4 complexes - Domaines d’expression colinéairesétagés le long de l ’axe antéro-postérieur(AP)- Mutations se traduisent par des transformations homéotiques = remplacement d ’une structure donnée par une autre normalement localisée à un endroit différent le long de l ’axe AP- Déterminent l’identité des régions corporels le long de l’axe AP
LE DIETHYLSTILBESTROL POURRAIT EXERCER SES EFFETS TÉRATOGÈNES EN ALTÉRANT L’EXPRESSION DES GÈNES HOX
GENES HOX
LE DIETHYLSTILBESTROL POURRAIT EXERCER SES EFFETS TÉRATOGÈNES EN ALTÉRANT L’EXPRESSION DES GÈNES HOX
L’administration de DES à la souris induit une postériorisation des domaines des gènes Hox qui sont normalement exprimés de façon étagée le long du canal de Müller (Ma et Coll., 1998 Dev. Biol.197: 141; Gaurang et coll.,2006 , Endocrine Rev. 27:331)
17β œstradiol
DES
ERα
Epigénome = ensemble des états de la chromatine permettant de moduler l’expression des gènes. Il repose sur 3 piliers : - La méthylation de l’ADN- Les modifications post-traductionnelles des histones(acétylation, méthylation, phosphorylation, ubiquitination, polyADP-ribosylation)- Les variants d’histones
TERATOGENES AGISSANT SUR L’EPIGENOME
2 molécules d’ADN identiques…
mais des marques épigénétiques différentes
LES EFFETS TÉRATOGÈNES DE L’ARSENIC, À L’INSTAR DE SES EFFETS CARCINOGÈNES/ ANTI-CANCEREUX , SEMBLENT DUS À UNE ALTÉRATION DE LA
MÉTHYLATION DE L’ADN
L’exposition à l’arsenic est associée à une hypométhylation globale de l’ADN et àune hyperméthylation de gènes spécifiques (revue dans Baccarelli et Bollati, 2009,Current Opinion in Pediatrics. 21:243)
Compaction des nucléosomes
Répression de la transcription
Smith's Recognizable Patterns of Human Malformation 5th edition, 1997
Le syndrome d’exposition à l’acide valproïque associe des anomales craniofaciales mineures et ,le cas échéant, des anomalies viscérales sévères (spina bifida ++)Di Liberti et coll., 1984, Am J Med Genet 19:473
L’ACIDE VALPROÏQUE EST TERATOGENE PAR INHIBITION DES DESACETYLASES D’HISTONES
L’ACIDE VALPROÏQUE EST TERATOGENE PAR INHIBITION DES DESACETYLASES D’HISTONES
Chromatine « fermée » Chromatine « ouverte »
Transcription du gèneEx: p21
Désacétylation des histones(répression de la transcription)
Acétylation des histones(activation de la transcription)
- L’acide valproïque est un inhibiteur des désacétylases d’histones (HDACi) (Phiel et coll, 2001 J Biol Chem, 276: 36734),
- La TSA (trichostatine), le prototype des HDACi, et l’acide valproïque induisent les mêmes malformations au cours du développement chez la souris (Menegola et al. 2005. BirthDefects Res.Dev Reprod Toxicol 74: 392).
HAT
HDAC
LES MECANISMES CELLULAIRES ET MOLECULAIRES DE LA
TÉRATOGENÈSE
PAR CARENCE ET EXCES EN ACIDE RETINOÏQUE (AR)
NADRALDH1
à 4 NADH
Membrane cellulaire
RAL
ADHRoDHNAD NADH
Activation de la transcription
NoyauCYP26A1, B
1, C1
ROLRBP
ComplexeRetinol-RBP
d’origine hépatique
SANGL’AR peut aussi agir comme un signal paracrine
ROL AR
ARAR 4-oxoAR 4-hydroxyAR 18-hydroxy
Cytosol
- RAR (α, β, γ) sont des facteurs de transcription inductibles par leurs ligands- In vitro, fonctionnent sous la forme d’hétérodimères RXR:RAR après fixation à des RARE
AR 9AR 9--cis ?cis ?AcAc. . DocosahDocosahééxaxaéénonoïïqueque
AcAc. . ArachidoniqueArachidoniqueAcAc. . phytaniquephytaniqueEcosanoEcosanoïïdesdes
AR toutAR tout--transtransAR 9AR 9--cis?cis?
Hétérodimère RXR:RAR
Histones
ADN
RAR
RXR
PuGPuG TCATCAGGTT
PuGPuG TCATCAGGTT
n = 5
LES RECEPTEURS DE L’ACIDE RÉTINOÏQUE (RAR)
Clarke et coll, 2004, Expert Reviews in Molecular Medicine 6
- La fixation du ligand sur le RAR induit un changement conformationnel de l’hétérodimère lui permettant: - de se séparer des co-répresseurs- de recruter un complexe de co-activateurs capable d’interactions directes avec la machinerie transcriptionnelle de base et présentant une activitéd’acétylation des histones (= activitéhistone acétyl transférase ou HAT)
LES RECEPTEURS DE L’ACIDE RÉTINOÏQUE (AR)
En l’absence de ligand, l’apo-hétérodimère liéau RARE recrute des co-répresseurs (SMRTet/ou NCor) et, par leur intermédiaire, des désacétylases d’histones (HDAC)
- Contiennent une séquence de type RARE au
niveau de leurs promoteurs
- Sont régulés par l’AR dans des cellules en culture
ou in vivo
LES GÈNES CIBLES DIRECTS DE L’AR
Liste des 27 gènes qui sont des cibles directes de l’AR(d’après Blomhoff et Blomhoff J. Neurobiol, 2006, 66)
à laquelle il convient de rajouter les Cyp26A1, B1, C1
Certains RAR présentent des profils d’expression spécifiques, mais ceux de RARα et de RXRα sont ubiquitaires tous les tissus en développement sont des cibles potentielles de le carence ou de l’excès d’AR.
Expression de RARγ dans des ébauches pré-cartilagineuses (coupe sagittale d’embryon de souris à E14; IHC).
LES RECEPTEURS DE L’ACIDE RÉTINOÏQUE (AR)
Colonne vertébrale
Sternum
Trachée
129/Sv129/Sv BalbBalb/c/c
ElectroporationElectroporationdu vecteur dedu vecteur derecombinaisonrecombinaison
souris sauvage souris sauvage BalbBalb/c/cChimChimèèrere
Culture des cellules ESCulture des cellules ES
PrPrééllèèvement de vement de blastocystesblastocystes
RRééimplantationimplantationdes des blastocystesblastocystesin uteroin utero
Injection des cellulesInjection des cellulesES recombinantesES recombinantesdans des dans des blastocystesblastocystesde souris de souris BalbBalb/c/c
CellulesCellulesde la massede la masseinterneinterne
SourisSourisMutanteMutante
hhééttéérozygoterozygote
Evènement de recombinaison homologue
FONCTIONS DES RARs et BASES MOLÉCULAIRES DE LA TÉRATOGENÈSE INDUITE PAR UNE DIMINUTION DE LA VOIE DE SIGNALISATION DE L’AR
PHÉNOTYPES DES MUTANTS NULS POUR LES RAR- FONCTIONS DES RARS
En raison d’un phénomène de redondance fonctionnelle, les mutants inactivles mutants inactivéés pour s pour un seul un seul RARRAR::- sont viables; - ne présentent pas (à une exception) les manifestations du syndrome de carence fœtale en vitamine A (SCFA).Les mutants nuls pour 2 Les mutants nuls pour 2 RARRAR::
- meurent à la naissance, parfois in utéro;- présentent toutes les anomalies du SCFA.
Aα/Aβ, Aα/AγAα/Aβ, Aα/AγAα/AγAα/Aγ
Anomalies du tractus génital• Agénésie des oviductes et de l'utérus• Agénésie du vagin• Agénésie du canal déférent• Agénésie des vésicules séminales
Aα/Aβ, Aα/AγAβ/Aγ, Aα/Aβ, Aα/AγAβ/Aγ, Aα/Aβ, Aα/Aγ
Anomalies de voies d'éjection du cœurs• Tronc commun aortico-pulmonaire• Communication interventriculaire• Anomalies des grosses artères
Aα/AγHypoplasie du myocarde
Aα/AβAα/AβAα/Aβ
Anomalies du système respiratoire• Agénésie ou hypoplasie des poumons• Absence du septum trachéo-œsophagien• Hernie diaphragmatique
Double mutants nuls pour des
RARs présentantdes
anomalies semblables
Anomaliesdu syndrome de carence foetale
en vitamine A
Aα/Aβ, Aα/AγHypoplasie du rein
Aα/Aβ, Aα/AγAα/Aβ, Aβ/Aγ
Anomalies urétrales• Agénésie• Ectopie
Aα/AγAβ/Aγ, Aα/AγAβ, Aα/Aβ, Aβ/Aγ, Aα/AγAβ/Aγ, Aα/AγAα/AγAβ/Aγ, Aα/AγAβ/Aγ, Aα/AγAβ/Aγ, Aα/AγAβ/Aγ
Anomalies occulaires• Colobome de la rétine• Colobome du nerf optique• PHPV• Absence du vitré définitif• Paupières non fusionnées• Hypoplasie du sac conjonctival• Stroma cornéen anormal• Absence de chambre antérieure• Fibres cristalliniennes anormales• Raccourcissement de la rétine ventrale
Mutants nuls pour lesRARs présentant des anomalies semblables
Anomaliesdu syndrome de carence foetale
en vitamine A
LES INACTIVATIONS SIMULTANEES DE 2 RAR REPRODUISENT L’ENSEMBLE DES ANOMALIES DU SYNDROME DE CARENCE FŒTALE EN VIT.A (SCFA)
Lohnes et coll, et Mendelsohn et coll, 1994, Development
Ces anomalies ne sont pas des manifestations du SCFA, mais sont ~ reproduites chez desembryons: - traités par des antagonistes des RAR- déficients en RALDH2 ou RALDH3Elles traduisent donc une carence fonctionnelle en AR
CCL1: L’AR EST INDISPENSABLEÀ L’ORGANOGENÈSE/HISTOGENESE DE NOMBREUSES STRUCTURES
Exencéphalie + fissure médiane de la face (mutant RARα/RARγ)
Agénésie du radius (mutant RARa/RARg)
LES INACTIVATIONS SIMULTANEES DE 2 RAR
PRODUISENT DES ANOMALIES NOUVELLES
En plus de son rôle dans la morphogenèse et
la différenciations cellulaire,l’AR à intervient dans la détermination de
l’identité cellulaire le longde l’axe antéro-postérieur
WT RARα/RARβ
Modification de l’expression de Hoxd4
Transformation homéotique de l’axis (C2) en atlas (C1)
CCL2: L’AR CONTRÔLE L’EXPRESSION DE CERTAINS GENES HOX
Les foetus doublement nuls pour Les foetus doublement nuls pour RARRARαα et et RARRARββ ou pour ou pour RARRARαα et et RARRARγγ reproduisent les anomalies reproduisent les anomalies observobservéées chez le poulet suite es chez le poulet suite ààll’’ablation de la crête neurale ablation de la crête neurale crâniennecrânienne
-- Absence du septumAbsence du septumaorticoaortico--pulmonairepulmonaire-- Malposition des troncs Malposition des troncs artartéériels criels cééphaliquesphaliques
(Larsen, 1995)
AgAgéénnéésies des os du crânesies des os du crâne
« It is possible that a major mechanism of isotretinoin teratogenesis is a deleteriouseffect on cephalic neural-crest cell activity that results in the observed craniofacial, cardiac, and thymic malformations » (Lammer, 1985)
CCL 3: L’AR EST INDISPENSABLE A L’ONTOGENESE DES DERIVES DE LA CRETE NEURALE CRANIENNE
RARα/RARβ et RARα/RARγ
RAR (α, β et γ)AR tout-trans
FXRAcides biliaires
LXR (α et β)hydroxycholésterols25-époxycholésterol
PPAR (α, β and γ)prostaglandin J2écosanoïdesacides gras désaturés
VDR1-25 di(OH)2 vitamin D3
TR (α et β)hormone thyroidienne (T3)
PXRpregnanes
CARandrostanes
OrphansCOUP-TF (α, β et γ)
NGF1-B...
RXR α, β, γ
LES PHENOTYPES DES MUTANTS NULS POUR LES RXR: FONCTIONS DES RXR
SCFA
RARγ
RARβ
RARα
viables
RXRγRXRβRXRαSCFA
Récepteur
inactivé
LES HETERODIMERES RXRα : RAR (α, β et γ ) REPRESENTENT LES UNITES FONCTIONNELLES DE LA VOIE DE SIGNALISATION DE L’AR IN VIVO AU
COURS DU DEVELOPPEMENT EMBRYONNAIRE
DIMINUTION DE LA VOIE DE SIGNALISATION DE L’ARET PATHOLOGIES HUMAINES
Carence alimentaire en vitamine ASyndrome d’alcool fœtal
Exposition à des polluants (nitrophène, TCDD)
Hypothesis: “Mutation of genes controlling
tissue specific vitamin A disposition predispose the developing embryo
of vitamin A deficient mothers to congenitalabnormalities of the eye”.
India Project (extrait de la page Web, 2004)
CARENCE ALIMENTAIRE EN VITAMINE A
Malformations oculaires (= les plus fréquentes desanomalies induites par la carence fœtale en vitamine A chez le rongeur de laboratoire)
CARENCE ALIMENTAIRE EN VITAMINE AA
B
RBP +/-RBP -/-
Ces 2 fœtus sont issu de la même mère porteuse d’une inactivation du gène codant pour la RBP et carencée en vitamine ALe fœtus B, porteur homozygote d’une mutation nulle présente un syndrome polymalformatif
(le fœtus A est normal)(D’après Quadro et coll., 2005 ,Endocrinology 146: 4479)
L’inactivation du gène codant pour la RBP, sans conséquence en cas d’alimentation équilibrée, favorise la survenue de malformations embryonnaires en cas de carence maternelleen vitamine A
rétinol (vitamine A)
rétinaldéhyde(rétinal)
acide rétinoïque
alcool déhydrogénasesAdh1- Adh2- Adh4- Adh7- Adh8Rodh1- Rodh2- Rodh3- Rodh4
aldéhyde déshydrogénases(Raldh1- Raldh2- Raldh3-Raldh4)
CH2OH
COOH
CHO
Ethanol
ETAT DE CARENCE EN AR ET SYNDROME D’ALCOOL FŒTAL
Cellules apoptotiques à l’apex du bourgeon de membre(Johnson et coll., 2007, Birth Defects Research 79:631)
Contrôle Traité AR
Traité éthanol Traité éthanol et AR
L’administration simultanée de faibles doses d’AR peut empêcher l’exacerbation de l’apoptoseinduite par l’éthanol(ici dans le bourgeon de membre).
ETAT DE CARENCE EN AR ET SYNDROME D’ALCOOL FŒTAL
Fissures médianes de la face et agénésiedu corps calleux (= holoprosencéphalie, HPE) - sont présent chez tous les mutants doublement nuls RARα/RARγ- sont précédés d’une mort cellulaire importante dans la masse fronto-nasale (Lohnes et coll., 1994, Development 120:2723. )
WT RARα/RARγ
L’HPE est une manifestation du syndrome d’alcool fœtal chez l’Homme(Revue: Cohen et Shiota, 2002, American Journal of Medical Genetics 109:1)
ETAT DE CARENCE EN AR ET SYNDROME D’ALCOOL FŒTAL
Agénésie du poumon gauche Agénésie du diaphragme
VOIE DE SIGNALISATION DE L’AR ET POLLUANTS I. NITROPHÈNE
Le nitrophène régule négativement la voie de signalisation de l’AR (Chen et coll. Biol Neonate, 2003, 83:157).
RARα /RARβ RARα /RARβ
AR
DEVELOPEMENT EMBRYONNAIREANORMAL =
Syndrome de carence foetale en vitamine A
CARENCE
EXCES
LES MECANISMES CELLULAIRES ET MOLECULAIRES DE LA TÉRATOGENÈSE
PAR EXCES D’ACIDE RETINOÏQUE (AR)
DEVELOPEMENT EMBRYONNAIREANORMAL =
Embryopathie par excès d’AR
Les mutants nuls pour RARγ sont résistants au syndrome de régression caudale induit par un excès d’acide rétinoïque d’origine exogène.
Conception
E0 E9 E18
ARAR(100mg/kg)
Observation des squelettes
LES EFFETS TERATOGENES DE L’AR SONT RELAYES PAR LES RARS
Iulianella et coll. Dev. Biol. 1999, 205:33.
WT + RA RARγ-KO + RA
Les mutants nuls pour RARγ sont résistants au syndrome de régression caudale induit par un excès d’acide rétinoïque d’origine endogène
Syrénomélie chez un mutant porteur d’allèles nuls pour CYP26A1. Cette anomalie est absente chez les doubles mutants nuls à la fois pour CYP26A1 et RARγ(Abu-abed et coll, 2003, Development 130, 1449)
LES EFFETS TERATOGENES DE L’AR SONT RELAYES PAR LES RARS
CYP26A1-/-
CYP26A1-/-et RARγ-/-
Les mutants nuls pour RXRα sont résistants aux anomalies des membres induites par un excès d’acide rétinoïque d’origine exogène (Sucov et coll 1995 Development. 121:3997)
LES EFFETS TERATOGENES DE L’AR SONT RELAYES PAR LES RARS
- Les rétinoïdes synthétiques incapables de se lier aux RAR ne sont pas tératogènes.- Les retinoïdes synthétiques spécifiques d’une isoforme de RAR donnéinduisent des malformation distinctes.
LacZ
Lignée de souris rapportrice sensible à l’AR
RARE HSP
Véhicule Agoniste de RARα Agoniste de RARγ
Matt et coll., 2003, Development, 130:2083
L’AR 9-Cis EST UN TERATOGENE SANS ACTION PHYSIOLOGIQUE
- est le ligand canonique des RXR- n’est pas détecté in vivo dans des conditions physiologiques - est détecté in vivo après administration d’une dose pharmacologique d’AR tout-trans/13-cis - sa fixation sur le RXR potentialise l’activation de la transcription relayée par les hétérodimères RAR : RXR in vitro - joue un rôle important dans l’embryopathie à l’AR
L’isotrétinoïne est isomérisée in vivo en AR tout-trans et en AR 9-cis
(Larsen, 1993)
(Sulick et coll., 1988, Development 103)
L’AR 9-Cis EST UN TERATOGENE SANSACTION PHYSIOLOGIQUE
Souris gestante à E 8.0
Hypoplasie et fusion et des 2 premiersarcs pharyngiens (Webster et coll., 1986)
Pas Pas dd’’ARAR
+ + ARAR
AR
CULTURES D’EMBRYONS EN PRESENCE DE RETINOIDES SYNTHETIQUESSPECIFIQUES DES RAR OU DES RXR
E 8.0: stade 2/3 somites Equivalent E 9.5: stade ~34 somites
Agonistes spécifiques de RAR ou de RXR
culture durant 48 hr
Agoniste de RARβ àune concentration
non-tératogène
Agoniste pan-RXR: non-tératogenequelqu’en soit
la concentration
Les 2 agonistes combinés:fusion des 2 arcs
branchiaux
- L’agoniste des RXR n’est, par lui même, jamais tératogène- L’agoniste de RAR et celui de RXR exercent des effets tératogènes synergiques sur le développement des arcs branchiaux
Coupes histologiquessériées du pharynx
A1A2
A 3
Syrénomélie chez un mutant nul pour CYP26A1. (Abu-Abed et coll, 2001, Genes Dev. 2001 15: 226 )
LES RAMBAS SONT POTENTIELLEMENT TERATOGENES
Parce qu’ils augmentent les concentrations d’AR endogène les inhibiteurs des CYP26 (RAMBA: Retinoic Acid MetabolismBlocking Agents ) sont vraisemblablement tératogènes
PESTICIDES ORGANOCHLORES DOUES DE PROPRIETES RA-MIMETIQUES IN VITRO
Lemaire et coll., 2005, Toxicol Appl Pharmacol. 202:38Kamata et coll., 2008, Toxicol In Vitro. 22:1050