introduÇÃo a biologia molecular claudia g. bica dna
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INTRODUÇÃO A BIOLOGIA INTRODUÇÃO A BIOLOGIA MOLECULARMOLECULAR
Claudia G. Bica
DNADNA
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ORGANISMO
CÉLULA
NÚCLEO
CROMOSSOMOS(DNA+PROTEÍNAS)
- Informação das proteínas e RNAs que serão sintetizadas pelas células do organismo ao longo da sua vida.-Capacidade de se auto-duplicar para originar outras células.
DNADNA
NOS SERES HUMANOSNOS SERES HUMANOS
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AMBIENTE
CÉLULAS
TECIDOS
ÓRGÃOS
CORPO
CÉLULAS
TECIDOS
ÓRGÃOS
CÉLULAS
TECIDOS
ÓRGÃOS
Embriologia Amadurecimentoe Fase reprodutiva
Envelhecimento Morte
Desenvolvimento
Acúmulo demodificaçõese disfunções
MoléculasOrganelas
MoléculasOrganelas
Envelhecimento...Envelhecimento...
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DNA
Controla: 1) homeostasia2) reprodução 3) morfologia4) função celular
A CÉLULA
TECIDOS
ÓRGÃOSE SISTEMAS
CORPO
UN
ICE
LU
LA
RE
S
MU
LT
ICE
LU
LA
RE
S
AMBIENTE
NÍV
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DE
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GA
NIZ
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ÃO
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HISTÓRICO
1865 - GREGOR MENDEL
Estudou cruzamento entre diferentes tipos de ervilhas demonstrando que certas características físicas dessas plantas eram transmitidas de geração para geração através de “fatores”.
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HISTÓRICO
1902 – SUTTON e BOVERI
Padrão de herança dos “fatores” acompanhava a segregação dos cromossomos de células em divisão
1909 – JOHANNSEN
Nomeou as unidades mendelianas da hereditariedade (“fatores”) de GENES
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HISTÓRICO
1915 – THOMAS MORGAN
Concluiu que os genes estavam organizados de maneira linear nos cromossomos
Propôs, pela 1ª vez, uma correlação entre um gene (genótipo) e uma característica física (fenótipo)
1941 – BEADLE e TATUM
Demonstraram que os genes agiam através da regulação de diferentes eventos químicos
HIPÓTESE: UM GENE UMA ENZIMA
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HISTÓRICO
1953 – JAMES WATSON e FRANCIS CRICK
Descrição da estrutura física do DNA baseando-se nos estudos de difração de raio X de
Rosalind Franklin e Maurice Wilkins e em estudos químicos da molécula
Modelo da dupla fita proposto foi fundamental para a compreensão do mecanismo de
transmissão e execução da informação genética
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•1953: Watson and Crick
Estrutura do DNA
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HISTÓRICO
1955 – JOE HIN TJIO
Definiu como 46 o número exato
de cromossomos humanos
ARTHUR KORNBERG
Isolou a enzima DNA polimerase da bactéria E.coli
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HISTÓRICO
1957 – CRICK e GAMOV
Dogma Central da Biologia Molecular
DNA RNA PROTEÍNA
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Dogma Central
da Biologia Molecula
r
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• 1961 – BRENNER, JACOB e MESELSON
• mRNA é a molécula que leva informação do DNA no núcleo para a maquinaria de produção de proteínas no citoplasma
HISTÓRICO
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HISTÓRICO
1966 – NIRENBERG, KHORANA e OCHOA
Seqüências sucessivas de três nucleotídeos do DNA (codon) determinam a seqüência de aminoácidos de uma proteína
O CÓDIGO GENÉTICO É DESVENDADO!!!
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Com o desenvolvimento da tecnologia do DNA recombinante (1972) e do seqüenciamento do
DNA (1975-77) tornou-se possível isolar e determinar a seqüência de genes dos mais
diferentes organismos.
Desta forma, com a disponibilidade de novos recursos, vários mecanismos biológicos,
como a replicação do DNA e a divisão celular, começaram a ser intensamente estudados.
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DNA
1. Regulação transcricional
HnRNA 2. Regulação no processamento do RNA primário
3. Regulação no transporte do mRNA para o citoplasma
RETÍCULO ENDOPLASMÁTICORUGOSO
4. Regulação da síntese proteíca
Proteínasintetizada
5. Regulação pós-síntese
A CÉLULA
- DIFERENCIAÇÃO- CRESCIMENTO- FUNÇÃO CELULAR- RESPOSTA AO AMBIENTE
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DNACromossoma
Gene
Promotor IntronExon
Núcleo
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DNA
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ÁCIDO DESOXIRRIBONUCLEICO (DNA)
Contém toda a informação genética de um organismo
Esta informação está arranjada em unidades hoje conhecidas como genes
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ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
As moléculas de DNA e RNA são compostas por quatro diferentes nucleotídeos:
• Adenina, Guanina e Citosina – comum para DNA e RNA
• Timina – encontrada somente no DNA
• Uracila – encontrada somente no RNA
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ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
Todos os nucleotídeos apresentam uma estrutura em comum:
radical fosfato
pentose
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ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
As bases nitrogenadas podem ser divididas em dois grupos de acordo com sua estrutura:
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ESTRUTURA DOS ÁCIDOS NUCLEICOS
O grupo hidroxil ligado ao carbono 3 da pentose de um nucleotídeo forma uma ligação fosfodiéster com o fosfato do outro nucleotídeo
5’ C-A-G 3’
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DNA
• Duas fitas de polinucleotídeos associadas formando uma estrutura de dupla hélice onde as pentoses e os radicais fosfato compõe a fita e as bases projetam-se para o interior da mesma
• As fitas mantêm-se unidas através da formação de pontes de hidrogênio entre as bases o que contribui para a estabilidade da dupla hélice
. Adenina (A) pareia com Timina (T) através de 2 pontes de hidrogênio
. Guanina (G) pareia com Citosina (C) através de 3 pontes de hidrogênio
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DNA
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ESTRUTURA DO DNAESTRUTURA DO DNA
1) Estrutura primária - É um polímero não ramificado- Formado por monômeros chamados de nucleotídeos- Cada nucleotídeo contém os seguintes elementos:
1 Açúcar chamado DESOXIRRIBOSE Possui 5 Carbonos na sua molécula
1 Base orgânica nitrogenada (Por que contém nitrogênio na sua formação)
1 grupo fosfato (PO4-)
NUCLEOTÍDEO
As Bases Nitrogenadas podem ser de dois tipos:
PÚRICAS
N CH HC CH N
PIRIMÍDICAS
C N N C CH HC C N N H
HC H
3C 2C
1C4C
5C
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O
H HH
HOO
CH2
PO O-
OO
O
H HH H
CH2
HO
PO O-
OO
Carbono5’
Carbono3’
BaseNitrogenadaDesoxirribose
LigaçãoFosfodiesteGrupo fosfato +Grupo hidroxila(OH) do Carbono 3’
Desoxirribose
BaseNitrogenada
Como a ligaçãoentre uma desoxirribose
e outra desoxirribosesó pode ser feitaquando um grupofosfato liga-se no
Carbono 5’doprimeiro açúcar eno Carbono 3’do
segundo açúcar dizemosque a molécula
de DNA “cresce emdireção 5’ 3’
5’
3’
ESTRUTURA QUÍMICA DA MOLÉCULA DO DNAESTRUTURA QUÍMICA DA MOLÉCULA DO DNA
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As fitas do DNA estão dispostas
em direções opostas
Antiparalelismo
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Cada base de uma fita é pareada com a base complementar da outra fita
Complementariedade
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Durante a replicação do DNA
as duas fitas velhas ou mães servem de
molde para cada fita nova ou filha
complementar, que está sendo sintetizada.
Fita nova
Fita velha
Complementariedade
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Fatores que estabilizam a dupla hélice:• interações hidrofóbicas• forças de van der Walls• pontes de hidrogênio
• interações iônicas
Entre as bases nitrogenadas
Entre os grupos fosfato do DNA e os cátions (Mg2+)
presentes na solução fisiológica
A Dupla Hélice
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Sulco menor
Sulco maior
A dupla hélice apresenta dois tipos de sulcos aos
quais se ligam as proteínas da cromatina
A Dupla Hélice
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Proteínas:níveis de complexidade estrutural
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DNA em procariontes: DNA circular nas formas não-super-helicoidal (esquerda) e super-helicoidal (direita)
O Empacotamento do DNA:a estrutura terciária do DNA
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O B-DNA é o predominante em condições fisiológicas
A Dupla Hélice
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A forma predominante de torção da espiral do DNA é para a direita ou sentido horário
A Dupla Hélice
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Propriedades Químicas e Físicas do DNA
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REPLICAÇÃO DO DNA
Conservativa ou Semiconservativa?
Unidirecional ou Bidirecional?
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REPLICAÇÃO
SEMICONSERVATIVA
Evidência baseada em um experimento clássico de Meselson-Stahl em 1958
• Células de E. coli foram inicialmente colocadas em um meio para crescimento contendo sais de amônia preparados com 15N (nitrogênio pesado – “heavy”) até todo o DNA celular conter o isótopo.
• As células foram, então, transferidas para um meio contendo 14N (nitrogênio leve – “light”).
• As amostras foram analisadas com gradiente de densidade que separa as duplas H-H, L-L e H-L em bandas distintas.
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PNAS
44:671, 1958
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•The Meselson-Stahl experiment
A replicação é semi-conservativa
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ORIGEM DA REPLICAÇÃO
Experimento com SV40 (Simian Virus)
• DNA viral de células infectadas com SV40 foi cortado com a enzima de restrição EcoRI, que reconhece um sítio único.
• A partir de um “ponto” vai se formando uma bolha chamada bolha de replicação comprovando a existência de um ponto de origem da replicação
Características da origem de replicação:
. estrutura repetitiva
. seqüências ricas em AT
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ORIGEM DA REPLICAÇÃO
ORIGEM Sítio de restrição EcoRI
Cromossomo viral circular
EcoRI
Bolha de replicação
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ORIGEM DA REPLICAÇÃO
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![Page 46: INTRODUÇÃO A BIOLOGIA MOLECULAR Claudia G. Bica DNA](https://reader036.vdocuments.net/reader036/viewer/2022062400/5706384d1a28abb8238f696a/html5/thumbnails/46.jpg)
REPLICAÇÃO
BIDIRECIONAL
Um experimento através da autoradiografia de moléculas de DNA marcadas de culturas
de células mamárias revelou grupos de replicons (unidades de replicação) com um
ponto de origem de replicação central
OR OR
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Síntese de DNA em Eucariontes: As “Bolhas de Replicação”
• Nos eucariontes, a replicação requer “múltiplas origens”, devido ao tamanho de seu genoma. A replicação é bidirecional e, em ambas as fitas, simultânea.
• Este processo gera “bolhas de replicação”.
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Região Gênica É a porção que codifica para um produto final,
que pode ser uma cadeia polipeptídica ou um RNA
O DNA é formado por 2 regiões:
Gênicas Intergênicas
Região IntergênicaÉ a porção regulatória,
que sinaliza o início ou o final de um gene, que influencia a transcrição
gênica, ou que é o ponto de início para a
replicação do DNA
Intergênicas Gênicas
Regiões Codificadoras e Não-Codificadoras do DNA
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PROCESSO DE REPLICAÇÃO
Os mecanismos celulares responsáveis pela replicação do DNA foram descobertos primeiramente em bactérias.
A replicação em eucariotos ocorre através de proteínas análogas e com processos semelhantes à replicação do DNA de E. coli
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1. DNA Polimerases2. Endonucleases3. Helicases 4. Topoisomerases5. Primases6. Telomerases
PRINCIPAIS ENZIMAS ENVOLVIDAS (SISTEMA DE REPLICAÇÃO DO DNA)
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DNA POLIMERASE
• São incapazes de quebrar as pontes de hidrogênio que ligam as duas fitas do DNA
• Só alongam uma fita de DNA/RNA pré-existente
• Catalisam a adição de um nucleotídeo no radical hidroxil da extremidade 3’ da cadeia que está se formando. Desta forma, as fitas só podem crescer no sentido 5’ 3’
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DNA Polimerases
• principais enzimas envolvidas no processo; responsáveis pela adição de nucleotídeos e reparo
• requerem um modelo e um primer (segmento de RNA sintetizado pela primase) complementares para início – alongamento
• 3 tipos principais : I, II, III I : importante no sistema de reparo III: principal e mais complexa (mais de 10 subunidades)
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Adição de nucleotídeos
1
2
3
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NUCLEASES
- Degradam o DNA, clivando-o em pedaços menores
1. EXONUCLEASES: clivam o DNA a partir do final da molécula
2. ENDONUCLEASES: clivam em qualquer local da molécula
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OUTRAS ENZIMAS ENVOLVIDAS NO PROCESSO DE REPLICAÇÃO
HELICASES – constituem uma classe de enzimas que podem se mover ao longo da fita dupla de DNA utilizando a energia da hidrólise de ATP para separar as duas fitas da molécula.
SSB (“single-strand-binding”) – ligam-se a cada uma das fitas impedindo o reanelamento das mesmas.
PRIMASE – RNA polimerase que sintetiza pequenas moléculas de RNA utilizadas como iniciadores durante o processo de replicação do DNA.
TOPOISOMERASES – Responsáveis por aliviar a torção na parte da fita que não está sendo replicada.
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PROCESSO DE REPLICAÇÃO
O movimento da forquilha de replicação revela uma fita molde no sentido 3’ 5’ e outra no sentido oposto 5’ 3’
Desta forma, as fitas novas são sintetizadas em sentidos opostos
FITA “LEADING” – crescimento segue a direção do movimento da forquilha de replicação
FITA “LAGGING” – crescimento no sentido oposto ao movimento da forquilha de replicação
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PROCESSO DE REPLICAÇÃO
FITA “LEADING” – sintetizada continuadamente a partir de um iniciador na fita molde 3’ 5’
FITA “LAGGING” – sintetizada descontinuadamente a partir de múltiplos iniciadores
• Sítios descobertos no molde da fita “lagging” são copiados em pequenos iniciadores de RNA pela primase.
• Cada iniciador é alongado pela DNA polimerase resultando na formação dos FRAGMENTOS DE OKAZAKI.
•DNA polimerase remove o primer do RNA do fragmento adjacente e preenche os “gaps” entre os fragmentos que, então, são unidos pela DNA ligase.
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PROCESSO DE REPLICAÇÃO
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PROCESSO DE REPLICAÇÃO
A síntese de DNA é feita na direção 5´ 3´ e é semidescontínua
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TELOMERASE
• Os cromossomos de eucariotos são lineares e apresentam seqüências repetitivas em suas extremidades denominadas telômeros
• A síntese da fita “leading” continua até o término da fita molde de DNA, no entanto, no telômero a extremidade feita pela primase na fita “lagging” não é digerida.
• Como o iniciador é instável, ele se degrada com o tempo diminuindo, assim, o tamanho do cromossomo.
• Telomerase age evitando a perda do fim do cromossomo.
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TELOMERASE
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ESTÁGIOS DA REPLICAÇÃO
1. INICIAÇÃO 2. ALONGAMENTO3. TERMINAÇÃO
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1. INICIAÇÃO
ORIGEM DA REPLICAÇÃO – OriC : - 245 pb ; - 3 repetições de 13 pb; - 4 repetições de 9 pb; (A=T)
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2. ALONGAMENTO Envolve duas operações distintas, mas
relacionadas: 1. Síntese da fita líder 2. Síntese da fita tardia Início comum na forquilha de replicação
envolvendo: - helicases- topoisomerase- DNA binding proteins
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SÍNTESE DA FITA LÍDER 1. Síntese de um RNA primer pela primase
na origem de replicação 2. Desoxirribunocleotídeos são adicionados
pela DNA polimerase III continuamente a partir da forquilha de replicação
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3. TERMINAÇÃO
-Procariotos: DNA circular, quando as duas forquilhas de replicação se encontram ela termina. -Eucariotos: seqüências de nucleotídeos específicas no final dos cromossomos, incorporadas a telômeros.
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REGULAÇÃO -única fase regulada da replicação, de forma que só ocorra uma vez por ciclo celular ;-afetada pela metilação de DNA -DAM metilase na (5´) GATC sobre a fita parental
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Gene
RNA polimerase
hnRNA
mRNA
Citoplasma
Transcrição
Processamento
Núcleo
Tradução
proteína
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http://www.virtual.epm.br/cursos/biomol/replica/html/6.htm
http://www.johnkyrk.com/DNAreplication.html
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..\..\claudia\GeneticsTour.exe
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Fim???