introduçãoa tecnologia proteômica - principais conceitos e tecnicas utilizadas ppt
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Prof. José Raimundo Correa
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Western Blotting
Eletroforese de proteínas
Diferença de tamanho (PM)
Mobilidade da proteína
Detecção
Marcação com
anticorpo específico
Detecção da
proteína alvo
Gel de poliacrilamidaMembrana de
nitrocerlulose
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Desafios da proteômica
”In a few years we will have finished sequencing the human genome. Then we will spend the next 500 years trying to understand the function of these genes. ”
1998
Professor Mathias Uhlén
Royal Institute of Technology (KTH), Stockholm
Member of the board, Amersham Biosciences
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GENOMA – Conjunto de DNA (humano)
30.000 – 45.000 ?? genes
Transcriptoma – Conjunto de mRNAs
mRNA – 100.000 representantes??
PROTEOMA – Equivalente protéico do genoma
Proteínas – 1.000.000 – 40.000.000 ?? representantes??
Além do Genoma : Sistemas Biológicos
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Marc Wilkins
Siena Itália setembro de 1994
“all proteins expressed by a genome, celll or tissue”
PROTEINOME PROTOME
PROTEOME
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1º Conceito de Proteoma
Electrophoresis. 1995 Jul;16(7):1090-4.
Progress with gene-product mapping of the Mollicutes: Mycoplasma genitalium.
Wasinger VC, Cordwell SJ, Cerpa-Poljak A, Yan JX, Gooley AA, Wilkins MR, Duncan MW, Harris R,
Williams KL, Humphery-Smith I.
Department of Microbiology, University of Sydney, Australia.
A protein map of the smallest known self-replicating organism, Mycoplasma genitalium (Class: Mollicutes),
revealed a high proportion of acidic proteins. Amino acid composition was used to putatively identify, or provide
unique parameters, for 50 gene products separated by two-dimensional gel electrophoresis. A further 19 proteins
were subjected to peptide-mass fingerprinting using matrix-assisted laser desorption ionisation-time
of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry and 4 were subjected to N-terminal Edman degradation. The majority of
M. genitalium proteins remain uncharacterised. However, the combined approach of amino acid analysis and
peptide-mass fingerprinting allowed gene products to be linked to homologous genes in a variety of organisms.
This has allowed proteins to be identified prior to detection of their respective genes via the M. genitalium sequencing initiative.
The principle of 'hierarchical' analysis for the mass screening of proteins and the analysis of microbial genomes via their protein
complement or 'proteome' is detailed. Here, characterisation of gene products depends upon the quickest and most economical
technologies being employed initially, so as to determine if a large number of proteins are already present in both homologous
and heterologous species databases. Initial screening, which lends itself to automation and robotics, can then be followed by
more time and cost intensive procedures, when necessary.
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Conceito
Proteôma: complemento protéico do genoma em um
dado organismo, em um dado momento, em uma dada
situação.
Proteômica: comparação qualitativa e quantitativa de
proteômas sob diferentes condições ou processos
biológicos.
Proteomática: bioinformática para proteômica.
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Mudanças biológica
(Morfogenesis)
Proteoma 1 Proteoma 2Perfis de proteínas
Proteoma 1
Proteoma 2
Proteoma 3
Proteoma „n‟
1 único genoma!
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2D – PAGE
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
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- Separação de aprox. 10.000 proteínas em um
único gel
- Separa proteínas de acordo com massa
molecular (MM) e ponto isoelétrico (PI)
2D – PAGE
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA
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Esquema da análise proteômica
Mistura protéica Proteínas individuais
PeptideosMassa dos peptideos
Identificação da Proteína
Separação
2D-SDS-PAGE
Digestão com
Tripsina
Espectometria de massas
MALDI-TOF
Busca nos
bancos de dados
Seleção dos ‘Spots’
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Componentes da Proteômica
Separação proteica
Bioinformatica
Espectometria de
massas
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2D – PAGE
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA(1ª. Dimensão)
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2D – PAGE
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA(1ª. Dimensão)
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2D – PAGE
ELETROFORESE EM GEL DE POLIACRILAMIDA(2ª. Dimensão)
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Revelação dos géis
11 cm
pH 3 - 10
Detecção: Comassie, prata, fluorescência, imunodetecção.
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DIGE : Differential Gel Electrophoresis
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DIGE : Differential Gel Electrophoresis
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DIGE : Differential Gel Electrophoresis
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PROCESSAMENTO DOS SPOTS
Imagem do gel Seleção do spot
Retirada
descoloração
TripsinizaçãoEspectrometria
de massa
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Prêmios Nobel da Espectrometria de massa
The Five Mass Spectrometry Nobel Prize Pioneers
Joseph John
Thomson
1906 Nobel Prize for
Physics
"in recognition of the
great merits of his
theoretical and
experimental
investigations on the
conduction of
electricity by gases"
Francis William Aston
1922 Nobel Prize for
Chemistry
"for his discovery, by
means of his mass
spectrograph, of
isotopes, in a large
number of non-
radioactive elements,
and for his
enunciation of the
whole-number rule"
Wolfgang Paul
1989 Nobel Prize for
Physics
"for the development
of the ion trap
technique"
John Bennet Fenn
2002 Nobel Prize for
Chemistry
"for the development
of soft desorption
ionisation methods
(ESI) for mass
spectrometric
analyses of biological
macromolecules"
Koichi Tanaka
2002 Nobel Prize for
Chemistry
"for the development
of soft desorption
ionisation methods
(MALDI) for mass
spectrometric
analyses of biological
macromolecules
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Espectômetro de massas:
MALDI-TOF-TOF
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Espectômetro de massas:
MALDI-TOF-TOF
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Aplicações da Proteômica
Mapeamento de uma rede de relações: identificação de proteínas em uma rede funcional: vias biosintéticas, vias de transdução de sinal, complexos multiprotéicos.
Mapeamento de modificações proteicas: caracterização de modificações pós-traducionais: fosforilação, glicosilação, oxidação, etc.
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Aplicações da Proteômica
Especificação de proteínas: catalogar todas as proteínas presentes em um tecido, célula, organela, etc.
Perfil de expressão diferencial: Identificação de proteínas em amostras com uma função particular; diferenciação, estágio de desenvolvimento, condição de doença, resposta a uma droga ou estímulo.
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Marcadores de diagnóstico: Expressão diferencial
Proteínas comuns
Proteínas dos
pacientes infectados
Proteínas dos
pacientes saudáveis
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Análise dos spots
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Desvantagens
Proteínas não vivem sozinhas
- Interações com outras proteínas
- Interações com RNA/DNA
- Interações com outras identidades químicas (ligantes, co-fatores, metais iônicos, hormones)
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Desvantagens
- O proteôma humano é muito variável
- Um proteôma por tecido (250 tecidos)
- Um proteôma por fração sub-celular
- Milhares de doenças
- O proteôma muda com influências externas (drogas, alimentação...)
- O proteôma muda com o tempo
Um genoma por indivíduo, mas quantos proteômas?
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Desvantagens
Proteínas pouco abundantes – (50 – 70%)
Proteínas de membrana
Proteínas com extremos de PI e MM
Método trabalhoso
Reprodutibilidade
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Vantagens
Sensibilidade
Analise em larga escala
Rapidez
Automação
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Ainda não é possível fazer a descrição molecular
completa de uma célula viva ou de um ser vivo!!!
Novos paradigmas na Biologia
Ciência do descobrimento