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1.1 Doença de Chagas
A Doença de Chagas é enfermidade endêmica de natureza parasitária que
afeta aproximadamente 20 milhões de pessoas na América Latina e sul dos Estados
Unidos. Este mal tem como conseqüências o comprometimento de órgãos e de
sistemas fisiológicos como o cardiovascular, o gastrintestinal e, em alguns casos,
neurológico dos pacientes que desenvolvem a doença (Urbina & Docampo, 2003;
Coura & Castro, 2002; Prata, 2001; WHO, 2000).
São estimados cerca de 20.000 a 50.000 casos fatais por ano em decorrência
do agravamento da doença (Otero et al., 2006; Vega-Teijido et al., 2006; Urbina &
Docampo, 2003; Gelb & Hol, 2002; Teixeira et al., 2002; Urbina, 2001, Araújo-Jorge &
Pirmez, 1999). Este panorama pode apresentar maior gravidade devido à ausência de
monitoramento eficaz, vigilância e obtenção de estimativas precisas em relação à
ocorrência da endemia na região amazônica (Rojas et al., 2005). A doença atinge
predominantemente populações pobres e habitantes de zonas rurais, o que torna o
indivíduo infectado marginalizado pela sociedade, com conseqüente exclusão social
(Lana & Tafuri, 2000; WHO, 2000). Este cenário resulta também em sobrecarga dos
sistemas de previdência e aumento nos gastos dos recursos destinados à saúde
pública (WHO, 2000).
A doença de Chagas tem como agente etiológico o Trypanosoma cruzi, que é
transmitido através do repasto sangüíneo do inseto triatomídeo denominado
vulgarmente de “Barbeiro”, e apresenta as fases aguda e crônica de infecção. As
outras formas de contaminação conhecidas são a transmissão congênita na fase fetal,
acidentes laboratoriais, transfusão sanguínea, transplante de órgãos infectados e
ingestão de alimentos contaminados. Atualmente, no Brasil, a via de infecção
transfusional encontra-se controlada devido a medidas de controle exercidas em
bancos de sangue (Funasa, 2005). A transmissão acidental em laboratório apresenta
baixos índices, uma vez que pode ser evitada por meio de treinamento dos
manipuladores do parasita e da adoção de medidas sanitárias preventivas. A infecção
por ingestão oral de alimentos contaminados com parasitas, onde o protozoário
atravessa as mucosas do trato gastrintestinal e vai para o sangue, é via de
contaminação importante e resulta em preocupação para os órgãos de Saúde Pública
(Rojas et al., 2005; Camandaroba et al., 2002, Hoft et al., 1996), haja vista a
ocorrência crescente de casos em todo o Brasil. Dentre estes casos, ressaltam-se
relatos de consumo de caldo de cana contaminado em Santa Catarina, em 2005, e de
açai no Pará, em 2005 (Informativos das Secretarias de Saúde de Santa Catarina e do
Pará, 2005).
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O ciclo de vida do parasita, Figura 1, encontra-se dividido em duas etapas que
ocorrem no hospedeiro invertebrado, o inseto, e em vertebrado, que pode ser o
homem e várias outras espécies de mamíferos. No inseto são encontradas três formas
do parasita, esferoamastigotas, epimastigotas e a tripomastigota metacíclica, sendo
esta a forma infectante presente no inseto. Após a ocorrência de infecção no mamífero
surgem as formas tripomastigota (fase aguda da doença), presente no sangue ou
interstício extracelular, e a amastigota, presente nas células e tecidos atingidos (fase
crônica da doença) (Lana & Tafuri, 2000, Araújo-Jorge & Pirmez, 1999).
Adicionalmente, a forma epimastigota foi também descoberta e documentada em
pequenas concentrações em humanos (Aguirre et al., 2006, Aguirre et al., 2004,
Almeida de Faria et al., 1999; Faucher et al., 1995) e pode apresentar importância no
processo de desenvolvimento da enfermidade.
Figura 1. Ciclo evolutivo do Trypanosoma cruzi. Adaptado de wikipedia:
http://pt.wikipedia.org/wiki/Imagem:Chagas_ciclo_de_doença, e sob
autorização de Center of Controul of Desease (www.dpd.cdc. gov/dpdx).
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Desde os primóridos da descoberta da Doença de Chagas por Carlos Chagas,
em 1909, os fatores de incidência e gravidade têm promovido a busca incessante de
agentes com atividade antichagásica eficaz e que possam promover a cura da
enfermidade (Castro et al., 2006). O objetivo da terapêutica antichagásica consiste em
suprimir a infecção ou mesmo impedir o desenvolvimento da doença e promover a
eliminação dos parasitas da corrente sangüínea e dos tecidos. Entretanto, os fármacos
disponíveis até o ano de 2006 no Brasil, o benznidazol, e na Argentina, o nifurtimox,
Figura 2, não satisfazem totalmente estes objetivos. Além de sua toxicidade (Castro et
al., 2006, Coura & Castro, 2002; Urbina, 2001; Cançado, 1999; Viodé et al., 1998;
Korolkovas & Burckhalter, 1988)são inespecíficos e não apresentam eficácia na forma
crônica da doença (Katzung, 2001; Lana & Tafuri, 2000).
Figura 2. Estrutura química dos fármacos atualmente empregados no tratamento da
Doença de Chagas.
A pesquisa de novas alternativas medicamentosas tem como base o
conhecimento da estrutura e dos processos metabólicos do Trypanosoma cruzi.
Estudos comparativos entre o metabolismo dos tripanossomas e os seus hospedeiros
mamíferos têm demonstrado a existência de alvos enzimáticos específicos para a
ação de novos compostos com atividade antichagásica, entre estes citam-se a
cruzipaína, a tripanotiona redutase, a fumarato redutase, a gliceraldeído-3-fosfato
desidrogenase, a esqualeno epoxidase e a trans-sialidase parasitária (Krauth-Siegel et
al., 2005; Krauth-Siegel & Inhoff, 2003; Coura & Castro, 2002).
Entre estes alvos, a tripanotiona redutase se apresenta em evidência por ser
responsável pelo mecanismo celular de detoxificação de radicais livres, vital ao
parasita, o que corrobora sua característica como alvo potencial para a ação dos
fármacos (Krauth-Siegel et al., 2005; Krauth-Siegel & Inhoff, 2003; Coura & Castro,
2002; Urbina, 2001; Blumenstiel et al., 1999; Viodé, et al., 1998; Krauth-Siegel et al.,
1995; Jockers-Scherübl et al., 1989; Henderson et al., 1988). Face a estes fatos,
vários autores procuraram obter e estudar compostos que possuíssem a habilidade de
N
S
ON
O
O2NN
N
O
N
O2N
Nifurtimox Benznidazol
O
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inibir a enzima ou induzir a ocorrência de estresse oxidativo, responsável pela
formação de radicais tóxicos ao parasita (Krauth-Siegel & Inhoff, 2003; Blumenstiel et
al., 1999; Viodé, et al., 1998; Henderson et al., 1988). Assim, por esta via, os
compostos 5-nitro-heterocíclicos, devido à característica de formação do radical nitro
ânion, interagem com o sistema tripanotiona redutase e seu substrato, sendo
considerados responsáveis pela atividade biológica. Deste modo, estes compostos se
apresentam como excelente escolha para o estudo e desenvolvimento de futuros
candidatos à fármacos antichagásicos.
1.2 Nitrocompostos
Os nitrocompostos surgiram como agentes terapêuticos na década de 40 e têm
sido empregados, até a atualidade, em diversas classes terapêuticas. Em seu amplo
espectro de atividade destacam-se as aplicações como antiparasitários,
antibacterianos, vasodilatadores, anti-hipertensivos, inseticidas, sedativos,
antipiréticos, analgésicos, antiinflamatórios e antineoplásicos, entre outras (Rang et al.,
2004; Raether & Hänel, 2003; Sweetman, 2002; Katzung, 2001; Tavares et al., 1999;
Tocher, 1997; Kovacic et al., 1989; Korolkovas & Burckhalter, 1988; Herlich &
Scweigel, 1976; Dodd & Stilman, 1944). O grupo nitro presente nestes compostos é
chamado parasitóforo , por ser indispensável à ação antiparasitária, principalmente,
quando ligado aos anéis furânico, tiofênico e imidazólico (Korolkovas & Burckhalter,
1988).
Entre os nitrocompostos identificam-se diversos derivados nitro-heterocíclicos
com atividade antichagásica que podem ser utilizados em estudos visando o
aperfeiçoamento do seu perfil antiparasitário (Aguirre et al. , 2005, Cerecetto et al.,
2000). Entre estes compostos, a nifuroxazida, 5-nitro-furfulideno 4-hidroxi-
benzidrazida, um antimicrobiano de amplo espectro, que também apresenta atividade
antichagásica (Blumenstiel et al., 1999), têm se apresentado como candidato potencial
à modificação estrutural em trabalhos que envolvem estudos de QSAR (Rando et al.,
2002; Tavares et al., 1999; Tavares et al., 1997; Tavares, 1993). Inseridos neste
conjunto, os derivados 5-nitro-furfulideno benzidrazidas e 5-nitro-tiofilideno
benzidrazidas com estrutura análoga à nifuroxazida, Figura 3, se apresentam como
compostos promissores na busca de novos fármacos antichagásicos, visando o
aperfeiçoamento de sua atividade biológica, assim como, a redução de seus efeitos
tóxicos.
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Figura 3. Estrutura química da nifuroxazida e de análogos antichagásicos potenciais.
1.3 Mecanismo de ação dos nitrocompostos
Estudos com derivados 5-nitrofurânicos demonstraram que o grupo nitro na
posição 5 do anel furânico é essencial para o estabelecimento da atividade biológica
(Remers & Bers, 1997). O mecanismo de ação antichagásica da maioria dos
nitrocompostos está ligado ao processo de biorredução do grupo nitro e a
subseqüente interação dos produtos, formados na redução, com biocompostos
essenciais do parasita (Viodé et al., 1998; Tocher, 1997; Edwards, 1993; Edwards,
1990; Declerck & De Ranter, 1986).
De acordo com o mecanismo de ação, Figura 4, há evidências que a formação
do radical nitro ânion, em reação envolvendo um elétron, demonstrado pelo par Ar-
NO2/Ar-NO2-, é intermediário-chave no processo de redução e está envolvido na ação
antichagásica dos 5-nitro-heterocíclicos (Viodé et al., 1998). Neste caso, devido à
ocorrência de redução, a partir dos nitrocompostos, é possível avaliar a
interdependência entre o processo de tranferência eletrônica, de um agente redutor
para o grupo nitro, e a atividade biológica. Ressalta-se que o registro do valor
numérico da transferência eletrônica caracterizada por reação de oxi-redução é
considerado como o potencial de redução do grupo nitro. Desse modo, a determinação
do potencial redox, E0, ou até mesmo, do potencial catódico, Epc, gerado a partir da
redução do grupo nitro, permite avaliar a influência da redução desta classe de
compostos em sua atividade antichagásica. Adicionalmente, pode-se considerar o
potencial de redução do grupo nitro como sendo uma forma de quantificar a eficácia
farmacológica destes compostos.
Observa-se que os produtos ou demais intermediários formados a partir da
reação de redução destes fármacos também podem apresentar danos às enzimas e
ao DNA de bactérias e de parasitas como o Trypanosoma cruzi (Teixeira et al., 2002;
de Castro et al., 1999; Viodé et al., 1998; Hardman et al., 1996). Ainda assim,
considera-se o processo de redução dos nitrocompostos e a formação do par Ar-
NO2/Ar-NO2- como etapa fundamental para a atividade biológica observada.
OO
N N
NO2
H
HOH
Nifuroxazida
XO
N N
NO2
Y
H
H
Y = Grupos substituintesX = (O) furfulidenos, (S) tiofilidenos
7
SOD e TR representam as enzimas superóxido dismutase e tripanotiona redutase
presentes no Trypanossoma cruzi. TS2 é o produto da ação da tripanotiona
redutase sobre seu substrato T(SH)2.
Figura 4. Rotas de biorredução anaeróbia e aeróbia de nitrocompostos
aromáticos, e os intermediários, formados em reações
subseqüentes, ativos frente ao Trypanosoma cruzi e a
bactérias. Adaptado de Viodé et. al., 1998 e Edwards, 1993.
O2●-
Rota aeróbica
Superóxido
dismutase
(S.O.D.)
2 H + + e-
Fé 2+
H2O2
(enzimas
bacterianas)
Fé 3+
OH●+ OH-
espécies reativas tóxicas
Interage com
o substrato da
Tripnotiona
redutase
H2O + ½ O2
(T. R.)
T(SH)2 TS2
Ar-NO2●-
Rota anaeróbica
Ar●+ NO2- (nitrito)2H +
Protonação
Ar-NO2H - danos ao DNA
Ar-NO2
Ar-NO2H
1 e-
Ar-NO(derivado nitroso)
2 H + + 2 e-
2 H + + 2 e-
2 H + + 2 e-
(hidroxilamina) (azoxi composto)
(amino derivado) (azo derivado)
Ar-NHOH Ar-NHNH-Ar
Ar-NH2 Ar-N=N-Ar + H2O Ar-N=N-Ar (O)
- aceptor de grupos tióis
Rota aeróbica
Rota anaeróbica
Flavina
Ciclo
Fútil
Flavina H2
Membrana
Plasmática
O2O2●-
Ar-NO2 Ar-NO2 Ar-NO2●-
NADP+ NADPH
(1 e -)
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A Figura 4 apresenta também o processo de redução de 5-nitro-heterocíclicos
em duas condições distintas, na presença e ausência de oxigênio no meio intracelular.
Em meio aeróbio o radical nitro ânion gerado no processo de redução interage com o
oxigênio presente no meio, em uma etapa metabólica denominada ciclo fútil, formando
o radical O2-. Este radical sofre ação da enzima superóxido dismutase, SOD,
formando espécies como o peróxido de hidrogênio, H2O2 que podem desestruturar
membranas biológicas. O peróxido formado reage com enzimas ferrodoxinas liberando
espécies reativas tóxicas (OH-) às células bacterianas e parasitárias (Chauviére et al.,
2003; Viodé et al., 1998; Tocher, 1997; Edwards, 1993). Verifica-se, assim, que o
processo de redução além de apresentar dependência da estrutura do nitrocomposto,
também sofre influência do oxigênio presente e do meio envolvido na reação de
redução. A Figura 4 ilustra o mecanismo de biorredução de compostos 5-nitro-
heterocíclicos.
Suspeita-se que o processo de redução dos nitrocompostos resulta em inibição
da tripanotiona redutase (Krauth-Siegel et al., 2005; Blumenstiel et al., 1999). Por outro
lado, a redução do grupo nitro resulta em formação de produto eletrofílico que
promove a oxidação da ligação dissulfeto do substrato tripanotiona reduzido, (TS2), e a
subseqüênte formação de substrato oxidado, T(SH)2. Este processo inibe a formação
do substrato biologicamente ativo da tripanotiona redutase, a partir da biomolécula
T(SH2), o que torna o parasita deficiente em suas defesas enzimáticas contra espécies
reativas de oxigênio (Chauviére et al., 2003; Viodé et al., 1998; Hardman et al., 1996
Henderson et al., 1988).
Na via metabólica anaeróbia o radical aniônico formado na primeira etapa do
processo de redução é transformado em derivado nitroso (Ar-NO), que se apresenta
como um eficiente ligante de grupos tióis biomoleculares essenciais às enzimas e às
células. A partir desta etapa, podem ocorrer outras reações de redução, onde o
derivado nitroso gera o intermediário hidroxilamina (Ar-NHOH) e, posteriormente, sob
a ação de agentes redutores, este último é reduzido ao derivado amínico (Ar-NH2). A
reação de formação dos intermediários Ar-NO, Ar-NHOH e Ar-NH2 em ambiente
anaeróbio envolvem a transferência de dois, quatro e seis elétrons, respectivamente
(Julião et al., 2005; Chauviére et al., 2003; Viodé et al., 1998; Squella et al., 1996;
Edwards, 1993; Monteagudo et al., 1992).
A ativação biológica através do processo de biorredução de nitrocompostos
apresenta-se como ponto importante à pesquisa e ao aperfeiçoamento da atividade
biológica desta classe de compostos. Nesta linha de raciocínio, Rozenski et al. em
1995, conseguiram relacionar a ação antibacteriana com o potencial de redução de
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alguns nitrocompostos, comprovando que a atividade biológica é decorrente da
redução do grupo nitro. Paralelamente, diversos estudos sobre o mecanismo de
biorredução do grupo nitro e determinação do potencial de redução por meio de
técnicas eletroquímicas foram realizados, sendo possível, deste modo, conhecer os
intermediários formados e estimar, para cada um destes, a influência sobre a atividade
biológica (Maya et al., 1997; Edwards, 1990; Declerck & De Ranter, 1986).
Estudos polarográficos e voltamétricos (Julião et al., 2005; Bollo et al., 2003;
Karakus & Zuman, 1995; Nüñes-Vergara et al., 1995; Monteagudo et al., 1992;
Morales et al., 1987) foram também utilizados com o objetivo de elucidar o mecanismo
de redução e investigar a sua semelhança com o caminho metabólico envolvido na
biorredução dos compostos nitrofurânicos. Ainda neste contexto, Squella et al. em
1996 demonstrou que o radical nitro ânion gerado eletroquimicamente a partir da
nifuroxazida pareceu ser mais estável em relação aos radicais nitro ânions formados a
partir de outros compostos, entre estes, o nitrofural, o nifurtimox e a furazolidona.
Deste modo, a partir destas informações foi possível considerar que o processo de
biotransformação da nifuroxazida, caracterizada pela redução do grupo nitro e a
formação do correspondente radical nitro ânion, aliado à sua estabilidade, é a etapa
chave para o desempenho da atividade antichagásica (Blumenstiel et al., 1999) e
antimicrobiana (Squella et al., 1996; Edwards, 1993).
Paulino et al., em 2002, ao estudarem compostos bioisósteros nitrofurânicos e
nitrotiofênicos, avaliaram a possibilidade destes compostos atuarem como inibidores
de ligação da enzima tripanotiona redutase do Trypanosoma cruzi com o seu
substrato. Os nitrocompostos foram submetidos a metodologias computacionais, que
simularam a interação do fármaco com o seu receptor, buscando atividade
antiparasitária, entre estas, a antichagásica. Esses autores, em concordância com a
literatura (Blumenstiel et al., 1999; Viodé et al., 1998), descreveram a formação de
radical nitro ânion e também do superóxido a partir dos nitrocompostos como principal
mecanismo de ação antichagásica. Nestes casos sugere-se que algum produto de
redução do grupo nitro in vivo atue como inibidor da tripanotiona redutase, cuja
integridade é fundamental à sobrevivência do parasita.
1.4 Determinação do potencial de redução dos nitrocompostos
Técnicas eletroquímicas têm sido utilizadas para caracterizar o comportamento
redox de moléculas de interesse biológico. Segundo Brajter-Toth et al., 1981, este
processo se deve à constatação experimental de que as reações de transferência de
carga, promovidas em uma interface eletrizada (eletrodo/solução), conduzem a
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intermediários reativos e/ou produtos finais, os quais são os mesmos produzidos por
sistemas biológicos como, por exemplo, os sistemas enzimáticos (Serrano et al., 2006;
Serrano & Gil, 2005; Abreu et al., 2002; Brajter-Toth et al., 1981). Estas técnicas
apresentam rapidez e alta sensibilidade na detecção de espécies eletroativas
orgânicas presentes ou provenientes dos sistemas biológicos (Sapel’nikova et al.,
2001). Inserido neste contexto, as técnicas voltamétricas se apresentam como
ferramenta versátil para simular processos farmacológicos, bioquímicos e/ou
toxicológicos envolvendo mecanismos de transferência eletrônica e estresse oxidativo
(Bollo et al., 2003, Abreu et al., 2002).
O potencial de redução do grupo nitro depende da natureza e posição dos
substituintes presentes na molécula. De acordo com a possível relação entre a
atividade antichagásica dos derivados dos 5-nitro-heterocíclicos e o potencial de
redução, associados à reação Ar-NO2 + 1e- Ar-NO2-, as técnicas voltamétricas
têm sido propostas como método de escolha para medida do potencial de redução e
monitoramento de novos nitrocompostos a serem empregados como potenciais
agentes antichagásicos (Squella et al., 2005; Bollo et al., 2003; Paulino et al., 2002).
Neste aspecto, os dados sobre o potencial de redução fornecidos devem ser
acompanhados das seguintes informações especiais: método eletroquímico utilizado
para sua determinação (voltametria cíclica e/ou de onda quadrada, por exemplo), o
tipo de eletrodo de trabalho empregado e as condições utilizadas durante o processo
experimental, o eletrólito de suporte e o meio de reação (aquoso, misto ou aprótico).
As técnicas eletroquímicas (voltametria cíclica e voltametria de onda quadrada)
podem ser utilizadas em conjunto visando à complementação dos resultados obtidos,
podendo também, em alguns casos, ser comparadas. Tais técnicas envolvem a
aplicação de perturbação de potencial a um eletrodo, denominado eletrodo de
trabalho, de modo a promover reações de oxidação ou redução na interface
eletrodo/solução. Desse modo, o eletrodo pode ser visto como substituto dos agentes
oxidantes e redutores comumente empregados em solução (Serrano & Gil, 2005;
Harris, 2001; Brett & Brett, 1993; Bard & Falker, 1980). A diferença principal é que em
solução tem-se uma reação homogênea de transferência de elétrons, enquanto na
superfície do eletrodo a reação de transferência de carga é heterogênea (fase sólida e
solução).
O experimento voltamétrico é realizado em uma célula que contém o
nitrocomposto na presença de um eletrólito inerte em solução e envolve, além do
emprego do eletrodo de trabalho, o eletrodo de referência e o eletrodo auxiliar. O
potencial do eletrodo de trabalho é monitorado contra o eletrodo de referência, mas a
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corrente determinada no experimento é produzida pela reação de transferência de
carga flui entre o eletrodo de trabalho e o eletrodo auxiliar (Serrano & Gil, 2005; Brett &
Brett, 1993). O eletrodo de gota de mercúrio ainda é o eletrodo de trabalho mais
utilizado em voltametria (Squella et al., 2005; Bollo et al., 2003; Wang, 2000; La-Scalea
et al., 1998; Squella, et al., 1996; Rozenski, et al., 1995; Morales et al., 1987). Todavia,
devido ao uso limitado em regiões negativas de potencial e conseqüências ambientais
do emprego do mercúrio, este está sendo substituído por outros tipos de eletrodo,
como os eletrodos de carbono vítreo, de pasta de carbono ou diamante dopado com
boro, que além de evitar a contaminação ambiental permitem estudar os processos
eletroquímicos na região positiva de potencial (Serrano et al., 2006; Serrano & Gil,
2005; Wang, 2000).
O carbono apresenta como vantagens a ampla faixa de potencial (cerca de
+1,5 a -1,3 V vs ECS dependendo do meio de reação), além de ser
eletroquimicamente inerte, apresentar resultados reprodutíveis, na ausência de efeitos
de adsorção, e ser de baixo custo (Wang, 2000). Neste contexto, ressalta-se que o
eletrodo de trabalho constituído de carbono se aplica, principalmente, no estudo do
comportamento de reações redox de nitrocompostos, uma vez que permite a detecção
de intermediários formados no processo de redução em uma faixa de potencial ampla,
onde o carbono vítreo atua.
Nos últimos anos inúmeros relatos do processo de redução de nitrocompostos
envolvendo técnicas eletroquímicas têm sido descritos na literatura (Julião et al., 2006;
Julião et al., 2005, Squella et al., 2005; Mandal, 2004; Pedrosa, et al., 2003; Bollo et
al., 2003; La-Scalea et al., 1998; Paulino et al., 2002; Radi, 1999; Buchberger et al.,
1998; Monteagudo, et al., 1992; Morales et al., 1987), ressaltando o emprego de
voltametria cíclica e voltametria de onda quadrada.
1.4.1 Voltametria cíclica
A voltametria cíclica é técnica versátil de varredura de potencial que tem sido
amplamente utilizada para obter informações sobre reações eletroquímicas a partir do
registro de curvas corrente-potencial. Esta técnica consiste em aplicação de potencial
que varia continuamente com o tempo. Este processo resulta, assim, no registro das
reações eletroquímicas existentes. A voltametria cíclica possibilita a determinação do
potencial redox de espécies eletroativas, a elucidação da cinética das reações de
eletrodo e a avaliação da influência do meio de reação sobre o processo redox
(Serrano & Gil, 2005; Harris, 2001; Wang, 2000; Brett & Brett, 1993).
Na voltametria cíclica, a corrente produzida durante o processo eletroquímico é
obtida a partir da aplicação de uma onda ou rampa triangular de potencial ao eletrodo
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de trabalho, sempre mantido no estado estacionário, Figura 5 A, (Brett & Brett, 1993;
Bard & Falker, 1980). A varredura é iniciada em um dado valor de potencial
denominado de potencial inicial, Ei. A escolha do potencial inicial é realizada em
função da ausência de corrente faradaica (corrente devida a oxidação ou redução do
composto), ou seja, em determinado potencial onde não é detectada ou produzida
variação na estrutura do composto estudado. A partir da escolha de Ei, o potencial é
variado no sentido positivo ou negativo até um determinado valor, denominado de
potencial de inversão de varredura, E, onde, após este ponto, a varredura é invertida
até atingir o potencial de partida. Desse modo, uma corrente de oxidação ou redução é
produzida e registrada como função do potencial aplicado, tanto na varredura direta
quanto na varredura reversa, em uma ilustração denominada voltamograma cíclico,
apresentada na Figura 5 B (Harris, 2001; Wang, 2000; Brett & Brett, 1993).
Em que Ei é o potencial inicial de varredura, Eé o potencial de inversão, Ef é o potencial final,
e +E é o sinal que demostra a ocorrência de varredura no sentido positivo de potencial.
Figura 5. Onda triangular de potencial aplicado ao eletrodo de trabalho (A), expressão
gráfica da corrente vs potencial característica da Voltametria cíclica (B).
A voltametria cíclica é aplicada a sistemas em repouso para garantir que a
espécie de interesse chegue à superfície do eletrodo por meio de processo
exclusivamente difusional (Brett & Brett, 1993; Bard & Falkner, 1980), com exceção de
espécies que são oxidadas ou reduzidas a partir do estado adsorvido. Deste modo, a
partir da difusão das espécies eletroativas, ocorre a geração de uma camada de
difusão na interface eletrodo-solução, o que permite a interação destas espécies com
a superfície do eletrodo de trabalho e a sua detecção, no instante em que se realiza o
experimento. Neste contexto, observa-se que a resposta obtida para determinados
+E Oxidação
Ef
E
EiCorrente
Potencial
Ei
E
Ef
Tempo
(-) 10
Potencial
A B
Redução
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processos redox, caracterizado pela detecção de picos catódicos e/ou anódicos,
depende da concentração da espécie eletroativa em solução (Harris, 2001; Brett &
Brett, 1993).
Esta técnica é normalmente empregada para caracterizar a velocidade da
reação, de transferência de carga para a formação do radical nitro ânion, e seu tempo
de meia vida (parâmetros cinéticos). Adicionalmente, a voltametria cíclica é também
utilizada para estudar a reversibilidade do processo eletródico, ou seja, se o processo
é reversível, quasi-reversível ou irreversível, e avaliar a influência do meio reacional
sobre estes parâmetros, bem como sobre a ocorrência e estabilidade dos radicais e
intermediários formados pela redução de espécies eletroativas como os
nitrocompostos (Harris, 2001; Nunes-Vergara et al., 2001; Squella et al., 1996; Brett &
Brett, 1993; Morales et al., 1987). Entre os diversos trabalhos descritos na literatura
que descrevem o emprego voltametria cíclica no estudo da redução de
nitrocompostos, destaca-se o trabalho de Arguelho et al., em 2001, que estudaram a
redução do benzidazol em meio aprótico (DMSO e eletrólito de suporte Bu4NBF4) e
velocidade de varredura de 500 mV s-1, empregando-se os eletrodo de trabalho de
carbono vítreo, eletrodo de auxiliar de platina e eletrodo de referência de calomelano
saturado. Os autores obtiveram o potencial de redução do nitrofurfurilideno,
característico para o par reversível Ar-NO2/Ar-NO2-, de -1,03 V.
A voltametria cíclica não é a técnica mais recomendável para determinações
analíticas, devido a menor sensibilidade em comparação a outras técnicas
voltamétricas, sendo facilmente superada pela voltametria de pulso diferencial e de
onda quadrada. Apesar disso, o ponto forte da voltametria cíclica é a sua grande
versatilidade para a elucidação de processos de eletrodos e mecanismos de reação
(Brett & Brett, 1993; Olmstead et al., 1969).
1.4.2 Voltametria de onda quadrada
A voltametria de onda quadrada, empregada em análise quantitativa, é mais
rápida e sensível quando comparadas a outras técnicas voltamétricas. Esta técnica
consiste na aplicação de pulsos de potencial ao eletrodo de trabalho de modo a gerar
uma perturbação na forma de onda quadrada simétrica de potencial. A resposta obtida
possui a forma de degraus e é sobreposta a uma rampa linear crescente de potencial
(Souza et al., 2003; Osteryoung & Osteryoung, 1985).
Nesta técnica voltamétrica, independente do sentido da varredura, a corrente é
lida em instantes anteriores à aplicação do pulso e alguns segundos antes do término
do pulso, o que resulta em corrente determinada a partir da diferença entre os valores
FBT/FCF/USP 14
obtidos nos dois pontos, Figura 6. O processo de amostragem de corrente, também
realizado para a voltametria de pulso diferencial, apresenta a vantagem de eliminar a
corrente capacitiva, considerada a corrente de fundo não faradaíca, e a partir desta
característica a técnica se torna mais sensível. A partir da aplicação destes pulsos
pode ocorrer uma resposta catódica e outra anódica correspondente à reação redox,
de caráter reversível ou quasi-reversível, ou mesmo catódica ou anódica, dependendo
do sentido da varredura de potencial, quando a reação apresenta caráter de
irreversibilidade (Zelié, 2005; Souza et al., 2003; Lovric, 2000; Wang, 2000; Komorski-
Lovric & Lovirc, 1995; Brett & Brett, 1993; Osteryoung & Osteryoung, 1985).
Figura 6. Seqüência de pulsos (1-4) característica para a voltametria de onda
quadrada aplicados em determinado período de tempo. Corrente
amostrada é sempre i2 – i1. Adaptado de Brett & Brett, 1993.
Na caracterização eletroquímica de compostos nitro-heterocíclicos, os pulsos
catódicos e anódicos conduzem à formação do radical nitro ânion a partir do nitro
composto (redução) e re-oxidação do nitro anion ao respectivo nitrocomposto quando
o processo apresentar reação reversível, Ar-NO2 + 1e- Ar-NO2-. Assim, as
correntes catódica e anódica são registradas e submetidas, quando expressas em
forma gráfica, versus o potencial aplicado na rampa linear, resultando em
voltamograma consistindo de dois picos, sendo um de redução e outro de oxidação.
Alternativamente, pode-se plotar a diferença entre as correntes anódica e a
catódica como função da rampa linear de potencial. Neste caso, como as correntes
possuem sinais opostos, os picos se sobrepõem gerando um sinal maior de corrente,
Potencial
Tempo
Amplitude
Leitura do pulso direto
Leitura do pulso reverso
Degrau de Potencial
1
2
34
i1
i2
i1
i2
I
I
I
I
I
I
FBT/FCF/USP 15
denominada de resultante, Figura 7, [corrente catódica (-) + anódica (+)]
responsável pela maior sensibilidade da técnica quando aplicada a sistemas
reversíveis (Zelié, 2006; Souza et al., 2003; Harris, 2001). Por outro lado, pode ser
observada, também, a ausência de pico de oxidação, o que caracteriza a ocorrência
de reação irreversível, característica para a reação de redução do nitrocomposto ao
derivado hidroxilamina, Ar-NO2 + 4e- Ar-NO2H, em determinados meios de
reação.
Figura 7. Voltamograma de onda quadrada que demonstra a ocorrência de pulsos
direto (corrente catódica), reverso (corrente anódica) e a corrente
resultante. Adaptado de Brett & Brett, 1993.
Neste sistema voltamétrico, são identificadas, normalmente, algumas
características desejáveis para a detecção e quantificação de espécies eletroativas de
vida curta como o nitro ânion radical. Do mesmo modo como descrito para outros
sistemas voltamétricos, a quantificação de espécies eletroativas, que possibilita o
desenvolvimento de metodologia analítica, decorre do fato da corrente de pico ser
proporcional à concentração de analito. Outras particularidades importantes desta
técnica são: a possibilidade do emprego de amplitude ótima de pulso, a qual é
aplicada em cerca de 50/n mV (onde n é o número de elétrons envolvidos na reação
redox) e a utilização de valores de freqüência (Hz) de 1 a 100 ciclos por segundo, o
que permite o uso de velocidades de varredura da voltametria de onda quadrada
extremamente rápidas. Ressalta-se que esta característica resulta em menor tempo
para a realização dos experimentos, menor consumo de espécies eletroativas,
Potencial
Pulso reverso
Pulso diretoCorrenteResultante
Corrente
POTENCIAL
CORRENTE
FBT/FCF/USP 16
redução de bloqueamento da superfície do eletrodo e ainda proporciona menor
interferência de O2 em análises de amostras degaseificadas (Zelié, 2006; Souza et al.,
2003; Harris, 2001; Wang, 2000; Brett & Brett, 1993; Osteryung & Osteryung, 1985).
1.5 Modelagem Molecular
A busca de fatores que possam influenciar a redução do nitrocomposto ou,
precisamente, apresentar influência sobre o potencial de redução, está relacionada
com a obtenção de subsídios que permitam o entendimento mais aprofundado do
mecanismo de atividade biológica destes compostos. Tal processo permite, também, o
conhecimento de informações estruturais e de propriedades físico-químicas relevantes
que possam ser utilizadas para o planejamento e obtenção de novos nitrocompostos
com atividade antichagásica.
A aplicação de métodos de desenvolvimento de fármacos fundamentados em
informações estruturais e de propriedades físico-químicas se apresenta como
alternativa viável na busca de novos agentes com atividade farmacológica
aproveitável, com vantagens relativas à redução do tempo necessário à obtenção e
identificação de novos possíveis fármacos. Entre estes métodos, a modificação
estrutural de compostos bioativos efetuada por meio de estudos de química
computacional, precisamente, a modelagem molecular, se mostra como ferramenta
extremamente promissora (Carvalho al., 2003; Barreiro et al., 1997).
A modelagem molecular de compostos bioativos, como os nitrocompostos,
consiste em conjunto de ferramentas computacionais que são utilizadas na
compreensão de fatores estruturais de uma ou conjunto de moléculas, do mecanismo
de ação e, também, para a obtenção de dados e informações necessárias para o
estudo das relações entre estrutura química e a atividade biológica (Barreiro et al.,
1997; Höltje et al., 1997; Rozenski et al., 1997; Foye et al., 1995).
Entre os elementos perceptíveis nos estudos de modelagem molecular, alguns
podem ser ressaltados, como a flexibilidade e o arranjo conformacional preferencial,
propriedades estéreo-eletrônicas e valores de energia livre (G) e cargas que
influenciam a interação fármaco-receptor (Barreiro et al., 1997; Höltje et al., 1997).
A maioria das moléculas bioativas apresenta algum grau de liberdade
conformacional, sendo que o arranjo conformacional estável destas moléculas pode
mudar de acordo com fatores relacionados ao ambiente onde estas se encontram
(Patrick, 2001; Höltje et al., 1997). A conformação das moléculas de derivados 5-nitro-
heterocíclicos é resultante da presença de diferentes grupos funcionais em sua
FBT/FCF/USP 17
estrutura química, sendo que estes grupos exercem influência direta e indireta sobre
as características físicas e químicas, de caráter estrutural e eletrônico, da molécula.
Entre estas características estruturais estão a torsão angular, o volume e distâncias
intramoleculares, além da conformação de menor energia mínima. As características
eletrônicas se concentram em ocorrência de efeito indutivo e mesomérico, cargas dos
átomos, valores de energia livre, de HOMO (highest unuccopied molecular orbital) e de
LUMO (lowest occupied molecular orbital), da molécula (Höltje et al., 1997; Foye et al.,
1995).
Segundo Silva, em 2003, a conformação molecular é determinada através de
técnicas de modelagem molecular que analisam a flexibilidade e o arranjo espacial
não idêntico em uma dada molécula e o mesmo é resultante de rotações em torno de
uma ou mais ligações monovalentes.
A análise conformacional envolve métodos computacionais de mecânica
quântica e é dependente de fatores como ângulo das ligações, energia torsional,
distância de duplas ligações e barreiras de energia de rotação interna da molécula
(Silva, 2003; Höltje et al., 1997). Cada conformação calculada e obtida apresenta
valores de energia termodinâmica singulares, onde a estrutura que apresentar menor
valor de energia é considerada aquela de maior estabilidade no ambiente estudado.
Desse modo, algumas características estruturais consideradas importantes para a
atividade biológica como a torsão angular, volume e distância intramoleculares, são
normalmente determinados a partir da conformação de menor energia mínima obtida
pela avaliação conformacional realizada (Monastérios et al., 2005).
Outra aplicação determinante da modelagem molecular envolve o estudo de
características eletrônicas de compostos bioativos potenciais. Neste sentido, ressalta-
se que os valores de energia das propriedades eletrônicas são importantes para a
compreensão dos processos que envolvem e regem a interação fármaco-receptor e a
ação farmacológica. Como já citadas anteriormente, as propriedades eletrônicas
abrangem a densidade eletrônica e efeito mesomérico, cargas dos átomos, valores
termodinâmicos de energia livre, valores de energia dos orbitais de HOMO e LUMO da
molécula.
A análise dos valores de energia dos orbitais de HOMO e de LUMO
possibilitam a avaliação e até a quantificação de propriedades eletrônicas importantes
para o entendimento da reatividade da molécula e, do mesmo modo, desempenho de
sua bioatividade. A diferença entre os valores de HOMO e de LUMO provém
informações sobre a reatividade da molécula, em intervalo de energia chamado banda
de valência ou bandgap (Galeazzi et al., 2003; Freitas et al., 2002; Karelson et al.,
1996). Quanto menor os valores de bandgap maior será a reatividade da molécula
FBT/FCF/USP 18
estudada. Outras duas propriedades obtidas de acordo com os valores de energia de
HOMO e de LUMO são a dureza química () e o potencial químico () da molécula,
que são ferramentas importantes para o entendimento da estabilidade de diferentes
confôrmeros em um sistema molecular.
A dureza química, , calculada segundo a equação = (LUMO – HOMO)/2, é
uma medida da resistência da nuvem eletrônica molecular sofrer deformações
permanentes a partir de sua conformação original, e está diretamente relacionada com
a força de ligação dos átomos. (Pasha et al., 2005; Freitas et al., 2002; Thanikaivelan
et al., 2000; Karelson et al., 1996). Adicionalmente, a dureza química indica se a
molécula tem facilidade ou resistência à adaptação em determinadas reações
químicas ou até mesmo a sítios de interação fármaco-receptor.
O potencial químico, , representa a contribuição por mol de determinado
componente de uma mistura ou solução à energia livre total de determinado sistema
(Florence e Attwood, 2003; Netz e Ortega, 2002). Esta é uma propriedade relevante
em sistemas onde ocorre transferência de massa e energia, tais como reações
químicas radicalares, como as que ocorrem nos nitrocompostos, ou mesmo a
interação entre fármaco e receptor, e é calculada através da equação = - (HOMO +
LUMO)/2 (Pasha et al., 2005; Anadan et al., 2003; Thanicaivelan et al., 2000). Neste
sentido, aplicando o conceito do potencial químico, esta propriedade permite saber a
contribuição dos valores de energia do composto para a energia total do sistema
responsável pelo desencadeamento da atividade biológica.
Outras propriedades eletrônicas obtidas a partir dos valores numéricos da
energia dos orbitais HOMO e LUMO, como a afinidade eletrônica, AE, e o potencial de
ionização, PI, são calculados conforme o Teorema de Koopman (Pasha et al., 2005;
Anadan et al., 2004; Thanikaivelan et al., 2000). Este teorema, uma aproximação
matemática da teoria de orbital molecular, direciona ao emprego da primeira energia
de ionização da molécula à energia de HOMO, determinando o potencial de ionização
como valor negativo de HOMO. Neste mesmo processo, o conceito físico de potencial
de ionização é considerado como a energia requerida para formar um cátion ou ânion
em um processo de ionização (Thanikaivelan et al., 2000).
Do mesmo modo como descrito para o orbital LUMO, a afinidade eletrônica
reflete a capacidade de determinado ligante aceitar um elétron de um composto
doador (Anadan et al., 2003;Thanikaivelan et al., 2000). Segundo o Teorema de
Koopman, a partir dos valores numéricos de LUMO e de HOMO é possível definir os
valores de afinidade eletrônica, calculada por AE = - ELUMO, e dos potenciais de
ionização, calculados através da equação Ip = - EHOMO.
FBT/FCF/USP 19
Diante do exposto, observa-se que o emprego de metodologias de modelagem
molecular permite gerar conhecimento, sobre fatores estruturais e propriedades
eletrônicas, fundamental para o estudo de moléculas bioativas. Desta forma, tais
metodologias se apresentam como ferramenta relevante no processo de planejamento
e desenvolvimento de novos agentes terapêuticos.
1.6 Ensaios de suscetibilidade antichagásica
Os ensaios de suscetibilidade antichagásica são utilizados para avaliar a
bioatividade de fármacos antichagásicos frente a cepas de linhagens diferentes do
agente causador da doença de Chagas. Estes ensaios são também utilizados para
avaliar a atividade antiparasitária de novos compostos com potencial atividade
antichagásica. Segundo Coura, em 2003, centenas de compostos candidatos a
agentes tripanomicidas já foram testadas frente ao Trypanosoma cruzi em infecções
experimentais utilizando animais de laboratório, sendo poucos ensaiados no homem, e
a maioria destes com resultados de baixa eficácia (Coura, 2003; Coura & Castro,
2002).
A avaliação da suscetibilidade antichagásica pode ser realizada por meio de
ensaios in vivo e in vitro e os fatores de eficiência do teste podem ser comprovados a
partir do efeito antiproliferativo (inibição de crescimento parasitário) ou com o emprego
de parâmetros usuais em estudos farmacológicos como IC50, DL50, DE50 e MIC
(Dantas et al., 2006; Rosseli et al., 2005; Millet et al., 2002; Yardley e Croft, 1999;
Liendo et al., 1998). Ainda neste sentido, a atividade antichagásica pode ser
investigada através do emprego dos ensaios de inibição de enzimas específicas do
parasita, como a tripanotiona redutase, a fumarato redutase e a cruzipaína (Aguirre et
al., 2004; Paulino et al., 2002; Ifa et al., 2000; Blumenstiel et al., 1999; Bonnet et al.,
1997). Estes ensaios refletem a seletividade de compostos bioativos frente a alvos
específicos do parasita.
Os testes realizados para o estudo da infecção in vivo, estabelecidos
inicialmente por Carlos Chagas (Araújo-Jorge & de Castro, 1999), são realizados
atualmente através do emprego de diversos modelos experimentais. Entre os mais
utilizados, citam-se a avaliação da influência da administração de substâncias
bioativas sobre a parasitemia em coelhos, hamsters, cães, macacos e ratos (Araújo-
Jorge & de Castro, 1999). Os ensaios realizados em camundongos se encontram em
evidência em relação aos demais e são frequentemente utilizados nas análises de
suscetibilidade antichagásica (Araújo-Jorge & de Castro, 1999).
FBT/FCF/USP 20
Os ensaios da suscetibilidade do parasita in vitro envolvem o cultivo celular do
tripanossoma em meios de cultura apropiados como o LIT, liver infusion tryptose, o
BHI, brain-hearth infusion, ou o NNN, Nicolle McNeal & Novy, juntamente com o
composto sob análise em temperatura de 26 a 28 oC (Rodrigues et al., 2001; Araújo-
Jorge & Pirmez, 1999; Barbosa, 1999; Liendo et al., 1998).
Os protocolos de realização dos ensaios apresentam diferenças em relação à
forma evolutiva do parasita, que pode ser epimastigota, tripomastigota ou amastigota.
Quando são utilizadas as formas tripomastigota e amastigota é possível correlacionar
os resultados obtidos com a atividade antichagásica em anima mobile, uma vez que
estas formas que estão presentes em pacientes portadores do parasita. Entre os
muitos exemplos descritos na literatura que corroboram o emprego destas formas
parsitárias, destaca-se o trabalho de Chung et al., em 2003, que avaliou a atividade de
um derivado hidroximetilado do nitrofural e registrou a atividade antichagásica frente à
forma tripomastigota do parasita.
O ensaio da atividade antichagásica in vitro frente à forma epimastigota do
parasita encontra-se bem estabelecido na literatura (Muelas-Serrano et al., 2002a,b;
Liendo et al., 1998). Embora a forma epimastigota do tripanossoma não seja
usualmente encontrada no organismo humano, existem relatos de que a mesma se
encontra presente em células de mamíferos parasitados (Arán et al., 2005; Tyler e
Engman, 2001; Faucher et. al., 1999; Almeida de Faria et al., 1999). Desse modo, o
emprego do ensaio de suscetibilidade usando a forma epimastigota fornece resultados
passíveis de serem empregados em análise da atividade antichagásica in vivo.
Adicionalmente, estes resultados podem ser extrapolados para avaliações
farmacológicas mais próximas as observadas em infestações humanas,
especificamente frente às formas amastigota e tripamastigota.
Os resultados dos ensaios in vitro, no entanto, são fortemente dependentes
dos métodos de avaliação de crescimento ou inibição de proliferação parasitária,
normalmente realizada através da contagem do número de parasitas em câmara de
Neubauer. Este é o método mais difundido em pesquisa, sendo sua aplicação e
validade comprovadas através dos vários trabalhos descritos na literatura (De
Carvalho et al., 2005; Muelas-Serrano et al., 2002b; Liendo et al., 1998). Entre os
estudos de relevância destaca-se o trabalho de Liendo et al., em 1998, que avaliou o
efeito anti-proliferativo de derivados bis-triazole frente a forma epimastigota cultivada
em meio LIT. Estes ensaios envolveram a inibição de crescimento da cultura de
parasitas através de leituras realizadas tanto por meio de contagem em câmera de
Neubauer, como através de avaliação da densidade celular em contador de partículas
FBT/FCF/USP 21
eletrônicas. Os compostos estudados apresentaram concentração inibitória mínima de
1 a 3 M L-1 após incubação por 120 horas.
Outros métodos de leitura do número de células parasitárias bem
sedimentados por diversos grupos de pesquisa são a espectrofotometria UV/visível
(Pozas et al., 2005, Muelas-Serrano et al., 2000), microscopia de densidade ótica
eletrônica (Santa-Rita et al., 2005; Muelas-Serrano et al., 2002a) e análise de
citometria de fluxo (Villarreal et al., 2004; Vergnes et al., 2002). Neste contexto,
Gómez-Barrio et al. em 2006 avaliaram a atividade de derivados homoalilaminas frente
a forma epimastigota do parasita incubada em meio LIT e mantida em placas de
ELISA. Neste ensaio de microdiluição a leitura do número de células viáveis foi
realizada após 96 horas de incubação com o emprego de espectrofotômetro
UV/visível, 595 nm, e tratamento prévio da amostra com cristais do corante formazan e
de sulfato dodecil sódico (SDS). Os resultados deste ensaio indicaram que a maioria
dos compostos testados, em concentração de 10 g mL-1, não apresentaram atividade
antichagásica.
Alguns pesquisadores como Aguirre et. al., 2006 e Aran et al., 2005
empregaram o meio BHI para o cultivo e crescimento de cepas epimastigotas com
posterior aplicação em ensaios de suscetibilidade antichagásica utilizando leitura em
UV, 600 nm. Este meio de cultura apresenta coloração verde clara o que facilita a
leitura e detecção do crescimento celular por meio de espectrofotometria UV/visível.
Pozas et al. em 2005, estudaram análogos do nifurtimox e avaliaram a
suscetibilidade destes com testes frente a forma epimastigota cultivada em meio LIT,
com leitura feita em UV/visível, 580 nm. Embora os compostos tenham apresentado
atividade menor que o protótipo, este trabalho indicou a possibilidade de leitura por
espectrofotometria do crescimento celular do parasita em meio LIT sem tratamento
prévio da cultura. Neste sentido, em outro estudo, De Carvalho et al., avaliaram a
atividade antichagásica in vitro do ácido usnico extraído da Cladonia substellata e
realizaram leituras diretamente em meio LIT através de UV/visível, 580 nm (De
Carvalho et al., 2005). Este composto apresentou efeito inibitório sobre o crescimento
parasitário quando incubado em concentrações inferiores a 30-50 g mL-1 pelo período
de 24 horas.
Os resultados dos ensaios realizados por Pozas et al. em 2005 e De Carvalho
et al., 2005 descritos acima, realizados em meio LIT com leitura em espectrofotômetro
UV/visível, foram comparados com os valores obtidos através do emprego da câmera
de Neubauer com a finalidade de validação dos mesmos. Estes estudos comprovam a
possibilidade do emprego da metodologia de UV/visível na leitura do número de
FBT/FCF/USP 22
parasitas em meio LIT. Ressalta-se, no entanto, que embora existam vários métodos
de detecção de células parasitárias que podem ser aplicados nos ensaios de
suscetibilidade do tripanossoma aos compostos estudados, o emprego da câmera de
Neubauer ainda é o método de referência para a realização deste estudo, sendo
utilizado, muitas vezes, em paralelo com as outras análises.
1.7 Relações quantitativas entre estrutura-atividade biológica/Relações
quantitativas entre estrutura-propriedade
A resposta biológica provocada por um composto bioativo ocorre por meio de
interações ligante-biomacromolécula alvo e depende da sua estrutura química e de
propriedades físico-químicas intrínsecas. Estas propriedades podem ser de caráter
molecular ou atômico e expressam características de efeito eletrônico, reatividade,
forma, lipofilicidade, estabilidade e polaridade da molécula, entre outras.
Neste aspecto, a realização de modificações na estrutura de um fármaco
resulta em alterações em suas propriedades físico-químicas e, assim, em sua
absorção, biodisponibilidade, interação com o receptor biológico e na sua
correspondente bioatividade (Tavares, 2004; Montanari et al., 2002; Katzung, 2001;
Barreiro & Fraga, 2001; Hardman et al., 1996; Kubinyi, 1995).
As propriedades físico-químicas, principalmente no âmbito do desenvolvimento
de novos agentes terapêuticos, podem ser utilizadas para classificar e quantificar as
contribuições da estrutura química sobre a atividade biológica. Para melhor
entendimento, as propriedades físico-químicas de compostos bioativos, como a
hidrofobicidade, os efeitos eletrônicos e efeito estérico, são geralmente expressas por
meio de parâmetros ou descritores estruturais. Neste contexto, o conhecimento de
valores numéricos de cada descritor estrutural permite estimar a contribuição, de maior
ou menor intensidade, de tais propriedades sobre a atividade biológica (Tavares, 2004;
Cronin & Shultz, 2003; Kubinyi, 1993).
A avaliação da magnitude da influência das propriedades moleculares sobre
determinado efeito bioativo é realizada por meio do estudo das relações quantitativas
estrutura-atividade biológica, QSAR (Quantitative Structure-Activity Relationship). Já a
avaliação da interação entre as propriedades físico-químicas é realizada por meio da
análise das relações quantitativas estrutura-propriedade, QSPR (Quantitative
Structure-Property Relationship).
As análises de QSAR e QSPR ocorrem por meio da obtenção de modelos
matemáticos que envolvem descritores estruturais e/ou variáveis indicadoras
característicos de uma série de compostos com estrutura química análoga. Estas
FBT/FCF/USP 23
análises são aplicadas para a investigação da ocorrência de correlação entre
determinado descritor com outras propriedades físico-químicas ou ainda com a
atividade biológica estudada (He & Jurs, 2005; Verma & Hansch, 2005; Tavares, 2004;
Eriksson et al., 2003; Davis, 1997; Gaudio, 1996; Kubinyi, 1995; Martin, 1981). Desse
modo, a partir do conhecimento das relações entre as características moleculares e a
atividade biológica, propõe-se o emprego destas informações no planejamento, busca
e identificação de fármacos que apresentem melhor perfil farmacológico.
A idéia de que a atividade biológica depende da estrutura química de um
determinado composto surgiu através dos estudos de Crum-Brown & Fraser, em 1868
(Gaudio, 1996). Estes autores registraram que a paralisia desempenhada por uma
série de derivados da estriquinina ocorre em função da estrutura molecular destes
compostos, e pode ser expressa através da relação abaixo (Eq. 1).
Atividade Biológica = (constituição da molécula) (Eq. 1)
Meyer, em 1899, e Overton, em 1901, concluíram, independentemente, que o
efeito narcótico apresentado por diversos compostos não ionizados era dependente do
coeficiente de partição clorofórmio-água e que a atividade narcótica observada
possuia correlação linear com o aumento do coeficiente de partição.
Hammett em 1937, descreveu por meio de equação matemática a ocorrência
de relações lineares de energia livre para diferentes reatividades de compostos
orgânicos aromáticos. Esta equação foi construída avaliando-se a relação linear entre
a constante eletrônica sigma de Hammett () e os valores de energia livre de cada
composto testado. Hammett foi o primeiro autor a utilizar uma constante de
substituinte para descrever uma propriedade estrutural (Gaudio, 1996; Hammett 1937).
Hansch & Fujita em 1964, estudando uma série de derivados de ácido
fenoxiacéticos concluíram que modelos matemáticos lineares obtidos a partir de
estudos de QSAR, que combinavam parâmetros físico-químicos múltiplos relativos aos
efeitos eletrônicos, hidrofobicidade e estereoquímica, eram fundamentais para
descrever a atividade biológica. Neste estudo, os autores apresentaram a formulação
do descritor estrutural da hidrofobicidade () para grupos substituintes e o seu
emprego em equações multiparamétricas que descrevem a resposta biológica em
função de suas propriedades físico-químicas. Este estudo, combinado com a aplicação
de regressão múltipla, permitiu identificar as relações entre a atividade biológica e
FBT/FCF/USP 24
estrutura química de compostos bioativos, expressas por propriedades físico-químicas
de compostos análogos (Tavares, 2004; Ferreira, 2002; Leo & Hansch, 1995; Hansch
& Fujita, 1964).
Nesta mesma linha de trabalho, em estudos posteriores de QSAR, envolvendo
os fenômenos de transporte e distribuição de fármacos em sistemas biológicos,
Hansch & Clayton, em 1973, descreveram que a hidrofobicidade apresenta relação
não linear com a atividade biológica. Estes autores sugeriram que para um conjunto de
compostos análogos, cada componente deste apresenta um dado valor para a
hidrofobicidade e, dependendo de sua estrutura química, esta poderia influenciar a
atividade biológica de maneira positiva (crescente) ou negativa (decrescente).
Especificamente, neste trabalho foram efetuadas correções matemáticas junto ao
modelo linear, resultando na formulação do modelo parabólico, onde moléculas com
hidrofobicidade diminuída ou mesmo muito acentuadas apresentavam atividade
biológica reduzida ou nula (Tavares, 2004; Gáudio, 1996; Kubinyi, 1995; Leo &
Hansch, 1995; Kubinyi, 1993). Esta análise fundamenta-se na idéia de que um
fármaco deve apresentar valor de hidrofobicidade ótimo para conseguir transpor as
membranas biológicas e interagir com o sítio receptor (biomacromolécula alvo)
resultando na resposta farmacológica. Ainda neste aspecto, Kubinyi, em 1977, em
estudos que descreviam a existência de relações não lineares entre a hidrofobicidade
e a atividade biológica, formulou o modelo bilinear, o qual permitiu um ajuste
matemático do modelo parabólico proposto por Hansch (Kubinyi, 1995, Kubinyi, 1993;
Kubinyi, 1977).
Outro marco observado durante o desenvolvimento dos métodos de QSAR foi
o surgimento e o emprego da abordagem de QSAR em três dimensões (QSAR 3D).
Esta abordagem possibilita determinar a conformação ativa e, muitas vezes, as
interações do fármaco com o receptor, as quais não são visualizadas durante a
aplicação dos modelos matemáticos propostos por Hansch. Os estudos de QSAR 3D
foram, inicialmente, utilizados para mapear a superfície tridimencional dos receptores
farmacológicos através de resultados obtidos por meio da aplicação da Análise de
Hansch (Kubinyi, 1997; Kubinyi, 1993).
Cramer et al. em 1988, desenvolveram o método de QSAR 3D denominado
Análise Comparativa de Campos Moleculares (CoMFA), o qual permite descrever as
interações ligante-receptor considerando a conformação bioativa e as propriedades
físico-químicas de interações eletrostáticas e hidrofóbicas destes ligantes (Kubinyi,
1995; Kubinyi, 1993;Cramer et al., 1988). Entre outras abordagens, destaca-se a
metodologia que utiliza o aplicativo denominado VolSurf, que é amplamente utilizado
em pesquisa e desenvolvimento de fármacos. Esta metodologia fundamenta-se na
FBT/FCF/USP 25
obtenção de modelos matemáticos constituídos de valores de descritores físico-
químicos extraídos a partir de mapas de interação molecular (em 3D) e a subseqüente
correlação dos mesmos com a atividade biológica de interesse (Cruciani et al., 2000).
O desenvolvimento dos estudos de QSAR ao longo do século XX e seus
progressos permitiram não só o conhecimento das relações entre a estrutura química
e a atividade biológica de compostos bioativos, como também a definição dos
descritores estruturais que expressam as propriedades físico-químicas que influenciam
a atividade biológica destes compostos. As abordagens utilizadas em estudos de
QSAR, propostas inicialmente por Hammett, em 1937, e em seguida por Hansch &
Fujita, em 1964, juntamente com análise de QSAR 3D, se apresentam como
ferramentas poderosas e complementares, que permitem obter, com maior
abrangência, subsídios fundamentais para a identificação e desenvolvimento de novos
agentes terapêuticos.
1.7.1 Descritores estruturais
Os descritores estruturais são medidas que expressam de maneira quali e
quantitativa as propriedades físico-químicas de uma determinada estrutura química.
Estes são frequentemente utilizados para estabelecer correlações entre as
propriedades físico-químicas e a atividade biológica desempenhada por compostos
bioativos (Tavares, 2004; Cronin & Schultz, 2003; Grover et al., 2000; Kubinyi, 1997).
1.7.1.1 Descritores estruturais que expressam os efeitos eletrônicos
A distribuição eletrônica de determinada molécula é constituída da somatória
dos efeitos eletrônicos de cada grupo ou átomo que forma a estrutura química
molecular. As contribuições diversas de cada porção ou características que compõe o
efeito eletrônico, quando mensuráveis, são expressas por meio de descritores
estruturais característicos.
Existem diversos descritores estruturais propostos para descrever os efeitos
eletrônicos, entre os mais utilizados citam-se a constante de Hammett (), as
constantes de Swain e Lupton para os efeitos de campo e ressonância ( e ),
respectivamente, parâmetros derivados de espectroscopia molecular, como freqüência
de absorção no IV (), e deslocamento químico em espectros de RMN 1H e 13C (), e a
constante de ionização (Ka) (Kubinyi, 1995; Jurs et al., 1995; Kubinyi, 1993; Swain &
Lupton, 1968). Outros descritores têm sido utilizados em escala crescente para
expressar as diferentes contribuições moleculares sobre o efeito eletrônico, entre
estes cita-se a variação no momento dipolar e os parâmetros derivados da química
quântica como as energias dos orbitais moleculares, HOMO e LUMO, energia de
FBT/FCF/USP 26
formação (Hf), potencial químico (), afinidade eletrônica (AE), entre outros. (Cheng
& Yuan, 2006; Gensmantel, 1997; Kubinyi, 1995; Jurs et al., 1995; Kubinyi, 1993).
Constante de Hammett
Hammett em 1937, estudou a reatividade do ácido benzóico em água a
25 oC e verificou a existência de relação linear entre o logaritmo da constante de
ionização do ácido benzóico não substituído e o logaritmo da constante de ionização
do ácido benzóico substituído. O sistema químico estudado por Hammett está
representado na Figura 8.
Figura 8. Reação de ionização de ácidos benzóicos.
O autor deste estudo concluiu que a presença de grupos substituintes ligados
ao ácido benzóico em posição para ou meta exercem influência, por meio do efeito
eletrônico, de maneira a facilitar ou dificultar a ionização destas moléculas. A partir
deste experimento foi formulada uma equação que relaciona a constante de ionização
do ácido benzóico não substituído e dos derivados do ácido benzóico substituído (Eq.
2). A partir desta equação observou-se o isolamento do efeito atribuído
exclusivamente ao grupo substituinte, representado por (sigma de Hammett).
= log KX – log KH (Eq. 2)
Em que:
KX e KH, são valores das constantes de ionização para o composto substituído enão substituído, respectivamente;é a constante que mede a influência do efeito eletrônico do grupo substituintesobre a reação de ionização.
A partir do emprego da equação 2 foi possível determinar o valor da constante
de Hammett para diversos grupos substituintes. Com isso, o autor verificou que a
ionização, medida através da constante de ionização das moléculas empregadas
COOH
X
COO-
X
KX
+ H+
FBT/FCF/USP 27
neste trabalho, poderia ser utilizada para estimar o efeito eletrônico de sistemas
similares ao estudado.
A partir da transformação matemática da equação 2, Hammett sugeriu a
formulação da equação 3, onde o autor atribuiu os valores das constantes do ácido
não substituído como zero (H = 0), e do ácido benzóico substituído R como valor
numérico maior ou menor que zero. Neste sentido, os derivados que apresentam
grupos doadores ou aceptores de elétrons ligados ao ácido benzóico possuem valores
de negativos ou positivos, respectivamente.
log KX = + log KH (Eq. 3)
Em que:
KX e KH, são valores das constantes de ionização para o composto substituído enão substituído, respectivamente;é o coeficiente angular da equação e indica a susceptibilidade da ocorrência areação do grupo substituinte;é a constante que mede a influência do efeito eletrônico do grupo substituintesobre a distribuição eletrônica da molécula.
A equação de Hammett é preditiva no sentido de que o conhecimento da
constante eletrônica possibilita a estimativa da reatividade de um composto. A
constante de Hammett obtida a partir do modelo proposto (Eq. 3) possui caráter
aditivo e é característica de cada grupo substituinte, sendo também conhecida como
constante de grupo. Além disso, é independente da reação envolvida ou mesmo da
molécula (ácido benzóico substituído) em que este grupo está ligado e sofre influência
da posição que o substituinte ocupa na molécula (meta ou para) (Tavares, 2004;
Gaudio em 1996; Hansch & Leo, 1995; Kubinyi, 1995; Kubinyi, 1993; Hansch et al.,
1991; Hammett, 1937).
Taft, em 1956, observou que o emprego da equação de Hammett não se
aplicava adequadamente ao estudo de moléculas alifáticas e aromáticas com
presença de grupo substituinte em posição orto (Kubinyi, 1995; Kubinyi, 1993; Hansch
et al., 1991; Taft,1956). Neste aspecto, Taft & Lewis, em 1959, realizaram análises
detalhadas da equação de Hammett e propuseram a formulação de derivações desta
(Eq. 4 e 5), em que a constante de Hammett foi dividida individualmente em efeito
indutivo e de ressonância, I e R, respectivamente (Taft & Lewis, 1959).
O emprego destas equações permitiu conhecer e quantificar a influência do
efeito eletrônico de grupos substituintes presentes nas posições para e também em
FBT/FCF/USP 28
meta (m e P), sobre a molécula de compostos aromáticos (Kubinyi, 1995; Kubinyi,
1993; Hansch et al., 1991; Taft & Lewis, 1959; Taft, 1956). Todas estas derivações da
equação de Hammett são apresentadas nas equações 4 e 5.
P = I + R (Eq. 4)
m= I + R (Eq. 5)
Em que:P e m são valores da constante de Hammett para substituintes na posição
para e meta no anel benzênico, respectivamente;I e R são valores da contribuição para os efeitos indutivo e de ressonância,
respectivamente;é o fator de correção para o efeito de ressonância a partir da posição meta.
O trabalho de Taft & Lewis permitiu também a dissociação do efeito polar em
suas componentes de efeito indutivo e de ressonância em uma mesma relação. Esta é
empregada quando a equação de Hammett original não fornece boa correlação ou
quando se pretende conhecer a contribuição de cada um dos efeitos isoladamente
(Tavares, 2004; Hansch & Leo, 1995; Kubinyi, 1995; Kubinyi, 1993; Hansch et al.,
1991; Taft, 1959). A equação que permite a obtenção dos valores isolados das
propriedades físico-químicos ficou conhecida como equação de Hammett extendida,
Eq. 5.
log KX = II + RR + log KH (Eq. 6)
Em que:KX é a constante de ionização do composto substituído;KH é a constante de ionização do composto não substituído;I e R são os coeficientes angulares da equação de Hammett relativos aos
efeitos indutivo e de ressonância, respectivamente;I e R são as contribuições dos efeitos indutivo e de ressonância,respectivamente.
Similarmente ao trabalho de Taft & Lewis, Swain & Lupton, em 1968,
propuseram a separação do efeito eletrônico de grupos substituintes em efeitos de
campo e de ressonância representados por e , respectivamente. Estes descritores
estruturais foram posteriormente redimensionados por Hansch, em 1976, o que
FBT/FCF/USP 29
redefiniu a forma de obtenção e o emprego dos valores correspondentes a estes
descritores (Hansch & Leo, 1995; Kubinyi, 1993; Van de Waterbeend, 1992; Hansch et
al., 1991).
Correlação de Hammett-Zuman
A correlação de Hammett-Zuman é um procedimento criado por Zuman com a
finalidade de avaliar com maior profundidade a influência do efeito eletrônico sobre o
potencial de redução de espécies eletroativas (Macías-Ruvalcaba et al., 2002). Esta
relação foi definida como uma aproximação matemática da equação linear de
Hammett, em que se busca correlacionar o descritor a alguns parâmetros obtidos a
partir de técnicas eletroquímicas (Eq. 7), entre estes o potencial e redução e o
potencial de meia onda (E1/2).
Segundo Bautista-Martinez et al., 2003, o emprego correlação de Hammett-
Zuman permite a investigação detalhada da influência de grupos aceptores ou
doadores de elétrons sobre determinados sistemas moleculares. A partir da diferença
entre os valores de E1/2 do composto não substituído e dos derivados substituídos (Eq.
8) obtém-se os valores que podem ser correlacionados ao sigma de Hammett.
Além disso, tal correlação é empregada quando se supõe que existam reações
químicas acopladas ao processo de transferência de elétrons. Ressalta-se que este
procedimento permite avaliar a ocorrência de correlação linear, ou até não linear, do
descritor sigma de Hammett com o potencial de meia onda, obtido a partir da redução
de derivados eletroativos (Macías-Ruvalcaba et al., 2002; Cosimeli et al., 2001). O
descritor de Hammett tende a apresentar correlação com o potencial de redução ou
potencial de meia onda E1/2, calculado por meio da equação 7 e 8.
E1/2 = Iπx (Eq. 7)
E1/2 = E1/2X - E1/2H (Eq. 8)
Em que:E1/2H e E1/2X correspondem aos valores dos potenciais de meia onda do
composto eletroativo não substituído e substituído, respectivamente;Iπ é o coeficiente angular da correlação de Hammett-Zuman;x é a constante que mede a influência do efeito eletrônico do grupo
substituinte sobre o E1/2.
FBT/FCF/USP 30
1.7.1.2 Descritores estruturais que expressam hidrofobicidade
A hidrofobicidade é a propriedade físico-química que desperta maior interesse
nos estudos de QSAR. Este fato ocorre porque a hidrofobicidade regula tanto a
solubilidade de fármacos, como os processos de absorção, distribuição nos diversos
compartimentos biológicos, tempo de meia-vida e excreção (Katzung, 2001; Hansch et
al., 1990). Em conseqüência, sugere-se que a hidrofobicidade interfere na habilidade
do fármaco de ação específica em atingir e ligar-se ao sítio receptor, interação em que
é responsável pela resposta farmacológica e influencia a intensidade da atividade
biológica (Patrick, 2001; Katzung, 2001).
A compreensão destes processos envolve o conhecimento da estrutura, função
e propriedades das membranas biológicas e engloba, também, as propriedades físico-
químicas como grau de ionização, em função do pH, e lipofilicidade relativa das formas
neutra e ionizada das moléculas estudadas (Tavares, 2004; Barreiro & Fraga, 2001).
Os fármacos são, em sua maioria, ácidos ou bases fracas, e quando presentes
em solução se apresentam em situação de equilíbrio químico entre a forma não
ionizada (dissociada ou neutra) e forma ionizada molecular. A forma neutra é
geralmente mais lipossolúvel e se difunde através das membranas biológicas por
processo passivo, o qual ocorre em função do gradiente de concentração do sistema,
do coeficiente de partição e do volume molecular. A forma ionizada, no entanto,
somente é absorvida através de transporte ativo que é grandemente influenciado pelo
pKa do composto e pH do meio biológico (Tavares, 2004; Barreiro & Fraga, 2001;
Kubinyi, 1995; Kubinyi, 1993).
Entre os descritores estruturais que expressam a hidrofobicidade destacam-se
o coeficiente de partição (log P), a constante de Hansch e a constante de Rekker
(Manhold et al., 1998; Kubinyi, 1995; Kubinyi, 1993; Hansch & Fujita, 1964).
Coeficiente de Partição
O coeficiente de partição (log P) pode ser definido como a razão entre as
concentrações, em condições de equilíbrio, de um composto dissolvido em sistema
bifásico cosntituído por uma fase aquosa e uma fase orgânica (Kubinyi, 1993). Este é
um dos descritores estruturais mais utilizados em estudos de QSAR e sua
determinação fidedigna é fundamental para a compreensão do mecanismo de ação e
planejamento de novos fármacos. Neste sentido, o sistema 1-octanol/ tampão fosfato
pH 7,4 é considerado o sistema de escolha para a determinação do coeficiente de
partição de moléculas para a aplicação em estudos de QSAR (Tavares, 2004; Hansch
& Leo, 1995; Kubinyi, 1993; Leo & Hansch, 1971).
FBT/FCF/USP 31
As vantagens do emprego do 1-octanol como fase orgânica, em relação a
outros sistemas utilizados para a determinação do coeficiente de partição, são:
constiui solvente quimicamente estável; apresenta grupo hidroxila com capacidade de
formar ligações de hidrogênio com grande variedade de grupos polares de diferentes
soluções; tem capacidade de dissolução de muitos compostos orgânicos; as ligações
de hidrogênio da molécula solvatada não necessitam ser quebradas durante a
transferência da fase orgânica para a fase aquosa; e não é volátil em temperatura
ambiente. Embora imiscível em água, o 1-octanol tem capacidade para dissolver até
2,3 mol L-1 de água sob condições de equilíbrio (Tavares, 2004; Kubinyi, 1995;
Kubinyi, 1993). Outra característica importante do solvente 1-octanol é a possibilidade
de medição direta na região do UV, uma vez que este não absorve na faixa do
espectro de UV onde a maioria dos fármacos absorve (Tavares, 2004; Kubinyi, 1993).
A determinação do coeficiente de partição pode ser feita pelos métodos de
Shake-flask, cromatografia de camada delgada (CCD), e cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE). O método de Shake-flask está fundamentado na dissolução de um
composto em sistema bifásico formado por um solvente aquoso e um solvente
orgânico, preferêncialmente o 1-octanol (Tavares, 2004; Kubinyi, 1993; Waller, 1994;
Deardem & Mays, 1985; Hansch & Fujita, 1964). Este método, no entanto, está sendo
substituído por técnicas cromatográficas devido à necessidade de pureza do composto
a ser testado e de tempo prolongado para a realização das medidas experimentais.
Adiciona-se a este fato a dificuldade de reprodutibilidade dos resultados obtidos.
A determinação do coeficiente de partição a partir das técnicas
cromatográficas, que promovem a separação dos compostos, como a CCD e CLAE,
envolvem o emprego de parâmetros característicos para cada técnica, Rf e K’,
respectivamente. Os valores de Rf e K’ se relacionam com o coeficiente de partição
através das equações 9 e 10, utilizadas para a CCD, e 11 e 12, empregadas para a
CLAE, o que possibilita, desse modo, a sua determinação.
Rm = Log [ 1/Rf -1] (eq. 9)
Log P = a Rm + b (eq. 10)
Em que:Rm representa a distância percorrida em relação a um composto padrão;Rf representa a razão entre as distâncias percorridas pelo composto e peloeluente;
P é o coeficiente de partição do composto;a e b são os coeficientes angular e linear da equação, respectivamente.
FBT/FCF/USP 32
K’ = (tr- to)/ to (eq. 11)
Em que:K’ é o fator de capacidade;tr representa o tempo de retenção do composto;to representa o tempo de eluição do solvente.
O tempo de retenção de compostos em sistema 1-octanol/fosfato utilizando
CLAE é expresso quantitativamente pelo fator de capacidade K’. A relação entre o Log
K’ e LogP é obtida através da aplicação da equação descrita a seguir.
logP = log K + log K’ (eq. 12)
Em que:K constante de retenção em meio aquoso,K’ é o fator de capacidade,logP é o logaritmo do coeficiente de partição do composto estudado.
Descritor de Hansch
O descritor estrutural de caráter hidrofóbico foi definido por Hansch & Fujita,
em 1964, como a medida da contribuição hidrofóbica de um determinado grupo
substituinte para o coeficiente de partição da molécula como um todo. Esta medida foi
avaliada a partir da relação logarítmica entre o coeficiente de partição de um composto
substituído e o coeficiente de partição do seu análogo não substituído (Eq. 13).
x = logPx – logPH (eq. 13)
Em que: é a constante de Hansch empregada para expressar a contribuição
hidrofóbica de grupos substituintes, X.LogPx é o coeficiente de partição do composto substituído,LogPH é o coeficiente de partição do composto não substituído.
O descritor de hidrofobicidade sofre influência significativa da posição que o
grupo substituinte ocupa na molécula. O valor de e LogP utilizados para descrever a
hidrofobicidade podem, atualmente, ser calculados empiricamente, sendo que este
procedimento deve ser complementar aos dados obtidos experimentalmente (Tavares,
2004; Kubinyi, 1993; Hansch & Fujita, 1964).
FBT/FCF/USP 33
1.7.1.3 Parâmetros que expressam a atividade biológica
A atividade biológica é resultante da resposta do organismo frente a um
estímulo provocado por compostos bioativos. Neste aspecto, quando se estudam
compostos bioativos potenciais é de fundamental importância a detecção e a
determinação de resposta biológica observada, a qual promove o entendimento dos
mecanismos que regem o efeito farmacológico. Desta forma, as medidas de atividade
biológica devem estar perfeitamente estabelecidas e apresentar elevada precisão e
qualidade em sua determinação para que possam ser usados em modelos
quantitativos, como os obtidos em estudos de QSAR (Tavares, 2004, Cronin &
Schultz, 2003; Grover et al., 2000).
Segundo Cronin & Schultz, 2003, a obtenção dos dados de atividade biológica
e o seu emprego em estudos de QSAR deve seguir algumas diretrizes fundamentais
para que seja possível manter a qualidade dos modelos obtidos. Entre estas, cita-se a
utilização de protocolos simples e a realização dos ensaios em laboratório pré-
determinado e adequado para os analistas efetuarem as análises. Se possível, deve-
se manter sempre o mesmo grupo de analistas nos ensaios biológicos a serem
realizados (Cronin & Schultz, 2003).
A atividade biológica é expressa, geralmente, por meio de potência, e segundo
Tavares, 2004, esta é considerada como sendo o inverso da dose ou concentração
necessária para a obtenção de uma determinada resposta biológica. Desta forma,
quanto menor for a dose necessária para a obtenção de determinada resposta
biológica, maior será a potência do composto analisado (Tavares, 2004; Hansch &
Leo, 1995).
Neste sentido, a escolha do método de quantificação da atividade biológica que
resulte em estimativa de sua potência e em determinação fidedigna de modelos
matemáticos são requisitos fundamentais para o êxito de estudos de QSAR (Tavares,
2004; Cronin & Schultz, 2003; Grover et al., 2000). Entre os parâmetros empregados
para descrever de forma semi-quantitativa ou quantitativa a atividade biológica cita-se
a determinação de dados de inibição de crescimento celular, de concentração inibitória
mínima (CIM), a dose terapêutica eficaz em 50% dos indivíduos (ED50), a dose letal
em 50% dos indivíduos (DL50), e a afinidade de ligantes a determinados receptores
(Ki), entre outras (Tavares, 2004; Cronin & Schultz, 2003; Grover et al., 2000).
1.7.1.4 Escolha dos grupos substituintes
O Diagrama de Craig é uma ferramenta utilizada na seleção de grupos
substituintes de um composto bioativo, que possibilita o planejamento de um conjunto
de análogos adequado para a condução de um estudo de QSAR.
FBT/FCF/USP 34
O emprego deste diagrama permite a obtenção de informações, referentes a
propriedades físico-químicas de efeitos eletrônicos (de Hammett) e hidrofobicidade
(de Hansch), que fornecem suporte aos estudos de QSAR clássico, especificamente
para a análise de Hansch.
Este diagrama consiste em distribuição espacial de grupos substituintes de
acordo com os valores dos descritores físico-químicos (eixo X) e (eixo Y) em um
sistema cartesiano bidimencional, Figura 9. Ressalta-se que cada grupo encontra-se
disposto ao longo dos eixos X e Y dependendo do valor dos descritores físico-
químicos determinado experimentalmente (Kubinyi, 1993; Craig, 1971).
= constante de grupo de Hammett;= constante de hidrofobicidade de Hansch
Figura 9. Diagrama de intercorrelação vs em substituição para-aromática do ácido
benzóico. Adaptado de Craig, 1971.
O emprego do diagrama ocorre por meio da localização de determinado grupo
substituinte no diagrama, onde a partir de suas coordenadas podem-se observar os
valores de e correspondentes (Craig, 1971). A partir de estudos de QSAR que
envolvem a análise da atividade biológica em função dos dois descritores estruturais,
e , a escolha dos substituintes deve atingir a maior dispersão possível no diagrama,
ou seja, os substituintes devem ser selecionados nos quatro quadrantes diferentes,
(-) (+)
(+) (+)
(-) (-)
(+) (-)
FBT/FCF/USP 35
incluindo os grupos -CH3, -NO2, -Cl ou -Br, -H, -NH2 ou-N(CH3)2 (Tavares, 2004;
Volkhard, 1995).
Quando a análise de QSAR envolve o estudo de um único descritor físico-
químico (ou ) deve-se escolher grupos substituintes localizados nas proximidades
de uma linha imaginária paralela ao eixo da propriedade estudada (Tavares, 2004;
Patrick 2001). A escolha adequada dos grupos substituintes faz parte de um conjunto
de cuidados que, se considerados, podem levar à obtenção de correlações
significativas, em estudos de relação estrutura-atividade. Ressalta-se que no processo
de escolha dos grupos substituintes deve-se evitar a colinearidade entre os descritores
(variáveis independentes), o que evita a obtenção de equações não representativas do
fenômeno estudado.
1.7.1.5 Análise de Hansch
O processo dinâmico que resulta na atividade biológica de compostos bioativos
envolve diversos fatores, entre os quais, a absorção, distribuição, interação fármaco-
receptor e excreção destes compostos. Neste sentido, os estudos de QSAR, se
apresentam como ferramenta essencial para o entendimento dos fatores que regem a
resposta biológica e, adicionalmente, permitem estabelecer as relações entre as
propriedades físico-químicas de uma série de compostos análogos com a atividade
biológica por eles desempenhada.
A análise de Hansch é o modelo de QSAR em duas dimensões (QSAR 2D)
mais difundido atualmente e se aplica a série de compostos de estrutura análoga com
variação dos grupos substituintes em posições definidas. Ressalta-se que os
compostos presentes na série estudada devem, se possível, apresentar o mesmo
mecanismo de ação e disponibilidade de descritores físico-químicos confiáveis
(Tavares, 2004; Gaudio, 1996; Kubinyi, 1995; Kubinyi, 1993). Está análise está
fundamentada na contribuição aditiva de diferentes propriedades físico-químicas,
expressas por descritores estruturais, sobre a atividade biológica (Tavares, 2004;
Gaudio, 1996; Kubinyi, 1995; Kubinyi, 1993; Martin, 1981; Hansch & Fujita, 1964).
A partir do emprego da Análise de Hansch pode-se caracterizar e isolar as
contribuições individuais de cada propriedade físico-química que influência a
bioatividade de um fármaco. Este processo ocorre por meio da avaliação de modelos
matemáticos obtidos a partir de análise de regressão linear, linear múltipla ou
regressão não linear e visa correlacionar os valores da atividade biológica com as
propriedades físico-químicas estudadas (Gaudio, 1996; Kubinyi, 1993). Nesta análise
de QSAR 2D, os descritores estruturais encontram-se ajustados em equação linear
FBT/FCF/USP 36
multiparamétrica (Eq. 14), a qual permite determinar a dependência da atividade
biológica em relação a estes descritores. Desse modo, a partir da aplicação da análise
de Hansch, podem-se descrever as relações entre as propriedades físico-químicas e
atividade biológica, e, por meio de extrapolação ou interpolação predizer valores da
atividade biológica de um composto ainda não analisado (Tavares, 2004; Gaudio,
1996; Kubinyi, 1995).
No caso de sistemas biológicos, o estudo das relações lineares entre a
hidrofobicidade e a atividade biológica é aplicado apenas a uma faixa limitada de
valores. Este fato está fundamentado na idéia de que moléculas que são muito
hidrofóbicas ou muito hidrofílicas não possuem habilidade de atravessar as
membranas biológicas. Face a este fato, Hansch & Fujita, em 1964, formularam o
modelo matemático parabólico (Eq. 15), que descreve a ocorrência de relação não
linear entre a hidrofobicidade e a atividade biológica. Este modelo expressa a
dependência da atividade biológica com a hidrofobicidade, onde esta propriedade é
linear até alcançar um valor de considerado ótimo, a partir do qual a atividade tende a
decrescer, delineando o perfil parabólico da curva (Tavares, 2004; Tavares 2003).
Kubinyi, em 1977, re-avaliou a influência da hidrofobicidade sobre a resposta
biológica e formulou o modelo matemático bilinear (Eq. 16), o qual é considerado um
ajuste do modelo parabólico aos dados experimentais obtidos e aplicados nos estudos
de QSAR. O autor inseriu no modelo o termo bilinear (), que assume caráter
probabilístico e expressa tanto os processos de transporte e distribuição de um
fármaco através de sistemas biológicos multicompartimentados, como a ocorrência de
relação não linear entre a hidrofobicidade e a atividade biológica (Kubinyi, 1995;
Kubinyi, 1993; Kubinyi, 1977).
log 1/C = a + b+ c (eq. 14)
log 1/C = -a()2 + b + c+ d (eq. 15)
log 1/C = a – b log (+ 1) + c (eq. 16)
Em que:log 1/C representa os valores de atividade biológica;C é a concentração do fármaco requerido para uma dada resposta biológica;a, b, e c são as constantes obtidas através de análise de regressão;é a constante de Hammett empregada para expressar o efeito eletrônico de
grupos substituintes;é a constante de Hansch empregada para expressar a hidrofobicidade de
grupos substituintes.
FBT/FCF/USP 37
1.7.1.6 Quimiometria aplicada ao estudo de QSAR/QSPR
Passados cerca de trinta anos desde a inserção na literatura da análise de
Hansch, outras metodologias matemáticas têm sido descritas e aplicadas com êxito na
construção de modelos, que permitem avaliar as relações quantitativas entre a
estrutura química e a atividade biológica (He & Jurs, 2005; Eriksson et al., 2003;
Ferreira, 2002; Franke & Gruska, 1994). Tais procedimentos, chamados de
quimiométricos, são particularmente empregados quando o número de variáveis
independentes (descritores estruturais) é equivalente ou mesmo excede o número de
compostos estudados (Eriksson et al., 2003). A quimiometria é também utilizada no
reconhecimento de propriedades que permitem a identificação de grupos e, também,
na análise de dados obtidos a partir de fontes de natureza multivariada (Ferreira,
2002).
A quimiometria engloba métodos de regressão, classificação de variáveis
analisadas ou métodos de reconhecimento de padrões. Os primeiros envolvem a
metodologia de regressão linear múltipla (MLR), a regressão por componentes
principais (PCR), e a regressão por mínimos quadrados parciais (partial least squares -
PLS). Já as metodologias de classificação de variáveis são divididas em
supervisionadas ou não supervisionadas. Para as metodologias de reconhecimento de
padrões supervisionadas pode ser citada a análise do K-iésimo vizinho mais próximo
(K th Nearest neighbor - KNN), que apresenta maior destaque desta classe. Entre as
metodologias não supervisionadas destacam-se a análise dos componentes principais
(principal component analysis - PCA) e a análise de agrupamento hierárquico
(Hierarchical cluster analysis - HCA). Entre todas as metodologias matemáticas
empregadas atualmente no estudo de QSAR, a análise de Hansch, a regressão por
PLS, que se encontra inserido em programas computacionais de QSAR 3D, análise
comparativa de campos moleculares (CoMFA) e Volsurf, juntamente com PCA são as
mais empregadas e difundidas na literatura (Teófilo & Ferreira, 2006; Ferreira, 2002;
Cruciani et al., 2000; Wold, 1994, Kubiniy, 1993; Cramer et al., 1989).
Análise por regressão por mínimos quadrados parciais
A ferramenta de correlação denominada análise de regressão por mínimos
quadrados parciais (PLS) é fundamentada na descrição da variável dependente (Y), a
atividade biológica, como uma combinação linear das variáveis independentes (X), os
descritores estruturais. Em outras palavras, este processo é realizado para descrever
de forma otimizada a relação entre os descritores (X) e a atividade biológica (Y),
permitindo a previsão dos dados de atividade biológica (Montanari et al., 2002). Esta
combinação resulta em formação de novos descritores, denominados de variáveis
FBT/FCF/USP 38
latentes, componentes ou fatores ortogonais, que são utilizados para modelar a
atividade (Y) (Ferreira, 2002).
A primeira variável obtida na análise apresenta a maior variância entre todas
obtidas, ou seja, esta abrange o maior volume de informações estatísticas
relacionadas a variável Y, neste caso a atividade biológica. Desse modo, a segunda
variável obtida deve apresentar a segunda maior variância. Os modelos obtidos na
correlação entre os componentes e a atividade biológica são similares aos obtidos
com a análise de Hansch.
Este método apresenta algumas propriedades importantes como a análise
simultânea de inúmeras variáveis dependentes (Y) e independentes (X), não ser
sensível à ocorrência de co-linearidade entre os descritores físico-químicos, e não
necessitar manter a proporção entre o número de compostos e o número de
descritores estruturais estudados (Ferreira, 2002; Montanari et al., 2002; Sjöström &
Eriksson, 1994; Wold, 1994). Face a estas informações, a metodologia de PLS se
apresenta como alternativa complementar ao entendimento e refinamento dos
resultados obtidos a partir da Análise de Hansch (Ferreira, 2002).
Neste sentido, ressalta-se que o emprego de ferramentas quimiometricas no
processo de desenvolvimento de fármacos é bem sedimentado na literatura (Aguirre et
al., 2005; Rosseli et al., 2005; Leitão et al., 2004; Silva et al. em 2004), e tem sido
aplicado, progressivamente, no desenvolvimento de novos fármacos antichagásicos.
FBT/FCF/USP 40
2.1. JUSTIFICATIVA
A Doença de Chagas é um problema de saúde pública grave que atinge
milhões de pessoas no continente americano (Araújo & Pirmez, 1999). A quimioterapia
atualmente empregada para o tratamento desta enfermidade, além de muito restrita,
apresenta eficácia relativa e resulta, na maioria dos casos, em efeitos colaterais
consideráveis. Estes fatores evidenciam a necessidade premente de busca de novos
agentes antichagásicos visando o controle desta doença.
A introdução de um fármaco completamente novo ao arsenal terapêutico
envolve cerca de 15 anos e custo aproximado de 800 milhões de dólares (Dimasi et
al., 2002). Este cenário, agravado pela falta de investimentos de indústrias
farmacêuticas em pesquisas envolvendo doenças negligenciadas, como a Doença de
Chagas, somado à ausência de tratamento eficaz para estas, resulta em
conseqüências graves ao bem-estar da sociedade. Dentro deste conjunto, citam-se a
sobrecarga dos sistemas de saúde pública, invalidez e morte de indivíduos
chagásicos.
Neste sentido, a aplicação dos métodos de planejamento de fármacos, que
visam à obtenção de agentes terapêuticos com melhor perfil farmacológico e que
promovam o entendimento do mecanismo de ação destes compostos, se apresentam
como alternativas viáveis tanto na busca de novos agentes antichagásicos como para
a redução do tempo necessário à obtenção de novos fármacos. Entre estes métodos,
o estudo das propriedades físico-químicas, emprego de metodologias de modelagem
molecular e a modificação estrutural envolvendo o estudo de QSAR (Quantitative
Structure-Activity Relationship) e QSPR (Quantitative Structure-Property Relationship)
se mostram entre os mais promissores. A metodologia de QSAR permite quantificar a
influência de propriedades físico-químicas sobre a atividade biológica desempenhada,
fornecendo informações importantes para o planejamento de análogos potencialmente
antichagásicos.
À luz do mecanismo de ação antichagásico de compostos 5-nitro-
heterocíclicos, a avaliação do potencial de redução do grupo nitro é fundamental para
o estudo de compostos com melhor perfil farmacológico. Os valores de potenciais de
redução em conjunto com as propriedades físico-químicas e estruturais fornecem
subsídios para o estudo das relações entre estrutura química e o potencial de redução
do grupo nitro, e com a atividade antichagásica. Ademais, ressalta-se que os estudos
de QSPR e SAR provêm informações que se inserem como suporte relevante para o
desenvolvimento de novos agentes antichágasicos.
FBT/FCF/USP 41
2.2 OBJETIVOS
Estudar o processo de redução e determinar o potencial de redução e o
potencial de pico catódico dos nitrocompostos, 5-nitro-2-tiofilideno
benzidrazidas e 5-nitro-2-furfurilideno benzidrazidas, com atividade
antichagásica por meio de técnicas voltamétricas (Voltametria de Onda
Quadrada e Voltametria Cíclica) em diferentes meios de reação.
Desenvolver estudos de modelagem molecular, utilizando a
metodologia de análise conformacional e cálculo de carga de ponto
único para determinação de fatores estruturais, de propriedades
estéreo-eletrônicas e mapeamento de superfícies moleculares de toda a
série de compostos estudados.
Realizar ensaios de inibição de crescimento parasitário (Trypanosoma
cruzi) dos nitrocompostos candidatos a fármacos e avaliar os fatores
que influenciam a atividade biológica determinada.
Avaliar as relações quantitativas entre a estrutura e as propriedades
físico-químicas, por meio de estudos de QSPR, e as relações
qualitativas entre a estrutura química, e atividade antichagásica.
FBT/FCF/USP 43
3.1 Materiais
3.1.1 Reagentes
Ácido cítrico/ citrato PA (Aldrich Chemical Company);
Ácido fosfórico PA (Merck);
Água deionizada (Millipore);
Dimetilformamida PA (Merck);
Dimetilsulfóxido PA (Labsynth Produtos Químicos para Laboratórios);
Dimetilsulfóxido deuterado (DMSO-d6) 99,9% (Cambridge Isotope
Laboratories, Inc.);
Etanol PA (Labsynth Produtos Químicos para Laboratórios);
Grafite(Merck);
Hidróxido de sódio PA (Merck);
Meio de cultura LIT;
Nitrato de sódio PA (Merck);
Nujol (Johnson & Johnson);
PIPES (ácido Bis-N,N-piperazina-etanosulfônico) (Sigma);
Tetrafluoroborato de tetrabutilamônio (Merck);
Soluções tampão Merck (4,0-7,0-9,0).
3.1.2 Nitrocompostos
Os compostos químicos empregados inicialmente nos experimentos descritos
neste trabalho foram a 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazida e 5-nitro-2-furfulideno
benzidrazida. Foram utilizados em seguida 21 análogos, 5-nitro-2-tiofilidenico
4-R-benzidrazida e 5-nitro-2-furfulideno 4-R-benzidrazida, em que R representa os
derivados H, CH3, Cl, F, CF3, OCH3, OCH2CH3, SO2NH2, N(CH3)2, NH2, OH e CN,
Figura 10. Salienta-se que estes compostos foram sintetizados (Masunari & Tavares,
2003; Rezende, 2002; Rando et al., 2001; Furlanetto et al., 2001, Tavares et al. 1999;
Tavares et al. 1997; Tavares, 1993) e encontram-se disponíveis no Laboratório de
Planejamento e Desenvolvimento de fármacos da FBT/FCF/USP, sob coordenação do
Prof. Leoberto Costa Tavares, orientador deste trabalho.
FBT/FCF/USP 44
N N
XO H
H H H
H
HH
R
NO2
H
1
2
6
3
7
5
41716
15 14
13
128 9
10 11
28
23 22
21
201918
25-27
Figura 10. Estrutura química das 5-nitro-2-furfulideno 4-R-benzidrazidas, X=O, e
5-nitro-tiofilideno 4-R-benzidrazidas, X=S, utilizadas neste trabalho.
3.1.3 Equipamentos
- Potenciostato/Galvanostato Autolab PGSTAT 20 com software GPES versão
4.9, Holanda*;
- Célula eletrolítica de 10 ml contendo os eletrodos de referência Ag/AgCl,
(KClsaturado), auxiliar (Platina) e de trabalho (carbono vítreo, pasta de carbono
e pasta de carbono modificada com 5-nitro-heterocíclicos)*;
- pHmetro - Metrohm 654 pHmeter*;
- Espectrofotômetro Hawlett Packard 8452 A Diode Array spectrophotometer*.
- Estufa com controle de temperatura Tecnal**.
- Capela de fluxo laminar**.
- Microscópio óptico Javenela, marca Carl Zeiss com aumento de 25 vezes**;
- Câmara de Neubauer Hausser Scientific – 0,100 mm deep, Lery
Hemoecitometer **.
* Os equipamentos citados encontram-se no laboratório de Eletroanalítica e
Bioeletroanalílitca do IQ/USP-SP.
** Os equipamentos citados encontram-se no laboratório de Planejamento e
desenvolvimento de fármacos da FCF/USP.
3.2 Métodos
3.2.1 Procedimentos experimentais utilizados:
- Espectrofotometria UV/Visível;
- Voltametria cíclica;
- Voltametria de onda quadrada;
- Microscopia ótica e contagem de formas epimastigotas do Trypanosoma cruzi
em câmara de Neubauer.
FBT/FCF/USP 45
3.2.2 Preparo de amostras
A) Para estudos eletroquímicos
Em meio misto e aprótico: as amostras dos compostos em concentração pré-
determinada (0,5 mol L-1) foram dissolvidas em meio aprótico, dimetilsulfóxido (DMSO)
e, posteriormente, diluídas em solução tampão PIPES com eletrólito de suporte NaNO3
0,1 mol L-1, quando em meio misto, ou DMSO com eletrólito de suporte Bu4NH4BF4,
quando em meio aprótico. As soluções estoque dos compostos foram conservadas em
temperatura ambiente e ausência de luz.
Em meio prótico: os nitrocompostos foram inseridos na constituição da pasta
de carbono conforme o procedimento descrito no item 3.2.3.1.B inserido neste
trabalho.
B) Para a leitura do número de formas epimastigotas viáveis em meio de cultura
As amostras dos compostos em concentração pré-determinada
(1,0 - 10,0 - 20 mg mL-1) foram diluídas em DMSO e, posteriormente, diluídas em meio
de cultura LIT até alcançar a concentração utilizada para leitura em câmara de
Neubauer.
3.2.3 Determinação do potencial de redução
3.2.3.1 Eletrodos:
A) Tratamento do eletrodo de carbono vítreo
O eletrodo de carbono vítreo foi lavado com água, submetido a polimento em
lixa de 1200 m e posteriormente submetido a polimento em flanela e diamante de 3,0
e 1,0 m, respectivamente. As últimas etapas do tratamento do eletrodo de carbono
vítreo envolveram a sonicação em etanol por cinco minutos e limpeza com água
desionizada.
B) Preparo dos eletrodos de trabalho em pasta de carbono
1) Preparo da pasta de carbono
O carbono em pó (grafite) foi submetido a dois banhos de HCl 0,1 mmol L-1 por
duas horas, filtrado sob pressão reduzida sendo, posteriormente, seco em estufa a
temperatura de 350 oC e mantido em dessecador. Este procedimento é necessário
para eliminar picos, resultantes da redução ou oxidação de grupos ativos presentes no
carbono. No preparo da pasta de carbono utilizou-se a proporção de 2:1 de carbono
em pó e óleo mineral (Nujol). O carbono e o óleo mineral (Nujol) foram pesados em
cadinho e, posteriormente, homogeneizados até obter uma pasta consistente.
FBT/FCF/USP 46
2) Preparo de eletrodo de pasta de carbono modificada com nitrocompostos
No preparo deste eletrodo utilizou-se a proporção de 10% de nitrocomposto a
ser imobilizado em pasta de carbono. A pasta de carbono foi preparada como descrito
no ítem anterior, onde, o carbono, o óleo mineral e o nitrocomposto foram
homogeneizados até se obter uma pasta consistente e uniforme, com proporção de
60, 30 e 10%, respectivamente.
3.2.4 Soluções-tampão - Escolha e estudo do seu comportamento frente aos
nitrocompostos
Ao considerar que a composição da solução-tampão tem efeito significativo na
forma e no número de ondas relativas à redução dos compostos analisados,
registradas no voltamograma, foram realizados testes visando determinar a solução
tampão apropriada para a realização deste experimento. A partir disto, os compostos
foram dissolvidos em misturas DMSO/solução-tampão para a determinação da melhor
condição experimental a ser empregada. Assim, as percentagens de DMSO testadas
foram 20% e 50% e as soluções-tampão empregadas foram Britton-Robinson (tampão
universal), soluções de citrato e PIPES com eletrólito de suporte NaNO3 0,3 mol L-1.
Todas as soluções-tampão foram preparadas de acordo com a literatura (Perrin &
Dempsey, 1974) e adequadas à faixa de pH entre 7,0 – 7,5, empregada inicialmente
neste estudo. Os compostos, em concentração de 5,0 mmol L-1, foram inicialmente
dissolvidos em DMSO e diluídos até 1,0 mmol L-1 nas soluções-tampão de pH
desejado.
3.2.5 Espectrofotometria UV/Vis
Os espectros de absorção obtidos a partir da espectrofotometria UV/Vis dos
compostos analisados foram determinados a fim de comparação dos espectros e
confirmação do caráter inerte da solução-tampão. Estas leituras foram realizadas a
partir de solução contendo os compostos dissolvidos em 50% v/v de DMSO/solução
tampão PIPES e em DMSO.
3.2.6 Estudos de modelagem molecular
Neste trabalho utilizou-se o programa Spartan 02 for Linux, versão 1.1.9, e
Spartan 04 for Windows (versão Demo), Wavefunction, Inc. CA, USA (Hehre et al.,
2004). Os modelos dos compostos em três dimensões (3D) foram construídos no
editor estrutural usando os átomos e fragmentos moleculares inseridos no pacote
computacional. O esquema de trabalho adotado no estudo de modelgem molecular
dos nitrocompostos está ilustrado na Figura 11.
FBT/FCF/USP 47
Figura 11. Fluxograma que expressa as etapas e procedimentos semi-empírico (AM1)
e ab initio (HF 3-21G* e 6-31G*) utilizados na modelagem molecular dos
compostos estudados.
A) Otimização de geometria e análise conformacional
Os métodos de mecânica molecular MMFF94 e o método de mecânica
quântica semi-empírico Hamiltoniano AM1 (Austim Model 1) (Dewar et al., 1985) foram
empregados na otimização da geometria estrutural de todos os compostos estudados.
A otimização da geometria estrutural dos compostos 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazidas
e 5-nitro-2-furfurilideno benzidrazidas no estado fundamental foi também efetuada por
métodos ab initio em nível Hartree-Fock com o conjunto de bases
3-21 G* e 6-31G*, para melhor avaliação das conformações e configurações obtidas
por AM1.
AM1
Desenho doscompostos
Otimização degeometria molecular
Análiseconformacional
Cálculo de energiade carga de ponto
único
Obtenção dos Cônformerosde menor energia mínima
Determinação daspropriedades
físico-químicas
HF 3-21G*
AM1
HF 6-31G*
HF 6-31G*
Obtenção dos mapas dedensidade de potencialeletrostático, orbitais
moleculares HOMO e LUMO
MMFF94
AM1
FBT/FCF/USP 48
A análise conformacional dos nitrocompostos foi realizada, na estrutura
otimizada pelo método AM1 dos análogos 5-nitro-heterocíclicos, empregando a
metodologia de busca sistemática, aplicando o método AM1. O espaço conformacional
dos nitrocompostos foi explorado por meio da torsão dos ângulos moleculares () com
flexibilidade avaliada em intervalos de incremento de 30o, na faixa de 0-360o. Os
ângulos estudados, ilustrados na Figura 12, foram 1, entre as porções do anel
nitrotiofeno e N=CH, (S-C-C=N); 2, a porção N=CH e NH, (C=N-N-H); 3, os átomos
NH e a carbonila, (H-N-C=O); 4, a carbonila e o anel benzênico, (O=C-C-); 5, anel
benzênico e grupos substituintes, (-Y); 6, ligação existente entre os átomos de
grupos substituintes. As conformações de menor energia mínima de cada molécula
foram obtidas em meio solvatado e em vácuo.
Figura 12. Ângulos diedros () utilizados na análise conformacional dos derivados
5-nitro-heterocíclicos.
B) Energia de carga de ponto único e mapas de potencial eletrostático
Os perfis dos mapas de potencial eletrostático, (maps of electrostatic potential -
MEPs), foram obtidos para todos os confôrmeros de menor energia mínima dos
compostos, selecionados a partir da análise conformacional. Os MEPs foram
calculados a partir das estruturas obtidas no cálculo de energia de carga de ponto
único (método semi-empírico AM1). Os contornos de energia dos MEPs foram gerados
em superfície de van der Waals na faixa de 45 a -75 kcal/mol, e obtidas em tamanhos
pré-determinados de 0,002e/au3. Esta superfície representa o potencial eletrostático
sobreposto à superfície de densidade eletrônica e fornece medidas do tamanho
aproximado de determinado fragmento ou da estrutura química completa do
nitrocomposto.
Todas as cores empregadas na ilustração da superfície do composto
representam regiões que demonstram a intensidade variável dos valores de carga
3
XO
N N
NO2
YH
H
14
2
FBT/FCF/USP 49
eletrostática, sendo que a maior intensidade de cargas negativa e positiva são
delineadas pela cor vermelha e azul, respectivamente.
C) Propriedades físico-químicas
Na etapa de cálculo de energia de carga de ponto único foram obtidos os
valores das propriedades físico-químicas de efeito eletrônico, tais como valores
termodinâmicos de energia livre (em vácuo e solvatado), valores de energia dos
orbitais moleculares de HOMO e de LUMO da molécula, dureza química, afinidade
eletrônica, potencial químico, potencial de ionização e bandgap, além de
características estruturais como a torsão angular, momento de dipolo, volume,
distâncias intramoleculares entre as extremidades de cada molécula e do átomo de
oxigênio do grupo carboníla (C=O) e o hidrogênio do grupo azometínico (HC=N).
Ainda nesta etapa foram determinadas as cargas de potencial eletrostático (Q), do
átomo de carbono substituido (C1), do anel benzênico (QC1), juntamente com o
carbono localizado no anel heterocíclico de cinco membros ligado ao grupo nitro
(QC14). Estes átomos foram escolhidos por se encontrarem em regiões que
representam maior possibilidade de variações de efeito eletrônico por influência de
diferentes grupos ligados a estes, ou mesmo por meio de sua reatividade.
3.2.7 Ensaio de atividade antichagásica
Os ensaios de atividade antichagásica foram executados com a forma
epimastigota do Trypanosoma cruzi no Laboratório de Planejamento e
Desenvolvimento de Fármacos da FCF/USP utilizando a cepa Y, isolada por Silva e
Nussenzweig em 1953. A cepa do parasita utilizada neste trabalho foi gentilmente
disponibilizada pela Professora Maria Júlia Manso Alves, do Laboratório de Bioquímica
Parasitária, Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da Universidade de
São Paulo.
A) Meio de Cultura
O parasita foi cultivado em meio LIT (liver infusion tryptose), composto por
NaCl 0,4%, KCl 0,04%, Na2HPO4 0,8%, glicose 0,2%, triptose 0,5%, infusão de fígado
0,5%, sendo as porcentagens expressas em massa/volume.
Esta mistura é enriquecida com a adição de 10% de soro bovino, v/v. Agita-se
e em seguida ajusta-se o pH para 7,2 e incuba-se o meio a 68 oC por 1 hora. Após
resfriamento até temperatura ambiente, adiciona-se solução de hemoglobina bovina
FBT/FCF/USP 50
até atingir a concentração de 2%, v/v. A esterilização do meio é realizada por filtração
em membrana Millipore 0,22 mm. Em seguida o meio é distribuído em frascos de vidro
que são estocados a 4 oC (Gonçalves, 1978; Fernandes & Catellani, 1966; Camargo,
1964). Este meio foi preparado no Laboratório de Bioquímica Parasitária,
Departamento de Bioquímica do Instituto de Química da Universidade de São Paulo e
cedido para a realização dos experimentos. O meio LIT foi mantido em frasco
esterilizado sob refrigeração de 4 oC, até o momento do uso.
B) Condições do Cultivo
O cultivo do inóculo, proveniente de culturas de epimastigotas com idade de
72 horas, apresenta normalmente, após período de incubação, cerca de 50x106
parasitas por mL-1.
C) Ensaio de suscetibilidade antichagásica
Os nitrocompostos, ao lado do fármaco de referência, o benznidazol, foram
separadamente dissolvidos em DMSO e diluídos em meio de cultura LIT até obter-se a
faixa de concentração de 1,0 a 20 g mL-1. Adicionalmente, uma alíquota do inóculo,
dependente do número de células viáveis do parasita, foi inserida em tubo Falcon em
conjunto com os compostos a serem testados, solubilizados em 1,0% de DMSO e
meio LIT. A concentração inicial de 20x106 parasitas/mL foi escolhida como padrão
para a realização de todos os ensaios.
O número de parasitas por mL foi obtido por meio de aplicação da equação 17.
A partir do valor numérico (parasitas/mL) emprega-se a equação 18 para a obtenção
do volume de inóculo a ser utilizado na suspensão a ser incubada. De posse do
volume de inóculo necessário para atingir a concentração escolhida de parasitas/mL
são adicionados aos tubos Falcon o volume de suspensão contendo o composto a ser
testado e o meio LIT, necessário para completar o volume da suspensão a ser
incubada (Volume do inoculo x Volume do ensaio = 1,0 mL, Volume total incubado).
Este procedimento é realizado também para o preparo de suspensão controle, sem os
compostos testados, para comparação dos resultados obtidos.
* Fator de diluição do inoculo para contagem (50x);
**Volume da câmara de Neubauer utilizado nas leituras.
Número de parasitas/mL = número contado x diluição* x 10 000** (Eq. 17)
FBT/FCF/USP 51
Volume do inoculo = 20 x 106 (Eq. 18)
Número de parasitas/mL
Os tubos Falcon que contém a suspensão de parasitas e os nitrocompostos em
meio LIT foram incubados em estufa sob temperatura de 28 oC, pelo período de 24 ou
48 horas.
A atividade antichagásica in vitro foi determinada através da contagem em
câmara de Neubauer das formas epimastigotas viáveis em tempo zero e no período de
incubação de 24 horas. De posse do número de parasitas foi realizada a determinação
de inibição da porcentagem de crescimento ou proliferação celular.
Os valores de porcentagem de crescimento parasitário foram obtidos por meio
da equação 19.
CP (%) = (L24 - L0) x 100/ L0 (Eq. 19)
Em que:
CP (%) é a porcentagem de crescimento parasitário em 24 horas;
L0 é a leitura do número de células viáveis em câmara de Neubauer
realizada em tempo inicial (0 horas);
L24 é a leitura do número de células viáveis em câmara de Neubauer
realizada em 24 horas.
Neste método, foi avaliada também a influência da proporção de DMSO
utilizada frente ao desenvolvimento do parasita, mantendo as mesmas condições do
teste descrito acima. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.
3.2.8 Relações quantitativas estrutura-propriedade - QSPR
3.2.8.1 Escolha dos substituintes
Considerando a possibilidade de influência eletrônica de grupos substituintes
sobre a redução do grupo nitro dos compostos estudados, escolheu-se, no Diagrama
de Craig (Craig, 1971), Figura 9, os grupos substituintes ao longo do eixo
FBT/FCF/USP 52
correspondente à propriedade eletrônica, expressa pelo de Hammett, Figura 12.
Este procedimento possibilita a análise da influência dos efeitos eletrônicos sobre
qualquer propriedade estrutural que se deseja estudar (Kubinyi, 1993, Craig, 1971).
A seleção de compostos foi efetuada de maneira a formar um sub-grupo para
ser avaliado quanto à redução dos nitrocompostos em meio aprótico, com variação
significativa nos valores de de Hammett (de 0,54, a -0,83) para os substituintes
triflúormetila e dimetilamino, respectivamente.
Figura 13. Grupos substituintes escolhidos para a realização dos
experimentos em meio aprótico de redução.
Em outra etapa do experimento, a análise de QSPR envolveu a avaliação da
influência dos parâmetros de Hammett e de Hansch sobre o potencial de redução
determinado em meio misto de reação, DMSO/ PIPES, 50% v/v. Deste modo, a
escolha dos compostos envolveu a inclusão de grupos substituintes dispersos nos
quatro quadrantes do diagrama de Craig (Craig, 1971), Figura 14.
A hidrofobicidade foi inserida nesta etapa do estudo visando determinar a
possibilidade de interferência desta propriedade no processo de difusão dos
nitrocompostos, do conjunto da solução para a interface do eletrodo de trabalho (Bard
4 - F
H
4 -C l
C F 3
4 - O C H3
4 - C H 3
4 -N (C H )3 2
(+ ), (- )
( -), (+ )
(+ ) , (+ )
( - ), (+ )
FBT/FCF/USP 53
& Falkner, 1980), o que pode influenciar os valores de potencial de redução dos
nitrocompostos.
Figura 14. Grupos substituintes escolhidos para a realização dos
experimentos em meio misto de redução.
3.2.8.2 Estudo de QSPR
Na análise de QSPR realizada neste trabalho empregou-se um conjunto de
vinte e três compostos, sendo doze 5-nitro-tiofilidênico 4-R-benzidrazidas e onze 5-
nitro-furfulidênico 4-R-benzidrazidas. Os valores dos parâmetros físico-químicos de
efeito eletrônico e de hidrofobicidade, expressos por de Hammett e de Hansch
foram correlacionados com o potencial de redução (E1/2) ou com o potencial de pico
catódico (Epc) dos nitrocompostos obtido, nos meios de reação aprótico e misto, e com
o potencial de pico catódico obtido em meio prótico.
A análise dos efeitos eletrônicos envolveu o emprego dos descritores
estruturais p e R, que representam, respectivamente, o efeito polar e de ressonância
dos substituintes em posição para (Hansch & Leo, 1995), e os descritores obtidos a
partir do emprego de técnicas de modelagem molecular, especificamente por meio de
cálculos de mecânica quântica, método semi-empírico AM1, descritos no
4 -F
H
4 -C l
C F 3C N
S O 2 N H 2
4 -O C H34 -O H
4 -N H 2
4 -E t4 -C H3
4 -N (C H )3 2
(+ ), (- )
( -), (+ )
(+ ) , (+ )
( - ), (+ )
FBT/FCF/USP 54
item 3.2.6 C (Hf [Kcal/mol], EHOMO, ELUMO, E, μ, bandgap [eV], momento de dipolo,
QC1 e QC14 [eV]).
Os estudos de QSPR envolveram o emprego de outras propriedades
estruturais, como o volume molecular e distâncias interatômicas, obtidas com o
emprego de cálculo de energia de ponto único (método semi-empírico AM1), em
metodologia descrita no item 3.2.6 C.
A constante de Hansch, bem como o CLogP, foram utilizados para avaliar a
influência da hidrofobificidade da molécula sobre o potencial de redução dos
nitrocompostos em meio misto de reação. Os valores dos descritores estruturais de
caráter eletrônico (p e R) e de hidrofobicidade () foram retirados da literatura
(Hansch & Leo, 1995a,b). As correlações entre o potencial de redução e as
propriedades físico-químicas e estruturais, analisadas sob a forma de QSPR e de
SAR, consideraram os dados apresentados na tabela 1.
Os valores de ClogP, calculados através de ClogP Program 4.0, desenvolvido
e comercializado por Biobyte Corp., Claremont, CA – USA, estão descritos na
literatura e foram disponibilizados pelos autores dos respectivos trabalhos (Rezende,
2002; Tavares et al. 1997; Tavares, 1993).
Tabela 1. Descritores físico-químicos utilizados no estudo de QSPR de 5-nitro-
2-tiofilideno benzidrazidas e 5-nitro-2-furfulideno benzidrazidas.
Descritores de
redução*
Descritores de caráter
eletrônico
Descritores
hidrofóbicos
Descritores de
efeito estérico
Variáveis Y Variáveis X Variáveis X Variáveis X
p, R, Hf (Kcal/mol) ClogP Volume molecular,
Y = Epc ou E1/2
(Volts)
EHOMO (eV), ELUMO (eV),
E (eV), μ (eV),
bandgap, momento de
dipolo, QC1,QC14.
distâncias
interatômicas.
* Descritores obtidos por técnicas voltamétricas no processo de redução dosnitrocompostos;
FBT/FCF/USP 55
Os estudos de QSPR e de SAR/QSAR foram realizados empregando-se o
método de regressão linear múltipla, seguindo o modelo de Hansch (Hansch & Leo,
1995a, Kubinyi, 1993, Hansch & Fujita, 1964). Para isso utilizou-se os programas BiIin
versão 98, desenvolvido por Hugo Kubinyi, BASF-Alemanha, e BuildQSAR
desenvolvido por Anderson C. Gáudio e Daniel B. de Oliveira (Oliveira & Gáudio,
2000), UFES, Brasil.
As regressões foram comparadas com outras análises correlacionais que
empregaram metodologia estatística de análise de regressão múltipla, como a análise
de regressão por mínimos quadrados parciais (PLS). Este procedimento visou
corroborar os resultados obtidos por meio da regressão linear. Para a realização da
metodologia de PLS utilizou-se o programa computacional Minitab 14.0 (Minitab
Brasil).
A qualidade do ajuste dos modelos obtidos em relação aos valores observados
do potencial de redução e do potencial de meia onda foi avaliada por meio do cálculo
do coeficiente de correlação (r), do desvio-padrão (s) e do teste de Fischer (F).
Segundo Ferreira et al., em 2002 e Kubinyi, em 1997, em termos simplificados, um
modelo bem ajustado deverá apresentar valor de R próximo à unidade, s pequeno e F
elevado (Ferreira et al., 2002; Kubinyi, 1997; Kubinyi, 1993).
FBT/FCF/USP 57
4.1 Escolha da solução-tampão a ser empregada na determinação do potencial
de redução
A escolha da solução-tampão se baseou no critério de solubilidade dos
compostos estudados. Inicialmente os nitrocompostos foram solubilizados em DMSO e
diluídos até atingir as proporções de 20 e 50% v/v em três soluções previamente
selecionadas, PIPES, Britton-Robinson e citrato. Observou-se que os compostos
5-nitro-2-furfulideno benzidrazida e 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazida, dissolvidos em
solução mista 50% v/v, não precipitam somente em presença do tampão PIPES. De
acordo com os resultados obtidos e ilustrados na Tabela 2, a solução tampão PIPES
foi escolhida como o melhor meio experimental a ser empregado neste trabalho
quando em presença de DMSO.
Tabela 2. Influência de diferentes soluções-tampão sobre a solubilidade de
1,0 mmol L-1 de nitrocompostos dissolvidos em DMSO.
Soluções tampão 20% (DMSO) 50% (DMSO)
PIPES/DMSO Solução turva não precipitou
Britton-Robinson/DMSO precipitou precipitou
Citrato/DMSO precipitou precipitou
Os espectros de absorção UV/Visível dos nitrocompostos em solução mista de
DMSO/PIPES, 50% v/v, anexo 1, demonstraram que a solução-tampão PIPES não
interage com os compostos dissolvidos em meio DMSO, sendo empregada no
decorrer dos experimentos.
4.2 Determinação do potencial de redução dos nitrocompostos
Na primeira etapa deste trabalho, os experimentos foram dirigidos para a
utilização de métodos eletroquímicos visando determinar o potencial de redução dos
nitrocompostos, especificamente na reação ArNO2 ArNO2. Ressalta-se que
nesta reação o radical nitro ânion gerado eletroquímicamente é considerado o
FBT/FCF/USP 58
responsável pelas reações que desencadeiam atividade antichagásica dos derivados
5-nitro-heterocíclicos.
A determinação do potencial de redução envolveu o emprego de três meios de
reação, aprótico, misto e prótico, o que permitiu avaliar a influência destes meios sobre
a geração do radical nitro ânion. O meio aprótico, freqüentemente citado em estudos
de eletroquímica, é constituído de solvente orgânico como DMSO, DMF ou acetonitrila
e eletrólito de suporte adequado (sal quaternário de amônio). Tal meio permite tanto a
solubilização dos nitrocompostos como a estabilização do radical nitro ânion (Bollo et
al., 2003, Arguello et al., 2001; Stradins et al., 1983). Ainda neste contexto, de acordo
com Abreu et al. em 2002, este meio é relevante em estudos que avaliam a atividade
biológica de compostos bioativos porque simula o ambiente hidrofóbico presente no
momento da passagem do fármaco através das membranas celulares do parasita.
Ressalta-se, no entanto, que os solventes orgânicos, como o DMSO, são tóxicos e
muito diferentes do meio aquoso intracelular onde, suspeita-se, ocorra a biorredução
in vivo.
Outro meio testado foi a solução mista de DMSO/solução tampão PIPES que
aproxima-se mais do meio e pH biológico. Este meio permite a obtenção do potencial
de redução e até o registro do radical nitro ânion em voltamogramas sob determinadas
condições experimentais. Por outro lado, é sabido, também, que, em alguns casos, o
potencial de redução determinado em solvente não aquoso ou em misturas de
solventes, não apresenta correlação com atividade biológica (Abreu et al., 2002;
Paulino et al., 2002; Bhattacharjee et al., 2002; Goulart et al., 1997). Face a estes
fatos, torna-se importante a determinação dos potenciais de redução dos
nitrocompostos em meio reacional que apresente a maior proximidade possível ao
meio fisiológico intracelular.
Em meio prótico ou aquoso, os experimentos foram realizados a partir do
emprego de técnicas eletroquímicas utilizando-se como eletrodo de trabalho a pasta
de carbono modificada com nitrocomposto. Estes experimentos visam alcançar o
estado de maior proximidade com o meio aquoso e, deste modo, obter correlações
com valores experimentais próximos à realidade. Ressalta-se que a modificação do
eletrodo, caracterizada pela incorporação de nitrocompostos insolúveis na pasta de
carbono, permite o estudo do comportamento redox dos mesmos em meio aquoso de
reação, usando apenas o eletrólito de suporte, tampão no pH desejado.
Para alcançar tal objetivo utilizaram-se as técnicas eletroquímicas: Voltametria
Cíclica (VC) e Voltametria de Onda Quadrada (VOQ). Desse modo, a investigação
eletroquímica dos compostos 5-nitro-heterocíclicos, visando à determinação do
potencial redox do par reversível Ar-NO2/Ar-NO2-, envolveu inicialmente a VC e,
FBT/FCF/USP 59
subseqüentemente, a VOQ com a finalidade de corroborar e complementar os dados
obtidos através da VC.
A comprovação da detecção do par reversível (radical nitro ânion) obtido por
meio de técnicas voltamétricas foi possível em algumas vezes através da avaliação
dos critérios de diagnóstico característicos para a VC e VOQ. Tais critérios permitem
obter o número de elétrons envolvidos na reação de transferência de carga e o caráter
da reação eletródica. Alguns critérios de diagnóstico, utilizados neste trabalho,
específicos para as técnicas voltamétricas são apresentados na Tabela 3.
Tabela 3. Critérios de diagnóstico utilizados para identificar o número de elétrons e
caracterizar o tipo de reação eletródica.
Critérios dediagnóstico Voltametria Cíclica Voltametria de Onda Quadrada
ReaçõesReversíveis
1Visualização do pico catódico
e anódico correspondenteVisualização do pico catódico e
anódico correspondente
2 Relação linear (Ip vs 1/2) Relação linear (Ip vs 1/2)
3Epa – Epc = 57,0/n mV
(Eq. 20)Ep/2 = 97/n (adsorção de
produto e reagente) (Eq. 22)
4 Ipa/Ipc 1elétron (Eq. 21) -
Reações quasi-reversíveis
5 Visualização do pico catódicoe anódico correspondente
Visualização do pico catódico eanódico correspondente
6 Epa – Epc 57,0/n mV(Eq. 23) Relação linear (Ip/vs log )
7 Relação linear (Ip vs 1/2) Relação não-linear (Ip vs f1/2)
Em que, Ipa, Ipc, Epa, Epc, n, , e Ep/2 significam, respectivamente, corrente de pico
anódico, catódico, potencial de pico anódico, potencial de pico catódico, número de elétrons,
velocidade de varredura, freqüência e largura do potencial de pico a meia altura de corrente
(Souza et al., 2003; Komorsky-Lovric & Lovric, 1995; Brett & Brett, 1993; Osteryung &
Osteryoung, 1985).
FBT/FCF/USP 60
A redução eletroquímica dos nitrocompostos nos referidos meios é dependente
do pH e do tipo de eletrodo de trabalho utilizado nas determinações, além de envolver
reação reversível de um elétron (Eq. 24), e reação irreversível subseqüente, com
transferência de três elétrons e quatro prótons (Eq. 25) (Julião et al., 2005; Squella et
al., 2005 Mandal, 2004; Bollo et al., 2003; La-Scalea et al., 1999; La-Scalea, 1999;
Squella et al., 1996; Karakus & Zuman, 1995; Monteagudo et al., 1992; Morales et al.,
1987). Ressalta-se que dificilmente é observada a formação do radical nitro ânion, em
reação envolvendo um életron, em meio prótico de reação (aquoso), mas é comum a
ocorrência de reação envolvendo quatro elétrons e quatro prótons (Eq. 26) (Bollo et
al., 2003; Viodé et al., 1998; Squella et al., 1996; Karakus & Zuman, 1995). Em
contraponto, o eletrodo de diamante dopado com boro tem sido descrito na literatura
como ferramenta importante na determinação do radical nitro anion em meio prótico
(Julião et al., 2005).
A VC foi utilizada para obtenção do potencial de redução dos nitrocompostos e,
subseqüentemente, para a investigação do comportamento eletroquímico do radical
nitro ânion gerado. Encontra-se a seguir o esquema simplificado do processo de
redução da referida classe de compostos nitro-heterocíclicos.
Ar-NO2 + 1e- Ar-NO2- (Eq. 24)
Ar- NO2- + 3e- + 4H+ Ar-NHOH (Eq. 25)
ou
Ar-NO2 + 4e- + 4H+ Ar-NHOH (Eq. 26)
4.2.1 Meio aprótico
O primeiro meio investigado é constituído de DMSO contendo Bu4NH4BF4
0,1 mol L-1 como eletrólito de suporte e, como citado anteriormente, foi utilizado porque
permite a estabilização e a visualização do pico de redução do nitrocomposto
correspondente ao radical nitro ânion eletroquimicamente gerado (Bollo et al., 2003;
Arguello et al., 2001; Stradins et al., 1983). Um passo experimental relevante, anterior
à obtenção dos voltamogramas cíclicos no presente meio, é o borbulhamento de N2
pelo período de 30 minutos. Este procedimento promove a desaeração da solução, o
que evita a ocorrência de reação entre o radical nitro ânion e o oxigênio e impede a
formação de radical superóxido, o qual apresenta pico de redução em sobreposição ao
sinal voltamétrico do radical em meio aprótico.
FBT/FCF/USP 61
A determinação dos potenciais de redução dos nitrocompostos em meio
aprótico foi efetuada utilizando-se a VC e a VOQ e eletrodo de carbono vítreo como
eletrodo de trabalho versus eletrodo de referência de prata/cloreto de prata (Ag/AgCl,
KClsaturado). A Figura 15 apresenta os voltamogramas cíclicos e de onda quadrada
obtidos em meio de reação aprótico.
Para ambas as técnicas utilizadas neste trabalho foram registrados,
primeiramente, voltamogramas em faixa estendida de potencial (Ei = - 0,15 V,
E1 = - 1,5 V, E2 = - 0,05 V e Ef = - 0,1 V para VC e E i = - 0,1 V e Ef = - 1,6 V para
VOQ) visando a obtenção dos picos referentes à formação do radical nitro ânion em
conjunto com os intermediários do processo de redução do composto 5-nitro-2-
tiofilideno benzidrazida em concentração de 0,5 mmol L-1. As condições voltamétricas
otimizadas para esta etapa do experimento foram velocidades de varredura de 500 mV
s-1 para a VC e freqüência de 100 Hz, amplitude de pulso de 50 mV e degrau de
potencial de 0,042 para a VOQ.
Os voltamogramas cíclicos obtidos no presente meio, Figura 15 A,
demonstraram a ocorrência de dois picos de redução e três de re-oxidação dos
produtos de redução dos nitrocompostos. Sugere-se inicialmente que os picos de
redução sejam referentes à formação do radical nitro ânion (Epc 1) e ao intermediário
hidroxilamina (Epc 2) em reações descritas nas equações 24 e 25, respectivamente.
Os picos de re-oxidação podem ser atribuídos a re-oxidação do radical nitro ânion ao
nitrocomposto (Epa 2) e do intermediário hidroxilamina ao intermediário nitroso (Epa
3), sendo Epa 1 objeto de investigação posterior.
Para a investigação da formação do radical nitro ânion a partir dos
voltamogramas cíclicos e de onda quadrada obtidos, foi reduzida a faixa de potencial
(Ei = - 0,15 V, E1 = - 0,9 V, E2 = - 0,05 V e Ef = - 0,1 V para VC e Ei = - 0,1 V e
Ef = - 0,9 V para VOQ) com a finalidade de isolar o par reversível Ar-NO2/Ar-NO2- (Eq.
24). Os voltamogramas obtidos com o emprego de ambas as técnicas voltamétricas,
ilustrados na Figura 15 em linha tracejada, permitem a visualização da formação do
radical nitro ânion em Epc 1 e sua re-oxidação ao respectivo nitrocomposto em Epa 2,
o que indica a existência de reversibilidade característica para a reação Ar-NO2/Ar-
NO2.
FBT/FCF/USP 62
Condições experimentais: (A) Voltametria Cíclica: = 500 mV s-1, faixa de potencial
estendida () Ei = - 0,15 V, E1= - 1,5 V, E2= - 0,05 V e Ef = - 0,1 V, faixa de potencial restrita
(---) Ei = - 0,15 V, E= - 0,9 V, E2= - 0,05 V e Ef = - 0,1 V. (B) Voltametria de Onda Quadrada:
= 100 Hz, amplitude de pulso 50 mV, degrau de potencial 0,042, faixa de potencial estendida
() Ei = - 0,1 V e Ef = - 1,6 V, faixa de potencial reduzida (---)Ei = - 0,1 V e Ef = - 0,9 V.
Figura 15. Voltamogramas cíclicos (A) e voltamogramas de onda quadrada (B)
registrados com eletrodo de carbono vítreo em solução 0,5 mmol L-1 de
5-nitro-2-tiofilideno benzidrazida (DMSO, contendo Bu4NH4BF4
0,1 mol L-1).
A
B
-1,6 -1,2 -0,8 -0,4 0,0
0,0
Epc,2
= - 1,20 V
Epa,3
= - 0,25 V
Epa,1
= - 0,82 V
Epa,2
= - 0,57 V
Epc,1
= - 0,67 V
(-) 1 ()
E vs Ag/AgCl, KClsat.
/ V
-1,6 -1,2 -0,8 -0,4 0,0
Epa,1
= - 0,60 V
Epc,2
= - 1,19 V Epc,1
= - 0,60 V
corrente reversa
corrente direta
0,0
(-) 4 ()
E vs Ag/AgCl, KClsat.
/ V
FBT/FCF/USP 63
A redução dos nitrocompostos foi avaliada através da variação de velocidade
de varredura, faixa de 0,05 a 1,0 V s-1, onde observou-se que o par redox apresenta o
mesmo potencial de redução independente da velocidade aplicada. Este fator é
registrado como característica comum a processos reversíveis como é o caso do par
Ar-NO2/Ar-NO2.
Quando aplicada a velocidade de varredura de 2,0 V s-1, no entanto, a resposta
voltamétrica não foi mais observada. Isto pode ocorrer devido a baixa velocidade de
formação do radical nitro ânion no presente meio de reação. O valor calculado da
diferença de potencial (Ep de 100 mV) determinado entre o pico de redução (Epc) e o
pico de oxidação (Epa), (Eq. 20), permite concluir que a reação redox do
nitrocomposto é de caráter quasi-reversível, uma vez que os valores são superiores a
57 mV.
Estes experimentos foram realizados com o objetivo de manter o foco principal
que é a obtenção dos potenciais de redução do nitrocomposto em reação reversível
envolvendo um elétron, uma vez que a atividade antichagásica é resultante da
formação do radical nitro ânion (Eq. 24) (Viodé et al., 1998; Squella et al., 1996).
Diante do exposto, apresenta-se a seguir uma discussão preliminar relativa à
investigação dos demais picos de redução e de re-oxidação dos produtos formados a
partir da redução dos nitroderivados, Figura 15.
O segundo pico obtido na corrente catódica (Epc 2) sofre deslocamento de
acordo com o aumento da velocidade de varredura aplicada durante a obtenção dos
voltamogramas cíclicos. Neste sentido, ressalta-se que a variação do potencial, de
acordo com a velocidade de varredura, é indicativa da ocorrência de reação
irreversível e neste caso, da formação do intermediário hidroxilamina (Eq. 26).
No processo de re-oxidação dos produtos formados na redução dos
nitrocompostos observou-se que o pico Epa 1 não se encontra presente nos
voltamogramas obtidos para outros derivados da série dos nitrocompostos, como a
nifuroxazida por exemplo (dados não apresentados). Supõe-se que Epa 1 seja
proveniente da adsorção de intermediários de redução dos nitrocompostos. Estes
fatores, no entanto, não serão discutidos porque ainda encontram-se em fase de
investigação.
Observou-se, também, que após restringir-se o intervalo de varredura de
potencial onde se registra o radical nitro ânion, o que impede a produção de
hidroxilamina em Epc 2, não ocorre a formação do pico Epa 3. Isto significa que Epa 3
é dependente do pico Epc 2, e de acordo com a literatura, Epa 3 é característico de re-
oxidação da hidroxilamina (Ar-NHOH) ao intermediário nitroso (Ar-NO), em reação de
FBT/FCF/USP 64
Ar-NHOH Ar-NO + dois prótons (H+) e um elétron (Julião et al., 2005; Squella et
al., 2005 Mandal, 2004; Bollo et al., 2003; La-Scalea et al., 1999; La-Scalea, 1999;
Squella et al., 1996; Karakus & Zuman, 1995; Monteagudo et al., 1992; Morales et al.,
1987).
Os voltamogramas de onda quadrada demonstraram a ocorrência de dois picos
de redução (Epc 1 e Epc 2) e somente um pico de re-oxidação (Epa 1). Os picos Epc 1
e Epa 1 podem ser atribuídos ao radical nitro ânion e Epc 2 pode ser considerado
como a redução do referido radical a hidroxilamina, uma vez que valor do potencial de
redução do mesmo se desloca para potenciais negativos quando se aumenta a
frequência empregada em VOQ. Para os picos de re-oxidação Epa 1 e Epa 3 obtidos
nos voltamogramas cíclicos sugere-se que os mesmos não são observados nos
voltamogramas de onda quadrada devido a elevada velocidade em que os mesmos
são obtidos, o que favorece a minimização de adsorção do nitrocomposto. Os valores
dos potenciais de redução e de re-oxidação para todos os picos obtidos nos
voltamogramas cíclicos e de onda quadrada são vistos na Tabela 4.
Tabela 4. Valores dos potenciais de picos catódicos (Epc) e picos anódicos (Epa) dos
nitrocompostos em meio aprótico.
S (H) - 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazida;O (H) - 5-nitro-2-furfurilideno benzidrazida.
Os resultados obtidos a partir da utilização de critérios de diagnóstico citados
na Tabela 3 não possibilitaram a determinação do número de elétrons e do caráter da
reação eletródica envolvida no par redox. Este fato, segundo Souza et al., em 2002,
pode ter ocorrido devido à adsorção de reagente e, em alguns casos, dos produtos
formados no decorrer da reação de redução, na superfície do eletrodo de carbono
vítreo. Tal fato impossibilita o emprego daqueles critérios na avaliação do processo de
redução dos nitrocompostos.
Metodologias/
compostos estudados
Epc 1
(mV)
Epc 2
(mV)
Epa 1
(mV)
Epa 2
(mV)
Epa 3
(mV)
VC
S (H) - 0,67 - 1,20 - 0,82 - 0,57 - 0,25
O (H) - 0,72 - 1,22 - 0,80 - 0,62 - 0,20
VOQ
S (H) - 0,60 - 1,19 - 0,60 - -
O (H) - 0,67 - 1,21 - 0,68 - -
FBT/FCF/USP 65
Neste contexto, para comprovar a ocorrência de efeito adsortivo foram
realizadas determinações sucessivas do potencial de redução dos nitrocompostos
empregando-se VOQ em meio aprótico, Figura 16, com as condições voltamétricas
descritas acima e variação da frequência. Foi escolhida a VOQ porque esta
metodologia apresenta melhor resolução dos picos em comparação à VC quando
empregada na investigação de processos adsortivos (Souza et al., 2002; Lovric, 2000).
A ausência de relação não linear entre os valores de corrente de pico obtidos
para o radical nitro ânion e o aumento da frequência indica que os efeitos de adsorção
estão envolvidos no processo eletródico. Este processo, também observado para o
meio misto, resulta em proposição da ocorrência de adsorção na superfície do eletrodo
de trabalho utilizado e na dificuldade de aplicação dos critérios de diagnóstico
utilizados para a confirmação do número de elétrons envolvidos na reação de redução.
* Valores de corrente obtidos para o radical nitro ânion.
Condições Experimentais: variação da frequência = 20-200 Hz, amplitude de pulso 50 mV,
degrau de potencial 0,042, Ei = - 0,1 V e Ef = - 0,9 V. Medidas realizadas com eletrodo de
carbono vítreo sem o polimento realizado entre cada voltamograma de onda quadrada .
Figura 16. Comportamento da corrente em função do acréscimo da freqüência
utilizada em VOQ, na redução da 5-nitro-2-tiofilidênico benzidrazida
(Epc 1) em meio aprótico (DMSO).
0 4 8 12 16 20
1
2
3
4
5
6
7
8
9
(-)
I(
)
f1/2 (Hz)
*
FBT/FCF/USP 66
Desde que a utilização do meio aprótico neste trabalho não reflete,
necessariamente, o meio intracelular onde ocorre a atividade antichagásica, os
mesmos experimentos descritos anteriormente foram realizados em meio misto,
utilizando os eletrodos de carbono vítreo e a pasta de carbono como eletrodos de
trabalho. Este procedimento foi efetuado com a finalidade de aproximação, ao máximo
possível, do meio fisiológico do parasita causador da Doença de Chagas. Neste
aspecto, as determinações dos valores do potencial de redução dos nitrocompostos,
em meio misto, podem simular com maior aproximação o meio biológico, sendo mais
significativo para estudos de SAR/QSAR.
4.2.2 Meio misto (DMSO/solução tampão PIPES 50% v/v)
4.2.2.1 Eletrodo de carbono vítreo
A determinação dos potenciais de redução dos nitrocompostos em meio misto
de reação constituíu-se, inicialmente, no emprego da VC e de VOQ utilizando o
eletrodo de carbono vítreo como eletrodo de trabalho versus eletrodo de referência de
prata/cloreto de prata (Ag/AgCl, KClsaturado), e o eletrodo auxiliar de platina. A Figura 17
apresenta os voltamogramas cíclicos (A) e de onda quadrada (B) obtidos em solução
0,5 mmol L-1 de 5-nitro-2-tiofilidênico benzidrazida em DMSO/solução tampão PIPES,
50% v/v, pH aparente de 7,4, contendo NaNO3 0,3 moL L-1 como eletrólito de suporte.
As medidas voltamétricas foram efetuadas na ausência de oxigênio, onde, borbulhou-
se o nitrogênio na solução por cinco minutos. Nos experimentos desenvolvidos neste
meio de reação, todavia, o borbulhamento de N2 arrasta o solvente diminuindo sua
concentração na solução. Este processo levou à formação de precipitados de
nitrocompostos testados e a instabilidade dos resultados. Isso provocou a
impossibilidade, em algumas vezes, do emprego das técnicas voltamétricas para a
determinação dos potenciais de redução.
As condições voltamétricas otimizadas para a investigação da formação do
radical nitro ânion a partir da redução dos nitrocompostos foram velocidade de
varredura de 500 mV s-1, faixa de potencial estendida (Ei = - 0,15 V, E1 = - 1,0 V,
E2 = 0,50 V e E f = - 0,15 V) e restrita (E i = - 0,15 V, E1 = - 0,9 V, E2 = - 0,05 V e
Ef = - 0,15 V). A Figura 17.A demonstra a formação de pico catódico durante a
redução (Epc 1) e a ocorrência de pico anódico (Epa 1) na varredura de potencial no
sentido reverso.
A redução dos nitrocompostos em meio misto foi estudada em várias
velocidades de verredura, na faixa de 0,05 a 1,0 V s -1, onde se observou que o pico
FBT/FCF/USP 67
Epc 1 apresenta deslocamento para valores de potencial mais negativos. O pico de
redução obtido, de acordo com comparação com o composto protótipo nifuroxazida,
descrito na literatura (Squella et al., 1996), pode ser caracterizado como a redução do
grupo nitro ao intermediário hidroxilamina em reação envolvendo quatro elétrons e
quatro prótons (Eq. 26).
Quando se restringe a faixa de potencial aplicada ao eletrodo de trabalho até o
potencial de -0,4 V não ocorre a formação do pico anódico Epa 1. Este fato indica que
Epa 1 é dependente da formação de Epc 1 e, de acordo com a redução de
nitrocompostos em meio misto, sugere-se a formação do intermediário nitroso a partir
da re-oxidação da hidroxilamina (Squella et al., 1996; Núñes-Vergara et al., 1995). Em
todos os voltamogramas cíclicos obtidos não foi possível determinar a formação de
pico anódico do radical nitro ânion em qualquer velocidade de varredura testada. Em
decorrência da formação da hidroxilamina, em reação irreversível, não foram aplicados
os critérios de diagnóstico do número de elétrons e do tipo de reação eletródica
característicos para as reações reversíveis e quasi-reversíveis, uma vez que o radical
nitro ânion não é observado com o emprego de VC.
Nos voltamogramas de onda quadrada obtidos com as condições voltamétricas
otimizadas, de freqüência de 100 Hz, amplitude de pulso 50 mV, degrau de potencial
de 0,042 V, reduziu-se a faixa de potencial investigada (E i = - 0,1 a E f = - 1,0 V), com a
finalidade de procurar isolar o par reversível Ar-NO2/Ar-NO2-.
A Figura 17.B demonstra a ocorrência de um pico catódico, Epc 1 (- 0,48 V), e
um pico anódico, Epa 1 (- 0,45 V) na re-oxidação dos produtos de redução dos
nitrocompostos. Adicionalmente, observou-se que a variação da freqüência, na faixa
de 50 a 500 Hz, não exerce influência sobre os potenciais de redução de Epc 1 e Epa
1. Este fato, somado a pequena diferença entre os valores dos potenciais de redução
do pico catódico e o anódico, indica a existência de reversibilidade característica para
o radical nitro ânion, na reação de redução do nitrocomposto a partir do estado
adsorvido. Em contraste, do mesmo modo como descrito para o meio aprótico, os
critérios de diagnóstico do número de elétrons envolvidos na reação eletródica não
puderam ser aplicados devido à ausência de relação linear (da corrente de pico de
redução com a raiz quadrada da freqüência), ou mesmo não linear, correspondente a
reações reversíveis ou quasi-reversíveis.
A diferença observada entre os voltamogramas cíclicos e de onda quadrada
obtidos pode ser devido a maior sensibilidade da VOQ em processos que envolvem
adsorção de reagentes ou produtos de reação (Souza et al., 2002; Lovric, 2000) na
superfície do eletrodo de carbono vítreo.
FBT/FCF/USP 68
Condições experimentais: Voltametria Cíclica = 500 mV s -1, faixa de potencial estendida
(----) E i = - 0,15 V, E1= - 0,9 V, E2= 0,5 V e E f = - 0,15 V e reduzida () E i = - 0,15 V,
E1= - 0,9 V, E2= - 0,05 V e Ef = - 0,1 V, e Voltametria de Onda Quadrada = 100 Hz,
amplitude de pulso 50 mV, degrau de potencial 0,042 e faixa de potencial empregada
Ei = - 0,1 V e Ef = - 0,9 V.
Figura 17. Voltamogramas cíclicos (A) e de onda quadrada (B) registrados com
eletrodo de carbono vítreo em solução 0,5 mmol L-1 da 5-nitro-
2-tiofilideno benzidrazida (DMSO/solução tampão PIPES, 50% v/v).
A
B
-1,2 -0,8 -0,4 0,0 0,4
Epa,1
= 0,10 V
Epc,1
= - 0,58 V
0,0
(-) 5 ()
E vs Ag/AgCl, KClsat.
/ V
-1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0
corrente direta
corrente reversa
Epc, 1
= - 0,48 V
Epa, 1
= - 0,45 V
0,0
( - ) 4 ()
E vs Ag/AgCl, KClsat.
/ V
FBT/FCF/USP 69
4.2.2.2 Eletrodo de pasta de carbono
O eletrodo de pasta de carbono foi utilizado como alternativa ao eletrodo de
carbono vítreo na determinação da formação do radical nitro ânion a partir dos
nitrocompostos. A escolha deste material foi feita em função da possibilidade deste ser
mais hidrofóbico que o carbono vítreo, o que estabilizaria o radical, além de permitir a
fácil renovação da superfície do eletrodo de trabalho.
Os voltamogramas cíclicos e de onda quadrada obtidos para os
nitrocompostos, com o emprego do eletrodo de pasta de carbono, foram realizados
utilizando-se as mesmas condições dos testes envolvendo eletrodo de carbono vítreo,
entre os quais estão a janela de potencial, a amplitude de pulso e a concentração do
meio misto de reação. A determinação dos potenciais de redução dos nitrocompostos
foi realizada em meio misto de DMSO/solução tampão PIPES, 50% v/v, pH aparente
7,4, e eletrólito de suporte NaNO3 0,3 mmol L-1.
Os voltamogramas obtidos demonstraram resultados muito similares aos
determinados com o emprego do eletrodo de carbono vítreo. Por outro lado, a pasta
de carbono perde consistência em presença de DMSO na solução, apresentando-se
instável em grande parte das medidas voltamétricas. Diante do exposto, foram
descontinuados os estudos com este tipo de eletrodo de trabalho no presente meio de
reação.
4.2.3 Meio prótico (aquoso)
Em virtude da obtenção do potencial de redução do radical nitro ânion nos
meios misto e aprótico partiu-se para medidas em meio 100% prótico, as quais
apresentam maior proximidade ao meio intracelular onde ocorre a atividade
antichagásica. Nestas condições, foi realizada a imobilização dos nitrocompostos em
pasta de carbono, o que permitiu transpor a solubilidadade reduzida dos derivados
estudados e possibilitou a investigação eletroquímica destes em meio aquoso prótico.
A escolha do eletrodo de pasta de carbono modificado com nitrocomposto
ocorreu também devido à facilidade de construção e a possibilidade do emprego de
outras soluções tampão não empregadas até o momento. Este procedimento permitiu,
quando em comparação com o eletrodo de carbono vítreo, a renovação da superfície
eletródica ocorre sem a necessidade de processo complexo de limpeza (Radi, 1999;
Buchberger et al., 1998; Kalcher et al., 1995; Rice et al., 1983).
Esta etapa envolveu a modificação da constituição da pasta de carbono, sendo
preparada com 10% m/v de 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazida homogeneizado na
massa da pasta. Assim, nitrocomposto ficou imobilizado na pasta de carbono bem
como na superfície do eletrodo de trabalho. As medidas experimentais otimizadas
FBT/FCF/USP 70
envolveram a redução eletroquímica dos nitrocompostos em meio prótico e pH neutro,
sendo a velocidade de varredura de 2000 mV s-1 e faixa de potencial de Ei = - 0,10 V,
E1 = -0,9 V, E2 = -0,05 V e E f = -0,05 V para a VC e = 500 Hz, amplitude de pulso 50
mV, degrau de potencial 0,0042 V, Ei = - 0,2 V e Ef = - 0,6 V, para a VOQ.
Os critérios de diagnóstico normalmente utilizados para as voltametrias cíclica
e de onda quadrada, Tabela 3, não podem ser utilizados neste caso, uma vez que o
composto analisado encontra-se presente na constituição da pasta de carbono. Este
fato impediu a determinação do número de elétrons envolvidos em cada pico de
redução obtido. Todavia, ressalta-se que o processo eletródico geralmente obtido
infere em reação irreversível com transferência de quatro elétrons e quatro prótons
(Eq. 26). A Figura 18 demonstra os voltamogramas cíclico (A) e de onda quadrada (B)
obtidos nas condições mencionadas anteriormente.
Os voltamogramas demonstraram a ocorrência de dois picos catódicos, Epc
1, e Epc 2, e permitiram a visualização de componente anódico, Epa, 1, na varredura
de potencial no sentido reverso. O potencial de inversão de varredura foi fixado ao
final do processo de redução de Epc 1, justamente antes da formação do segundo
pico de redução (Epc 2). Este procedimento resultou no desaparecimento do
componente anódico anteriormente gerado (Epa 1), demonstrando, portanto, ser este
dependente do pico registrado em Epc 2. Tal comportamento dificultou a comprovação
de que o pico registrado em Epc 1 realmente se deve à formação do radical nitro ânion
a partir da redução do nitrocomposto em meio prótico. Por outro lado, a razão das
correntes de pico catódicos obtidas em Epc 1 e Epc 2 apresentam valores indicando
que o número de elétrons envolvidos no primeiro pico de redução é 1/3 do número de
elétrons envolvidos no segundo pico de redução. Isto indica que o provável
mecanismo envolvido nesta reação é o descrito nas equações 24 e 25.
Em medidas voltametricas que envolvem o aumento da velocidade de
varredura (VC), na faixa de 100 a 2000 mV s-1, e freqüências de 50 a 500 Hz (VOQ),
observou-se que Epc 1 não é visível em velocidades de varredura e freqüências
menores que 500 mV s-1 e 200 Hz, respectivamente. A partir destes resultados sugere-
se que o radical nitro ânion apresenta meia vida muito curta em meio prótico e não
pode ser detectado em voltamogramas realizados em velocidades lentas.
Com a finalidade de verificar se Epc 1 possui componente anódico, elevou-se
o pH do meio prótico para 10,0 (com adição de solução de NaOH 0,1 mol L-1) onde é
esperada maior estabilidade do radical nitro ânion. Utilizou-se, também, a solução de
NaOH, em pH 10,0 para confirmação dos resultados obtidos com o tampão PIPES (pH
10,0). Desse modo, os voltamogramas foram obtidos empregando-se as mesmas
FBT/FCF/USP 71
condições voltamétricas utilizadas para determinar os voltamogramas em meio prótico
de pH 7,0. Os voltamogramas obtidos com a solução tampão PIPES apresentaram o
mesmo perfil voltamétrico e potenciais de redução que o meio constituído de NaOH.
Quando comparados às respostas voltamétricas, no entanto, os picos determinados
em NaOH apresentaram melhor resolução.
A Figura 19 A refere-se aos voltamogramas cíclicos obtidos em meio prótico
de pH 10,0 (meio NaOH). O voltamograma mostra que nesta condição o pico Epc 1
possui componente anódico e que a razão de correntes (Ipc,1/Ipa,1) é próxima da
unidade. Para confirmar a formação do radical nitro ânion reduziu-se a janela de
potencial (VC) e isolou-se o par reversível de redução caracterizando a ocorrência do
par redox. Assim, os picos Epc 1 e Epa 1 podem ser atribuídos à redução do
nitrocomposto ao respectivo radical e re-oxidação deste ao composto original em
reação eletródica envolvendo um elétron.
O segundo pico de redução (Epc 2) não apresentou componente anódico
correspondente nesta janela restrita de potencial, e pode ser atribuído à redução do
radical ao intermediário hidroxilamina em processo envolvendo mais três elétrons e
quatro prótons.
A partir dos voltamogramas de onda quadrada foi possível observar a formação
de dois picos de redução (Epc 1 e Epc 2), assim como dois picos de re-oxidação (Epa
1 e Epa 2), dos produtos eletroquimicamente gerados durante o processo de redução.
O potencial de inversão de varredura foi fixado ao final do processo de redução de Epc
1, justamente antes da formação do segundo pico de redução (Epc 2). Este
procedimento resultou em manutenção do componente anódico Epa 2 e demonstrou,
portanto, que Epa 2 é dependente do pico registrado em Epc 1. A partir deste
resultado sugere-se a formação de radical nitro ânion caracterizado por Epc 1 e sua
re-oxidação ao nitrocomposto de partida (Epa 2).
O primeiro pico anódico (Epa 1) não sofre influência da variação da freqüência
aplicada nos diversos voltamogramas de onda quadrada registrados e foi atribuído a
re-oxidação do intermediário hidroxilamina ao intermediário nitroso. A presença de Epa
1 pode ocorrer em região negativa de potencial devido a ocorrência de processo
adsortivo. A diferença observada entre voltamogramas cíclicos e de onda quadrada
obtidos, mais precisamente na formação de Epa 2, pode ser devido à maior
sensibilidade da VOQ em relação a VC, na detecção do material adsorvido. Este
procedimento experimental encontra-se ainda em fase de investigação no Laboratório
de Bioeletroanalítica e Bioeletroquímica do IQ/USP e envolve o emprego de outras
soluções-tampão e o estudo dos picos obtidos em faixa estendida de potencial.
FBT/FCF/USP 72
Condições experimentais: A) Voltametria Cíclica: = 2000 mV s-1, Ei = - 0,15 V, E= - 0,9 V e
Ef = - 0,1 V, B) Voltametria de Onda Quadrada: = 500 Hz, amplitude de pulso 50 mV,
degrau de potencial 0,0042, Ei = - 0,2 V e Ef = - 0,6 V.
Figura 18. Voltamogramas registrados com eletrodo de pasta de carbono ( ----) e
eletrodo de pasta de carbono modificado com a 5-nitro-
2-tiofilideno benzidrazida () em solução tampão PIPES pH 7,06.
A
B
-1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0
Epc, 2
= - 0,45 V
Epc, 1
= - 0,33 V
Epa, 1
= - 0,22 V
0,0
(-) 20 ()
E vs Ag/AgCl, KClsat.
/ V
-0,6 -0,5 -0,4 -0,3 -0,2 -0,1 0,0
corrente reversa
corrente direta
Epa, 1
= - 0,35 V
Epc, 2
= - 0,43 V
Epc, 1
= - 0,31 V
0,0
(-) 20 ()
E vs Ag/AgCl, KClsat.
/ V
FBT/FCF/USP 73
Condições experimentais: A) Voltametria Cíclica: = 2000 mV s -1, Ei = -0,15 V, E= -0,9 V e
Ef = -0,1 V, B) Voltametria de Onda Quadrada: = 500 Hz, amplitude de pulso 50 mV,
degrau de potencial 0,0042, Ei = -0,2 V e Ef = -0,9 V.
Figura 19. Voltamogramas registrados com eletrodo de pasta de carbono (----) e
eletrodo de pasta de carbono modificado com a 5-nitro-
2-tiofilideno benzidrazida () em solução NaOH (pH 10,0).
B
A
-1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0
Epa, 1
= - 0,41 V
Epc, 2
= - 0,64 V
Epc, 1
= - 0,41 V
0,0
(-) 10 ()
E vs Ag/AgCl, KClsat.
/ V
-1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0
corrente
reversacorrente
direta
0,0
Epa, 2
= - 0,43 VE
pa, 1= - 0,53 V
Epc, 2
= -0,64
Epc, 1
= - 0,43 V
(-) 10 ()
E vs Ag/AgCl, KClsat.
/ V
FBT/FCF/USP 74
Este estudo envolveu a determinação do potencial de redução (E1/2) e o
potencial de pico catódico (referente ao primeiro pico de redução - Epc 1) de todos os
nitrocompostos escolhidos para o estudo de QSPR e SAR/QSAR. O potencial de
redução de todos os compostos foi determinado por meio da somatória dos valores
dos picos catódico (Epc 1) e anódico (Epa 1) e dividido pela metade. Ressanta-se, no
entanto, que o radical nitro ânion foi determinado em meio prótico apenas para os
derivados 5-nitro-tiofilidenos, uma vez que os 5-nitro-furfurilidenos não apresentaram
resposta voltamétrica para o referido radical no meio de reação estudado.
Os valores dos potenciais de pico catódico (Epc 1) e os potenciais de redução
(E1/2) dos nitrocompostos, determinados nos meios aprótico (utilizando VC) e misto
(utilizando VOQ), em conjunto com os valores dos potenciais de pico catódico (Epc 1)
dos 5-nitro-tiofilidênicos, determinados em meio prótico (utilizando VC), estão
apresentados na Tabela 5.
FBT/FCF/USP 75
Tabela 5. Valores de E1/2 dos nitrocompostos, referente ao par Ar-NO2/Ar-NO2-, e Epc 1
obtidos em meio aprótico (VC), em meio misto (VOQ) e meio prótico (VC).
(X = S ou O) Meio aprótico Meio misto Meio aquoso
Y Epc 1* E1/2** Epc 1* E1/2** Epc 1*
(S) H - 0,67 - 0,62 - 0,48 - 0,46 - 0,33
(S) CH3 - 0,68 - 0,58 - 0,46 - 0,44 - 0,33
(S) Cl - 0,75 - 0,70 - 0,46 - 0,43 - 0,33
(S) F - 0,68 - 0,62 - 0,49 - 0,46 - 0,33
(S) CF3 - 0,65 - 0,61 - 0,47 - 0,44 - 0,33
(S) OCH3 - 0,68 - 0,63 - 0,46 - 0,45 -
(S) OCH2CH3 - 0,68 - 0,63 - 0,48 - 0,45 - 0,33
(S) N(CH3)2 - 0,67 - 0,62 - 0,48 - 0,48 - 0,33
(S) NH2 - 0,70 - 0,64 - 0,47 - 0,47 -
(S) SO2NH2 - - - 0,46 - 0,44 -
(S) OH - - - 0,47 - 0,46 -
(S) CN - - - 0,43 - 0,40 -
(O) H - 0,72 - 0,68 - 0,47 - 0,44 -
(O) CH3 - 0,72 - 0,68 - 0,48 - 0,45 -
(O) Cl - 0,72 - 0,68 - 0,45 - 0,43 -
(O) F - 0,75 - 0,68 - 0,46 - 0,44 -
(O) CF3 - 0,52 - 0,50 - 0,51 - -
(O) OCH3 - 0,72 - 0,68 - 0,46 - 0,44 -
(O) OCH2CH3 - 0,72 - 0,70 - 0,49 - 0,47 -
(O) N(CH3)2 - 0,75 - 0,68 - 0,47 - 0,45 -
(O) NH2 - 0,69 - 0,68 - 0,47 - 0,42 -
(O) SO2NH2 - - - 0,47 - 0,46 -
(O) OH - 0,73 - 0,70 - 0,47 - 0,46 -
* Epc 1 significa potencial de pico catódico (Volts) e ** E1/2 potencial de redução (Volts)
determinados em triplicata e desvio padrão máximo de 0,02V (3,0%).
XO
N N
NO2
Y
FBT/FCF/USP 76
4.3 Modelagem Molecular
4.3.1 Cálculo de otimização de geometria estrutural
As moléculas foram desenhadas nos pacotes computacionais Spartan 02 para
Linux e Spartan 04 para Windows, e as estruturas tridimencionais submetidas ao
processo de otimização de geometria, empregando o método de mecânica molecular
MMFF94 e o método semi-empírico Hamiltoniano AM1.
Adicionalmente, quando necessário, foram utilizados os métodos de mecânica
quântica ab initio em nível Hartree-Fock com conjunto de bases 3-21G* e 6-31G* para
corroborar os resultados obtidos por AM1. Neste contexto, ressalta-se que o processo
de otimização de geometria estrutural dos nitrocompostos por AM1 apresentou a
mesma conformação obtida a partir de cálculos ab initio Hartree-Fock 6-31G*.
Ademais, as formas espaciais obtidas em ambas metodologias foram similares às
obtidas através do método de análise conformacional. Os cálculos da geometria
estrutural otimizada, obtida nesta etapa do trabalho, para todos os nitrocompostos
apresentaram desvios (root mean square – RMS) de, no máximo, 0,1 Kcal/mol. Estes
valores foram similares aos valores obtidos na análise conformacional e no cálculo de
carga de ponto único.
4.3.2 Análise conformacional
A análise conformacional dos nitrocompostos foi realizada por método AM1 em
meio solvatado e vácuo. Inicialmente, os estudos foram direcionados para a obtenção
dos confôrmeros de energia mínima dos derivados 5-nitro-tiofilidênicos no vácuo.
Estes derivados foram representados pela 5-nitro-2-tiofilideno 4-hidroxi-benzidrazida
(S) e são demonstrados na Figura 20.1 (S) por modelo “space filling” (CPK) e em 20.2
(S) por modelo tubo, respectivamente.
A partir da análise conformacional dos derivados 5-nitro-tiofilidênicos foi
observado que estes apresentaram confôrmeros com configuração s-cis entre o
hidrogênio benzidrazídico e os dois átomos de hidrogênio do anel 5-nitro-tiofilidênico.
Observou-se, ainda, que o confôrmero de energia mínima s-cis apresentou valor de
1,10 Kcal/mol menor que o confôrmero s-trans obtido na mesma análise, o que indica
a ocorrência de maior estabilidade do confôrmero s-cis em relação à configuração s-
trans dos isoconfôrmeros obtidos.
Os confôrmeros dos derivados 5-nitro-furfurilidênicos, por outro lado,
representados na Figura 20.2 (O) pela 5-nitro-2-furfurilideno 4-hidroxi-benzidrazida
(nifuroxazida), apresentaram configuração s-trans entre os átomos de hidrogênio
presentes na mesma posição da molécula. Este efeito pode ser atribuído ao maior raio
FBT/FCF/USP 77
atômico e volume do átomo de enxofre em comparação ao átomo de oxigênio,
presentes no anel de cinco membros, o que proporciona maior impedimento estérico
frente à ocorrência de conformação s-trans dos 5-nitro-furfurilidênicos. Assim, a partir
da análise dos valores de energia termodinâmica obtidos, verificou-se que a
conformação s-trans registrada nesta análise apresenta valores de 0,71 Kcal/mol
menores que a configuração s-cis. Este resultado indica tendência de maior
estabilidade da configuração s-trans em meio vácuo para os compostos 5-nitro-2-
fufurilidênicos.
Figura 20. Confôrmeros de menor energia mínima obtidos por AM1 dos 5-nitro-
heterocíclicos (S) e (O): modelos CPK (1) e tubo - visão frontal e lateral
(2). Cor dos átomos: C (cinza); H (branco); N (Azul); O (vermelho); S
(verde).
Em paralelo ao estudo realizado em vácuo, a análise conformacional de
confôrmeros presentes em meio solvatado é relevante para a compreensão dos
mecanismos envolvidos no conjunto da atividade antichagásica, uma vez que os
parasitas encontram-se presentes em ambiente aquoso no organismo humano. O
estudo da interação entre soluto e solvente é geralmente um processo complicado e
poucos métodos matemáticos computacionais são aceitos e utilizados pela
comunidade científica para descrever estas interações (Anadan et al., 2004; Young,
2001). Entre estes, os métodos SCRF (self-consistent reaction field) e o modelo
derivativo contínuo de Born, conhecido como SM5.4 model, apresentam-se como
alternativas viáveis e robustas para investigar o efeito do solvente sobre os
confôrmeros dos nitrocompostos (Cramer, 2002; Yong, 2001; Dixon et al., 1993;
(S)
(O)
1 2
FBT/FCF/USP 78
Cramer & Truhlar, 1992). Desse modo, o modelo SM5.4, presente no programa de
modelagem molecular Spartan, foi utilizado para a investigação dos confôrmeros de
energia mínima em meio solvatado (Cramer, 2002).
A partir da análise dos confôrmeros de menor energia mínima dos derivados
5-nitro-tiofilidênicos e 5-nitro-furfurilidênicos obtidos por método AM1, em meio
solvatado, alcançaram-se compostos que apresentam configuração s-trans entre o
hidrogênio benzidrazídico e os dois átomos de hidrogênio do anel 5-nitro-tiofilidênico.
A diferença observada entre os distintos meios solvatado e vácuo pode ser decorrente
da forma como o programa abrange (ou parametriza) o átomo de enxofre ou como
realiza o cálculo de investigação conformacional.
Os diferentes confôrmeros obtidos na análise conformacional apresentaram
pequena diferença para os valores de energia termodinâmica calculada. Como
demonstrado para a nifuroxazida, 5-nitro-2-tiofilideno 4-hidroxi-benzidrazida, os
confôrmeros que apresentam as configurações s-trans e s-cis registrados em meio
vácuo demonstram valores de energia de 19,24 e 20,34 Kcal/mol, respectivamente.
Para o mesmo composto, em meio solvatado os valores de energia obtidos para os
confôrmeros s-trans e s-cis foram 4,89 e 4,97 Kcal/mol, respectivamente. A partir
destes dados é possível afirmar a ocorrência de isoconfôrmeros, ou seja, não existe
diferença significativa dos valores de energia termodinâmica entre os confôrmeros de
energia mínima obtidos nos meios pesquisados, não ultrapassando valores de 1,6
Kcal/mol entre todos os confôrmeros. Este comportamento foi também registrado para
todos os 5-nitro-heterocíclicos estudados. Desse modo, foi escolhido o meio vácuo
para a continuidade dos experimentos devido a maior variação entre os valores de
energia, em comparação com o meio solvatado, dos diferentes confôrmeros obtidos
através da análise conformacional.
A partir da análise dos confôrmeros obtidos em meios solvatado e vácuo por
método AM1, e dos estudos de otimização de geometria das estruturas das 5-nitro-
2-furfurilideno 4-hidroxi-benzidrazida e 5-nitro-2-tiofilideno 4-hidroxi-benzidrazida em
nível Hartree-Fock com o conjunto de bases 3-21G* e 6-31G*, foi observada a
ocorrência de efeito co-planar da molécula do grupo nitro até a carbonila
benzidrazídica, Figura 20, visão lateral. A molécula sofre deformação angular na
ligação do anel benzênico com a carbonila, ângulo torsional 4 na Figura 12. Esta
observação é compatível com os dados cristalográficos obtidos na literatura para a
nifuroxazida, (O) (Pniewska e Januchowski, 1998). A análise conformacional dos
compostos 5-nitro-2-tiofilideno e 5-nitro-2-furfurilideno benzidrazidas, através da
FBT/FCF/USP 79
variação de 30º dos ângulos () 1 a 6, revelou orientação espacial em comum a todos
os 5-nitro-heterocíclicos estudados.
A similaridade estrutural com os dados cristalográficos propostos por Pniewska
e Januchowski, em 1998, semelhante à configuração estrutural da nifuroxazida
estudada por Boussac et al., em 2003, se infere somente ao efeito co-planar citado
acima e, no entanto, diferem de forma acentuada quanto à configuração observada. A
nifuroxazida obtida por meio da análise conformacional apresenta configuração s-trans
entre o hidrogênio da porção (HC=N) hidrazídica e os dois átomos de hidrogênio do
anel nitrotiofilidênico. Do mesmo modo, a carbonila se encontra em configuração
s-trans em relação aos átomos de hidrogênio da porção hidrazídica-nitrotiofilidênica.
Para a estrutura retirada da literatura, todos os átomos de hidrogênio da porção
hidrazídica-nitrotiofilidênica se encontram em posição s-cis, Figura 20. Ressalta-se
ainda que a porção hidrazídica tenha sido alvo de estudos que visam definir a sua
configuração real, sendo que alguns autores sugerem, a partir de moléculas similares
aos compostos estudados neste trabalho, a ocorrência simultânea de isoconfôrmeros
de configuração s-cis e s-trans (Carvalho et al., 2004; Ifa et al., 2000).
No presente estudo de modelagem molecular, o confôrmero obtido a partir dos
dados cristalográficos (hidrogênios em configuração s-cis), apresentou a posição de
qüinquagésimo nono lugar em lista contendo todos os confôrmeros de menor energia
obtida por método semi-empírico AM1, com valor de energia de formação de
5,44 Kcal/mol maior que o confôrmero s-trans (1). Desse modo, o confôrmero de
menor energia obtido (1) e o confôrmero extraído a partir dos dados cristalográficos
foram submetidos à nova otimização de geometria empregando-se o método ab initio
6-31G* visando a comprovação da real estrutura presente nos meios estudados.
Os valores de energia para o confôrmero 1 foram -997,13 e -997,15 au2 em
vácuo e em meio solvatado, respectivamente. O confôrmero de número 59 apresentou
valores de energia de -997,12 e -997,14 au2 em ambos os meios estudados. A partir
da análise dos resultados obtidos por métodos AM1 e ab initio é possível concluir que
a configuração de menor energia obtida pelos métodos computacionais é diferente e
teoricamente mais estável do que a configuração determinada quando na forma de
cristais, obtida em meio de DMSO.
FBT/FCF/USP 80
Figura 21. Confôrmero de menor energia mínima obtido por método AM1
(configuração s-trans) e confôrmero (hidrogênios em configuração s-cis)
descrito na literatura para a nifuroxazida: modelo misto de bolas e tubo.
Coloração dos átomos: C (cinza); H (branco); N (Azul); O (vermelho); S
(verde).
O padrão estrutural que visualiza a quebra de efeito co-planar na estrutura da
molécula indica que o efeito eletrônico não se transmite da porção 5-nitro-tiofilidênica
ou 5-nitro-furfurilidênica até a extremidade do anel benzênico molecular, região onde
foi realizada a variação estrutural. Em virtude da ocorrência da citada conformação
dos 5-nitro-heterocíclicos pode-se sugerir que ocorre ausência do efeito mesomérico
conjugado em todo conjunto da molécula.
A conformação que registra a quebra de efeito co-planar na estrutura dos
nitrocompostos sugere a ocorrência de repulsão, por meio de efeito estérico, dos
átomos de hidrogênio do anel benzênico e os hidrogênios da porção hidrazídica da
molécula.
Com o objetivo de avaliar a influência da presença do anel benzênico sobre a
conformação dos nitrocompostos foram realizados estudos de modelagem molecular,
submetidos à otimização de geometria estrutural e análise conformacional, de
compostos que não possuem o anel benzênico em sua estrutura química, a saber:
5-nitro-tiofilideno 4-fluor-di-vinilhidrazida e a 5-nitro-tiofilideno etilhidrazida. A partir
desta análise verificou-se que há ausência de torção na ligação da porção etil ou
4-flúor-divinil ligada à porção hidrazídica, Figura 22, sendo diferente da observada
quando na presença do anel benzênico. Desse modo, pode-se sugerir que o anel
benzênico é fator preponderante à quebra de efeito co-planar na estrutura dos
nitrocompostos.
Átomos de hidrogênio emconfiguração s-cis.
Átomos de hidrogênio emconfiguração s-trans.
FBT/FCF/USP 81
Figura 22. Estrutura química dos nitrocompostos (A) 5-nitro-2-tiofilideno 4-fluor-di-
vinilhidrazida e (B) 5-nitro-2-tiofilideno 4-etilhidrazida utilizados na
investigação da influência do anel benzênico sobre a conformação dos
derivados 5-nitro-heterocíclicos.
Ainda visando obter dados que corroborem a constituição de torção estrutural
da porção do anel benzênico realizaram-se experimentos de espectrofotometria
UV/Visível com o objetivo de obter informações sobre a ocorrência, ou não, de grupos
cromóforos conjugados na estrutura dos nitrocompostos.
Os espectros obtidos com varredura entre 200-750 nm, velocidade 1200 nm
min-1 registraram sinais em valores de comprimento de onda () diferentes, os quais
correspondem a cromóforos característicos de sistemas ressonantes não-conjugados
(Claidem, 2000). Estes resultados sugerem a ausência de efeito mesomérico
conjugado na estrutura dos 5-nitro-heterocíclicos. As bandas registradas nos
espectros UV/Visível (anexo 1) para o composto 5-nitro-2-tiofilidênico benzidrazida
foram 1 = 211 nm, máx,2 = 381 nm. Este comportamento foi observado para todos os
compostos estudados.
Em virtude aos resultados descritos acima, foi proposta outra hipótese visando
explicar a ausência de efeito co-planar na estrutura dos nitrocompostos. Esta
proposição, apresentada na Figura 23, propõe a ocorrência de equilíbrio ceto-enólico,
a partir da estrutura padrão da porção 5-nitro-benzidrazídica. Os estudos de
otimização de geometria da estrutura da 5-nitro-2-tiofilideno benzo-enol 1-
metilenohidrazina seguidos pela análise conformacional e cálculo de energia de carga
de ponto único, realizados com emprego dos métodos AM1 e ab initio em nível HF
com conjunto de bases 3-21G*, permitiram observar a quebra do efeito co-planar em
duas porções da molécula do nitrocomposto, sendo a primeira no carbono enólico e a
segunda no anel benzênico. Este resultado comprovaria a ausência de transmissão do
efeito mesomérico através da molécula. Todavia, ao comparar os valores de energia
SO
N N
NO2
H
HH
FH
H
H
SO
N N
NO2
H
H
H H
H H
H
A B
FBT/FCF/USP 82
termodinâmica dos compostos enólico e ceto-benzidrazídicos, foi observado que a
estrutura enólica apresenta valor de 5,0 kcal/mol maior que o valor obtido para a
carbonilica, o que significa maior estabilidade da estrutura padrão dos derivados 5-
nitro-2-heterocíclo benzidrazida. Após este estudo, foi abandonada a hipótese de
formação dos compostos enol-benzidrazícos.
Figura 23. Hipótese de ocorrência de equilíbrio ceto-enólico da estrutura da 5-nitro-
2-tiofilideno benzidrazida.
4.3.3 Cálculo de energia de carga de ponto único
Ao escolher os confôrmeros dos nitrocompostos em vácuo foi calculada em
seguida a energia de ponto único juntamente com diversos parâmetros físico-
químicos, a saber: energia de HOMO e de LUMO, diferença entre os valores de
energia de HOMO e LUMO (bandgap), energia de formação em meio vácuo e
solvatado, momento de dipolo, valores de distâncias intramoleculares e volume
molecular.
A conformação obtida na análise de cálculo de energia de carga de ponto único
é a mesma observada para os confôrmeros de energia mínima determinados pela
análise conformacional. Os parâmetros estruturais dos confôrmeros obtidos em vácuo,
tais como ângulos diedro, O16-C7-C4-C5 (1), N8-C7-C4-C3 (2), que correspondem a
torção das ligações 3 e 4, C10-N9-N8-C7 (3), que corresponde a torção das
ligações 2 e 3, as distâncias interatômicas medidas entre as extremidades das
moléculas, e entre o O1 (oxigênio do grupo carbonila) e o hidrogênio do grupo H-C=N,
encontram-se listados na Tabela 5.
O ângulos diedros 1 e 2 determinados para os nitrocompostos apresentaram
variação de oito a nove graus, na faixa de 34-45 oC para 1 e 36-45 oC para 2, o que
define pequena diferença na conformação entre os compostos estudados. A partir da
análise destes resultados, similares aos obtidos a partir a análise conformacional,
sugere-se que o anel benzênico se apresenta com desvio aproximado de 40o fora do
SO
N N
NO2H
H
SO
N N
NO2
H
HSO
N N
NO2
H
H
FBT/FCF/USP 83
plano da porção 5-nitro-heterocíclico-acilhidrazida, o que corrobora a quebra de efeito
co-planar na estrutura dos nitrocompostos.
Para o ângulo diedro de número 3 a variação angular observada entre os
diversos nitrocompostos foi cerca de 1 grau. Esta diferença poderia indicar que algum
composto apresenta maior quebra de efeito co-planar nesta porção da molécula em
relação às moléculas da mesma classe, entretanto, a variação observada não foi
significativa.
Foram analisadas duas distâncias interatômicas que poderiam estar
influenciando tanto a conformação molecular como a atividade antichagásica
potencial. A determinação da primeira distância intramolecular envolveu os átomos O1
(oxigênio do grupo carbonila) e o hidrogênio da porção H-C=N, os quais poderiam
representar a distância necessária para a formação de ligação de hidrogênio
intramolecular não formal, caracterizando a ocorrência de anel heterocíclico na
molécula dos nitrocompostos. Esta estrutura química hipotética se apresentaria
contorcida e, portanto, sem a ocorrência de efeito co-planar na porção hidrazídica-
nitrotiofilidênica ou hidrazídica-nitrofurfurilidênica.
Embora as distâncias determinadas para todos os 5-nitro-heterocíclicos
apresentem valores de 2,22 a 2,24 Â que favorecem a formação de ligação de
hidrogênio, a partir da análise de otimização de geometria estrutural da 5-nitro-
2-tiofilideno banzidrazida e do análogo anelado, foi descartada esta hipótese devido
aos compostos apresentarem valores de energia mínima maiores que os compostos
sem ligação de hidrogênio interna. Tais resultados significam que a molécula
hipotética seria mais instável que os 5-nitro-heterocíclicos inicialmente propostos neste
trabalho.
A determinação da segunda distância intramolecular envolveu as extremidades
de todos os 5-nitro-heterocíclicos. Como se pode esperar, a distância é tanto maior
quanto maior for o volume do grupo inserido em posição para do anel benzênico da
estrutura dos compostos estudados. Estas medidas podem fornecer subsídios
relevantes para o estudo fármaco-receptor, ou mesmo, definir a influência do tamanho
molecular sobre a atividade antichagásica destes compostos. Os valores calculados
das distâncias intramoleculares e dos ângulos diedro encontram-se ilustrados na
Tabela 6.
FBT/FCF/USP 84
Tabela 6. Valores de ângulos diedros e distâncias atômicas de maior importância para
o estudo dos nitrocompostos.
(X = S ou O) Ângulos diedros (graus)Distâncias
interatômicas (Â)
Substituição
em C1O16-C7-C4-C5 N8-C7-C4-C3 C10-N9-N8-C7 O1-H17 extremidades
(S) H 38,61 40,85 2,62 2,22 14,30
(S) CH3 38,05 39,74 2,53 2,22 15,21
(S) Cl 38,75 41,00 3,13 2,23 14,37
(S) F 38,75 41,00 3,13 2,23 14,37
(S) CF3 40,71 42,87 3,15 2,23 15,54
(S) OCH3 35,88 38,35 3,23 2,22 16,45
(S) OCH2CH3 35,42 37,91 3,44 2,22 16,80
(S) N(CH3)2 34,01 36,55 3,68 2,22 16,59
(S) NH2 34,86 37,28 3,86 2,22 15,22
(S) SO2NH2 43,73 45,20 2,71 2,23 15,95
(S) OH 36,03 38,51 3,34 2,22 15,04
(S) CN 40,07 42,25 3,07 2,23 15,76
(O) H 38,39 41,29 2,18 2,23 14,12
(O) CH3 38,11 40,48 2,34 2,23 14,96
(O) Cl 41,29 41,29 2,71 2,23 14,37
(O) F 37,79 40,30 2,91 2,23 14,37
(O) CF3 40,80 43,80 2,69 2,24 15,20
(O) OCH3 35,62 38,26 2,71 2,23 16,23
(O) OCH2CH3 35,34 38,01 2,71 2,23 16,25
(O) N(CH3)2 35,59 36,31 2,91 2,23 16,32
(O) NH2 34,71 37,25 3,43 2,23 14,94
(O) SO2NH2 45,15 47,43 1,97 2,24 15,49
(O) OH 35,78 38,43 2,49 2,23 14,78
N N
XO H
H H H
H
HH
H
NO2
H
1
2
6
3
7
5
41716
15 14
13
128 9
10 11
28
23
24
22
21
201918
25-27
FBT/FCF/USP 85
4.3.4 Estudo estereoeletrônico
A análise estereoeletrônica é ferramenta importante no estudo de relações
quantitativas entre estrutura química e a atividade biológica de nitrocompostos
(Thakur et al., 2006; Monastérios et al., 2005). A partir desta análise é possível
determinar, com precisão, as regiões envolvidas em interações eletrostáticas e em
mecanismos de transferência de carga entre compostos estudados e receptores
biológicos (Arroio et al., 2005; Foye et al., 1995; Marshall, 1995). Paulino et al, 2002,
estudaram uma série de nitro-heterocíclicos antichagásicos e verificaram que
determinadas propriedades eletrônicas proporcionam melhor entendimento do
mecanismo de ação e podem influenciar a atividade antichagásica destas moléculas.
Em virtude à relevância destes dados, foram obtidas informações eletrônicas
em nível molecular, utilizando o método semi-empírico AM1, a partir do confôrmero de
menor energia mínima calculado em vácuo e submetido à análise de cálculo de
energia de carga de ponto único. Neste processo, foram calculadas, também, as
propriedades físico-químicas de energia de formação em vácuo e meio solvatado,
energia de HOMO e de LUMO, momento de dipolo e cargas eletrônicas de potencial
eletrostático. Os mapas 3D de isossuperfície de HOMO e LUMO, e de potencial
eletrostático estão ilustrados nas Figuras 24.1, 24.2 e 25, respectivamente. Os valores
de energia termodinâmica de formação (calor de formação) calculados para todos os
nitrocompostos estudados encontram-se ilustrados na Tabela 7.
4.3.4.A Energia de LUMO
A propriedade eletrônica de energia orbitalar de LUMO indica a capacidade de
determinada molécula de aceitar um elétron em dada reação, que pode ser
representada pela redução do grupo nitro dos 5-nitro-heterocíclicos ou interação
fármaco-receptor (Marshall, 1995; Rozenski et al., 1995). Segundo Monastérios et al,
2005, quando um nitrocomposto ganha um elétron em processo de redução é no
orbital LUMO onde o mesmo entrará na molécula. A energia utilizada neste processo
indica a maior facilidade ou, até mesmo, dificuldade de redução desta classe de
compostos. Ainda de acordo com Monastérios et al, 2005, alguns 5-nitrofuranos que
apresentam valores de energia de LUMO altamente negativos devem proporcionar
maior reatividade devido a capacidade de ganhar um elétron rapidamente.
Os valores calculados de LUMO, utilizando o método AM1, para toda classe
das 5-nitro-benzidrazidas não apresentaram grande variação, sendo o valor mínimo de
-1,31 eV para o derivado 5-nitro-2-furfurilideno 4-etóxi-benzidrazida e o valor máximo
de -1,69 eV para o derivado 5-nitro-2-tiofilideno 4-trifluormetila-benzidrazida. Os
FBT/FCF/USP 86
valores de energia de LUMO calculados para todos os 5-nitro-heterocíclicos estudados
são observados na Tabela 7.
Os mapas 3D de distribuição de LUMO para os compostos 5-nitro-
2-tiofilideno benzidrazida e 5-nitro-2-furfurilideno benzidrazida estão ilustrados na
Figura 24.1 B e 24.2 B, respectivamente. A investigação dos mapas mostra que a
distribuição de energia encontra-se localizada na região 5-nitro-2-heterociclo
hidrazídica da estrutura de ambos nitrocompostos não substituídos.
Os compostos que possuem grupos aceptores de elétrons ligados à posição
para do anel benzênico apresentam a energia de LUMO distribuída por quase toda a
molécula dos nitrocompostos. O anel benzênico e o nitrogênio da porção amídica
apresentam menor intensidade de energia de LUMO em comparação com a região do
anel 5-nitro-heterocíclico.
Os compostos que possuem grupos doadores ligados à mesma porção
molecular dos nitrocompostos apresentam a energia de LUMO distribuída na região
5-nitro-heterocíclica hidrazídica, encontrando-se ausente na porção do anel benzênico
substituído.
4.3.4.B Energia de HOMO
A propriedade eletrônica de energia orbitalar de HOMO indica a capacidade de
determinada molécula de doar um elétron em dada reação (Barreiro et. al., 1997;
Marshall, 1995) a qual é diretamente relacionada ao potencial de ionização e pode ser
relevante na interação fármaco-receptor, resultando, também, em influência direta
sobre a atividade biológica destes compostos.
Os valores calculados de energia orbitalar de HOMO, utilizndo o método AM1,
para toda classe das 5-nitro-benzidrazidas não apresentaram grande variação quando
comparados entre os compostos do mesmo subconjunto, sendo o valor mínimo de -
8,81 eV para o derivado 5-nitro-2-tiofilideno 4-dimetilamino-benzidrazida e o valor
máximo de -9,63 eV para o derivado 5-nitro-2-tiofilideno 4-trifluormetila-benzidrazida.
Os mapas de distribuição orbitalar de HOMO para os compostos 5-nitro-
2-tiofilideno benzidrazida e 5-nitro-2-furfurilideno benzidrazida estão ilustrados na
Figura 24.1 A e 24.2 A, respectivamente. Os valores de energia de HOMO calculados
para todos os 5-nitro-heterocíclicos estudados são observados na Tabela 7.
Os mapas 3D de distribuição orbitalar de HOMO para todos os compostos
5-nitro-heterocíclicos demonstram haver vários sítios difundidos na porção 5-nitro-
furfurilidênica ou tiofilidênica hidrazidica da molécula. Os derivados 5-nitro-tiofilidênicos
apresentam sítio de energia de HOMO no átomo de enxofre do anel heterocíclico,
efeito não observado para oxigênio do anel de cinco membros dos derivados 5-nitro-
FBT/FCF/USP 87
furfurilidênicos. Esta característica foi observada entre todos os mapas obtidos a partir
dos derivados 5-nitro-furfurilidênicos e 5-nitro-tiofilidênicos.
A presença de grupos substituintes em posição para do anel benzênico dos
nitrocompostos é fator relevante no estudo do efeito eletrônico destes compostos.
Quando grupos aceptores encontram-se ligados à molécula, a energia de HOMO
apresenta-se distribuída de maneira similar aos compostos não substituídos, ou seja,
localizados na porção 5-nitro-2-tiofilidênico hidrazídica ou 5-nitro-2-furfurilidênico
hidrazídica. Neste contexto, observou-se também que a distribuição da energia de
HOMO apresenta maior intensidade na porção hidrazídica e de menor intensidade na
porção 5-nitro-2-heterocíclica.
Quando grupos doadores de elétrons encontram-se ligados ao anel benzênico
dos nitrocompostos, a energia de HOMO encontra-se distribuída por quase toda a
molécula dos 5-nitro-heterocíclicos, encontrando-se ausente somente na carbonila e
no carbono 18 do anel heterocíclico. Nestes experimentos, o derivado 5-nitro-
2-furfurilideno 4-metill-benzidrazida não apresentou distribuição da energia de HOMO
no anel benzênico.
1A
Figura 24. Mapas de distribuição orbitalar de HOMO (A) e LUMO (B) calculados por
AM1 para os compostos 1) 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazida e 2) 5-nitro-2-
furfurilideno benzidrazida, isossuperfície de 0,032 eV. Cor dos átomos: C
(cinza); H (branco); N (Azul); O (vermelho); S (verde).
1A 1B
2A 2B
FBT/FCF/USP 88
4.3.4.C Propriedades eletrônicas obtidas com os valores de HOMO e LUMO
Os valores das propriedades físico-químicas obtidas a partir dos valores de
energia de HOMO e de LUMO como bandgap, dureza química, afinidade eletrônica,
potencial de ionização e potencial químico, encontram-se ilustrados na Tabela 7.
Entre estas propriedades, a análise da dureza química calculada a partir dos
nitrocompostos é relevante para o entendimento da reatividade da molécula e, em
alguns casos, de propriedades importantes (Thanikaivelan et al., 2000; Parr &
Chattaraj, 1991) para este sistema molecular. Para os derivados 5-nitro-2-tiofilideno
benzidrazidas, observou-se a ocorrência de pequena variação de -3,68 eV (derivado
dimetilamino) até -4,01 eV (derivado trifluorometila), o que sugere que a reatividade
seja similar para os compostos estudados.
Para os derivados 5-nitro-2-furfurilideno benzidrazidas observou-se a
ocorrência de variação maior dos valores de dureza química, de -3,79 eV (derivado
dimetilamina) até -4,04 eV (derivado trifluorometila) em comparação aos derivados
5-nitro-2-tiofilideno benzidrazidas. Embora tenha sido determinada a ocorrência de
diferença entre os valores da dureza química calculados para os nitrocompostos, tal
propriedade não apresenta diferença significativa entre os resultados obtidos e não
permite, portanto, a determinação de qual molécula apresenta maior reatividade.
A análise das demais propriedades físico-químicas obtidas a partir dos valores
de energia de HOMO e de LUMO encontra-se descrita em conjunto com os resultados
obtidos na análise de QSPR dos nitrocompostos.
4.3.4.D Potencial eletrostático molecular – MEP
O potencial eletrostático molecular (molecular eletrostatic potential – MEP), é
propriedade eletrônica muito utilizada em estudos de relações quantitativas entre
estrutura química e a atividade biológica (Monastérios et al., 2005; Carvalho et al.,
2001). Ademais, a ilustração gráfica dos MEPs, obtida a partir de determinado cálculo
possibilita o entendimento de interações moleculares entre os sítios ricos e/ou pobres
em elétrons com o receptor biológico (Bhattachariee et al., 2000). Desse modo, os
MEPs de todos os nitrocompostos estudados foram obtidos por meio do cálculo de
energia de carga de ponto único e do método semi-empírico AM1. Os MEPs foram
determinados a partir dos confôrmeros de menor energia mínima obtidos na análise
conformacional. Os mapas de isosuperfíce de MEP em três dimensões sobrepostos à
densidade eletrônica total dos 5-nitro-heterocíclicos, obtidos são apresentados na
Figura 25.
FBT/FCF/USP 89
O perfil tridimensional dos MEPs das 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazidas é
similar ao obtido para os derivados 5-nitro-2-furfurilideno benzidrazidas. A Figura 25.1
A (visão frontal) e 25.1 B (visão posterior), demonstra que as porções da carbonila e
dos oxigênios do grupo nitro da molécula são ricos em elétrons, efeito observado em
coloração vermelha nas superfícies das moléculas. Os átomos de hidrogênio ligados
ao anel benzênico, juntamente com os nitrogênios presentes no grupo nitro e na
porção hidrazídica, apresentam distribuição eletrônica reduzida, efeito observado em
coloração azul nas superfícies moleculares ilustradas na Figura 25. Observa-se ainda
maior intensidade de coloração azul sobre o átomo de nitrogênio do grupo nitro ligado
ao anel heterocíclico de cinco membros. Esta diferença de intensidade de coloração
pode ser decorrente da presença do átomo de enxofre ou oxigênio, do anel
heterocíclico, nas vizinhanças do grupo nitro.
Figura 25. Mapas tridimensionais do potencial eletrostático calculado por AM1 para os
compostos 1) 5-nitro-2-tiofilidênico benzidrazidas [(S)OH] e 2) 5-nitro-2-
furfurilidênico benzidrazidas [(O)H], isossuperfície de 0,002 eV. Parte
superior: (A) visão frontal; Abaixo (B) visão posterior. Escala de cor nível
11: vermelha -65,00, verde cerca de -10,00 até azul 41,00 Kcal/mol.
Na comparação dos MEPs, observou-se diferença visual qualitativa na
coloração do anel heterocíclico dos compostos 5-nitro tiofilidenicos, Figura 25.1, e
dos5-nitro-2-furfurilidênicos, Figura 25.2. O átomo de enxofre apresenta exposição
gráfica de coloração azul, representando a ocorrência de região com distribuição
2A
1B
1A
2B
FBT/FCF/USP 90
eletrônica reduzida. Já o átomo de oxigênio do anel heterocíclico, isóstero ao anel
tiofilideno, apresenta coloração verde, indicando a ocorrência de região com
densidade eletrônica elevada, o que caracteriza forte efeito eletrônico. Esta diferença
ocorre devido ao maior raio atômico do átomo de enxofre, de menor eletronegatividade
em relação ao átomo de oxigênio, o que confere maior distância do par de elétrons
livres e, portanto, proporciona maior facilidade de doar o mesmo para a região do
grupo nitro, fortemente aceptora de elétrons.
A visão frontal das moléculas dos nitrocompostos indica que o efeito eletrônico
se transmite fracamente através da estrutura química. Assim, o efeito eletrônico, de
coloração verde intensa e clara apresenta valores de densidade de energia de cerca
de -8,00 e 0,12 Kcal/mol, respectivamente, se inicia no grupo nitro e se transmite até o
grupo carbonila da porção hidrazídica. O anel benzênico apresenta este mesmo efeito,
no entanto, a comunicação do anel de seis membros com a porção hidrazídica se
encontra fraca na visão frontal e ausente na visão posterior da mesma molécula.
A introdução dos grupos substituintes em posição para do anel benzênico,
átomo de carbono denominado C1, não produz modificações significativas dos valores
de densidade de potencial eletrostático. A maior coloração azul ou vermelha registrada
no grupo substituinte é devido à característica intrínseca do grupo ligado ao C1.
No contexto do estudo das propriedades estereoeletrônicas, a análise das
cargas atômicas, especificamente as derivadas do potencial eletrostático,
fundamentadas no cálculo de energia pontual definida ao redor das moléculas
(Cramer, 2002; Guadagnini et al., 1996; Chirlian & Fracl, 1987) são relevantes para o
conhecimento de qual região da molécula é mais reativa ou também qual seria
fundamental para o entendimento das interações fármaco-receptor. Desse modo, as
cargas do átomo do carbono substituído (C1), do anel benzênico (QC1), juntamente
com o carbono localizado no anel heterocíclico de cinco membros ligado ao grupo nitro
(QC14) foram determinadas para todos os compostos estudados. Os valores das cargas
calculados por AM1 encontram-se ilustrados na Tabela 8.
A partir da análise dos resultados obtidos para as cargas de potencial
eletrostático no átomo C14 pode-se constatar que não ocorreu variação grande entre
os valores calculados para todos os compostos estudados (de 0,04 a -0,28). É
possível observar, no entanto, a separação do grupo dos derivados 5-nitro-2-
tiofilidênicos (-0,24 a -0,28) e 5-nitro-2-tiofilidênicos (0,04 a -0,01), o que reflete a
ocorrência da eletronegatividade do heteroátomo ligado ao carbono testado. Para o
átomo C1, os valores calculados para os nitrocompostos demonstram diferença de -
0,17 a 0,62, o que reflete a presença de grupo aceptores ou doadores de elétrons
ligados ao anel benzênico. Esta variação habilita o emprego do valor numérico de
FBT/FCF/USP 91
carga deste átomo em estudos de relação estrutura-atividade antichagásica e pode ser
utilizada no planejamento de novos compostos e no entendimento das interações
biológicas entre o composto químico e sítios ativos que desencadeiam a atividade
antichagásica
Tabela 7. Valores de HOMO, de LUMO dos nitrocompostos obtidos com o método
AM1 e das propriedades eletrônicas calculadas a partir destes.
Nitrocompostos Propridades eletrônicas
HOMOa LUMOa b b AEb PIb
(S) H -9,42 -1,53 -3,94 5,47 1,53 9,42
(S) CH3 -9,38 -1,51 -3,93 5,45 1,51 9,38
(S) Cl -9,49 -1,59 -3,95 5,54 1,59 9,49
(S) F -9,50 -1,59 -3,93 5,55 1,59 9,50
(S) CF3 -9,63 -1,69 -4,01 5,66 1,69 9,63
(S) OCH3 -9,35 -1,50 -3,92 5,43 1,50 9,35
(S) OCH2CH3 -9,33 -1,49 -3,92 5,41 1,49 9,33(S) N(CH3)2 -8,81 -1,43 -3,68 5,12 1,43 8,81
(S) NH2 -9,08 -1,45 -3,81 5,27 1,45 9,08
(S) SO2NH2 -9,38 -1,68 -3,96 5,53 1,68 9,38
(S) OH -9,39 -1,53 -3,93 5,46 1,53 9,39
(S) CN -9,60 -1,67 -3,96 5,64 1,67 9,60
(O) H -9,41 -1,34 -4,03 5,38 1,34 9,41
(O) CH3 -9,38 -1,33 -4,02 5,35 1,33 9,38
(O) Cl -9,49 -1,41 -4,03 5,45 1,41 9,49
(O) F -9,49 -1,41 -4,03 5,45 1,41 9,49
(O) CF3 -9,62 -1,53 -4,04 5,58 1,53 9,62
(O) OCH3 -8,82 -1,32 -4,01 5,07 1,32 8,82
(O) OCH2CH3 -9,33 -1,31 -4,01 5,32 1,31 9,33
(O) N(CH3)2 -9,35 -1,32 -3,79 5,33 1,32 9,35
(O) NH2 -9,10 -1,26 -3,92 5,18 1,26 9,10
(O) SO2NH2 -9,60 -1,55 -4,02 5,57 1,55 9,60
(O) OH -9,39 -1,34 -4,02 5,36 1,34 9,39a HOMO e LUMO = eV. b Dureza (), potencial químico (), afinidade eletrônica (AE),
potencialde ionização (PI) = Kcal/mol.
FBT/FCF/USP 92
Tabela 8. Valores de energia de formação em vácuo e meio solvatado, momento de
dipolo e cargas de potencial eletrostático calculadas pelo método AM1.
a Hf vácuo e Hf hidratado = Kcal/mol.b momento dipolo = debye.
c Cargas de potencial eletrostático = eletrovolts (eV).
Nitrocompostos Hfvácuoa Hf hidratado
a MomentodipoloB QC1
c QC14c
(S) H 63,90 54,73 7,84 -0,02 -0,25
(S) CH3 56,01 47,15 8,32 0,28 -0,28
(S) Cl 57,49 48,40 6,53 0,04 -0,26
(S) F 19,25 11,27 6,20 0,40 -0,24
(S) CF3 -90,31 -98,08 4,22 0,46 -0,25
(S) OCH3 14,91 14,91 8,69 0,48 -0,24
(S) OCH2CH3 9,65 9,65 8,98 0,48 -0,25
(S) N(CH3)2 61,02 61,02 10,34 0,46 -0,25
(S) NH2 60,90 47,60 9,81 0,62 -0,24
(S) SO2NH2 -16,71 -25,45 6,55 -0,77 -0,26
(S) OH 50,16 4,89 8,32 0,47 -0,24
(S) CN 97,05 85,81 4,37 -0,14 -0,26
(O) H 50,16 41,34 8,99 -0,03 0,01
(O) CH3 42,25 33,70 9,39 0,20 0,00
(O) Cl 43,77 35,06 7,86 0,03 0,04
(O) F 5,53 -2,08 7,07 0,39 0,01
(O) CF3 -103,98 -111,23 6,04 -0,17 0,01
(O) OCH3 11,61 1,50 9,05 0,47 -0,01
(O) OCH2CH3 5,94 -3,76 9,19 -0,06 0,44
(O) N(CH3)2 57,47 47,51 11,02 0,46 0,00
(O) NH2 47,09 34,07 10,34 0,62 -0,01
(O) SO2NH2 -16,71 -38,65 5,19 -0,78 0,01
(O) OH 50,16 -8,49 8,44 0,47 0,00
FBT/FCF/USP 93
4.4 Descritor eletrônico de Hammett
Os valores dos descritores eletrônicos p e R dos nitrocompostos utilizados
nos estudos de QSPR e SAR (structure activiy-relationship) encontram-se ilustrados
na Tabela 9.
Os valores de E1/2, calculados por meio da equação 5, utilizados nos estudos
de QSPR, precisamente na análise de correlação Hammett-Zuman, encontram-se
ilustrados na Tabela 9.
4.5 Descritores de Hidrofobicidade
No estudo de QSPR optou-se por testar também a influência da
hidrofobicidade sobre o potencial de redução dos nitrocompostos obtido em meio
misto, uma vez que a formação do radical nitro ânion pode sofrer influência da mistura
de solvente aprótico e tampão PIPES. Os parâmetros utilizados nesta etapa do
trabalho foram a constante de de Hansch, característica para grupos substituintes, e
o coeficiente de partição, expresso pelo ClogP (calculado pelo ClogP Program 4.0,
CyberCop Co. - USA). Ressalta-se que os descritores de hidrofobicidade foram
empregados também nos estudos de relação estrutura-atividade antichagásica dos
nitrocompostos. Os valores dos descritores de hidrofobicidade e ClogP dos
nitrocompostos utilizados nos estudos de QSPR e SAR estão apresentados na
Tabela 9.
FBT/FCF/USP 94
Tabela 9. Valores dos descritores estruturais de caráter eletrônico, p e R, e
hidrofóbico, e Clog P, e do delta do potencial de meia onda, E1/2.
(X = S ou O)
Y p* R** * ClogP *** E1/2 (Map)+ E1/2 (Mm)+
(S) H 0,0 0,0 0,0 2,10 0,00 0,00
(S) CH3 -0,17 -0,13 0,56 2,60 -0,03 -0,02
(S) Cl 0,23 -0,24 0,71 -2,91 0,07 -0,02
(S) F 0,06 -0,46 0,14 2,34 0,00 0,00
(S) CF3 0,54 0,14 -0,02 3,15 -0,01 -0,01
(S) OCH3 -0,27 -0,54 -0,27 2,41 0,00 0,00
(S) OCH2CH3 -0,24 -0,52 0,38 2,93 0,00 -0,01
(S) N(CH3)2 -0,83 -0,89 0,39 2,67 0,00 0,00
(S) NH2 -0,66 -0,78 -1,30 1,55 0,01 -0,01
(S) SO2NH2 0,60 0,14 -1,82 0,98 - -0,01
(S) OH -0,37 -0,66 -0,67 2,15 - 0,00
(S) CN 0,54 0,14 0,57 1,76 - -0,06
(O) H 0,0 0,0 0,0 1,51 0,00 0,00
(O) CH3 -0,17 -0,13 0,56 2,01 0,00 0,01
(O) Cl 0,23 -0,24 0,71 2,42 0,00 -0,01
(O) F 0,06 -0,46 0,14 1,75 0,00 0,00
(O) CF3 0,54 0,14 -0,02 2,56 - -
(O) OCH3 -0,27 -0,54 -0,27 1,70 0,00 0.00
(O) OCH2CH3 -0,24 -0,52 0,38 2,02 0,01 0,02
(O) N(CH3)2 -0,83 -0,89 0,39 1,89 0,00 0,00
(O) NH2 -0,66 -0,78 -1,30 0,63 0,00 -0,01
(O) SO2NH2 0,60 0,14 -1,82 0,21 - 0,02
(O) OH -0,37 -0,66 -0,67 1,18 0,00 0,02
* Hansch & Leo, 1995.
** Valores calculados segundo fórmula (p - I = R).
*** Valores calculados segundo o ClogP Program 4.0, CyberCop Co., USA.+ Valor do delta do potencial meia onda obtido em meio prótico (Map) e misto (Mm) de reação.
XO
N N
NO2
Y
FBT/FCF/USP 95
4.6 Relações entre as propriedades físico-químicas e o potencial de redução ou
potencial de pico catódico dos nitrocompostos, QSPR
4.6.1 Análise de QSPR em meio aprótico
Neste estudo, o potencial de redução (Epc) e o potencial de meia onda (E1/2)
dos nitrocompostos foram escolhidos como variável dependente no decorrer da
análise de QSPR para determinar qual propriedade exerce influência sobre a redução
dos nitrocompostos.
Nesta etapa, os derivados 5-nitro-2-tiofilideno p-R-benzidrazidas e 5-nitro-
2-furfurilideno p-R-benzidrazidas, em que R = H, F, Cl, CH3, OCH3, OCH2CH3, CF3 e
N(CH3)2), em conjunto com a nifuroxazida foram escolhidos para a realização do
estudo de QSPR. Ressalta-se que a seleção dos grupos substituintes ocorreu,
inicialmente, por meio de seleção dos compostos com base no diagrama de Craig.
Esta escolha visou promover o estudo da influência do efeito eletrônico sobre o
potencial de redução dos nitrocompostos buscando não interferir na hidrofobicidade da
série de compostos relacionada.
Após a conclusão deste estudo, optou-se por aumentar o número de
compostos da série e avaliar, indiretamente, a influência da hidrofobicidade e da
polaridade sobre a redução dos nitrocompostos. Este procedimento, devido à
impossibilidade do emprego dos valores dos descritores de hidrofobicidade em meio
aprótico, foi realizado por meio da adição de dois análogos, a 5-nitro-2-tiofilideno
4-amino-benzidrazida, (S) NH2, e a 5-nitro-2-furfurilideno 4-amino-benzidrazida,
(O) NH2, que apresentam valores de hidrofobicidade bastante diferenciados dos
compostos da série originalmente relacionada. Deste modo, a inclusão dos
aminoderivados permitiu, no transcorrer do estudo de QSPR, a análise da influência
tanto do efeito eletrônico como da hidrofobicidade sobre o potencial de redução da
série de compostos.
Observou-se que os valores de Epc 1 e E1/2, determinados em meio aprótico,
Tabela 5, para todo o conjunto de nitrocompostos se encontram na faixa de potencial
de -0,67 V a -0,75 V e -0,58 V a -0,70 V, respectivamente. Ressalta-se que o derivado
5-nitro-2-furfurilideno 4-trifluorometila-benzidrazida, (O) CF3, apresentou perfil
voltamétrico atípico em comparação a todos os outros compostos estudados, com a
observação de picos em excesso no voltamograma. Desta forma, a análise deste
derivado não permitiu a determinação de E1/2 e apresentou valores Epc 1 distantes do
grupo dos furfurilidenos, e devido a estes fatos o composto foi excluído dos estudos de
QSPR. Em análise comparativa dos dados de Epc 1 e de E1/2, preliminar ao estudo de
FBT/FCF/USP 96
QSPR, sugere-se que não há influência da presença de grupos doadores ou
receptores de elétrons ligados ao anel benzênico sobre a redução dos nitrocompostos.
O primeiro passo da análise de QSPR envolveu a determinação da matriz de
intercorrelação entre os valores das propriedades físico-químicas utilizadas. Este
procedimento visou impedir a ocorrência de co-linearidade entre as propriedades
estudadas. Sem a execução deste procedimento, a análise poderia resultar em
obtenção de modelos matemáticos sem representatividade ao fenômeno analisado.
Neste aspecto, ressalta-se que quanto menor o coeficiente de intercorrelação
determinado menor são as chances de se obter co-linearidade entre os descritores
estruturais estudados (Cronin & Chultz, 2003; Kubinyi, 1993). No caso deste trabalho,
estipulou-se que as propriedades inseridas em conjunto em um mesmo modelo não
devem apresentar valores de coeficiente de intercorrelação superiores a 0,70. A matriz
de intercorrelação das propriedades físico-químicas encontra-se apresentada na
Tabela 10.
Através da análise de QSPR foram obtidos cerca de 270 modelos matemáticos
visando comprovar as relações quantitativas entre as diferentes propriedades físico-
químicas, relacionadas aos efeitos eletrônicos e estrutural das moléculas, e o Epc ou o
E1/2. A análise da redução dos nitrocompostos por meio de Epc envolveu a
investigação do emprego de uma, duas ou três propriedades.
O melhor modelo obtido sugere que o potencial de pico catódico (Epc 1) dos
nitrocompostos é influenciado pelo efeito de ressonância, expresso por, R, e da carga
de potencial eletrostático do carbono ligado ao grupo nitro (QC14). O modelo encontra-
se descrito na equação 27 e a correlação está representada na Figura 26.
FBT/FCF/USP 97
Figura 26. Influência da distribuição eletrônica, R, e da carga de potencial
eletrostático do carbono ligado ao grupo nitro (QC14) sobre o potencial de
pico catódico, Epc 1, de nitrocompostos em meio aprótico.
FBT/FCF/USP 98
Tabela 10. Matriz de intercorrelação dos descritores físico-químicos empregados nos estudos de QSPR/SAR
HOMO LUMO Eg VM MD AE PI p R Ehid QC1 QC14 Distintram.
HOMO 1 0,13 0,09 0,13 0,28 0,36 0,13 0,91 0,43 0,32 0,11 0,13 0,01 0,30 0,74
LUMO 1 0,35 0,01 0,00 0,60 1,0 0,21 0,35 0,22 0,10 0,03 0,65 0,1 0,56
Eg 1 0,07 0,14 0,21 0,03 0,11 0,14 0,04 0,86 0,10 0,02 0,07 0,12
VM 1 0,28 0,05 0,01 0,09 0,14 0,12 0,02 0,18 0,12 0,82 0,03
1 0,24 0,00 0,28 0,51 0,39 0,23 0,14 0,20 0,22 0,14
MD 1 0,60 0,44 0,81 0,44 0,39 0,08 0,10 0,18 0,65
AE 1 0,21 0,35 0,22 0,10 0,03 0,65 0,01 0,56
PI 1 0,53 0,39 0,12 0,20 0,00 0,25 0,87
p 1 0,72 0,25 0,31 0,01 0,25 0,61
R 1 0,08 0,51 0,01 0,24 0,43
Ehid 1 0,11 0,00 0,02 0,15
QC1 1 0,00 0,37 0,16
QC14 1 0,04 0,12
Distintram.
1 0,18
1
FBT/FCF/USP 99
Epc 1 = +0,03 (±0,02) R -0,20 (±0,03) QC14 -0,72 (±0,01) (Eq. 27)
(n=16; r=0,938; s=0,01; F=47,66; Q2=0,66; SPRESS=0,02)
Ainda de acordo com a equação 20, ressalta-se que esta foi determinada após
a retirada de dois derivados (S) Cl e (O) NH2 que se apresentam flagrantemente fora
da tendência de correlação (desvio com valor acima de 95%). Estes compostos se
apresentam como outliers, com comportamento atípico em relação a toda a série de
compostos estudada. Porquanto, estes foram retirados desta análise visando à
obtenção de nova correlação com melhor ajuste estatístico.
Outros modelos obtidos a partir da análise de QSPR apresentaram ajuste à
curva de regressão linear somente quando foram retirados três outliers da série de
derivados estudados (desvio com valor acima de 95%), sendo os mesmos
anteriormente citados em conjunto com o (O) OH. Os parâmetros estatísticos
calculados e o número de descritores inserido nos cinco modelos obtidos para
expressar a depndência de Epc e cinco para E1/2 apresentam-se descritos na Tabela
11.
A partir de análise detalhada dos modelos de correlação obtidos para toda a
série de compostos concluiu-se que não há influência significativa dos descritores
relacionados ao efeito eletrônico dos grupos substituintes e as propriedades
estruturais sobre Epc 1 e E1/2 dos nitrocompostos. A apreciação dos parâmetros
estatísticos dos modelos, como o desvio padrão da equação [ou coeficiente de
regressão] (s) e o teste de significância de Fischer (F); dos parâmetros de validação
cruzada, como o coeficiente de correlação cruzada [ou análise dos quadrados parciais]
(Q2) e o desvio padrão de validação cruzada (Spress); em conjunto com a análise dos
resíduos de correlação, comprovaram a ausência de modelos matemáticos
significativos.
FBT/FCF/USP 100
Tabela 11. Modelos correlacionais, parâmetros estatísticos, número de compostos
das dez melhores correlações que expressam a dependência de Epc 1 e
E1/2, determinados em meio aprótico, de descritores estruturais.
Modelos Parâmetros estatísticos da correlação
Epc 1 = MD QC14 n=15; r=0,946; s=0,01; F=50,93; Q2=0,59; SPRESS=0,02.
Epc 1 = QC1 QC14 n=15; r=0,943; s=0,01; F=48,49; Q2=0,53; SPRESS=0,02
Epc 1 = Lumo PI n=15; r=0,933; s=0,01; F=40,19; Q2=0,51; SPRESS =0,02
Epc 1 = Homo PI n=15; r=0,933; s=0,01; F=40,19; Q2=0,51; SPRESS =0,02
Epc 1 = AE n=15; r=0,933; s=0,01; F=40,27; Q2=0,51; SPRESS =0,02
E1/2 = Lumo MD n=16; r=0,96; s=0,01; F=79,85; Q2=0,47; SPRESS =0,02
E1/2 = MD AE n=16; r=0.962; s=0.01; F=79.84; Q2=0.47; SPRESS=0.02
E1/2 = AE n=16; r=0.952; s=0.011; F=62.46; Q2=0.49; SPRESS =0.02
E1/2 = Lumo n=15; r=0,907; s=0,01; F=60,32; Q2=0,46; SPRESS =0,02
E1/2 = Lumo P n=15; r=0,959; s=0,01; F=60,32; Q2=0,41; SPRESS =0,03
Foram avaliados, também, os gráficos que buscam expressar a ocorrência de
linearidade entre os valores dos resíduos de correlação e os valores de Epc 1 e E1/2.
Ressalta-se que um modelo, robusto e com alto valor preditivo, deve apresentar
linearidade entre os valores de descritores, obtidos experimentalmente e, também, por
meio de predição, e os resíduos de correlação (He & Jurs, 2005; Eriksson et al., 2003;
Kubinyi, 1993). As Figuras 27 e 28 ilustram os gráficos, obtidos a partir da equação 27,
que permitiram analisar a ocorrência de linearidade entre os valores dos resíduos de
correlação e os valores determinados e preditos de Epc 1 dos nitrocompostos. Os
gráficos demonstraram a ampla dispersão dos derivados, o que confirma a ausência
de linearidade. Este fato indica que a equação obtida não apresenta robustez e não é
estatisticamente válida. A análise de resíduos de todos os modelos calculados permitiu
observar que a ausência de co-linearidade é uma característica de todas as equações
obtidas. Devido ao presente cenário verifica-se que os modelos não apresentam
validade estatística e, portanto, são considerados como artefatos matemáticos.
FBT/FCF/USP 101
Figura 27. Resíduo de correlação obtido a partir da equação 27 vs potencial de pico
catódico (Epc 1) determinado experimentalmente.
Figura 28. Resíduo da correlação obtido a partir da equação 27 vs potencial de pico
catódico (Epc 1) predito no modelo.
FBT/FCF/USP 102
A partir destes resultados, optou-se pela separação dos derivados tiofilidênicos e
furfurilidênicos em dois grupos distintos, com a finalidade de obtenção de subsídios
que permitam a compreensão do comportamento de formação do radical nitro ânion
gerado eletroquimicamente em meio aprótico.
Foi observado que os valores de Epc 1 e E1/2 determinados em meio aprótico
(Tabela 5), para o conjunto das 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazidas, se encontram na
faixa de potencial de - 0,67 V a - 0,75 V e - 0,58 V a - 0,70 V, respectivamente. Já os
valores de Epc 1 e E1/2, determinados em meio aprótico (Tabela 5), para o conjunto
dos 5-nitro-2-furfurilideno benzidrazidas se encontram na faixa de potencial de - 0,69 V
a - 0,75 V e - 0,68 V a - 0,70 V, respectivamente.
A partir da análise preliminar dos valores de Epc 1 e E1/2, da mesma maneira
como observado para todo o conjunto dos nitrocompostos, é possível sugerir que não
há influência da presença de grupos doadores ou receptores de elétrons ligados ao
anel benzênico sobre a redução dos nitrocompostos. Em análise do conjunto de dados
de E1/2 verifica-se que o derivado (S) Cl, do grupo dos tiofilidênicos, apresenta valor de
- 0,70 V, diferente aos demais compostos presentes no mesmo grupo. Quando retira-
se este derivado da série de compostos observa-se a diferença dos valores de E1/2
existente entre o grupo dos 5-nitro-2-tiofilidenos, - 0,58 a 0,64 V, e dos 5-nitro-
2-furfurilidenos, - 0,68 V a - 0,70 V. Deste modo, a caracterização de diferença entre
os dois grupos de nitrocompostos sugere que a formação do par redox Ar-NO2/Ar-
NO2-, a partir dos tiofilidênicos, em contraste aos furfurilidênicos, encontra-se facilitada
em meio aprótico de reação.
A análise dos modelos matemáticos calculados durante a análise de QSPR
confirmou a ausência de influência significativa de todas as propriedades físico-
químicas estudadas sobre Epc 1 e E1/2 obtidos a partir dos compostos 5-nitro-
2-tiofilideno benzidrazidas ou 5-nitro-2-furfulideno benzidrazidas. Estes resultados
foram confirmados através da análise dos parâmetros estatísticos e da análise de
resíduo de correlação.
Adicionalmente a estes estudos, foi utilizada a equação de Hammett-Zumam
que pode ser definida como uma aproximação matemática da aplicação da equação
de Hammett ao estudo de parâmetros obtidos a partir de técnicas eletroquímicas. Os
resultados obtidos com o emprego desta equação (E1/2), descritos na Tabela 8,
corroboram a ausência de correlação entre as propriedades físico-químicas.
Observou-se também a influência inexpressiva da presença de grupos doadores ou
aceptores de elétrons ligados ao anel benzênico sobre a redução dos nitrocompostos.
A inserção dos derivados amino substituídos em posição para no anel benzênico, (S)
NH2 e (O) NH2, não interferiu em nenhum dos resultados obtidos, o que sugere que a
FBT/FCF/USP 103
hidrofobicidade também não exerce efeito sobre os descritores eletroquímicos
estudados em meio aprótico de reação.
Após execução da análise de regressão linear múltipla nos estudos de QSPR,
partiu-se para a aplicação de quimiometria, através da metodologia de regressão por
PLS, a fim de investigar de forma detalhada a hipótese de influência das propriedades
físico-químicas sobre a redução dos nitrocompostos. Desse modo, a análise de PLS
foi realizada para o mesmo conjunto de nitrocompostos utilizado na investigação das
análises de QSPR em meio aprótico.
A partir do emprego de PLS foram construídos 10 modelos matemáticos com
todas as propriedades físico-químicas estudadas. Neste processo, avaliou-se a
validação interna e a capacidade preditiva dos modelos por meio da aplicação do
método de validação cruzada intitulado “leave-one-out” (Ferreira, 2002; Kubinyi, 2003).
Ressalta-se que os modelos obtidos com o emprego de PLS são também chamados
de variáveis latentes ou componentes, e são obtidos por meio de combinação linear
das variáveis independentes da correlação, neste caso dos descritores estruturais
estudados (Ferreira, 2002; Ferreira et al., 2002; Kubinyi, 1993).
O melhor resultado determinado foi obtido para a somatória dos 10
componentes, onde observou-se a variância acumulada de 99,7%. Isto significa que a
somatória destes componentes pode explicar quase 100% da influência das
propriedades físico-químicas sobre Epc 1. Os outros parâmetros estatísticos de
regressão obtidos foram coeficiente de correlação de 0,91, desvio padrão da
correlação de 0,001 e o desvio padrão da validação cruzada (Spress) de 0,14.
A Figura 29 demonstra a ocorrência de correlação obtida para a somatória dos
dez componentes em conjunto com a correlação obtida através de validação cruzada.
Observa-se que poucos valores de Epc 1 obtidos experimentalmente (pontos em
forma de círculo) encontram-se em concordância com os valores Epc 1 estimados
(quadrados vermelhos). Estes resultados sugerem a ocorrência de modelos instáveis e
de pouco valor preditivo.
A Figura 30 ilustra o gráfico de análise de PLS para seleção de modelos
obtidos na correlação. O gráfico da Figura 30 é utilizado para comparar os valores dos
coeficientes de correlação de regressão do modelo calculado com os modelos obtidos
a partir do mecanismo de validação cruzada. Quanto mais próximo estiverem os
valores de R2 dos modelos calculado e de validação cruzada maior é o poder preditivo.
Adicionalmente, o emprego de número excessivo de componentes utilizados para a
formulação de um modelo, de dez no caso desta análise, pode resultar em situação de
super-ajuste estatístico (Peralta-Zamora et al., 2005) e, portanto não se recomenda a
FBT/FCF/USP 104
sua utilização. Diante do exposto, a partir da análise das Figuras 29 e 30, sugere-se
que o modelo obtido não apresenta validade estatística.
Figura 29. Relação entre os valores de Epc 1 determinados e predito pelo modelo.
Figura 30. Relação entre o erro de predição e o número de componentes do modelo.
Relação de resposta - PLS
Relação da raiz quadrada do erro de prediçãocom o número de componentes do modelo
FBT/FCF/USP 105
A análise de PLS frente ao descritor eletroquímico E1/2 e as propriedades físico-
químicas escolhidas para a investigação de QSPR não resultou em obtenção de
correlação estatisticamente válida.
Do mesmo modo como procedido durante a aplicação da análise de QSPR
inicial, os grupos dos nitro-tiofilidênicos e dos nitro-furfurilidênicos foram analisados
separadamente por meio do emprego de PLS. Os resultados obtidos nesta análise,
que envolveu o Epc ou E1/2, foram similares aos registrados para o grupo que envolveu
o conjunto de todos os nitrocompostos estudados.
Os resultados obtidos permitem observar que a redução dos nitrocompostos em
reação envolvendo um elétron, expressa por meio de Epc 1 ou E1/2, em meio aprótico
não sofre influência dos descritores estruturais estudados. Ademais, a redução dos
nitrocompostos pode sofrer influência de outras propriedades físico-químicas
peculiares desta série de compostos e não estudadas neste trabalho.
4.6.2 Análise de QSPR em meio misto
Nesta etapa, o potencial de pico catódico (Epc 1) e o potencial de redução
(E1/2) dos nitrocompostos foram novamente escolhidos como variável dependente no
decorrer da análise de QSPR. Este estudo visou determinar a ocorrência de
correlação e qual propriedade exerceu influência sobre a redução dos nitrocompostos
em meio misto de reação.
Nesta etapa, os derivados 5-nitro-2-tiofilideno 4-R-benzidrazidas, em que
R = H, F, Cl, CH3, OCH3, OCH2CH3, CF3, CN, SO2NH2, OH e N(CH3)2), e 5-nitro-
2-furfulideno 4-R-benzidrazidas, em que R = H, F, Cl, CH3, OCH3, OCH2CH3, SO2NH2,
OH e N(CH3)2, foram escolhidos para a realização do estudo de QSPR. Ressalta-se
que a seleção dos grupos substituintes ocorreu de acordo com sua dispersão nos
quatro quadrantes do diagrama de Craig. O grupo de compostos escolhidos permitiu a
investigação da influência do efeito eletrônico e hidrofóbico, expressos por de
Hammett e de Hansch, dos grupos substituintes sobre a redução dos nitrocompostos
em meio misto de reação. Todas as propriedades utilizadas no estudo de QSPR em
meio aprótico foram adicionadas a esta etapa do trabalho.
A partir dos resultados do emprego da VOQ, observou-se que os valores de
Epc 1 e E1/2 determinados em meio misto (Tabela 5), para todo o conjunto dos
nitrocompostos se encontram na faixa de potencial de - 0,43 V a - 0,49 V e - 0,40 V a
- 0,48 V, respectivamente. Em análise preliminar dos dados de Epc 1 e E1/2 é possível
sugerir que não há influência da presença de grupos substituintes, doadores ou
FBT/FCF/USP 106
receptores de elétrons, ligados ao anel benzênico sobre a redução dos
nitrocompostos.
Observou-se que os valores de Epc e E1/2, determinados em meio misto
(Tabela 5), para o conjunto dos 5-nitro 2-tiofilideno benzidrazidas se encontram na
faixa de potencial de - 0,46 V a - 0,49 V e - 0,42 V a - 0,47 V, respectivamente. Já os
valores de Epc e E1/2, determinados em meio misto (Tabela 5), para o conjunto dos
5-nitro 2-furfurilideno benzidrazidas se encontram na faixa de potencial de - 0,43 V a
- 0,49 V e - 0,40 V a - 0,48 V, respectivamente. A partir da análise destes dados
observou-se que os valores de Epc 1 e de E1/2 dos derivados tiofilidênicos e derivados
furfurilidênicos se encontram agrupados em uma mesma faixa de potencial, resultando
na ocorrência de grupo homogêneo de compostos.
Através da análise de QSPR foram obtidos cerca de 290 modelos
matemáticos, envolvendo equações lineares, parabólicas e bilineares, visando
identificar a influência de diferentes propriedades físico-químicas, de efeito eletrônico e
estrutural, sobre o Epc 1 ou o E1/2. As análises envolveram inicialmente o conjunto dos
nitrocompostos e, logo após a conclusão desta, avaliou-se os derivados tiofilidênicos e
furfulidênicos separadamente.
Os modelos parabólico e bilinear foram inseridos nesta etapa do experimento
com a finalidade de estudar a influência da hidrofobicidade sobre o processo de
redução do grupo nitro em meio misto. Estes modelos, expressos originalmente para
processos biológicos, foram extraídos da Análise de Hansch visando promover um
estudo preliminar da dependência não linear da lipofilicidade sobre o processo
eletródico envolvido na redução dos nitrocompostos, que pode ser difusivo ou
adsortivo. Ressalta-se que este passo é importante devido a possibilidade de
interferência desta propriedade no processo de difusão dos nitrocompostos do
conjunto da solução para a interface do eletrodo de trabalho (Bard & Falkner, 1980),
influenciando assim, a redução dos nitrocompostos e os valores de Epc 1 e E1/2
obtidos. Destaca-se, ainda, que as determinações foram realizadas por voltametria de
onda quadrada em meio misto de DMSO/solução tampão PIPES 50% v/v.
A análise de QSPR que envolveu Epc ou E1/2 possibilitou a obtenção de vários
modelos matemáticos que apresentaram ajuste à curva de regressão. Por outro lado,
quando foi analisado o coeficiente de correlação da regressão (r) verificou-se que
nenhum dos modelos obtidos apresentou valor deste superior a 0,90. Este fato indica
que os modelos obtidos não podem ser utilizados para confirmar a ocorrência de
correlação entre as propriedades físico-químicas e Epc 1 ou E1/2. Os outros
parâmetros estatísticos destas equações, caracterizados pelos valores baixos de Q2 e
de Spress, juntamente a análise dos gráficos dos resíduos evidenciam a ausência de
FBT/FCF/USP 107
significância estatística em todas as correlações testadas. Este efeito, já observado
para os resultados obtidos a partir da análise de QSPR em meio aprótico de reação,
demonstra que o potencial de redução ou mesmo o potencial de meia onda não
sofrem influência dos descritores físico-químicos estudados.
Observou-se também que a inserção dos descritores de hidrofobicidade e a
aplicação de modelos parabólicos e bilineares não resultou em ocorrência de
correlações significativas. A ausência de modelos que fundamentam a hipótese da
influência da hidrofobicidade sobre Epc 1 ou E1/2 pode ser devido à ocorrência de
processo adsortivo na superfície do eletrodo de carbono vítreo, o que impede a
identificação da difusão dos compostos da solução para o eletrodo.
A etapa subseqüente da análise de QSPR envolveu a utilização da equação de
Hammett-Zumam. Os resultados obtidos com o emprego desta equação (E1/2),
descritos na Tabela 9, confirmaram a ausência de correlação entre as propriedades
físico-químicas e a redução dos nitrocompostos. Não observou-se influência da
presença de grupos substituintes, doadores ou aceptores de elétrons, ligados ao anel
benzênico sobre a redução dos nitrocompostos.
Os testes subseqüentes do estudo de QSPR em meio misto envolveram a
utilização de PLS. A partir do emprego desta metodologia e do descritor Epc foram
construídos 10 modelos matemáticos com todas as propriedades físico-químicas
estudadas. Nesta análise determinou-se que a primeira componente da série obtida foi
considerada ótimo, Figura 31, ou seja, apresentou a menor distância entre os valores
de R2 da correlação e do resíduo obtido com o emprego de validação cruzada.
Ademais, este modelo foi considerado o melhor entre os 10 obtidos por este
apresentar o maior valor de variância, de 40,12%. Em contrapartida, esta componente
apresentou valores de coeficientes de correlação do modelo e de predição de 0,25 e
0,00, respectivamente, o que corroborou a ausência de significância estatística da
correlação obtida.
A análise de PLS frente ao descritor eletroquímico E1/2 em conjunto com as
propriedades estruturais utilizados para a investigação de QSPR em meio misto de
reação, como observado para Epc 1, não apresentou nenhuma correlação
estatisticamente válida.
Do mesmo modo, os grupos dos derivados nitro-tiofilidênicos e derivados nitro-
furfurilidênicos foram analisados separadamente por meio do emprego de PLS. Os
resultados obtidos nestas análises, que envolveram o Epc 1 e E1/2, foram similares aos
registrados para o grupo que envolveu todos os nitrocompostos estudados.
Os resultados obtidos permitiram observar que a redução dos nitrocompostos
em reação envolvendo um elétron, expressa por meio dos descritores Epc 1 e E1/2, em
FBT/FCF/USP 108
meio misto não sofre influência dos descritores físico-químicos estudados. Além
disso, supõe-se que a redução dos nitrocompostos pode sofrer influência de outras
propriedades físico-químicas não estudadas neste trabalho.
Figura 31. Relação entre o erro de predição e o número de componentes do modelo.
4.6.3 Análise de QSPR em meio aquoso
A análise dos potenciais de redução dos 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazidas em
reação envolvendo um elétron (Eq. 21) indica similaridade entre todos os valores dos
compostos estudados. A análise voltamétrica dos 5-nitro-furfurilidênicos, por outro
lado, não possibilitou a determinação do radical nitro ânion, sendo observada somente
a reação de formação da hidroxilamina a partir dos nitrocompostos. A similaridade dos
valores de Epc para os derivados 5-nitro-2-tiofilidênicos combinado à ausência de
resposta voltamétrica para os 5-nitro-2-furfurilidênicos impediu a ocorrência da análise
de QSPR destes compostos em meio aquoso de reação e pH neutro.
4.6.4 Considerações parciais da análise de QSPR
A partir do diagnóstico do conjunto dos resultados obtidos com a aplicação da
metodologia de QSPR, sugere-se que o potencial de redução e o potencial de meia
onda não sofrem influência significativa de todas as propriedades físico-químicas
Relação da raiz quadrada do erro depredição com o número de componentes
FBT/FCF/USP 109
utilizadas neste trabalho. Além disso, a presença de grupos substituíntes diferentes
ligados ao anel benzênico não é fator que interfere no processo de redução dos
nitrocompostos. Este fato decorre, provavelmente, da quebra do efeito co-planar da
estrutura dos nitrocompostos, o que resulta em transmissão reduzida do efeito
mesomérico conjugado através da molécula, precisamente dos grupos substituintes
até o grupo nitro ligado ao anel heterocíclico. A quebra de efeito co-planar foi
confirmada por meio da análise conformacional, Figura 20, e a transmissão reduzida
de efeito mesomérico pode ser observada nos mapas de densidade de potencial
eletrostático dos nitrocompostos, Figura 25.
4.7 Ensaios de atividade frente ao Trypanosoma cruzi
Os ensaios de suscetibilidade antichagásica foram realizados in vitro, para os
compostos 5-nitro-2-tiofilideno 4-R-benzidrazidas, em que R = H, CF3, OCH3, Cl,
SO2NH2, N(CH3)2, e 5-nitro-2-furfurildeno 4-R-benzidrazidas, em que R = H, Cl, em
concentrações de 1,0, 10,0 e 20,0 g mL-1. Estes ensaios foram realizados também
para o benznidazol, único fármaco utilizado para o tratamento da doença de Chagas
no Brasil, e escolhido como referência nestes experimentos.
Foram adicionados nesta análise os resultados da atividade frente ao
Trypanosoma cruzi dos derivados 5-nitro-2-tiofilideno 4-ciano-benzidrazida e 5-nitro-2-
tiofilideno 4-hidroxi-benzidrazida realizados por Márcia Maria Lima Dias e disponíveis
em sua dissertação de mestrado (Dias, 2005) mediante autorização dos autores. Estes
resultados foram obtidos por meio do emprego da mesma metodologia e mesma cepa
do Tripanossoma cruzi utilizadas nos ensaios acima mencionados.
A escolha das concentrações utilizadas neste trabalho foi dependente da
solubilidade dos nitrocompostos em meio de cultura LIT. Os compostos foram
dissolvidos em DMSO e misturados ao meio LIT até atingir as concentrações
desejadas do composto estudado bem como a concentração de 1,0% de DMSO.
Observou-se que a presença do solvente na referida concentração não interfere nos
resultados obtidos nos ensaios biológicos Ressalta-se que os dados referentes ao
DMSO se apresentam em concordância os resultados obtidos por Tavares e Dias
(Dias, 2005). O aumento das concentrações dos nitrocompostos para valores acima
de 20,0 g mL-1 em solução de meio LIT e DMSO, 1,0%, resultou em precipitação dos
compostos estudados.
Nestes ensaios, investigou-se a atividade antichagásica dos nitrocompostos
por meio da supressão do crescimento da forma epimastigota da cepa Y do
FBT/FCF/USP 110
Trypanosoma cruzi em meio LIT axênico. Elegeu-se este ensaio devido ao uso de
forma parasitária com reduzida capacidade infectante, o que promove maior
segurança aos executores do ensaio. Somam-se a este fato, relatos que indicam a
presença da forma epimastigota do tripanossoma em células de mamíferos (Arán et
al., 2005; Tyler e Engman, 2001; Faucher et. al., 1999; Almeida de Faria et al., 1999),
que tornam o emprego desta forma do parasita uma ferramenta importante para a
avaliação preliminar do efeito anti-proliferativo de cadidatos a agentes antichagásicos.
Os resultados do efeito anti-proliferativo do Trypanosoma cruzi causado pelos
nitrocompostos, expressos por meio de porcentagem de crescimento das parasitas
viáveis em 24 horas, encontram-se descritos nas Tabelas 12 e 13.
Observou-se que não ocorreu crescimento do Trypanosoma cruzi incubado
com nitrocompostos em meio LIT quando o número de parasitas viáveis observados,
em 24 horas, foi igual ou menor que ao valor obtido no tempo inicial (0 horas).
Em investigação inicial, observou-se que a solução controle, que contém os
parasitas incubados em meio LIT e 1,0% de DMSO, com 24 horas, apresentou
crescimento parasitário de cerca de 40%.
Os derivados 5-nitro-2-tiofilideno 4-R-benzidrazidas para-substituídas, R = Cl,
CF3, OCH3, e 5-nitro-2-fufurilidenos 4-R-benzidrazidas para-substituídas, R = H e Cl,
testados apresentaram 100% de inibição de proliferação parasitária nas concentrações
de 10,0 e 20 g mL-1. O composto 5-nitro-2-tiofilideno 4-dimetilamino-benzidrazida,
(S) N(CH3)2, apresentou 100% de inibição de crescimento das formas epimastigotas
na concentração de 20 g mL-1. Estes derivados apresentaram melhor habilidade de
inibir a proliferação do parasita em comparação ao benznidazol, utilizado como
composto de referência, o que evidencia a atividade antichagásica promissora destes
compostos.
FBT/FCF/USP 111
Tabela 12. Atividade frente a cepas Y de Trypanosoma cruzi dos derivados 5-nitro-
2-tiofilideno benzidrazidas determinado pelo método de inibição de
proliferação parasitária.
Nitrocompostos Concentração* O h** 24 h** CP***Atividade
antichagásica
(S) H 1,0 21,4 24,2 13,0 (-)
10,0 15,7 24,7 57,3 (-)
20,0 29,8 29,7 0,0 (-)
(S) Cl 1,0 29,2 30,3 4,0 (-)
10,0 38,3 30,3 0,0 (+)
20,0 45,0 7,0 0,0 (+)
(S) CF3 1,0 48,5 62,3 28,4 (-)
10,0 45,7 5,7 0,0 (+)
20,0 37,0 2,0 0,0 (+)
(S) OCH3 1,0 24,0 49,0 100,0 (-)
10,0 40,7 34,3 0,0 (+)
20,0 35,3 34,0 0,0 (-)
(S) N(CH3)2 1,0 32,3 35,3 10,0 (-)
10,0 28,3 40,6 43,6 (-)
20,0 40,0 31,2 0,0 (+)
(S) SO2NH2 1,0 22,0 25,6 16,0 (-)
10,0 24,1 28,49 18,2 (-)
20,0 35,7 42,5 19,0 (-)
(S) CN**** 10,0 22,5 15,5 0,0 (+)
(S) OH**** 10,0 20,7 32,3 56,6 (-)
Controle (DMSO) - 35,8 50,7 41,7 -
* Concentração em g mL-1 utilizada nos ensaios;** Leituras do número de parasitas viáveis (106) realizadas em triplicata;*** Crescimento parasitário (%);**** Retirado de Dias, 2005, com autorização dos autores.
FBT/FCF/USP 112
Tabela 13. Atividade frente a cepas Y de Trypanosoma cruzi dos derivados 5-nitro-
2-furfurilideno benzidrazidas e do composto de referência benznidazol
determinado pelo método de inibição de proliferação parasitária.
* Concentração em g mL-1 utilizada nos ensaios;** Leituras do número de parasitas viáveis (106) realizadas em triplicata;*** Crescimento parasitário (%).
4.7.1 Estudo das relações estrutura-atividade
Estipulou-se como composto com atividade frente ao Trypanosoma cruzi (+),
aqueles que apresentaram valores das leituras dos números de parasitas viáveis, em
24 horas, menor que os valores obtidos no tempo zero de ensaio (Tabelas 11 e 12).
Neste contexto, observou-se que a 5-nitro-2-tiofilideno 4-trifluoro-benzidrazida, (S)
CF3, em concentração de 20,0 g mL-1 foi o composto mais ativo do conjunto de
compostos avaliados.
Em estudo de SAR verificou-se que o potencial de redução e o potencial de
pico catódico, determinados nos meios aprótico, misto e prótico, para os compostos
considerados com atividade antichagásica não apresentam influência sobre a
bioatividade analisada. Por outro lado, a partir da comparação entre os valores de
porcentagem de crescimento parasitário em presença de 1,0 g mL-1 dos compostos
5-nitro-2-furfurilideno benzidrazida, (O) H, e 5-nitro-2-furfurilideno 4-cloro-benzidrazida,
(O) Cl, com os compostos 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazida, (S) H, e 5-nitro-
Nitrocompostos Concentração* O h** 24 h** CP***Atividade
antichagásica
(O) H 1,0 44,9 43,6 0,0 (-)
10,0 31,7 31,0 0,0 (-)
20,0 38,0 25,6 0,0 (+)
(O) Cl 1,0 48,3 44,0 0,0 (+)
10,0 30,3 30,0 0,0 (+)
20,0 48,0 24,3 0,0 (+)
benznidazol - - - - -
10,0 35,0 50,0 30,0 (-)
20,0 44,3 45,7 3,0 (-)
Controle (DMSO) - 35,76 50,66 41,66 -
FBT/FCF/USP 113
2-tiofilideno 4-cloro-benzidrazida, (S) Cl, sugeriu-se que a série dos derivados
furfulidênicos é mais ativa que a série dos derivados tiofilidênicos. Os resultados
obtidos a partir desta avaliação, no entanto, não são conclusivos e devem ser
confirmados, por meio de protocolos diferentes, em análises subseqüentes.
4.7.2 Considerações da análise da atividade antichagásica dos nitrocompostos
É conhecido que a enzima tripanotiona redutase reduz o substrato oxidado da
tripanotiona (SH) em tripanotiona dissulfeto em potenciais de redução aproximados de
- 0,24 V (Krauth-Siegel et al., 2005, Fairlamb & Cerami, 1992). De acordo com os
valores dos potenciais de redução obtidos em meio aquoso de reação, - 0,33 V,
sugere-se que o radical nitro ânion não é o principal agente responsável pela inibição
complexo tripanotiona-tripanotiona redutase.
De acordo com o mecanismo de ação dos nitrocompostos proposto por Viodé
et al., 1998, e sugerido para o nifurtimox (Maia et al., 2003), o radical nitro ânion
formado a partir da redução do grupo nitro reage com o oxigênio formando superóxido,
o qual é responsável por inibir a enzima tripanotiona redutase (Blumenstiel et al.,
1999) e promover a oxidação do substrato tripanotiona reduzido (Krauth-Siegel et al.,
2005, Viodé et al., 1998).
Nesta linha de raciocínio, aliado a constatação preliminar de que Epc dos
nitrocompostos determinados em meio prótico de reação não apresentam diferença
entre os valores obtidos, sugere-se que estes não demonstram efeito expressivo sobre
a atividade antichagásica. Este fato, combinado à ausência de influência aparente de
Epc 1 e E1/2, determinados em meios misto e aprótico, sobre a atividade biológica,
fornece suporte para questionamentos sobre a relevância do emprego destes
parâmetros no estudo de QSAR.
FBT/FCF/USP 115
Os procedimentos voltamétricos descritos são adequados para a avaliação do
potencial de redução dos nitrocompostos em diferentes meios de reação. Estas
metodologias podem, também, ser utilizados para a determinação de
parâmetros físico-químicos e no desenvolvimento de metodologia analítica a
ser empregada na determinação dos compostos utilizados neste trabalho.
Os procedimentos voltamétricos efetuados em meio aprótico de reação
forneceram dados que podem ser comparados com valores obtidos em meio
misto (DMSO/solução tampão PIPES) e o meio aquoso (solução tampão
PIPES), o que pode resultar em considerações importantes sobre a reatividade
molécular dos nitrocompostos. Os valores de E1/2 dos derivados 5-nitro-
2-tiofilideno benzidrazidas se encontram em potenciais menores que as 5-nitro-
2-furfurilideno benzidrazidas, o que representa maior reatividade (ou
estabilidade) dos 5-nitro-2-furfurilidênicos neste meio de reação.
Os resultados obtidos em meio misto permitem observar que não existe
diferença entre os valores de Epc 1 e E1/2 dos grupos 5-nitro-2-furfurilideno
benzidrazidas e 5-nitro-2-tiofilideno benzidrazidas.
Os estudos de QSPR demonstraram a ausência de correlação das
propriedades físico-químicas e o processo de redução dos nitrocompostos, em
reação envolvendo um elétron, em todas as condições estudadas,
Os estudos de modelagem molecular dos nitrocompostos, utilizando as
metodologias de análise conformacional e análise de mapas de potencial
eletrostático, permitiram a elucidação de características estruturais e
eletrônicas moleculares. Observou-se a quebra do efeito co-planar estrutural
entre as porções benzeno substiuida e a 5-nitro-2-heterocíclo hidrazídica. Esta
característica favorece a redução, ou mesmo o bloqueio, da transmissão do
efeito conjugado através da molécula.
FBT/FCF/USP 116
Os resultados preliminares obtidos a partir dos ensaios antichagásicos
necessitam de estudos subseqüentes visando a sua confirmação. Em análise
prévia, contudo, observou-se que os derivados 5-nitro-2-furfurilideno
4-benzidrazida, (O) H, e 5-nitro-2-furfurilideno 4-cloro-benzidrazida, (O) Cl,
apresentaram maior atividade frente à forma epimastigota da cepa Y do
Trypanosoma cruzi em comparação aos isósteros 5-nitro-2-tiofilideno
benzidrazidas, quando incubados em concentração de 1,0 g mL-1.
FBT/FCF/USP 118
Aperfeiçoamento de procedimento voltamétrico com a finalidade de
desenvolvimento de metodologia analítica para a identificação e quantificação
dos nitrocompostos estudados;
Avaliação da atividade antichagásica com o emprego dos valores de inibição
de concentração em 50% (IC50);
Emprego de método espectrofotométrico para a leitura do número de parasitas
viáveis incubados em meio LIT;
Promover o estudo de QSPR e QSAR em três dimensões com o objetivo de
avaliar sob novas perspectivas as interações entre o radical nitro ânion, as
propriedades físico-químicas dos nitrocompostos e a atividade antichagásica.
Neste contexto, sugere-se o emprego das abordagens presentes nos softwares
Volsurf, CoMFA e CoMSIA;
Avaliar a hipótese que indica à ocorrência de interação dos nitrocompostos a
enzima cruzipaína, e a sua inibição subseqüente, a qual seria responsável pela
atividade antichagásica apresentada pelos derivados estudados neste trabalho.
Sugere-se que proposição pode ser avaliada por meio do emprego de ensaio
de inibição enzimática e a aplicação da ferramenta computacional de “docking”
molecular.
FBT/FCF/USP 120
ABREU, F. C., FERRAZ, P. A. L., GOULART, M. O. F., Some Applications ofEletrochemistry in Biomedical Chemistry. Emphasis on the Correlation ofElectrochemical and Bioactive Properties, J. Braz. Chem. Soc., São Paulo, vol. 13,n. 1, p. 19-35, 2002.
AGUIRRE, G., BOIANI, M., CERECETTO, H., DI MAIO, R., GONZÁLEZ, M., PORCAL,W., DENICOLA, A., PIRO, O. E., CASTELLANO, E. E., SANT’ANNA, C. M. R.,BARREIRO, E. J., New potent 5-substitude benzofuroxans as inhibitors ofTrypanosoma cruzi grouth: Quantitative structure-activity relationship studies,Bioorg. Med. Chem., Oxford, vol. 13, p. 6336-6346, 2005.
AGUIRRE, G., CABRERA, E., CERECETTO, H., DI MAIO, R., GONZÁLEZ, M.,SEOANE, G., DUFFAUT, A., DENICOLA, A., GIL, M. J., MARTÍNEZ-MERINO, V.,Design, synthesis and biological evaluation of new potent 5-nitrofuryl derivatives asanti-Trypanosoma cruzi agents. Studies of trypanothione bindig site of trypanothionereductase as target for rational design, Europ. J. Med. Chem., Paris, vol. 39, p. 421-431, 2004.
ALMEIDA-DE-FARIA, M., FREYMULLER, E., COLLI, W., ALVES, M. J. M.,Trypanosoma cruzi: Characterization of an Intracellular Epimastigote-like Form, Exp.Parasitol., San Diego, vol. 31, p. 263-274, 1999.
ANADAN, K., KOLANDAIVEL, P., KUMARESAN, R., GOWENLOCK, B. G., Ab initioand DFT studies on structure and stability of nitroso and nitro substituded furanmolecules, J. Mol. Struct. (Theo Chem) , Amsterdam, vol. 639, p. 213-221, 2003.
ANADAN, K., KOLANDAIVEL, P., KUMARESAN, R., Ab initio and DFT studies ontautomerism of indazole in gaseous and aqueous phases, J. Mol. Struct. (TheoChem), Amsterdam, vol. 686, p. 83-89, 2004.
ARÁN, J. V., OCHOA, C., BOIANI, L., BUCCINO, P., CERECETTO, H., GERPE, A.,GONZÁLES, M., MONTERO, D., NOGAL, J. J., GÓMEZ-BARRIO, A., AZQUETA,A., CERÁIN, A. L., PIRO, O. E., CASTELLANO, E. E., Síntesis and biologicalproperties of new 5-nitroindazole derivatives, Bioorg. Med. Chem., Oxford, vol. 13,p. 3197-3207, 2005.
ARAÚJO-JORGE, T. C., PIRMEZ, C., Protocolos e métodos de trabalho em doença deChagas, Normas de segurança para o trabalho com Trypanosoma cruzi, Cap. 8, In.ARAÚJO-JORGE, T. C., de CASTRO, S. L. (eds), Doença de Chagas: Manual paraExperimentação Animal, Fiocruz, Rio de Janeiro, p. 125-134, 1999.
ARAÚJO-JORGE, T. C., de CASTRO, S. L., Protocolos e métodos de trabalho emdoença de Chagas, Normas de segurança para o trabalho com Trypanosoma cruzi,Modelos animais para o estudo in vivo da doença de Chagas, Cap. 9-10, Doençade Chagas: Manual para Experimentação Animal, Fiocruz, Rio de Janeiro, p. 134-178, 1999.
ARGUELHO, M. L. P. M., SILVA, G. M., STRADIOTTO, N. R., Electroreduction ofbenznidazole in dimethylsulfoxide, J. of Electrochem. Soc., Pennington, vol. 148, n.2, p. D1-D3, 2001.
Referências inseridas de acordo com norma da ABNT NBR6023/2000.
FBT/FCF/USP 121
ARROIO, A., HONORIO, K. M., WEBER, K. C., HOMEM-De-MELLO, P., Da SILVA, A.B. F., The teaching of Quantum Chemistry and the computer from the perspectiveprojects, Quim. Nova, São Paulo, vol. 28, n. 2, p. 360-363, 2005.
BARBOSA, H. S., Planejamento de experimentos e escolha dos modelos: hospedeiroe parasita, Cap.10.4, In. ARAÚJO-JORGE, T. C., de CASTRO, S. L. (eds), Doençade Chagas: Manual para Experimentação Animal, Fiocruz, Rio de Janeiro, p. 184-197, 1999.
BARD, J. A., FALKNER, L. R., Eletrochemical Methods – Fundamentals andApplications, John Wiley & Songs, New York, 1 ed., p. 121-155, 1980.
BARREIRO, E. J., FRAGA, C. A. M., Química Medicinal: As Bases Moleculares daAção dos Fármacos, Artmed Editora, Porto Alegre, RS, 1ed., p.1-167, 2001.
BARREIRO, E. J., RODRIGUES, C. R., ALBUQUERQUE, M. G., SANT’ANNA, M. R.,ALECASTRO, R. B., Modelagem Molecular: Uma Ferramenta para o PlanejamentoRacional de Fármacos em Química Medicinal, Quim. Nova, São Paulo, vol. 20, n.3,p.300-310, 1997.
BAUTISTA-MARTINEZ, J. A., GONZÁLEZ, I., AGUILAR-MARTÍNEZ, M., Influence ofacidity level in acetonitrile on Hammett-Zuman type correlations on the reduction of-hydroxyquinones, Electroc. Acta, Oxford, vol. 48, p. 4239-4244, 2003.
BLUMENSTIEL, K., SCHÖNECK, R., YARDLEY, V., CROFT, S. L., KRAUFT-SIEGEL,R. L., Nitrofuran Drugs as Common Subversive Substrates of Trypanosoma cruziLipoamine Dehydrogenase and Trypanothione Reductase, Biochem. Pharmacol.,New York, vol. 58, p.1791- 1799, 1999.
BOLLO, S., NÚÑES-VERGARA, L. J., BONTÁ, M., CHAUVIERE, G., PÉRIÉ, J.,SQUELLA, J. A., Cyclic voltammetric studies on nitro radical anion formation frommegazol and some related nitroimidazole derivatives, J. Electroanal. Chem.,Lausanne, vol. 541, p. 46-54, 2001.
BOLLO, S., NÚÑES-VERGARA, L. J., MARTINEZ, C., CHAUVIERE, G., PÉRIÉ, J.,SQUELLA, J. A., Voltammetric Study of Nitro ânion radical Anion Generated fromSome Nitrofuran Compounds of Pharmacological Significance, Electroanalysis,Weinhem, vol. 15, n. 1, p. 9-25, 2003.
BOUSSAC, N., GALMIER, M.-J., DAUPHIN, G. MADESCLAIRE, M., LARTIGUE, C.,Nifuroxazide Photodecomposition: Identification of the (Z)-isomer by 1H-NMR Study,Microchim. Acta, Vienna, vol. 141, p. 179-181, 2003.
BRAJTER-TOTH, A., GOYAL, R. N., WRONA, M. Z., LACAVA, T., NGUYEN, N. T.,DRYHURST, G., Electrochemical and enzymic oxidation of biological purines,Bioelectroc. Bioenerg., Lauzanne, vol. 8, p. 413-435, 1981.
BRETT, C. M. A., BRETT, A. M., Electrochemistry. Principles, Methods andApplications, Oxford University Press, New York, 1 ed., p. 25, 13-138, 1993.
BUCHBERGER, W., NIESSNER, G., BAKRY, R., Determination of nifuroxazide withpolarography and adsorptive stripping voltammetry at mercury and carbon pasteelectrodes, Fresenius J. Anal. Chem., vol. 362, p. 205-208, 1998.
FBT/FCF/USP 122
BHATTACHARJEE, A. K., SKANCHY, D. J., JENNINGS, B., HUDSON, T. H.,BRENDLE, J. J., WERBONVETZ, K. A., Analysis of stereoelectronic properties,mechanism of action and pharmacophore of synthetic indolo[2,1-b]quinazoline-6,12-dione derivatives in relation to antileishmanial activity using quantum chemical,cyclic voltammetry and 3-D-QSAR CATALYST procedures, Bioorg. Med. Chem,Oxford, vol. 10, n. 6, p. 1979-1989, 2002.
CAMANDAROBA, E. L., LIMA, C. M. P., ANDRADE, S. G., Oral Transmission ofChagas Disease: Importance of Trypanosima cruzi Biodeme in the IntragastricInfection, Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, São Paulo, vol. 44, p. 97-103, 2002.
CAMARGO, E, P., Growth and differention in Trypanosoma cruzi I. Origein ofmetacyclic trypanosomes in liquid media, Rev. Inst. Med. Trop. São Paulo, SãoPaulo, vol. 6, p. 93-100, 1964.
CANÇADO, J. R., Criteria of Chagas disease cure, Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio deJaneiro, vol. 64, s. 1, p. 331-335, 1999.
CARVALHO, S. A., SILVA, E. F., SANTA-RITA, R. M., CASTRO, S. L., FRAGA, C. A.M., Synthesys and antitrypanosomal profile of new functionalized 1,3,4-thiazole-2-arylhydrazone derivatives, designed as non-mutagenic megazol analogues, Bioorg.Med. Chem. Lett., Oxford, vol. 14, p. 5967-5970, 2004.
CARVALHO, I., PUPO, M. T., BORGES, A. D. L., BERNARDES, L. S. C., Introdução aModelagem Molecular de Fármacos no Curso de Química Farmacêutica, Quim.Nova, São Paulo, vol. 26 n. 3, p. 428-438, 2001.
CASTRO, J. A., de MECCA, M. M. BARTEL, L. C., Toxic side effects of drugs used totreat Chagas’ disease (American trypanosomiasis), Human Exp. Toxicol., London,vol. 25, p. 471-479, 2006.
CHAUVIÉRE, G., BOUTEILLE, B., BERTINEHANGA, B., ALBUQUERQUE, C. N.,CROFT, S. L.; DUMAS, M., PÉRIÉ, J., Synthesis and Biological Activity of NitroHeterocycles Analogous to Megazol, a Trypanocidal Lead, J. Med. Chem.,Washington, vol. 46, p. 427, 440, 2003.
CHENG, Y.-Y., YUAN, H., Quantitative study of electrostatic and steric effects onphysicochemical property and biological activity, J. Mol. Graph. Model., New York,vol. 24, p. 219-226, 2006.
CHIRLIAN, L. E., FRACL, M. M., Atomic charges derived from electrostatic potentials– a detailed study, J. Comput. Chem., New York, vol. 8, p. 894-905, 1987.
CHUNG, M. -C. GÜIDO, R. V. C., MARTINELLI, T. F., GONÇALVES, M. F., POLLI, M.C., BOTELHO, K. C. A., VARANDA, E. A. COLLI, W., MIRANDA, T. M., FERREIRA,E. I., Synthesis and in Vitro Evaluation of Potential AntichagasicHydroxymethylnitrofurazone (NFOH-121): A New Nitrofurazone Prodrug, Bioorg.Med. Chem, Oxford, vol. 11, p. 4779-4783, 2003.
CLAIDEM, J., Delocalization and Conjugation, Cap. 7, Inc. Organic Chemistry, Ed.Oxford University Press, Oxford, p. 165-170, 2000.
COURA, J. R., Tripanossomose, Doença de Chagas, Cienc. Cult.,Rio de Janeiro, vol.55, p. 171-176, 2002.
FBT/FCF/USP 123
COURA, J. R., CASTRO, S. L., A Critical Review on Chagas Disease Chemotherapy,Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, vol. 97, n. 1, p. 3-24, 2002.
CRAIG, P. N., Interdependence between physical parameters and selection ofsubstituent groups for correlation studies, J. Med. Chem., Washington, v. 14, p. 680-684, 1971.
CRAMER, C. J., Charge Distribution and Spectroscopic Properties, Inc. Essential ofComputational Chemistry, Theory and Models, Ed. John Wiley & Sons, New York, p.275-278, 2002.
CRAMER, C. J., TRUHLAR, D. G., An SCF Solvation model for the hydrophobic effectand absolute free energies of aqueous salvation, Science, Washington, vol. 256, p.217-213, 1992.
CRAMER, R. D. III, PATTERSON, D. E., BRUNCE, J. D., Comparative molecular fieldanalysis (CoMFA). 1. Effect of shape on binding of steroids to carrier proteins, J.Am. Chem. Soc., Washington, vol. 110, p. 5959-5967, 1988.
CRONIN, M. T. D., SCHULTZ, T. W., Pitfalls in QSAR, J. Mol. Struct. (Theo Chem),Amsterdam, vol. 622, p. 39-51, 2003.
CRUCIANI, G., PASTOR, M., GUBA, W., VolSurf: a new tool for the pharmacokineticoptimization of lead compounds, Eur. J. Pharm. Sci., Amsterdam, vol. 11, p. S29-S39, 2000.
DANTAS, A. P., SALOMÃO, K., BARBOSA, H. S., de CASTRO, S. L., The effect ofBulgarian própolis against Tripanosoma cruzi and during its interaction with hostcells, Mem. Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, vol. 101, p. 207-211, 2006.
DAVIS, A. M., Quantitative Structure-Activity Relationship, Cap. 8, Inc. MEDICINALCHEMISTRY, Principles and Practice, KING, F. D., ed., Ed. The Royal Society ofChemistry, London, p.115-129, 1997.
DEARDEN, J. C., Partitioning and lLpophilicity in Quantitative Structure ActivityRelationships, Envirom. Health Perspec., Res. Triangle, vol. 61, p. 203-228 , 1985.
DECLERCK, P. J., DE RANTER, C. J., In vitro reductive activation of nitroimidazoles,Biochem. Pharmacol., New York, vol. 35, 1986, p. 59-61.
DE CARVALHO, E. A. B., ANDRADE, P. P., SILVA, N. H., PEREIRA, E. C.,FIGUEIREDO, R. C. B. Q., Effect of usnic acid from the lichen Cladonia substellataon Trypanosoma cruzi in vitro: na ultrastructural sutdy, Mícron, vol. 36, p. 155-161,2005.
De CASTRO, S. L., SANTA-RITA, R. M., EINICKER-LAMAS, M., QuimioterapiaExperimental, Cap. 7, In. ARAÚJO-JORGE, T. C., de CASTRO, S. L. (eds), Doençade Chagas: Manual para Experimentação Animal, Fiocruz, Rio de Janeiro, p. 111-121, 1999.
DEWAR, M. J. S., ZOEBISCH, E. G., HEALY, E. F., STEWART, J. J. P., J. Am. Chem.Soc., Washington, vol. 107, p. 3902, 1985.
FBT/FCF/USP 124
DIMASI, A. J., HANSEN, R. W., GRABOWSKI, H. G., The price of innovation: newestimates of drug development costs, J. Health Econ., New York, vol. 22, p. 151–185, 2003.
DIXON, R. W., LEONARD, J. M., HEHRE, W. J. A., Continuum salvation model for theAM1 Semi-Empirical method, Israel J. Chem., Jerusalém, vol. 33, p. 427-434, 1993.
DODD, M. C., STILLMAN, W. B., The in vivo bacteriostatic action of some simple furanderivatives., J. Pharmacol. Exp. Ther., Bethesda, vol. 82, n. 1, p. 11-18, 1944.
EDWARDS, D.I., DNA binding and nicking agents. In: Hansch, C., SAMMES, P.G.,eds. Comprehensive medicinal chemistry, vol. 2, Pergamon Press, Oxford, 1990,p.725-751.
EDWARDS, D. I., Nitroimidazoles drugs – action and resistance mechanisms I.Mechanisms of action, J. Antimicrob. Chemother., London, vol. 31, 1993, p. 09-20.
ERIKSSON, L.., JAWORSKA, J., WORTH, A. P., CRONIN, M. T. D., McDOWELL, R.M., GRAMATICA, P., Regulatory Acceptance of (Q)SARs, Methods for Reliabilityand Uncertainty Assessment and for Applicability Evaluations of Classification-andRegression-Based QSARs, Envirom. Health Persp., Res Triangle PK, vol. 111, n.10, p. 1361-1375, 2003.
FAIRLAMB, A. H., CERAMI, A., Metabolism and functions of trypanothione inKinetoplastida, Ann. Rev. Microb., vol. 46, p. 695-729, 1992.
FAUCHER, J. F., BALTZ, T., PETRY, K.. G., Detection of an epimastigote-likeintracellular stage of Trypanosoma-cruzi, Parasitol. Res., New York, vol. 81, p. 441-443, 1995.
FERNANDES, J. F., CASTELANI, O., Grow characteristics and chemical compositionof T. cruzi, Exp. Parasitol., San Diego, vol. 18, p. 195-202, 1966.
FERREIRA, M. M C., Multivariate QSAR, J. Braz. Chem. Soc., São Paulo, vol. 13, n. 6,p. 742-753, 2002.
FERREIRA, M. M C., MONTANARI, C. A., GAUDIO, A. C., Seleção de variáveis emQSAR, Quim. Nova, São Paulo, vol. 25, n. 3, p. 439-448, 2002.
FLORENCE A. T., ATTWOOD, D., Princípios Físico-Químicos e m Farmácia, 1a Ed.,Editora Edusp, São Paulo, 2003.
FOYE, W. O., LEMKE, T. L., WILLIAMS, D. A., Principles of Medicinal Chemistry, 4th
Ed., Williams & Wilkins, Baltimore, p. 59-74, 1995.
FRANKE, R., GRUSKA, A., Principal Component and Factor Analysis, Cap. 4.1, In.Methods and Principles in Medicinal Chemistry: Chemometric Methods in MolecularDesign, VAN DE WATERBEEMD, H. ed., Ed. VCH, Weinheim, p. 113-164, 1994.
FREITAS, M. P., TORMENA, C. F., LUÍZAR, C., FERREIRA, M. M. C., RITTNER, R.,Substituent interactions in trans-2-substituted methoxycyclohexanes: an explanationto the conformational behaviour in a chemometric and theoretical view, J. Mol.Struct. (Theo Chem), Amsterdam, vol. 618, p. 219-224, 2002.
FBT/FCF/USP 125
FURLANETTO, M., SANTOS, M. G. B., TAVARES, L. C., Avaliação da influência degrupos substituintes sobre a atividade antimicrobiana de derivados 5-nitro-2-tioflidênicos, Rev. Bras. Cien. Farm., São Paulo, v. 37, supl. 1, p. 62, 2001.
GALEAZZI, R., MARUCCHINI, C., ORENA, M. ZADRA, C., Stereoelectronic propertiesand activity of some imidazolinone herbicides: a computational approach, J. Mol.Struct. (Theo Chem), Amsterdam, vol. 640, p. 191-200, 2003.
GAUDIO, A. C., Modelos clássicos de estudo quantitativo das relações entre estruturaquímica e atividade biológica, Quim. Nova, São Paulo, vol. 19, n. 3, p. 278-289,1996.
GELB, M. H., HOL, W.G.J. Drugs to combat tropical protozoan parasites. Science,Washington, vol. 297, p. 343-344, 2002.
GENSMANTEL, N. P., Physicochemical Properties and Drug Design, Cap. 7, Inc.MEDICINAL CHEMISTRY, Principles and Practice, KING, F. D., ed., Ed. The RoyalSociety of Chemistry, London, p. 99-113, 1997.
GÓMEZ-BARRIO, A., MONTERO-PEREIRA, D., NOGAL-RUIZ, J. J., ESCARIO, J. A.,MUELAS-SERRANO, S., KOUZNETSOV, V. V., MÉNDEZ, L. Y., V., GONZÁLES, J.M. U., OCHOA, C., Antiparasitic properties of homoallylamines and relatedcompounds, Acta Parasitol., Varsóvia, vol. 51, n. 1, p. 73-78, 2006.
GONÇALVES, M. F., Fosfodiesterase do AMP cíclico de formas epimastigotas de T.cruzi, Dissertação de Mestrado – Instituto de Química – Universidade de São Paulo,São Paulo, 1978.
GOULART, M. O. F., ZANI, C. L, TONHOLO, J., FREITAS, L. R., ABREU, F. C.,OLIVEIRA, A. B., RASTAN, D. S., STARLING, S.; CHIARI, E., Trypanocidal activityand redox potential of heterocyclic- and 2-hydroxy-naphthoquinones, Bioorg. Med.Chem. Lett., Oxford, vol. 7, n. 15, p. 2043-2048, 1997.
GROVER, M., SINGH, B., BAKSHI, M., SINGH, S., Quantitative structure-propertyrelationships in pharmaceutical research – Part 1, Pharm.Sci.Tech. Today, Oxford,vol. 3, n. 1, p. 28-35, 2000.
GUADAGNINI, P. H., BRUNS, R. E., de SOUZA, A. A., Cargas atômicas emmoléculas, Quim. Nova, São Paulo, vol. 19, n. 2, p. 148-155, 1996.
HE, L., JURS, P. C., Assessing the reliability of a QSAR model’s predictions, J. Mol.Graph. Model., New York, vol. 23, p. 503-523, 2005.
HEHRE, W. J., HUNAG, W. W., KLUNZINGER, P. E., DEPPMEIER, B. J., DRIESSEN,A. J., Spartan 04 for Windows: User’s guide; Irvine, CA,2004.
HAMMETT, T. L., The effect of structure upon the reacitions of organic compoundsbenzene derivatives, J. Am. Chem. Soc., vol. 59, Washington, p. 96-103, 1937.
HANSCH, C., FUJITA, T., p--análisis: a meted for the correlation of biologicalactivity and chemical structure, J. Am. Chem. Soc., Washington, vol. 86, p. 1616-1626, 1964.
HANSCH, C., CLAYTON, J. M., Lipophilic Character and Biological-Activity of Drugs .2.Parabolic Case J. Pharm. Sci., Washington, vol. 62, p. 1-21, 1973.
FBT/FCF/USP 126
HANSCH, C., SAMMES, P. G., TAYLOR, J. B., Comprehensive medicinal chemistry:The rational design, mechanistic study & therapeutic application of chemicalcompounds, Oxford, Pergamom Press, 1990.
HANSCH, C., LEO, A., TAFT, R. W., A survey of Hammett substituent constants andresonance and field parameters, Chem. Rev., Colombus, vol. 91, p. 165-195, 1991.
HANSCH, C., LEO, A., Exploring QSAR: fundamentals and applications in chemistryand biology, Ed. American Chemical Society, Washington, USA, vol. 1, 1995 (a).
HANSCH, C., LEO, A., Exploring QSAR, Hidrophobic, Eletronic and Steric Constants,Vol. 2, Ed. American Chemical Society, Washington, USA, p. 557, 1995 (b).
HARDMAN, J. G., LIMBIRD, L. E.; GILMAN, A. G.; GOOMANN & GILMAN – ThePharmacological Basis of therapeutics, 9 ed., McGraw-Hill, New York, 1996.
HARRIS, D. C., Análise Química Quantitativa, 5o. Ed., LTC Editora, Rio de Janeiro, p.403-420, 2001.
HEHRE, W. J., HUNAG, W. W., KLUNZINGER, P. E., DEPPMEIER, B. J., DRIESSEN,A. J., Spartan 04 for Windows: User’s guide; Irvine, CA, 2004.
HENDERSON, G. B.; URLICH, P. FAIRLAMB, A. H. ROSEMBERG, I.; PEREIRA, M.;SELA, M.; CERAMI, A., “Subversive”substrates for the enzyme trypanothionedisulfide reductase: Alternative approach to chemotherapy of Chagas disease, Proc.Nat. Acad. Sci Usa, Washington, vol. 85, p. 5374-5378, 1988.
HERLICH, P., SCWEIGEL, M., Nitrofurans. A group of synthetic antibiotics with a newmode of action: Discrimination of specific messenger RNA classes. Proc. Natl.Acad. Sci USA, Washington, vol. 73 (10), 1976, p. 3386-3390.
HÖLTJE, H. -D., GERD, F., Molecular Modeling – Basic Principles and Applications, 1ed., VHC, Weinheim, vol. 5, 1997.
HOFT, D. F., FARRAR, P. L., KRATZ-OWEN, K., SHAFFER, D., Gastric invasionbyTrypanosoma cruzi and induction of protective mucosal immune responses,Infect. Immun, Washington, vol. 64, p. 3800-3810, 1996.
IFA, D. R., RODRIGUES, C. R., ALENCASTRO, R. B., FRAGA, C. A. M., BARREIRO,E. J., A possible molecular mechanism for the inhibition of cysteine proteases bysalicylaldehyde N-acylhydrazones and related compounds, J. Mol. Struct. (TheoChem), Amsterdam, vol. 505, p. 11-17, 2000.
JOCKERS-SCHERÜBL, M. C.; SCHIRMER, R. H., KRAUTH-SIEGEL, R. L.,Tripanothione reductase from Trypanosoma cruzi Catalytic properties of the enzymeand inhibition studies with trypanocidal compounds, Eur. J. Biochem., vol. 180, p.267-272,1989.
JULIÃO, M. S. S, FERREIRA, E. I., FERREIRA, N. G., SERRANO, S. H. P.,Voltammetric detection of the interactions between RNO2 circle- and electronacceptors in aqueous medium at highly boron doped diamond electrode (HBDDE),Electroc. Acta, Oxford, vol. 5I, n. 24, p. 5080-5086, 2006.
FBT/FCF/USP 127
JULIÃO, M. S. S., ALMEIDA, E. C., LA-SCALEA, M. A., FERREIRA, N. G.,COMPTON, R., SERRANO, S. H. P., Voltametric Behaviour of Nitrofurazone atHighly Boron doped Diamond Electrode, Electroanalysis, Weinhein, vol. 17, n. 3, p.269-274, 2005.
KALCHER, K., KAUFFMANN, J.-M., WANDG, J., SVANCARA, I., VYTRAS, K.,NEURHOLD, CL, YANG, Z., Sensors Based on Carbon Paste in ElectrochemicalAnalysis: A Review with Particular Emphasis on the Period 1990-1993,Electroanalysis, Weinhein, vol. 7, p. 5-22, 1995.
KARAKUS, C., ZUMAN, P., Polarographic and electrochemical studies of somearomatic and heteroaromatic nitrocompounds Part 9. Substituints effects onprotonation of the radical ArNO2H
- and its reactions with hidroxylamino and nitrosocompounds in buffered mixtures of water and DMF, J. Electroanal. Chem.,Lausanne, vol. 396, p. 499-505, 1995.
KARELSON, M., LOBANOV, V. S., KATRITZKY, A. R., Quantum-Chemical Descriptorsin QSAR/QSPR Studies, Chem. Rev., vol. 96, p. 1027-1043, 1996.
KATZUNG, B. G., Farmacologia Básica e Clínica, Cap. 52, 8 ª ed., GuanabaraKoogan, Rio de Janeiro, p. 757, 2001.
KOMORSKY-LOVRIC, S.; LOVIRC, M., Kinetics measurements of a surface confinedredox reaction, Anal. Chim. Acta, vol. 305, p. 248-255, 1995.
KOROLKOVAS, A., BURCKHALTER, J. H., Química Farmacêutica, GuanabaraKoogan, Rio de Janeiro, p. 65, 542, 544, 1988.
KOVACIC, P., AMES, J. R., RECTOR, D. L., JAWDOSIUK, M., RYAN, M. D.,Reduction Potentials of Anthelmintic Drugs: Possible Relationship to Activity, FreeRad. Biol. & Med., vol. 6, p. 131-139, 1989.
KRAUTH-SIEGEL, R. L., BAUER, H., SCHIRMER, H. R., Dithiol Proteins as Guardiansof the Intracellular Redox Milieu in Parasites: Old and New Drug Targets inTrypanosomes and Malaria-Causing Plasmodia, Angew. Chem. Int. Ed., vol. 44, p.690-715, 2005.
KRAUTH-SIEGEL, R. L.; SCHÖNECK, R., Trypanothione reductase and lipoamidedehydrogenase as targets for a structure-based drug design, FASEB J., Bethesda,vol. 9, p. 1138-1146, 1995.
KRAUTH-SIEGEL, R. L.; INHOFF, O., Parasite-specific trypanothione reductase as adrug target molecule, Parasit. Res., Washington, vol. 90, n. 2, p. S77-S85, 2003.
KUBINYI, H., Quantitative Structure-Activity Relationships. 7. The Bilinear Model, aNew Model for Nonlinear Dependence of biological Activity on HydrophobicCharacter, J. Med. Chem. Washington, vol. 20, n. 5, p. 625-629, 1977.
KUBINYI, H., QSAR: Hansch Analysis and Related Approaches, 1 ed., VHC,Weinheim, Germany, p. 1-75, 1993.
KUBINYI, H, In. Burguer’s Medicinal Chemistry and Drug Discovery, Vol. 1, Principlesand Practice, 5 ed. Cap. 4, p. 497-550, 1995.
FBT/FCF/USP 128
KUBINYI, H., QSAR and 3D QSAR in drug design Part 1: methodology, Drug. Discov.Today, vol. 2, n. 11, p. 457-467, 1997.
LANA & TAFFURI, Inc. Parasitologia Humana, Ed. NEVES, D. P., 10 ed., Ed. Atheneu,São Paulo, p. 73-96, 2000.
LA-SCALEA, M., SERRANO, S. H. P., GUTZ, G. R., Voltammetric Behaviour ofMetronidazole at Mercury Electrodes, J. Braz. Chem. Soc., São Paulo, vol. 10, n. 2,p. 127-135, 1999.
LEITÃO, A., ANDRICOPULO, A. D., OLIVA, G., PUPO, M. T., MARCHI, A. A., VIEIRA,P. C., SILVA, M. F. G. F., FERREIRA, V. F., SOUZA, M. C. B. V., SÁ, M. M.,MORAES, V. R. S., MONTANARI, C. A., Structure-activity relationship of novelinhibitors of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, Bioorg. Med. Chem. Lett.,Oxford, vol. 14, p. 2129-2204, 2004.
LIENDO, A., LAZARDI, K., URBINA, J. A., In-vitro antiproliferative effects andmechanism of action of the bis-triazole D0870 and its S(-) enantiomer againstTrypanosoma cruzi, J. Antimicrob. Chemoth., London, vol. 41., p. 197-205, 1998.
LEO, A., HANSCH, C., Linear free-energy relationships partitioning solvent systems. J.Org. Chem., Washington, v. 36, p. 1539-1544, 1971.
LOVRIC, M., Theory of Square-Wave Votlammetry of a Reversible Redox ReactionComplicated by the Reactant Adsorption, Electroanalysis, Weinhein, vol. 14, n. 6, p.405-412, 2000.
MANDAL, P. C., Reactions of nitro anion of metronidazole in aqueous and mixedsolvent: a cyclic voltammetric study, J. Electroanal. Chem., Lausanne, vol. 570, p.55-61, 2004.
MANNHOLD, R., REKKER, R. F., DROSS, K., BIJLOO, G., DE VRIES, G., Thelipophilic behavior of organic compounds: 1. An updating of the hydrophobicfragemental constant approach, Quant. Struct.-Act. Relat., Weinhein, vol. 17, p. 578-536, 1998.
MARSHALL, G. R., Burger’s Medicinal Chmistry and Drug Discovery. Vol. 1, MolecularModeling, 5 ed. Cap. 15, Wiley Interscience, New York , p. 573-659, 1997.
MASUNARI, A., TAVARES, L.C. Antimicrobial activity optimization of 5-nitro-2-thiophylidene derivatives against multi-resistant strains of Staphylococcus aureus.Drug Fut., vol. 27, suppl. A, p.183. In: Abstracts from the XVIIth InternationalSymposium on Medicinal Chemistry – Barcelona, 2002.
MARTIN, Y. C., A Practitioner’s Perspective of the Role of Quantitative Structure-Activity Analysis in Medicinal Chemistry, J. Med. Chem., Washington, vol. 24, n. 2,p. 229-238, 1981.
MARTINEZ-MERINO, V., CERECETTO, H., CoMFA-SIMCA model for antichagasicnitrofurazone derivatives, Bioorg. Med. Chem, Oxford, vol. 9, n. 4, p. 1025-1030,2001.
MINITAB 14 - Minitab Inc., www.minitab.com, acess. 09/2006.
FBT/FCF/USP 129
MONASTÉRIOS, M., ESCORCHE, M., AVERDAÑO, M., Conformational analysis,electronic properties and molecular electrostatic potential of nitrofurans derivativeswith antibacterial activity, J. Mol. Struct., Amsterdam, vol. 748, 2005, p. 49-55.
MASUNARI, A., TAVARES, L.C. Antimicrobial activity optimization of 5-nitro-2-thiophylidene derivatives against multi-resistant strains of Staphylococcus aureus.Drug Fut., vol. 27, suppl. A, p.183. In: Abstracts from the XVIIth InternationalSymposium on Medicinal Chemistry – Barcelona, Spain., 2002.
MAYA, J. D., BOLLO, S., NUÑES-VERGARA, L.J., SQUELLA, J.A., REPETTO, Y.,MORELLO, A., PÉRIE, J., CHAUVIÈRE, G., Trypanosoma cruzi: effect and mode ofaction of nitroimidazole and nitrofuran derivatives, Biochem. Pharmacol., New York,vol. 65, 2003, p. 999-1006.
MAYA, J. D., REPETTO, Y., AGOSÍN, M., OJEDA, J. M., TELLEZ, R., GAULE, C.,MORELLO, A., Effects of nifurtimox and benznidazole upon glutathione andtrypanothione content in epimastgote, trypamastigote and amastigote forms ofTrypanosoma cruzi, Molec. Biochem. Parasitology., Amsterdam, vol. 86, p. 101-106,1997.
MEYER, H., Arch. Exp. Path. Pharm., vol. 42, p. 109-118, 1899. In. KUBINYI, H.,QSAR: Hansch Analysis and Related Approaches, 1 ed., VHC, Weinheim,Germany, p. 1-75, 1993.
MILLET, R., MAES, L., LANDRY, V., SERGHERAERT, C., DAVIOUD-CHARVET, E.,Antitrypanosomal Activities and Cytotoxicity of 5-Nitro-2-furancarbohydrazides,Bioorg. Med. Chem. Lett., Oxford, vol. 12, p. 3601-3604, 2002.
MONTANARI, M. L. C., MONTANARI, C. A., GAUDIO, A. C., Validação Lateral emRelações Quantitativas entre Estrutura e Atividade Farmacológica, QSAR, Quim.Nova, São Paulo, vol. 25, n. 2, p. 231-240, 2002.
MONTEAGUDO, J. C. G.; FONSECA, J. M. L.; CRESPO, M. A., Mechanism of thepolarographic reduction of a new 5-nitrofuran derivative with antibacterial activity,Pharmazie, Berlin, vol. 47, n. 2, p. 98-101, 1992.
MORALES, A.; RICHTER, P.; TORAL, M. I., Voltammetric Behaviour of Nitrofurazone,Furazolidone and Other Nitro Dericatives of Biological Importance, Analyst,Cambridge, vol. 112, p. 965-970, 1987.
MUELAS-SERRANO, S., NOGAL-RUIZ, J.J., GÓMES-BARRIO, A., Setting of acolorimetric method to determine the viability of Trypanosoma cruzi epimastigotes,Parasitol. Res., Washington, vol. 86, p. 999-1002, 2000.
MUELAS-SERRANO, S., PÉREZ-SERRANO, J., GÓMES-BARRIO, A., ARAN, V.J.,RODRÍGUES-CAABEIRO, F., Ultrastructural alterations induced by nifurtimox andanother nitro derivative on epimastigotes of Trypanosoma cruzi, Parasitol. Res.,Washington, vol. 88, p. 97-101, 2002.
MUELAS-SERRANO, S., LE-SENNE, A., FERNÁNDES-PORTILLO, C., NOGAL, J. J.,OCHOA, C., GÓMES-BARRIO, A., In Vitro and In Vivo Anti-Trypanosoma cruziActivivity of a Novel Nitro-derivative, Mem. Instit. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, vol.97, n. 4, p. 553-557, 2002.
FBT/FCF/USP 130
NETZ, P. A., ORTEGA, G. G., Fundamentos de Físico-Química. Uma AbordagemConceitual para Ciências Farmacêuticas, 1ª Ed., Ed. Artmed, Porto Alegre, 2002.
NICHOLSON, R. S., Semiempirical Procedure for Measuring with Stationary ElectrodePolarography rates of Chemical Reactions Involving the Product of ElectronTransfer, Anal. Chem., Washington, vol. 38, n. 10, p. 1406, 1966.
NÚÑES-VERGARA, L.J., BONTA, M., NAVARRETE-ENCINA, P. A., SQUELLA, J.A.,Electrochemical characterization of ortho and meta-nitrotoluene derivatives indifferent electrolytic media. Free radical formation, Electroquim. Acta, Oxford, vol.46, p. 4289-, 2001.
NÚÑES-VERGARA, L.J., ALDUNATE, J., LETELIER, M. E., BOLLO, S., REPETTO,Y., MORELLO, A., SPENCER, P. L., SQUELLA, J.A., Nitro radical anion formationfrom nifurtimox II: electrochemical evidence, Bioelec. Bioenerg., Lausane, vol. 38, p.355-358, 1995.
OLIVEIRA, D. B., GAUDIO, A. C., BuildQSAR: A New Computer Program for QSARAnalysis, Quant. Struct.-Act. Relat.. Weinhein, vol. 19, p. 599- 601, 2000.
OLMSTEAD, M., HAMILTON, R., NICHOLSON, R. S., Theory of cyclic voltammetry fora dimerization reaction iniciated electrochemically, Anal. Chem., Washington, vol.41, p. 260-267, 1969.
OVERTON, E., Studien uber die Narkose, zugleich ein Beitrag zur allgemeinenPharmakologie, G. Fischer, Jena, 1901; English translation by Lipnich, R. L., ed.,Studies on Narcosis, Charles Ernest Overton, Chapman and Hall, London, 1991.
OSTERYOUNG, J. G., OSTERYOUNG, R. A., Square Wave Voltammetry, Anal.Chem., Washington, vol. 57, n. 1, p. A101-&,1985.
PARR, E. G., CHATTARAJ, P. K., Principles of Maximum Hardness, J. Am. Chem.Soc., Washington, vol. 113, p. 1854-1855, 1991.
PASHA, F. A., SRIVASTATA, H. K., SINGH, P. P., QSAR Study of Estrogens With theHelp of PM3-Based Descriptors, Int. J. Quant. Chem., Hoboken, vol. 104, p. 87-100, 2005.
PATRICK, G. L., An Introduction to Medicinal Chemistry, 2O ed., Oxford, New York,NY, USA, 2001.
PAULINO, M., IRIBARNE, F., HANSZ, M., VEJA, M., SEOANE, G., CERECETTO, H.,DI MAIO, R., CARACELLI, I., ZUKERMAN-SCHPECTOR, J., OLEA, C.,STOPPANI, A. O. M., BERRIMAN, M.; FAIRLAMB, A. H., TAPIA, O., Computerassisted design of potentially active anti-trypanosomal compounds, J. Mol. Struct.(Theo Chem), Amsterdam, vol. 584, p. 95-105, 2002.
PEDROSA, V. D.; CODOGNOTO, L.; AVACA, L. A., Electroanalytical determination of4-nitrophenol by square wave voltammetry on diamond electrodes, J. Braz. Chem.Soc., São Paulo, vol. 14, n. 4, p. 530-535, 2003.
PERALTA-ZAMORA, P., CORDEIRO, G., NAGATA, N., Utilização de regressãomultivariada para avaliação espectrofotométrica da demanda química de oxigênioem amostras de relavância ambiental, Quim. Nova, São Paulo, vol. 28, n. 5, p. 838-841, 2005.
FBT/FCF/USP 131
PERRIN, D. D., DENPSEY, B., Buffers for pH and Metal Ions Control, Chapman andHall, London , UK, p. 8, 35, 155, 1974.
PNIEWSKA, B.; JNUCHOWSKI, M. Structural Investigations of Nifuroxazide, p-Hydroxy-N’-(5-nitrofurfurylidene)benzhydrazide, Polish J. Chem., Varsóvia, vol. 72,p. 2629, 1999.
POZAS, R., CARBALLO, J., CASTRO, C., RUBIO, J., Syntesis and in vitroantitrypanosomal activity of novel Nifurtimox analogues, Bioorg. Med. Chem. Lett.,Oxford, vol. 15, p. 1417-1421, 2005.
PRATA, A., Clinical and epidemiiological aspects of Chagas disease, The Lancet Infec.Dises., Oxford, vol. 1, p. 92-100, 2001.
RADI, A., Voltammetric study of nifuroxazide at unmodified and Sephadex-modifiedcarbon paste electodes, Fresenius J. Anal. Chem., vol. 364, p. 590-594, 1999.
RICE, M. E., GALUS, Z., ADAMS, R. N., Graphite Paste Electrodes. Effects of PasteComposition and Surface States on Electron-Transfer Rates, J. Electroanal. Chem.,Lausanne , vol. 143, p. 89, 1983.
RAETHER, W.; HANEL, H. Nitroheterocyclic drugs with broad spectrum activity,Parasitol. Res., New York, vol. 90 (S.1), S19-S39, 2003.
RANDO, D. C.; SATO, D. N.; SIQUEIRA, L.; MALVEZZI, A.; LEITE, C. Q. F.;do_AMARAL A. T.; FERREIRA, E. I.; TAVARES, L. C.; Potential TuberculostaticAgents. Topliss Application on Benzoic acid {(5-Nitro-thiophen-2-yl)-methyne}-hydrazide Series, Bioorg. Med. Chem., Oxford, vol. 10, p. 557-560, 2002.
REMERS, W. A.; BEAR, S., Burger’s Medicinal Chmistry and Drug Discovery. Vol. 4,Antimicrobians. 5 ed. Cap. 4, Wiley Interscience, New York , p. 271-272, 1997.
REKKER, R. F.; MANNHOLD, R., Calculation of drug lipophilicity: the hidrophobicfragmental constant approach, Weinhein, Ed. VCR, p. 3, 1992.
REZENDE, P., Relações quantitativas estrutura-atividade de derivados 5-nitro-2-tiofilidênicos: planejamento, síntese e determinação da atividade anitmicrobianafrente a cepas de Staphylococus aureus, Dissertação de Mestrado, Faculdade deCiências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2002.
RODRIGUES, C. O., CATISTI, R., UYEMURA, S. A., VERCESI, A. E., LIRA, R.,RODRIGUEZ, C., URBINA, J. A., DOCAMPO, R., The sterol Composition ofTripanosoma cruzi After Growth in Different Culture Media and Results in DifferentSensitivity to Digitonin-Permealization, J. Eukaryot. Microbiol., Lawrence, vol. 48, p.588-594, 2001.
ROJAS, A.; VINHÃES, M.; RODRÍGUEZ, M.; MONROY, J.; PERSAUD, N.; AZNAR,C.; NÁQUIRA, C.; HIWAT, H.; BENÍTEZ, J., Reunião Internacional sobre Vigilânciae Prevenção da Doença de Chagas na Amazônia. Implementação da IniciativaIntergovernamental de Vigilância e Prevenção da doença de Chagas na Amazônia,Rev. Soc. Bras. Med. Trop., São Paulo, vol. 38, p. 82-89, 2005.
FBT/FCF/USP 132
ROSSELI, F. P.; ALBUQUERQUE, C. N.; da SILVA, A. B. F., Quantum Chemical andStatistical Study of Megazol-Derived Compounds With Trypanocidal Activity, Int. J.Quant. Chem., Hoboken, vol. 103, p. 738-748, 2005.
ROZENSKI, J.; DE RAUNTER, C. J.; VERPLANKEN, H., Quantitative Structure-Activity Relationship for Antimicrobial nitroheterocyclic Drugs, Quant. Struct.-Act.Relat., Weinhein, vol. 14, p. 134-141, 1995.
SANTA-RITA, R, M.; LIRA, R.; BARBOSA, H. S.; URBINA, J. A.; de CASTRO, S. L.,Anti-proliferative synerty of lysophospholipid analogues and ketoconazole againstTripanosoma cruzi (Kinetoplastida: Trypanosomatidae): cellular and ultrastructuralanalysis, J. Antimic. Chemoth., London, vol. 55, p. 780-784, 2005,
SAPEL’NIKOVA, S. V.; KUZ’MINA, N. V.; MAISTRENKO, V. N.; KUDASHEVA, F. K.,Preconcentration and Voltammetric Determination of Nitro Compounds on Carbon-Paste Electrodes, J. Anal. Chem., Moscow, vol. 57, p. 532-537, 2002.
Secretaria de vigilância em Saúde de Santa Catarina (SVS), 13/2/2005; Secretaria devigilância em Saúde do Pará (SVS), 31.03.2005, Brasil,http://dtr2001.saude.gov.br/svs. Nota Técnica - 4/4/05, acessado em 11/2006.
SERRANO, S. H. P.; BARROS, R. C. M.; JULIÃO, M. S. S; PAULA, F. R., Biologicalelectrochemical applications on diamond electrodes: Solving old problems andoppening new possibilities, Inc. Electroanalytical Aspects of Biological SignificanceCompounds, SQUELLA, J. A., BOLLO, S., eds., Ed. Transworld Research Network,Kerala, p. 51-71, 2006.
SERRANO, S. H. P.; GIL, E. S., Métodos Eletroquímicos, Cap. 2.2, Inc. Controle deQualidade Físico-Químico de Qualidade de Medicamentos, GIL, E. S.; ORLANDO,R. M.; MATHIAS, R.; SERRANO, S. H. P. eds., Ed. Uniderp, Campo Grande, p.363-399, 2005.
SJÖSTRÖM, M.; ERIKSSON, L., Applications of Statistical Eperimental Design andPLS Modeling in QSAR, Cap. 3.2, In. Methods and Principles in MedicinalChemistry: Chemometric Methods in Molecular Design, VAN DE WATERBEEMD,H. ed., Ed. VCH, Weinheim, p. 63-90, 1994.
SILVA, C. H. T. P., SANCHES, S. M., TAFT, C. A., A molecular modeling and QSARstudy of suppressors of the growth of Tripanosoma cruzi epimastigotes, J. Mol.Graph. Model., New York, vol. 23, p. 89-97, 2004.
SILVA, T. H. A., Modelagem Molecular, In. Da Química Medicinal à QuímicaCombinatória e Modelagem Molecular, um curso prático, 1ª Ed., Ed. Manole, Cap.6, p. 111-139, 2002.
SILVA, L. H. P., NUSSENSZWEIG, V., Sobre uma cepa de Trypanosoma cruzialtamente virulenta para o camundongo branco, Folia Clin. Biol., São Paulo, v. 20,p. 191-207, 1953.
SOUZA, D.; MACHADO, S. A.; AVACA, L. A., Voltametria de onda quadrada, primeiraparte: Aspectos teóricos, Quim. Nova, São Paulo, vol. 26, n. 1, p. 81-89, 2003.
SQUELLA, J. A.; BOLLO, S.; NUÑES-VERGARA, L. J., Recent Developments In theElectrochemistry of Some Nitro compounds of Biological Significance, Curr. Org.Chem., Oxford, vol. 9, n. 6, p. 565-581, 2005.
FBT/FCF/USP 133
SQUELLA, J. A.; LETELIER, M. E.; LINDERMEYER, L.; NUNES-VERGARE, L. J.,Redox behaviour of nifuroxazide: generation of the one-electron reduction product,Chem. Biol. Interac., Oxford, vol. 99, p. 227-238, 1996.
STRADINS, J., GAVARS, R., BAUMANE, L., Intermediate products of electrochemicalreduction in aprotic media, Electrochem. Acta, vol. 28, n. 4, p. 495-500, 1983.
SWAIN, C. G.; LUPTON, E. C., Field and ressonance components of substituenteffects, J. Am. Chem. Soc., Washington, vol. 90, p. 4328-4337, 1968.
TAFT, R. W., LEWIS, J. C., The general applicability of a fixed scale of inductiveeffects. II. Inductive effect of dipolar substituents in the reactivities of m- and p-substituted derivatives of benzene, J. Am. Chem. Soc., Washington, vol. 80, p.2346-2443, 1958.
TAFT, R. W., Polar and sterics substituints constant for aliphatic and o-benzoategroups from esterification and hydrolysis of esters, J. Am. Chem. Soc., Washington,vol. 74, n. 12, p. 3120-3128, 1952.
TAVARES, L. C., FERREIRA, E. I., Relações Quantitativas Estrutura-Atividade, Cap.8, Inc: Prácticas de Químcia Farmacêutica y Medicianal, eds. PRADO, M. A. F.,BARREIRO, E. J., 2ª ed., Ed. Cyted - Programa Iberoamericano de Ciencia yTecnologia para el Desarrollo, Pamplona, pg. 37-68, 2006.
TAVARES, L. C., QSAR: A abordagem de Hansch, Quim. Nova, São Paulo, vol. 27, n.4, p. 631-639, 2004.
TAVARES, L. C., FERREIRA, E. I., Relações Quantitativas Estrutura-Atividade, Cap.8, Inc: Prácticas de Químcia Farmacêutica y Medicianal, eds. PRADO, M. A. F.,BARREIRO, E. J., 1ª ed., Ed. Cyted - Programa Iberoamericano de Ciencia yTecnologia para el Desarrollo, Pamplona, pg. 37-68, 2002.
TAVARES, L. C., CHISTÉ, J. J., SANTOS, M. G. B., PENNA, T. C. V., Synthesis andbiological activity of nifuroxazide and analogs. II, Boll. Chim. Farm., Milano, vol. 138,n. 8, p. 432-436, 1999.
TAVARES, L. C., PENNA, T. V. C., AMARAL, A. T., Synthesis and biological activity ofnifuroxazide and analogs., Boll. Chim. Farm., Milano, vol. 136, n. 3, p. 244-249,1997.
TAVARES, L. C., Relações Quantitativas Entre a Estrutura Química e a AtividadeAntimicrobiana de Análogos à Nifuroxazida, Tese de doutorado – Faculdade deCiências Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, São Paulo, p. 89-90, 1993.
TEIXEIRA, S. M. R., VIERA, L. Q., GAZZINELLI, R. T., Genomic, pathogenesis andcontrol of infection with protozoan parasites, TRENDS in Parasitology, Oxford, vol.18, n. 2, p. 52-54, 2002.
TEOFILO, R. F., FERREIRA, M. M. C., Chemometrics II: Spreadsheets forexperimental design calculations, a tutorial, Quim. Nova, São Paulo, vol. 29, p. 338-350, 2006.
FBT/FCF/USP 134
THANIKAIVELAN, P., SUBRAMANIAN, V., RAO, J. R., NAIR, B. U., Application ofquantum chemical descriptor in quantitative structure activity and structure propertyrelationship, Chem. Phys. Lett., Amsterdam, vol. 323, p. 59-70, 2000.
THAKUR, M., THAKUR, A., BALASUBRAMANIAN, K., QSAR and SAR Studies on theReduction of Some Aromatic Nitro Compounds by Xanthine Oxidase, J. Chem. Inf.Model., Washington, vol. 46, p. 103-110, 2006.
TOCHER, J. H., Reductive activation of Nitroheterocyclic Compounds, Gen. Pharmac.,Oxford, vol. 28 (4), p.485-487, 1997.
TYLER, K. M., ENGMAN, D. M, Int. The life cycle of Trypanosoma cruzi revisited, Int.J. Parasitol., Oxford, vol. 31, p. 472-481, 2001.
URBINA, J. A., DOCAMPO, R., Specific chemotherapy of Chagas disease:controversies and advances, Trends in Parasitol., Oxford, vol. 19, p. 495-501, 2003.
URBINA, J. A., Specific treatment of Chagas disease: current status and newdevelopments, Cur. Opinions of Infec. Disease, Philadelphia, vol. 14, n. 6, p. 733-741, 2001.
VAN DE WATERBEEMD, H., The history of drug research: from Hansch to thepresent, Quant. Struct.-Act. Relat., Weinhein, vol. 11, p. 200-204, 1992.
VERGNES, B., SERENO, D., MADJIDIAN-SERENO, N., LEMESRE, J.-L., OUAISSI,A., Citoplasmic SIR2 homologue overexpression promotes survival of Leishmaniaparasites by preventing progammed cell death, Gene, Amsterdan, vol. 296, p. 139-150, 2002.
VERMA, R. P.; HANSCH, C., An approach toward the problems of outliers in QSAR,Bioorg. Med. Chem., Oxford, vol. 12, p. 4597-4621, 2005.
VILLARREAL, D., BARNABÉ, C., SERENO, D., TIBAYRENC, M., Lack of correlationbetween in vitro susceptibility to Benznidazole and phylogenetic diversity ofTrypanotiona cruzi, the agent of Chagas disease, Exp. Parasitol., San Diego, vol.108, p. 24-31, 2004.
VIODÉ, C.; BETTACHE, N.; CENAS, N.; KRAUTH-SIEGEL, R. L.; CHAUVIÈRE, G.;BAKALARA, N.; PÉRIÉ, J., Enzimatic Reduction Studies of Nitroheterocycles,Biochem. Pharmac., New York, vol. 57, p. 549-557,1999.
VOLKHARD, A., Experimental Design in Synthesis Planning and Structure-PropertyCorrelations, In. Chemometric Methods in Molecular Design, Waterbeemd, H. V., 1o
Ed., VHC, Tokio, Cap. 3.1, p. 49-62, 1995.
WALLER, C. L., A three-dimensional technique for the calculation of octanol-waterpartition coeficients, Quant. Struct-Act. Relat., Weinhein, vol. 13, p. 172-176, 1994.
WIKIPEDIA, http://pt.wikipedia.org/wiki/Imagem:Chagas_ciclo_de_doença, assessadoem 11/2006.
WANG, J., Analytical Electrochemistry, 2o. Ed., Wiley-VHC, New York, p. 1-124, 2000.
WHO – WORLD HEALTH ORGANIZATION, Genebra, Suiça -http://www,who.int/ctd/chagasdts/html, 2000. Acessado em 15/03/2007.
FBT/FCF/USP 135
WOLD, S., PLS for Multivariate Linear Modeling, Cap. 4.4, In. Methods and Principlesin Medicinal Chemistry: Chemometric Methods in Molecular Design, VAN DEWATERBEEMD, H. ed., Ed. VCH, Weinheim, p. 195-218, 1994.
YARDLEY, V., CROFT, S. L., In vitro and In vivo activity of Amphotericin B-lipidFormulations Against Experimental Trypanosoma cruzi infections, Am. J. Trop. Med.Hyg., Washington, vol. 61, p. 193-197, 1999.
YOUNG, D. C., Solvation, Cap. 21, Inc. Computational Chemistry: A Practical Guide forApplying Techniques to Real-Word Problems, Ed. John Wiley & Sons, New York, p.206-214, 2001.
ZELIÉ, M., Reverse Scan as a Source of Information in Square Wave Voltammetry,Croat. Chem. Acta, Zagreb, vol. 79, n. 1, p. 49-55, 2006.
FBT/FCF/USP 137
8.1 Espectros de Espectrofotometria UV/Vis
Influência da solução tampão PIPES sobre os espectros de UV/vis obtidos em meio
1,0 mmol L-1 5-nitro-2-tiofilidênico benzidrazida dissolvido em DMSO:
Figura 32. Espectro de UV/vis de 5-nitro-2-tiofilidênico benzidrazida em meio misto
(DMSO/PIPES 50% v/v), varredura de scan 200-750 nm, velocidade de
scan 1200 nm min-1.
Equipamento: Hawlett Packard Diode Array
Cubetas de quartzo
Absorção máxima obtida em varredura de scan: 381,45 nm
FBT/FCF/USP 138
Figura 33. Espectro de UV/vis de 5-nitro-2-tiofilidênico benzidrazida em meio aprótico
(DMSO, 100% v/v), varredura de scan 200-750 nm, velocidade de scan
1200 nm min-1.
Equipamento: Hawlett Packard Diode Array
Cubetas de quartzo
Absorção máxima obtida em varredura de scan: 386,20 nm
FBT/FCF/USP 140
1. Dados pessoais:
Endereço: Rua Borges Lagoa, 908, Apto: 191
Bairro Vila Clementino, CEP: 04038-002. São Paulo – SP CRF-SP: 30.509
e-mail: [email protected]/ fá[email protected]
2. Formação Profissional:
2003 - 2007: Doutorado em Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica na Universidade de São
Paulo (USP/SP).
2000 - 2002: Mestre em Ciência e Tecnologia Farmacêuticas, Universidade Federal de Santa
Maria – RS (UFSM).
1995 - 1999: Graduação em Farmácia e Bioquímica – Ênfase em Tecnologia de Alimentos,
Universidade Federal de Santa Maria – RS (UFSM).
3. Experiência Didática:
2006 - Palestra intitulada “Planejamento e desenvolvimento de fármacos: atualizações e
principais metodologias” proferido ao curso de farmácia da FMU, campus Santo Amaro,
São Paulo, SP, 02/10/2006.
2006 - Palestra intitulada “Application of QSAR Studies of New Antimicrobial Drug Design”,
proferida durante o encontro - International Symposium on Drug Discovery and IX
National Meeting of Medicinal Chemistry Professors - na Faculdade de Ciências
Farmacêuticas da Universidade Estadual de São Paulo, Unesp, Araraquara, SP, Brasil,
24/07/2006.
2005 - Monitoria na disciplina de Tecnologia Químico-Farmacêutica I (FBT-0531), Estágio
supervisionado em docência do Programa de Aperfeiçoamento ao Ensino da
Universidade de São Paulo, USP, São Paulo, SP, 01/07-15/12/2005 (2o semestre de
2005).
2005 - Pós-graduação - Ministrou-se as aulas intituladas “Estatística e Quimiometria
empregadas em QSAR” e “Tópicos de Modelagem Molecular – Aplicação em
Otimização de Fármacos”, no curso de Otimização de Fármacos do Programa de pós-
graduação em Tecnologia Bioquímico-Farmacêutica da Faculdade de Ciências
Farmacêuticas da Universidade de São Paulo, FCF/USP, sob coordenação do Prof.
Associado Leoberto Costa Tavares, São Paulo, SP, 2o semestre de 2005.
2005 - Curso intitulado “Planejamento e Desenvolvimento de Fármacos”, com duração de 8
horas aula, proferido ao curso de farmácia da Universidade de Rio Preto, UNIRP, Rio
Preto, SP, 27/09/2005.
2003 - Palestras intituladas “QSAR este estranho” proferidas ao curso de Farmácia da
Universidade Anhembi Morumbi, São Paulo, 15 e 21/09/2003.
2001 - Docência Orientada - Ministrou-se a disciplina de Toxicologia Química (QMC 152), com
duração de 15 horas aula, para o curso de Química Industrial, UFSM, 1o Semestre.
FBT/FCF/USP 141
4. Experiência Profissional:
2005 - Estágio supervisionado em docência do Programa de Aperfeiçoamento ao Ensino
(PAE), Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo,
SP, 01/07-15/12/2005 (2o semestre de 2005).
1999 - Tecnologia de Alimentos – Conservas Oderich S.A., São Sebastião do Caí, RS, estágio
com duração de 480 horas.
1998 - Farmácia Hospitalar – Hospital da Brigada Militar, Santa Maria, RS, estágio com
duração de 120 horas.
1997 - Manipulação de medicamentos – Hospital Materno Infantil, São Luiz Gonzaga, RS,
estágio com duração de 90 horas.
5. Atividades extra-curriculares:
1998 - Organização de congresso - XXVIII CONEF/ I ENEF – Conselho Nacional das Entidades
Estudantis de Farmácia/ Fórum Estudantil Nacional sobre Ensino Farmacêutico –
UFSM, Santa Maria, RS.
1997 - Organização da VI Semana Acadêmica da Farmácia – Centro de Ciências da Saúde,
UFSM, Santa Maria, RS, 40 horas.
6. Prêmios e Titulações
2006 - Aprovação em primeiro lugar em concurso público para professor universitário,
disciplinas de Química Farmacêutica e Análises Toxicológicas, da Universidade
Estadual do Centro Oeste do Paraná – Unicentro, Campus Guarapuava, 12/2006.
2006 - Trabalho escolhido como melhor pôster de pós-graduação do departamento de
Farmácia , trabalho intitulado “Planejamento Molecular e Síntese de análogos do
Nitrofural com Atividade Antichagásica”, autores: TROSSINI, G.H.G., PAULA, F.R.,
FERREIRA, E.I., MENESES, C.M.S., (XI Semana Farmacêutica de Ciência e
Tecnologia da FCF/USP, São Paulo, SP, 13-20/10/2006).
7. Trabalhos apresentados em eventos científicos:
2006 - PAULA, F.R., JORGE, S. D., TAVARES, L. C., ALBUQUERQUE, C. N., Molecular
Modeling Studies and Structure-Activity Relationship of 2,3-pyridinedicarboxamide
Derivatives, 3rd Brazilian Symposium on Medicinal Chemistry, São Pedro, SP, 12-
15/11/2006.
2006 - GRALLERT, S.R., PAULA, F.R., PASSALAQUA, L. F. M., TAVARES, L.C., Studies of
Molecular Reactivity of Flavonoids, 3rd Brazilian Symposium on Medicinal Chemistry,
São Pedro, SP, 12-15/11/2006.
2006 - PAULA, F.R., TROSSINI, G.H.G., SERRANO, S.H.P., FERREIRA, E.I., MENESES,
C.M.S., TAVARES, L.C., Estudo químico-quântico de propriedades estereoeletrônicas
de derivados nitrocompostos com atividade antichagásica, XI Semana Farmacêutica de
Ciência e Tecnologia da FCF/USP, São Paulo, SP, 13-20/10/2006.
FBT/FCF/USP 142
2006 - GRALLERT, S.R., PAULA, F.R., PASSALAQUA, L. F. M., CALDEIRA, J.L., TAVARES,
L.C., Estudos de reatividade molecular da flavona, XI Semana Farmacêutica de Ciência
e Tecnologia da FCF/USP, São Paulo, SP, 13-20/10/2006.
2006 - TROSSINI, G.H.G., PAULA, F.R., FERREIRA, E.I., MENESES, C.M.S., Planejamento
Molecular e Síntese de análogos do Nitrofural com Atividade Antichagásica, 29a
Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química, Águas de Lindóia, SP, 20-
23/05/2006. (também apresentado na XI Semana Farmacêutica de Ciência e
Tecnologia da FCF/USP, São Paulo, SP, 13-20/10/2006).
2006 - PAULA, F.R., TROSSINI, G.H.G., SERRANO, S.H.P., FERREIRA, E.I., MENESES,
C.M.S., TAVARES, L.C., Estudo conformacional de derivados 5-nitro-heterocíclicos
com potencial atividade antichagásica, 29a Reunião Anual da Sociedade Brasileira de
Química, Águas de Lindóia, SP, 20-23/05/2006.
2005 - PAULA, F.R., JULIÃO, M.S.da S., TAVARES, L.C., SERRANO, S.H.P., Redução
Eletroquímica da 5-nitro-2-furfurilidênico 4-cloro-benzidrazida com Atividade
Antichagásica Utilizando Eletrodo de Diamante Dopado com Boro, X Semana
Farmacêutica de Ciência e Tecnologia da FCF/USP.
2005 - JULIÃO, M.S.da S., FERREIRA, E.I., PAULA, F.R., FERREIRA, N.G., SERRANO,
S.H.P., Determinação Voltamétrica de Nitrofurazona sobre Eletrodo de Diamante
Altamente Dopado com Boro Utilizando a Voltametria de Onda Quadrada, submetido
ao 13o Encontro Nacional de Química Analítica/ 1o Congresso Ibero-Americano de
Química Analítica, 12-16/10/2005.
2004 - PAULA, F.R., SERRANO, S.H.P., TAVARES, L.C., Influence of the physicochemical
properties on the reduction potential of the 5-nitro-heterocyclics with antichagasic
activity, 2nd Brazilian Symposium on Medicinal Chemistry, Rio de Janeiro, RJ, 22-
25/11/2004.
2004 - PAULA, F.R., SERRANO, S.H.P., TAVARES, L.C., Influência da distribuição eletrônica
sobre o potencial de redução de compostos 5-nitro-heterocíclicos com atividade
antichagásica, IX Semana Farmacêutica de Ciência e Tecnologia. XIX Seminário de
Pós Graduação, São Paulo, SP, 22-27/10/2004.
2004 - PAULA, F.R., TAVARES, L.C., SERRANO, S.H.P., Apresentação oral do trabalho
“Comportamento eletroquímico de Derivado 5-Nitro-2-tioflidênico-4-hidroxibenzidrazida
em meio aquoso” - XIV Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica –
Teresópolis, RJ, 08-12/08/2004.
2004 - PAULA, F.R., TAVARES, L.C., SERRANO, S.H.P., Avaliação do Potencial de Redução
de Nitroradical a partir de Derivado 5-Nitro-2-tioflidênico benzidrazida com Atividade
Antichagásica - 27o Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química/ XXVI
Congresso Latinoamericano de Química - Salvador, Ba, 30/05-02/06/2004.
FBT/FCF/USP 143
2002 - PAULA, F.R., SILVA, F.E.B., SANTOS, E.P., DRESSLER, V.L., FLORES, E.M.M.,
Determinação de Sb(III) por FI-HG-AAS em medicamentos injetáveis para tratamento
de leishmaniose – 25o Reunião Anual da Sociedade Brasileira de Química - Poços de
Caldas, MG, 20-23/05/2002.
2002 - SILVA, F.E.B., PAULA, F.R., SANTOS, E.P., BARIN, J.S., DRESSLER, V.L., FLORES,
E.M.M., Determinação de arsênio em medicamentos injetáveis contendo elevados
níveis de antimônio pentavelente – 25o Reunião Anual da Sociedade Brasileira de
Química - Poços de Caldas, MG, 20-23/05/2002.
2002 - FLORES, E.M.M., SILVA, F.E.B., PAULA, F.R., SANTOS, E.P., ROSSI, R.C., BARIN,
J.S., DRESSLER, V.L., Arsenic Determination in Samples of Injectable Drugs
Containing High Levels of Sb(V) - SEVENTH RIO SYMPOSIUM ON ATOMIC
SPECTROMETRY, Florianópolis, SC, 7-12/04/2002.
2001 - SANTOS, E.P., PAULA, F.R., SILVA, F.E.B., BARIN, J.S., DRESSLER, V.L., FLORES,
E.M.M., Avaliação de Procedimentos para a Determinação de Sb (III) em Amostras de
Medicamentos Antimoniais – 11o ENQA – Encontro Nacional de Química Analítica,
UNICAMP, Campinas, SP, 18-21/09/2001.
2001 - SANTOS, E.P., SILVA, F.E.B., PAULA, F.R., BARIN, J.S., FLORES, E.M.M.,
DRESSLER, V.L., BITTENCOURT, C.F., Determination of Sb (III) in Antimonial Drugs -
VI PHARMATECH/ III ENECQ, Recife, PE, 05-08/08/2001.
2001 - SANTOS, E.P., SILVA, F.E.B., PAULA, F.R., BARIN, J.S., FLORES, E.M.M.,
BITTENCOURT, C.F., Heavy Metals Determination in Meglumine Antimonate by
Instrumental Methods – VI PHARMATECH/ III ENECQ, Recife, PE, 05-08/08/2001
2001 - BARIN, J.S., KAECHER, L.E., PEDROSO, M.P., FLORES, E.L.M., PAULA, F.R.,
FLORES, E.M.M., Decomposição de Fígado Bovino em Minifrascos de Polipropileno
em Sistema Hermético e Determinação de Cd por GFAAS – 24o Reunião da Sociedade
Brasileira de Química - Poços de Caldas, MG, 28-31/05/2001.
8. Cursos:
2006 - Curso – Estratégias em Química Medicinal: planejamento, síntese e avaliação biológica
de novas substâncias bioativas, ministrado pelos Profs. Dr. Carlos Alberto Montanari
(IQSC), Adriano D. Andricopulo (IFSC-USP) e Luiz Carlos Dias (IQ-Unicamp), 29ª
RASBQ, Águas de Lindóia, SP, 19 - 22/05/2006.
2004 - Curso – Planejamento racional de fármacos: Métodos em quimio-e bioinformática,
ministrado pelos Profs. Dr. Adriano D. Andricopulo (IFSC-USP), Carlos Alberto
Montanari (UFMG) e Glaucius Oliva (IFSC-USP), 27ª RASBQ/XXVI CLAQ, Salvador,
Ba, 31/05-02/06/2004.
2003/2004 - Curso - New Approaches in Drug Design, ministrado pelo Prof. Dr. Hugo Kubinyi
(Basf - University of Heidelberg), IQ/USP, São Paulo, SP, 17-21/11/2003 e 16-
18/11/2004.
FBT/FCF/USP 144
2003 - Workshop - Técnicas de Amostragem na Indústria Farmacêutica, ministrado pelo Prof.
Dr. Humberto Zardo, FEBRAFARMA, São Paulo, SP, 20-21/03/2003.
2002 - Curso - Química de Medicamentos, ministrado pelo Prof. Dr. Eliezer J. Barreiro (UFRJ),
Santa Maria, RS, DQ/UFSM.
2002 - Curso - Hydride Generation Technique, ministrado pelo Prof. Dr. Jiri Dedina (Academy of
Sciences of Czech Republic), SQIA, UFSM, Santa Maria, RS, 15-17/04/2002.
2001 - Curso - Ultra-som e Aplicações em Química Analítica – (Teoria e Prática), ministrado
pelo Prof. Dr. Mauro Körn (Uneb), SQIA, UFSM, Santa Maria, RS, 16-18/10/2001.
2001 - Curso - Troca Iônica - Fundamentos e Aplicações Analíticas, ministrado pelo Prof. Dr.
João Alfredo Medeiros (UFRJ), SQIA, UFSM, Santa Maria, RS, 25-28/11/2001.
2000 - Curso de Biossensores, V Escola de Inverno em Físico-Química e Química Analítica –
UFSCar, São Carlos, SP, 03-08/08/2000.
1999 - Curso Teórico-Prático de Processo Cervejeiro e Produção de Refrigerantes, ministrado
pelo Eng. Quim. MSc Dilson Fronza, CT, UFSM, Santa Maria, RS, 48 horas.
1998 - Curso de Enzimologia – Curso de pós-graduação em Ciência e Tecnologia dos
Alimentos, ministrado pelo Prof. Dr. Raymon Pacovsky, CCR, UFSM, Santa Maria, RS,
30 horas.
1998 - Curso Manipulação Magistral, CCSH, UFSM, Santa Maria, RS, 17 horas.
9. Publicações científicas
- Determination of total arsenic by batch hydride generation atomic absorption spectrometry in
injectable drugs containing high levels of Sb(V) as N-methylglucamine antimoniate,
FLORES, E. M. M., SILVA, F. E. B. da, SANTOS, E. P., BARIN, J. S., PAULA, F. R.,
ZANELLA, R., DRESSLER, V. L., BITTENCOURT, C. S., Spectrochimica Acta Part
B, 57, 2002, p. 2095–2102, Holanda.
- Selective Determination of Sb(III) in Drugs by Flow Injection Hydride Generation AAS,
FLORES, E. M. M., PAULA, F. R., SILVA, F. E. B. da, MORAES, D. P., PANIZ, J. N.
G., SANTOS, E. P., DRESSLER, V. L., BITTENCOURT, C. S., Atomic Spectroscopy,
24 (1), 2003, p. 15-21, Estados Unidos.
- Capítulo de livro intitulado “Biological Electrochemical Applications on Diamond
Electrodes: Solving Old Problems and Oppening New Possibilities”, incluso no livro
“Electrochemistry of Biological Significance Compounds”, Editores Squella J.A., Bollo,
S., ISBN: 81-7895-205-X, Editora Transworld Research Network, Kerala, India, 2006,
Autores: SERRANO, S. H. P., Rita de Cássia Mendes de BARROS, R. C. M., JULIÃO,
M. S. S., PAULA, F. R., (02/2006).
- Regiospecific Synthesis of 5-trichloromethyl-1H-pyrazoles and carboxylic esters derivatives,
MOURA, S., FLORES, A. F. C., PAULA, F. R., MACHADO, P., PINTO, E., MARTINS,
M. A. P., Synlett, submetido, 2007.