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Introduzione alla Spettroscopia Introduzione alla Spettroscopia NMR 2D con GradientiNMR 2D con Gradienti

C.I.G.S. Modena9 Dicembre 2003

Dr. Francesca BenevelliBruker Biospin srl

[email protected]

Durante un esperimento 1D, la magnetizzazione viene PREPARATA, ad esempio con un impulso a 90ºSuccessivamente si procede alla DETECTION, durante la quale si raccoglie il FID

1Dpreparation detection

2Dpreparation detectionevolution

mixing

increment

In uno spettro 2D si introduce un’ulteriore fase, chiamata EVOLUTIONIn alcuni esperimenti (ad es. NOESY) un periodo di MIXING viene inserito tra EVOLUTION e DETECTION

Spettroscopia 2DSpettroscopia 2D

Quindi la magnetizzazione evolve in due “ambiti temporali”: evolution e detectionDa ciascuno, tramite FT, si estrae un diagramma nel dominio delle frequenze, cioè uno spettro 2D

COME?1. Eseguo una prima serie di FT lungo t2, creando F2 (2)2. Ogni spettro si distingue per un diverso evolution

time

1


3. Mettendo gli spettri, uno sopra l’altro, ogni picco è modulato, cioè cambia di intensità4. La modulazione dipende dall’evolution time.5. Una seconda serie di FT viene eseguita lungo t1, creando F1 (1)

Si ottiene così la seconda dimensione

N.B. Per spettri 3D o oltre, basta aggiungere piú evolution times

2


F2 = 1H F2 = X proprietá

ETER

O-

CO

RR

ELA

zZIO

NI

COLOC J long range

XHCORR J dirette

HMBCHMBC J long rangeJ long range

HSQCHSQC J diretteJ dirette

HMQCHMQC J diretteJ dirette

OM

O-

CO

RR

ELA

ZIO

NI

COSYCOSY J diretteJ dirette

COSYPSCOSYPS J diretteJ dirette

TOCSY Intero spin system

NOESYNOESY Dipolar couplingDipolar coupling

ROESY Dipolar coupling



Eterocorrelata J diretta (HSQC o HMQC)

ppm

6.5 6.0 5.5 5.0 4.5 4.0 3.5 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 ppm

150

140

130

120

110

100

90

80

70

60

50

40

30

20

10

ppm

4.04.14.24.34.44.5 ppm

72

74

76

78

80


Eterocorrelata J long range (HMBC)

ppm

5.555.605.655.705.755.805.85 ppm

71

72

73

74

75

76

77

78

79


Omocorrelata J diretta (COSY)

ppm

5.505.555.605.655.705.755.805.85 ppm

4.00

4.05

4.10

4.15

4.20

4.25

4.30

4.35

4.40


TOCSYppm

4.64.85.05.25.45.65.8 ppm

0.5

1.0

1.5

2.0

2.5

3.0

3.5

4.0

CH

Me2Me1


NOESY

ppm

2.72.82.93.03.13.23.33.43.53.63.73.8 ppm

4.7

4.8

4.9

5.0

5.1

5.2

5.3

5.4

5.5

N-CH3

CO-CH-N

Gradiente di B0 è un campo magnetico aggiuntivo (per esempio lungo l’asse z) la cui intensità dipende dalla posizione

Cos’è un gradiente?Cos’è un gradiente?

L’applicazione del gradiente rende la velocità di precessione dipendente dalla posizione del nucleo. L’effetto globale è una DEPHASING.


tzGitBBitzGBBiBti zcszcs eeMeMeM 00000

Il gradiente provoca la perdita di fase della magnetizzazione, che può essere rifocalizzata da un secondo gradiente.

Si comporta come una disomogeneità (T2).

xy

x

y

G1 G2

x

y

xy


La bobina di gradiente è immersa in un cilindro ceramico per che fa da supporto meccanico e da dissipatore

HardwareHardware

Il generatore di corrente è una scheda del BSMS, che eroga fina a 10A. Il gradiente totale risultante è dell’ordine dei 50G/cm

HardwareHardware

I gradienti possono operare da soli o in coppia

Un gradiente si caratterizza per • forma• intensità • durata


Gk

p16

S

d16

• Intensità del gradiente (Gk). E’ il valore massimo che

assume l’impulso di gradiente

• Durata del gradiente: p16. In alta risoluzione si usa

1ms – 1.5ms

• Gradient stabilization delay: d16=100usec

• Forma del gradiente (S). Di solito sine.100

1 ze2 d13 p1 ph1 d0 50u UNBLKGRAD p16:gp1 d16 p0 ph2 d13 p16:gp2 d16 4u BLKGRAD go=2 ph31 d1 wr #0 if #0 id0 zd lo to 3 times td1exit

ph1=0 2ph2=0 0 2 2ph31=0 2

Sintassi dei gradientiSintassi dei gradienti

NELLA SINTASSI GP I GRADIENTI SONO TRATTATI COME IMPULSI

In spettroscopia i gradienti di campo hanno

varie funzioni:

1. Imaging2. Distruggere magnetizzazioni non

desiderate (spoil gradient)3. Sopprimere segnali indesiderati4. Selezionare dei cammini di

coerenza5. Misurare coefficienti di diffusione

A cosa serve il gradiente?A cosa serve il gradiente?

Posso acquisire un FID con il gradiente accesso:

L’acquisizione in presenza di gradiente fa si chela velocità di precessione (e quindi la frequenzaa cui viene acquisito il segnale) dipendono dallaposizione: imaging.Questa procedura si usa anche per il gradshim.

1H

G

ImagingImaging

Si applica, per esempio nel NOESY.

1H

G

t1 Mixing time

Durante il mixing time del NOESY, la magnetizzazione “utile” è lungo z. Tutto ciò che è rimasto sul piano trasversaleva eliminato o con cicli di fase oppure con gradienti.

Gli spoil gradient lavorano “da soli” e l’unica esigenza che devono soddisfare è di essere sufficientemente intensi da eliminare le coerenze indesiderate.

Gradienti di SpoilGradienti di Spoil

Si possono eliminare in modo molto efficiente segnali indesiderati, come ad esempio quello del solvente.

Il gradiente rifocalizza solo i segnali che hanno subito l’echo: gli altri vengono ulteriormente defocalizzati. (ZGESGP)

In questo esperimento i gradienti lavorano in coppia.

1H

G18090 180

Eliminazione di picchi indesideratiEliminazione di picchi indesiderati

Eliminazione di picchi indesiderati: es Eliminazione di picchi indesiderati: es e wge wg

Nell’excitation sculpting l’impulso sagomato è un 180° di solito SQUA100.1000, di durata 2 ms. La potenza viene calcolata con l’au-program PULSE.

Altre sequenze con i gradienti sono P3919GP e ZGGPWG. Utilizzano entrambe la tecnica watergate, ma P3919GP usa impulsi hard per la selezione del picco mentre ZGGPWG usa impulsi sagomati.

P3919GP: d19=1/SW; p27=p0=p1; pl18=pl1

ZGGPWG: shape scelta in base a selettività

Le COERENZE assieme alle popolazione dei singoli livelli energetici quantizzati descivono completamente un sistema di spin.COERENZA si verifica quando piú spin si muovono all’unisono, con la stessa fase.Per esempio:

• Dopo un ’impulso di 90°, la parte polarizzata degli spin si muove all’unisono nel moto di precessione. E’ questo “moto coerente” che ci permette di osservare la FID

• L’energia fra spin che si muovono all’unisono e spin defocalizzati è quasi la stessa. In un caso (a) ho coerenza, nell’altro (b) no

(a) (b)

Selezione di coerenzeSelezione di coerenze

I gradienti sono alternativi ai cicli di fase.

Quando ci sono più spin accoppiati, questo modello non è sufficiente a descrivere tutto

Coerenze a più spinCoerenze a più spin

E

SISISISI

SISISISI

SI

SSS

III

yyxyyxxx

yzxzzyzx

zz

zyx

zyx

coerenze osservabili

popolazioni

single quantum

double quantum

Impulsi di 90° eccitano tutti gli ordini di coerenza accessibili al sistema di spin.

Impulsi di 180° invertono p in –p.

0-1-2-3

+1+2+3

90° 180° 90°

Ordini di Coerenza “p” e impulsiOrdini di Coerenza “p” e impulsi

t1 t2

zx

ySJIy

zy

xSJIx

BIx

SI

II

SI

II

Izz

zz

zz

2

2

2

2

)( 0

yz

SIzy SISI xx 22 90

y

xIx

yz

SJIyz

S

SS

SI

SIz

zz

2

2

90° 90°

COSYCOSY

x

SIyz

SIzy

SIx SSISII zzyyzz 22 90

+1

-1 Rec.

+1

-1 Rec.

Echo

Antiecho

COSY con i gradientiCOSY con i gradienti

Durante l’applicazione del gradiente evolve anche il chemical shift. Per non avere distorsioni la fase inserisco un impulso di rifocalizzazione di180 gradi.

Evoluzione del chemical shift durante il Evoluzione del chemical shift durante il gradientegradiente

x

SIyz

SIyx

SIzx

SIx SSISISII zzyyyyzz 222 9090

+1

-1 Rec.

+2

-2

COSYDQFCOSYDQF

Per il cammino di coerenza selezionato si deve verificare che l’effetto

totale dei gradienti sia nullo durante l’intero esperimento. In pratica:

Eexpt=0

E=G n(n pn)

Per esempio: COSYDQF, G1=10, G2=20

-1 Rec.

+2

E1=10 (H*2)

E2=20 (H*(-1))Eexpt=0

Gradienti e NMRGradienti e NMR

• Parto da magnetizzazione H: robusta, più nuclei polarizzati• Trasferisco la magnetizzazione H al nucleo X, via accoppiamento J (INEPT e simili)• Evoluzione in X• ritrasferisco la magnetizzazione ad H, per sfruttare la maggiore sensibilità del nucleo 1H• Detection su H

Vantaggi:Parto da magnetizzazione “robusta” (H)Detection su 1H, più sensibile

Svantaggi:Devo eliminare tutto il segnale 1H non accoppiato a C13.

Sono richieste caratteristiche strumentali ottimali (impulsi esatti, strumentazione stabile).

Strategia dell’esperimento inversoStrategia dell’esperimento inverso

INEPT e HSQC (heteronuclear single quantum INEPT e HSQC (heteronuclear single quantum coherence)coherence)

Decoupling

I

S t1

1H 13C

inept

13C 1H

retro-inept

t1 t2

x

zA

(90x)I

x

y

zB

free precession = 1/4JIS

Iz

Iy

C (180x)I(180x)S

x

zD

y

z

x

y

free precession = 1/4J IS

Sz

(90y)I

x

z

y

x

zE

y-2IxSz (Ix antiphasemagnetization)

Gacquire on Nor C channel

1/ 2 [-Iy - 2IxSz]

(90x)S

-2IzSy (Sy antiphasemagnetization)

Sz

1/ 2 [Iy + 2IxSz](I _ JIS) t1+

HSQC (heteronuclear single quantum coherence)HSQC (heteronuclear single quantum coherence)

yzzxSIJ

yz SISIIISx

Iyzz

Ix 22 9090290

10cos22 0 tSISI yzI

yzz

xSJI

zyyz ISISI zzSx

Ix 29090 22

HSQC (heteronuclear single quantum coherence)HSQC (heteronuclear single quantum coherence)

1H

13C

xJ

zyyzzyJ

y ISISISII SISI 222 ,, 9090

1H

13C

Per ottenere spettri 2D phase sensitive si possono usare varie metodologie (States, TPPI, States-TPPI, etc.).

Per esperimenti eteronucleari inversi di solito si usa echo-antiecho, in cui si selezionano alternativamente i cammini echo o antiecho in t1.

Quadrature detection inn F1: echo-entiechoQuadrature detection inn F1: echo-entiecho

assorbimentodispersione

“misto” magnitude

HSQCsi (sensitive improved)HSQCsi (sensitive improved)

xxJ

xxxzt

yJ

zxyzt

zyJ

ySISISI

ISISISII

SI

SI

222

222

,

,

901

901

1H

13C

yJ

zxxx ISISI ISy

22 90

HMQC (heteronuclear multi-quantum coherence)HMQC (heteronuclear multi-quantum coherence)

ySJI

zxyx ISISI zzSx 290 22

Decouplet1

yxzxSJI

yz SISIIISxzz

Ix 22 90290

xx

yxtIyx SI

SISI z

2

22 1

HMQC con gradienti- QFHMQC con gradienti- QF

xJ

zxyxzxJ

y ISISISII SS 222 9090

1H

1H

13C

13C

• Ricostruisco le connettività

• Trovo J piccole (debole accoppiamento): tempi lunghi per il trasferimento di coerenza (10/100ms)

• Non disaccoppio: ottengo infos sulla J long range

• Non disaccoppio: i picchi sono sfasati spettro magnitude

• Filtro via (se voglio) le connettività short range

Allungo il raggio di azione: eterocorrelate long Allungo il raggio di azione: eterocorrelate long rangerange

Il primo 90° 13C crea 2Q J diretta, che viene cancellata con cicli di fase.

HMBC (heteronuclear multi-bond correlation)HMBC (heteronuclear multi-bond correlation)

COSY: cosygpqf cosygpmfqf

HSQC: hsqcetgpsi hsqcedetgp

HSQC-TOCSY: hsqcdietgpsi

HMBC: hmbcgpqf

Per l’esecuzione si può sempre usare RPAR

Esperimenti tipiciEsperimenti tipici

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