invalidation du gène tph1 chez la souris

Invalidation du gène Invalidation du gène Tph1 Tph1 chez la sourischez la souris

Rôle de la sérotonine circulante et implication de la sérotonine maternelle dans la fonction cardiaque.

Cécile FLIGNY – 14 JUIN 2007

La découverte de la sérotonineLa découverte de la sérotonine

Erspamer & Vialli, 1937 Une substance isolée de la muqueuse gastrique provoque des contractions des

muscles lisses: elle est nommée entéramine.

Rapport et coll., 1948 Une substance présente dans le sang provoque la contraction des vaisseaux:

elle est appelée sérotonine.

Erspamer & Asero, 1952 Entéramine et sérotonine sont une seule et même substance.

Twarog & Page, 1954 La sérotonine est un neurotransmetteur dans le cerveau des mollusques et est

présente dans le cerveau des mammifères.

La sérotonine: fonctions biologiquesLa sérotonine: fonctions biologiques Système nerveux central

thermorégulation nociception mémoire et apprentissage cycle veille/sommeil

comportement sexuel/maternel prise alimentaire humeur

contractilité cardiaque tonus vasculaire

Système cardiovasculaire Système sanguin fonction des lymphocytes hémostase

Système gastro-intestinal

péristaltisme

Développement embryonnaire différenciation neuronale synaptogenèse division cellulaire morphogène développement cardiaque

La sérotonine: pathologies associéesLa sérotonine: pathologies associées

Système nerveux central schizophrénie douleur anxiété dépression

comportements suicidaires agressivité migraine alcoolisme

hypertension artérielle systémique et pulmonaire cardiopathie hypertrophique cardiopathie dilatée

Système cardiovasculaire Système sanguin asthme thrombose

Système gastro-intestinal tumeurs carcinoïdes syndrome du colon irritable

Développement embryonnaire retard de croissance

Les acteurs du système 5-HTLes acteurs du système 5-HT1/ des récepteurs spécifiques1/ des récepteurs spécifiques

15 récepteurs 5-HT différents, répartis en 7 classes.

5-HTNa+

Na+R.à 7 domaines transmembranaires

R. canaux (5-HT3)

Signalisation intracellulaire

Récepteurs à 7 domaines transmembranaires couplés aux protéines G, à l’exception du récepteur 5-HT3.

Expression dépendante de l’organe et de l’espèce considérés.

Les récepteurs de la classe 2 sont spécialement impliqués dans la régulation des fonctions cardiaques chez la souris.

Les acteurs du système 5-HTLes acteurs du système 5-HT2/ des mécanismes d’inactivation2/ des mécanismes d’inactivation

Na+

Na+R. à 7 domaines transmembranaires

R. canaux (5-HT3)


Un mécanisme de recapture: Le transporteur de haute affinité SERT

SERT

5-HT

5-HT

R. 5-HT

5-HT

Recapture

Ext.

Int.

Les acteurs du système 5-HTLes acteurs du système 5-HT2/ des mécanismes d’inactivation2/ des mécanismes d’inactivation

Na+

Na+R. à 7 domaines transmembranaires

R. canaux (5-HT3)

SERT

5-HT

5-HT

R. 5-HT

5-HT


Recapture

5-HT

Un mécanisme de dégradation: La monoamine oxydase MAO

5-HIAA

MAO

VMAT

Les acteurs du système 5-HTLes acteurs du système 5-HT3/ une enzyme de synthèse limitante: la TPH3/ une enzyme de synthèse limitante: la TPH

Enzyme limitante de la voie de biosynthèse de la 5-HT

tryptophane

Décarboxylase des aa

aromatiques

5-hydroxytryptamineSÉROTONINE

noyaux du raphé

neurones myentériques cellules entérochromaffines

Mélatonine

glande pinéale

5-hydroxytryptophane5-HTP

Tryptophane hydroxylase

Inactivation du gène Inactivation du gène TphTph chez la souris chez la souris

locus Tph endogène

locus Tph muté

Vecteur de ciblage

Stratégie de « knock-in »

Les souris Tph-/-(+/-) sont viables

♂ Tph1+/- x ♀ Tph1+/-

Deux gènes Deux gènes TphTph……

glande pinéale

***

neurones myentériques cellules entérochromaffines

***

Effondrement du taux de 5-HT.

Tph2 noyaux du raphé

Taux de 5-HT normal.

2 gènes Tph

Lieux d’expression des gènes Lieux d’expression des gènes TphTph

65% d’identité

TPH2 4 5 6 7 8 9 10 11

TPH1

Domaine catalytique83% d’identité

Domaine de régulationet d’interaction

1 2 3

4 5 6 7 8 9 10 112 3

Région 3’ non traduite

Biosynthèse de 5-HT

TPH1 non neuronaleGlande pinéaleCellules entérochromaffines

TPH2 neuronale Neurones 5-HT du raphéNeurones myentériques

90%

5%

5%

Souris invalidées pour le gène Tph1

Temps d’expression des gènes Temps d’expression des gènes TphTph

SNC Tph2 E10.5

intestins

Tph1 E14.5

Naissance2.5 4.5 6.5 8.5 10.5 12.5 14.5 16.5 18.50.5

Sérotonine de l’embryon

glande pinéale

Tph1CE

E15.5

Tph2 E12.5

NM

En résumé …En résumé …

parents

adultes

100% de survieSouris viables

Tph1-/-(+/-)

3-15%

50%

Tph1+/-

***

***

***

3%

15%

Conséquences du faible taux Conséquences du faible taux de 5-HT circulante?de 5-HT circulante?

Problèmes cardiaques

Faible taux de 5-HT circulante

Tph1-/-(+/-)

3-15%

dysfonctionnement?

La cathéterisation de conductanceLa cathéterisation de conductance

Volume

Pression

remplissage

contraction

éjection

relaxation

Volume

Pression

Courbe de fonction ventriculaire gauche

= contractilité

Insuffisance cardiaque

Le phénotype cardiaque Le phénotype cardiaque est hétérogèneest hétérogène

Phase de compensation

Tph1-/-(+/-)

3-15%

Tph1+/+

Tph1-/-

Souris 273

Phase de décompensationTph1-/-

Souris 296

Le phénotype cardiaque Le phénotype cardiaque est hétérogèneest hétérogèneTph1-/-(+/-)

3-15%

n=30n=7n=30n=7

Conclusion (1)Conclusion (1)

parents

adultes


Tph1-/-(+/-)

3-15%

50%

Tph1+/-Diminution contractilité cardiaque

Insuffisance cardiaque

Hétérogénéité importante

Origine de l’hétérogénéité du Origine de l’hétérogénéité du phénotype cardiaque?phénotype cardiaque?Tph1-/-(+/-)

3-15%

Le stress, un facteur aggravant de la cardiopathie? exacerbation du phénotype cardiaque en période de stress

Le taux individuel de 5-HT, prédicateur de la sévérité du phénotype cardiaque?

Le stress, facteur aggravant Le stress, facteur aggravant de la cardiopathie?de la cardiopathie?Tph1-/-(+/-)

3-15%

Protocoles envisageables: Exercice physique (marche forcée, nage). Une stimulation adrénergique.

Protocole expérimental choisi: Test pharmacologique d’effort avec la dobutamine.

dobutamine Catécholamine de synthèseAgoniste 1-adrénergique

Inotrope + ( force de contraction)Bathmotrope + ( conduction)Chronotrope + ( fréquence)

Aucune réserve contractile Aucune réserve contractile cardiaque…cardiaque…Tph1-/-(+/-)

3-15%

Surv

ie (m

in)

Souris Tph1-/-(+/-)non sensibles sensibles

Souris contrôles

Survie moyenne des souris Tph1-/-

(+/-) après dobutamine:

11.4 ± 2.8 min.

Souris Tph1-/-

Non sensibles

Souris Tph1-/-

sensibles

Modification de la signalisationModification de la signalisation 5-HT cardiaque 5-HT cardiaqueTph1-/-(+/-)

3-15%

Étude de liaison des récepteurs -adrénergiques cardiaques

Tph1+/+ Tph1-/-

Kd (nmol/l) 0.03 ± 0.00 0.045 ± 0.02

Bmax (fmol/mg prot.) 39.66 ± 2.24 42.42 ± 3.08

β1/β 2 (%) 51 ± 49 52 ± 48

Tph1+/+ Tph1-/-

5-HT2A (fmol/mg prot.) 67 51

5-HT2B (fmol/mg prot.) 107 211

SERT (fmol/mg prot.) 13 57

Ø modification de la signalisation -AR.

Étude de liaison des récepteurs 5-HT cardiaques

x 2

néoexpression


parents

adultes


Tph1-/-(+/-)

3-15%

50%

Tph1+/- Absence de réserve contractile cardiaque

Hétérogénéité importante

stress, facteur aggravant de la cardiopathie

5-HT2B

SERT

Diminution contractilité cardiaqueInsuffisance cardiaque

Taux individuel de 5-HT, Taux individuel de 5-HT, prédicateur de la cardiopathie?prédicateur de la cardiopathie?Tph1-/-(+/-)

3-15%

Protocole expérimental: Mesure des paramètres cardiaques de chaque animal par échocardiographie. Détermination des taux individuels de sérotonine circulante.

Contrainte: Analyser un nombre important d’animaux .

Analyse des souris Tph1-/- issues de mères Tph1-/-.

Générer un nombre important d’animaux mutés dans une même portée Diminuer l’hétérogénéité entre les individus d’une même portée.

Seuls 20% des souris Seuls 20% des souris Tph1Tph1-/--/-(-/-) (-/-) survivent !survivent !

parents

adultes


Tph1-/-(+/-)

3-15%

50%

Tph1+/-

5-HT2B

SERT Tph1-/-(-/-)

Tph1-/-(+/-)

3-15%

Tph1-/-(-/-)

Diminution contractilité cardiaqueInsuffisance cardiaqueStress aggrave la cardiopathie

Très peu de naissance

20% de survie

Conséquences du faible taux de Conséquences du faible taux de 5-HT maternelle?5-HT maternelle?

Génotype maternel

Génotype paternel

Nombre de croisements

Génotype des embryons% d’embryons

petits / malformés+/+ +/- -/-

+/+

+/+ 3 28 - - 3.6

+/- 1 4 6 - 0

-/- 2 - 27 - 3.7

+/-

+/+ 1 6 4 - 0

+/- 4 11 24 10 6.7

-/- 2 - 4 3 0

-/-

+/+ 3 - 10 80

+/- 2 - 9 9 88.9

-/- 2 - - 15 86.7

malformations létales à ~E12

Tph1-/-(-/-)

Tph1+/+(+/+) Tph1+/+(+/-)Tph1-/-(-/-) Tph1+/-(-/-)

La 5-HT maternelle est indispensable pour le développement embryonnaire normal.

Embryons normaux

Seuls 20% des souris Seuls 20% des souris Tph1Tph1-/--/-(-/-) (-/-) survivent !survivent !

parents

adultes


Tph1-/-(+/-)

3-15%

50%

Tph1+/-

5-HT2B

SERT Tph1-/-(-/-)

Tph1-/-(+/-)

3-15%

??


Très peu de naissance

20% de survie

Tph1-/-(-/-)

??

Quel phénotype cardiaque?Quel phénotype cardiaque?

Tph1+/+ Tph1-/-(+/-) Tph1-/-(-/-)2 mois 5 mois 5 mois 2 mois 5 mois

PPVGd (cm) 0.07 ± 0.01 0.07 ± 0.01 0.08 ± 0.01 0.07 ± 0.01 0.06 ± 0.01 Ұ

PPVGs (cm) 0.10 ± 0.01 0.10 ± 0.01 0.11 ± 0.01 0.10 ± 0.02 0.07 ± 0.01 *** Ұ Ұ Ұ

Sd (cm) 0.08 ± 0.01 0.08 ± 0.01 0.08 ± 0.01 0.08 ± 0.01 0.07 ± 0.01

Ss (cm) 0.10 ± 0.01 0.10 ± 0.01 0.11 ± 0.01 0.11 ± 0.01 0.08 ± 0.01 * Ұ Ұ

DIVGd (cm) 0.41 ± 0.01 0.42 ± 0.01 0.41 ± 0.04 0.43 ± 0.05 0.48 ± 0.05 ** Ұ

DIVGs (cm) 0.25 ± 0.01 0.25 ± 0.03 0.25 ± 0.05 0.29 ± 0.04 0.35 ± 0.05 ** Ұ

Longueur VG (cm) 0.82 ± 0.03 0.80 ± 0.06 0.77 ± 0.07 0.86 ± 0.07 0.84 ± 0.05

Echocardiographie sur des souris âgées de 2 à 5 mois: données anatomiques.

Signes anatomiques de cardiopathie dilatée (CMD). Se développe entre 2 et 5 mois.

Tph1-/-(-/-)

??

Ø signe anatomique de cardiopathie à 2 mois.


Echocardiographie sur des souris âgées de 2 à 5 mois: données fonctionnelles.

Signes fonctionnels de CMD:• FS (index de contractilité)

5 mois

FS (%

)

FC (b

pm)

2 mois

Tph1-/-(-/-)

??


Mesure des marqueurs plasmatiques précoces d’insuffisance cardiaque.

5 mois

Tph1-/-(-/-)

??

BN

P (p

g/m

l)

CK

-MB

(µg/

l)

Trop

onin

e Ic

(ng/

ml)

Influence du génotype maternel

Augmentation plus importante chez les Tph1-/-(-/-).

Augmentation des marqueurs précoces d’IC chez les Tph1-/-(+/-)

Les souris Tph1-/-(+/-) développent une cardiopathie à un âge plus avancé


parents

adultes


Tph1-/-(+/-)

3-15%

50%

Tph1+/-

5-HT2B

SERT Tph1-/-(-/-)

Tph1-/-(+/-)

3-15%

??

20% de survieTrès peu de naissance


Augmentation ± des marqueurs d’IC

Augmentation +++ des marqueurs d’IC

Cardiopathie dilatée

La sérotonine circulanteLa sérotonine circulante

5-HT

99% plaquettes sanguines

1% plasma

Neuronesmyentériques

(TPH2)

Cellulesentérochromaffines

(TPH1)

90% de la sérotonine circulante est synthétisée dans les cellules entérochromaffines par la TPH1.

Taux de sérotonine plaquettaire?Taux de sérotonine plaquettaire?Tph1-/-(-/-)

??

> 99% de la sérotonine circulante stockée dans les plaquettes sanguines.

5 mois

Pas de corrélation entre la sévérité de la cardiopathie et le

taux de 5-HT plaquettaire.

5-H

T sa

ng to

tal (

µM)

Même taux de 5-HT entre les souris Tph1-/-(+/-) et Tph1-/-

(-/-).

Taux de sérotonine plasmatique?Taux de sérotonine plasmatique?Tph1-/-(-/-)

??

< 1% de la sérotonine localisée dans le plasma sanguin.

5 mois

5-H

T pl

asm

a (n

M)

Taux de 5-HT plasmatiques significativement diminués entre les Tph1-/-(+/-) et -/-(-/-).

Corrélation 5-HT / cardiopathie?Corrélation 5-HT / cardiopathie?Tph1-/-(-/-)

??

5-HT plasma

BN

P corrélation inverse entre la sévérité de la cardiopathie et le taux de 5-HT plasmatique.

La sérotonine active pour la régulation de la fonction cardiaque est localisée dans le compartiment plasmatique sanguin.


parents

adultes


Tph1-/-(+/-)

3-15%41%

50%

Tph1+/-

5-HT2B

SERT Tph1-/-(-/-)

Tph1-/-(+/-)

3-15%

20% de survieTrès peu de naissance

Diminution contractilité cardiaqueInsuffisance cardiaqueStress aggrave la cardiopathie Augmentation ± des marqueurs d’IC

Cardiopathie dilatéeAugmentation +++ des marqueurs d’IC

corrélation inverse entre la sévérité de la cardiopathie et le taux de 5-HT plasmatique.

Le génotype maternel influence le taux de 5-HT plasmatique

3-15%20%

Le génotype maternel réguleLe génotype maternel régule le taux de 5-HT plasmatique? le taux de 5-HT plasmatique?

Naissance2.5 4.5 6.5 8.5 10.5 12.5 14.5 16.5 18.50.5

Sérotonine de l’embryon

Sérotonine maternelle

Tph2

Tph1

E10.5

Tph1

Tph2

E14.5

E15.5

E12.5

5-HT2B SERT

diminution de la production de 5-HT dans les intestins des souris Tph1-/-(-/-)? augmentation du catabolisme de la 5-HT?

Peu probable car la concentration plaquettaire de 5-HT est la même entre les groupes de souris Tph1-/-.

modification du nombre, de la fonction (capture de 5-HT, capacité de dégranulation) et/ou de la structure (capacité de stockage de la 5-HT) des plaquettes?

La 5-HT maternelle régule La 5-HT maternelle régule le taux de 5-HT plasmatique?le taux de 5-HT plasmatique?Tph1-/-(-/-)

Les plaquettes sanguinesLes plaquettes sanguinesTph1-/-(-/-)

20%

•Diminution du nombre de plaquettes en fonction du génotype maternel .

5 mois

Plaq

uette

s (1

03 /µl)

Nombre de plaquettes sanguines.

La sérotonine maternelle régule le nombre de plaquettes sanguines

… … une première piste?une première piste?

Plaquettes sanguines

mégacaryocytes proplaquettes plaquettes

Réarrangement

du cytosquelette

Réarrangement

du cytosquelette

5-HT2A

SERT

5-HT2A?

5-HT2B?

SERT

5-HT2B

SERT

5-HT

Sérotonine

L’implication des petites protéines G?L’implication des petites protéines G?

cardiomyocytes adultes

5-HT2B x 2

5-HT

SERT x 5

mégacaryocytes

5-HT

5-HT2B SERT

Maintien du phénotype 5-HT foetal

Réarrangement anormal du cytosquelette

Formation anormale du cytosquelette

activation petites protéines G (RhoA?)

contractilité

cardiomyocytes

maturation

Mégacaryocytes / proplaquettes

sérotonine maternelle

Études épidémiologiques Environnement maternel

AutismeMaladies psychiatriquesDiabèteObésite…

invalidation du gène tph1 chez la souris

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