1

Investeşte în oameni !

FONDUL SOCIAL EUROPEAN

Programul Operaţional Sectorial Dezvoltarea Resurselor Umane 2007 – 2013

Axa prioritară 1

„Educaţia şi formarea profesională în sprijinul creşterii economice şi

dezvoltării societăţii bazate pe cunoaştere”

Domeniul major de intervenţie 1.5

„Programe doctorale şi postdoctorale în sprijinul cercetării”

Titlul proiectului

"Dezvoltarea şcolilor doctorale prin acordarea de burse tinerilor doctoranzi

cu frecvenţă"

Contract nr: POSDRU/88/1.5/S/52826

Beneficiar

Universitatea de Medicină şi Farmacie din Craiova

2

UNIVERSITATEA DE MEDICINĂ ȘI FARMACIE

CRAIOVA

EVALUAREA EXPRESIEI

GENELOR TGF-β1, TGF-β2 ȘI SOCS3 ÎN

INFECȚIA CRONICĂ CU

VIRUSUL HEPATITIC C

TEZĂ DE DOCTORAT

Rezumat

Conducator Științific,

PROF. UNIV. DR. MIHAI CRUCE

Doctorand,

CIOBOATĂ ELENA

Craiova, 2012

3

INTRODUCERE

De la identificare, în 1989, infecția cu virusul hepatitic C (VHC) a fost

recunoscută ca o problemă majoră de sănătate la nivel mondial. Infecția cu VHC

afectează actual ~ 150 de milioane locuitori în SUA și Europa, circa 85% din ei

dezvoltând infecție cronică exprimată ca hepatită cronică, ciroză hepatică (20- 30%) sau

carcinom hepatocelular (1-4%). O estimare la nivelul populației României ar duce la

ideea unui număr de 1 milion de persoane infectate cu virus hepatitic C.

Tratamentul actual, precum şi criteriile de selecţie ale pacienţilor sunt clar

standardizate prin ghiduri de tratament alcătuite în urma rezultatelor trialurilor clinice. Cu

toate acestea, răspunsul virusologic susţinut se obţine doar la aproximativ jumătate dintre

pacienţii incluşi în tratament. Principala provocare pentru viitor este îmbunătățirea ratei

de success a terapiei la pacienții dificil de tratat și la pacienții non-responsivi cu VHC

genotip 1. În timp ce pacienții cu VHC genotip 2 și 3 pot fi vindecați în mai mult de 75%

din cazuri, la pacienții VHC genotip 1 rămâne o rată de RVS încă nesatisfăcătoare, de 40-

50%.

Ne propunem în acest proiect integrarea datelor clinice, histologice şi genetice

cu scopul identificării unor noi factori predictivi ai răspunsului la tratament, în vederea

ajustării criteriilor de selecţie a pacienţilor care vor primi terapie antivirală, pentru

creşterea ratei răspunsului la tratament şi scăderea costurilor economice pe care le

implică terapia antivirală.

4

PARTEA I – STADIUL CUNOAȘTERII

CAPITOLUL 1: Prevalența, factorii de risc și modalitățile de transmitere ale

virusului hepatitic C prezintă considerațiile generale asupra prevalenței virusului

hepatitic C, atât la nivel mondial cât si la nivel national, si asupra factorilor de risc si a

modalitatilor de transmitere ale virusului hepatitic C.

CAPITOLUL 2: Structura virusului hepatitic C, patogenia hepatitei cronice

cu virusul C și tratamentul actual al bolii descrie in prima parte structura virusului

hepatitic C si organizarea lui genomica. Urmeaza o clasificare a factorilor legati de virus,

legati de gazda sau externi ce pot avea impact asupra progresiei hepatitei cronice tip C. In

a treia parte a capitolului sunt descrise mecanismele moleculare implicate in patogenia

infectiei cu VHC. Capitolul se incheie cu descrierea tratamentului actual al hepatitei cu

virus C atat in forma acuta cat si in cea cronica, facand referire si la aderenta la tratament

a pacientilor, durata optima a tratamentului in functie de genotipul VHC, si asupra

reactiilor adverse si a complicatiilor in urma terapiei antivirale.

CAPITOLUL 3: Mecanisme celulare si moleculare ale fibrozei și steatozei în

hepatita cronică cu virus C pune accent in prima parte pe activarea si proliferarea

celulelor stelate hepatice. Urmeaza o descriere a metodelor invazive si non-invazive

folosite in diagnosticul paraclinic al fibrozei hepatice

CAPITOLUL 4: Gene implicate în infecția croincă cu virus hepatitic C -

descrie genele TGF-β1, TGF-β2 si SOCS3, precum si mecanismele lor moleculare de

actiune implicate intr-o varietate de procese fiziologice si patologice.

PARTEA A II-A - CONRIBUȚII PERSONALE

CAPITOLUL 5

5.1. Scopul și obiectivele studiului

Scopul studiului a constat în analiza nivelurilor expresiei unor gene implicate

în rezistenţa la interferon în infecţia cronică cu virusul hepatitic C şi a receptorilor

acestora la nivelul ţesutului hepatic.

Atingerea scopului studiului s-a realizat prin indeplinirea obiectivelor

reprezentate de stabilirea potenţialelor corelaţii între expresia genelor SOCS3, TGF β-

1 şi TGF β-2 şi:

5

caracteristicile demografice (rasa, vârsta, sexul, greutatea corporală,

durata infecţiei, consumul de alcool şi/sau de droguri),

caracteristicile histologice (gradul de activitate necroinflamatorie, stadiu

fibrozei hepatice, prezenţa steatozei hepatice),

caracteristicile virusologice (nivelul incărcăturii virale, genotipul VHC),

parametrii biochimici (nivelul aminotransferazelor)

răspunsul la tratament.

5.2. Material și metode

Includerea pacienţilor în studiu.

Probele de țesut hepatic folosite pentru analiza comparativa a expresiei genice

au fost obținute de la 53 pacienți cu infecție cronică cu VHC prin puncție biopsie

hepatică (PBH) sub control ecografic, in Spitalul Clinic de Urgenta Craiova – Clinica

medicala I si in Spitalul Clinic de Boli Infecţioase şi Pneumoftiziologie „Victor Babeş“

Craiova – Clinica de Boli Infectioase I. Probele de sânge au fost recoltate în vacutainer

fără anticoagulant, iar serul a fost folosit pentru cuantificarea ARN VHC. Nici unul

dintre pacienți nu a prezentat coinfecție cu alte virusuri hepatice (tip A, B, D sau E)

sau suprainfecție cu HIV.

Compararea analizei expresiei genice s-a realizat cu fragmente de țesut hepatic,

folosite drept probe control, obținute de la 37 pacienți fără infecție cronică cu VHC și

fără activitate necroinflamatorie sau modificări ale arhitecturii hepatice. Probele au fost

recoltate in Spitalul Clinic de Urgenta Craiova - Clinica Chirugie I si Chirurgie II.

Studiul histopatologic s-a realizat pe preparate histologice, în cadrul

Departamentului de Anatomopatologie al Spitalului Clinic Județean de Urgență

Craiova. Fragmentele de biopsie hepatică au fost prelucrate urmărind următoarele

etape:

a) Fixarea;

b) Includerea la parafină a respectat următorii timpi:

- Deshidratarea

- Clarificarea

- Parafinarea

- Includerea propriu-zisă

- Secționarea blocului de parafină

- Lipirea secțiunilor pe lama de sticlă și uscarea lor

6

Extracția ARN-ului total din țesuturi s-a realizat folosind kitul SV Total RNA

Isolation System (Promega). Evaluarea concentraţiei şi purităţii ARN-ului total s-a

determinat folosind spectrofotometrul Eppendorf Biophotometer. Integritatea și

dimensiunea ARN-ului total purificat a fost verificată prin denaturarea prin

electroforeză în gel de agaroză și colorarea cu etidium bromid si prin folosirea Agilent

2010 Bioanalyzer și Agilent RNA 6000 Pico Kit (Agilent Technologies Inc., US).

Tehnica Real-Time RT-PCR cantitativă cuprinde doua etape:

a) Revers-transcripția ARN-ului total în ADN complementar monocatenar

(ADNc), cand am utilizat kit-ul “High-Capacity cDNA Reverse Transcription

Kit” (Applied Biosystems, Foster City, CA).

b) Reacţia de polimerizare în lanţ în timp real (Real-Time PCR) - in această

etapă produşii PCR au fost sintetizaţi din ADNc utilizând TaqMan Gene

Expression Master Mix şi TaqMan Gene Expression Assays (Applied

Biosystems, Foster City, CA) specifice pentru fiecare ţintă.

Amplificarea Real-Time PCR s-a realizat cu ajutorul sistemului ViiA™ 7 Real-

Time PCR System - Applied Biosystems conform protocolului TaqMan Gene

Expression Master Mix, cu mentiunea ca am marit numarul de cicluri de amplificare de la

40 la 50 de cicluri.

Determinarea cantitativă a ARN VHC s-a realizat la toti pacienții infectați cu

VHC incluși în studiu prin 2 metode: Cobas Amplicor HCV Monitor (Roche diagnostics)

si Real-Time PCR cantitativă (qRT-PCR - quantitative Real Time Polymerase Chain

Reaction). Viremia s-a determinat la inițierea terapiei, la 3 luni pentru evaluarea

răspunsului virusologic precoce și la 18 luni pentru determinarea răspunsului virusologic

susținut. Pentru 30 dintre pacienți s-a realizat și genotiparea VHC folosind testul Linear

Array HCV Genotyping .

Analiza statistică a rezultatelor obtinute s-a facut folosind:

- Testele Kolmogorov-Smirnov și Shapiro-Wilk – evalueaza daca nivelului

expresiei relative a ARNm urmareste distributia Gaussiana;

- Testul Mann-Whitney – evalueaza diferentele expresiei genice între

pacienți și grupul control.

- Testul Kruskal-Wallis sau coeficientul Spearman - evalueaza expresia

genelor în conformitate cu parametrii clinico-patologici și posibilele

corelații între expresia genelor țintă.

7

CAPITOLUL 6: REZULTATE OBȚINUTE

Caracteristicile demografice ale loturilor studiate sunt sumarizate in tabelul 1.

Caracteristicile virusologice ale loturilor studiate – nu au fost obținute rezultate

fals pozitive sau fals negative în urma determinării viremiei prin cele două metode.

Coeficientul de corelație între cele două metode a fost de 0.758666. Din cei 30 de

pacienți la care s-a realizat genotiparea, 29 au avut viremie detectabilă, la toți

determinându-se prezența genotipului 1b al virusului hepatitic C.

Din punct de vedere histopatologic, lotul studiat a avut următoarea distribuție în

funcție de Scorul Metavir,

Pacienți cu infecție

cronică cu VHC

Pacienți din lotul

control

Bărbați/Femei 19/34 16/21

Vârsta (ani),

media SD

47,71 14,3 51,42 13,04

IMC 24.658 3.913 24,96 4,99

Încărcătura

virală (U/L)

687020,66

8

Iar în funcție de stadializarea steatozei distribuția lotului a fost următoarea:

Caracteristicile expresiei genice a ARNm pentru gena TGF-β1 în loturile

studiate:

Nu au fost variații clinico-biologice semnificative statistic între pacienții cu

hepatită cronică cu VHC și grupul control;

Nu a fost observată nicio corelație între expresia genică a ARNm pentru TGF-β1 și

parametri biologici: încărcătură virală, GOT, GPT, bilirubina totală și glicemia, cu

excepția unei corelații negative între nivelele ARNm ale genei TGF-β1 și nivelele

bilirubinei serice totale, dar fără să fie semnificativă statistic (r = -0,33490, p = 0,13782)

9

TGFb1

Vârsta

Sex

IMC Viremia

Glicemia GPT GOT

Bilirubina

totală

TGFb1

-0.06756 -0.01077 -0.23073 0.09101 0.22351 0.33498 0.27470 -0.33490

Vârsta 0.63414 0.07415 0.31862 -0.01483 0.22628 -0.28927 -0.12028 0.40007

Sex 0.93958 0.60139 -0.05522 -0.11851 -0.36201 0.07946 0.28604 0.04058

IMC 0.09984 0.02133 0.69739 -0.04778 0.22144 -0.00049 0.06425 0.07698

Viremia 0.52107 0.91690 0.40271 0.73660

0.24384 0.19763 0.19664 0.23423

Glicemia 0.23511 0.22921 0.04932 0.23959 0.19411 0.04431 0.03976 -0.09411

GPT 0.11818 0.18065 0.71857 0.99821 0.36605 0.84478

0.88834 0.01832

GOT 0.20461 0.58461 0.18579 0.77088 0.36850 0.86054 0.00000

0.05650

Bilirubina

totală 0.13782 0.07233 0.86134 0.74015 0.30680 0.69310 0.93888 0.81299

Analiza Krukal-Wallis a arătat că nu există nicio corelație între expresia genei

țintă și scorurile Metavir A, Metavir F sau steatoză (Tabel 6.5.).

Scorul histopatologic

TGFβ-1

Nr. cazuri

Expresia relativă

Valoarea lui p

Metavir A

0

1 2

3

2

17 28

5

0.464±0.025

0.062±0.015 0.065±0.010

0.060±0.011

0,86660

Metavir F

0

1 2

3+4

3

11 21

17

0.054±0.016

0.066±0.017 0.073±0.013

0.050±0.010

0,62770

Steatosis

0

1 2

3

17

16 12

7

0.051±0.005

0.085±0.017 0.055±0.012

0.055±0.028

0,36250

Caracteristicile expresiei genice a ARNm pentru gena TGF-β2 în loturile

studiate:

Expresia relativă a ARNm pentru TGF-β2 a avut nivele mai scăzute la majoritatea

pacienților cu hepatită cronică cu VHC comparativ cu cei din lotul control ( p=0,03360,

testul Mann-Whitney).

Nivelele expresiei relative ale ARNm au fost evaluate în corelație cu câțiva

parametri clinico-biologici: vârstă, sex, indicele de masă corporală (IMC), încărcătură

10

virală, GOT, GPT, bilirubina totală și glicemia. Nu a fost observată nicio corelație

semnificativă statistic între expresia genică și acești parametri.

Au fost evaluate posibilele corelații între nivelele ARNm pentru genele TGF-β2 și

scorurile histopatologice care evaluează steatoza, fibroza și activitatea necroinflamatorie

(Figura 6.21. a) – c) ). A existat o corelație semnificativă statistic între nivelul expresiei

TGF- β2 și gradul de activitate necroinflamatorie ( p = 0,04920).

Caracteristicile expresiei genice a ARNm pentru gena SOCS3 în loturile studiate:

Expresia relativă a ARNm pentru gena SOCS3 a avut nivele scăzute semnificativ

statistic la majoritatea pacienților cu hepatită cronică cu VHC comparativ cu cele de la

lotul control (p ˂ 0,0001, testul Mann-Whitney). Nu s-a observat nicio diferență

semnificativă statistic între nivelele expresiei ARNm pentru SOCS3 între pacienții cu

VHC insulino-rezistenți comparativ cu cei non-insulino-rezistenți (Figura 6.23.).

11

Evaluarea expresiei relative ale ARNm pentru SOCS3 corelată cu câțiva parametri

clinico-biologici a arătat o corelație pozitivă între nivelele expresiei ARNm pentru

SOCS3 și nivelele GPT și GOT (r=0.411, p=0.05, respectiv r=0.421, p=0.04), dar și o

corelație negativă între nivelul expresiei ARNm pentru Socs3 și bilirubina totală serică

(r=-0.413, p=0.06).

SOCS3 Vârsta Sex

IMC Viremia Glicemia

GPT

GOT

Bilirubina totală

SOCS3

-0.00403 -0.01394 -0.03558 -0.07663 -0.03525 0.41107 0.42095 -0.41319

Vârsta 0.97759

0.06279 0.30987 0.00630 0.22628 -0.28927 -0.12028 0.40007

Sex 0.92265 0.66158

-0.06134 -0.10035 -0.36201 0.07946 0.28604 0.04058

IMC 0.80423 0.02691 0.66897 -0.03766 0.22144 -0.00049 0.06425 0.07698

Viremia 0.59303 0.96502 0.48351 0.79306

0.24384 0.19763 0.19664 0.23423

Glicemia 0.85329 0.22921 0.04932 0.23959 0.19411

0.04431 0.03976 -0.09411

GPT 0.05134 0.18065 0.71857 0.99821 0.36605 0.84478 0.88834 0.01832

GOT 0.04547 0.58461 0.18579 0.77088 0.36850 0.86054 0.00000 0.05650

Bilirubina totală 0.06264 0.07233 0.86134 0.74015 0.30680 0.69310 0.93888 0.81299

Analiza Krukal-Wallis a arătat că există o corelație între expresia genei țintă la

nivel hepatic și steatoza ușoară (p= 0,02670). (Figurile 6.27. a-c)

12

CAPITOLUL 7. DISCUȚII

Hepatitele cronice constituie o serioasă problemă de sănătate publică oriunde în

lume, ele reprezentând o boală inflamatorie, cu evoluţie de peste 6 luni şi etiologie

variată, având sau nu o simptomatologie clinică evidentă. Conceptul de hepatită cronică a

fost individualizat de Kalk în 1947; la noi o contribuţie importantă au avut-o studiile lui

O. Fodor.

A fost luat în studiu un lot de 90 subiecți, dintre care 53 pacienți diagnosticați cu

infecție cronică cu virus hepatitic C (VHC) și 37 pacienți fără infecție cronică cu VHC și

fără activitate necroinflamatorie sau modificări ale arhitecturii hepatice au fost folosite

drept probe control.

În acest studiu am evaluat dacă expresia ARNm pentru genele TGF-β1, TGF-β2

și SOCS3 se modifică în prezența infecției cu VHC și dacă expresia lor este corelată cu

parametrii clinico-biologici și scorurile histo-patologice pentru evaluarea inflamației,

fibrozei și steatozei.

Mecanismele moleculare care declanșează fibrogeneza hepatică în hepatita

cronică cu VHC nu au fost încă elucidate. TGF-β este un factor de creștere

multifuncțional cu un rol esențial în controlul creșterii, apoptozei, adeziunii și motilității

celulare, și, de asemenea, în remodelarea matrixului extracellular (EMC).

TGF-β este implicată în evoluția fibrozei hepatice din hepatita cronică C și

carcinomul hepatocelular (CHC) și este supra-exprimată în infecția cronică cu VHC și

CHC prin acțiunea sa de remodelare asupra EMC. Există cel puțin trei izoforme pentru

TGF-β, numite TGF-β1, TGF-β2 și TGF-β3. TGF-β inhibă proliferarea celulelor

epiteliale prin blocarea ciclului celular în faza de sinteză G1 tardivă și în faza de tranziție

G1/S. Acest mecanism de inhibare a progresiei celulelor canceroase prin ciclul celular

este crucial, inducând astfel o cale de supresie tumorală. Evadarea din acest mechanism

este responsabilă pentru dezvoltarea mai multor cancere.

13

Rezultatele studiului nostru deschid noi căi în patogeneza infecției cronice cu

VHC, iar studiile următoare asupra nivelelor ARNm și a proteinelor în ser sau țesuturi,

înainte sau după tratament sunt necesare pentru elucidarea rolului TGF-β în fibrogeneza

hepatică și a implicațiilor sale asupra prognosticului.

Mecanismele moleculare ale răspunsului scăzut sau variabil la terapia bazată pe

IFN au fost explorate, ajungându-se la concluzia că atât factorii virali cât și cei legați de

gazdă pot să influențeze răspunsul la tratament. Nivelul expresiei genei SOCS3

(supresoare a semnalului citokinelor 3) se consideră că antagonizează semnalizarea IFN

prin interferența cu calea de semnalizare Jak-STAT la nivelul fosforilarii STAT1 și este

asociat cu rezultatul tratamentului în studiile in vivo.

Supraexpresia genei SOCS3 în țesutul hepatic este asociată cu un răspuns slab la

terapia cu IFN la pacienții cu hepatită cronică cu virus C, genotipul 1.

Tratamentul actual cel mai eficient pentru hepatita cronică C constă în asocierea

peginterferon (PEG-IFN) cu ribavirina (RBV) [2], dar este un tratament scump, are efecte

adverse semnificative, precum și eficacitate variabilă în funcție de factorii virali și gazdă.

Genotipul 1, încărcătura virală mare, vârsta înaintată, obezitatea, și fibroza hepatică

avansată sunt asociate cu un răspuns scăzut la tratament, dar nu există nici un singur

factor predictiv de încredere, înainte de administrarea tratamentului, pentru obținerea

răspunsului virusologic susținut. Măsurarea nivelului seric al ARN VHC la 4 și 12

săptămâni de terapie antivirală pare a fi cel mai bun predictor actual al răspunsului la

tratament, dar nu poate fi determinat înainte de inițierea tratamentului. Prin urmare, este

esențială identificarea unor factori predictori înainte de administrarea terapiei pentru a

putea aprecia rezultatul tratamentului la pacientii cu hepatită cronică cu virus C.

CAPITOLUL 8: CONCLUZII

Pentru cuantificarea ARN-VHC există mai multe metode, metoda Cobas Amplicor

încă reprezintă „standardul de aur”, fiind singura aprobată de Food & Drug

Administration. Multe alte tehnici sunt în curs de evaluare – detecția ARN-VHC prin

metoda RT-PCR este e metodă rapidă, sensibilă, și are un cost redus față de metoda

Cobas Amplicor;

14

Există o corelație puternică între viremia determinată prin metoda Cobas Amplicor

și RT PCR, dar pentru monitorizarea clinică este necesară determinarea viremiei

folosind aceeași metodă;

Ca citokine, TGF-β pot juca un un rol important în patogeneză de-a lungul

evoluției infecției virale, relația dintre replicarea VHC și TGF-β1 și TGF-β2 fiind

de mare importanță. Deși nu sunt date referitoare la relația dintre TGF-β1 și VHC,

la pacienții infectați cronic există o relație inversă între viremie și nivelele TGF-β1.

Mult mai puțin cunoscute sunt implicațiile TGF-β2 în infecția cronică cu VHC;

Am realizat acest studiu pentru a determina dacă expresia genelor TGF-β1, TGF-

β2 și SOCS3 este modificată în hepatita cronică cu VHC și dacă expresia mRNA a

acestor gene se corelează cu parametrii clinico-patologici;

Expresia relativă a ARNm pentru TGF-β1 nu a avut variații biologice sau

semnificative statistic între pacienții cu hepatită cronică cu VHC și grupul control;

Dimpotrivă, nivelele ARNm pentru TGF-β2 au fost mai scăzute la majoritatea

pacienților cu hepatită cronică cu VHC comparativ cu cele de la lotul control

(p=0.03, testul Mann-Whitney);

Expresia relativă a ARNm pentru SOCS3 au fost scăzute semnificativ statistic

pacienților cu hepatită cronică cu VHC comparativ cu cele de la lotul control

(p=0.0001, testul Mann-Whitney);

Calcularea corelației coeficientului Spearman a arătat că nu există nicio corelație

între expresia relativă a ARNm pentru genele TGF-β1 și TGF-β2 ( r = 0,27, p =

0,04);

15

A existat o puternică corelație pozitivă între expresia relativă a ARNm pentru

SOCS3 și expresia relativă a ARNm pentru TGF-β;

Terapia bazată pe IFN este singurul tratament eficace pentru hepatita cronică

cu VHC, în prezent, dar produce rezultate variabile, în funcție de gazda si de

factorii virali. Având în vedere efectele sale adverse și costurile crescute, ar fi

extrem de util să poată fi prezis rezultatul tratamentului înainte de inițierea

tratamentului. În plus, identificarea factorilor care influențează rezultatul

tratamentului ar fi de ajutor în elucidarea mecanismului de acțiune și a

rezistenței la IFN în infecția cu VHC.

BIBLIOGRAFIE SELECTIVĂ

Adinolfi LE, Gambardella M, Andreana A, Tripodi MF, Utili R, Ruggiero G. Steatosis

accelerates the progression of liver damage of chronic hepatitis C patients and correlates

with specific HCV genotype and visceral obesity. Hepatology. 2001 Jun;33(6):1358-64.

Akuta N, Suzuki F, Tsubota A, et al. Efficacy of interferon monotherapy to 394 consecutive

naive cases infected with hepatitis C virus genotype 2a in Japan: therapy efficacy as

consequence of tripartite interaction of viral, host and interferon treatment-related factors. J

Hepatol 2002;37:831–6.

Ashcroft GS, Dodsworth J, van Boxtel E, Tarnuzzer RW, Moran MA, Schultz GS, et al.

Estrogen accelerates cutaneous wound healing associated with an increase in TGF-beta 1

levels. Nat Med 1997;3: 1209-1215.

Bedossa P, Poynard T. An algorithm for the grading of activity in chronic hepatitis C. The

METAVIR Cooperative Study Group. Hepatology 1996;24:289–293.

Bjoro K, Bell H, Hellum KB, et al. Effect of combined interferon-alpha induction therapy

and ribavirin on chronic hepatitis C virus infection: a randomized multicentre study. Scand J

Gastroenterol 2002;37:226–32.

Bode JG, Ludwig S, Ehrhardt C, Albrecht U, Erhardt A, Schaper F, Heinrich PC, Häussinger

D. IFN-alpha antagonistic activity of HCV core protein involves induction of suppressor of

cytokine signaling-3. FASEB J. 2003 Mar;17(3):488-90. Epub 2003 Jan 22.

Bressler BL, Guindi M, Tomlinson G, Heathcote J. High body mass index is an independent

risk factor for nonresponse to antiviral treatment in chronic hepatitis C. Hepatology. 2003

Sep; 38(3):639-44.

Emanuelli B, Peraldi P, Filloux C, Chavey C, Freidinger K, Hilton DJ, Hotamisligil GS, Van

Obberghen E. SOCS-3 inhibits insulin signaling and is up-regulated in response to tumor

16

necrosis factor-alpha in the adipose tissue of obese mice. J Biol Chem. 2001 Dec

21;276(51):47944-9. Epub 2001 Oct 16.

Farci P. Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradley DW, Houghton M. Isolation of a

cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome [Science

1989;244:359-362]. J Hepatol. 2002 May;36(5):582-5.

Ghanim H, Aljada A, Daoud N, Deopurkar R, Chaudhuri A, Dandona P. Role of

inflammatory mediators in the suppression of insulin receptor phosphorylation in circulating

mononuclear cells of obese subjects. Diabetologia 2007;50:278-285.

Huang Y, Feld JJ, Sapp RK, Nanda S, Lin JH, Blatt LM, Fried MW, Murthy K, Liang TJ.

Defective hepatic response to interferon and activation of suppressor of cytokine signaling 3

in chronic hepatitis C. Gastroenterology. 2007 Feb;132(2):733-44. Epub 2006 Nov 29.

Matsuura K, Tanaka Y, Hasegawa I, Ohno T, Tokuda H, Kurbanov F, Sugauchi F, Nojiri

S, Joh T, Mizokami M. Abbott RealTime hepatitis C virus (HCV) and Roche Cobas

AmpliPrep/Cobas TaqMan HCV assays for prediction of sustained virological response to

pegylated interferon and ribavirin in chronic hepatitis C patients. J Clin

Microbiol. 2009 Feb;47(2):385-9. Epub 2008 Dec 17.

Ogata H, Chinen T, Yoshida T, Kinjyo I, Takaesu G, Shiraishi H, Iida M, Kobayashi T,

Yoshimura A. Loss of SOCS3 in the liver promotes fibrosis by enhancing STAT3-mediated

TGF-beta1 production. Oncogene. 2006 Apr 20;25(17):2520-30.

Persico M, Capasso M, Persico E, Svelto M, Russo R, Spano D, et al. Suppressor of cytokine

signaling 3 (SOCS3) expression and hepatitis C virus-related chronic hepatitis: Insulin

resistance and response to antiviral therapy. Hepatology. 2007; 46:1009–1015.

Poynard T, Ratziu V, McHutchison J, Manns M, Goodman Z, Zeuzem S, Younossi Z,

Albrecht J. Effect of treatment with peginterferon or interferon alfa-2b and ribavirin on

steatosis in patients infected with hepatitis C. Hepatology. 2003 Jul;38(1):75-85.

Saile B, Matthes N, Knittel T, Ramadori G. Transforming growth factor beta and tumor

necrosis factor alpha inhibit both apoptosis and proliferation of activated rat hepatic stellate

cells. Hepatology. 1999 Jul;30(1):196-202.

The METAVIR Cooperative Group. Inter- and intra-observer variation in the assessment of

liver biopsy of chronic hepatitis C. Hepatology 1994;20:15–20.

Walsh MJ, Jonsson JR, Richardson MM, Lipka GM, Purdie DM, Clouston AD, et al.

Nonresponse to antiviral therapy is associated with obesity and increased hepatic expression

of suppressor of cytokine signalling 3 (SOCS-3) in patients with chronic hepatitis C, viral

genotype 1. Gut. 2006; 55:529–535.

Werling K, Schaff Z, Dinya E, Tulassay Z. Effect of liver steatosis on therapeutic response in

chronic hepatitis C virus genotype 1 infected patients in hungary.Pathol Oncol Res. 2010

Jun;16(2):149-57. Epub 2009 Sep 15.

Wolff D, Gerritzen A. Comparison of the Roche COBAS Amplicor Monitor, Roche COBAS

Ampliprep/COBAS Taqman and Abbott RealTime Test assays for quantification of hepatitis C

virus and HIV RNA. Clin Chem Lab Med. 2008;46(3):424.

Yasuda M, Shimizu I, Shiba M, Ito S. Suppressive effects of estradiol on

dimethylnitrosamine-induced ®brosis of the liver in rats. Hepatology 1999;29:719-727