iodine - kills viruses research

8/7/2019 Iodine - Kills Viruses Research

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APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY, May 1 9 9 1 , p . 1379-13850 0 9 9 - 2 2 4 0 / 9 1 / 0 5 1 3 7 9 - 0 7 $ 0 2 . 0 0 / 0C o p y r i g h t ) 1 9 9 1 , A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g yV o l . 5 7 , N o . 5

I n a c t i v a t i o n o f I n f e c t i o u s H e m a t o p o i e t i c N e c r o s i s V i r u s byLow L e v e l s o f I o d i n eWILLIAM N . B A T T S , ' * MARSHA L . LANDOLT,2 AND JAMES R . WINTON'

N a t i o n a l F i s h e r i e s R e s e a r c h C e n t e r , B u i l d i n g 2 0 4 , Naval S t a t i o n , U . S . F i s h and W i ld l i f e S e r v i c e , S e a t t l e , Washington9 8 1 1 5 , 1 and S c h o o l o f F i s h e r i e s , U n i v e r s i t y o f W a s h i n g t o n , S e a t t l e , Washington 9 8 1 9 5 2R e c e i v e d 1 7 December 1 9 9 0 / A c c e p t e d 1 2 F e b r u a r y 1 9 9 1

T h e f i s h r h a b d o v i r u s i n f e c t i o u s h e m a t o p o i e t i c n e c r o s i s v i r u s (IHNV) was r a p i d l y i n a c t i v a t e d by e x t r e m e l yl o w c o n c e n t r a t i o n s o f i o d i n e i n w a t e r . A 9 9 . 9 % v i r u s r e d u c t i o n was o b t a i n e d i n 7 . 5 s when v i r u s ( 1 0 5 P F U / m l )a n d i o d i n e ( 0 . 1 m g / l i t e r , f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) were c o m b i n e d i n d i s t i l l e d - d e i o n i z e d or h a t c h e r y w a t e r . I o d i n ee f f i c a c y d e c r e a s e d a t pHs g r e a t e r t h a n 7 . 5 or when p r o t e i n a c e o u s m a t e r i a l was added t o t h e w a t e r . B o v i n es e r u m a l b u m i n b l o c k e d i o d i n e i n a c t i v a t i o n o f t h e v i r u s more e f f e c t i v e l y t h a n d i d e q u a l c o n c e n t r a t i o n s o f f e t a lb o v i n e s e r u m or r i v e r s e d i m e n t . S o d i u m t h i o s u l f a t e e f f e c t i v e l y n e u t r a l i z e d f r e e i o d i n e . Powder, i o d o p h o r , andc r y s t a l l i n e i o d i n e s o l u t i o n s i n a c t i v a t e d IHNV equally. I o d i n e r a p i d l y i n a c t i v a t e d IHNV i s o l a t e s r e p r e s e n t i n ge a c h o f t h e f i v e e l e c t r o p h e r o t y p e s . Under t h e c o n d i t i o n s u s e d i n t h i s s t u d y , i n ac t i v a t i o n was not a f f e c t e d byt e m p e r a t u r e , s a l i n i t y , or w a t e r h a r d n e s s . When Dworshak N a t i o n a l F i s h H a t c h e r y water was c o n t i n u o u s l yt r e a t e d t o p r o v i d e a f r e e i o d i n e c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 1 4 m g / l i t e r , a 7 . 5 - s exposure t o i o d i n e was s u f f i c i e n t t oi n a c t i v a t e 9 9 . 9 % o f t h e IHNV. I o d i n e a d d e d t o water t h a t c o n t a i n e d IHNV p r e v e n t e d i n f e c t i o n o f r a i n b o w t r o u t( O n c o r h y n c h u s m y k i s s ) f r y . T h e s e r e s u l t s s u g g e s t t h a t t h e w a t e r b o r n e r o u t e o f IHNV t r a n s m i s s i o n can b eb l o c k e d b y a d d i n g l o w i o d i n e c o n c e n t r a t i o n s t o t h e w a t e r s u p p l i e s o f h a t c h e r i e s .

M i l l i o n s o f f i s h d i e e a c h y e a r f r o m t h e s a l m o n i d d i s e a s ei n f e c t i o u s h e m a t o p o i e t i c n e c r o s i s ( I H N ) . T h e s e d e a t h s r e -s u l t d i r e c t l y f r o m m o r t a l i t y a n d i n d i r e c t l y f r o m m a n d a t e dd e s t r u c t i o n o f i n f e c t e d f i s h . T h e c a u s a t i v e a g e n t , i n f e c t i o u sh e m a t o p o i e t i c n e c r o s i s v i r u s ( I H N V ) , i s a r h a bd o v i r u s t h a ti s e n z o o t i c i n many w a t e r s h e d s o f w e s t e r n N o r t h A m e r i c a( 2 5 , 3 3 ) .To c o n t r o l I H N , i t i s i m p o r t a n t t o u n d e r s t a n d t h e e p i z o o t i -o l o g y o f t h e v i r u s . Two m o d e s o f t r a n s m i s s i o n a r e k n o w n .T h e f i r s t i s v e r t i c a l t r a n s m i s s i o n , i n w h i c h t h e v i r u s i s p a s s e df r o m a d u l t t o o f f s p r i n g b y g a m e t e s ( 2 0 ) . S u r f a c e d i s i n f e c t i o no f f e r t i l i z e d e g g s w i t h a n i o d o p h o r s o l u t i o n ( 2 , 4 ) m ay a i d i nr e d u c i n g t r a n s m i s s i o n b y t h i s r o u t e . T h e s e c o n d a n d m o s tl i k e l y mode i s h o r i z o n t a l t r a n s m i s s i o n , b y w h i c h i n f e c t e df i s h s h e d v i r u s i n t o t h e w a t e r t o i n f e c t s u s c e p t i b l e f i s h ( 2 1 ,3 2 ) . Low c o n c e n t r a t i o n s o f IHNV h a v e b e e n d e t e c t e d i nw a t e r s t h a t c o n t a i n i n f e c t e d s a l m o n i d s ( 6 , 2 1 , 2 3 , 2 9 ) .A v o i d a n c e o f w a t e r b o r n e e x p o s u r e t o IHNV i s a p o t e n t i a l l yp o w e r f u l m e t h o d f o r p r e v e n t i n g t h e d i s e a s e i n s u s c e p t i b l eh a t c h e r y s t o c k s .I o d i n e i s a n e f f e c t i v e d i s i n f e c t a n t a g a i n s t b a c t e r i a , v i r u s e s ,p r o t o z o a , a n d f u n g i ( 9 , 1 2 ) . Low l e v e l s a r e g e n e r a l l y s u f f i -c i e n t t o d i s i n f e c t s u r f a c e s , b u t l e v e l s o f i o d i n e a s h i g h a s 1 %( 1 0 , 0 0 0 m g / l i t e r ) h a v e s t i l l n o t p r o v i d e d c o m p l e t e i n a c t i v a -t i o n o f r e s i s t a n t v i r u s e s u n d e r s p e c i f i c c o n d i t i o n s ( 5 , 2 8 ) .I o d o p h o r d i s i n f e c t a n t s h a v e b e e n t e s t e d f o r v i r u c i d a l a c t i v i t ya g a i n s t t h r e e f i s h v i r u s e s ( 4 , 1 0 ) a n d f o r i n a c t i v a t i o n o fs e l e c t e d b a c t e r i a l a n d f u n g a l f i s h p a t h o g e n s ( 2 7 ) . H i g h l e v e l so f i o d i n e ( 2 5 t o 1 0 0 m g / l i t e r ) a r e u s e d f o r d i s i n f e c t i o n o f e g gs u r f a c e s o r h a t c h e r y e q u i p m e n t . A c c o r d i n g t o Amend a n dP i e t s c h ( 4 ) , i o d i n e a t 1 2 m g / l i t e r c o m p l e t e l y i n a c t i v a t e dIHNV w i t h i n 3 0 s . T h e g o a l o f t h e p r e s e n t s t u d y wa s t oi n v e s t i g a t e w h e t h e r v e r y l o w l e v e l s o f e l e m e n t al i o d i n e c o u l db e u s e d a s a l o w - c o s t w a t e r t r e a t m e n t a t h a t c h e r i e s w h e r eIHNV i s e n z o o t i c . S e v e r a l c o n c e n t r a t i o n s o f i o d i n e were

* C o r r e s p o n d i n g a u t h o r .

c o m b i n e d w i t h IHNV u n d e r v a r i o u s e n v i r o n m e n t a l c o n d i -t i o n s . C o n c e n t r a t i o n s o f i o d i n e w e r e l o w e n o u g h t o b en o n t o x i c t o r a i n b o w t r o u t ( O n c o r h y n c h u s m y k i s s ) f r y b u th i g h e n o u g h t o i n a c t i v a t e IHNV. T h e r e s u l t s s u g g e s t t h a ti o d i n e t r e a t m e n t o f h a t c h e r y w a t e r i s a u s e f u l m e t h o d f o rc o n t r o l l i n g IHN.MATERIALS ANDMETHODS

C e l l a n d v i r u s s t o c k s . E p i t h e l i o m a p a p u l o s u m c y p r i n i( E P C ) c e l l s ( 1 1 ) w e r e m a i n t a i n e d a t 2 5 C i n minimum e s s e n -t i a l medium (MEM; F l o w L a b o r a t o r i e s , I n c . , M c L e a n , V a . )c o n t a i n i n g 10% f e t a l b o v i n e s e r u m ( F B S ; GIBCO L a b o r a t o -r i e s , G r a n d I s l a n d , N . Y . ) a n d 0 . 3 % t r y p t o s e p h o s p h a t e b r o t h( D i f c o L a b o r a t o r i e s , D e t r o i t , M i c h . ) . A d d i t i o n o f 7 . 5 % s o -d i u m b i c a r b o n a t e wa s u s e d t o a d j u s t t h e p H t o b e t w e e n 7 . 6a n d 7 . 8 .T h e IHNV i s o l a t e s u s e d i n t h i s s t u d y a r e l i s t e d i n T a b l e 1 .U n l e s s o t h e r w i s e s p e c i f i e d , i n a c t i v a t i o n t r i a l s were c o n -d u c t e d w i t h t h e i s o l a t e o f IHNV r e c o v e r e d f r o m a n a d u l ts p a w n i n g s t e e l h e a d t r o u t ( 0 . m y k i s s ) a t t h e D w o r s h a k N a -t i o n a l F i s h H a t c h e r y ( A h s a h k a , I d a h o ) . S t o c k v i r u s wa sp r e p a r e d a f t e r t h r e e p a s s a g e s o n EPC c e l l m o n o l a y e r s .C u l t u r e f l u i d wa s c l a r i f i e d b y l o w - s p e e d c e n t r i f u g a t i o n ( 1 , 8 0 0x g , 1 0 m i n ) a n d f r o z e n a t - 7 0 C u n t i l n e e d e d . F o r e a c ht r i a l , a n a l i q u o t o f v i r u s wa s t h a w e d a n d d i l u t e d t o 1 0 5P F U / m l u n l e s s o t h e r w i s e n o t e d .P l a q u e a s s a y . T r y p s i n i z e d EPC c e l l s were s u s p e n d e d i nMEM t h a t c o n t a i n e d 0 . 3 % t r y p t o s e p h o s p h a t e b r o t h , 1 2 mMT r i s b u f f e r ( p H 7 . 6 , MEM-T), a n d 5 % FBS ( M E M - 5 T ) . Thec e l l s were s e e d e d i n t o e i g h t - w e l l m u l t i p l a t e s ( M i l e s S c i e n -t i f i c , N a p e r v i l l e , I l l . ) a t a d e n s i t y o f 2 x 1 0 6 c e l l s p e r w e l l a n di n c u b a t e d a t 2 5 C o v e r n i g h t . To e n h a n c e t h e s e n s i t i v i t y o fEPC c e l l s t o i n f e c t i o n w i t h IHNV, we f o l l o w e d t h e c e l lp r e t r e a t m e n t p r o c e d u r e o f B a t t s a n d W i n t o n ( 7 ) , i n w h i c h1 0 0 R I o f a 7 % p o l y e t h y l e n e g l y c o l s o l u t i o n ( m o l e c u l a rw e i g h t , 2 0 , 0 0 0 ; p r e p a r e d i n M E M - 5 T ) wa s d i s p e n s e d o n t oe a c h d r a i n e d c e l l m o n o l a y e r 3 0 m i n b e f o r e i n o c u l a t i n g v i r u s .

1 3 7 9


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A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .TABLE 1 . Summary o f IHNV i s o l a t e s a n d c h a r a c t e r i s t i c s o f t h ef i v e e l e c t r o p h e r o t y p e s t e s t e d f o r i n a c t i v a t i o n b y i o d i n e

H o s t Y r N o . o f c e l l V i uI s o l a t e l o c a t i o n H o s ' Y r c u l t u r e V i r u ss p e c i e s a i s o l a t e d t y p e "p a s s a g e sD w o r s h a k H a t c h e r y , I d a h o S t 1 9 8 6 4 1Round B u tt e H a t c h e r y , O r e g . S t 1 9 8 5 2 1C o w l i t z H a t c h e r y , W a s h . S t 1 9 8 3 2 2S a c r a m e n t o R i v e r , C a l i f . Ch 1 9 6 6 ? 3C o l e m a n H a t c h e r y , C a l i f . Ch 1 9 8 5 2 4C e d a r R i v e r , W a s h . S o c 1 9 8 9 3 5

a V i r u s e s w e r e a l l i s o l a t e d f r o m a d u l t s p a w n i n g s a l m o n i d s ( S t , s t e e l h e a dt r o u t [ 0 . m y k i s s ] ; C h , c h i n o o k s a l m o n [ 0 . t s h a w y t s c h a ] ; S o c , s o c k e y e s a l m o n[ 0 . n e r k a ] ) .b V i r u s i s o l a t e s w e r e c l a s s i f i e d a c c o r d i n g t o e l e c t r o p h o r e t i c m o b i l i t y o fs t r u c t u r a l p r o t e i n s ( 1 4 ) .

We i n oc u la t e d 1 0 0 u l I o f e a c h v i r u s d i l u t i o n o n t o d u p l i c a t em o n o l a y e r s , a l lo w e d v i r u s a d s o r p t i o n f o r 3 0 m i n , a n d t h e na d d e d 2 m l o f m e t h y l c e l l u l o s e ( 0 . 7 5 % ) o v e r l a y t o e a c h w e l l( 8 , 1 9 ) . T h e i n f e c t e d c e l l s w e r e i n c u b a t e d a t 1 5 C f o r 7 d a y st o a ll ow p l a q u e f o r m a t i o n b ef o re t h e y w e r e s t a i n e d a n d f i x e dw i t h a c r y s t a l v i o l e t - F o r m a l i n s o l u t i o n . P l a q u e s w e r ec o u n t e d , a n d t h e m ean v i r u s c o n c e n t r a t i o n o f t h r e e r e p l i -c a t e s was c o n v e r t e d t o l o g 1 o v a l u e s .G e n e r a l e x p e r i m e n t a l d e s i g n . T h r e e r e p l i c a t e t r e a t m e n t sw e r e p e r f o r m e d f o r e a c h t e s t . E q u a l v o l u m e s o f v i r u s a n di o d i n e s o l u t i o n s w e r e r e a c t e d f o r a s e l e c t e d t i m e , a n d t h e n a ne q u a l v o l u m e o f MEM-T c o n t a i n i n g 0 . 1 % b o v i n e s e r u ma l b u m i n ( B S A ; MEM-BSA) wa s a d d e d t o s t o p t h e r e a c t i o n( u n l e s s o t h e r w i s e s p e c i f i e d ) . A s t o c k s o l u t i o n o f 1 0 0 m g o ff r e e i o d i n e p e r l i t e r was p r e p a r e d b y d i s s o l v i n g p o l y v i n y l p y r -r o l i d o n e - i o d i n e ( P V P - i o d i n e ; S i g m a C h e m i c a l C o . , S t .L o u i s , M o . ) i n d i s t i l l e d - d e i o n i z e d w a t e r ( N a n o p u r e I I ; B a r n -s t e a d C o . , N e w t o n , M a s s . ) . T h e i o d i n e c o n c e n t r a t i o n ( r e -p o r t e d a s m i l l i g r a m s o f f r e e i o d i n e p e r l i t e r ) was d e t e r m i n e dw i t h a c h l o r i n e m e t e r ( H a c h C o . , L o v e l a n d , C o l o . ) t h a t h a db e e n c a l i b r a t e d w i t h a n i o di n e s t an d a r d . F o r e a c h e x p e r i -m e n t , n eg a t i v e (MEM o n l y ) a n d p o s i t i v e (IHNV o n l y ) c o n -t r o l s w e r e i n c l u d e d , a s w e l l a s a p a i r o f IHNV i n a c t i v a t i o nc o n t r o l s c o n t a i n i n g 0 . 4 m g o f f r e e i o d i n e p e r l i t e r w i t h o rw i t h o u t BSA. E a c h e x p e r i m e n t w a s r e q u i r e d t o s h o w v i r u si n a c t i v a t i o n f o r t h e i o d i n e - I H N V c o n t r o l a n d n o i n a c t i v a t i o nwhen i o d i n e w a s i n c u b a t e d w i t h MEM-BSA b e f o r e c o m b i -n a t i o n w i t h IHNV. T h e p l a q u e a s s a y w a s u s e d t o d e t e r m i n et h e n u m b e r o f r e m a i n i n g i n f e c t i o u s v i r u s p a r t i c l e s .I o d i n e e f f i c a c y i n d i s t i l l e d - d e i o n i z e d w a t e r . I o d i n e a n dIHNV s o l u t i o n s w e r e p r e p a r e d i n d i s t i l l e d - d e i o n i z e d w a t e r ,a n d e q u a l ( 5 0 - m l ) v o l u m e s w e r e s i m u l t a n e o u s l y p o u r e d i n t oa s t e r i l e b e a k e r a n d m i x e d w i t h a m a g n e t i c s t i r r e r . A t 7 . 5 , 1 5 ,3 0 , 6 0 , 1 2 0 , 2 4 0 , 4 8 0 , 9 6 0 , a n d 1 , 9 2 0 s , a 1 - m l v o l u m e w a sr e m o v e d f r o m t h e m i x t u r e a n d a d d e d t o 1 m l o f MEM-BSAt o s t o p t h e i n a c t i v a t i o n p r o c e s s . T h r e e r e p l i c a t e s o f t h e v i r u si n a c t i v a t i o n s t u d y w e r e p e r f o r m e d a t f i n a l f r e e i o d i n e c o n -c e n t r a t i o n s o f 0 . 0 1 3 , 0 . 0 2 6 , 0 . 0 5 6 , 0 . 1 1 , 0 . 2 2 , a n d 0 . 4 2m g / l i t e r .E f f i c a c y o f d i f f e r e n t i o d i n e f o r m u l a t i o n s . S o l u t i o n s c o n t a i n -i n g p o w d e r e d P V P - i o d i n e , i o d o p h o r ( a l i q u i d P V P - i o d i n es o l u t i o n ; A r g e n t C h e m i c a l L a b o r a t o r i e s , Redmond, W a s h . ) ,o r p u r e i o d i n e c r y s t a l s ( S i g m a ) w e r e p r e p a r e d i n d i s t i l l e d -d e i o n i z e d w a t e r t o p r o v i d e a 1 0 0 - m g / l i t e r s t o c k s o l u t i o n . Toc o m p a r e t h e a b i l i t y o f t h e t h r e e i o d i n e t y p e s t o i n a c t i v a t eIHNV, we t e s t e d t h r e e r e p l i c a t e s o f e a c h i o d i n e t y p e a t 0 . 1 0 ,0 . 2 0 , a n d 0 . 4 0 m g o f f i n a l f r e e i o d i n e p e r l i t e r . V i r u s a n di o d i n e ( 5 0 m l e a c h ) w e r e p o u r e d i n t o a s t e r i l e b e a k e r a n d

m i x e d b y u s i n g a m a g n e t i c s t i r r e r . A 1 - m l s a m p l e wa sr e m o v e d f r o m t h e s o l u t i o n a f t e r 7 . 5 s a n d a d d e d t o 1 m l o fMEM-BSA t o s t o p t h e i n a c t i v a t i o n p r o c e s s .I o d i n e e f f i c a c y a g a i n s t d i f f e r e n t IHNV i s o l a t e s . I s o l a t e s o fIHNV r e p r e s e n t i n g e a c h o f t h e f i v e e l e c t r o p h e r o t y p e s ( T a b l e1 ) were d i l u t e d t o 1 0 5 PFU/ml i n 5 0 m l o f d i s t i l l e d - d e i o n i z e dw a t e r a n d c o m b i n e d w i t h an e q u a l v o l u m e o f P V P - i o d i n es o l u t i o n t o p r o v i d e a f i n a l c o nc e n t r a t i o n o f 0 . 1 0 m g / l i t e r .A f t e r 7 . 5 s o f m i x i n g i n t h e r e a c t i o n b e a k e r , 1 m l wa sr e m o v e d a n d a d d e d t o 1 m l o f MEM-BSA t o s t o p t h ei n a c t i v a t i o n p r o c e s s .To d e t e r m i n e w h e t h e r t h e c o n c e n t r a t i o n o f IHNV i t s e l fa f f e c t e d t h e i n a c t i v a t i o n b y i o d i n e , we d i l u t e d s t o c k s o f t h eD w o r s h a k i s o l a t e i n d i s t i l l e d - d e i o n i z e d water t o p r o v i d e f i n a lv i r u s s t o c k d i l u t i o n s o f 1 : 1 0 0 , 1 : 1 , 0 0 0 , a n d 1 : 1 0 , 0 0 0 ( 1 0 6 , 1 0 5 ,a n d 1 0 4 P F U / m l ) . E q u a l v o l u m e s o f v i r u s a n d P V P - i o d i n es o l u t i o n s were c o m b i n e d t o g i v e f i n a l f r e e i o d i n e c o n c e n t r a -t i o n s o f 0 . 0 7 , 0 . 2 5 , 0 . 4 2 , a n d 0 . 6 2 m g / l i t e r . A f t e r 5 m i n o fc o n t a c t , t h e r e a c t i o n wa s s t o p p e d b y t h e a d di t i o n o f an e q u a lv o l u m e o f MEM-5T. To d e t e r m i n e t h e i o d i n e d e m a n d o f t h es t o c k v i r u s s u s p e n s i o n , we a d d e d an e q u a l v o l u m e o f i o d i n es o l u t i o n ( 0 . 7 m g / l i t e r , f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) t o e a c h o f t h ed i l u t i o n s o f v i r u s . A f t e r 5 m i n , t h e r e s i d u a l f r e e i o d i n e wa sm e a s u r e d .E f f e c t o f w a t e r q u a l i t y on e f f i c a c y o f i o d i n e . The e f f e c t o fw a t e r p H , t e m p e r a t u r e , s a l i n i t y , a n d h a r d n e s s on t h e a b i l i t yo f i o d i n e t o i n a c t i v a t e IHNV wa s e x a m i n e d . F o r e a c he x p e r i m e n t , e q u a l v o l u m e s ( 0 . 5 m l ) o f t h e D w o r s h a k i s o l a t eo f IHNV a n d P V P - i o d i n e ( 0 . 4 m g / l i t e r , f i n a l f r e e i o d i n ec o n c e n t r a t i o n ) were c o m b i n e d f o r a 5 - m i n e x p o s u r e f o l l o w e db y t h e a d d i t i o n o f MEM-BSA.T h e e f f e c t o f pH on IHNV i n a c t i v a t i o n b y i o d i n e wa st e s t e d b y u s i n g 0 . 0 2 M p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 6 . 0 , 6 . 5 , 7 . 0 ,a n d 7 . 5 ; S i g m a ) a n d 0 . 0 5 M T r i s b u f f e r ( p H 7 . 5 , 8 . 0 , 8 . 5 , a n d9 . 0 ; S i g m a ) a s d i l u e n t s . S t o c k s o l u t i o n s ( 1 0 0 m g o f f r e ei o d i n e p e r l i t e r ) o f P V P - I o r p u r e i o d i n e c r y s t a l s were d i l u t e dt o p r o v i d e a 0 . 4 - m g / l i t e r f i n a l f r e e i o d i n e c o n c e n t r a t i o n whenr e a c t e d w i t h IHNV. T h e t i t e r s o f v i r u s d i l u t e d i n b u f f e rs o l u t i o n s were d e t e r m i n e d a t e a c h pH a n d u s e d a s i o d i n e -f r e e c o n t r o l s . M e a s u r e m e n t s o f pH were c o n d u c t e d b y u s i n ga pH m e t e r s u i t a b l e f o r u s e i n T r i s b u f f e r s ( C o r n i n g G l a s sW o r k s , C o r n i n g , N . Y . ) .T h e e f f e c t o f t e m p e r a t u r e on IHNV i n a c t i v a t i o n b y i o d i n ewa s t e s t e d a t 0 , 5 , 1 0 , 1 5 , 2 0 , a n d 2 5 C . V i r u s a n d i o d i n es o l u t i o n s were p r e p a r e d s e p a r a t e l y i n d i s t i l l e d - d e i o n i z e dw a t e r a c c l i m a t e d t o e a c h t e m p e r a t u r e . D i s t i l l e d - d e i o n i z e dw a t e r was c o m b i n e d w i t h IHNV a t e a c h t e m p e r a t u r e t o f o r mi o d i n e - f r e e c o n t r o l s .T h e e f f e c t o f s a l i n i t y on IHNV i n a c t i v a t i o n b y i o d i n e wa st e s t e d a t 0 , 4 . 0 , 7 . 5 , 1 5 . 5 , a n d 3 2 . 0 a o . V i r u s a n d i o d i n e werep r e p a r e d i n t w o f o l d d i l u t i o n s w i t h f i l t e r e d s e a w a t e r o b t a i n e df r o m n o r t h e r n P u g e t S o u n d , W a s h . T h e s a l i n i t y wa s mea -s u r e d w i t h a r e f r a c t o m e t e r . D i l u t i o n s o f s e a w a t e r werec o m b i n e d w i t h IHNV t o f o r m i o d i n e - f r e e c o n t r o l s .To c o m p a r e t h e e f f e c t o f w a t e r h a r d n e s s , we p r e p a r e ds o l u t i o n s b y t h e m e t h o d o f M a r k i n g ( 1 6 ) , e x c e p t t h a t 5 0 0 m go f s o d i u m b i c a r b o n a t e p e r l i t e r wa s a d d e d t o c o n t r o l pH a n da l k a l i n i t y . W a t e r h a r d n e s s a n d a l k a l i n i t y were m e a s u r e dw i t h t e s t k i t s ( H a c h C o . ) a n d r e p o r t e d a s t o t a l m i l l i g r a m s o fC a C O 3 p e r l i t e r . I o d i n e a n d IHNV were p r e p a r e d w i t hh a r d n e s s s o l u t i o n s o f 0 , 1 0 , 2 0 , 4 0 , 8 0 , 1 6 0 , a n d 3 2 0 m g / l i t e r .I o d i n e e f f i c a c y i n t h e p r e s e n c e o f o r g a n i c m a t e r i a l . T h ec o m p e t i t i v e e f f e c t o f o r g a n i c m a t e r i a l on t h e a b i l i t y o f i o d i n et o i n a c t i v a t e IHNV wa s e x a m i n e d . Two p r o t e i n s , BSA a n dF B S , were d i l u t e d i n d i s t i l l e d - d e i o n i z e d w a t e r a n d m i x e dw i t h e q u a l v o l u m e s o f IHNV b e f o r e t h e a d d i t i o n o f i o d i n e .

1 3 8 0 BATTS ET AL.


3/7

INACTIVATION OF IH N VIRU S B Y IODINE 1 3 8 1TABLE 2 . Summary o f p h y s i c a l c h a r a c t e r i s t i c s f o r t h e w a t e rs o u r c e s u s e d f o r e x p e r i m e n t a l i o d i n e i n a c t i v a t i o n o f IHNV

W a t e r s o u r c e H a r d n e S S a A l k a l i n i t y ' p H b( m g / l i t e r ) ( m g / l i t e r )L y o n s F e r r y H a t c h e r y , W a s h . 1 5 4 1 6 0 6 . 6Round B u t t e H a t c h e r y , O r e g . 4 6 8 0 7 . 1C o l e m a n H a t c h e r y , C a l i f . 6 8 7 0 7 . 0C e d a r R i v e r , W a s h . 2 6 3 5 6 . 5NFRS w e t l a b , W a s h . c 4 2 4 5 6 . 7D w o r s h a k H a t c h e r y , I d a h o 1 4 2 0 6 . 0U n i v e r s i t y o f W a s h i n g t o n 4 3 5 0 6 . 8H a t c h e r y , W a s h .S o a p L a k e , W a s h . 2 4 6 , 9 0 0 1 0 . 0

a H a r d n es s a n d a l k a l i n i t y w e r e m e a s u r e d b y u s i n g t e s t k i t s ( H a c h C o . ) a n de x p r e s s e d a s m i l l i g r a m s o f C a C O 3 p e r l i t e r .b T h e h y d r o g e n i o n c o n c e n t r a t i o n w a s m e a s u r e d b y u s i n g a c a l i b r a t e d p Hm e t e r ( C o r n i n g ) .c L a k e W a s h i n g t o n w a t e r f r o m t h e w e t l a b a t t h e N a t i o n a l F i s h e r i e s R e -s e a r c h C e n t e r i n S e a t t l e w a s t e s t e d a s a d i l u e n t .

S u s p e n s i o n s o f BSA w e r e p r e p a r e d a t 0 , 0 . 0 0 4 , 0 . 0 0 8 , 0 . 0 1 6 ,0 . 0 3 2 , 0 . 0 6 4 , 0 . 1 2 8 , 0 . 2 5 6 , a n d 0 . 5 1 2 % , a n d s u s p e n s i o n s o fFB S w e r e p r e p a r e d a t 0 , 0 . 0 3 2 , 0 . 0 6 4 , 0 . 1 2 8 , 0 . 2 5 6 , 0 . 5 1 2 ,1 . 0 2 4 , 2 . 0 4 8 , a n d 4 . 0 9 6 % . F o r e a c h t r i a l , 0 . 5 m l o f e a c hp r o t e i n s u s p e n s i o n w a s a d d e d t o 0 . 5 m l o f IHNV ( 2 x 1 0 5P F U / m l ) . A f t e r 2 m i n o f i n c u b a t i o n , 1 m l o f 0 . 8 - m g / l i t e ri o d i n e s o l u t i o n w a s a d d e d t o t h e m i x t u r e a n d a l l o w e d t or e a c t f o r 5 m i n . T h e i o d i n e i n t h e B S A - v i r u s m i x t u r e s w a sn e u t r a l i z e d b y t h e a d d i t i o n o f 2 m l o f MEM-5T, a n d t h ei o d i n e i n t h e F B S - v i r u s m i x t u r e s was n e u t r a l i z e d b y t h ea d d i t i o n o f 2 m l o f MEM-BSA.T h i s e x p e r i m e n t was r e p e a t e d w i t h n a t u r a l s e d i m e n t f r o mt h e C e d a r R i v e r , W a s h . S e d i m e n t a t 0 , 0 . 1 0 , 0 . 4 0 , 1 . 6 0 , a n d6 . 4 0 % ( w t / v o l ) was s u s p e n d e d i n d i s t i l l e d - d e i o n i z e d w a t e rc o n t a i n i n g IHNV. A f t e r a 5 - m i n e x p o s u r e o f i o d i n e t o t h ev i r u s - s e d i m e n t m i x t u r e s , 2 m l o f MEM-BSA w a s a d d e d t os t o p t h e i n a c t i v a t i o n p r o c e s s .

I o d i n e w a s a l s o c o m b i n e d w i t h s e v e r a l c o n c e n t r a t i o n s o fBSA f o r 2 m i n b e f o r e a d d i n g a n e q u a l v o l u m e o f IHNV.A f t e r e x p o s u r e f o r 5 m i n , MEM-5T wa s a d d e d t o s t o p t h ei n a c t i v a t i o n p r o c e s s .I o d i n e n e u t r a l i z e d b y s o d i u m t h i o s u l f a t e . B e c a u s e r e m o v a lo f f r e e i o d i n e m i g h t b e r e q u i r e d b e f o r e t r e a t e d w a t e r c o u l db e u s e d f o r f i s h c u l t u r e , we t e s t e d t h e c o n c e n t r a t i o n o fs o d i u m t h i o s u l f a t e t h a t c o u l d n e u t r a l i z e t h e l e v e l o f i o d i n eu s e d . S o d i u m t h i o s u l f a t e a t 0 , 1 0 2 , 1 0 - 3 , 1 0 - 4 , 1 0 - 5 , a n d1 0 - 6 M wa s r e a c t e d f o r 2 m i n w i t h a n e q u a l v o l u m e o f0 . 8 8 - m g / l i t e r ( 3 . 5 x 1 0 - 6 M) f r e e i o d i n e ( P V P - I ) . An e q u a lv o l u m e o f IHNV wa s a d d e d t o t h i s m i x t u r e f o r a 5 - m i ne x p o s u r e b e f o r e t h e i o d i n e wa s n e u t r a l i z e d w i t h MEM-BSA.D i s t i l l e d - d e i o n i z e d w a t e r wa s m i x e d w i t h IHNV f o r 5 m i n a sa n i o d i n e - f r e e c o n t r o l .I o d i n e e f f i c a c y i n n a t u r a l w a t e r s a m p l e s . W a t e r s a m p l e sw e r e c o l l e c t e d f r o m l o c a t i o n s w h e r e IHN e p i z o o t i c s h a do c c u r r e d o r w h e r e w a t e r h a d p a r t i c u l a r p h y s i c a l c h a r a c t e r -i s t i c s o f i n t e r e s t ( T a b l e 2 ) . E a c h w a t e r s o u r c e wa s u s e d t op r e p a r e i o d i n e s o l u t i o n s a t s e v e r a l c o n c e n t r a t i o n s a n d t op r e p a r e a s t o c k s o l u t i o n o f t h e D w o r s h a k i s o l a t e o f IHNV.E q u a l ( 5 0 - m l ) v o l u m e s o f P V P - i o d i n e a n d IHNV s o l u t i o n sw e r e p o u r e d s i m u l t a n e o u s l y i n t o a s t e r i l e b e a k e r a n d m i x e dw i t h a m a g n e t i c s t i r r e r . A 1 - m l s a m p l e wa s r e m o v e d a f t e r 7 . 5s o f m i x i n g a n d a d d e d t o 1 m l o f MEM-BSA t o s t o p t h ei n a c t i v a t i o n p r o c e s s . The v i r u s i n a c t i v a t i o n t e s t s were p e r -f o r m e d f o r e a c h w a t e r s o u r c e a t f i n a l f r e e i o d i n e c o n c e n t r a -t i o n s o f 0 , 0 . 0 5 , 0 . 1 0 , 0 . 2 0 , 0 . 4 0 , a n d 0 . 8 0 m g / l i t e r .

E f f i c a c y o f p i l o t p l a n t t r e a t m e n t o f h a t c h e r y w a t e r . A t t h eD w o r s h a k N a t i o n a l F i s h H a t c h e r y , a s a t u r a t e d s o l u t i o np r e p a r e d f r o m b u l k - g r a d e c r y s t a l i o d i n e wa s a d d e d b y am e t e r i n g pump t o p r o v i d e a 0 . 3 1 - m g / l i t e r f r e e i o d i n e c o n c e n -t r a t i o n i n w a t e r d e l i v e r e d t o r a c e w a y s u s e d f o r j u v e n i l e f i s hr e a r i n g . T h r e e r e p l i c a t e s o f t h e f o l l o w i n g c o m b i n a t i o n s w e r ep e r f o r m e d : ( i ) a 9 0 - m l s a m p l e o f i o d i n e - t r e a t e d w a t e r wa sr e m o v e d f r o m t h e r a c e w a y ; ( i i ) a 4 5 - m l s a m p l e o f i o d i n e -t r e a t e d w a t e r wa s r e m o v e d f r o m t h e r a c e w a y a n d a d d e d t o4 5 m l o f raw h a t c h e r y w a t e r t o p r o v i d e a 1 : 2 d i l u t i o n ; ( i i i ) a2 2 . 5 - m l s a m p l e o f i o d i n e - t r e a t e d w a t e r wa s r e m o v e d f r o mt h e r a c e w a y a n d a d d e d t o 6 7 . 5 m l o f r aw h a t c h e r y w a t e r t op r o v i d e a 1 : 4 d i l u t i o n . T h e s o l u t i o n s were m i x e d a n d com-b i n e d w i t h 1 0 m l o f IHNV. A f t e r 7 . 5 , 1 5 , 3 0 , a n d 6 0 s o fm i x i n g on a m a g n e t i c s t i r r e r , a 1 - m l v o l u m e wa s r e m o v e da n d a d d e d t o 1 m l o f MEM-BSA t o n e u t r a l i z e t h e i o d i n e . Asa n i o d i n e - f r e e c o n t r o l , 9 0 m l o f r aw h a t c h e r y w a t e r wa sc o m b i n e d w i t h 1 0 m l o f IHNV. A f t e r 6 0 s , a 1 - m l v o l u m e wa st r a n s f e r r e d t o 1 m l o f MEM-BSA.A c u t e t o x i c i t y a n d e f f i c a c y o f i o d i n e . P r e l i m i n a r y f i s h t o x -i c i t y a n d e f f i c a c y t r i a l s were p e r f o r m e d . I o d i n e c o n c e n t r a -t i o n s o f 0 , 0 . 2 5 , 0 . 5 , 1 . 0 , 2 . 0 , a n d 4 . 0 m g / l i t e r were p r e p a r e di n a q u a r i a s u p p l i e d w i t h w a t e r f r o m L a k e W a s h i n g t o n . F o re a c h i o d i n e c o n c e n t r a t i o n , t h e D w o r s h a k i s o l a t e o f IHNVwa s a d d e d t o p r o v i d e 1 0 3 P F U / m l i n e a c h o f two r e p l i c a t ea q u a r i a , w h i l e two o t h e r a q u a r i a r e c e i v e d c e l l c u l t u r e m e -d i u m . A f t e r t h e v i r u s wa s e x p o s e d f o r 5 m i n t o i o d i n e , 2 0r a i n b o w t r o u t f r y were p l a c e d i n e a c h a q u a r i u m f o r 1 h ( w i t ha e r a t i o n ) . F l o w i n g water wa s t h e n p r o v i d e d t o a l l a q u a r i a ,a n d d e a d f i s h were r e m o v e d e a c h d a y f o r v i r u s a n a l y s i s .W h o l e f r y were d i l u t e d 1 : 1 0 ( w t / v o l ) i n MEM-T a n d h o m o g -e n i z e d , d e b r i s wa s r e m o v e d b y c e n t r i f u g a t i o n ( 1 , 0 0 0 x g , 1 0m i n ) , a n d t h e s u p e r n a t a n t wa s a s s a y e d b y p l a q u e a s s a y . T h ee x p e r i m e n t wa s t e r m i n a t e d a f t e r 1 4 d a y s .

RESULTSI o d i n e e f f i c a c y i n d i s t i l l e d - d e i o n i z e d w a t e r . A t a f i n a l c o n -

c e n t r a t i o n o f 0 . 0 5 6 m g o f f r e e i o d i n e p e r l i t e r i n d i s t i l l e d -d e i o n i z e d w a t e r , a 7 . 5 - s e x p o s u r e i n a c t i v a t e d over 9 9 . 9 9 % o fIHNV ( F i g . 1 ) . I o d i n e a t 0 . 0 2 6 m g / l i t e r a n d 7 . 5 - s c o n t a c ti n a c t i v a t e d 9 8 . 2 % o f t h e i n f e c t i o u s v i r u s , w h e r e a s a 6 0 - sc o n t a c t wa s r e q u i r e d t o a c h i e v e 9 9 . 9 9 % i n a c t i v a t i o n . A v i r u si n a c t i v a t i o n o f 9 7 . 2 % o c c u r r e d when 0 . 0 1 3 m g o f f r e e i o d i n ep e r l i t e r wa s i n c u b a t e d w i t h IHNV f o r 6 0 s . As e x p e c t e d , ag r e a t e r i n a c t i v a t i o n o f v i r u s o c c u r r e d when t h e i o d i n e con-c e n t r a t i o n o r c o n t a c t d u r a t i o n wa s i n c r e a s e d . C o m p l e t ei n a c t i v a t i o n o f v i r u s o c c u r r e d w i t h i n 7 . 5 s a t i o d i n e concen-t r a t i o n s o f 0 . 1 1 , 0 . 2 2 , a n d 0 . 4 2 m g o f f r e e i o d i n e p e r l i t e r .V i r u s i n a c t i v a t i o n wa s n o t a p p r e c i a b l y g r e a t e r when e x p o -s u r e t i m e s i n c r e a s e d f r o m 2 t o 3 2 m i n .E f f i c a c y o f d i f f e r e n t i o d i n e f o r m u l a t i o n s . P o w d e r , l i q u i d( i o d o p h o r ) , a n d c r y s t a l i o d i n e a t 0 . 1 0 m g / l i t e r p r o v i d e dg r e a t e r t h a n 9 9 . 9 9 % r e d u c t i o n o f IHNV t i t e r s i n a 7 . 5 - se x p o s u r e . A l t h o u g h t h e m a j o r i t y o f t h e l a b o r a t o r y s t u d i e swere d o n e w i t h P V P - I a s a p o w d e r , t h e r e s u l t s were c o m -p a r a b l e t o t h o s e a c h i e v e d u s i n g i o d i n e f r o m c r y s t a l s , t h ef o r m l i k e l y t o b e u s e d i n t r e a t m e n t o f h a t c h e r y water d u e t oc o s t , c o m m e r c i a l a v a i l a b i l i t y , a n d ease o f a p p l i c a t i o n .I o d i n e e f f i c a c y a g a i n s t d i f f e r e n t IHNV i s o l a t e s . V i r u s i s o -l a t e s r e p r e s e n t i n g t h e f i v e e l e c t r o p h e r o t y p e s o f IHNV werei n a c t i v a t e d b y a t l e a s t 9 9 . 4 % b y e x p o s u r e f o r 7 . 5 s t o i o d i n ea t a f i n a l c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 1 0 m g / l i t e r ( T a b l e 3 ) . A t t h i ss h o r t c o n t a c t t i m e a n d l o w l e v e l o f i o d i n e , i s o l a t e s o f IHNVb e l o n g i n g t o e l e c t r o p h e r o t y p e 1 or 2 we r e i n a c t i v a t e d t o ag r e a t e r e x t e n t .

VOL. 5 7 , 1 9 9 1


4/7

1 3 8 2 BATTS ET A L .5-

-J

EU. 4-0V3I E.o .c 2-0C0

1

I I I

0 15 30 45 60Time (seconds)

FIG. 1 . I n a c t i v a t i o n o f t h e Dworshak i s o l a t e of IHNV wh e ncombined w i t h t h r e e i o d i n e c o n c e n t r a t i o n s f o r v a r i o u s c o n t a c tt i m e s . V i r u s and i o d i n e s o l u t i o n s w e r e p r e p a r e d i n d i s t i l l e d - d e i o n -i z e d water and mixed w i t h a m a g n e t i c s t i r r e r . At e a c h t i m e p o i n t , as a m p l e was r e mov ed and combined w i t h a s o l u t i o n o f BSA t o s t o pt h e i n a c t i v a t i o n p r o c e s s . Th e d e t e c t i o n l i m i t o f t h e p l a q u e a s s a y was0 . 5 2 l o g 1 o PFU/ml. Th e f r e e i o d i n e c o n c e n t r a t i o n s a f t e r c o m b i n i n gw i t h v i r u s were 0 . 0 1 3 m g / l i t e r ( 0 ) , 0 . 0 2 6 m g / l i t e r ( A ) , an d 0 . 0 5 6m g / l i t e r ( U ) .

C h a n g e s i n t h e d i l u t i o n o f s t o c k v i r u s r e s u l t e d i n q u i t ed i f f e r e n t i n a c t i v a t i o n e f f i c i e n c i e s . Wh e n t h e Dworshak i s o -l a t e was combined f o r 5 m i n a t 0 . 0 7 mg o f f r e e i o d i n e perl i t e r , over 99.9% o f IHNV was i n a c t i v a t e d a t s t o c k v i r u sd i l u t i o n s o f 1 : 1 , 0 0 0 or 1 : 1 0 , 0 0 0 . H o w e v e r , i n a c t i v a t i o n wasr e l a t i v e l y poor ( < 9 7 . 2 % ) a t f r e e i o d i n e c o n c e n t r a t i o n s up t o0 . 6 2 m g / l i t e r w h e n t h e v i r u s was d i l u t e d 1 : 1 0 0 . When i o d i n e( 0 . 7 m g / l i t e r , f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) was added t o s t o c k v i r u sd i l u t i o n s o f 1 : 1 0 0 , 1 : 1 , 0 0 0 , and 1 : 1 0 , 0 0 0 ( f i n a l ) , t h e f r e ei o d i n e c o n c e n t r a t i o n r e m a i n i n g was l e s s t h a n 1 0 % ( b e l o wd e t e c t i o n ) , 4 1 % , and 9 4 % , r e s p e c t i v e l y .E f f e c t o f w a t e r q u a l i t y on e f f i c a c y o f i o d i n e . I n a c t i v a t i o n o fIHNV b y i o d i n e showed a r e d u c t i o n i n e f f i c a c y w i t h i n c r e a s -i n g p H ( T a b l e 4 ) . When r e a c t e d f o r 5 m i n a t 0 . 4 mg o f f r e ei o d i n e p e r l i t e r i n water b u f f e r e d a t p H 6 . 0 , 6 . 5 , 7 . 0 , and 7 . 5 ,TABLE 3 . I n a c t i v a t i o n o f s e l e c t e d v i r u s i s o l a t e s r e p r e s e n t i n g t h e

f i v e e l e c t r o p h e r o t y p e s o f IHNV b y 0 . 1 0 mg o f i o d i n e( P V P - I ) p e r l i t e r i n d i s t i l l e d - d e i o n i z e d waterV i r u s t i t e r

( l o g l o %HNVisolate t y p e a Water + Iodine + ReducedIHNVb IHNVC

Dworshak 1 4 . 6 2 < 0 . 5 2 > 9 9 . 9 9Round Butte 1 5 . 1 1 1 . 7 0 9 9 . 9 6Cowlitz 2 4 . 5 3 < 0 . 5 2 > 9 9 . 9 9Sacram ento R i v e r 3 5 . 1 8 2 . 8 8 9 9 . 4 9Col e m a n 4 5 . 0 0 2 . 3 4 9 9 . 7 8C edar River 5 5 . 0 0 2 . 1 8 9 9 . 8 5aVirus i s o l a t e s w e r e c l a s s i f i e d a c c o r d i n g t o Hsu e t a l . ( 1 4 ) . S e e T a b l e 1 f o r

d e t a i l s about t h e i s o l a t e s u s e d .bWater and IHNV w e r e combined i n 5 0 - m l volumes f o r 6 0 s b e f o r e as a m p l e wa s added t o MEM-BSA.CIodine and IHNV w e r e combined i n 5 0 - m l volumes f or 7 .5 s b e f o r e a

s a m p l e w as a dd ed t o MEM-BSA t o s t o p t h e i n a c t i v a t i o n p r o c e s s .

TABLE 4 . E f f e c t o f p H o n t h e i n a c t i v a t i o n o f t h e D w o r s h a ki s o l a t e o f IHNV b y 0 . 4 m g o f i o d i n e p e r l i t e ra s P V P - I o r p u r e c r y s t a l s aMean v i r u s t i t e r Mean v i r u s t i t e r

B u f f e r pH ( l o g l o P F U / m l ) % R e - ( l o g 1 o P F U / m l ) % R e -B u f f e r + P + d u c e d b o f c r y s t a l + d u c e d bIHNV IHNV IHNVP h o s p h a t e 6 . 0 4 . 6 2 < 0 . 5 2 > 9 9 . 9 9 < 0 . 5 2 > 9 9 . 9 9P h o s p h a t e 6 . 5 4 . 5 2 < 0 . 5 2 > 9 9 . 9 9 < 0 . 5 2 > 9 9 . 9 9P h o s p h a t e 7 . 0 4 . 6 6 < 0 . 5 2 > 9 9 . 9 9 < 0 . 5 2 > 9 9 . 9 9P h o s p h a t e 7 . 5 4 . 7 0 < 0 . 5 2 > 9 9 . 9 9 < 0 . 5 2 > 9 9 . 9 9T r i s 7 . 5 4 . 7 2 0 . 8 3 9 9 . 9 9 1 . 4 3 9 9 . 9 5T r i s 8 . 0 4 . 7 4 1 . 8 0 9 9 . 8 9 2 . 1 5 9 9 . 7 5T r i s 8 . 5 4 . 6 9 2 . 3 2 9 9 . 5 7 2 . 6 3 9 9 . 1 2T r i s 9 . 0 4 . 7 1 3 . 6 7 9 0 . 7 8 3 . 7 6 8 8 . 6 3

a V i r u s a n d i o d i n e w e r e d i l u t e d i n b u f f e r e d s o l u t i o n s a n d c o m b i n e d f o r 5m i n b e f o r e t h e i n a c t i v a t i o n p r o c e s s w a s s t o p p e d w i t h MEM-BSA.b P e r c e n t r e d u c t i o n o f v i r u s t i t e r b y i o d i n e c o m p a r e d w i t h c o n t r o l s c o n t a i n -i n g b u f f e r a n d v i r u s .

t h e t i t e r o f i n f e c t i o u s v i r u s was r e d u c e d b y a t l e a s t 9 9 . 9 5 % .F o r h i g h e r p H l e v e l s , t h e e f f i c a c y c o n t i n u e d t o d r o p t o a b o u t9 0% r e d u c t i o n a t p H 9 . 0 . D u r i n g p r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t a lt r i a l s , s e v e r a l b i o l o g i c a l b u f f e r s n e u t r a l i z e d f r e e i o d i n e r a p -i d l y a n d c o u l d n o t b e u s e d f o r i n a ct i va t i o n s t u d i es ( da t a n o ts h o w n ) .I n a c t i v a t i o n o f IHNV b y i o d i n e wa s n o t a f f e c t e d b yt e m p e r a t u r e u n d e r t h e c o n d i t i o n s u s e d ( d a t a n o t s h o w n ) .When i n c u b a t e d f o r 5 m i n a t 0 . 4 m g o f i o d i n e p e r l i t e r , t h et i t e r o f i n f e c t i o u s v i r u s w a s r e d u c e d b y a t l e a s t 9 9 . 9 5 % f o r a l lt e m p e r a t u r e s t e s t e d .I n a c t i v a t i o n o f IHNV b y i o d i n e was n o t a f f e c t e d b ys a l i n i t y u n d e r t h e c o n d i t i on s u s e d ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e t i t e ro f i n f e c t i o u s v i r u s was r e d u c e d b y a t l e a s t 9 9 . 9 9 % wheni n c u b a t e d f o r 5 m i n a t 0 . 4 m g o f i o d i n e p e r l i t e r i n d i l u t i o n so f n a t u r a l s e a w a t e r c o n t a i n i n g 0 , 4 . 0 , 7 . 5 , 1 5 . 5 , a n d 3 2 . O o os a l t s .I n a c t i v a t i o n o f IHNV b y i o d i n e w a s n o t g r e a t l y a f f e c t e db y w a t e r h a r d n e s s a s l o n g a s t h e a l k a l i n i t y a n d p H w e r ec o n t r o l l e d ( d a t a n o t s h o w n ) . I o d i n e a t 0 . 4 m g / l i t e r i n a c t i -v a t e d IHNV i n 5 - m i n e x p o s u r e s b y a t l e a s t 9 9 . 8 % . I n t h i ss t u d y , p H w a s m a i n t a i n e d b e t w e e n 7 . 4 a n d 7 . 8 a n d a l k a l i n i t yw a s m a i n t a i n e d b e t w e e n 2 5 7 a n d 2 7 4 m g / l i t e r a s C a C 0 3 .I o d i n e e f f i c a c y i n t h e p r e s e n c e o f o r g a n i c m a t e r i a l . T h ep r o t e i n s BSA a n d FBS e f f i c i e n t l y p r e v e n t e d t h e i n a c t i v a t i o no f IHNV b y i o d i n e . When s 0 . 0 1 6 % BSA ( f i n a l ) w a s c o m -b i n e d w i t h t h e v i r u s b e f o r e a d d i n g t h e i o d i n e , t h e v i r u s t i t e rwas r e d u c e d a t l e a s t 9 9 . 9 6 % . H o w e v e r , a t . 0 . 0 3 2 % BSA( f i n a l ) , t h e IHNV t i t e r r e d u c t i o n w a s l e s s t h a n 9 3% ( T a b l e 5 ) .A f i n a l BSA c o n c e nt r a t i o n o f 0 . 1 2 8 % h a d n o e f f e c t o n t h ed e t e c t i o n o f v i r u s b y t h e p l a q u e a s s a y .When 0 . 4 m g o f f i n a l i o d i n e p e r l i t e r w a s c o m b i n e d w i t hBSA f o r 2 m i n b e f o r e a d d i n g IHNV, t h e i n a c t i v a t i o n b yi o d i n e was p o o r a t 0 . 0 0 8 0 % BSA ( f i n a l c o n c e n t r a t i o n w i t hi o d i n e a d d e d ) b u t e x c e l l e n t a t a BSA c o n c e n t r a t i o n o f0 . 0 0 4 0 % o r l o w e r ( T a b l e 5 ) .FBS w a s l e s s e f f e c t i v e t h a n BSA a t b l o c k i n g IHNVi n a c t i v a t i o n b y i o d i n e ( d a t a n o t s h o w n ) . When 0 . 1 2 8 %( f i n a l ) FBS was c o m b i n e d w i t h t h e v i r u s b e f o r e a d d i n g t h ei o d i n e , t h e v i r u s t i t e r w a s r e d u c e d a t l e a s t 9 9 . 9 9 % . H o w e v e r ,a t . 0 . 2 5 6 % ( f i n a l ) , t h e IHNV t i t e r r e d u c t i o n w a s l e s s t h a n9 7 . 5 % . A f i n a l FBS c o n c e n t r a t i o n o f 6 . 4 % h a d n o e f f e c t o nt h e d e t e c t i o n o f IHNV b y t h e p l a q u e a s s a y .When s 0 . 4 0 % ( f i n a l ) C e d a r R i v e r s e d i m e n t was c o m b i n e d

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .


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INACTIVATION OF IH N VIRUS BY IODINE 1 3 8 3TABLE 5 . E f f e c t o f BSA o n i o d i n e ( P V P - I ) i n a c t i v a t i o n o f t h eD w o r s h a k i s o l a t e o f IHNV"

I o d i n e + BSA + IHNV + BSA +B S A b I o d i n e c IHNV i o d i n e( % ) ( m g / l i t e r ) T i t e r d % R e d u c e d T i t e r % R e d u c e d0 0 5 . 0 4 4 . 8 10 0 . 4 < 0 . 5 2 > 9 9 . 9 9 < 0 . 5 2 > 9 9 . 9 90 . 0 0 2 0 . 4 < 0 . 5 2 > 9 9 . 9 9 < 0 . 5 2 > 9 9 . 9 90 . 0 0 4 0 . 4 0 . 8 3 9 9 . 9 9 < 0 . 5 2 > 9 9 . 9 90 . 0 0 8 0 . 4 4 . 8 1 4 1 . 8 2 < 0 . 5 2 > 9 9 . 9 90 . 0 1 6 0 . 4 5 . 0 4 0 . 0 0 1 . 1 1 9 9 . 9 60 . 0 3 2 0 . 4 ND e ND 3 . 4 1 9 2 . 7 80 . 0 6 4 0 . 4 ND ND 4 . 0 8 6 6 . 6 7

a E q u a l v o l u m e s ( 5 0 0 , u l ) o f t h e f i r s t s o l u t i o n s w e r e c o m b i n e d f o r 2 m i nb e f o r e 1 , 0 0 0 p . l o f t h e o t h e r s o l u t i o n w a s a d d e d . A f t e r 5 m i n , MEM-5T w a sa d d e d t o s t o p t h e i n a c t i v a t i o n p r o c e s s .b BSA w a s p r e p a r e d i n d i s t i l l e d - d e i o n i z e d w a t e r . T h e l e v e l o f BSA r e p o r t e di s t h e c o n c e n t r a t i o n a f t e r c o m b i n a t i o n w i t h i o d i n e .' F i n a l i o d i n e c o n c e n t r a t i o n a f t e r b e i n g c o m b i n e d w i t h IHNV.d R e m a i n i n g IHNV ( l o g l o P F U / p e r m i l l i l i t e r ) b y p l a q u e a s s a y .eND, n o t d o n e .

w i t h IHNV b e f o r e a d d i n g i o d i n e , t h e t i t e r o f IHNV w a sr e d u c e d b y g r e a t e r t h a n 9 9 . 9 9 % ( d a t a n o t s h o w n ) . A t 1 . 6 0 %( f i n a l ) s e d i m e n t , t h e t i t e r o f IHNV w a s r e d u c e d b y 9 9 . 7 5 % ,s u g g e s t i n g t h a t l i t t l e , i f a n y , r e d u c t i o n i n e f f i c a c y w a s c a u s e db y s e d i m e n t l e v e l s t h a t e x c e e d t h o s e n o r m a l l y e n c o u n t e r e di n n a t u r a l w a t e r s u p p l i e s . No v i r u s r e d u c t i o n w a s a t t r i b u t e dt o t h e p r e s e n c e o f s e d i m e n t s i n c o n t r o l s l a c k i n g i o d i n e .I o d i n e n e u t r a l i z e d b y s o d i u m t h i o s u l f a t e . A l o w c o n c e n t r a -t i o n o f s o d i u m t h i o s u l f a t e e f f e c t i v e l y n e u t r a l i z e d t h e a b i l i t yo f i o d i n e t o i n a c t i v a t e IHNV ( d a t a n o t s h o w n ) . T h e c o n t r o lv i r u s t i t e r w i t h o u t i o d i n e p r e s e n t w a s 4 . 5 4 l o g 1 o P F U / m l .When 1 0 2 , 1 0 - 3 , 1 0 - 4 , o r 1 0 - 5 M s o d i u m t h i o s u l f a t e wasa d d e d t o a n e q u a l v o l u m e o f 0 . 8 8 - m g / l i t e r ( 3 . 5 x 1 0 - 6 M)i o d i n e b e f o r e c o m b i n i n g w i t h IHNV, n o v i r u s t i t e r r e d u c t i o no c c u r r e d . H o w e v e r , a t 1 0 - 6 M, a 9 9 . 9 9 % t i t e r r e d u c t i o no c c u r r e d , s u g g e s t i n g t h a t i n s u f f i c i e n t s o d i u m t h i o s u l f a t e wasnow p r e s e n t t o n e u t r a l i z e t h e i o d i n e .I o d i n e e f f i c a c y i n n a t u r a l w a t e r s a m p l e s . When v i r u s a n di o d i n e w e r e p r e p a r e d i n w a t e r s a m p l e s f r o m v a r i o u s n a t u r a ls o u r c e s a n d m i x e d f o r 7 . 5 s , 0 . 2 0 m g o f i o d i n e p e r l i t e ri n a c t i v a t e d 9 9 . 9 % o f t h e IHNV f o r s i x o f t h e e i g h t w a t e rTABLE 6 . R e m a i n i n g IHNV ( D w o r s h a k i s o l a t e ) c o n c e n t r a t i o nf o l l o w i n g 7 . 5 - s e x p o s u r e t o s e v e r a l i o d i n e ( P V P - I ) c o n c e n t r a t i o n sw i t h v a r i o u s w a t e r s o u r c e s a s t h e d i l u e n t '

Mean t i t e r ( l o g l o P F U / m l )W a t e r s o u r c e a t a f i n a l i o d i n e c o n c n ( m g / l i t e r ) o f :a s d i l u e n t b 0 0 . 0 5 0 . 1 0 0 . 2 0 0 . 4 0 0 . 8 0L y o n s F e r r y 4 . 9 1 3 . 6 1 1 . 2 3 < 0 . 5 2 c NDd < 0 . 5 2R o u n d B u t t e 4 . 7 9 4 . 3 6 2 . 7 4 0 . 5 2 0 . 5 2 < 0 . 5 2C o l e m a n 4 . 4 0 4 . 3 6 3 . 3 2 < 0 . 5 2 < 0 . 5 2 < 0 . 5 2C e d a r R i v e r 4 . 7 0 4 . 7 9 3 . 4 5 < 0 . 5 2 0 . 5 2 < 0 . 5 2NFRS w e t l a b 4 . 5 4 4 . 5 4 4 . 5 1 0 . 8 3 < 0 . 5 2 < 0 . 5 2D w o r s h a k 4 . 8 2 4 . 8 8 4 . 8 7 1 . 5 2 < 0 . 5 2 < 0 . 5 2U n i v e r s i t y o f 4 . 4 1 4 . 4 5 4 . 4 6 2 . 8 5 < 0 . 5 2 < 0 . 5 2W a s h i n g t o nS o a p L a k e 4 . 6 3 4 . 8 1 4 . 8 6 4 . 5 7 4 . 1 8 0 . 5 2

a T h e i o d i n e was n e u t r a l i z e d b y a d d i n g t h e m i x t u r e t o a n e q u a l v o l u m e o fMEM-BSA.b S e e T a b l e 2 f o r d e t a i l s o f p h y s i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f e a c h w a t e r s o u r c e .c D e t e c t i o n l i m i t o f IHNV b y t h e p l a q u e a s s a y wa s 3 . 3 P F U / m l .d ND, n o t d o n e .

TABLE 7 . I n a c t i v a t i o n o f t h e D w o r s h a k i s o l a t e o f IHNV whenm i x e d w i t h s a mp l e s o f D w o r s h a k H a t c h e r y ( I d a h o ) w a t e r m e t e r e dc o n t i n u o u s l y t o c o n t a i n 0 . 3 1 m g o f f r e e i o d i n e p e r l i t e r "F i n a l M e a n IHNV t i t e r ( l o g 1 o P F U / m l ) a f t e r aT r e a t m e n t i o d i n e t r e a t m e n t e x p o s u r e o f :+HNV ( m g / l i t e r ) " 7 . 5 s 1 5 s 3 0 s 6 0 s

Raw w a t e r 0 ND C ND ND 4 . 4 6l o d i n a t e d 0 . 2 8 0 . 5 2 < 0 . 5 2 < 0 . 5 2 < 0 . 5 2l o d i n a t e d 0 . 1 4 1 . 4 8 0 . 8 3 0 . 5 2 0 . 5 2l o d i n a t e d 0 . 0 7 4 . 5 4 4 . 5 1 4 . 4 6 4 . 4 3a F o l l o w i n g e x p o s u r e o f v i r u s t o d i l u t i o n s o f i o d i n e - t r e a t e d w a t e r , t h ei n a c t i v a t i o n p r o c e s s w a s s t o p p e d b y a d d i n g MEM-BSA.b I o d i n e c o n c e n t r a t i o n was d e t e r m i n e d f r o m t e s t k i t r e s u l t s ( H a c h C o . ) a n dd i l u t i o n o f i o d i n e - t r e a t e d w a t e r w i t h IHNV. T w o f o l d d i l u t i o n s o f t h e i o d i n e -t r e a t e d w a t e r w e r e p e r f o r m e d w i t h D w o r s h a k raw h a t c h e r y w a t e r a s t h ed i l u e n t .cND, n o t d o n e .

s o u r c e s ( T a b l e 6 ) . T h e b e s t n a t u r a l d i l u e n t w a t e r f o r i o d i n ei n a c t i v a t i o n o f IHNV was f r o m t h e L y o n s F e r r y h a t c h e r y ;0 . 1 0 m g o f i o d i n e p e r l i t e r i n a c t i v a t e d 9 9 . 9 8 % o f t h e IHNVa n d 0 . 0 5 m g o f i o d i n e p e r l i t e r i n a c t i v a t e d 9 5 . 0 % whend i l u t e d i n t h i s w a t e r . A c o nc e nt r a t i o n o f 0 . 2 0 m g o f i o d i n ep e r l i t e r i n a c t i v a t e d 9 7 . 3 % o f t h e v i r u s when w a t e r f r o m t h eU n i v e r s i t y o f W a s h i n g t o n h a t c h e r y wa s u s e d a s t h e d i l u e n t ,a l t h o u g h 0 . 4 0 m g o f i o d i n e p e r l i t e r r e d u c e d t h e t i t e r b yg r e a t e r t h a n 9 9 . 9 9 % . An i o d i n e c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 8 0 m g / l i t e rwas r e q u i r e d b e f o r e a n y s i g n i f i c a n t i n a c t i v a t i o n o f IHNVw a s o b s e r v e d i n S o a p L a k e w a t e r .E f f i c a c y o f p i l o t p l a n t t r e a t m e n t o f h a t c h e r y w a t e r . S a m p l e so f i o d i n e - t r e a t e d h a t c h e r y w a t e r e f f e c t i v e l y i n a c t i v a t e dIHNV. When 0 . 2 8 m g o f i o d i n e p e r l i t e r ( f i n a l c o n c e n t r a t i o n )was r e a c t e d w i t h IHNV f o r 7 . 5 s , t h e v i r u s t i t e r wa s r e d u c e db y 9 9 . 9 9 % ( T a b l e 7 ) . A t 0 . 1 4 m g o f i o d i n e p e r l i t e r , a 7 . 5 - sc o n t a c t w i t h v i r u s r e s u l t e d i n 9 9 . 9 0 % i n a c t i v a t i o n , w h e r e a s a3 0 - s c o n t a c t i n a c t i v a t e d 9 9 . 9 9 % o f t h e v i r u s . No r e d u c t i o n i nv i r u s t i t e r was e v i d e n t a t 0 . 0 7 m g o f i o d i n e p e r l i t e r f o re x p o s u r e t i m e s u p t o 6 0 s .A c u t e t o x i c i t y a n d e f f i c a c y o f i o d i n e . P r e l i m i n a r y t e s t s werec o n d u c t e d t o d e t e r m i n e t h e a b i l i t y o f i o d i n e t o p r e v e n ti n f e c t i o n o f f i s h a n d t o t e s t t h e a c u t e t o x i c i t y o f i o d i n e f o rr a i n b o w t r o u t f r y ( d a t a n o t s h o w n ) . F i s h were n o t i n f e c t e df o l l o w i n g e x p o s u r e t o a s o l u t i o n o f i o d i n e ( . 0 . 2 5 m g / l i t e r ,f i n a l c o n c e n t r a t i o n ) c o m b i n e d w i t h 1 0 3 PFU o f IHNV p e rm l , w h e r e a s IHN m o r t a l i t y ( 4 2 . 5 % ) o c c u r r e d i n f i s h r e c e i v -i n g IHNV a l o n e . M o r t a l i t y ( 1 0 0 % ) f r o m a c u t e t o x i c i t y o c -c u r r e d w i t h i n 2 4 h when f i s h were p l a c e d i n r e a r i n g w a t e rc o n t a i n i n g 2 a n d 4 m g o f f r e e i o d i n e p e r l i t e r , b u t noi o d i n e - a s s o c i a t e d m o r t a l i t y wa s o b s e r v e d a t o r b e l o w 1 m g o fi o d i n e p e r l i t e r . No m e a s u r a b l e i o d i n e r e m a i n e d a f t e r 1 h i nt h e a q u a r i a c o n t a i n i n g f i s h , p o s s i b l y d u e t o t h e i o d i n eb i n d i n g t o o r g a n i c w a s t e s e x c r e t e d b y t h e f i s h o r t o t h e f i s ht h e m s e l v e s .

DISCUSSIONT h i s s t u d y e x a m i n e d f a c t o r s a f f e c t i n g t h e i n a c t i v a t i o n o fIHNV i n w a t e r b y l o w l e v e l s o f i o d i n e . U n d e r t h e c o n d i t i o n su s e d i n t h i s s t u d y , w a t e r t e m p e r a t u r e , s a l i n i t y , a n d h a r d n e s sh a d n o e f f e c t on t h e i n a c t i v a t i o n . B e c a u s e IHNV i s as a l m o n i d f i s h v i r u s , we d i d n o t t e s t t h e i n a c t i v a t i o n p r o c e s sa t t e m p e r a t u r e s , s a l i n i t i e s , p H s , o r h a r d n e s s l e v e l s o u t s i d et h e r a n g e e n c o u n t e r e d b y t h e v i r u s i n n a t u r e . A l l i o d i n ef o r m u l a t i o n s e f f e c t i v e l y i n a c t i v a t e d t h e s t r a i n s o f IHNV t h a tw e r e u s e d .

VOL. 5 7 , 1 9 9 1


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1 3 8 4 BATTS ET AL.T h e i n a c t i v a t i o n o f IHNV b y i o d i n e was s i g n i f i c a n t l ya f f e c t e d b y t h e p H o f t h e s o l u t i o n . When v i r u s a n d i o d i n e

were r e a c t e d a t v a r i o u s p H l e v e l s , i n a c t i v a t i o n d e c r e a s e dw i t h i n c r e a s i n g p H . T h i s s u g g e s t s t h a t f o r w a t e r s h a v i n gh i g h e r p H , t h e i o d i n e c o n c e n t r a t i o n may n e e d t o b e i n -c r e a s e d s o m e w h a t t o o b t a i n s u f f i c i e n t i n a c t i v a t i o n o f IHNV.I o d i n e p r e p a r e d i n S o a p L a k e w a t e r ( p H 1 0 . 0 ) was e f f e c t i v eo n l y when 0 . 8 mg o f f r e e i o d i n e p e r l i t e r was p r e s e n t ,a l t h o u g h t h i s water was o u t s i d e t h e p H r a n g e ( 6 . 5 t o 8 . 0 ) a tw h i c h t r o u t n o r m a l l y ar e r e a r e d ( 2 6 ) .U n d e r o p t i m a l c o n d i t i o n s , a c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 0 5 6 mg o fi o d i n e p e r l i t e r r e d u c e d t h e IHNV t i t e r b y 9 9 . 9 9 % i n 7 . 5 s .Wh e n Am e nd a n d P i e t s c h ( 4 ) t e s t e d two i o d o p h o r d i s i n f e c -t a n t s a g a i n s t s a l m o n i d v i r u s e s , t h e y r e p o r t e d t h a t a 3 0 - sexposure t o 1 2 mg o f i o d i n e p e r l i t e r or a 1 5 - s exposure t o 2 5mg o f i o d i n e p e r l i t e r was r e q u i r e d f o r c o m p l e t e i n a c t i v a t i o no f IHNV. T h e h i g h e r l e v e l o f i o d i n e r e p o r t e d i n t h a t s t u d ym i g h t r e f l e c t d i f f e r e n c e s i n t h e amount o f v i r u s a n d t o t a lp r o t e i n p r e s e n t i n t h e r e ac t i o n m i x t u r e . O u r r e s u l t s s h o w e dt h a t t h e e f f i c a c y o f i o d i n e was d e p e n d e n t on t h e d i l u t i o n o ft h e IHNV s t o c k . T h i s d i f f e r e n c e was p r o b a b l y d u e t o t h ep r e s e n c e o f a d d i t i o n a l o r g a n i c m a t e r i a l ( e . g . , FBS or d e b r i sf r o m i n f e c t e d c e l l c u l t u r e s ) i n t h e l e s s d i l u t e p r e p a r a t i o n .A l s o , t h e h i g h v i r u s t i t e r i t s e l f may h a v e e x e r t e d a n i o d i n ed e m a n d .H o r i z o n t a l ( w a t e r b o r n e ) t r a n s m i s s i o n may c o n s t i t u t e am a j o r r o u t e b y w h i c h young f i s h a r e e x p o s e d t o IHNV ( 2 1 ) .P r e v e n t i o n o f exposure o f s u s c e p t i b l e s a l m o n i d s t o IHNVr e q u i r e s a n e f f e c t i v e m e c h a n i s m f o r r e d u c i n g t h e amount o fv i r u s c o m i n g i n t o a h a t c h e r y . F o r some h a t c h e r i e s , water-b o r n e e x p o s u r e c a n b e e l i m i n a t e d w i t h p a t h o g e n - f r e e waterf r o m w e l l s or s p r i n g s . O t h e r h a t c h e r i e s r e q u i r e treatment o ft h e w a t e r t o remove p a t h o g e n s , i n c l u d i n g v i r u s e s . I n t h i sr e g a r d , ozone t r e a t m e n t o f h a t c h e r y water h a s r e c e i v e da t t e n t i o n ( 3 0 , 3 1 ) .A l t h o u g h ozone i s a g o o d o x i d i z e r a n d i s e f f e c t i v e a t k i l l i n gf i s h p a t h o g e n s , i t i s t o x i c t o f r y a t l o w c o n c e n t r a t i o n s ( 3 1 )a n d must b e r e m o v e d b e f o r e f i s h ar e e x p o s e d t o t h e t r e a t e dw a t e r . T h e b i g g e s t d r a w b a c k t o ozone treatment i s t h e c o s to f e q u i p m e n t a n d o p e r a t i o n . To b e f a i l - s a f e , a b a c k u p systemi s r e q u i r e d t o d i s i n f e c t t h e water i n t h e event o f a m e c h a n i c a lor e l e c t r i c a l f a i l u r e . Even i f i o d i n e t r e a t m e n t o f t h e i n c o m i n gwater were n o t s e l e c t e d as t h e p r i m a r y treatment o p t i o n , i tc o u l d s e r ve as a b a c k u p system t o ozone.P r e v i o u s m e t h o d s f o r p r e v e n t i o n a n d c o n t r o l o f IH Ne i t h e r h a v e n o t b e e n a d e q u a t e l y t e s t e d a t a l a r g e - s c a l es a l m o n i d p r o d u c t i o n f a c i l i t y or h a v e f a i l e d t o p r o v i d e s a t i s -f a c t o r y p r o t e c t i o n . I n c r e a s i n g t h e water temperature suc -c e s s f u l l y c o n t r o l l e d IHN i n s o c k e y e s a l m o n ( O n c o r h y n c h u sn e r k a ) j u v e n il e s ( 1 ) b u t n o t r a i n b o w t r o u t ( 1 3 ) . To r e s i s t v i r a ld i s e a s e , t h e h o s t must r e l y on s p e c i f i c i m m u n i t y , n o n s p e c i f i cr e s i s t a n c e f a c t o r s ( 3 , 1 7 , 2 4 ) , or o t h e r m e c h a n i s m s . V a r i o u sv a c c i n e r e g i m e n s h a v e b e e n t e s t e d ( 1 5 ) a n d are e f f e c t i v e o n l yi f f r y h a v e r e a c h e d a s u f f i c i e n t age f o r immune c o m p e t e n c e .I f s u s c e p t i b l e s a l m o n i d s l a c k s p e c i f i c i m m u n i t y , IHN mor-t a l i t y u s u a l l y oc curs soon a f t e r h a t c h i n g ( 18 , 2 2) , and t o t a lm o r t a l i t y may r e a c h over 9 0 % o f t h e p o p u l a t i o n . I o d i n et r e a t m e n t o f h a t c h e r y water c o u l d protect j u v e n i l e s a l m o n i d sf r o m e x p o s u r e t o IHNV u n t i l t h e y r e a c h s u f f i c i e n t s i z e tomake v a c c i n a t i o n e f f e c t i v e .I o d i n e t r e a t m e n t o f h a t c h e r y water may p rev ent exposureo f s u s c e p t i b l e f i s h t o IHNV, b u t h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o fi o d i n e may b e r e q u i r e d a t l o c a t i o n s h a v i n g water w i t h a l a r g eo r g a n i c l o a d or h i g h e r pH. I n s u c h i n s t a n c e s , i o d i n e c o u l d bea d d e d t o t h e h a t c h e r y i n t a k e l i n e a nd r em ov ed b e f o r ed e l i v e r y t o t h e r e a r i n g u n i t s . I n t h i s s t u d y , l o w concentra-

t i o n s o f s o d i u m t h i o s u l f a t e e f f e c t i v e l y r e m o v e d f r e e i o d i n ef r o m t h e w a t e r , s u g g e s t i n g t h a t i t c o u l d b e a d d e d t o t h et r e a t m e n t p r o c e d u r e a t l o w c o s t .When IHNV was a d d e d t o a w a t e r s a m p l e f r o m a n u r s e r yt a n k r e c e i v i n g a n i o d i n e s o l u t i o n a t t h e D w o r s h a k N a t i o n a lF i s h H a t c h e r y , l o w l e v e l s o f i o d i n e r a p i d l y r e d u c e d t h e v i r u sc o n c e n t r a t i o n . I n t h e se n u r s e r y t a n k s , no m o r t a l i t y wa so b s e r v e d among g r o u p s o f r a i n b o w t r o u t f r y c o n t i n u o u s l ye x p o s e d f o r s e v e r a l w e e k s t o a n i o d i n e c o n c e n t r a t i o n o f 0 . 2 5m g / l i t e r . T h i s s u g g e s t s t h a t l e v e l s o f i o d i n e c o u l d b e a d d e d t ot h e h a t c h e r y w a t e r s u p p l y t h a t w o u l d e f f e c t i v e l y i n a c t i v a t eIHNV a n d y e t b e n o n t o x i c t o f i s h , w i t h o u t r e q u i r i n g r e m o v a lo f t h e i o d i n e . I n a c t i v a t i o n o f IHNV wa s a l s o r a p i d ( 7 . 5 s )when i o d i n e a n d v i r u s w e r e p r e p a r e d i n w a t e r s a m p l e s f r o md i f f e r e n t h a t c h e r y s u p p l i e s , s u g g e s t i n g t h a t t h e m e t h o d i sb r o a d l y a p p l i c a b l e .To e n s u r e t h a t i o d i n e d o e s n o t i n d u c e c h r o n i c t o x i c i t y ,e x t e n d e d c o n t a c t e x p e r i m e n t s s h o u l d b e p e r f o r m e d . T h e s et o x i c i t y s t u d i e s m u s t i n c o r p o r a t e v a r i o u s w a t e r q u a l i t y f a c -t o r s , e s p e c i a l l y p H a n d w a t e r h a r d n e s s . I n a c t i v a t i o n o fIHNV s h o u l d b e t e s t e d a t e a c h h a t c h e r y w h e r e t h i s s y s t e mm i g h t b e i n s t a l l e d .

ACKNOWLEDGMENTSWe t h a n k t h e s t a f f o f t h e D w o r s h a k N a t i o n a l F i s h H a t c h e r y f o rp r o v i d i n g f a c i l i t i e s t o c o n d u c t t h e p i l o t p l a n t s t u d i e s a n d t h e s t a f f o ft h e D w o r s h a k F i s h H e a l t h C e n t e r f o r m o n i t o r i n g t h e h e a l t h o f t e s tf i s h . We a l s o t h a n k S c o t t F o o t t , S c o t t L a P a t r a , a n d S t e v e R o b e r t sf o r a r r a n g i n g t h e c o l l e c t i o n o f h a t c h e r y w a t e r s a m p l e s . We a p p r e -c i a t e t h e t e c h n i c a l a s s i s t a n c e b y C i n d y A r a k a w a , K e i t h H i g m a n ,a n d K e v i n O s h i m a . D i a n e E l l i o t t , G a r y W e d e m e y e r , R o b e r t S t i c k -n e y , a n d E l i z a b e t h R o c k w e l l p r o v i d e d h e l p f u l r e v i ew s o f t h e m a n u -s c r i p t .P o r t i o n s o f t h i s w o r k w e r e s u p p o r t e d b y t h e C o o p e r a t i v e S t a t eR e s e a r c h S e r v i c e , U . S . D e p a r t m e n t o f A g r i c u l t u r e , t o t h e W e s t e r nR e g i o n a l A q u a c u l t u r e C o n s o r t i u m u n d e r a g r e e m e n t s 8 7 - C R S R - 2 -3 2 1 9 , 8 8 - 3 8 5 0 0 - 4 0 2 7 , 8 9 - 3 8 5 0 0 - 4 2 8 7 , a n d 9 0 - 3 8 5 0 0 - 5 0 2 5 .REFERENCES

1 . A m e n d , D . F . 1 9 7 0 . C o n t r o l o f i n f e c t i o u s h e m a t o p o i e t i c n e c r o s i sv i r u s d i s e a s e b y e l e v a t i n g t h e w a t e r t e m p e r a t u r e . J . F i s h . R e s .B o a r d C a n . 2 7 : 2 6 5 - 2 7 0 .2 . A m e n d , D . F . 1 9 7 4 . C o m p a r a t i v e t o x i c i t y o f t w o i o d o p h o r s t or a i n b o w t r o u t e g g s . T r a n s . Am . F i s h . S o c . 1 0 3 : 7 3 - 7 8 .3 . A m e n d , D . F . , a n d J . R . N e l s o n . 1 9 7 7 . V a r i a t i o n i n t h e s u s c e p -t i b i l i t y o f s o c k e y e s a l m o n , O n c o r h y n c h u s n e r k a t o i n f e c t i o u sh e m a t o p o i e t i c n e c r o s i s v i r u s . J . F i s h B i o l . 1 1 : 5 6 7 - 5 7 3 .4 . A m e n d , D . F . , a n d J . P . P i e t s c h . 1 9 7 2 . V i r u c i d a l a c t i v i t y o f t w oi o d o p h o r s t o s a l m o n i d v i r u s e s . J . F i s h . R e s . B o a r d C a n . 2 9 : 6 1 -6 5 .5 . A n s a r i , S . A . , S . A . S a t t a r , V . S . S p r i n g t h o r p e , G . A . W e l l s , a n dW. T o s t o w a r y k . 1 9 8 9 . I n v i v o p r o t o co l f o r t e s t i n g e f f i c a c y o fh a n d - w a s h i n g a g e n t s a g a i n s t v i r u s e s a n d b a c t e r i a : e x p e r i m e n t sw i t h r o t a v i r u s a n d E s c h e r i c h i a c o l i . A p p l . E n v i r o n . M i c r o b i o l .5 5 : 3 1 1 3 - 3 1 1 8 .6 . B a t t s , W. N . , a n d J . R . W i n t o n . 1 9 8 9 . C o n c e n t r a t i o n o f i n f e c -t i o u s h e m a t o p o i e t i c n e c r o s i s v i r u s f r o m w a t e r s a m p l e s b yt a n g e n t i a l f l o w f i l t r a t i o n a n d p o l y e t h y l e n e g l y c o l p r e c i p i t a t i o n .C a n . J . F i s h . A q u a t . S c i . 4 6 : 9 6 4 - 9 6 8 .7 . B a t t s , W. N . , a n d J . R . W i n t o n . 1 9 8 9 . E n h a n c e d d e t e c t i o n o fi n f e c t i o u s h e m a t o p o i e t i c n e c r o s i s v i r u s a n d o t h e r f i s h v i r u s e s b yp r e t r e a t m e n t o f c e l l m o n o l a y e r s w i t h p o l y e t h y l e n e g l y c o l . J .A q u a t . A n i m . H e a l t h 1 : 2 8 4 - 2 9 0 .8 . B u r k e , J . A . , a n d D . M u l c a h y . 1 9 8 0 . P l a q u i n g p r o c e d u r e f o ri n f e c t i o u s h e m a t o p o i e t i c n e c r o s i s v i r u s . A p p l . E n v i r o n . M i c r o -b i o l . 3 9 : 8 7 2 - 8 7 6 .9 . C h a n g , S . L . 1 9 5 8 . T h e u s e o f a c t i v e i o d i n e a s a w a t e r d i s i n f e c -t a n t . J . Am . P h a r m . A s s o c . 4 7 : 4 1 7 - 4 2 3 .1 0 . E l l i o t t , D . G . , a n d D . F . A m e n d . 1 9 7 8 . E f f i c a c y o f c e r t a i nd i s i n f e c t a n t s a g a i n s t i n f e c t i o u s p a n c r e a t i c n e c r o s i s v i r u s . J . F i s h

A P P L . E N V I R O N . M I C R O B I O L .


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INACTIVATION OF IH N VIRUS BY IODINE 1 3 8 5B i o l . 1 2 : 2 7 7 - 2 8 6 .1 1 . F i J a n , N . , D . S u l i m a n o v i c , M. B e a r z o t t i , D . M u z i n i c , L . 0 .Z w i l l e n b e r g , S . C h i l m o n c z y k , J . F . V a u t h e r o t , a n d P . d e K i nk e -l i n . 1 9 8 3 . Some p r o p e r t i e s o f t h e e p i t h e l i o m a p a p u l o s u m c y p r i n i( E P C ) c e l l l i n e f r o m c a r p ( C y pr i n u s c a r p i o ) . A n n . V i r o l . ( I n s t .P a s t e u r ) 1 3 4 : 2 0 7 - 2 2 0 .1 2 . H a y s , H . , P . R . E l l i k e r , a n d W. E . S a n d i n e . 1 9 6 7 . M i c r o b i a ld e s t r u c t i o n b y l o w c o n ce n t r at i o n s o f h y p o ch l o r it e a n d i o d o p h o rg e r m i c i d e s i n a l k a l i n e a n d a c i d i f i e d w a t e r . A p p l . M i c r o b i o l .1 5 : 5 7 5 - 5 8 1 .1 3 . H e t r i c k , F . M . , J . L . F r y er , a n d M. D . K n i t t e l . 1 9 7 9 . E f f e c t o fw a t e r t e m p e r a t u r e o n t h e i n f e c t i o n o f r a i n b o w t r o u t , S a l m og a i r d n e r i R i c h a r d s o n , w i t h i n f e c t i o u s h e m a t o p o i e t i c n e c r o s i sv i r u s . J . F i s h D i s . 2 : 2 5 3 - 2 5 7 .1 4 . H s u , Y . L . , H . M. E n g e L i d n g , a n d J . C . L eo n g . 1 9 8 6 . O c c u r r e n c eo f d i f f e r e n t t y p e s o f i n f e c t i o u s h e m a t o p o i e t i c n e c r o s i s v i r u s i nf i s h . A p p l . E n v i r o n . M i cr o bi o l. 5 2 : 1 3 5 3 - 1 3 61 .1 5 . L e o n g , J . C . , J . L . F r y e r , a n d J . R . W i n t o n . 1 9 8 8 . V a c c i n a t i o na g a i n s t i n f e c t i o u s h e m a t o p o i e t i c n e c r o s i s , p . 1 93 - 2 03 . I n A . E .E l l i s ( e d . ) , F i s h v a c c i n a t i o n . A c a d e m i c P r e s s , I n c . ( L o n d o n ) ,L t d . , L o n d o n .1 6 . M a r k i n g , L . L . 1 9 6 9 . T o x i c o l o g i c a l a s s a y s w i t h f i s h . B u l l . W i l d l .D i s . A s s o c . 5 : 2 9 1 - 2 9 4 .1 7 . M c I n t y r e , J . D . , a n d D . F . A m e n d . 1 9 7 8 . H e r i t a b i l i t y o f t o l e r -a n c e f o r i n f e c t i o u s h e m a t o p o i e t i c n e c r o s i s v i r u s i n s o c k e y es a l m o n ( O n c o r h y n c h u s n e r k a ) . T r a n s . Am . F i s h . S o c . 1 0 7 : 3 0 5 -3 0 8 .1 8 . M u l c a h y , D . , a n d K . B a u s e r f e l d . 1 9 8 3 . E f f e c t o f l o a d i n g d e n s i t yo f s o c k e y e s a l m o n , O n c o r h y n c h u s n e r k a ( W a l b a u m ) , e g g s i ni n c u b a t i o n b o x e s o n m o r t a l i t y c a u s e d b y i n f e c t i o u s h a e m a t o p o i -e t i c n e c r o s i s . J . F i s h D i s . 6 : 1 8 9 - 1 9 3 .1 9 . M u l c a h y , D . , J . B u r k e , R . P a s c h o , a n d C . K . J e n e s . 1 9 8 2 .P a t h o g e n e s i s o f i n f e c t i o u s h e m a t o p o i e t i c n e c r o s i s v i r u s i n a d u l ts o c k e y e s a l m o n ( O n c o r h y n c h u s n e r k a ) . C a n . J . F i s h . A q u a t .S c i . 3 9 : 1 1 4 4 - 1 1 4 9 .2 0 . M u l c a h y , D . , a n d R . J . P a s c h o . 1 9 8 5 . V e r t i c a l t r a n s m i s s i o n o fi n f e c t i o u s h e m a t o p o i e t i c n e c r o s i s v i r u s i n s o c k e y e s a l m o n ,O n c o r h y n c h u s n e r k a ( W a l b a u m ) : i s o l a t i o n o f v i r u s f r o m d e a de g g s a n d f r y . J . F i s h D i s . 8 : 3 9 3 - 3 9 6 .2 1 . M u l c a h y , D . , R . J . P a s c h o , a n d C . K . J e n e s . 1 9 8 3 . D e t e c t i o n o fi n f e c t i o u s h a e m a t o p o i e t i c n e c r o s i s v i r u s i n r i v e r w a t e r a n dd e m o n s t r a t i o n o f w a t e r b o r n e t r a n s m i s s i o n . J . F i s h D i s . 6 : 3 2 1 -3 3 0 .

2 2 . M u l c a h y , D . , R . P a s c h o , a n d C . K . J e n e s . 1 9 8 3 . M o r t a l i t y d u e t o

i n f e c t i o u s h e m a t o p o i e t i c n e c r o s i s o f s o c k e y e s a l m o n ( O n c o -r h y n c h u s n e r k a ) f r y i n s t r e a m s i d e e g g i n c u b a t i o n b o x e s . C a n . J .F i s h . A q u a t . S c i . 4 0 : 1 5 1 1 - 1 5 1 6 .2 3 . N i s h i m u r a , T . , Y . I s h i d a , S . Y a m a m o t o , H . F u k u d a , N . O k a -m o t o , a n d T . S an o . 1 9 8 8 . I n f e c t i o u s h a e m a t o p o i e t i c n e c r o s i s :v i r u s t i t e r i n t h e f i s h b o d i e s , r e a r i n g w a t e r a n d f e c e s o f a r t i f i -c i a l l y i n f e c t e d r a i n b o w t r o u t f r y . F i s h P a t h o l . 2 3 : 1 3 - 1 7 .2 4 . P a r s o n s , J . E . , R . A . B u s c h , G . H . T h o r g a a r d , a n d P . D .S c h e e r e r . 1 9 8 6 . I n c r e a s e d r e s i s t a n c e o f t r i p l o i d r a i n b o w t r o u t xc o h o s a l m o n h y b r i d s t o i n f e c t i o u s h e m a t o p o i e t i c n e c r o s i s v i r u s .A q u a c u l t u r e 5 7 : 3 3 7 - 3 4 3 .2 5 . P i l c h e r , K . S . , a n d J . L . F r y e r . 1 9 8 0 . T h e v i r a l d i s e a s e s o f f i s h :a r e v i e w t h r o u g h 1 9 7 8 . P a r t I : D i s e a s e s o f p r o v e n v i r a l e t i o l o g y .C r i t . R e v . M i c r o b i o l . 7 : 2 8 7 - 3 6 4 .2 6 . P i p e r , R . G . , I . B . M c E l w a i n , L . E . O r m e , J . P . M c C r a r e n , L . G .F o w l e r , a n d J . R . L eo n a r d . 1 9 8 2 . F i s h h a t c h e r y m a n a g e m e n t .U . S . F i s h a n d W i l d l i f e S e r v i c e P u b l i c a t i o n , W a s h i n g t o n , D . C .2 7 . R o s s , A . J . , a n d C . A . S m i t h . 1 9 7 2 . E f f e c t o f t w o i o d o p h o r s o nb a c t e r i a l a n d f u n g a l f i s h p a t h o g e n s . J . F i s h . R e s . B o a r d C a n .2 9 : 1 3 5 9 - 1 3 6 1 .2 8 . S a t t a r , S . A . , V . S . S p r i n g t h o r p e , Y . K a r i m , a n d P . L o r o . 1 9 8 9 .C h e m i c a l d i s i n f e c t i o n o f n o n - p o r o u s i n a n i m a t e s u r f a c e s e x p e r -i m e n t a l l y c o n t a m i n a t e d w i t h f o u r human p a t h o g e n i c v i r u s e s .E p i d e m i o l . I n f e c t . 1 0 2 : 4 9 3 - 5 0 5 .2 9 . W a t a n a b e , R . A . , J . L . F r y e r , a n d J . S . R o h o v e c . 1 9 8 8 . M o l e c -u l a r f i l t r a t i o n f o r r e c o v e r y o f w a t e r b o r n e v i r u s e s o f f i s h . A p p l .E n v i r o n . M i c r o b i o l . 5 4 : 1 6 0 6 - 1 6 0 9 .3 0 . W e d e m e y e r , G . A . , N . C . N e l s o n , a n d C . A . S m i t h . 1 9 7 8 .S u r v i v a l o f t h e s a l m o n i d v i r u s e s i n f e c t i o u s h e m a t o p o i e t i c n e -c r o s i s ( I H N V ) a n d i n f e c t i o u s p a n c r e a t i c n e c r o s i s ( I P N V ) i no z o n a t e d , c h l o r i n a t e d , a n d u n t r e a t e d w a t e r s . J . F i s h . R e s .B o a r d C a n . 3 5 : 8 7 5 - 8 7 9 .3 1 . W e d e m e y e r , G . A . , N . C . N e l s o n , a n d W. T . Y a s u t a k e . 1 9 7 9 .P h y s i o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l a s p e c t s o f o z o n e t o x i c i t y t or a i n b o w t r o u t ( S a l m o g a i r d n e r i ) . J . F i s h . R e s . B o a r d C an .3 6 : 6 0 5 - 6 1 4 .3 2 . W i n g f i e l d , W. H . , a n d L . D . C h a n . 1 9 7 0 . S t u d i e s on t h eS a c r a m e n t o R i v e r c h i n o o k d i s e a s e a n d i t s c a u s a t i v e a g e n t , p .3 0 7 - 3 1 8 . I n S . F . S n i e s z k o ( e d . ) , A s y m p o s i u m on d i s e a s e s o ff i s h a n d s h e l l f i s h e s . A m e r i c a n F i s h e r i e s S o c i e t y S p e c i a l P u b l i -c a t i o n n o . 5 . A m e r i c a n F i s h e r i e s S o c i e t y , W a s h i n g t o n , D . C .3 3 . W o l f , K . 1 9 8 8 . I n f e c t i o u s h e m a t o p o i e t i c n e c r o s i s , p . 8 3 - 1 1 4 . I nF i s h v i r u s e s a n d f i s h v i r a l d i s e a s e s . C o r n e l l U n i v e r s i t y P r e s s ,I t h a c a , N . Y .

V O L . 5 7 , 1 9 9 1

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