3/5/2011

1

LECTURE 3:LECTURE 3:CHARACTERISTICS OF CHARACTERISTICS OF

ENZYME ENZYME CATALYSISCATALYSIS

IsoenzymeIsoenzyme Enzymes that perform the same catalytic Enzymes that perform the same catalytic

function in different body tissues or different function in different body tissues or different organisms, but which have different organisms, but which have different sequences of amino acids in various portions sequences of amino acids in various portions of their polypeptide chain are called of their polypeptide chain are called isoenzymesisoenzymes. . IsoenzymesIsoenzymes can be separated can be separated from one another by electrophoresisfrom one another by electrophoresis..

ProenzymeProenzyme or or zymogenzymogen ProenzymeProenzyme (or (or zymogenzymogen) is the name given to ) is the name given to

the inactive form of an enzyme. Enzymes the inactive form of an enzyme. Enzymes (especially digestive enzymes) are often (especially digestive enzymes) are often secreted in their inactive form, transported to secreted in their inactive form, transported to the place where activity is desired, and then the place where activity is desired, and then converted to their active forms.converted to their active forms.

EnzimEnzim monomerikmonomerik; yang ; yang memilikimemiliki hanyahanyasatusatu rantairantai polipeptidapolipeptida dimanadimana terdapatterdapattempattempat aktifaktif..

EnzimEnzim oligomerikoligomerik; ; yang yang memilikimemiliki paling paling sedikitsedikit 2 2 dandan sebanyaksebanyak 60 60 atauatau lebihlebihsubunit yang subunit yang terikatterikat kuatkuat dalamdalampembentukanpembentukan protein protein enzimenzim aktifaktif..

KompleksKompleks multienzimmultienzim; ; yang yang terdiriterdiri daridarisejumlahsejumlah enzimenzim yang yang terikatterikat kuatkuat

EnzymeEnzyme--Substrate InteractionSubstrate Interaction Lock and Key" HypothesisLock and Key" Hypothesis The "Induced Fit" Hypothesis The "Induced Fit" Hypothesis

"Lock and Key" Hypothesis"Lock and Key" Hypothesis Emil Fischer in 1890 proposed Emil Fischer in 1890 proposed "Lock and Key" "Lock and Key"

Hypothesis Hypothesis The shape, or configuration, of the active site The shape, or configuration, of the active site

is especially designed for the specific substrate is especially designed for the specific substrate involved.involved.

3/5/2011

2

Because the configuration is determined by Because the configuration is determined by the amino acid sequence of the enzyme, the the amino acid sequence of the enzyme, the native configuration of the entire enzyme native configuration of the entire enzyme molecule must be intact for the active site to molecule must be intact for the active site to have the correct configuration. In such a case, have the correct configuration. In such a case, the substrate then fits into the active site of the substrate then fits into the active site of the enzyme in much the same way as a key the enzyme in much the same way as a key fits into a lock.fits into a lock.

Lock & Key ModelLock & Key Model

E n z i m S u b stra t

The "Induced Fit" Hypothesis The "Induced Fit" Hypothesis Enzymes are highly flexible, Enzymes are highly flexible, conformationallyconformationally

dynamic molecules, and many of their dynamic molecules, and many of their remarkable properties, including substrate remarkable properties, including substrate binding and catalysis, are due to their binding and catalysis, are due to their structural pliancy. structural pliancy.

Realization of the conformational flexibility of Realization of the conformational flexibility of proteins led Daniel proteins led Daniel KoshlandKoshland to hypothesize to hypothesize that the binding of a substrate (S) by an that the binding of a substrate (S) by an enzyme is an interactive process. That is, the enzyme is an interactive process. That is, the shape of the enzyme's active site is actually shape of the enzyme's active site is actually modified upon binding S, in a process of modified upon binding S, in a process of dynamic recognition between enzyme and dynamic recognition between enzyme and substrate aptly called induced fit. substrate aptly called induced fit.

In essence, substrate binding alters the In essence, substrate binding alters the conformation of the protein, so that the protein conformation of the protein, so that the protein and the substrate "fit" each other more and the substrate "fit" each other more precisely. The process is truly interactive in precisely. The process is truly interactive in that the conformation of the substrate also that the conformation of the substrate also changes as it adapts to the conformation of the changes as it adapts to the conformation of the enzyme. enzyme.

Enzim Substrat

3/5/2011

3

Induced Fit Model

Enzyme KineticsEnzyme Kinetics Enzymes follow zero order kinetics when Enzymes follow zero order kinetics when

substrate concentrations are high. Zero order substrate concentrations are high. Zero order means there is no increase in the rate of the means there is no increase in the rate of the reaction when more substrate is added.reaction when more substrate is added.

Given the following breakdown of sucrose to Given the following breakdown of sucrose to glucose and fructoseglucose and fructose

Sucrose + H20 → Glucose + Fructose

O

H

HO

H

HO

H

OH

OHHH

OH OH

HO H

H OH

O

HH

HO

H

H

H

OH

ReaksiReaksi bersifatbersifat dapatdapatbalikbalik yaituyaitu sebagiansebagiansenyawasenyawa dapatdapatdisintesisdisintesis kembalikembali daridarizatzat yang yang terdapatterdapatdalamdalam reaksireaksi

JikaJika faktorfaktor lingkunganlingkungantetaptetap, , kecepatankecepatanpembentukanpembentukan produkproduk((kecepatankecepatan reaksireaksi) ) ditentukanditentukan oleholehkonsentrasikonsentrasi enzimenzimdandan substratsubstrat

•• V = V = kecepatankecepatan reaksireaksi, , •• [E] = [E] = konsentrasikonsentrasi

enzimenzim & & •• [S] = [S] = konsentrasikonsentrasi

substratsubstrat

V

Waktu[E]

[E]

2

1

3

4

V

Gambar 6. Hubungan antara kecepatan reaksi (V) dengankonsentrasi enzim (kiri), dan dengan waktu pada [E] yang berbeda (kanan)

Apabila [S] tetap, kecepatan reaksi me-ningkat sebanding dengan peningkatan [E]

3/5/2011

4

ApabilaApabila konsentrasikonsentrasi enzimenzim tetaptetap dandan substratsubstratmeningkatmeningkat, V , V akanakan meningkatmeningkat mulamula--mulamula dandanproporsionalproporsional dengandengan peningkatanpeningkatan [S], [S], tapitapi padapada[S] yang [S] yang lebihlebih tinggitinggi, , lajulaju peningkatanpeningkatan V V menurunmenurun secarasecara perlahanperlahan--lahanlahan hinggahinggakemudiankemudian V V hampirhampir tidaktidak tergantungtergantung padapada [S]. [S].

VmaxV

KM [S]

Gambar 2.2. Hubunganantara kecepatan reaksi(V) dengan konsentrasisubstrat ([S]) padareaksi yang dikatalisisoleh suatu enzim

Leonor Leonor MichaelisMichaelis dandan Maud Maud MentenMenten padapada tahuntahun1913 1913 mengusulkanmengusulkan suatusuatu model model untukuntukmenjelaskanmenjelaskan kinetikkinetik reaksireaksi enzimatisenzimatis untukuntuksatusatu substratsubstrat dandan satusatu enzimenzim ((UniUni--UniUni reaction)reaction)

HipotesisnyaHipotesisnya adalahadalah bahwabahwaEnzimEnzim (E), yang (E), yang bertindakbertindak sebagaisebagaireaktanreaktan tapitapi tidaktidak digunakandigunakan dalamdalamreaksireaksi, , menyatumenyatu dengandengan substratsubstrat (S) (S) dalamdalam suatusuatu komplekskompleks ES ES dalamdalampembentukanpembentukan produkproduk

MICHAELISMICHAELIS--MENTEN MODELMENTEN MODEL

E = Enzyme, S = Substrate, P = ProductES = Enzyme-Substrate complex k1, k2, k3 & k4 = rate constants

3

k

1

kESE+S E+Pk

2

k

4

When the substrate concentration becomes large enough to force the equilibrium to form completely all ES the second step in the reaction becomes rate limiting because no more ES can be made and the enzyme-substrate complex is at its maximum value.

ESP2k

dtdv

[ES] is the difference between the rates of ES formation minus the rates of its disappearance.

ESESSEES211 kkk

dtd

1

3/5/2011

5

Assumption of equilibrium

k-1>>k2 (k2>>k3) the formation of product is so much slower than the formation of the ES complex. That we can assume:

Ks is the dissociation constant for the ES complex.

3

k

1

kESE+S E+Pk

2

k

4

]ES[]S][E[

KKK

1

2S

Assumption of steady state

Transient phase where in the course of a reaction the concentration of ES does not change

0ES

dtd

VV SK SM

max[ ][ ]

Michaelis-Menten Model

ES E E T

The Km is the substrate concentration where voequals one-half Vmax

There are a wide range of KM, Vmax , and efficiency seen in enzymes

But how do we analyze kinetic data?

3/5/2011

6

PenetuanPenetuan KKMM dandan VmaxVmax

HargaHarga KKMM bervariasibervariasi sangatsangat besarbesar, , tapitapidaridari kebanyakankebanyakan enzimenzim berkisarberkisar diantaradiantara1010--11 -- 1010--66 M (M (TabelTabel 2.1) 2.1) tergantungtergantungsubstratsubstrat dandan lingkunganlingkungan sepertiseperti suhusuhu dandankuantitaskuantitas ionion

UntukUntuk mendapatkanmendapatkan hargaharga KKMM dandan VmaxVmax, , analisisanalisis langsunglangsung persamaanpersamaan diatasdiatasdapatdapat dilakukandilakukan, , tapitapi caracara iniinimembutuhkanmembutuhkan waktuwaktu yang lama, yang lama, dandanbantuanbantuan komputerkomputer sangatsangat pentingpenting untukuntukmengoptimasimengoptimasi hargaharga parameter parameter persamaanpersamaan dengandengan cepatcepat. .

Tabel 2.1 Parameter beberapa enzimTabel 2.1 Parameter beberapa enzim

*“C = Competitive, NC = Non-competitive & UC = Uncompetitive”

PENDEKATAN LAINPENDEKATAN LAIN LinierisasiLinierisasi persamaanpersamaan

ModifikasiModifikasi persamaanpersamaan keke bentukbentuklinier linier sehinggasehingga dapatdapat dianalisisdianalisisdengandengan mudahmudah1. 1. PersamaanPersamaan “double“double--reciprocal” reciprocal”

atauatau ““LineweaverLineweaver--Burk” Burk” 2. 2. PersamaanPersamaan ““EadieEadie--HofsteeHofstee” ” 3. 3. PersamaanPersamaan “Hanes“Hanes--Woolf” Woolf”

PersamaanPersamaan “double“double--reciprocal” reciprocal” atauatau ““LineweaverLineweaver--Burk”Burk”

JikaJika ruasruas kirikiri dibalikdibalik dandan demikiandemikian jugajuga ruasruas kanankanan, , makamaka

SekarangSekarang persamaanpersamaan iniini akanakan mudahmudah dianalisisdianalisisdengandengan metodemetode linier linier sedehanasedehana

maxmax

MV

1]S[

1.VK

V1

VV SK SM

max[ ][ ]

3/5/2011

7

SekarangSekarangy = 1/V ; x = 1/[S]y = 1/V ; x = 1/[S]a = 1/a = 1/VmaxVmax ; b = K; b = KMM//VmaxVmaxdapatdapat dianalisisdianalisis dengandengan y = a + y = a + bxbx

JikaJika 1/V 1/V dihubungkandihubungkan dengandengan 1/[S], 1/[S], suatusuatu garisgaris luruslurus akanakan dihasilkandihasilkanyang yang memotongmemotong sumbusumbu y y padapada1/1/VmaxVmax dandan sumbusumbu x x padapada --1/K1/KMMsertaserta membentukmembentuk sudutsudut terhadapterhadapsumbusumbu x x sebesarsebesar KKMM//VmaxVmax. .

-1/KM

1/[S]

KM/Vmax

1/Vmax

PersamaanPersamaan ““EadieEadie--HofsteeHofstee” ”

]S[V])S[K(V maxM

VV SK SM

max[ ][ ]

]S[VVK]S[V maxM

]S[]S[VVKV maxM

maxM V]S[

VKV

SekarangSekarang

y = V ; x = V/[S]y = V ; x = V/[S]a = Vmax ; b = a = Vmax ; b = --KKMM

dapat dianalisis dengan y = a + bx dapat dianalisis dengan y = a + bx

Jika V dihubungkan dengan V/[S], suatu garis Jika V dihubungkan dengan V/[S], suatu garis lurus akan dihasilkan yang memotong sumbu lurus akan dihasilkan yang memotong sumbu y pada Vmax dan sumbu x pada Vmax/Ky pada Vmax dan sumbu x pada Vmax/KMM

serta membentuk sudut terhadap sumbu x serta membentuk sudut terhadap sumbu x sebesar Ksebesar KMM

3/5/2011

8

V/[S]

Persamaan Eadie-Hofstee

V

Vmax/KM

Vmax PersamaanPersamaan “Hanes“Hanes--Woolf”Woolf”

maxMV

]S[KV

]S[

]S[V])S[K(V maxM

]S.[V

1VK

V]S[

maxmaxM

]S.[V

1VK

V]S[

maxmaxM

VV S

K SM

max[ ]

[ ]

SekarangSekarang

y = [S]/V ; x = [S]y = [S]/V ; x = [S]a = Ka = KMM/Vmax ; b = 1/Vmax/Vmax ; b = 1/Vmax

dapat dianalisis dengan y = a + bx dapat dianalisis dengan y = a + bx

Jika [S]/V dihubungkan dengan [S], suatu Jika [S]/V dihubungkan dengan [S], suatu garis lurus akan dihasilkan yang memotong garis lurus akan dihasilkan yang memotong sumbu y pada Ksumbu y pada KMM/Vmax dan sumbu x pada /Vmax dan sumbu x pada --KKMM serta membentuk sudut terhadap sumbu x serta membentuk sudut terhadap sumbu x sebesar 1/Vmax. sebesar 1/Vmax.

Persamaan Hanes-W oolf

-KM

[S]/V

[S]

K M/Vmax

3/5/2011

9

3/5/2011

10

STEPS OF MODEL DERIVATIONSTEPS OF MODEL DERIVATION

1.1. PembentukanPembentukan ES ES adalahadalah intiinti daridari hipotesishipotesis tersebuttersebut

(1)(1)

1.1. ReaksiReaksi E E dengandengan S S terjaditerjadi dengandengan kecepatankecepatan kk11

dandan menghasilkanmenghasilkan komplekskompleks ES (ES (enzimenzim--substratsubstrat))

2.2. KompleksKompleks ES ES dapatdapat berubahberubah menjadimenjadi E E dandan S S bebasbebas kembalikembali dengandengan kecepatankecepatan kk22, , atauatau menjadimenjadiE E dandan P P dengandengan kecepatankecepatan kk33..

3

k

1

kESE+S E+P k

2

k

4

STEPS OF MODEL DERIVATION

3/5/2011

11

4.4. Jika kJika k33 kk44 , maka reaksi bersifat “irreversible”, , maka reaksi bersifat “irreversible”, sehingga produk P tidak ada yang diubah kembali sehingga produk P tidak ada yang diubah kembali menjadi substrat asal dan kmenjadi substrat asal dan k4 4 dapat diabaikan. dapat diabaikan.

5.5. Suatu hal penting yang perlu diingat adalah bahwa Suatu hal penting yang perlu diingat adalah bahwa konstanta kkonstanta k11, k, k22, k, k33 dan kdan k44 proporsional dengan proporsional dengan G G aktivasi substrat dari reaksi yang bersangkutanaktivasi substrat dari reaksi yang bersangkutan

6.6. Pada [S] yang rendah, kebanyakan enzim berada Pada [S] yang rendah, kebanyakan enzim berada dalam bentuk bebas, sehingga penambahan S akan dalam bentuk bebas, sehingga penambahan S akan langsung terikat dengan E dan diubah menjadi P langsung terikat dengan E dan diubah menjadi P dengan demikian kecepatan awal proporsional dengan demikian kecepatan awal proporsional dengan peningkatan [S]dengan peningkatan [S]

7.7. PadaPada [S] yang [S] yang lebihlebih tinggitinggi, , kecepatankecepatan reaksireaksi bervariasibervariasidengandengan peningkatanpeningkatan [S] [S] karenakarena enzimenzim mulaimulai mengalamimengalamikejenuhankejenuhan

8.8. PadaPada [S] yang [S] yang tinggitinggi, , semuasemua enzimenzim dijenuhidijenuhi oleholehsubstratsubstrat dandan karenanyakarenanya beradaberada dalamdalam bentukbentuk komplekskompleksESES

9.9. JadiJadi enzimenzim dalamdalam suatusuatu reaksireaksi dapatdapat beradaberada dalamdalamkeadaankeadaan bebasbebas dandan terikatterikat dengandengan substratsubstrat, , sehinggasehinggatotal total enzimenzim secarasecara matematismatematis adalahadalah

[E][E]00 = [E]+[ES]= [E]+[ES] (2)(2)

10.10. Penurunan persamaan MichaelisPenurunan persamaan Michaelis--Menten Menten tergantung pada asumsi yang disebut tergantung pada asumsi yang disebut ”Briggs”Briggs--Haldane SteadyHaldane Steady--State”State”

11.11. Keadaan "steady state" adalah suatu Keadaan "steady state" adalah suatu keadaan dimana konsentrasi intermediat keadaan dimana konsentrasi intermediat (perantara) ES tetap konstan, sementara (perantara) ES tetap konstan, sementara konsentrasi substrat dan produk berubahkonsentrasi substrat dan produk berubah

12.12. Keadaan demikian terjadi apabila Keadaan demikian terjadi apabila kecepatan pembentukan ES sama dengan kecepatan pembentukan ES sama dengan kecepatan peruraian ESkecepatan peruraian ES

13.13. KeadaanKeadaan “steady” “steady” dapatdapat dinyatakandinyatakan secarasecaramatematismatematis sepertiseperti dengandengan persamaanpersamaanberikutberikut

[ES]/[ES]/tt = 0= 0 (3)(3)

dimanadimana t = t = waktuwaktu ((menitmenit))

14.14. PernyataanPernyataan [ES]/[ES]/t t dapatdapat ditulisditulis daridari sudutsudutkonstantakonstanta dandan konsentrasikonsentrasi perspers (1) (1) yaituyaituKecepatanKecepatan pembentukanpembentukan ESES

ES = kES = k11[E][S][E][S] (4a)(4a)

3/5/2011

12

KecepatanKecepatan peruraianperuraian ESES

ES = (kES = (k22 + k+ k33) (ES)) (ES) (4b)(4b)

15.15. DalamDalam keadaankeadaan "steady state" "steady state" keduakeduapersamanpersaman (4a) (4a) dandan (4b) (4b) adalahadalah samasama, , sehinggasehingga

[ES]/[ES]/tt = k= k11[E][S][E][S]--(k(k22+k+k33)(ES) = )(ES) = 00 (5)(5)

16.16. SubsitusiSubsitusi E E daridari perspers (2) (2) kedalamkedalam perspers (5) (5) menghasilkanmenghasilkan

kk11[S][E][S][E]00 ––[ES](k[ES](k11[S]+k[S]+k22+k+k33)=0 (6))=0 (6)

17.17. PengaturanPengaturan persamaanpersamaan lebihlebih lanjutlanjut

(7)(7)

18.18. PersamaanPersamaan iniini dapatdapat dimodifikasidimodifikasi dengandengancaracara ruasruas kanankanan dibagidibagi dengandengan kk11[S], [S],

(8)(8)

19.19. KarenaKarena kk11, k, k22, , dandan kk33 adalahadalah konstantakonstanta, , makamakaketigaketiga konstantakonstanta iniini dapatdapat dijadikandijadikan satusatukonstantakonstanta yaituyaitu (k(k22 + k+ k33 )/k)/k11 = K= KMM yang yang dikenaldikenal sebagaisebagai konstantakonstanta MichaelisMichaelis--MentenMenten

]S[k/)kk(1]E[]ES[

1320

20.20. UntukUntuk kebanyakankebanyakan enzimenzim kk33 kk22, , sehinggasehingga KKMMakanakan mendekatimendekati (k(k22 + k+ k11), ), sedangsedang (k(k22 + k+ k33 )/ )/ kk11 adalahadalah Ks (Ks (konstantakonstanta dissosiasidissosiasi komplekskompleksenzimenzim--substratsubstrat). ).

21.21. JikaJika KKMM, yang , yang merupakanmerupakan ukuranukuran affinitasaffinitasenzimenzim akanakan substratsubstrat, , disubsitusikandisubsitusikan kedalamkedalamperspers (8), (8), makamaka

(10)(10)

])S/[K(1]E[]ES[

M0

3/5/2011

13

22.22. Kecepatan reaksi katalisis dapat dinyatakan dengan Kecepatan reaksi katalisis dapat dinyatakan dengan jumlah produk yang tebentuk per satuan waktu yaitu jumlah produk yang tebentuk per satuan waktu yaitu produk dari konsentrasi kompleks ES dengan produk dari konsentrasi kompleks ES dengan kapasitas katalisis enzim kkapasitas katalisis enzim k3 3 (turnover number(turnover number).).

(11)(11)

23.23. Subsitusi [ES] dari pers. (11) kedalam pers (10) Subsitusi [ES] dari pers. (11) kedalam pers (10) memberikanmemberikan

(12)(12)

]ES[kt

]P[V 3

])S/[K(1]E[k

VM

03

24.24. PadaPada keadaankeadaan E E dijenuhidijenuhi S yang S yang berartiberarti semuasemuaenzimenzim terikatterikat dengandengan substratsubstrat dalamdalam komplekskompleks ES, ES, makamaka V = V = VmaxVmax = k= k33[E][E]00. . KemudianKemudian persamaanpersamaandiatasdiatas dapatdapat ditulisditulis dalamdalam bentukbentuk berikutberikut..

atauatau (13)(13)

25.25. PersamaanPersamaan terakhirterakhir iniini ad.ad. persamaanpersamaan MichaelisMichaelis--MentenMenten yang yang secarasecara luasluas digunakandigunakan utkutk analisisanalisisreaksireaksi enzimenzim..

VVK SM

max

( /[ ])1V

V SK SM

max[ ][ ]

26.26. StoikiometriStoikiometri perspers (13) (13) adalahadalah SS P P yaituyaitu satusatu substratsubstratdandan satusatu produkproduk ((uniuni--uniuni), ), sementarasementara banyakbanyak reaksireaksiyang yang dikatalisisdikatalisis enzimenzim melibatkanmelibatkan stoikiometristoikiometri yang yang lebihlebih komplekskompleks sepertiseperti berikutberikut;;

27.27. UntungnyaUntungnya, , persamaanpersamaan MichaelisMichaelis--MentenMenten kirakira--kirakiraberlakuberlaku untukuntuk reaksireaksi yang yang lebihlebih komplekskompleks sekalipunsekalipundengandengan mekanismemekanisme yang yang berbedaberbeda. .

S P1 + P2 (Ui-Bi) S1 + S2 P (Bi-Uni) S1 + S2 P1 + P2 (Bi-Bi)

3/5/2011

14

MATURNUWNMATURNUWNTHANK YOUTHANK YOUSHUKRANSHUKRAN

XIÈXIEXIÈXIE