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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO

ISOLAMENTO, PROLIFERAÇÃO E

CARACTERIZAÇÃO DE PERICITOS ORIGINADOS

DE PLACENTAS HUMANAS

GUSTAVO ANTONIO PANIM CIOCCA

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ii

ISOLAMENTO, PROLIFERAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE

PERICITOS ORIGINADOS DE PLACENTAS HUMANAS

GUSTAVO ANTONIO PANIM CIOCCA

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em Ciências

Morfológicas, Instituto de Ciências Biomédicas da

Universidade Federal do Rio de Janeiro, como

parte dos requisitos para a obtenção do título de

Mestre em Ciências Morfológicas.

Orientador: Radovan Borojevic

Rio de Janeiro

2008

iii

Rio de Janeiro 2008

FICHA CATALOGRÁFICA

Ciocca, Gustavo Antonio Panim

ISOLAMENTO, PROLIFERAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE

PERICITOS ORIGINADOS DE PLACENTAS HUMANAS. / Gustavo

Antonio Panim Ciocca – Rio de Janeiro, 2008, 67p.

Referências Bibliográficas: f. 54-67

Dissertação (Mestrado em Ciências Morfológicas) – Universidade

Federal do Rio de Janeiro – UFRJ. Centro de Ciências da Saúde,

Instituto de Ciências Biomédicas, 2008


1. Pericito 2. CD146 3. Placenta 4. NG2. I. Radovan Borojevic

(orientador). II. Universidade Federal do Rio de Janeiro. Centro de

Ciências da Saúde. Instituto de Ciências Biomédicas.

iv

ISOLAMENTO, PROLIFERAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DE PERICITOS ORIGINADOS DE PLACENTAS HUMANAS

Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Ciências Morfológicas, Instituto de

Ciências Biomédicas da Universidade

Federal do Rio de Janeiro, como parte

dos requisitos para obtenção do título de

Mestre em Ciências Morfológicas.


APROVADO EM _______DE_____________________DE_________

BANCA EXAMINADORA

Profa. Dra. Váleria de Mello Coelho – UFRJ (Membro interno)

Profa. Dra. Cláudia dos Santos Mermelstein – UFRJ (Membro interno)

Prof. Dr. José Mauro Granjeiro – UFF (Membro externo)

Profa. Dra. Márcia Cury El Cheikh – UFRJ (Suplente interno)

Profa. Dra. Maria de Fátima Brandão Pinho – UFF (Suplente externo)

Prof. Dr. Leonardo Rodrigues Andrade – UFRJ (Revisor)

Rio de Janeiro

2008

v

AGRADECIMENTOS

Inicialmente, gostaria de agradecer a Deus, inteligência suprema e causa

primária de todas as coisas, por estar vivo, pela saúde, pela família e por todas as

oportunidades que Ele me proporcionou até agora. Além disso, também sou grato

aos obstáculos que enfrentei durante a minha vida, pois eles me ensinaram a

crescer e me tornar uma pessoa melhor.

Aos meus pais e irmãos, que são as pessoas mais queridas e importantes

pra mim, pois sem o amor, o carinho, a força e os ensinamentos que recebi deles

a minha vida não teria sentido. Todos os dias agradeço a Deus por ter uma família

tão maravilhosa e unida. Amo demais você pai, que sempre foi o exemplo pra

mim; você mãe, sempre carinhosa e irradiando essa sua alegria que me contagia

sempre; e vocês meus queridos irmãos Zé e Neno, amigos eternos e especiais.

À todos os meus outros familiares pelo carinho e apoio. Mesmo longe de

casa sinto sempre a vibração positiva que vocês me passam. Saudades de todos.

Ao professor Radovan Borojevic pela oportunidade e confiança, além dos

valiosos ensinamentos que nunca serão esquecidos.

Ao revisor e membros da banca pela compreensão em relação ao tempo.

Aos grandes amigos de São José do Rio Preto-SP e do Rio de Janeiro, por

todos os momentos de alegria que passamos juntos, sempre rodeado de muito

papo, risada e aquela cervejinha gelada pra relaxar. A amizade de vocês sempre

será peça fundamental na minha vida.

vi

Á todos os integrantes do Laboratório de Proliferação e Diferenciação

Celular que me acolheram da melhor forma possível, sendo na troca de

conhecimento, nas conversas e nos momentos de descontração.

Aos membros do Departamento de Embriologia e Histologia.

Aos amigos Leandra Baptista, Anderson Teodoro, Ronaldo Amaral, Débora

Portilho e Michelle Othen, pela ajuda nos experimentos finais.

Ao CNPq pelo apoio financeiro.

Ao professor e amigo Adaumir Castro pela correção ortográfica do texto.

Á todas as outras pessoas que me ajudaram de alguma forma para que

esta dissertação de mestrado pudesse ser concluída.

vii

RESUMO

Os pericitos são células perivasculares essenciais na manutenção das

funções metabólicas, mecânicas e de sinalização nos microvasos. Estas células

respondem a sinais vasoativos, a estímulos angiogênicos, guiam brotos

vasculares, estabilizam capilares neoformados, e produzem fatores importantes

para a sobrevivência da célula endotelial formadora dos vasos. Evidências atuais

sugerem que os pericitos funcionem como células progenitoras tecido-residentes

capazes de se diferenciarem em diferentes tipos celulares, incluindo osteoblastos,

condroblastos e adipócitos. O objetivo do presente estudo foi estabelecer

protocolo de isolamento, proliferação e caracterização in vitro de pericitos

originados de placentas humanas. As células foram isoladas de microvilosidades

de placentas por digestão enzimática seguida de centrifugação em gradiente de

Percoll. As células foram caracterizadas por western-blotting utilizando anticorpos

contra NG2 e desmina, marcadores de pericitos. Resultados de citometria de fluxo

mostraram duas populações distintas, sendo negativas para células

hematopoieticas (CD45, CD34) e endoteliais (CD31). As populações

apresentaram marcações positivas para CD105 (endoglina), CD44 (marcador de

célula-tronco), CD73 (marcador de células progenitoras mesenquimais) e CD146

(marcador de pericito). Ensaios de diferenciação também foram realizados para

confirmar a plasticidade dessas células. Sob meio de cultura condicionado

adipogênico e osteogênico, estas células acumularam lipídeos e depositaram

grânulos de cálcio, respectivamente. Os resultados mostraram que o método de

isolamento testado foi eficaz para obtenção de grande número de pericitos, e que

estas células podem ser utilizadas em protocolos de terapias celulares devido a

sua plasticidade fenotipica.

Palavras chaves: pericito, placenta, CD146, NG2

viii

ABSTRACT

Pericytes are perivascular cells essential in the maintenance of the

metabolic, mechanical and signaling functions in microvessels. These cells

respond to vasoactive signals, angiogenic stimuli, guide vascular sprouts, stabilize

new capillaries, and they produce important factors for the survival of the

endothelial cells. Current evidences suggest that they function as tissue-resident

progenitor cells capable of differentiating into a variety of cell types including

osteoblasts, chondroblasts and adipocytes. The aim of the present study was to

establish protocols of isolation, proliferation and characterization in vitro of

pericytes from human placentas. The cells were isolated from placenta microvilli by

enzymatic digestion followed by centrifugation on a Percoll gradient. The cells were

characterized by western-blotting analyses using antibodies against NG2 and

desmin, which are pericytes markers. Results from flow cytometry showed two

distinct populations, negative for hematopoietic (CD45, CD34) and endothelial

(CD31) cell markers. The populations showed positive labeling for CD105

(endoglin), CD44 (hyaluronte receptor, a stem cells marker), CD73 (mesenchymal

progenitors) and CD146 (pericyte marker). Differentiation assays were done to

confirm the plasticity of these cells. Under culture with adipogenic and osteogenic-

inducing media, these cells accumulated lipids or deposited calcium granules,

respectively. The results showed that the method of pericyte isolation was efficient

for getting great number of pericytes, and that these cells can be used in cellular

therapies protocols due to their phenotypic plasticity.

Key words: pericyte, placenta, CD146, NG2

ix

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

ACK – tampão cloreto de amônio

-SMA – alfa smooth muscle actin / actina alfa de músculo liso

bFGF – basic fibroblast growth factor / fator básico de crescimento de fibroblasto

BFS – bovine fetal serum / soro fetal bovino

BHE – blood brain barrier / barreira hemato-encefálica

BSA – bovine serum albumin / soro de albumina bovina

BSS – balanced saline solution / solução salina balanceada

DMEM – Dulbecco’s modified eagle’s medium / meio eagle modificado por

Dulbecco

EC – endothelial cells / células endoteliais

ECM – extracellular matrix / matriz extracelular

HMWMAA – high molecular weight melanome associated antigen / antígeno de

alto peso molecular associado a melanoma

NG2 –nerve-glial 2 / nervo-glial 2

PBS – phosphate buffer saline / solução saline fosfatada

PDGF-AA – platelet derived growth factor AA / fator de crescimento AA derivado

de plaqueta

PDGF-B – platelet derived growth factor B / fator de crescimento B derivado de

plaqueta

PDGFR- – platelet derived growth factor receptor beta / receptor beta do fator de

crescimento derivado de plaqueta

PP – pericyte progenitors / progenitores pericíticos

SMC – do inglês smooth muscle cell / célula de músculo liso

TBS – tris buffer saline / tampão salina tris

TGF-1 – transforming growth factor beta 1 / fator de crescimento transformante

beta 1

VEGF – vascular endothelial growth factor / fator de crescimento endotelial

vascular

x

SUMÁRIO

1) Introdução:..........................................................................................................1

Figura 1..........................................................................................................2

Figura 2..........................................................................................................3

Figura 3..........................................................................................................6

Figura 4........................................................................................................12

2) Objetivos:..........................................................................................................14

3) Metodologia:.....................................................................................................15

3.1) Isolamento de células de placenta humana.........................................15

3.1.1) Preparação das vilosidades....................................................15

3.1.2) Digestão das vilosidades.........................................................15

3.1.3) Isolamento dos microvasos.....................................................16

3.1.4) Cultura de células....................................................................16

3.2) Imunofluorescência...............................................................................17

3.3) Western blotting....................................................................................18

3.3.1) Eletroforese em gel de poliacrilamida.....................................18

3.3.2) Immunoblotting.................................................................... 19

3.4) Extração de RNA Total, síntese de cDNA e RT– PCR.........................20

3.5) Citometria de Fluxo...............................................................................22

3.6) Ensaio de diferenciação osteogênico e adipogênico............................22

4) Resultados:.......................................................................................................24

4.1) Microscopia óptica de contraste de fase de células de placenta humana

crescidas in vitro..........................................................................................24

4.2) Células isoladas de placenta humana expressam o marcador nervo-

glial-2 (NG2)................................................................................................24

4.3) Células isoladas de placenta humana expressam as proteínas NG2 e

desmina...................................................................................................... 25

xi

4.4) Células isoladas de placenta humana expressam RNAm para ANG-1

......................................................................................................................25

4.5) Células isoladas de placenta humana apresentam marcação positiva

para marcadores de células progenitores e ausência de marcadores de

células hematopoiéticas e endoteliais..........................................................25

4.6) As células isoladas de placenta humana respondem positivamente às

induções osteogênica e adipogênica.......................................................... 27

Figura 5........................................................................................................28

Figura 6........................................................................................................29

Figura 7........................................................................................................30

Figura 8........................................................................................................31

Figura 9........................................................................................................32

Figura 10......................................................................................................33

Figura 11......................................................................................................34

Figura 12......................................................................................................35

Figura 13......................................................................................................36

Figura 14......................................................................................................37

Figura 15......................................................................................................38

Figura 16......................................................................................................39

Figura 17......................................................................................................40

5) Discussão:.........................................................................................................41

6) Conclusões:......................................................................................................53

7) Referências Bibliográficas:.............................................................................54

1

1. INTRODUÇÃO

No campo das Terapias Celulares, existe sempre uma busca de fontes

alternativas de células multipotentes com habilidade de diferenciação em múltiplas

linhagens. Uma das fontes mais promissoras para a obtenção dessas células

atualmente é a placenta, pois é um órgão que não necessita de procedimentos

invasivos na sua coleta, já que é expelida após o parto. Além disso, não existem

conflitos éticos envolvidos, devido ao fato desse órgão ser descartado como

expurgo hospitalar.

A placenta, órgão transitório encontrado apenas em mamíferos, é o

intermediário das trocas fisiológicas entre mãe e feto e é constituída por uma parte

fetal e uma parte materna. A parte fetal da placenta é formada pelo córion. Consta

de uma placa corial de onde partem vilos coriônicos. Esses vilos são constituídos

por uma parte central conjuntiva, derivada do mesênquima extra-embrionário, e

pelas camadas do citotrofoblasto e de sinciciotrofoblasto. Os vilos coriais podem

ser livres ou fixos e ambos têm a mesma estrutura, porém os livres não atingem a

decídua, ao passo que os fixos se prendem à decídua basal. A superfície dos vilos

é banhada pelo sangue das lacunas da decídua basal (espaços intervilosos da

placenta), e é aqui que ocorrem as trocas de substâncias entre o sangue fetal e o

materno. A parte materna da placenta é a decídua basal, que fornece sangue

arterial para as lacunas situadas entre os vilos secundários e recebe de volta o

sangue tornado venoso nessas lacunas. Embora os vasos sanguíneos se rompam

durante a implantação, os vasos fetais contidos nos vilos secundários mantêm-se

íntegros (JUNQUEIRA & CARNEIRO, 2008)

Os pericitos (peri = ao redor; cito = célula) foram descritos há mais de 100

anos como células perivasculares que envolvem os microvasos (arteríolas,

vênulas e capilares) (Fig. 1) (EBERTH, 1871; ROUGET, 1873). Eles também eram

chamados células de Rouget, ou referidos como células murais ou, por causa das

suas fibras contráteis, como células de músculo liso (SMC) vascular (HIRSCHI &

D’AMORE, 1996).

2

Figura 1: Fotomicrografia eletrônica de varredura da microvasculatura.

Pericitos envolvendo uma arteríola pré-capilar (Fujiwara and Uehara, 1984).

As primeiras análises por microscopia eletrônica de transmissão revelaram

as características ultraestruturais dos pericitos. Em geral, pericitos possuem um

formato estrelado, corpo celular com núcleo proeminente e limitado citoplasma

perinuclear, de onde se estendem diversos processos citoplasmáticos, envolvendo

a parede do endotélio abluminal (ALLT & LAWRENSON, 2001; BERGERS &

SONG, 2005). Essas células estão aderidas na membrana basal dos microvasos,

que é formada tanto pelos pericitos quanto por células endoteliais (EC)

(MANDARINO et al., 1993).

Os pericitos não servem unicamente como arcabouço, como historicamente

se pensava; podem se comunicar com as EC por contato físico direto e vias de

sinalização parácrina. Junções comunicantes do tipo “gap” fornecem conexões

diretas entre os citoplasmas dos pericitos e EC, permitindo assim a troca de íons e

pequenas moléculas. As placas de adesão ancoram os pericitos nas EC, enquanto

os contatos “peg-and-socket” (pino e tomada) permitem às células penetrar

3

através de descontinuidades da membrana basal dos vasos e tocarem uma a

outra (RUCKER et al., 2000). Esses complexos juncionais sustentam a

transmissão de forças mecânicas contráteis dos pericitos para o endotélio e

contêm N-caderina, moléculas de adesão celular, junções aderentes baseadas em

β-catenina, e moléculas de matriz extracelular (ECM) como a fibronectina

(GERHARDT et al., 2003) (Fig. 2).

Figura 2: Interações entre endotélio e pericitos nos microvasos. Pericitos

envolvendo as EC compartilham a mesma membrana basal. Contato direto entre

pericitos e endotélio é estabelecido via complexos juncionais localizados nos

contatos “peg-and-socket” nos sítios onde a membrana basal é ausente

(modificado de ARMULIK et al., 2005).

Os pericitos exibem longos processos citoplasmáticos, que não apenas

podem contatar numerosas EC, e assim integrar sinais ao longo do comprimento

dos vasos, mas podem também estender para mais de um capilar na vasculatura

(ALLT & LAWRENSON, 2001). Interessantemente, contatos célula-célula parecem

necessários para a ativação do fator de crescimento de transformação β1 (TGF-

β1), que induz a diferenciação dos pericitos in vitro (ORLIDGE & D’AMORE,

1987), sustentando a noção de que o contato celular direto é uma ferramenta de

comunicação crucial para a formação e manutenção dos vasos. Pericitos ainda

4

exibem um número de características consistentes com atividade de célula

muscular, como expressar actina contrátil de músculo liso, além do envolvimento

na maturação dos vasos (HERMAN & D’AMORE, 1985).

Os desafios em definir molecularmente os pericitos não têm sido fáceis pelo

fato de ainda não se ter encontrado um marcador específico para esse tipo celular.

Existem, entretanto, alguns marcadores moleculares que estão presentes nos

pericitos, embora não exclusivamente, e são comumente usados na sua detecção

(BERGERS & SONG, 2005).

Os principais marcadores utilizados na literatura incluem: desmina e α-

actina de músculo liso (α-SMA), que são proteínas do citoesqueleto; nervo-glial 2

(NG2), um proteoglicano transmembranar de sulfato de condroitina; o receptor

beta do fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGFR-β), o gangliosídio 3G5

(BERGERS & SONG, 2005), além do CD146 (SACCHETTI et al, 2007).

Desmina é um filamento intermediário de classe III específico de músculo

encontrado em células musculares maduras esqueléticas, cardíacas e lisas.

Camundongos deficientes em desmina são viáveis e férteis, mas eles

desenvolvem fraqueza muscular progressiva e alterações distróficas em ambos os

músculos cardíacos e esqueléticos (LI et al., 1996; MILNER et al., 1996).

A α-SMA é uma das seis isoformas de mamíferos da proteína actina

citoesquelética. As actinas não musculares beta e gama estão presentes em todas

as células, enquanto que a α-SMA é normalmente restrita às células da linhagem

muscular lisa. Também tem sido mostrado que certas células não-musculares

expressam α-SMA transitoriamente, especificamente fibroblastos, e são referidas

como miofibroblastos (RONNOV-JESSEN & PETERSEN, 1996).

Interessantemente, α-SMA aparece inibindo a migração e mobilização dos

fibroblastos, sugerindo que essa proteína possa promover um fenótipo

diferenciado (RONNOV-JESSEN & PETERSEN, 1996).

O PDGFR-β é uma das moléculas expressas nos pericitos mais

amplamente estudadas. O camundongo deficiente para PDGFR-β ou seu ligante

PDGF-β tem o número de pericitos severamente reduzido e uma subseqüente

hiperdilatação dos vasos sanguíneos, causando assim a formação de edemas,

5

culminando na letalidade embrionária. Entretanto, outros tipos celulares além dos

pericitos também produzem PDGFR-β, como fibroblastos, astrócitos e certas

células tumorais (LINDAHL et al., 1997).

O proteoglicano de sulfato de condroitina NG2 (também chamado de

antígeno associado à melanoma com alto peso molecular, ou HMWMAA; a

derivação para camundongo é denominada AN2) é expresso na superfície dos

pericitos durante os processos de vasculogênese e angiogênese (STALLCUP,

2002). Historicamente, o NG2 foi postulado em ser característico de células

neurais imaturas capazes de se diferenciarem tanto em glia quanto em neurônio e

foi por isso denominado nervo-glial 2. Sustentando essa hipótese, NG2 é

encontrado no sistema nervoso central em células precursoras gliais O-2A, que

originam tanto oligodendrócitos quanto astrócitos tipo II, perdendo a expressão de

NG2 durante o processo de diferenciação (STALLCUP, 2002). O NG2 exerce sua

atividade biológica, em parte, através da ligação com alta afinidade no fator de

crescimento básico de fibroblasto (bFGF), PDGF-AA, plasminogênio e

angiostatina. O camundongo “knockout” para NG2 é viável, mas quando a

angiogênese patológica é induzida no camundongo adulto, como angiogênese

isquêmica na retina do camundongo em resposta à hipóxia ou angiogênese

induzida por bFGF na córnea, a neovascularização é substancialmente reduzida

(OZERDEM AND STALLCUP, 2004). Uma possibilidade adicional é que o NG2

medeie diretamente a comunicação entre pericitos e EC vasculares. O apelo

dessa idéia é aumentado pela observação de que o domínio extracelular do NG2

pode ser liberado proteoliticamente da superfície celular in vitro e in vivo

(NISHIYAMA et al., 1995; JONES et al., 2002). Além disso, NG2 solúvel, liberado

da superfície celular de pericitos, pode estimular o recrutamento de EC para os

sítios de neovascularização (FUKUSHI et al., 2004).

O gangliosídio de membrana 3G5 é expresso na superfície de vários tipos

celulares incluindo células das ilhotas pancreáticas, células foliculares da tireóide,

células glomerulares renais e pericitos (FIEDLER et al., 2004; NAYAK et al.,1988).

STRAMER e colaboradores (2004) demonstraram que o anticorpo monoclonal

3G5 é um marcador de pericitos microvasculares in vitro e in vivo. A expressão

6

desse marcador também foi relatada em pericitos cultivados de retina e coração

(HELMBOLD et al., 2001). Por ser expresso principalmente por células que

possuem processos membranares, esse gangliosídeo pode estar envolvido na

regulação e manutenção da forma celular (STRAMER et al., 2004).

O CD146 é um membro identificado no gene da superfamília de

imunoglobulinas e foi anteriormente chamado por nomes diferentes, devido à sua

identificação em diferentes tecidos, por vários grupos de pesquisa independentes.

Os sinônimos de CD146 incluem MUC18, o antígeno de A32, MCAM, MEL-CAM,

e S-Endo-1 (SHIH, 1999). Atualmente ele é utilizado como marcador de

progenitores mesenquimais e pericitos (SHI & GRONTHOS, 2003; SACCHETTI et

al, 2007; ZANNETTINO et al, 2008).

Os pericitos têm sido associados principalmente aos processos de

estabilização e hemodinâmica dos vasos sanguíneos. Suas funções são,

entretanto, muito mais diversas (Fig. 3). Eles podem, sob estímulo angiogênico,

guiar tubos de brotamento, eliciar funções de sobrevivência endotelial, e até exibir

atividades macrofágicas (BERGERS & SONG, 2005).

Figura 3: Atividades multifuncionais do pericitos nos microvasos. Os

pericitos exercem diversas funções (modificado de EGGINTON et al., 2000).

7

Similar às SMC dos grandes vasos, os pericitos podem produzir

vasoconstrição e vasodilatação dentro da trama de capilares para regular o

diâmetro vascular e o fluxo sanguíneo capilar (RUCKER et al., 2000). A primeira

linha de evidência para essa função veio da identificação de proteínas contráteis

como α-SMA, tropomiosina, e miosina em perictios. Esses filamentos também são

produzidos por SMC e por isso contribuem bastante para a confusão entre a

definição de uma SMC e um pericito (BERGERS & SONG, 2005).

Muitas moléculas que regulam a contração dos pericitos têm sido

identificadas. Por exemplo, pericitos possuem receptores para ambos os

receptores colinérgicos e adrenérgicos (α-2 e β-2). A resposta β-adrenérgica em

pericitos induz o relaxamento, ao passo que a resposta do α-2 é antagonista e

produz contração (RUCKER et al., 2000).

Outras substâncias vasoativas que se ligam aos pericitos são angiotensina

II e endotelina-1. A expressão de endotelina-1 é induzida por EC, que também

produz óxido nítrico, um potente vasodilatador que promove o relaxamento

vascular por um mecanismo dependente de cGMP (RUCKER et al., 2000). Essas

moléculas funcionam como sinais parácrinos, regulam a contração e o

relaxamento de pericitos, e produzem parte das evidências que EC e pericitos

interagem na regulação do fluxo sanguíneo (RUCKER et al., 2000).

Os níveis de oxigênio também regulam a contração dos pericitos. Tem sido

mostrado que a hiperóxia aumenta a contração de pericitos in vitro, ao passo que

elevados níveis de dióxido de carbono induzem o relaxamento (BERGERS &

SONG, 2005). Esses dados sugerem que os vasos dilatam quando o oxigênio é

necessário, mas comprimem se os níveis forem suficientes, por meio disso ligando

a taxa do fluxo sanguíneo ao estado metabólico (BERGERS & SONG, 2005).

Embora a contração in vivo dos pericitos seja mais difícil de provar, técnicas

morfométricas ultraestruturais têm demonstrado a compressão das membranas

endoteliais por pericitos próximos. A contração dos pericitos foi medida em

resposta a substâncias vasoativas no músculo esquelético (TILTON et al., 1979;

HIRSCHI & D’AMORE, 1996).

8

A densidade dos pericitos difere a respeito da sua função nos vasos e

órgãos em que eles são encontrados. Essas células são muito abundantes nas

vênulas e arteríolas, mas são um tanto escassas nos capilares (SIMS, 2000).

Embora seja desconhecido como os pericitos escolhem sua localização

exata na parede dos vasos, eles não estão localizados ao acaso, mas sim

funcionalmente determinados. Tem sido notado que eles, preferencialmente,

cobrem junções de EC, especificamente durante a inflamação (SIMS, 2000).

A cobertura de pericitos nos vasos sanguíneos também varia entre os

tecidos. Isso não é necessariamente surpreendente, porque células vasculares

adquirem características especializadas em diferentes órgãos, baseadas na

função de cada órgão. Em diversos órgãos, como cérebro, fígado e rins, os

pericitos aparecem executando funções específicas e, por isso, essas células

receberam nomes diferentes em cada órgão (BERGERS & SONG, 2005). A maior

densidade de pericitos no corpo é encontrada nos vasos dos tecidos neurais,

como cérebro e retina. A razão para isso é que as EC no cérebro formam um

endotélio contínuo com junções aderentes complexas, interagindo com os

pedículos dos astrócitos e com numerosos pericitos para criar a barreira hemato-

encefálica (BHE), que protege as células cerebrais de potenciais fatores tóxicos

derivados do sangue (CLEAVER & MELTON, 2003; BALLABH et al., 2004). Os

pericitos possuem um papel essencial na integridade dos vasos estruturais e na

BHE. Tem sido mostrado, in vitro, que essas células protegem o rompimento da

BHE, induzido por hipóxia (HAYASHI et al., 2004).

O mais interessante é que os pericitos do cérebro podem executar

atividades típicas de macrófagos, assim provendo uma defesa imunológica. Esse

fenótipo levantou a hipótese que pericitos possam atuar como células precursoras

de macrófagos no cérebro, existindo ainda outras observações para sustentar esta

idéia (THOMAS, 1999). Como macrófagos, pericitos capturam moléculas solúveis

e pequenas por pinocitose, limpando o fluido extracelular, como parte da BHE. Os

pericitos também têm atividade fagocitária (THOMAS, 1999), sendo que a primeira

evidência dessa atividade nessas células foi revelada quando, seguindo

tratamento histamínico, as células gradualmente capturaram carbono durante um

9

período de muitos meses (MAJNO et al., 1961). Além do mais, os pericitos

expressam receptores Fc, que são essenciais para o reconhecimento do complexo

antígeno-anticorpo, para provocar a fagocitose dependente de anticorpo

(BALABANOV et al., 1996).

Os pericitos também possuem funções especializadas no fígado. As células

hepáticas estreladas, também chamadas de células de Itoh (nomeado após seu

descobridor, Toshio Itoh) (SUEMATSU & AISO, 2002), são os equivalentes dos

pericitos no fígado (SATO et al., 2003). Essas células estão localizadas entre as

placas de células parenquimatosas e as EC sinusoidais. Ao contrário do endotélio

contínuo cerebral, as EC do fígado são altamente fenestradas e descontínuas.

Elas alinham os sinusóides hepáticos e medeiam a troca de metabólitos entre a

veia porta, as células de Kupffer e hepatócitos, no processamento das toxinas

(ABBOTT, 2002).

Nos rins, os pericitos dos capilares glomerulares são chamados células

mesangeais e contabilizam aproximadamente 30% das células glomerulares.

Essas células contribuem para a bifurcação intussusceptiva ou a divisão de um

laço vascular único que invade vários capilares glomerulares, criando assim um

aumento significativo da área da superfície capilar para a ultrafiltração do sangue

(BETSHOLTZ, 2004). A sinalização de PDGFR-β parece ser crítica para o

desenvolvimento das células mesangeais, pois camundongos deficientes em

PDGF-B ou seu receptor PDGFR-β apresentam ausência de células mesangeais

e, por isso, formam glomérulos renais defeituosos que possuem apenas um laço

capilar distendido (BETSHOLTZ, 2004).

Os pericitos não estão apenas envolvidos nos processos hemodinâmicos,

mas também possuem um papel ativo na formação do vaso. Os vasos sanguíneos

desenvolvem-se inicialmente durante a embriogênese e são derivados de

precursores mesodermais chamados angioblastos (CARMELIET, 2004).

Adicionalmente, acredita-se que as EC dividem um precursor comum com as

células hematopoiéticas, sendo esse precursor chamado de hemangioblasto. Essa

hipótese de um precursor comum é sustentada pelas observações de que EC e

células hematopoiéticas em desenvolvimento dividem marcadores de superfície

10

comuns e que as hematopoiéticas podem crescer do principal vaso sanguíneo

embrionário (RIBATTI et al., 2002; CARMELIET, 2004).

O tecido estromal da medula óssea (BM) de mamíferos adultos foi

tradicionalmente examinado, basicamente, quanto ao seu papel bem

documentado no apoio a hematopoiese, isto é, um tecido cuja função principal é

fornecer um microambiente dentro do BM que suporta a proliferação, a

diferenciação e a maturação de células-tronco hematopoiéticas em cada uma das

oito linhagens distintas que compreendem o sistema hematopoiético. Em

contraste, a possibilidade de que o estroma da BM pode ele mesmo ser baseado

em um modelo de célula-tronco e que contenha células estromais multipotentes,

com a capacidade para dar a origem a cada uma das linhagens de células

diferenciadas encontradas no estroma medular, no osso, e na cartilagem, tem

recebido uma atenção relativamente pequena. Contudo, com o progresso rápido

nesta área, é claro agora que as células progenitoras/tronco do tecido esquelético

e estromal da BM, inequivocamente existem em múltiplas espécies mamíferas, e

que BM deve ser vista como um órgão que abriga pelo menos duas população

distintas de células-tronco adultas, cujas várias progênies coexistem em uma

maneira funcionalmente interdependente. (SHORT et al, 2003).

Os pericitos têm uma ontogenia complexa, pois podem desenvolver-se a

partir de várias células, como uma função da sua posição no embrião (BERGERS

& SONG, 2005). Por exemplo, pericitos podem desenvolver-se da crista neural na

parte anterior do cérebro e tratos cardíacos (BERGWERFF et al., 1998).

Mais comumente descrita é sua origem a partir das células-tronco

mesenquimais (CREAZZO et al., 1998). Sob essas circunstâncias, TGF-β1 parece

iniciar a diferenciação dos progenitores pericíticos (PP) PDGFR-β+ que são então

atraídos quimiotaticamente pelas EC que secretam PDGF-B nos plexus capilares

(HELLSTROM et al., 1999). TGF-β1 parece guiar a diferenciação dos

progenitores, derivados da crista neural ou do mesênquima, em células similares a

SMC (DARLAND & D’AMORE, 2001; CHEN & LECHLEIDER, 2004).

Logo que o plexo capilar primário é montado, o mesmo é refinado em uma

rede funcional por angiogênese, que pode incluir intussuscepção endotelial,

11

junção celular endotelial, brotamento de vasos, ou uma combinação dos três

processos. No brotamento de vasos, fatores angiogênicos, como o fator de

crescimento de endotélio vascular (VEGF), estimulam as EC que, por sua vez,

começam a secretar várias proteases para degradar a membrana basal do vaso.

Isso permite que as EC invadam a ECM ao redor e formem uma coluna de

migração que consiste em EC proliferando e migrando (BERGERS & SONG,

2005). Como demonstrado na retina, essa coluna é guiada por EC que migram na

mesma ponta e se movem em direção a um gradiente de VEGF (GERHARDT et

al., 2003).

Entretanto, estudos em corpo lúteo, retina e tumores têm sugerido que os

pericitos também são capazes de guiar processos de brotamento migrando

adiante das EC e expressando VEGF. Foi observada a ocorrência de tubos de

pericitos, livres de endotélio, tanto na microvasculatura normal quanto na

patológica (REYNOLDS et al., 2000; OZERDEM et al., 2001; OZERDEM &

STALLCUP, 2003). Novos brotamentos formados cessam a proliferação atrás da

zona de migração, aderem uns aos outros e formam um novo vaso contendo

lúmen. As EC então secretam fatores de crescimento, em parte para atrair

pericitos que envolvem a parede vascular, e promovem a maturação do vaso

(BERGERS & SONG, 2005).

Embora muitos fatores como o S1P-1 (esfingosina-1-fosfafo-1) e as

angiopoetinas tenham sido implicados no recrutamento dos pericitos e na

maturação dos vasos (JAIN, 2003), é o PDGF-B que parece ter um papel crucial

no recrutamento dos pericitos para vasos neoformados (BETSHOLTZ, 2004).

Durante a angiogênese em embriões e adultos, PDGF-B é expresso pelas EC dos

brotamentos de capilares, ao passo que seu receptor, PDGFR-β, é localizado nos

pericitos, sugerindo um circuito de sinalização parácrina entre os dois tipos

celulares (HELLSTROM et al., 1999; HIRSCHI et al., 1999; HENGE et al., 2002).

(Fig. 4).

12

Figura 4. Sinalização PDGF-B/PDGFR-β é necessário para o recrutamento de

pericitos durante a angiogênese. PDGF-B é sintetizado e secretado pelas

células da extremidade que lideram o avanço do broto angiogênico. A ligação do

PDGF-B aos proteoglicanos de sulfato de heparan (HSPG) é importante para a

localização do PDGF-B nas proximidades do vaso em desenvolvimento. Pericitos,

que expressam PDGFR-β, são dependentes do PDGF-B derivados do endotélio

para a sua proliferação e migração (modificado de ARMULIK et al., 2005).

Acredita-se que os pericitos, por causa da sua posição abraçando o vaso,

sejam capazes de transferir sinais angiogênicos ao longo do comprimento do vaso

por contatar numerosas EC. As EC e pericitos se comunicam tanto por contato

direto quanto por sinalização parácrina; por meio disso, também afetam a taxa

mitótica um do outro. Pericitos induzem diferenciação endotelial e inibição do

crescimento endotelial (HIRSCHI et al., 1998; SIMS, 2000; GERHARDT &

BETSHOLTZ, 2003).

Essas idéias a respeito da interação entre pericitos e EC são primariamente

baseadas na visão de que o recrutamento de pericitos fica para trás do

brotamento endotelial e que essa janela de ausência de pericitos permite uma

plasticidade vascular, resultando em crescimento, sobrevivência, remodelamento

ou regressão do endotélio, dependendo da presença ou ausência de fatores de

crescimento angiogênicos, como o VEGF (BONDJERS et al., 2003). Em conjunto,

EC e pericitos regulam a formação, a maturação e a especificação dos vasos,

todos os quais necessitam de uma orquestração de muitas moléculas reguladas.

13

Finalmente, a função pluripotencial dos pericitos está ganhando

credibilidade. Existem boas evidências que células com características

pluripotentes estejam presentes em muitos tecidos adultos, incluindo a medula

óssea, pele, músculo esquelético, tecido adiposo e a polpa do dente (BIANCO et

al., 2001; VERFAILLIE, 2002; TUAN et al., 2003). Entretanto a identidade dessas

células precisa ser mais bem definida. Interessantemente, BIANCO e

colaboradores (2001) sugeriram que as células-tronco mesenquimais presentes na

BM poderiam originar-se de pericitos microvasculares, devido ao fato em ambos

expressarem fosfatase alcaline e potencial de diferenciação em linhagens

mesenquimais.

Pelo fato de vários outros tecidos, de onde células pluripotentes são

isoladas, serem também ricos em microvasos, existe a hipótese de que essas

células também possam ter origem vascular (FARRINGTON-ROCK et al., 2004).

Sustentando essa hipótese, vários autores demonstraram que o pericito tem o

potencial de se diferenciar em osteoblastos, condrócitos, adipócitos, SMC,

macrófagos e fibroblastos (SCHOR et al., 1990; DIAZ-FLORES et al., 1991; SIMS,

1991; BRIGHTON et al., 1992; DIAZ-FLORES et al., 1992; DOHERTY et al., 1998;

DOHERTY & CANFIELD, 1999; SIMS, 2000).

Como visto, os pericitos possuem grande potencial de diferenciação na

linhagem mesenquimal, além de estar presente em vários órgãos, abrindo novas

portas para a utilização em terapias celulares, o que justifica o estudo dessas

células.

14

2. OBJETIVO GERAL

Este estudo tem como objetivo principal isolar, proliferar e caracterizar

pericitos humanos in vitro e gerar informações para uso futuro em terapia celular.

2.1 Objetivos Específicos

Estabelecer protocolo de isolamento de pericitos originados de

microvilosidades de placentas humanas;

Caracterizar as células isoladas utilizando marcadores apropriados

utilizando citometria de fluxo;

Confirmar o potencial adipogênico e osteogênico das células isoladas

através de testes de diferenciação.

15

3. METODOLOGIA

3.1 – Isolamento de células de placenta humana:

Placentas humanas frescas foram coletadas assepticamente no Centro

Obstétrico da Maternidade Pró-Matre, Rio de Janeiro, RJ. O material proveniente

de gestações normais e partos naturais foi transportado em bolsa estéril

acomodado em recipiente térmico com gelo até o Banco de Células do Rio de

Janeiro, localizado no Hospital Universitário Clementino Fraga Filho da

Universidade Federal do Rio de Janeiro, onde foi realizado o procedimento de

isolamento das células, mediante autorização do Comitê de Ética do Hospital. A

metodologia utilizada foi modificada de KACÉMI e colaboradores (1997) para ser

utilizada em cultura de células.

3.1.1 – Preparação das vilosidades:

Após a remoção da lâmina corióide e basal, foram retirados alguns

cotilédones placentários, que foram lavados em tampão fosfato salino 0,1M e pH

7,2 (PBS) a 4°C suplementado com os antibióticos penicilina (0,1 mg/mL),

estreptomicina (0,1 mg/mL), anfotericina (1 mg/mL) e ciprofloxacina (1 µg / mL),

para a retirada do excesso de sangue. Os vasos de maior calibre foram extirpados

utilizando-se material cirúrgico apropriado e esterilizado, e as vilosidades retiradas

foram lavadas 4 vezes em solução ACK (cloreto de potássio) para lisar o excesso

de hemácias. Após esse processo, foram separadas para posterior digestão.

3.1.2 – Digestão das vilosidades:

Cinco gramas de microvilosidades placentárias frescas foram digeridas em

25 mL de colagenase IA 0,3% (3mg/mL) (SiGMA) sob agitação branda a 37°C.

Após 2 horas de digestão, o material foi centrifugado por 7 minutos a 600g e o

pellet lavado 3 vezes com 30 mL de PBS.

16

3.1.3 – Isolamento dos microvasos:

Os microvasos foram separados em gradiente de Percoll (SIGMA). O Percoll

foi diluído em meio DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium - SIGMA) para

produzir 50% Percoll, usando Percoll (d = 1,13) em 1,5M NaCl. As microvilosidades

foram bandeadas por centrifugação a 400g por 20 minutos em temperatura

ambiente. Foram utilizados 5 mL de Percoll para cada 35 mL de microvilosidades

suspensas em DMEM. A banda observada entre 0,5 e 2 centímetros do topo do

gradiente foi removida, ressuspendida em 20 mL de DMEM e coletada por

centrifugação.

Para remover o material contaminante (fibras e células estromais) as

microvilosidades foram novamente digeridas em 10 mL de colagenase IA 0,3% por

mais duas horas a 37°C sob agitação branda. Após a digestão, a suspensão foi

centrifugada a 600g por 7 minutos e o pellet lavado 3 vezes com 30 mL de DMEM.

As microvilosidades foram novamente separadas em gradiente de Percoll e

coletadas como descrito anteriormente.

3.1.4 – Cultura de células:

Os fragmentos de microvasos digeridos no processo foram transferidos para

garrafas de cultura de 25 cm2 e cultivados em DMEM suplementado com 10% de

soro fetal bovino (BFS) (CUTLAB) em estufa a 37°C com atmosfera de 5% de CO2.

Após a migração e adesão das células na garrafa, as mesmas foram lavadas 3

vezes com PBS suplementado com os antibióticos penicilina (0,1 mg/mL),

estreptomicina (0,1 mg/mL), anfotericina (1 mg/mL) e ciprofloxacina (1 µg / mL)

para retirar o restante do material digerido e evitar a contaminação da cultura

primária por microrganismos. Após 30 dias, a cultura atingiu a confluência, e as

células foram tripsinizadas (0,125%) para posterior utilização em experimentos, e

também congeladas em criotubos, utilizando-se 5% de DMSO (Dimetilsulfóxido)

(SIGMA) + 95% de BFS, em um volume de 1 mL por criotubo. Os criotubos foram

17

colocados em um container apropriado para congelamento contendo álcool

isopropílico. O container contendo os criotubos foi deixado overnight em freezer -

80°C e após isso, armazenado em nitrogênio líquido. As células utilizadas nos

experimentos encontravam-se em terceira passagem.

As células foram analisadas por microscopia de contraste de fases no

microscópio Leica DC 300 e as imagens digitais obtidas utilizando o programa

Leica Image Manager 50.

3.2 – Imunofluorescência:

Antes da utilização do anticorpo NG2 nas células isoladas, foi utilizada,

como controle positivo, uma linhagem de glioma humano denominada U-373.

Utilizou-se também anticorpo contra GFAP (proteína ácida fibrilar glial) (1:500)

(DAKO) para confirmar que as células eram realmente de uma linhagem de glioma.

A linhagem celular e o anticorpo contra GFAP foram gentilmente cedidos pelo Dr.

Vivaldo Moura Neto (ICB-CCS, UFRJ).

As células isoladas a partir da digestão das microvilosidades de placenta

humana e a U-373 foram semeadas (2x104 células/poço) em placas de 24 poços

sobre lamínulas de vidro previamente lavadas e esterelizadas, e, após adesão,

foram fixadas com parafolmaldeído 4% não tamponado por 1 hora.

Após 5 lavagens com BSS (solução salina balanceada), as células foram

permeabilizadas com Triton X-100 0,2% por 5 minutos, lavadas 1 vez com BSS e

lavadas com cloreto de amônio 500mM (neutraliza os sítios aldeídicos livres) por 30

minutos. Uma nova lavagem com BSS foi realizada, e então os sítios inespecíficos

foram bloqueados com BSS/BSA (solução saline balanceada/soro de albumina

bovina) 5% (bloqueia as ligações inespecíficas do anticorpo primário) por 30

minutos.

Em seguida, as células foram incubadas com o anticorpo primário contra

NG2 (1:200, código H-300 policlonal, Santa Cruz Biotechnology, USA) diluído em

BSS/BSA 0,1% overnight a 4°C em câmara úmida. Após a incubação com o

anticorpo primário, as células foram lavadas 3 vezes e, posteriormente, incubadas

18

com o anticorpo secundário acoplado a FITC (Isotiocianato de fluoresceína) (1:200,

Institut Pasteur Production, France) diluído em BSS/BSA 0,1% por duas horas a

temperatura ambiente. Depois desse processo, as células foram lavadas 3 vezes

com BSS, sendo que o excesso de líquido foi retirado com o auxílio de papel filtro.

O mesmo procedimento foi realizado utilizando-se o anticorpo contra GFAP apenas

nas células U-373.

Todos os núcleos celulares foram marcados por DAPI (4',6-Diamidino-2-

fenilindole). As lamínulas contendo as células foram incubadas por 5 minutos em

DAPI (1:8000) (sem luminosidade) e depois lavadas 3 vezes com PBS e por final

lavadas mais 3 vezes com água destilada.

As lamínulas foram montadas sobre lâminas previamente lavadas utilizando-

se o meio de montagem Vectashield (Vector Laboratories, USA). A vedação das

lamínulas foi realizada com esmalte e, após secarem, foram mantidas à 4°C e

posteriormente analisadas em microscópio de fluorescência.

Foram observados 10 campos por lâmina, para verificar se as células, tendo

os núcleos identificados por DAPI, também apresentavam marcação positiva para

NG2.

As células foram analisadas no microscópio de fluorescência Nikon Eclipse

E800 e as imagens obtidas utilizando o programa Image Pro Plus.

3.3 Western blotting:

3.3.1 Eletroforese em gel de poliacrilamida:

Os procedimentos descritos neste tópico da tese e que se referem a

eletroforese em gel de poliacrilamida e Western Blotting, foram feitos com a

colaboração da aluna de doutorado Débora Morueco Portilho. As células isoladas

foram lavadas 3 vezes com PBS e depois tratadas com 1 volume de tampão de

amostra (SDS 4%, Tris-HCl 125 mM pH 6,8, glicerol 20% e DTT 0,2 mM) para

eletroforese a uma dimensão e fervidas por 5 minutos a 100 oC. As amostras foram

conservadas a –20 oC. Géis de corrida desnaturantes de poliacrilamida a 10%

19

(SDS-PAGE) (LAEMMLI, 1970) foram preparados e as amostras na concentração

de 60 µg de proteínas/20µL de volume final. As eletroforeses foram realizadas a

corrente constante (cerca de 15 mA) por 1:30h.

3.3.2 Immunoblotting:

A revelação imunológica da reação imunológica da separação

eletroforética de proteínas em gel desnaturante de poliacrilamida para folha de

PVDF (Polivinilideno fluorado) (Millipore, São Paulo, Brasil), ou immunoblotting, foi

feita de acordo com o descrito por TOWBIN e colaboradores (1979), com

modificações.

Primeiramente, foi feita uma eletroforese unidimensional em gel

desnaturante de poliacrilamida das amostras contra as quais se quis fazer um

reconhecimento imunológico. Ao final da eletroforese, o gel foi colocado no tampão

de transferência (Tris 25 mM, glicina 191 mM e metanol 20%), por 20 minutos. A

folha de PVDF foi lavada por 10 segundos em metanol 100%, colocada em água

destilada por 5 minutos (sob agitação) e depois por 10 minutos em tampão de

transferência. A seguir, as proteínas foram transferidas eletroforeticamente para

essa folha, durante 19 horas, a 25 mA e à 4 oC. A eficiência da transferência foi

analisada pela solução de vermelho ponceau (VP) (VP 0,1% e ácido acético 5%),

que serve para confirmar se as proteínas do gel foram transferidas para a

membrana, assim testando-se a eficiência da transferência.

As proteínas imobilizadas na membrana foram imediatamente bloqueadas

por 1 hora à temperatura ambiente por uma solução de 5 % de leite em pó

desnatado Molico em tampão TBS-Tween (tampão Tris-HCl salino com Tween 20)

(0,001%) e após, a membrana foi lavada 3 vezes por 5 minutos cada, com TBS-

Tween. A PVDF então, foi incubada com os anticorpos primários contra NG2

(1:200, Santa Cruz Biotechnology, USA) e desmina (1:100, Sigma Chemical Co.,

USA), diluído adequadamente nesse mesmo tampão, overnight, à 4 oC e sob

agitação. Após a incubação, a membrana foi lavada mais 5 vezes, por 3 minutos

cada, com TBS-Tween. A seguir, incubou-se com o anticorpo secundário

20

conjugado à peroxidase devidamente diluído, por 1 hora, à temperatura ambiente e

sob agitação. Após 4 lavagens de 10 minutos cada, com TBS-Tween, a PVDF foi

submetida à revelação pelo Kit ECL (Amersham, Buckinghamshire, UK) e todo o

procedimento foi feito segundo protocolo da Amersham.

Para verificar outra proteína presente nessa mesma folha de PVDF, a

mesma foi tratada com tampão de Striping (SDS 2%, 2-mercaptoetanol 100 mM e

Tris 62,5 mM pH 6,7) por 40 minutos a 60 oC, lavada 4 vezes em TBS-Tween 20 e

bloqueada novamente. Depois, a membrana foi incubada com anticorpo primário

devidamente diluído em TBS-Tween e o procedimento a seguir se deu da mesma

forma descrita anteriormente.

3.4 – Extração de RNA Total, síntese de cDNA e Reação em Cadeia da

Polimerase via Transcriptase Reversa (RT– PCR), Reverse Transcriptase-

Polymerase Chain Reaction):

Os procedimentos descritos neste tópico da tese foram feitos com a

colaboração do doutor Anderson Teodoro. Para avaliação da expressão gênica

das células do processo de isolamento, foram realizados ensaios de RT-PCR nas

seguintes condições:

Foi adicionado 1 mL de solução de TRIzol ReagentTM (Gibco) a cada inserto,

homogeneizando a solução e posteriormente, adicionando-se 200 µL de

clorofórmio para separação do mRNA, conforme o protocolo do fabricante. Por

espectrofotometria, o RNA total foi quantificado. Para a síntese de cada cDNA, foi

utilizado a mesma quantidade de RNA (1 µg de RNA total), para possibilitar uma

comparação mais fidedigna entre as diferentes amostras. A este, se adicionou 0,5

µg de oligo-(dT) (Gibco), incubando-se a 65°C por 10 minutos.

A 4°C foi adicionado 4 µL de tampão (5 vezes concentrado), 1 µL de DTT

(0,1 mM), 1 µL de dNTPs (10 mM), 200 unidades de MLV (transcriptase reversa)

(todos da Gibco) e 1 µL de água DEPC (dietilpirocarbonato). As amostras foram

incubadas por 1 hora a 37°C e, ao final desse período, a temperatura foi elevada

21

até 95°C por 10 minutos. Foi adicionada água, a 4°C, até o volume de 100 µL a

cada tubo de reação.

O cDNA foi amplificado utilizando-se primers para 18S e ANG1, Para cada

reação de PCR, foram utilizados 2,5 µL de cDNA, 0,5 U de Taq polimerase, 1,5

mM de MgCl2, 0,5 µL de dNTP (10 mM) e 0,1 µg do senso e do anti-senso de

primer. A temperatura de anelamento variou de acordo com o par de primers a ser

utilizado, seguindo as especificações do fabricante.

Após a amplificação, as amostras foram misturadas com 5 µL do tampão de

corrida (azul de bromofenol + TBE (tris + ácido bórico + EDTA) + glicerol) e

adicionadas a um gel de agarose 2% em uma cuba contendo TBE 0,5 vezes, para

análise por eletroforese. Foi utilizado padrão de peso molecular de 100 pares de

bases (Gibco). Em uma cuba, a corrida das amostras foi feita a 100mA.

Após eletroforese, o gel foi incubado em solução de brometo de etídeo

[0,17 μg/mL de TAE (Tris-Acetato-EDTA)] e posteriormente lavado em água

corrente por 5-10 minutos para remoção do excesso do corante. O gel foi

analisado em transiluminador de luz ultravioleta (Pharmacia) e o registro foi feito

através de imagem digitalizada.

As seqüências dos primers (Gene LinkTM) utilizados para o PCR foram:

Primers Seqüências Número

de pares

de bases

GAPDH senso 5’-CACCCATGGCAAATTCCATGGCA-3’

anti-senso 5’-TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC-3’

600 pb

ANG-1 senso 5’GTGGAATCTGTCATATACTGTGAA3’

anti-senso 3’ACTGTGCAGATGTATATGAAGC5’

326pb

22

3.5 – Citometria de fluxo:

Os procedimentos descritos neste tópico da tese foram feitos com a

colaboração da doutora Leandra Baptista. As células foram tripsinizadas e

distribuídas nos tubos em quantidades desejadas (5 x 105 a 1 x 106/tubo). Após a

suspensão das células, elas foram lavadas em tampão de FACS [PBS (solução

salina fosfatada) contendo 3% de SFB (soro fetal bovino) e 0,1% de azida sódica]

e incubadas por 20 minutos a 4ºC com anticorpos monoclonais conjugados aos

fluorocromos PE (695nm), PerCP-Cy5 (490nm), e APC (660nm). Foram

analisados os seguintes marcadores de superfície: CD34 (clone 8G12; Becton &

Dickinson, Franklin Lakes, NJ), CD45 (clone H130; Becton & Dickinson), CD31

(clone L133.1; Becton & Dickinson), CD146 (clone P1H12; Becton & Dickinson),

CD105 (clone 166707; R & D Systems), CD44 (clone G44-26; Becton & Dickinson)

e CD73 (clone AD2; Becton & Dickinson). Após a incubação, a suspensão celular

foi lavada com tampão de FACS e analisada em citômetro FACScanto (BD

Biosciences, US), equipado com o programa FACS Diva Software 4.0.

3.6 – Ensaio de diferenciação osteogênica e adipogênica:

Em ambos os ensaios, as células isoladas foram plaqueadas (5x104

células/poço) em placas de 24 poços, tendo como meio controle DMEM

suplementado com 10% de BFS, penicilina (0,1 mg/mL) e estreptomicina (0,1

mg/mL). Para indução osteogênica foi adicionado ao meio controle 50 μM ácido

ascórbico, 10 mM β-glicerolfosfato e 0,1 μM dexametasona. A cultura foi mantida

por 28 dias, sendo ambos os meios (controle e indutor) trocados 2 vezes por

semana. Após o final do tempo estipulado foi utilizada a coloração Nuclear Fast

Red (Chroma), que revela a presença de depósitos de cálcio produzidos pelas

células.

Para indução adipogênica foram adicionados 3-Isobutil-1-metilxantina

(IBMX) 0,5 mM, insulina 10 μM, indometacina 200 μM e dexametasona 1 μM. A

cultura foi mantida por 14 dias sendo o meio trocado 2 vezes por semana. Ao final

23

do tempo estipulado foi utilizada a coloração Oil-Red-O (Sigma), que mostra se há

ou não acúmulo de lipídeos pelas células cultivadas. As células foram analisadas

no microscópio de contraste de fases Leica DC 300 e as imagens obtidas utilizando

o programa Leica Image Manager 50.

24

4. RESULTADOS

4.1 – Microscopia óptica de contraste de fase de células de placenta humana

crescidas in vitro:

No estabelecimento do protocolo de isolamento de pericito a partir de

microvilosidades de placenta humana foram realizados testes relacionados ao tipo

de plaqueamento dos microvasos digeridos. No plaqueamento do tecido digerido

foi utilizada principalmente a técnica de explante. Entretanto, também foi testado o

plaqueamento do material em suspensão no meio, sendo utilizados volumes

diferentes.

Tanto o explante como a adição de 2mL de material digerido foram bem

sucedidos, o que não ocorreu quando foi adicionado 4mL de material digerido.

Nos primeiros 10 dias de cultura, observou-se uma migração das células do

tecido explantado para a parede da garrafa de cultura, sendo lenta a proliferação

das células nesse intervalo de tempo (Figs. 5A – 5C). Após a migração e

proliferação das células na garrafa, as mesmas foram lavadas para retirar o

restante do explante (Figs. 5D e 5E). A partir daí, observou-se a proliferação de

diversos grupos de células distantes um dos outros. Com a continuidade da cultura,

esses grupos celulares se confluíram, formando grupos maiores até ser atingida a

confluência da garrafa em 30 dias (Figura 5F). O número total de células

conseguidas na tripsinização foi de aproximadamente 5x106 células para cada 5

gramas de microvilosidades.

4.2 – Células isoladas de placenta humana expressam o marcador nervo-glial-2

(NG2):

Nas células controles U-373 foi observada marcação positiva para o

proteoglicano de membrana NG2 (Fig. 6A) e GFAP (Fig. 6B).

Foram realizados então ensaios de imunofluorescência nas células isoladas

de placenta humana utilizando-se o anticorpo para o proteoglicano NG2. As células

25

apresentaram marcação positiva para NG2 (Figs. 7A e 7B). Não houve, no controle

negativo, sinal de marcação inespecífica pelo anticorpo secundário, o que mostra a

especificidade da reação (Fig. 7C). Nos campos observados nas lâminas, todas as

células marcadas com DAPI foram também positivas para NG2.

4.3 – Células isoladas de placenta humana expressam as proteínas NG2 e

desmina:

As células isoladas da placenta foram submetidas a análises moleculares

para investigar a presença de proteínas expressas nessas células. Foi observada

nas células isoladas de placentas humanas a expressão do proteoglicano NG2 e

também do filamento intermediário desmina (Fig. 8).

4.4 – Células isoladas de placenta humana expressam RNAm para ANG-1:

A extração do DNA foi confirmada pela presença do DNA constitutivo 18S.

As células isoladas da placenta apresentaram marcação positiva para Ang-1 (Fig.

9)

4.5 – Células isoladas de placenta humana apresentam marcação positiva para

marcadores de células progenitores e ausência de marcadores de células

hematopoiéticas e endoteliais:

As células analisadas na citometria de fluxo possuiam morfologia

fibroblastóide e encontravam-se em terceira passagem. A população de células

isoladas das microvilosidades placentárias se mostrou heterogênea. Duas

populações puderam ser evidenciadas, uma P1 e P2, sendo que as células da

primeira possuíam um tamanho maior que as da segunda (Fig. 10A). Foram

realizados controles da auto-fluorescência, sendo que neste não foi detectado

sinal dos fluorocromos PerCP-Cy5 (Fig. 10B), PE (Fig. 10C) e APC (Fig. 10D),

evitando assim um resultado falso positivo.

26

Não foram encontradas, em nenhuma das duas populações, células

positivas para CD31 (Fig. 11A), mostrando a ausência de células endoteliais nas

células analisadas. Além disso, também não foram encontradas nas populações,

células positivas para CD45 (Fig. 11B) e também para CD34 (Fig. 11C),

descartando assim a presença de células hematopoiéticas e de células-tronco

hematopoiéticas, respectivamente, nas células analisadas.

Algumas populações de células apresentaram marcações positivas para

CD105 (endoglina), CD44 (marcador de célula-tronco), CD73 (marcador de células

progenitoras mesenquimais) e CD146 (marcador de pericito).

Cada marcador foi analisado individualmente e os resultados foram os

seguintes:

CD 105

Foram encontradas 37,9% de células positivas (Fig. 12A) em ambas as

populações analisadas, sendo que na P1 as células positivas eram 79% (Fig.

12B), enquanto que na P2 esse número cai para 11,4% (Fig. 12C).

CD 44

Foram encontradas 65,9% (Fig. 13A) de células positivas em ambas as

populações analisadas, sendo que na P1 as células positivas eram 96,6% (Fig.

13B), enquanto que na P2 esse número cai para 58% (Fig. 13C).

CD 73

Foram encontradas 56,6% de células positivas (Fig. 14A) em ambas as

populações analisadas, sendo que na P1 as células positivas eram 89.5% (Fig.

14B), enquanto que na P2 esse número cai para 43,9% (Fig. 14C).

27

CD146

Das células analisadas, 17,8% foram positivas para CD146 (Fig 15A).

Quase todas essas células se encontravam na população 1, sendo quase

desprezível a quantidade de células positivas na população 2. Se formos

considerar apenas a população P1, o número de células positivas para CD146

sobe para 29,4% (Fig 15B).

Os dados analisados mostraram que uma maior quantidade de células

CD146+CD73+CD44+CD105+ estão presentes na P1, porém podemos também

encontrar, em uma quantidade menor, estes tipos celulares na P2. Esses

resultados mostraram que foi possível obter das microvilosidades placentárias,

uma população que expressa vários marcadores de progenitores mesenquimais,

incluindo pericitos.

4.6 – As células isoladas de placenta humana respondem positivamente às

induções osteogênica e adipogênica:

Com base na literatura que mostra que o pericito possui características de

células multipotentes, e é capaz de se diferenciar em outros tipos celulares, foram

realizados dois testes de diferenciação, sendo um deles osteogênico e o outro

adipogênico, para confirmar se as células isoladas também possuíam tais

características.

Em ambos os testes, as células sob indução responderam de forma

esperada. Nas células induzidas com meio osteogênico foi observada uma

deposição de cálcio, marcada pela coloração Nuclear Fast Red (Fig. 16A), sendo

negativa a coloração nas células cultivada apenas com meio suplementado com

soro fetal bovino (Fig. 16B). Essa diferença também pode ser observada

macroscopicamente na placa de cultura (Fig. 16C). Nas células induzidas com

meio adipogênico foi observado um acúmulo de lipídeos em vacúolos, marcado

pela coloração Oil-Red-O (Fig. 17A), sendo negativa a coloração nas células

cultivada apenas com meio suplementado com soro fetal bovino (Fig. 17B).

Figura 5. Cultura primária de pericitos humanos isolados de microvilosidades de

placenta observadas por microscopia óptica de contraste de fase. As células

migraram a partir de microvasos digeridos explantados na garrafa de cultura (A

– C). Após lavagem com tampão PBS, o material digerido foi removido (D e E).

Após 30 dias as células alcançaram a confluência (F). Barras: A/D = ~2 m;

B/E/F = ~4 m e C = ~6 m.

Figura 6. Controle positivo para NG2. Marcação imunofluorescente mostrando

reconhecimento do antígeno pelo anticorpo policlonal NG2 em células da

linhagem de glioma humano U-373 (A). Estas células também apresentaram

marcação imunofluorescente positiva para GFAP (B), confirmando serem de

uma linhagem de glioma. Barras: A/B = ~8 m.

Figura 7. Caracterização do pericito. Marcação imunofluorescente mostrando a

expressão de NG2 pelos pericitos em A e B. O controle, utilizando somente

anticorpo secundário, mostra células não marcadas em C. Os núcleos em azul

foram marcados com DAPI. Barras: A/C = ~8 m; B = ~3 m.

31

Figura 8. Caracterização molecular do pericito por wester-blotting mostrando a

expressão de NG2 (A) e desmina (B) pelas células isoladas de placenta humana.

A B

270-300 kDa 52 kDa

32

Figura 9. Expressão de ANG-1 nas células isoladas da placenta (HPP). O RNA

total das células expandidas foi isolado, e o cDNA amplificado com primer

específico. O produto do RT-PCR foi analisado por gel de agarose corado por

brometo de etídeo. As células apresentaram marcação positiva (seta). Células de

tecido adiposo (TA) foram utilizado como controle negativo.

TA HPP

ANG 1

326 pb 300 pb

200 pb

100 pb

400 pb

500 pb

600 pb

33

Figura 10. Fenótipo da população celular isolada de microvilosidades de

placentas humanas. Vermelho = células menores; Azul = células maiores (A)

Tamanho (FSC) e granulosidade (SSC) das células de placenta. As análises foram

realizadas nas populações 1 e 2. (B-D) Controle de autofluorescência. Eixo X =

número de eventos; eixo Y = intensidade de fluorescência do fluorocromo.

A B

D C

34


placentas humanas. Histograma mostrando a ausência de expressão dos

marcadores CD31 (A), CD 45 (B) e CD 34 (C) em ambas as populações. Eixo X =

número de eventos; eixo Y = intensidade de fluorescência do fluorocromo.

A B C

35


placentas humanas. Histograma mostrando a expressão do marcador CD105 em

ambas as populações (A), apenas na P1 (B) e apenas na P2 (C). A população

positiva está contida entra as duas barras paralelas verticais (P3), mostrando a

porcentagem de células positivas em cada população. Eixo X = número de

eventos; eixo Y = intensidade de fluorescência do fluorocromo.

37,9

%

A

79

%

B

11,4

%

C

36







65,9%

A

96,6%

B

58%

C

37







89,5

%

56,6

%

A

43,9

%

C

38


placentas humanas. Histograma mostrando a expressão do marcador CD146 (A)

sendo a expressão existente apenas em células da população 1 (B). A população




17,8

%%

A

29,4%

B

39

meio

osteogênico

controle

Figura 16. Diferenciação osteogênica de pericitos. Pericitos foram cultivados em

meio osteogênico (DMEM suplementado com SFB 10%, dexametasona 0.1 μM,

ácido ascórbico 50 μM e β-glicerol-fosfato 10 mM) (A) e na presença de DMEM

suplementado com SFB 10% (B). As células foram cultivadas por 28 dias e o

depósito de cálcio foi corado com Nuclear Fast Red. Visão macroscópica da

placa de cultura em C. Barras: A/B = ~4 m.

Figura 17. Diferenciação adipogênica de pericitos. Pericitos foram cultivados

em meio adipogênico (DMEM suplementado com SFB 10%, IBMX 0,5mM,

insulina 10 μM, indometacina 200 μM e dexametasona 1 μM) (A) e na presença

de DMEM suplementado com SFB 10% (B). As células foram cultivadas por 14

dias e o acúmulo de lipídios citoplasmáticos foi corado com Oil-Red-O. Barras:

A/B = ~4 m e inserto = 250X

41

5. DISCUSSÃO

O protocolo utilizado para o isolamento de pericitos das microvilosidades

placentárias é parecido com o realizado por KACÉMI e colaboradores, (1997),

diferenciando-se nos seguintes pontos: A primeira diferença foi a utilização do

ACK, pelo nosso grupo, para lisar as hemácias (não utilizado por eles), fazendo

com que o excesso de sangue seja lavado e descartado no sobrenadante, obtendo

assim uma melhor digestão pela enzima. Segundo, nosso grupo utilizou apenas

colagenase como enzima digestora (eles utilizam um mix de enzimas), diminuindo

assim o custo do isolamento, sem perder a eficiência. Terceiro, para separar as

microvilosidades digeridas, não utilizamos uma série decrescente de membranas

de aço inoxidável de 420 µm, 250 µm, 70 µm (o que eles fizeram), evitando custos

com material e manuseio desnecessário, sem perder também a eficiência.

Os pericitos possuem múltiplas origens, possuindo assim uma ontogenia

muito complexa. Uma origem mesodermal tem sido sugerida para as células

murais que envolvem vasos em desenvolvimento da placa lateral e axial do

mesênquima (HUNGERFORD & LITTLE, 1999). Já as células murais dos vasos

coronários podem derivar de células epicardiais, que são derivadas do

mesoderma esplânquinico (VRANCKEN PEETERS et al., 1999).

Geralmente, os pericitos são descritos possuindo uma origem

mesenquimal, mas transdiferenciação a partir de EC também tem sido sugerida,

apesar de não ser a maior rota de formação dessas células, durante o

desenvolvimento normal. Acredita-se, através de evidências in vivo, que o

endotélio embrionário pode originar células mesenquimais que expressam α-SMA

(DERUITER et al., 1997).

A origem a partir da crista neural tem sido demonstrada para parte dos

pericitos do cérebro. O compartimento dorsal/posterior depende do mesoderma

paraxial cefálico para todos os componentes da parede do vaso sanguíneo,

enquanto o compartimento ventral/anterior deriva seus pericitos e parede músculo-

conjuntiva inteiramente a partir de células da crista neural. A parte mais externa do

cérebro e a retina são irrigadas por capilares combinando origem mesodermal e

42

também a partir da crista neural, sendo que a cooperação entre o mesoderma

cefálico e a crista neural é necessária para construir a árvore vascular da cabeça

(ETCHEVERS et al., 2001).

Evidências sobre a origem de células murais a partir da medula óssea (BM)

têm sido apresentadas recentemente (RAJANTIE et al., 2004; OZERDEM et al.,

2005; LAMAGNA & BERGERS, 2006). Células derivadas da BM, que se

desenvolvem em pericitos, foram identificadas em tumores e tecidos injuriados,

envolvendo a vasculatura em desenvolvimento (LAMAGNA & BERGERS, 2006).

Um dos primeiros estudos que propuseram a existência de progenitores periciticos

(PP) derivados da BM mostrou que células hematopoiéticas CD11b e CD45,

expressando o marcador pericítico NG2, foram detectados em grande proximidade

dos vasos sanguíneos, em um modelo de melanoma subcutâneo B16-F1. Nesse

estudo, foi observado um grande número de células periendoteliais GFP+

derivadas da BM, tanto em vasos induzidos por VEGF quanto os induzidos por

tumores. Essas células estavam freqüentemente em contato muito próximo com

as EC adjacentes (RAJANTIE et al., 2004).

Diferentemente de RAJANTIE e colaboradores (2004), em nossos

experimentos, não encontramos nenhuma população que expressasse CD 45,

sendo toda a população CD45, sabendo-se que população isolada das

microvilosidades são também NG2+. Os dados obtidos por RAJANTIE e

colaboradores (2004) fornecem uma explicação alternativa para os trabalhos que

descrevem a existência de precursores de EC derivadas da BM, embora não seja

possível concluir, incondicionalmente, que essas células não possam existir.

Pericitos estão freqüentemente em contato muito íntimo com as EC adjacentes

onde, ocasionalmente, um espaço extremamente fino (menores até que 1 μm) das

EC separa os pericitos do lúmen vascular (MORIKAWA et al., 2002). Apenas um

escaneamento confocal de cortes pode separar a co-localização dos marcadores

de uma sobreposição de EC e células periendoteliais. Pelo fato de as células

murais estarem em contato tão próximo uma das outras, e também do lúmen

vascular, é impossível separar com confiança, utilizando microscopia óptica

convencional, EC e periendoteliais murais (RAJANTIE et al., 2004).

43

Os resultados de RAJANTIE e colaboradores (2004) aumentam a

possibilidade de que a maioria das supostas EC derivadas da BM, descritas

anteriormente em muitas publicações (ASAHARA et al., 1997; CROSBY et al.,

2000; EDELBERT ET AL., 2002; URBICH et al., 2003) possam na realidade ser

células semelhantes a pericitos e/ou células hematopoiéticas periendoteliais que

foram, por causa da sua extrema proximidade com o lúmen vascular, mal

interpretadas como EC. Esses autores concluem que células adultas derivadas da

BM participam da angiogênese, e que uma pequena subpopulação se diferencia

em células periendoteliais murais vasculares, morfologicamente indistinguíveis de

pericitos (RAJANTIE et al., 2004).

Mais adiante, outro estudo mostrou que os precursores vasculares

derivados da BM contribuem apenas para a formação de pericitos, mas não de EC

vasculares, na neovascularização da córnea. A investigação revelou que uma

fração significante dos pericitos neovasculares da córnea deriva de células

progenitoras hematopoiéticas derivadas da BM, ao invés de vasos pré-existentes,

sugerindo um papel abrangente para a BM e vasculogênese, na

neovascularização da córnea (OZERDEM et al., 2005).

Três observações no estudo realizado por OZERDEM e colaboradores

(2005) são dignas de atenção especial. Primeiro, os pericitos dos novos vasos da

córnea possuem duas origens: BM (vasculogênese) e capilares preexistentes do

limbo (angiogênese), sendo que mais pericitos se originam a partir da BM do que

dos capilares preexistentes. Os resultados obtidos por esses autores sugerem

que, apesar da maioria dos pericitos derivados da BM, na neovascularização

corneal, derivarem de células precursoras hematopoiéticas, uma pequena fração

(4% - 8%) dessas células deriva de células não hematopoiéticas da BM. Essas

células progenitoras não-hematopoiéticas podem representar células estromais ou

células-tronco mesenquimais. Esses achados estabelecem a BM, com seus

elementos hematopoiéticos e não-hematopoiéticos, como um importante órgão

manipulador nas desordens da córnea associado com neovascularização.

Segundo, as diversas origens dos pericitos e sua proximidade espacial entre eles

nos brotos neovasculares aumentam as possibilidades de um mecanismo de

44

neovascularização composto tanto por angiogênese quanto por vasculogênese.

Por definição, angiogênese e vasculogênese referem-se à formação de vasos

sanguíneos a partir de outros vasos preexistentes e células-tronco,

respectivamente (OZERDEM et al., 2005). Isso sugere a possibilidade de uma

sinergia ou uma sobreposição dos dois mecanismos, operando simultaneamente

nos mesmos brotos neovasculares, ao invés de uma progressão independente da

angiogênese a partir da vasculogênese. Estudos adicionais são necessários para

esclarecer os mecanismos de migração dos PP circulantes derivados BM através

do endotélio preexistente e a camada de pericitos (barreira) nos brotos

neovasculares. Esses processos de migração podem envolver extensivos

processos de adesão e extravasamento (emigração) pericito-endotélio e pericito-

pericito, junto com o enfraquecimento dos complexos juncionais entre esses dois

tipos celulares (OZERDEM et al., 2005).

Os resultados obtidos por OZERDEM e colaboradores (2005), junto com

trabalhos anteriores (RAJANTIE et al., 2004; OZERDEM et al., 2002; OZERDEM

et al., 2001; OZERDEM & STALLCUP, 2003), também corroboram os achados de

outros autores, revelando a participação de pericitos nascentes durante os

estágios iniciais da neovascularização (GERHARDT & BETSHOLTZ, 2003;

REDMER et al., 2001).

A habilidade em detectar a contribuição precoce dos pericitos no

desenvolvimento microvascular depende bastante do uso do proteoglicano NG2 e

do PDGFR-β como marcadores dessas células em um estágio inicial de

desenvolvimento (GERHARDT & BETSHOLTZ, 2003; MCDONALD & CHOYKE,

2003). O proteoglicano NG2 nos pericitos possui um papel funcional na

angiogênese e sua inibição extrínseca (farmacológica) ou intrínseca (genética)

está associada a uma diminuição significante na angiogênese e queda na razão

de investimento na neovascularização (OZERDEM & STALLCUP, 2004;

OZERDEM, 2004). Esse proteoglicano transmembranar de sulfato de condroitina,

associado aos pericitos nascentes ativos mitoticamente, exibe diversas

propriedades que sugerem um papel funcional na neovascularização (OZERDEM

et al., 2002; OZERDEM & STALLCUP, 2004). NG2 parece servir como co-receptor

45

para ambos bFGF e PDGF (GORETZKI et al., 1999; GRAKO & STALLCUP,

1995), podendo também ligar-se a componentes da ECM tais como colágenos tipo

V, VI e II, tenascina e laminina (TILLET et al., 1997; BURG et al., 1996). Terceiro,

as investigações de OZERDEM e colaboradores (2005) também identificaram um

investimento descontínuo da parede capilar linfangiogênico por células

periendoteliais derivadas da BM, em linfangiogênese induzido por bFGF. Esses

pericitos podem abastecer as paredes vasculares com um suporte físico

temporário até que o endotélio linfático possa estabelecer uma conexão direta

com a ECM. As mesmas células podem também representar um estágio

transicional de precursores derivados da BM, antes que eles se transdiferenciem

em endotélio linfático.

Esses estudos fornecem evidências de que pericitos derivados da BM

contribuem para as fases iniciais da formação dos brotos neovasculares, durante

neovascularização patológica e linfangiogênese. Possuindo um importante papel

na neovascularização, os precursores derivados da BM representam um alvo

adicional nos tratamentos projetados para regular negativamente a

neovascularização na córnea (OZERDEM et al., 2005).

A existência de PP derivados da BM foi comprovada também pela

identificação de PP PDGFR-β+ em um modelo endógeno de tumorigênese

pancreática em camundongos (SONG et al., 2005). É importante notar que nesses

tumores apenas as células perivasculares expressam PDGFR-β, enquanto as EC

secretam o ligante PDGF-B, lembrando que a mesma situação é encontrada na

formação dos vasos embrionários (LAMAGNA & BERGERS, 2006). Nesses

tumores, PP foram capazes de se diferenciar em pericitos maduros, expressando

os marcadores NG2, α-SMA, e desmina, assim como regular a estabilidade e a

sobrevivência vascular nos tumores (RAJANTIE et al., 2004). É interessante que,

enquanto PP PDGFR-β+ induziram NG2 e α-SMA quando cultivadas sozinhas, co-

culturas de PP PDGFR-β+ com EC foram essenciais para promover o

desenvolvimento de pericitos desmina+. Isso sugere a necessidade de vias de

sinalização parácrina entre as EC e pericitos para permitir a indução de desmina.

É intrigante que, num subconjunto de PP PDGFR-β+, foram encontradas células

46

sendo recrutadas da BM para sítios perivasculares dentro dos tumores. Essas

células derivadas da BM expressaram marcadores hematopoiéticos tal como

antígeno-1 de células-tronco (Sca-1) e CD11b, embora ainda seja confuso afirmar

se PP são de origem hematopoiética ou mesenquimal (LAMAGNA & BERGERS,

2006).

Existem muitas indicações de que o recrutamento de PP não está apenas

limitado aos tumores. PP derivados da BM também foram encontrados infiltrando

no cérebro após a oclusão da artéria cerebral média, em um modelo experimental

de derrame em camundongos. PP foram observados ao redor de vasos

sanguíneos em desenvolvimento nas áreas isquêmicas, e se desenvolveram em

pericitos desmina+, na qual expressam TGF-β e VEGF (KOKOVAY et al., 2006).

Além disso, células derivadas da BM foram encontradas em vasos angiogênicos

da córnea após neovascularização induzida por bFGF e se diferenciaram em

células periendoteliais NG2+/ PDGFR-β+ (OZERDEM et al., 2005).

É importante notar que existem diversos trabalhos descrevendo a presença

de células derivadas da BM que exibem localização perivascular em tumores, mas

que não são pericitos. Dentre elas, células hematopoiéticas e monomielocíticas

provavelmente representam a maior população de células derivadas da BM

(KOPP et al., 2006). DE PALMA e colaboradores (2003) descreveram uma

população Sca-1+/CD45+/CD11b+ de células mielóides que se infiltram em

tumores que expressam o receptor de angiopoetina Tie2 [monócitos expressando

Tie2 (TEMs)], o que promove angiogênese tumoral. Quando co-injetadas com

células tumorais de mama, TEMs aumentam o número de leucócitos CD45+

infiltrantes e pericitos NG2+. Entretanto, mesmo quando TEMs exibem uma

localização perivascular similar à dos pericitos, elas não expressam os

marcadores de pericitos NG2 e α-SMA.

Semelhantemente, GRUNEWALD e colaboradores (2006) descreveram o

recrutamento de células CXCR4+ derivadas da BM, localizadas em grande

proximidade dos vasos sanguíneos, porém essas células parecem não contribuir

para a população de pericitos.

47

Desde BIANCO & COSSU (1999), considerava-se a possibilidade de se

estar emergindo, de um nicho perivascular e de uma identidade pericítica, células

precursores estromais no tecido hematopoiético. Esses autores diziam que a

pesquisa de precursores mesodérmicos multipotentes em outros tecidos deveriam

começar por estas células.

BADOO e colaboradores (2003) usaram uma combinação de aderência ao

plástico e culturas in vitro (essencialmente a metodologia originalmente descrita

por FRIEDENSTEIN e colaboradores) para estabelecer pela primeira vez culturas

de células estromais e subsequentemente removeu células hematopoiéticas

contaminantes, pela seleção negativa usando anticorpos para CD45, CD34 e

CD11b. As células estromais resultantes desta metodologia exibiram um potencial

de diferenciação adipogênico, osteogênico e condrogênico in vitro e expressavam

os marcadores CD29, CD44 e CD106, mas não marcadores hematopoiéticos ou

de células endotelais vasculares.

As células isoladas da placenta não precisaram de uma seleção negativa

para que todas as células em terceira passagem fossem negativas para CD34 e

CD45. Como observado por BADOO e colaboradores (2003), também obtivemos

células CD44+ e ausência de células endoteliais (CD31-) e hematopoiéticas

(CD45- e CD34-), além das células da placentas também exibiram um potencial de

diferenciação osteogênico e adipogênico.

Em um trabalho em que MUSINA e colaboradores (2005) comparam

células-tronco mesenquimais de diversos tecidos humanos (pele, tecido adiposo,

timo e inclusive placenta), a caracterização das células foi similar a nossa. No

trabalho de MUSINA e colaboradores (2005), todas as células foram

caracterizadas utilizando marcadores para CD44, CD90, CD105, CD13, CD10,

CD31, CD34 e CD45 e utilizadas células até décima passagem. A expressão dos

marcadores de MSC (CD44, CD90, CD105 e CD13) foi similar em todas as células

estudadas. A expressão dos genes foi elevada e não mudou ao longo das

passagens. A expressão de CD31, CD45 e CD34 foram negativas para todas as

populações com exceção do CD34 para as células do timo. Esses resultados são

muito semelhantes aos encontrados por nosso grupo nas células isoladas das

48

microvilosidades da placenta. As células isoladas da placenta, no trabalho de

MUSINA e colaboradores (2005), cresceram devagar e atingiram 80% da

confluência depois de 3-4 semanas o que acontece também nas células isoladas

pelo nosso grupo, podendo sugerir que sejam a mesma linhagem utilizada,

lembrando somente que em nenhum momento do trabalho, os autores sugerem

que as células isoladas por eles sejam pericitos.

Em outro trabalho, XU e colaboradores (2004) mostraram que os perfis de

antígeno de superfície de MSC humanos obtidos pela citometria de fluxo foram

positivos para CD13, CD19, CD44, CD71, e negativas para CD3, CD14, CD15,

CD33, CD34, CD38, CD45, e HLA-DR. Essas células originárias da BM humana

adulta podem se diferenciar em cardiomiócitos in vitro. Esses mesmos autores

publicaram que nas células utilizadas por eles, da passagem 2 a 6 o cariótipo foi

normal, os ciclos celulares foram similares, sendo que estes dados indicam que

MSC adultas têm habilidade de auto-renovação e estabilidade genética in vitro

(XU et al., 2004).

SARUGASER e colaboradores (2005) isolaram uma população perivascular

de cordão umbilical que também apresentaram os mesmo marcadores CD34-,

CD45-, CD44+, CD105+, CD73+. As células isoladas por SARUGASER et al.,

eram muito semelhantes com as células que isolamos das microvilosidades

placentárias, e também exibiam uma morfologia fibroblastóide e corpo estrelado,

estendendo longos processos citoplasmáticos em torno de 100 a 300 µm. Os

comprimentos dos processos citoplasmátivos não foram medidos no nosso

trabalho. Essas células marcavam positivamente para α-SMA, desmina, vimentina

(não testada nas células de placenta) e o anticorpo monoclonal 3G5, um marcador

de pericito, resultados iguais aos nossos. A não marcação para CD45 mostra que

foi eliminada qualquer contaminação por precursores hematopoiéticos do sangue

de cordão umbilical, além de serem testadas as populações resultantes por uma

série de marcadores que são característicos de fenótipos embrionário e

mesenquimal. Além disso, devido a marcação por α-SMA, desmina e a reatividade

positiva para o marcador 3G5, os autores sugerem que as células perivasculares

49

do cordão umbilical parecem ser similares a outro precursor perivascular

mesenquimal, como o pericito.

KAISER et al., 2007 publicou que células mesenquimais estromais isoladas

da BM humana adulta, expressam as moléculas de superfície CD44, CD90, SH2

(CD105) e SH3 (CD73) e são negativas para CD34 e o marcador hematopoiético

CD45. Essas células podem se diferenciar em adipócitos e osteócitos, sendo que

as células derivadas de placenta isoladas por nosso grupo também se comportam

da mesma maneira.

Para acabar com a confusão, o Comitê das Células-tronco Teciduais e

Mesenquimais da Sociedade Internacional de Terapia Celular propuseram critérios

mínimos para definir uma célula-tronco mesenquimal humana (DOMINICI et al.,

2006). Primeiro, MSC devem ser aderentes ao plástico quando mantidas em

condições padrão de cultura. Segundo, MSC devem expressar CD105 (SH2),

CD73 (SH3) e CD 90 (Thy-1), e ausência de expressão de CD45, CD34, CD14,

CD11b, CD79alpha e moléculas de superfície de HLA-DR. Terceiro, elas devem

se diferenciar em osteoblastos, adipócitos e condroblastos in vitro. Os autores

acreditam que esse padrão mínimo criará uma caracterização mais uniforme das

MSC e facilitará a troca de dados entre os pesquisadores (DOMINICI et al., 2006).

As células isoladas das microvilosidades placentárias exibem vários

marcadores listados nos critérios mínimos para MSC descritos por DOMINICI e

colaboradores (2006) como por exemplo o CD105 e CD73, além de possuírem

uma ausência de expressão de CD45 e CD34

Resumindo, existem evidências emergentes que células derivadas da BM

possuem um papel crucial na formação dos vasos sanguíneos no adulto por

incorporação na vasculatura em desenvolvimento, localizando-se adjacentes a ela,

ou envolvendo a vasculatura, para servirem como células de sustentação

perivasculares (LAMAGNA & BERGERS, 2006).

Mais recentemente, SACHETTI e colaboradores (2007) mostraram que

células estromais subendoteliais da BM humana que expressavam CD146 são

capazes de transferir sobre transplantação sítios do microambiente

hematopoiético para sítios heterotópicos, coincidente com o estabelecimento de

50

células subendoteliais idênticas, dentro de um órgão ósseo em miniatura.

Estabelecimento de células subendoteliais estromais no desenvolvimento de BM

heterotópica in vivo ocorre via interações específicas e dinâmicas com os

sinusóides em desenvolvimento (SACHETTI et al., 2007). As células estromais

subendoteliais que residem na parede sinusoidal são as principais produtoras de

angiopoetina-1 (uma molécula fundamental do nicho da célula-tronco

hematopoiética envolvida no remodelamento vascular). Os dados desses autores

revelaram as relações funcionais entre o estabelecimento do microambiente

hematopoiético in vivo, o estabelecimento de progenitores esqueléticos nos

sinusóides da medula óssea, e angiogênese.

O interessante é que as células isoladas das placentas humanas também

expressam o marcador CD 146 e são positivas para Ang-1, nos levando a

suspeitar de que se trata do mesmo tipo celular, em lugares diferentes do corpo,

mas que tem funções semelhantes nos diversos órgãos.

Muitas vezes é assumido que a expressão de certa gama de marcadores

definem vários tipos de culturas de célula como MSCs, mas na verdade, a maior

parte desses marcadores são expressos por culturas de células fibroblásticas de

qualquer tecido. Além do mais, a maioria, se não todos os marcadores são

altamente modulados na cultura, que sublinha a futilidade de esforços para

caracterizar culturas de células estromais por si. Em contraste, a indagação

original sobre marcadores putativos não hematopoiéticos de célula-tronco da BM

concentrou-se naqueles que poderiam identificar as CFU-F entre as células da

BM. Junto com o clássico epítopo STRO-1, um número de outros marcadores

pode ajudar no enriquecimento de CFU-Fs, como por exemplo, MCAM (CD 146) e

CD105 (BIANCO et al., 2008). Os marcadores CD146 e CD105 citados por Bianco

e colaboradores (2008), foram encontrados por nosso grupo nas células isoladas

de placentas humanas.

Na BM humana, MCAM marcam células reticulares adventícias

(SACCHETTI et al., 2007), um tipo celular estromal classicamente conhecido,

residindo numa posição subendotelial por cima da superfície abluminal dos

sinusóides da BM (WESTEN E BAINTON, 1979). Em outros tecidos, MCAM é

51

expresso por pericitos (LI et al., 2003), um tipo celular reconhecido pela sua

anatomia e posição e não por algum fenótipo precisamente definido. Como células

reticulares adventícias, pericitos residem na superfície abluminal de células

endoteliais na microvasculatura de cada tecido conjuntivo. Considerando esta

ampla distribuição, e que pericitos podem representar a contraparte in situ das

CFU-Fs da BM, pode-se concluir que pericitos são as MSCs encontrado em

diferentes tecidos. A utilização de MCAM (CD 146) para identificar a população de

pericito ajudará na determinação de que CFU-Fs de tecidos não hematopoiéticos

são de fato pericitos. Nesse caso, é possível testar a hipótese de que MSCs

existem em todos os tecidos conjuntivos, e determinar se a sua capacidade para

funcionar em ensaios clonogênicos e in vivo é consistente, apesar do seu tecido

de origem. Neste sentido, pericitos isolados de músculo esquelético é

espontaneamente miogênico in vitro (DELLAVALLE et al., 2007) e não

osteogênico in vivo, em contraste com as CFU-Fs de BM e com células

subendoteliais da BM, apesar da sua coincidente localização anatômica. Assim,

evidências atuais quanto aos pericitos em diferentes tecidos parecem refletir um

sistema de progenitores órgão-específico com potencial órgão-específico.

Todavia, estudos da biologia dos pericitos podem fornecer pistas quanto à origem

do desenvolvimento de células progenitoras/tronco pós-natais em tecidos não

hematopoiéticos (BIANCO et al., 2008).

Devido a sua multipotencialidade, a utilização dos pericitos em terapias

celulares tem ganhado força ultimamente. Estudos recém publicados em distrofia

muscular discutem que, em protocolos clínicos futuros, a distribuição sistêmica

parece ser uma escolha obrigatória, já que uma distribuição intramuscular pode

requerer um excessivo número de injeções (DELLAVALLE et al., 2007). Células

humanas derivadas de pericitos expressam algumas das proteínas que os

leucócitos utilizam para aderir e atravessar o endotélio (integrinas β2 e α4), e,

dessa forma, podem difundir-se para o interior do interstício do músculo

esquelético quando injetados via intra-venosa (DELLAVALLE et al., 2007).

Nosso estudo mostrou que pericitos derivados de placenta podem ser

isolados e expandidos in vitro, sendo comprovado o potencial de diferenciação

52

dessas células, provando que a placenta pode ser uma rica e atrativa fonte de

pericitos. Os dados referentes ao potencial de diferenciação são promissores,

sendo que importantes utilizações terapêuticas, aproveitando-se os pericitos,

podem vir a existir no futuro.

A utilização dessa fonte extremamente acessível de células multipotentes

em futuros experimentos e aplicações clínicas é um grande desafio e precisa ser

mais bem investigado.

53

6. CONCLUSÕES

- A metodologia utilizada é eficiente para o isolamento de células a partir de

microvilosidades de placenta humana.

- O cultivo e a expansão das células isoladas in vitro são viáveis porque pode-se

isolar as células de um órgão de fácil acesso e tem uma boa expansão em garrafas

de cultura.

- Parte das células isoladas foram caracterizadas como pericitos através de

marcadores apropriados, como NG2, CD146 e desmina, além da ausência de

expressão dos marcadores CD45, CD34 e CD31

- Os pericitos responderam com sucesso aos testes de diferenciação adipogênica e

osteogênica, confirmando o potencial de diferenciação para essas linhagems.

54

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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