isolasi bakteri dan uji aktivitas amilase termofil

ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS AMILASE TERMOFIL KASAR DARI SUMBER AIR PANAS

PENEN SIBIRUBIRU SUMATERA UTARA

TESIS

Oleh

DESSY CHRISTINA SIANTURI

067030006/BIO

SEKOLAH PASCASARJANA UNIVERSITAS SUMATERA UTARA

MEDAN 2008

Dessy Christina Sianturi : Isolasi Bakteri Dan Uji Aktivitas Amilase Termofil Kasar Dari Sumber Air Panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara, 2008 USU Repository © 2008

ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS AMILASE TERMOFIL KASAR DARI SUMBER AIR PANAS

PENEN SIBIRUBIRU SUMATERA UTARA

TESIS

Untuk Memperoleh Gelar Magister Sains dalam

Program Studi Biologi pada Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera Utara

Oleh

DESSY CHRISTINA SIANTURI 067030006/BIO

SEKOLAH PASCASARJANA

UNIVERSITAS SUMATERA UTARA MEDAN

2008


Judul Tesis : ISOLASI BAKTERI DAN UJI AKTIVITAS AMILASE TERMOFIL KASAR DARI SUMBER AIR PANAS PENEN SIBIRUBIRU SUMATERA UTARA Nama Mahasiswa : Dessy Christina Sianturi Nomor Pokok : 067030006 Program Studi : Ilmu Biologi

Menyetujui Komisi Pembimbing

(Dr. Dwi Suryanto, M.Sc.) (Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc.) Ketua Anggota Ketua Program Studi Direktur

(Dr. Dwi Suryanto, M.Sc.) (Prof. Dr. Ir. T. Chairun Nisa B, M.Sc.) Tanggal lulus : 26 September 2008


Telah diuji pada

Tanggal : 26 September 2008

PANITIA PENGUJI TESIS Ketua : Dr. Dwi Suryanto, M.Sc. Anggota : 1. Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc. 2. Dr. Delvian SP., MP. 3. Dr. Herla Rusmarilin, MS.


ABSTRAK

Telah dilakukan isolasi bakteri termofil penghasil enzim amilase dari sumber air panas Penen Sibirubiru Sumatera Utara di Laboratorium Mikrobiologi MIPA Universitas Sumatera Utara dari bulan Februari-Juli 2008. Enam belas isolat bakteri penghasil amilase didapatkan melalui uji iodin pada media pati yang digunakan untuk pertumbuhan isolat-isolat tersebut. Melalui pengukuran diameter zona bening pada media selektif amilase dengan uji iodin dipilih tiga isolat yang paling besar zona beningnya yaitu PN1, PN4 dan PN9. Enzim amilase kasar yang dihasilkan ketiga isolat terpilih tersebut diuji aktivitasnya lewat konsentrasi glukosa yang dihasilkan dari hidrolisis pati pada pengaruh suhu inkubasi dan pH yang berbeda. Dari hasil pengujian didapatkan hasil amilase kasar isolat PN9 menghasilkan glukosa lebih banyak pada suhu 80oC (165,78µg/ml) diikuti oleh amilase kasar isolat PN1 (117,88 µg/ml) dan PN4 (129,19 µg/ml), meskipun pada suhu optimum aktifitasnya (60°C) amilase isolat PN4 menghasilkan glukosa yang lebih banyak sebagai hasil hidrolisis pati yaitu 437,22 µg/ml. Amilase kasar isolat PN1 memiliki aktivitas katalik yang lebih tinggi pada pH yang alkalis (pH 9,0) dibandingkan dengan PN4 dan PN9. Amilase kasar isolat PN4 aktivitas amilasenya lebih tinggi di suasana pH yang sifatnya sedikit asam sampai netral (pH 5,0 – pH 7,0). Amilase kasar isolat PN9 memiliki aktivitas katalik yang tertinggi dari ketiga isolat dan optimum aktivitasnya pada pH substrat yang bersifat netral (pH 7,0) dengan glukosa hasil hidrolisis tertinggi (390,11µg/ml). Kata kunci : Amilase termofil, air panas Penen, enzim amilase, isolasi bakteri.


ABSTRACT

Isolation of amylolytic thermophile bacteria from Penen Hot spring Sibirubiru has been carried out in Microbiology Laboratory, Department of Biology, Faculty of Mathematics and Natural Sciences, University of Sumatera Utara from February to July 2008. Sixteen amylolytic bacterial isolates were obtained through the Iodine test on starch media. Three out of sixteen isolates showed relatively high hydrolytic activity and were used for further study. PN9 showed enzyme activity at 80oC by producing 165,78 µg/ml glucose, followed by PN4 with 129,19 µg/ml and PN1 with 117,88 µg/ml glucose, respectively. Optimum activity were showed by PN4 at 60oC by producing 437,22 µg/ml glucose. This isolate also showed relatively high enzyme activity at pH 5,0-7,0. Crude enzyme activity were measured at different of temperature and pH. However PN9 showed the highest activity among isolates tested and has optimum activity at pH 7,0 with glucose production 390,11µg/ml. Key word : Thermophile amylase, Penen hot spring, amylase enzyme, isolation of bacteria.


UCAPAN TERIMA KASIH

Dengan segenap jiwaku aku menyerukan terima kasih padaMu ya Tuhan, karena

atas segala rencana, berkat kasih dan pertolonganMulah aku dapat melalui dan

menyelesaikan perkuliahan serta tugas akhir tesis ini. Besar kasih dan kuasaMu dan

segala puji syukur kupanjatkan kehadiratMu Tuhan.

Terima kasih yang sebesar besarnya saya ucapkan kepada Pemerintah Provinsi

Sumatera Utara lewat BAPPEDA Provinsi Sumatera Utara yang memberikan

kesempatan dan bantuan finansial selama perkuliahan saya di Program Studi Biologi

SPs USU.

Dengan selesainya tesis ini perkenankanlah saya mengucapkan terima kasih

yang sebesar-besarnya kepada: Rektor Universitas Sumatera Utara Bapak Prof.

Chairuddin P. Lubis, DTM&H, Sp.A(K), atas kesempatan fasilitas yang diberikan

kepada kami untuk menyelesaikan pendidikan program Magister, Direktur Sekolah

Pascasarjana Ibu Prof. Dr. Ir. T. Chairun Nisa B, M.Sc., Ketua Program Studi Biologi

Bapak Dr. Dwi Suryanto, M.Sc dan Sekretaris Program Studi Biologi Bapak Prof. Dr.

Ing. Ternala Alex Barus, M.Sc. atas kesempatan dan bimbingan yang diberikan

kepada kami selama mengikuti perkuliahan pada program Studi Biologi Pascasarjana

Universitas Sumatera Utara ini.


Terima kasih dan penghargaan yang sebesar-besarnya kepada :

1. Bapak Dr. Dwi Suryanto, M.Sc selaku pembimbing I dan Bapak Prof. Dr. Erman

Munir, M.Sc selaku pembimbing II saya, yang selama penelitian dan penyusunan

tesis ini telah banyak memberikan bantuan dan masukan sehingga tesis ini dapat

selesai.

2. Bapak Dr. Delvian, SP, MP dan Ibu Dr. Ir. Herla Rusmarilin MS, selaku dosen

penguji yang telah banyak memberikan masukan saran untuk penyelesaian tesis

ini agar lebih baik, terima kasih buat dukungannya.

3. Bapak Prof. Dr. Erman Munir, M.Sc. selaku Kepala Laboratorium Mikrobiologi

FMIPA USU dan Bapak Drs. Fathur Rahman Harun, M.Si. Apt., selaku Kepala

Laboratorium Kimia Farmasi Kuantitatif Fakultas Farmasi USU yang memberi

saya kesempatan melakukan penelitian tesis di laboratorium tersebut.

4. Bapak dan Ibu dosen di Program Studi Biologi Magister SPs USU, terima kasih

untuk ilmu yang sudah diberikan selama ini.

5. Bu Nurhasni Muluk Laboran Mikrobiologi dan Bu May Laboran Kimia Farmasi Kuantitatif, terima kasih buat bantuannya selama saya melakukan penelitian di

laboratorium. Buat adik-adik Asisten Lab Mikrobiologi Atika, Lidya, Netty,Ginta,

Ansen dan yang lainnya, juga buat Muti dan Faksi di Lab Kimia Farmasi

Kuantitatif. Terima kasih atas bantuannya selama di Laboratorium.

6. Ayahandaku Drs. F. Sianturi dan Ibundaku R. A. Tambunan, BA. Tiada terbalas

segala doa, kebaikan, dukunganmu, dan pengorbananmu sehingga ananda bisa

menyelesaikan tugas akhir tesis ini. Kupersembahkan semua yang kudapatkan ini


untuk melengkapi kebahagianmu, telah kuwujudkan harapanmu, juga buat Ibu

mertuaku Ny. Pdt. Nalom Simanjuntak br. Tampubolon. Terima kasih buat

dukungan doamu. Buat kakak, abang dan adik-adikku semua, terima kasih buat

dukungan semangat dari kalian semua.

7. Suamiku tercinta Ir. Basar S.L. Simanjuntak, tanpa semangat dan semua bantuan

dan dukungan yang kau berikan aku tidak dapat menyelesaikan perkuliahanku dan

tugas tesisku ini, terima kasih yang tak terkira buatmu. Anak-anakku tercinta Adela,

Otniel dan si kecilku Regita, kalian merupakan motivasi terbesar dalam hidup mama.

Terima kasih buat pengertianmu untuk semua tugas kuliah mama selama ini, buat

waktu bermain dan belajar bersama yang terpakai untuk kuliah mama. Semoga apa

yang mama peroleh ini dapat menjadi motivasi baik buat kehidupan kalian kelak

untuk belajar yang sungguh-sungguh.

8. Kepala Sekolah dan segenap rekan guru serta pegawai di SMA Negeri 3 Medan

yang selalu memberikan semangat pada saya untuk menyelesaikan kuliah ini.

9. Teman-temanku di S2 Biologi 06, khususnya di Mikrobiologi (Bu Bunga, Bu Dewi

Bu Nur, Bu Sri, Bu Ros, Bu Iche, Pak Jusuf dan Pak Parasian), terima kasih buat

kebersamaan selama ini, juga buat teman-teman di Biologi 07 dan Biologi 08,

terima kasih atas dukungannya.


Penulis menyadari bahwa tesis ini masih jauh dari sempurna, karena itu penulis

sangat mengharapkan kritik dan saran dari pembaca yang bermanfaat untuk

menyempurnakan tesis ini. Semoga tesis ini dapat bermanfaat bagi penelitian dan

ilmu pengetahuan.

(Dessy Christina Sianturi)


RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan pada tanggal 12 Desember 1970 di Medan, putri dari Bapak

Drs. F. Sianturi dan Ibu R.A. Tambunan, BA., sebagai anak pertama dari empat

bersaudara. Penulis menjalani pendidikan di SD Negeri Sei Petani Medan Baru dari

tahun 1977 sampai tahun 1983, kemudian masuk ke SMP Katholik RK Makmur

Medan dari tahun 1983 sampai tahun 1986 dan kemudian melanjut ke SMA Negeri 8

Medan dari tahun 1986 sampai tahun 1989. Tahun 1989 melanjutkan Pendidikan ke

IKIP Negeri Medan dengan mengambil Jurusan Biologi di Fakultas Pendidikan

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam dan lulus Sarjana Pendidikan Biologi pada

tahun 1993.

Penulis memperoleh SK Pengangkatan sebagai guru Pegawai Negeri Sipil pada

tahun 1994 dan ditempatkan sebagai guru Biologi di SMA Negeri Padang Tualang

Kabupaten Langkat dan tahun 1998 mutasi ke SMA Negeri 3 Medan dan sampai saat

ini aktif bertugas sebagai guru Biologi di SMA Negeri 3 Medan.

Pada tahun 1997 penulis menikah dengan Ir. Basar SL. Simanjuntak dan

dikarunia 3 orang anak yaitu Adela Yohanna Simanjuntak, Otniel Wahana

Simanjuntak dan Regita Flora Simanjuntak.

Penulis melanjutkan pendidikan ke Sekolah Pascasarjana Universitas Sumatera

Utara dengan mengambil jenjang Magister program studi Biologi pada bulan

September 2006 dengan bantuan dana dari Pemerintah Propinsi Sumatera Utara

melalui BAPPEDA Propinsi Sumatera Utara.


DAFTAR ISI

Halaman

ABSTRAK ....................................................................................................................i

ABSTRACT..................................................................................................................ii UCAPAN TERIMA KASIH .......................................................................................iii RIWAYAT HIDUP ....................................................................................................vii DAFTAR ISI .............................................................................................................viii DAFTAR TABEL .......................................................................................................xi DAFTAR GAMBAR .................................................................................................xii DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................xiii BAB I. PENDAHULUAN .........................................................................................1 1.1. Latar Belakang Masalah .........................................................................1 1.2. Permasalahan …………………………………………………………..4 1.3. Tujuan penelitian ………………………………………………………5 1.4. Hipotesis ……………………………………………………………….5 1.5. Manfaat Penelitian ..................................................................................5 1.6. Pembatasan masalah ...............................................................................5 BAB II. TINJAUAN PUSTAKA ...............................................................................7 2.1. Amilum ..................................................................................................7 2.2. Enzim .....................................................................................................9 2.3. Enzim Amilase .....................................................................................11


2.4. Bakteri Termofil .................................................................................16 2.5. Amilase dari Mikroorganisma .............................................................19 2.6. Amilase dari Mikroba Termofil ……………………………………..21 2.7. Sumber Air Panas Penen Sibirubiru .. ……………………………….24 BAB III. METODE PENELITIAN ...........................................................................26 3.1. Waktu dan Tempat ...............................................................................26 3.2. Bahan dan Alat ....................................................................................26 3.3. Sampel Percobaan ................................................................................26 3.4. Pengambilan Sampel Air Panas ...........................................................27 3.5. Isolasi Bakteri dan Pemurnian Bakteri ................................................27 3.6. Pembuatan Stok Kultur ........................................................................28 3.7. Uji Diameter Zona Bening Hasil Hidrolisis Pati .................................29 3.8. Karakterisasi Morfologi Bakteri Penghasil Enzim Amilase Termofil ...............................................................................................29 3.9. Karakterisasi Bakteri Penghasil Amilase Secara Mikroskopis ............30 3.10. Uji Sifat Biokimia Bakteri Amilase Termofilik …...………………30 3.11. Pembuatan Larutan Standar Glukosa .................................................31 3.12. Produksi Enzim Amilase Dari Isolat ...............................................32 3.13. Ekstraksi Enzim Dari Kultur Cair Bakteri .........................................32 3.14. Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase Kasar Dari Isolat Bakteri Termofil .............................................................................................33 3.15. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar ..................................................................................................33


3.16. Pengaruh pH Terhadap Aktifitas Enzim ...........................................34 3.17. Metode Statistik dan Analisis Data ....................................................35 BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ...................................................................37 4.1. Isolasi dan Seleksi Bakteri Amilolitik .................................................37 4.2. Karakterisasi Morfologi dan Uji Biokimia ..........................................37 4.3. Hasil Seleksi Isolat Untuk Pengujian Aktifitas Enzim Amilase Kasar .....................................................................................41 4.4. Pengaruh Suhu Inkubasi terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar ....43 4.5. Pengaruh pH terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar ......................47 BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN ..................................................................52 5.1. Kesimpulan ..........................................................................................52 5.2. Saran ....................................................................................................53 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................54


DAFTAR TABEL

Nomor Halaman

Tabel 1. Penggunaan Amilum Di Bidang Industri .......................................................9 Tabel 2. Enzim Amilase Dari Mikroorganisma Dan Aplikasinya Pada Bidang Industri .........................................................................................................22 Tabel 3. Karakter Morfologi dan Uji Biokimia Isolat Bakteri Termofil Amilolitik Penen Sibirubiru ..........................................................................38 Tabel 4. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar ............43 Tabel 5. Pengaruh pH Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar Isolat Bakteri Termofil Sumber Air Panas Penen Sibirubiru .......................48


DAFTAR GAMBAR Nomor Halaman Gambar 1. Struktur Kimia Dari Amilosa Dan Amilopektin ........................................8 Gambar 2. Jenis Reaksi Hidrolisis Yang Dikatalis Oleh Enzim Amilase .................13 Gambar 3. Konversi Amilum Menjadi Glukosa Oleh Enzim α dan ß Amilase .................................................................................................14 Gambar 4. Rentang Suhu Lingkungan Yang Menggambarkan Keberadaan Tempat Hidup Bakteri .............................................................................16 Gambar 5. Diameter Zona Bening Hasil Hidrolisa Pati oleh Enzim Amilase Isolat Bakteri Termofil Penen .................................................................41 Gambar 6. Tiga Isolat Terpilih Berdasarkan Diameter Zona Bening Uji Iodin ........42 Gambar 7. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar Isolat Bakteri Termofil Sumber Air Panas Penen Sibirubiru ..................44 Gambar 8. Pengaruh pH Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar Isolat Bakteri Termofil Sumber Air Panas Penen ....................................50


DAFTAR LAMPIRAN

Nomor Judul Halaman

1. Isolasi Bakteri Dari Sampel Air Panas ..................................................................60 2. Uji Adanya Produksi Enzim Amilase Oleh Isolat Bakteri ...................................61 3. Karakterisasi Isolat Bakteri Penghasil Enzim Amilase .........................................62 4. Produksi Enzim Amilase Dan Ekstraksi Enzim Dari Kultur ................................63 5. Pembuatan Larutan StandarGlukosa ......................................................................64 6. Pengukuran Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar ............................................................................................65 7. Pengukuran Pengaruh pH Substrat Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar ........................................................................................................66 8. Pembuatan Larutan Blanko ...................................................................................67 9. Hasil Uji Diameter Zona Bening Hidrolisa Pati ...................................................68 10. Analisis Varians Untuk Aktifitas Enzim ..............................................................69 11. Kurva Standart Glukosa .................................................................................... 72 12. Foto-Foto Pewarnaan Bakteri Isolat Penen ..........................................................73


BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang Masalah

Enzim dihasilkan oleh semua makhluk hidup untuk mengkatalis reaksi

biokimia dalam tubuh mahluk hidup tersebut sehingga reaksi-reaksi itu dapat

berlangsung lebih cepat. Enzim memegang peranan penting dalam dunia industri

seperti industri tekstil, detergen, bahan pangan dan minuman, bahan kimia, obat-

obatan dan industri kulit (Muchtadi et al., 1992). Produksi dan perdagangan enzim

didominasi oleh kelompok enzim hidrolitik seperti amilase, protease, katalase dan

lipase. Enzim untuk kebutuhan industri diekstraksi dari berbagai jenis sel mahluk

hidup, tetapi pada saat ini enzim lebih banyak diekstraksi dari berbagai jenis

mikroorganisma, sebab mikroorganisma menghasilkan enzim yang dapat

dimanfaatkan manusia dalam jumlah dan jenis yang sangat bervariasi selain

mikroorganismanya sendiri dapat dikulturkan untuk memperoleh enzim yang

dihasilkannnya (Palmer, 1985).

Salah satu jenis enzim yang banyak dihasilkan oleh mikroorganisma

adalah enzim amilase. Enzim amilase memiliki distribusi yang sangat luas dan

merupakan salah satu jenis enzim yang paling banyak dipelajari baik di Indonesia

maupun di luar Indonesia. Enzim ini memiliki aplikasi untuk skala yang sangat

luas mulai dari industri tekstil sampai ke pengujian-pengujian yang sangat luas

(Aiyer, 2005). Kebutuhan amilase di dunia sangat tinggi, pada tahun 2004 saja

mencapai penjualan sekitar US $2 milyar, sedangkan amilase yang digunakan

untuk industri makanan dan minuman pada tahun 2004 bernilai sekitar US $11


juta. Produksi amilase sendiri oleh Bacillus lichineformis dan Aspergillus sp

sekitar 300 ton enzim murni pertahun (Sivaramkrisnan et al., 2000).

Enzim amilase digunakan dalam menghidrolisis berbagai jenis sumber

amilum menjadi senyawa-senyawa sederhana seperti maltosa, glukosa dan

produksi bioetanol yang memiliki nilai ekonomi lebih tinggi. Enzim amilase

merupakan salah satu dari enzim hidrolitik yang dapat memecah ikatan-ikatan

pada amilum hingga terbentuk maltosa (Poedjiadi, 1994). Pengetahuan tentang

manfaat amilase yang berasal dari mikroba untuk hal yang bersifat komersial

merupakan awal dari penggunaan enzim dalam industri beberapa dekade yang lalu

(Walter & Nagesh, 1965).

Saat ini amilase yang bersumber dari mikroorganisma termofil dan

hipertermofil lebih banyak digunakan dalam bidang industri, terutama industri yang

menggunakan suhu tinggi dalam prosesnya. Hal ini terjadi karena enzim yang

berasal dari mikroorganisma tersebut memiliki termostabilitas dan aktivitas yang

tetap optimal pada suhu yang tinggi (Vieille & Zeikus, 2001).

Bakteri termofil penghasil enzim amilase dapat diisolasi dari berbagai

tempat seperti sumber-sumber geotermal, daerah vulkanoik, pemandian mata air

panas di darat maupun mata air panas di laut dalam dan juga dari proses

pembuatan kompos (Brock, 1978). Bakteri termofil mampu hidup secara optimal

di atas suhu 45oC, dengan struktur protein penyusun enzim yang tetap stabil atau

tidak terdenaturasi oleh panas. Mikroorganisma ini sendiri tidak hanya bersifat

toleran terhadap suhu lingkungannya yang bersifat ekstrim tetapi juga mampu


untuk bertahan hidup dan berkembangbiak pada kondisi suhu yang ekstrim

tersebut (Brock, 1986).

Banyak penelitian yang dilakukan baik di Indonesia maupun di luar

Indonesia untuk mencari dan mendapatkan informasi tentang bakteri termofil

penghasil enzim amilase ini. Misalnya Hyun dan Zeikus (1985) berhasil

mengisolasi dan mengkarakterisasi sifat biokimia dari Clostridium

thermosulfurogenes yang diperoleh dari Octopus Hot Spring di Taman Nasional

Yellow Stone. Isolat ini menghasilkan enzim β-amilase yang memiliki aktivitas

optimum pada suhu 75oC–80oC. Fu Shaw et al. (1995) berhasil mempurifikasi

dan mendata sifat dari Thermus sp, penghasil enzim ekstraseluler α-amilase dari

sedimen sumber air panas di Taman Nasional Yangmin Shan, Taiwan bagian

Utara. Enzim amilase tersebut bekerja optimum pada suhu 70oC. Al-Qodah et al.

(2007), berhasil mendeterminasi parameter kinetik dari enzim amilase yang

dihasilkan oleh Bacillus sphaericus yang berasal dari sumber air panas di

Jordania, dengan suhu optimum aktivitasnya pada suhu 50oC. Hartuti (2006)

berhasil mengisolasi dan mengkarakterisasi bakteri termofil penghasil amilase

yang bersumber dari pemandian Air panas Pawan, Riau. Ternyata ada 24 isolat

yang bersifat amilolitik. Diantara isolat tersebut 15 isolat berbentuk basil gram

negatif, delapan isolat berbentuk basil gram positif sedangkan satu berbentuk

kokus gram negatif. Semuanya memiliki suhu inkubasi optimum sebesar 50oC.


1.2. Permasalahan

Proses-proses kimia dalam bidang industri banyak yang berlangsung pada

suhu yang relatif tinggi di atas 40oC. Agar proses reaksi berlangsung cepat

dibutuhkan bantuan enzim, namun enzim yang digunakan harus bersifat stabil

pada suhu yang tinggi tersebut. Banyak industri yang melibatkan bantuan enzim

amilase terutama amilase termostabil dalam proses reaksi-reaksi kimianya, karena

itu perlu dicari dan diteliti sumber-sumber di muka bumi yang dapat

menghasilkan enzim amilase termostabil tersebut.

Indonesia merupakan negara pertanian yang mana hasil pertaniannya

banyak berasal dari golongan karbohidrat. Hal ini tentu membutuhkan banyak

enzim amilase untuk pengolahan hasil pertanian tersebut agar memiliki nilai

ekonomi yang lebih tinggi dan lebih bermanfaat. Indonesia juga sebagai salah satu

wilayah yang memiliki aktivitas vulkanoik dan sumber geotermal yang banyak,

memiliki kesempatan untuk menghasilkan sumber-sumber mikroorganisma yang

dapat memproduksi enzim amilase termostabil tersebut. Salah satu sumber

geotermal itu adalah mata air panas yang cukup banyak tersebar di Indonesia

termasuk di Sumatera Utara. Di Sumatera Utara sendiri terdapat sumber mata air

panas yang banyak jumlahnya, salah satunya adalah sumber mata air panas Penen

Sibirubiru yang ada di Kabupaten Deli Serdang. Untuk itu diharapkan dari sumber

mata air panas Penen Sibirubiru tersebut dapat ditemukan mikroorganisme

termofil terutama bakteri penghasil enzim amilase yang tetap memiliki aktivitas

pada suhu tinggi.


1.3. Tujuan Penelitian

a. Untuk mendapatkan serta mengetahui karakter isolat bakteri termofil yang memiliki potensi amilolitik dari sumber air panas Penen Sibirubiru .

b. Untuk mengetahui potensi aktivitas enzim amilase termofil kasar dari isolat bakteri termofil di sumber air panas Penen Sibirubiru tersebut.

1.4. Hipotesis

a. Terdapat beberapa isolat bakteri termofil yang memiliki karakter berbeda

serta mampu menghasilkan enzim amilase.

b. Terdapat perbedaan potensi aktifitas enzim amilase kasar yang dihasilkan

bakteri termofil isolat Penen tersebut.

1.5. Manfaat Penelitian

a. Untuk mendapatkan isolat bakteri termofil penghasil enzim amilase yang

hidup di sumber air panas Penen Sibirubiru dan data karakternya.

b. Untuk mengetahui berapa besar potensi aktivitas enzim amilase kasar yang

dihasilkan oleh isolat bakteri termofil Penen tersebut.

c. Sebagai sumber informasi untuk penelitian lebih lanjut terhadap usaha

ekplorasi enzim amilase termofil.

1.6. Pembatasan Masalah

Berdasarkan masalah yang telah dirumuskan penelitian ini dibatasi pada

isolasi bakteri dan karakterisasi yang dilakukan pada tingkat pengamatan


makroskopis, mikroskopis dan sifat biokimia dari isolat–isolat bakteri yang

diperoleh serta pengujian aktivitas enzim amilase kasar lewat pengaruh variasi

suhu inkubasi dan pH substrat yang berbeda.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Amilum

Amilum adalah polimer karbohidrat dengan rumus molekul (C6H10O5)n.

Karbohidrat golongan polisakarida ini banyak terdapat di alam, terutama pada

sebagian besar tumbuhan. Amilum dalam bahasa sehari-hari disebut juga pati

terdapat pada umbi, daun, batang dan biji-bijian. Amilum merupakan kelompok

terbesar karbohidrat cadangan yang dimiliki oleh tumbuhan sesudah selulosa (Liu,

2005). Butir-butir pati apabila diamati dengan mikroskop ternyata berbeda-beda

bentuknya dan ukurannya tergantung dari tumbuhan apa pati tersebut diperoleh

(Poedjiadi, 1994).

Amilum disusun oleh dua kelompok polisakarida yaitu amilosa (Gambar

1.), kira kira 20–28% dan amilopektin sebagai sisanya (Poedjiadi, 1994). Baik

amilosa maupun amilopektin memiliki monomer yang sama yaitu molekul

glukopiranosa. Amilosa terdiri dari 100-10000 unit -D-glukopiranosa per

molekulnya, yang tiap unitnya berikatan lewat ikatan α-1,4 glikosida (Liu, 2005).

Tiap rantai polimer molekulnya memiliki satu ujung gula tereduksi dan satu

ujungnya lagi gula non reduksi sehingga molekul amilosa merupakan rantai

terbuka (Poedjiadi, 1994).

Amilosa merupakan bagian terdepan dari rantai amilum, bersifat larut

dalam air yang dipanaskan dan dapat membentuk endapan dalam air, yang

sifatnya tidak dapat balik (Aiyer, 2005). Amilopektin merupakan rantai molekul

polisakarida yang memiliki banyak percabangan. Molekul D-glukopiranosa yang


menjadi unit monomernya yang berikatan lewat ikatan α-1,4 glikosida seperti

pada amilosa yang membentuk rantai lurus dan ikatan α-1,6 glikosida yang

membentuk percabangan pada rantai amilopektin tersebut (Murray et al., 2003).

Molekul amilopektin lebih besar dari molekul amilosa dengan berat moleklunya

berkisar antara 106–109 g permolnya (Liu, 2005). Molekul amilosa merupakan

molekul yang larut dalam air dan memberikan warna biru apabila tercampur

dengan larutan iodin, sedang amilopektin merupakan molekul yang tidak larut

dalam air dan akan kelihatan berwarna merah bila terkena iodin (Sale, 1961).

Butir-butir pati tidak larut dalam air dingin, tetapi apabila suspensi dalam

air dipanaskan terbentuk suatu larutan koloid yang kental. Bila pati dipanaskan

dan didilusi dengan asam, pati akan terhidrolisis menjadi dekstrin, maltosa dan D-

glukosa (Sale, 1961). Semua hasil hidrolisis ini memiliki sifat yang larut dalam

air. Hidrolisis dari pati juga dapat terjadi dengan bantuan enzim amilase yang akan

mengubah amilum menjadi maltosa dalam bentuk β-maltosa (Poedjiadi, 1994 ).

Gambar 1. Struktur kimia dari (a) Amilosa, (b) Amilopektin (Murray et al., 2003)


Dalam kehidupan manusia amilum berperan sebagai sumber makanan

penghasil energi utama dari golongan karbohidrat, disamping itu amilum juga

dapat berperan sebagai bahan aditif pada proses pengolahan makanan, misalnya

sebagai penstabil dalam proses pembuatan puding. Amilum juga berperan dalam

pembuatan sirup dan pemanis buatan seperti sakarin. Dalam bidang non makanan,

amilum digunakan untuk bahan baku dalam proses pembuatan kertas, pakaian dari

katun, industri cat, maupun untuk produksi hidrogen. Tabel 1. di bawah ini

menunjukkan peran amilum di berbagai bidang.

Tabel 1. Penggunaan amilum di bidang industri (Liu, 2005)

Jenis Industri Penggunaan Amilum/ Amilum Termodifikasi

Makanan Pengental, pelapis makanan, film makanan Bahan perekat Pembuat lem Kertas dan papan Kertas penjilid, pembungkus,pengepak Textil Dalam proses sizing, finishing dan printing Farmasi Kapsul obat, bahan pelarut obat Pengeboran minyak Modifikasi pengental Detergen Surfaktan, bahan pensuspensi, bahan pemutih, aktivator pemutih Kimia pertanian Pemungkus biji, pembungkus pestisida,benang pintal Plastik Pembungkus makanan, filler Kosmetik Bedak dan talk Purifikasi Flokulan Bidang Medis Scaffold, plasma eksterder, produk absorben untuk sanitasi

2.2. Enzim

Enzim merupakan protein khusus yang dapat bergabung dengan suatu

substrat spesifik untuk mengkatalisasi reaksi biokimia dari substrat tersebut

(Maier et al., 2000). Dalam reaksi tersebut enzim mengubah senyawa yang


disebut substrat menjadi bentuk suatu senyawa baru yang disebut produk. Enzim

memiliki substrat spesifik dan reaksi kimia yang spesifik untuk dikatalisnya

(Palmer, 1985). Aktivitas enzim dipengaruhi oleh suhu, pH dari lingkungan

tempat enzim bekerja, konsentrasi substrat, aktivator dan inhibitor enzim.

Suhu bepengaruh besar terhadap aktivitas enzim. Semua enzim bekerja

dalam rentang suhu tertentu pada tiap jenis organisma. Peningkatan suhu eksternal

secara umum akan meningkatkan kecepatan reaksi kimia enzim, tetapi kenaikan

suhu yang terlalu tinggi akan menyebabkan terjadinya denaturasi enzim yaitu

kerusakan struktur protein enzim, terutama kerusakan pada ikatan ion dan ikatan

hidrogennya. Hal ini menyebabkan terjadinya penurunan kecepatan reaksi yang

dikatalis oleh enzim tersebut. Denaturasi enzim di atas suhu optimum akan

menyebabkan terjadinya kematian pada sel organisma, tetapi beberapa organisma

mampu bertahan hidup dan tetap aktif pada suhu yang sangat tinggi, dimana

organisma lain sudah tidak mampu lagi hidup seperti bakteri dan alga yang

ditemukan pada sumber-sumber air panas di taman Nasional Yellow Stone

Amerika, suhu optimum untuk hidupnya sebesar 70oC (Brock & Brock, 1978).

Selain suhu aktivitas enzim dipengaruhi oleh pH lingkungan tempat enzim

tersebut bekerja. Banyak enzim yang sensitif terhadap perubahan pH dan setiap

enzim memiliki pH optimum untuk aktivitasnya. Perubahan pH dapat

menyebabkan berhentinya aktivitas enzim akibat proses denaturasi pada struktur

tiga dimensi enzim (Palmer, 1985). Umumnya enzim bekerja optimum pada

rentang pH 6-8, tetapi beberapa jenis organisma dapat hidup pada pH yang lebih


rendah yang dikenal dengan istilah asidofil ataupun pada pH yang lebih tinggi

yang dikenal dengan istilah alkalifil.

Aktivitas enzim di lingkungan juga terjadi pada berbagai sumber

mikroorganisma seperti bakteri, jamur dan aktinomisetes. Mikroorganisma ini

menghasilkan enzim intraseluler dan enzim ekstraseluler. Enzim intraseluler

merupakan enzim yang langsung digunakan di dalam sel, dan sering ditemukan

pada bagian membran dari sebuah organel sel. Enzim ekstraseluler merupakan

enzim yang dilepas dari sel ke lingkungan untuk menghidrolisis molekul polimer

di lingkungan, seperti selulosa, hemiselulosa, lignin, ataupun juga untuk

memfasilitasi pengambilan suatu zat dari lingkungan bagi kebutuhan

metabolismanya (Maier et al., 2000). Enzim ekstraseluler dapat dipisahkan dari

lingkungan dengan filtrasi ataupun sentrifugasi (Palmer, 1985), sedangkan enzim

intraseluler dapat diekstrak dari dalam sel lewat proses pemecahan sel.

2.3. Enzim Amilase

Amilase adalah kelompok enzim yang memiliki kemampuan untuk

memutuskan ikatan glikosida yang terdapat pada molekul amilum. Hasil hidrolisis

atau pemecahan molekul amilum ini adalah molekul-molekul yang lebih kecil

seperti maltosa, dekstrin dan terutama molekul glukosa sebagai unit terkecil

(Reddy et al., 2003). Amilase dihasilkan oleh berbagai jenis organisma hidup,

mulai dari tumbuhan, hewan, manusia bahkan pada mikroorganisma seperti

bakteri dan fungi. Kelompok enzim ini memiliki banyak variasi dalam

aktivitasnya, sangat spesifik, tergantung pada sumber organismanya dan


tempatnya bekerja. Enzim amilase memiliki nama asli diastase dan pertama kali

ditemukan dan diisolasi oleh Anselme Payen pada tahun 1833. Seiring dengan

penemuan-penemuan baru di bidang penelitian kelompok enzim amilase yang

dapat mendegradasi amilum dan senyawa polisakarida lainnya juga semakin

bertambah jumlahnya. Menurut Aiyer (2005), Hagihara et al. (2001) beberapa

kelompok enzim amilase tersebut adalah:

a. Alpha amilase (α –amilase), EC.3.2.1.1

Disebut juga dengan 1,4–α-D-glukan glukanohidrolase atau glukogenase. Enzim

ini bekerja memutus ikatan α-1,4 glikosida pada amilum secara acak terutama

pada rantai yang panjang (Gambar 2.) sehingga menghasilkan maltotriosa dan

maltosa dari polimer amilosa pada amilum (Gambar 3.), dan menghasilkan

glukosa dan sedikit dekstrin dari polimer amilopektin penyusun amilum. Karena

sifatnya yang dapat memutus ikatan glikosida secara acak, enzim ini bekerja lebih

cepat dibanding amilase lainnya terutama β-amilase. Pada kelompok hewan α–

amilase merupakan enzim pencerna amilum yang utama. Enzim α–amilase

merupakan kelompok metaloenzim yang tidak dapat bekerja sama sekali bila ion

calsium tidak ada (Palmer, 1985). α–Amilase merupakan jenis enzim yang

bersifat calcium metalloenzyme dependent.


Gambar 2. Jenis reaksi hidrolisis yang dikatalis Oleh enzim amilase (Nickerson & Brown, 1965)

b. Beta amilase (β-amilase) , EC.3.2.1.2

Disebut juga 1,4–α-D-glukan maltohidrolase ataupun sakarogen amilase. Enzim

ini dijumpai pada kelompok tumbuhan, bakteri dan fungi. Enzim ini bekerja

menghidrolisis amilum dari bagian ujung non reduksi dan menghidrolisis ikatan α-

1,4 glikosida pada tahap kedua hidrolisis amilum sehingga terbentuk molekul

maltosa yang disusun oleh dua unit glukosa pada saat yang sama setelah -

amilase bekerja. Selama proses pematangan buah β-amilase bekerja memecah

amilum menjadi gula sehingga buah yang matang terasa manis. Jaringan hewan


tidak menghasilkan enzim β-amilase, kecuali bila ada mikroorganisma yang

bersimbiosis di saluran pencernaannya. Produk akhir dari hasil hidrolisa enzim -

amilase dan β-amilase ini dapat di β-amilase lihat pada Gambar 3.

Gambar 3. Konversi amilum menjadi glukosa oleh enzim α dan β-Amilase (Alexander, 1977) c. Gamma amilase (γ –amilase), EC.3.2.1.3

Disebut juga glucan 1,4-α–glukosidase, amiloglukosidase, ekso-1,4-α–

glukosidase, lisosomal α-glukosidase, glukoamilase, 1,4-α-D-glukan

glukohidrolase. Merupakan pemutus terakhir ikatan glikosida pada bagi ujung non

reduksi dari amilosa dan amilopektin untuk menghasilkan unit glukosa.

d. Pullulanase, EC.3.2.1.41

Merupakan enzim pemutus cabang, menghidrolisis hanya pada ikatan α-1,6

glikosida, seperti pullulan 6-glukanohydrolase.


e. α-Glukosidase,EC.3.2.1.20

Memutus ikatan α-1,4 glikosida dari molekul amilosa ataupun amilopektin

menjadi rantai-rantai pendek oligosakarida.

f. Enzim Penghasil Siklodekstrin

Enzim yang dapat menghidrolisis amilum menjadi jenis siklik D-glukosil non

reduksi yaitu suatu jenis polimer yang disebut siklodekstrin atau sakhardinger

dekstrin. Jenis ini dijumpai misalnya pada amilase yang dihasilkan oleh Bacillus

macerans.

Berdasarkan arahnya memutus ikatan glikosida dari amilum, maka enzim

amilase dapat dikategorikan menjadi 2 kelompok (Reddy et al., 2003) yaitu

endoamilase dan ektoamilase. Endoamilase melakukan hidrolisis secara acak

dari bagian depan molekul amilum sehingga menghasilkan molekul

oligosakarida dalam bentuk rantai lurus maupun bercabang dengan panjang rantai

yang bervariasi sedangkan ektoamilase melakukan hidrolisis dari ujung non

reduksi dan dengan produk akhir molekul yang pendek.

Enzim amilase secara konstitusi merupakan kelompok enzim yang sangat

dibutuhkan dalam bidang industri, dengan pangsa pasar mencapai hampir 25%

dari pasaran enzim di dunia (de Carvalho et al., 2008). Penggunaan enzim amilase

dalam industri sangat luas mulai dari industri pembuatan roti, sirup, pemanis,

campuran oligosakarida, dekstrin, industri textil, pembuatan ethanol, pengujian

limbah cair yang mengandung amilum, industri detergen, industri obat dan

suplemen enzim (Palmer, 1985). Karena enzim ini sangat bernilai komersil maka


perlu ditemukan banyak sumber-sumber penghasil enzim amilase dengan

karakteristik yang sesuai dengan yang dibutuhkan.

2.4. Bakteri Termofil

Suhu merupakan salah satu faktor penting di lingkungan yang mengontrol

aktivitas dan evolusi dari organisma hidup (Brock, 1978). Tidak semua tingkatan

suhu cocok bagi pertumbuhan dan reproduksi dari organisma. Dengan demikian

tinggi rendahnya suhu lingkungan sangat penting bagi organisma. Secara Umum

ada 4 kelompok pembagian mikroorganisma berdasarkan suhu lingkungan

tempatnya hidup yaitu mikroorganisma psikrofil, mesofil, termofil dan

hipertermofil, sebagaimana yang di gambarkan oleh Thiel (Gambar 4.)

Thermal vents > 100oC 100oC 90oC Hipertermofil 80oC-100oC 80oC Mata air panas 60oC–80 oC 70oC Termofil 45oC-80oC Pasteurisasi 65oC 60oC 50oC

40oC Tubuh manusia Mesofil 20oC-50oC 37oC

30oC 20oC 10oC Refrigerator 4oC Psikrofil -10oC-25 oC 0oC -10o C Freezer -20oC Gambar 4. Rentang suhu lingkungan yang menggambarkan keberadaan tempat hidup mikroorganisma (Thiel, 1999)


Ada empat peristiwa yang menjadi penyebab lingkungan bersuhu

tinggi yaitu sinar matahari, pembakaran, letusan gunung api, peluruhan

radioaktif dan aktifitas geotermal di perut bumi (Brock, 1978). Dengan

ditemukannya mikroorganisma yang memiliki kemampuan untuk hidup pada

suhu yang relatif tinggi (60oC atau lebih) konsep tentang daya tahan dan

kestabilan protoplasma sel untuk bertahan pada batas limit suhu 42oC – 45oC

perlu dipikirkan kembali. Istilah termofil pertama kali dipergunakan oleh Miquel

pada tahun 1879, untuk menggambarkan organisma yang dapat berkembang pada lingkungan dengan suhu tinggi pada saat mana bagi organisma lain sudah

tidak dapat hidup (Morrison & Tanner, 1921).

Menurut klasifikasi fisiologis yang dibuat Gilter dijelaskan organisma termofil memiliki suhu minimum untuk hidupnya sebesar 45oC,

optimum 55oC dan maksimum 70oC. Muir dan Rikhie mendefinisikan bakteri

termofil merupakan organisma yang tumbuh sangat baik pada suhu 60oC– 70oC ,

sedangkan Hiss dan Zinsser menyatakan bakteri termofilik merupakan bakteri

yang didapatkan dari sumber air panas ataupun lapisan bagian paling atas dari

permukaan tanah (Morrison & Tanner, 1921). Bakteri termofil juga merupakan

kelompok mikroorganisma yang dapat ditemukan di lingkungan yang sangat

bervariasi kondisinya serta tetap eksis pada suhu tinggi dengan sifat obligat,

fakultatif maupun termotoleran (Singleton & Amelunxen, 1973). Spesies

termofil paling banyak ditemukan pada kelompok bakteri dan dapat tetap hidup

pada keadaan aerob, anaerob fakultatif dan anaerob.


Kelompok bakteri termofil tergolong dalam kelompok Archaebacteria yang

secara umum struktur selnya memiliki beberapa kelebihan dibanding kelompok

bakteri lainnya. Kelompok ini umumnya memiliki daya adaptasi yang sangat

tinggi terhadap kondisi lingkungan yang bersifat ekstrim seperti temperatur, kadar

garam, pH, tekanan dan oksigen dimana mikroorganisma lain tidak dapat

mempertahankan aktifitas hidupnya (de Rosa et al., 1986).

Kemampuan hidup dari mikroorganisma termofil ini berhubungan dengan

struktur selnya yang memiliki kelebihan dalam beberapa hal, yaitu :

a. Struktur membran sel

Membran sel setiap mahluk hidup tersusun atas senyawa lipid dan protein

yang disebut lipoprotein. Pada umumnya bagian lipid dari membran sel mahluk

hidup dihubungkan oleh ikatan ester, sedangkan pada organisma termofil senyawa

lipid membran selnya mengandung ikatan eter yang terbentuk lewat proses

kondensasi dari gliserol atau senyawa poliol kompleks lainnya dengan alkohol

isoprenoid yang mengandung 20, 25 atau 40 atom karbon (de Rossa et al., 1986).

Lebih jauh lagi senyawa eter gliserol pada Archaebacteria ini mengandung 2,3 О-

sn-gliserol yang menyebabkan struktur lipoprotein dari membran sel termofil

tersebut lebih stabil.

b. Struktur Protein

Chaperonin merupakan suatu jenis protein yang merupakan jenis protein

yang tidak umum dijumpai pada protein-protein fungsional lainnya di dalam sel.

Protein ini berperan dalam mempertahankan kembali struktur tiga dimensi dari

protein fungsional sel dari denaturasi suhu lingkungan yang bersifat ekstrim.


Protein ini memiliki struktur yang tetap stabil, tahan terhadap denaturasi dan

proteolisis (Kumar & Nussinov, 2001). Protein ini dapat membantu organisma

termofil mengembalikan fungsi aktifitas enzimnya bila terdenaturasi oleh suhu

yang tinggi (Everli & Alberto, 2000). Chaperonin tersusun oleh molekul yang

disebut chaperone, yang membentuk struktur chaperonin seperti tumpukan kue

donot pada sebuah drum. Tiap cincin donat ini terdiri atas 7, 8 atau 9 subunit

chaperone tergantung jenis organismanya. Dalam aktivitasnya mempertahankan

struktur protein fungsional agar tetap stabil, chaperonin membutuhkan molekul

ATP.

c. Struktur DNA Gyrase

DNA gyrase merupakan salah satu anggota kelompok enzim

topoisomerase yang berperan dalam mengontrol topologi DNA suatu sel dan

memegang peran penting dalam proses replikasi dan transkripsi DNA. Semua

jenis topoisomerase dapat merelaksasikan DNA tetapi hanya DNA gyrase yang

dapat mempertahankan struktur DNA tetap berbentuk supercoil ( Maxwell, 1999).

DNA gyrase disusun oleh 90-150 pasangan basa-N DNA. DNA gyrase ini juga

selalu dijumpai pada organisma yang hidup di lingkungan di atas 70oC dan juga

dapat dijumpai pada organisma yang hidup pada suhu sekitar 60oC. DNA ini

merupakan salah satu kelengkapan sel dari organisma termofil (D’ Amaro et al.,

2007).

2.5. Amilase dari Mikroorganisma

Enzim yang digunakan untuk keperluan industri sebagian besar diisolasi

dari mikroba. Pemilihan mikroba sebagai sumber enzim mempunyai beberapa


keuntungan bila dibandingkan dengan enzim yang diisolasi dari tumbuhan

maupun hewan. Keuntungan itu antara lain sel mikroba lebih mudah untuk

ditumbuhkan dan kecepatan pertumbuhannya relatif lebih cepat, skala produksi

sel lebih mudah ditingkatkan apabila dikehendaki produksi yang lebih besar,

biaya produksinya relatif lebih murah, kondisi selama produksi tidak tergantung

oleh adanya perubahan musim dan waktu yang dibutuhkan dalam proses produksi

lebih singkat (Poernomo, 2003).

Amilase secara umum diproduksi oleh tumbuhan, hewan, manusia dan

mikroba, tetapi enzim amilase yang berasal dari fungi dan bakteri mendominasi

penggunaan enzim amilase di bidang industri. Beberapa dari jenis Bacillus sp. dan

Actinomycetes, termasuk Termomonospora dan Thermoactinomycetes merupakan

kelompok yang memiliki kemampuan besar dalam meproduksi enzim amilase,

Bacillus licheniformis memiliki kemampuan untuk menghasilkan enzim amilase

dalam kondisi lingkungan yang bersifat alkalis (Reddy et al., 2003)

Enzim amilase yang dihasilkan oleh mikroba terutama dari bakteri,

merupakan jenis enzim ekstraseluler (Palmer, 1985). Bakteri menghasilkan enzim

ini di dalam sel dan menggunakannya di luar sel, yaitu untuk menghidrolisis

sumber makanan yang mengandung amilum yang terdapat di lingkungannya.

Molekul amilum tidak dapat masuk ke dalam sel bakteri karena ukurannya sangat

besar, karena itu molekul amilum dihidrolisis terlebih dahulu oleh enzim amilase

ekstraselular menjadi molekul karbohidrat yang lebih sederhana dan kecil ukuran

molekulnya. Molekul hasil hidrolisis amilum oleh enzim amilase tersebut


selanjutnya akan ditransport masuk ke dalam sel bakteri dan digunakan sebagai

sumber karbon bagi aktivitas pertumbuhan dan kehidupannya (Benson, 1994).

Enzim amilase ekstraseluler yang dihasilkan bakteri maupun fungi tersebut

dimanfaatkan sebagai katalisator dalam industri maupun untuk keperluaan dalam

bidang kesehatan (Tabel 2.). Untuk mendapatkan enzim amilase dari mikroba

tersebut maka kultur mikroba yang memproduksi enzim amilase ekstraseluler

tersebut disentrifugasi untuk mendapatkan supernatan yang mengandung enzim

amilase ekstraselular (Palmer, 1985).

Tabel 2. Enzim amilase dari mikroorganisma dan aplikasinya pada bidang industri (Brock & Brock, 1978) Enzim

Sumber

Aplikasi

Industri

Fungi Pembuatan roti Roti Bakteri Pembungkus kertas Kertas Fungi Pabrik sirup dan glucosa Makanan Bakteri Binatu Amilum Fungi Obat pencernaan Farmasi

Amilase

Bakteri Pembersih pakaian Tekstil

2.6. Amilase dari mikroba termofil

Enzim hidrolitik yang dihasilkan oleh mikroorganisma termofil

merupakan salah satu kelompok yang menarik perhatian untuk dipelajari

(Cordeiro et al., 2002). Enzim dari mikroorganisma termofil ini memiliki nilai

komersial yang cukup tinggi dalam bidang industri karena memiliki daya

termostabilitas yang tinggi, stabil terhadap zat-zat yang bersifat dapat

mendenaturasi enzim seperti detergen dan senyawa organik lainnya, stabil dalam


kondisi lingkungan yang asam maupun alkalis, sangat cocok untuk proses

fermentasi di bidang industri (www.osmania.ac.in). Kelebihan-kelebihan ini

menjadikan enzim yang berasal dari mikroorganisma termofil semakin

berkembang penggunaannya dalam bidang industri dan bioteknologi.

Konsep tentang termostabilitas yang dimiliki oleh enzim yang berasal dari

mikroorganisma termofil ini dilandaskan pada dua konsep yaitu pertama struktur

molekular pada selnya yang memang tersusun oleh molekul protein yang

termostabil, kedua termostabilitas itu berkaitan dengan adanya asosiasi senyawa

protein enzim dengan molekul lainnya seperti lipid, polisakarida maupun protein

lainnya yang menyebabkan terbentuknya suatu senyawa yang memiliki

mekanisma yang memungkinkannya tetap stabil saat menghadapi kondisi yang

dapat menginaktivasinya (Hibino et al., 1974).

Hampir 70% sektor industri yang menggunakan enzim dalam prosesnya

memanfaatkan enzim yang berasal dari mikroorganisma termofil. Industri

detergen misalnya menggunakan protease yang bersifat tahan suasana alkalis,

industri amilum menggunakan enzim amilase, amiloglukosidase dan

glukoisomerase yang berasal dari mikroorganisma termofil.

Amilase termostabil digunakan dalam skala yang cukup luas pada proses

industri. Enzim amilase yang digunakan tersebut berkisar pada -amilase, ß-

amilase, glukoamilase, pullulanase dan jenis lainnya (Illanes, 1999). Diantara

semua jenis enzim amilase, -amilase dari mikroorganisma termofil ini memiliki

nilai aplikasi komersil yang paling tinggi dalam bidang industri makanan,

minuman, pembuatan sirup yang mengandung glukosa, maltosa maupun


oligosakarida. -Amilase pertama sekali diisolasi dari isolat Bacillus

amyloliquefaciens dan digunakan dalam bidang industri selama bertahun-tahun

(Cordeiro et al., 2002), tetapi penemuan enzim amilase termostabil dari isolat

Bacillus licheniformis ternyata menunjukkan adanya termostabilitas yang lebih

tinggi sekitar 10-20oC dibandingkan dari amilase termostabil pada B.

amyloliquefaciens (Rath & Subramanyam, 1998). Selanjutnya enzim–enzim

amilase termostabil juga berhasil didapatkan dari mikroorganisma seperti B.

subtilis, B. stearothermophilus, B. calcalovelox, B. alcalophilus, Thermus sp.,

Clostridium acetobutylicum, Pyrococcus furiosus, Sulfolobus acidocaldarius, dan

lainnya. Selain yang dihasilkan oleh bakteri ternyata beberapa kelompok fungi

seperti Aspergillus oryzae, A. niger dan Saccharomyces castelli juga

menghasilkan amilase termostabil, demikian juga halnya dengan kelompok

Aktinomisetes seperti Thermomyces vulgaris, Streptomyces thermoviolaceaus

memproduksi amilase yang bersifat termostabil (Rath & Subramanyam, 1998).

Akhir-akhir ini penelitian terhadap mikroorganisma termofil penghasil

enzim amilase termostabil telah diarahkan bukan hanya yang bersifat temofil saja

tetapi juga hipertermofil (mampu hidup di atas suhu 80oC) seperti amilase yang

didapatkan pada Pyrococcus furiosus, Pyrococcus woesei yang memiliki aktifitas

katalitik sampai 130oC (Carolina, 1999). Pada umumnya mikroba-mikroba

termofil tersebut dijumpai di sumber-sumber air panas, daerah aktifitas gunung

berapi, maupun di dasar laut yang memiliki sumber mata air panas.

Adapun faktor-faktor yang dianggap berhubungan dengan termostabilitas

enzim-enzim dari mikroorganisma termofil bervariasi pada berbagai spesies


termofil, namun beberapa hal umum yang ditemukan antara lain terjadinya

peningkatan ikatan hidrogen dan salt bridge pada protein dari enzim termofik.

Selain itu ditemukan juga adanya perbedaan jenis dan komposisi asam amino

penyusun protein enzim termofil bila dibandingkan dengan protein enzim yang

mesofilik. Pada enzim temofilik terjadi penurunan jumlah sistein dan serin secara

nyata, sedangkan jumlah arginin dan tirosin meningkat secara nyata. Asam amino

prolin juga lebih sedikit ditemukan pada struktur -heliks pada protein termofilik

(Kumar et al., 20000).

2.7. Sumber Air Panas Penen Sibirubiru

Manifestasi panas bumi di permukaan adalah sebagai indikasi adanya

aktifitas panas bumi di bawah permukaan tersebut. Bentuk manifestasi aktifitas

panas bumi di dalam perut bumi itu dapat berupa munculnya mata air panas,

munculnya bualan gas ke permukaan tanah, fumarola, solfatara dan tanah panas.

Mata air panas yang muncul ke permukaan ini dapat mengandung klorida,

bikarbonat ataupun sulfat.

Sumber air panas meskipun memiliki suhu cukup tinggi ternyata dapat

dijadikan untuk lingkungan tempat kehidupan bagi beberapa mikroorganisma

yang tahan terhadap suhu air yang panas tersebut, seperti bakteri, fungi maupun

alga yang bersifat termofil. Sumber air panas selain memiliki air yang suhunya

cukup tinggi juga memiliki suatu aroma khas yaitu berupa aroma hidrogen

peroksida (H2S) yang berasal dari aktifitas bakteri anaerob yang menggunakan

senyawa-senyawa sulfur.


Sumber mata air panas Penen Sibirubiru terletak di desa Penen Kecamatan

Sibirubiru Kabupaten Deli Serdang Propinsi Sumatera Utara. Tepatnya berada di

posisi geografis 03o 18’ 02,7” LU dan 98o 38’ 53,3” BT. Memiliki suhu air sekitar

47oC sampai 57o C, dengan pH air berkisar netral 6,8.


BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Waktu dan Tempat

Penelitian ini dilakukan dari bulan Februari 2008 sampai Juli 2008

bertempat di Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi Fakultas

Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara.

3.2. Bahan dan Alat

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah media agar

untuk seleksi bakteri termofil, media agar untuk seleksi bakteri amilolitik, kristal

violet, aquadest, gram iodin, alkohol, safranin, malachit green, reagen DNS, sitrat

buffer phosphat, glukosa monohidrat, NaOH, larutan iodin, media untuk produksi

enzim amilase. Alat yang digunakan adalah botol sampel steril, termometer, pH

meter (Hanna Instrument), timbangan analitik, hoki stik, shakerwaterbath (Julabo

Sw22), vortex, waterbath (Griffin), bunsen, pipet serologi, propipet, mikropipet

(Gilson), jarum ose, tabung uji, sentrifuge, petridish, erlenmeyer, tabung reaksi,

otoklaf (Yamato), inkubator (Fisher), oven (Gallenkamp), gelas benda, mikroskop

lanjutan, kamera foto digital, spektofotometer.

3.3. Sampel Percobaan

Sampel percobaan dalam hal ini adalah isolat-isolat bakteri termofil

penghasil enzim amilase, yang didapat dari kolam sumber air panas yang ada di

sumber mata air panas Penen Sibirubiru.


3.4. Pengambilan Sampel Air Panas

Sampel air panas diambil dari sumber mata air panas, masing-masing pada

3 tempat yang berbeda. Sebelum sampel air diambil terlebih dahulu dilakukan

pengukuran parameter fisika dan kimia di lapangan kerja. Parameter yang diukur

pertama adalah suhu air di tiap titik pengambilan dengan menggunakan

termometer yang dicelupkan selama 3 menit ke dalam tiap bagian tempat

pengambilan sampel dan di catat suhunya. Parameter kedua adalah pH air di tiap

titik pengambilan diukur dengan pH meter yang dicelupkan ke permukaan air lalu

angka pH yang tertera dicatat. Sampel air diambil dari bagian kolam dengan

kedalaman 50 cm dari permukaan air. Sampel air diambil sebanyak 200 ml dari

tiap tempat dan dimasukkan ke dalam botol steril dan diberi label. Selanjutnya

sampel air di bawa ke Laboratorium Mikrobiologi Departemen Biologi Fakultas

MIPA Universitas Sumatera Utara, untuk dilakukan isolasi.

3.5. Isolasi Bakteri dan Pemurnian Bakteri

Media yang digunakan untuk mengisolasi bakteri termofil adalah Luria

agar (ekstrak yeast 5 g, tripton 5 g, NaCl 5 g, tepung agar 5 g dalam 1 liter

aquadest) disterilkan, dituang pada petri steril. Setelah media padat sebanyak 0,1

ml sampel air panas disebar dengan hoki stik pada permukaan agar, diinkubasi

selama 48 jam pada suhu 65oC. Tiap sampel air panas dibuat ulangannya 2 kali.

Untuk pemurnian bakteri, tiap koloni bakteri yang tumbuh berbeda pada

kultur sebelumnya diambil satu ose dan digores ke tiap cawan petri lain yang

mengandung media agar selektif amilolitik (Yeast ekstrak 0,2 %, pepton 0,5 %,


NaCl 0,05 %, MgSO4 0,05%, CaCl2 0,015%, tepung agar 2 % dan soluble pati

1%), diinkubasi selama 24 jam pada suhu 65oC. Hal ini dilakukan untuk

mendapatkan biakan tunggal tiap jenis bakteri termofil penghasil amilase yang

hidup pada sumber air panas Penen. Setiap isolat murni yang dapat tumbuh

diasumsikan dapat menggunakan media yang mengandung pati tersebut. Untuk

memastikannya dilakukan uji iodin dengan cara meneteskan iodin pada

permukaan agar yang berisi isolat, bila terdapat zona bening pada media

mengindikasikan enzim amilase diproduksi oleh isolat sehingga di daerah tersebut

amilum sudah dihidrolisis (Cappucino, 1983), sedangkan media yang berwarna

biru kehitaman menandakan pati di tempat itu belum terhidrolisis. Sebelum

pengujian tiap isolat disiapkan dulu stok kulturnya pada media miring. Hal ini

perlu dilakukan karena uji iodin membuat isolat bakteri mati karena larutan iodin

bersifat desinfektan (Pelczar & Chan, 1988).

3.6. Pembuatan Stok Kultur

Stok kultur disiapkan dengan cara menggores satu ose dari tiap isolat

bakteri yang tumbuh di kultur pemurnian sebelumnya, dalam bentuk media miring

dengan komposisi media sama seperti media pemurnian isolat. Kultur diinkubasi

selama 24 jam pada suhu 65oC, selanjutnya disimpan di kulkas untuk stok isolat.

Stok kultur ini diremajakan sekali dalam 3 minggu.


3.7. Uji Diameter Zona Bening Hasil Hidrolisis Pati

Isolat bakteri disuspensikan dalam larutan NaCl fisiologis sampai

kekeruhannya sama dengan kekeruhan Larutan Mac Farland 0,5 standart yang

setara dengan 108 CFU. Dari tiap suspensi bakteri diambil 5 µl suspensi dengan

menggunakan mikropipet, lalu diteteskan dengan tepat pada bagian tengah cawan

petri yang sudah berisi media agar pati yang disterilkan. Kultur diinkubasi selama

72 jam pada suhu 65oC. Tiap isolat bakteri yang tumbuh pada media pati tersebut

ditetesi dengan larutan iodin untuk melihat kemampuan daya amilolitiknya. Isolat

yang menghasilkan enzim amilase menghasilkan zona bening pada agar di sekitar

koloninya jika ditetesi dengan larutan iodin. Lebar zona bening yang terbentuk

diukur dengan menggunakan jangka sorong (Hartuti, 2006). Tiga isolat terbesar

zona beningnnya selanjutnya digunakan dalam penelitian ini untuk pengujian

parameter aktifitas enzim amilase kasar.

3.8. Karakterisasi Morfologi Bakteri Penghasil Enzim Amilase Termofil

Morfologi isolat bakteri penghasil amilase diamati pada kultur isolat yang

dimurnikan. Pengamatan morfologi dari tiap isolat meliputi warna koloni, bentuk

koloni dilihat dari atas, permukaan koloni dilihat dari samping dan tepi koloni

dilihat dari atas (Cappuccino, 1983).


3.9. Karakterisasi Bakteri Penghasil Amilase Secara Mikroskopis

Pewarnaan gram dilakukan dengan mengambil satu ose isolat bakteri,

diletakkan pada kaca objek yang ditetesi 1 tetes air, disebar, kemudian difiksasi

dengan memanaskannya di atas lampu bunsen. Pewarnaan dilakukan dengan

kristal violet dengan memiringkan gelas objek. Setelah 1 menit dibilas dengan air

perlahan, kemudian diberi gram iodin, setelah itu secepatnya diberi aseton alkohol

dan dibilas. Kemudian diteteskan larutan safranin sebagai zat warna tandingan,

dibiarkan satu menit, lalu dibilas dengan air dan dikeringkan perlahan dengan

tissue. Selanjutnya diamati di bawah mikroskop, bentuk dan penataan sel-selnya

serta gramnya (Cappuccino, 1983).

Pewarnaan spora dilakukan dengan mengambil satu ose isolat bakteri,

difiksasi pada kaca objek, lalu diberikan 2-3 tetes Malachite green, lalu

dipanasuapkan selama 5 menit (sampai uap terlihat), didiamkan selama 1 menit,

bilas dengan aquadest, diteteskan safranin dan dibiarkan selama 30 detik, lalu

dikeringkan tanpa pamanasan Setelah itu diamati dengan mikroskop, spora

berwarna hijau sedangkan bagian sel lainnya berwarna merah (Cappucinno,

1983).

3.10. Uji Sifat Biokimia Bakteri Amilase Termofilik

Uji katalase dilakukan dengan mengambil 2 tetes hidrogen peroksida 3%

diletakkan pada kaca objek, satu ose isolat bakteri, diletakkan di atas cairan

hidrogen peroksida tersebut. Uji katalase positif ditandai dengan dihasilkannya

gelembung udara (Cappuccino,1983).


Uji sitrat dilakukan dengan mengambil satu ose isolat bakteri, digores

pada permukaan media Simon Citrat Agar dan dengan ose lurus satu ose isolat

bakteri juga ditusukkan ke bagian tengah media sampai ke dasar tabung reaksi.

Media kultur tersebut diinkubasi pada suhu 65oC selama 48 jam. Uji positif bila

media berubah dari warna hijau menjadi warna biru (Cappuccino, 1983).

Uji fermentasi karbohidrat dilakukan dengan menggores isolat bakteri

pada permukaan media miring Triple Sugar Iron agar dan juga ditusuk lurus pada

bagian tengah media. Kultur dinkubasi selama 48 jam pada suhu 65oC, lalu

diamati perubahan warna media. Uji positif bila terjadi perubahan warna media

TSIA dari warna teh menjadi warna oranye atau kuning (Cappuccino, 1983).

Uji gelatinase dilakukan dengan menginokulasikan isolat bakteri dengan

cara menusuk cara tegak lurus jarum ose pada bagian tengah media Gelatin, lalu

diinkubasi selama 5 hari pada suhu 65oC, setelah itu kultur media disimpan dalam

kulkas selama 15 menit. Uji gelatinase positif ditandai dengan bentuk media yang

tetap cair meskipun telah disimpan di dalam kulkas (Cappuccino, 1983).

Uji Motilitas dilakukan dengan cara menginokulasikan isolat bakteri

dengan cara menusukkan jarum ose secara tegak lurus hingga setengah tinggi

media Sulfit Indol Motility pada tabung reaksi. Tabung diinkubasi selama 48 jam

pada suhu 65oC, setelah itu diperhatikan jejak pergerakan bakteri (Cappuccino,

1983).

3.11. Pembuatan Larutan Standar Glukosa

Aktivitas enzim amilase yang akan diuji dari ketiga isolat terpilih

diplotkan ke kurva standar glukosa agar dapat diketahui berapa konsentrasi


glukosa yang diperoleh dari hasil hidrolisis amilum yang dikatalis enzim amilase

isolat terpilih tersebut. Untuk membuat larutan standar glukosa tersebut dibuat

larutan–larutan glukosa dengan konsentrasi mulai dari 80-260 µg/ml. Untuk tiap

konsentrasi diambil 1 ml larutan glukosa tersebut, dan ditambahkan 1,5 ml larutan

reagen DNS, divorteks, kemudian diinkubasi dididihkan selama 5 menit,

didinginkan dengan air mengalir selama 15 menit, ditambah aquabidest sebanyak

20 ml, divortex, lalu diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm.

Dari tiap hasil absorbansi masing-masing larutan glukosa dengan konsentrasi

yang berbeda tersebut dibuat garis regresi yang menunjukkan hubungan linier

antara absorbansi dan kadar glukosa (Junaidi, 2008).

3.12. Produksi Enzim Amilase Dari Isolat

Satu ose kultur bakteri amilolitik dari stok kultur yang berumur 1 hari

dimasukkan ke dalam media cair steril untuk perangsang pembentukan amilase.

Media cair terbuat dari (gram per liter larutan) 6 peptone, 0,5 KCl, 0,5

MgSO4.7H2O, 1 pati. Larutan kemudian disterilisasi. Media yang mengandung

kultur bakteri diinkubasi pada suhu 65oC selama 72 jam pada shakerwaterbath

dengan kecepatan 150 rpm (Ajayi, 2007).

3.13. Ekstraksi Enzim Dari Kultur Cair Bakteri

Setelah diinkubasi selama 72 jam, kultur cair bakteri dimasukkan ke dalam

tabung centrifuge dan diputar selama 20 menit dengan kecepatan 6000 rpm.


Supernatan yang mengandung ekstrak dari enzim amilase kasar diambil dengan

mikropipet untuk di uji aktivitasnya (Palmer, 1985).

3.14. Pengukuran Aktivitas Enzim Amilase Kasar Dari Isolat Bakteri

Termofil

Aktivitas enzim amilase dideterminasi lewat metode DNS dengan

menggunakan pati sebagai substrat (Bernfeld, 1951; Bailey, 1988). Supernatan

dari kultur enzim amilase kasar digunakan sebagai sampel enzim. Aktivitas enzim

amilase dihitung berdasarkan data kadar glukosa relatif sebagai mg glukosa yang

dihasilkan oleh 1 ml filtrat kasar amilase. Satu Unit aktifitas enzim didefenisikan

sebagai banyaknya µmol glukosa yang dihasilkan dari hidrolisa pati oleh 1 ml

ekstrak kasar enzim amilase selama masa inkubasi. Untuk melihat besarnya satu

unit aktifitas enzim tersebut digunakan rumus:

AE = MG x 1000 .............................(Kombong, 2004)

BMg x MI di mana : AE = Aktifitas enzim ( Unit/mL filtrat enzim).

MG = Miligram glukosa yang dihasilkan dari reaksi hidrolisa pati

BMg = Berat Molekul Glukosa = 180

MI = Masa Inkubasi = 20 menit

3.15. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar

Sebanyak 1 ml ekstrak amilase kasar hasil sentrifugasi dimasukkan ke

dalam tabung uji, lalu ditambahkan 1% larutan pati yang sudah dilarutkan dalam


sitrat bufer fosfat pH 6,5. Larutan pati dan enzim tersebut diinkubasi pada

waterbath dengan suhu yang bervariasi mulai suhu 40oC, 50oC, 60oC, 65oC, 70oC,

80oC selama 20 menit. Untuk blanko disiapkan 2 ml ekstrak amilase kasar dalam

tabung uji dan dipanaskan hingga mendidih selama 20 menit, lalu secepatnya

dimasukkan dalam es selama 5 menit untuk menginaktivasi enzim tersebut.

Bagian ini digunakan untuk blanko. Ke dalam tabung blanko ditambahkan juga

larutan pati 1% dalam sitrat bufer fosfat pH 6,5, lalu diinkubasi pada suhu yang

bervariasi sama dengan sampel enzimnya yang aktif selama 20 menit. Untuk

menghentikan reaksi setelah 20 menit, ke dalam tiap tabung uji ditambahkan 2 ml

reagen DNS (terbuat dari 1 g 3,5,dinitrosalicyclic acid, 20 ml NaOH dan 30 g

sodium potassium tartarate dalam 100 ml larutan). Tabung uji dipanaskan hingga

mendidih selama 5 menit, didinginkan dengan air mengalir selama 15 menit dan

ditambahkan air yang didestilasi sebanyak 20 ml. Tiap larutan dalam tabung uji

kemudian dideterminasi intensitas warnanya dengan menggunakan

spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Nilai absorbansinya diplotkan

dengan kurva standart glukosa yang terbuat dari larutan glukosa monohidrat

dengan konsentrasi antara 80–260 µg/ml yang telah dibuat sebelumnya (Junaidi,

2008). Tiap sampel pengujian aktifitas enzim dibuat ulangannya sebanyak tiga

kali.

3.16 Pengaruh pH Terhadap Aktifitas Enzim

Aktivitas enzim amilase dideterminasi lewat metode DNS (3,5-dinitro

salicylic acid) dengan menggunakan pati sebagai substrat (Bernfeld, 1951; Bailey,


1988). Filtrat dari kultur enzim amilase kasar digunakan sebagai sampel enzim.

Sebanyak 1 ml ekstrak amilase kasar hasil sentrifugasi dimasukkan ke dalam

tabung uji, lalu ditambahkan 1% larutan pati yang sudah dilarutkan dalam sitrat

bufer fosfat dengan variasi pH 4, pH 5, pH 6, pH 7, pH 8 dan pH 9, Lalu tiap

sampel diinkubasi pada waterbath dengan menggunkan suhu 65oC selama 20

menit, setelah itu ditambahkan masing-masing 2 ml reagen DNS, dididihkan

selama 5 menit, didinginkan pada air mengalir selama 15 menit, ditambahkan

masing-masing aquadest sebanyak 20 ml, divortex dan absorbansinya diukur

dengan menggunakan spektrofotometer pada panjang gelombang 540 nm. Untuk

blanko digunakan enzim yang sudah dinonaktifkan dengan cara dididihkan selama

20 menit lalu didinginkan dengan es selama 5 menit.. Untuk perlakuannya dibuat

sama dengan perlakuaan sampel pH yang mau diuji.

3.17. Metode Statistik dan Analisis data

Penelitian ini dilakukan dengan menggunakan metode Rancangan Acak

Lengkap (RAL) yang bersifat eksperimen dan Non Faktorial dengan

menggunakan model persamaan :

Yij = µ + τi + εij ..................................(Yitnosumarto, 1991).

dimana : Yij = µg/ml glukosa yang dihasilkan oleh reaksi amilase + pati pada

perlakuan ke-i ulangan ke-j

µ = nilai tengah umum

τi = pengaruh perlakuan ke-i

εij = galat percobaan pada perlakuan ke-i ulangan ke-j

i = 1, 2, 3, 4,5,6 dalam hal ini adalah suhu perlakuan inkubasi yaitu


40, 50, 60, 65, 70 dan 80oC untuk perlakuan parameter suhu dan

pH4, 5, 6, 7, 8, 9 untuk perlakuan parameter pH substrat ( p)

j = 1,2,3 (n)

Hasil pengamatan karakterisasi makroskopis, mikroskopis dan uji biokimia

dipaparkan secara deskriptif, sedangkan hasil berupa data kuantitatif hasil uji

aktifitas enzim dianalisis varian. Bila didapatkan perbedaan nyata atau sangat

nyata dilanjutkan dengan Uji Duncan Multiple Range Test untuk melihat

perbedaan antar perlakuan yang dibuat (Yitnosumarto, 1991).


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Isolasi dan Seleksi Bakteri Amilolitik

Dari isolasi bakteri dari sampel air panas Penen didapatkan 22 isolat masing-

masing terdiri dari 5 isolat dari lokasi I (suhu 48oC, pH 6,8), 12 isolat dari lokasi II

(suhu 55oC, pH 6,8) dan 5 isolat dari lokasi III (suhu 57oC, pH 6,7). Masing-masing

isolat dimurnikan pada media agar pati 1% dan didapatkan hasil 2 isolat amilolitik

dari lokasi I, 10 isolat dari lokasi II dan 4 isolat dari lokasi III. Setiap isolat yang

dapat dimurnikan dianggap dapat menggunakan pati tetapi untuk memastikan

dilakukan uji iodin. Isolat yang mampu menghidrolisis pati menghasilkan zona

bening di sekeliling isolat setelah ditetesi iodin (Cappuccino, 1983). Sebelum

penetesan iodin dilakukan terlebih dahulu dilakukan karakterisasi morfologis dari

koloni, juga dibuat stok kultur untuk ke enam belas isolat yang tumbuh tersebut. Dari

hasil uji iodin didapatkan hasil enam belas isolat yang tumbuh itu semuanya dapat

menghidrolisis pati.

4.2. Karakterisasi Morfologis dan Uji Biokimia

Enam belas isolat bakteri yang teridentifikasi dapat menghidrolisis pati tersebut,

dikarakterisasi sifat morfologi dan biokimianya, hasil dapat dilihat pada Tabel 3 di

bawah ini:


Tabel 3. Karakter Morfologi dan Sifat Biokimia Isolat Bakteri Termofil Amilolitik Penen Sibirubiru Karakter morfologis Uji biokimia sederhana Kode Bentuk Tepi Elevasi Warna Bentuk/ G S T S G S K isolat koloni koloni koloni koloni tataan sel r p S I e C a a o I M l A t m r A a a a t l i a n se PN1 tidak beraturan berombak datar krem pseudobasil + + + + + - + mono, strepto PN2 bulat berombak datar putih pseudobasil + + + + + + + Mono,strepto PN3 tidak beraturan berombak naik krem pseudobasil - - + + + + + mono,diplo PN4 bulat berombak datar krem pseudobasil + + + + + + + mono, diplo PN5 tidak beraturan berombak datar krem pseudobasil + + + + + - + mono, diplo PN6 tidak beraturan rata datar krem pseudobasil + + - + + - - mono, diplo PN7 tidak beraturan rata naik krem pseudobasil + + + + + + - mono, diplo


Lanjutan Tabel 3 : PN8 bulat berombak datar krem pseudobasil - - + + + + - mono, diplo PN9 tidak beraturan berombak naik krem pseudobasil + + + + + + + mono, diplo PN10 tidak beraturan berombak datar krem pseudobasil mono, diplo - - + + + + + strepto PN11 tidak beraturan filamen datar krem pseudobasil - - + + + + + mono, strepto PN12 tidak beraturan filamen datar krem pseudobasil + + + + + + + mono, diplo PN13 tidak beraturan filamen datar krem pseudobasil + + + + + + - mono, diplo PN14 rizoid berlekuk datar Putih pseudobasil + + + + + - + Mono, diplo PN15 rizoid filamen datar krem Kokus/ + + + + + - - Mono, diplo PN16 bulat rata datar putih pseudobasil + + + + + - + Mono, diplo


Dari hasil pewarnaan gram terlihat isolat amilolitik Penen ini 15 berbentuk

batang pendek (pseudobasil) dan satu kokus. Untuk sifat gram 12 isolat gram

positif dan 4 isolat bersifat gram negatif. Duabelas dari 16 isolat dapat

membentuk endospora, sehingga diduga sebagian besar yang berbentuk basil,

gram positif dan endospora positif dan katalase positif tersebut berasal dari genus

Bacillus. Bakteri jenis ini mampu bertahan hidup dalam bentuk sel vegetatifnya

sampai suhu 70oC, pada suhu yang lebih tinggi dari 70oC bakteri ini membentuk

endospora (Tarigan, 1988; Pelczar & Chan, 1988).

Hasil uji biokimia pada media Simon Citrat Agar menunjukkan 10 dari 16

isolat amilolitik Penen dapat menggunakan sitrat sebagai sumber karbonnya.

Kemampuan menggunakan sitrat ini ini ditandai oleh berubahnya warna media

SCA dari warna hijau menjadi warna biru (Cappuccino, 1983).

Hasil uji biokimia fermentasi karbohidrat dengan media TSIA

memperlihatkan 15 dari 16 isolat menunjukkan hasil positif dapat menggunakan

media TSIA sebagai sumber karbon. Limabelas isolat tersebut memperlihatkan

hasil fermentasi pada bagian atas berwarna merah dan bagian dasar kuning

sehingga dari sumber carbon yang tersedia isolat hanya dapat memfermentasi

glukosa untuk sumber energinya. Tidak ada di antara limabelas isolat tersebut

yang memproduksi H2S karena tidak terjadi pembentukan warna hitam pada

bagian dasar media setelah fermentasi 48 jam (Cappuccino, 1983).

Hasil uji motilitas dengan media SIM memperlihatkan 16 isolat tersebut

bersifat motil. Hal ini ditandai dengan adanya jejak pergerakan bakteri sesudah

media yang diinokulasi dengan isolat diinkubasi selama 3 hari.


Hasil uji gelatinase dengan media gelatin agar memperlihatkan 16 isolat

dapat menghidrolisis gelatin. Hal ini tampak dari bentuk media gelatin yang sudah

diinokulasi dan diinkubasi selama 3 hari lalu sesudah itu disimpan di kulkas

selama 30 menit ternyata tetap cair (Cappuccino, 1983).

Hasil uji katalase memperlihatkan 11 dari 16 isolat positif menghasilkan

katalase. Hal ini ditandai dengan munculnya gelembung oksigen dari permukaan

isolat ketika ditetesi dengan H2O2 (Cappuccino, 1983).

4.3. Hasil Seleksi Isolat Untuk Pengujian Aktifitas Enzim Amilase Kasar

Hasil pengujian hidrolisis pati secara semikuantitatif yang dilakukan

terhadap 16 isolat bakteri termofil amilolitik Penen didapatkan data sebagaimana

ditunjukkan oleh Gambar 4.1 di bawah ini serta pada Lampiran 9.

0

5

10

15

20

25

30

35

zon

a be

ning

(mm

PN1 PN2 PN3 PN4 PN5 PN6 PN7 PN8 PN9 PN10PN11PN12PN13PN14PN15PN16Isolat bakteri

Gambar 5. Diameter zona bening hasil hidrolisis pati oleh enzim amilase isolat bakteri termofil


Igarashi et al. (1998) berhasil mengisolasi bakteri termofilik penghasil

enzim amilase dengan aktifitas hidrolitik yang termasuk kriteria memiliki potensi

tinggi adalah yang zona beningnya > 26 mm, potensi sedang bila diameter zona

beningnya berkisar 14–26 mm dan potensi rendah bila diameter zona beningnya <

14 mm. Zona bening yang terbentuk di sekeliling isolat setelah ditetesi larutan

iodin menunjukkan bahwa isolat bakteri tersebut telah menghidrolisis pati di

bagian media pati tersebut (Cappuccino, 1983). Dengan demikian berdasarkan

kriteria potensi yang dibuat oleh Igarashi et al. (1998) dari 16 isolat bakteri

termofil amilolitik Penen tersebut 6 isolat berpotensi rendah yaitu PN10, PN13,

PN16, PN8, PN5 dan PN7. Potensi sedang dimiliki oleh 7 isolat yaitu PN2, PN12,

PN11, PN6, PN14, PN15, PN3 sedangkan yang berpotensi tinggi ada 3 isolat

yaitu PN4, PN1 dan PN9 seperti terlihat pada Gambar 6.

(A) (B) (C) Gambar 6. Tiga Isolat Terpilih Berdasarkan Diameter Zona Bening Uji Iodin. Setelah Inkubasi 72 jam: (A) Isolat PN1 (B) Isolat PN4 dan (C) Isolat PN9 Dari hasil uji hidrolisis zona bening dipilih tiga isolat terbesar zona

beningnya yaitu isolat PN9 (31,58 mm), PN1 (29,93 mm) dan PN4 (27,33 mm)

untuk diuji aktifitas enzim amilase kasarnya.


4.4. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktifitas Enzim Amilase Kasar

Dari hasil pengujian aktifitas enzim amilase kasar yang diperoleh dari

supernatan ketiga isolat terpilih, diperoleh data besar konsentrasi glukosa hasil

hidrolisis pati seperti pada Tabel 4 dan Lampiran 10

Tabel 4. Pengaruh suhu inkubasi terhadap aktifitas enzim amilase kasar isolat bakteri termofil

Isolat Suhu konsentrasi

glukosa Aktivitas enzim Notasi (°C) (µg/ml) (Unit/ml)per menit = 0.05

PN1 40 207.63 0.058 c 50 290.63 0.081 b 60 352.83 0.098 a 65 175.38 0.049 d 70 130.56 0.036 e 80 117.38 0.033 e

PN4 40 367.24 0.102 b 50 379.36 0.105 b 60 437.22 0.121 a 65 184.99 0.051 c 70 143.83 0.040 cd 80 129.19 0.036 d

PN9 40 211.19 0.059 c 50 275.31 0.076 b 60 328.37 0.091 a 65 351.69 0.098 a 70 181.35 0.050 d 80 165.78 0.046 d

Ket: Huruf yang sama pada notasi untuk masing-masing isolat menunjukkan pengaruh yang tidak berbeda nyata pada tingkat kepercayaan 95%.

Dari Tabel 4 di atas terlihat aktivitas amilase kasar isolat PN1 dan PN4 optimal

pada suhu 60oC. Aktivitas PN1 menurun hampir 48% bila suhu inkubasi


dinaikkan menjadi 65oC, demikian juga aktivitas PN4 menurun hampir 43% saat

suhu inkubasi dinaikkan menjadi 65oC. Aktivitas PN9 optimal pada suhu 65oC,

aktivitas enzim ini juga menurun sekitar 48% ketika suhu dinaikkan jadi 70oC.

Kisaran suhu optimum pada aktifitas enzim kasar dari ketiga isolat tersebut

didukung hasil penelitian sebelumnya yang pernah dilakukan terhadap berbagai

jenis enzim amilase dimana suhu optimum untuk enzim amilase dari

mikroorganisma termofil berkisar antara 50oC–70°C (Madi et al., 1987; Bessler et

al., 2003; Cordeiro et al., 2002). Beberapa spesies Bacillus yang termofil juga ada

ditemukan menghasilkan enzim amilase yang memiliki aktivitas optimum pada

suhu 80°C (Vihinen & Mantsala, 1990; Viara et al., 1993; Carvalho et al., 2008).

Dari aktivitas enzim amilase kasar ketiga isolat Penen tetap optimal pada suhu

60oC-650C, berarti ketiga jenis enzim ini memiliki sifat yang termofilik. Ketiga

jenis enzim amilase kasar tersebut memiliki kemampuan untuk tetap melakukan

aktivitas kataliknya sampai suhu 80oC, walaupun aktivitas tersebut mengalami

penurunan pada suhu yang lebih tinggi dari 60oC (Gambar 7.).

050

100150200250300350400450500

40 50 60 65 70 80

Suhu inkubasi (oC)

Kon

sent

rasi

glu

kosa

( µg

/ m

l)

PN1 PN4 PN9

Gambar 7. Pengaruh suhu inkubasi terhadap aktifitas enzim amilase kasar isolat bakteri termofil


Analisis varians pengaruh suhu inkubasi (Lampiran 10.1) menunjukkan

suhu inkubasi mempengaruhi aktivitas enzim amilase kasar isolat PN1. Uji

Duncan pada Tabel 4 memperlihatkan suhu inkubasi dinaikkan dari dari 40oC

sampai 70oC berpengaruh nyata terhadap aktivitas enzim amilase kasar isolat PN1

tetapi peningkatan suhu inkubasi dari 70oC menjadi 80oC menunjukkan hasil

yang tidak berbeda nyata.

Suhu inkubasi juga berpengaruh terhadap aktivitas enzim amilase kasar

isolat PN4 (Lampiran 10.2). Suhu inkubasi menunjukkan pengaruh yang berbeda

nyata untuk kenaikan suhu dari 40oC hingga 60oC, tetapi kenaikan suhu dari 60oC

hingga 80oC tidak menunjukkan aktivitas yang berbeda nyata. Pada amilase kasar

isolat PN4 perubahan suhu dari 65oC - 80oC juga tidak berbeda nyata seperti

ditunjukkan pada Tabel 4.

Suhu inkubasi juga berpengaruh terhadap aktivitas enzim isolat PN9 ketika

dilakukan Analisa Varian seperti pada Lampiran 10.3 Uji pengaruh variasi suhu

seperti pada Tabel 4 menunjukkan jika kenaikan suhu inkubasi dari 40oC – 60oC

menunjukkan aktivitas yang berbeda nyata, tetapi kenaikan suhu dari 60oC

menjadi 65oC tidak menunjukkan hasil yang berbeda nyata. Aktivitas kembali

berbeda bila suhu dinaikkan dari 60oC menjadi 70oC, tetapi kenaikan suhu dari

70oC menjadi 80oC tidak menunjukkan perbedaan nyata.

Bila dibandingkan aktivitas amilase kasar berdasarkan variasi suhu

inkubasi enzimatik dari ke tiga isolat Penen tersebut maka dengan masa inkubasi

selama 20 menit pada suhu 60oC enzim amilase PN4 ternyata menghasilkan

glukosa terbanyak (437,22 µg/ml) dibandingkan enzim amilase PN1 (352,84


µg/ml) dan amilase PN9 (328,37 µg/ml), tetapi pada suhu inkubasi enzimatik

yang tertinggi digunakan dalam penelitian ini yaitu suhu 80oC enzim amilase

PN10 menghasilkan glukosa terbanyak yaitu 165,78 µg/ml, PN4 (129,19 µg/ml)

dan PN1 (117,38 µg/ml). Dengan demikian terlihat jika amilase PN9 relatif lebih

toleran terhadap suhu tinggi.

Berdasarkan hasil yang diperoleh aktivitas enzim amilase kasar dari isolat

bakteri termofil Penen lebih tinggi dibandingkan oleh aktivitas amilase kasar yang

didapatkan dari isolat bakteri termofil yang berasal dari lumpur panas Lapindo

(Junaidi, 2008) yang pada suhu inkubasi 40oC hanya berkisar antara 135 - 75

µg/ml. Aktivitas amilase kasar isolat Penen ini menunjukkan aktivitas yang lebih

tinggi dibandingkan aktivitas amilase kasar dari Thermus sp. (Fu-Shaw et al.,

1995) yang besarnya 3,5 unit/ml untuk masa inkubasi 1 jam (0,058 Unit/ml untuk

per menit ) pada suhu inkubasi 60oC ataupun yang pernah didapatkan dari amilase

kasar isolat limbah buangan pabrik ubi oleh Oboh (2005) yang besarnya 2,2

unit/ml untuk masa inkubasi 30 menit (0,07 Unit/ ml per menit).

Mikroorganisma termofil dapat menghasilkan enzim yang memiliki

aktivitas pada suhu yang tinggi melebihi enzim dari mikroorganisma mesofil

karena 3 komponen perlengkapan yang dimiliki oleh mikroorganism termofil itu

sendiri pertama berupa protein yang tetap stabil, tahan terhadap denaturasi dan

proteolisis (Kumar & Nussinov, 2001). Protein ini dikenal dengan nama

Chaperonins yang dapat membantu mikroorganisma termofil mengembalikan

fungsi aktivitas enzimnya bila terdenaturasi oleh suhu yang tinggi (Everly &

Alberto, 2000). Kelebihan kedua mikroorganisma termofil memiliki membran sel


yang terbuat dari struktur lipid yang resisten terhadap suhu tinggi sehingga

mampu untuk hidup di lingkungan bersuhu tinggi (Herbert & Sharp, 1992; de

Rosa et al., 1994). Komponen ketiga yang dimiliki oleh mikroorganisma termofil

adalah suatu struktur DNA yang disebut Reverse DNA Gyrase yang menghasilkan

suatu bentuk superkoil yang bermuatan positif sehingga DNA memiliki titik leleh

yang lebih tinggi dari pada titik leleh DNA pada mikroorganisma non termofil.

Selain kemampuan mikroorganismanya maka enzim termofil ini juga memiliki

perangkat genetik yang membuatnya memiliki daya katalis pada suhu tinggi.

Perangkat genetik tersebut menyangkut komposisi asam amino arginin dan tirosin

yang meningkat pada protein enzimnya, jumlah ikatan hidrogen dan salt bridge

yang meningkat pada struktur protein enzimnya dan struktur komformasi -helix

dari protein enzim (Kumar et al., 2000).

4. 5. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar Dari hasil pengujian aktivitas enzim amilase kasar yang diperoleh dari

supernatan ketiga isolat terpilih, diperoleh hasil konsentrasi glukosa hasil

hidrolisis pati seperti terlihat pada Tabel 5 dan Lampiran 10.4-10.6


Tabel 5. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar Isolat Bakteri Termofil

Isolat pH konsentrasi

glukosa Aktivitas enzim Notasi (µg/ml) (Unit/ml per menit) = 0.05

PN1 4,0 75.68 0.021 e 5,0 122.79 0.034 d 6,0 157.09 0.044 c 7,0 188.65 0.052 ab 8,0 203.28 0.056 a 9,0 172.6 0.048 bc

PN4 4,0 117.53 0.033 c 5,0 180.41 0.050 b 6,0 224.78 0.062 a 7,0 176.98 0.049 b 8,0 117.07 0.033 c 9,0 94.2 0.026 d

PN9 4,0 267.31 0.074 bc 5,0 285.6 0.079 b 6,0 350.09 0.097 a 7,0 390.11 0.108 a 8,0 239.18 0.066 c 9,0 134.91 0.037 d

Keterangan: Huruf yang sama pada notasi dari masing-masing isolat menunjukkan pengaruh yang tidak berbeda nyata pada tingkat kepercayaan 95%. Amilase dari isolat PN1 menunjukkan aktivitas optimumnya pada pH 8.

Aktifitas optimum pada pH 8,0 pernah diteliti sebelumnya pada amilase dari isolat

Bacillus sp strain SMIA-2 (Carvalho et al., 2008) juga pada amilase dari isolat

Bacillus sp KSM-K38 yang memiliki rentang pH optimumnya 8,0-9,5. Bahkan

pada pH 10,0 aktivitas optimumnya masih mencapai 50% (Hagihara et al., 2001).

Aktifitas enzim PN1 meningkat mulai dari pH 4 sampai pH 8 hal ini menunjukkan

jika amilase isolat PN1 lebih cocok digunakan pada pH lingkungan yang sifatnya


alkalis. Aktivitas enzim amilase PN1 ini juga dipengaruhi oleh suhu ketika

dilakukan Analisa Varian (Lampiran 10.4). Uji Duncan (Tabel 5.)menunjukkan

enzim amilase isolat PN1 aktifitasnya pada pH 4,0 hingga pH 7,0 terus

mengalami peningkatan dan peningkatan pH itu menghasilkan aktivitas yang

masing-masing berbeda nyata, tetapi tidak ada perbedaan nyata untuk aktivitas

enzim ketika pH menjadi pH 8,0 maupun pada pH 9,0.

Dari data yang diperoleh ternyata enzim amilase kasar isolat PN4 aktivitas

optimumnya berada pada pH 6,0. Aktivitas optimum di pH 6,0 ini juga dijumpai

pada enzim amilase dari isolat bakteri Thermus sp. (Fu-Shaw et al., 1995), dan

enzim dari isolat limbah pabrik tapioka (Oboh, 2005). Aktivitas amilase isolat

PN4 ini meningkat mulai dari pH 4–6 tetapi mulai mengalami penurunan sekitar

21% ketika pH menjadi 7. Penurunan aktivitas terus terjadi sampai pH 8, dengan

aktivitas enzimnya menurun sebesar 58% dibandingkan pada saat aktivitas

optimumnya. Analisis varians menunjukkan pH berpengaruh sangat nyata pada

aktivitas amilase PN 4 (Lampiran 10.5). Uji Duncan (Tabel 5.) menunjukkan

aktivitas enzim pada pH 4,0 tidak berbeda nyata dengan aktivitas enzim pada pH

8,0, demikian juga dengan aktivitas enzim pada pH 5,0 tidak berbeda nyata

dengan pada pH 7,0.

Isolat PN9 menghasilkan enzim amilase kasar yang aktifitas optimumnya

pada pH 7,0. Aktivitas optimum pada pH ini pernah ditemukan pada enzim

amilase dari isolat Clostridium thermosulforogenes (Swamy & Seenayya, 1996),

juga pada isolat Bacillus licheniformis (Haq et al., 2005), juga pada amilase dari

isolat Bacillus amyloliquefaciens (Syu & Chen, 1997). Aktivitas amilase isolat


PN9 ini menunjukkan peningkatan dari pH 4,0 sampai pH 7,0, tetapi mulai terjadi

penurunan sebesar 38% ketika pH meningkat menjadi 8. Aktivitas terus menurun

sebesar 65 % dari aktivitas optimumnya dengan peningkatan pH sampai 9,0. pH

substrat berpengaruh nyata terhadap aktivitas enzim amilase kasar isolat PN9

(Lampiran 10.6). Uji Duncan (Tabel 5.) menunjukkan aktivitas enzim amilase

kasar PN9 berbeda nyata ketika pH substrat berubah dari pH 5,0 menjadi 6,0 dan

pada pH 8,0 serta 9,0 aktifitas juga menunjukkan hasil yang berbeda nyata. Hal ini

menunjukkan enzim amilase dari isolat PN9 ini lebih cocok digunakan pada pH

yang cenderung netral untuk mendapatkan hasil yang optimum.

Pengaruh pH terhadap aktivitas amilase kasar ketiga isolat tersebut dapat

dilihat pada Gambar 8 di bawah ini

Gambar 8. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar Isolat Bakteri Termofil Dari grafik terlihat jika pada pH yang paling rendah (pH4) aktivitas

amilase terbesar untuk 20 menit masa inkubasi tenyata PN9 menghasilkan glukosa

terbanyak (267,31 µg/ml) dibandingkan enzim amilase PN4 (117,53 µg/ml) dan

050

100150200250300350400450

4 5 6 7 8 9

pH

Kon

sent

rasi

glu

kosa

(µg/

ml)

PN1 PN4 PN9


amilase PN1 (75,68 µg/ml), tetapi pada pH yang paling tinggi (pH9) aktivitas

enzim amilase PN10 menghasilkan glukosa terbanyak yaitu 172,60 µg/ml, PN1

(134,91 µg/ml) dan PN4 (94,20 µg/ml). Dengan demikian terlihat jika amilase

PN9 relatif lebih toleran terhadap lingkungan pH asam dibandingkan amilase PN1

yang lebih toleran terhadap lingkungan yang bersifat alkalis.

Bila dibandingkan dengan tempat hidup alami dari isolat Penen ini yang

berkisar pada pH 6,7-pH 6,8 maka kemampuan enzim untuk melakukan aktifitas

kataliknya yang optimum tidak berbeda jauh dengan kondisi pH pada pengujian di

laboratorium dimana pH optimum PN4 pH optimumnya 6,0, PN9 optimum pada

pH 7,0, tetapi PN1 ternyata memiliki sifat alkalitoleran yang cukup baik untuk

aktifitas optimumnya pada pH 8,0.

Secara keseluruhan enzim amilase kasar ketiga isolat Penen ini masih dapat

melakukan aktifitas kataliknya dari pH 4,0 juga sampai pH 9,0. Hal ini terjadi

karena mikroorganisma dari kelompok termofil umumnya memiliki kelengkapan

sel yang lebih baik agar dapat hidup lebih toleran terhadap perubahan pH

lingkungan. Kelengkapan sel ini terutama dijumpai pada muatan ion yang tinggi

pada membran selnya yang berhubungan dengan kemampuannya

mengembangkan daya toleransi menghadapi peningkatan pH lingkungan

(Ulukanli, 2002) yang ekstrim. Mikroorganisma ekstremofil ini juga umumnya

menghasilkan enzim yang sifatnya toleran menghadapi perubahan pH lingkungan

reaksi kimia kataliknya.


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5. 1. Kesimpulan

Dari hasil penelitian yang telah dilakukan tentang aktivitas amilase kasar dari

isolat bakteri sumber air panas Penen Sibirubiru dapat disimpulkan:

1. Sumber air panas Penen Sibirubiru memiliki isolat bakteri termofil yang

berbeda-beda karakter morfologi demikian juga biokimianya dan sebanyak 16

isolat bakteri tersebut ternyata menghasilkankan enzim amilase.

2. Terdapat perbedaan aktivitas hidrolitik di antara isolat bakteri termofil amilolitik Penen tersebut dalam mendegradasi amilum pada media agar pati.

Tiga isolat terbesar untuk zona bening hidrolisis pati didapatkan pada isolat

PN9 (31,58 mm), PN1 (29,93 mm) dan PN4 (27, 33 mm).

3. Tiga isolat terpilih memperlihatkan aktifitas enzim yang berbeda-beda pada

pengaruh suhu inkubasi demikian juga pada pengaruh pH.

4. Aktifitas PN1, PN4 dan PN9 dalam menghidrolisis pati optimum pada suhu

60o-65oC. Pada suhu 60oC amilase PN4 menghasilkan glukosa terbanyak (437,

22 µg/ml) tetapi peningkatan suhu dari 65o-80oC menunjukkan amilase PN9

memiliki aktifitas tertinggi diantara ketiga enzim amilase terpilih meskipun

konsentrasi glukosa yang dihasilkan semakin menurun (351,69 µg/ml-165,78

µg/ml).

5. pH memiliki pengaruh yang berbeda terhadap aktifitas optimum enzim amilase

dari ketiga isolat tersebut. PN1 aktifitas optimumnya pada pH yang alkalis


yaitu pada pH 8,0 (203,28 µg/ml), PN 4 pada pH 6,0 (224,78µg/ml) dan PN9

pada pH 7 (390,11µg/ml). Pada pH yang paling rendah digunakan (pH4)

amilase PN9 memiliki aktifitas tertinggi (267,31µg/ml)dibandingkan amilase

PN1 dan PN4, tetapi untuk pH tertinggi yang digunakan (pH 9,0) amilase

PN1 memiliki aktifitas tertinggi menghidrolisis pati (172,60 µg/ml).

5. 2. Saran

Enzim amilase dari isolat PN1, PN4 dan PN9 ini memiliki aktivitas enzim

kasar yang cukup potensial dilihat dari kemampuan aktivitasnya pada suhu

inkubasi yang cukup tinggi dan pada pH yang berkisar netral, tetapi aktivitas ini

masih perlu diteliti lebih lanjut untuk melihat interaksi antara suhu dan pH juga

pengaruh faktor eksternal lainnya untuk mendapatkan data yang lebih baik lagi

tentang potensi aktivitas enzim amilase isolat Penen tersebut. Perlu dilakukan juga

penelitian lanjut untuk aktivitas enzim ini pada tingkat yang lebih murni sehingga

potensi enzim amilase isolat Penen ini dapat diketahui datanya lebih jelas dan

dapat diketahui kemampuan yang dimiliki enzim amilase tersebut untuk

digunakan pada bidang aplikatif.


DAFTAR PUSTAKA Aiyer PV. 2005. Amylases and their applications. African Journal of Biotechnology. 4: 125–1529. Ajayi OA & Fagade EO. 2007. Heat activation and stability of amylase from Bacillus species. African Journal of Biotechnology. 6: 1181–1184. Alexander M. 1977. Introduction to soil microbiology. John Wiley & Son. p.191. Al-Qodah Z, Daghstani H, Geopel & Lafi W. 2007. Determination of kinetic parameters of -Amylase producing thermophile Bacillus sphaericus. African Journal of Biotechnology. 6: 699–706. Bailey MJ. 1988. A note on the use to dinitrosalicyclic acid for determining the products of enzymatic reaction. App. Microbiol. Biotechnol. 29: 494 – 496. Benson HJ. 1994. Microbiological applications. Win C. Brown Publication. Bernfeld. 1951. Enzyme of starch degradation and synthesis. In: Advance in Enzymology. Interscience Publications. Inc. New York. Bessler C, Schmitt J, Maurer KH & Schmitt RD. 2003. Directed evolution of bacterial -amylase: Toward enhance pH- performance and higher specific activity, Protein Science 12: 2141– 149. Biology Amylase Lab. http://departement.oxy/edu/test/Amylase. (12 April 2008). Brock TD & Brock KM. 1978. Basic microbiology with application. 2nd edition. Prentice Hall, Inc, New Jersey. p.583. Brock TD. 1978. Thermophillic microorganisms and life at high temperatures. Springer–Verlag, New York. Brock TD. 1986. Thermophiles: General, Molecular. 2nd Applied Microbiology. A Willey Interscience Publication. Cappucino JG. 1983. Microbiology: A Laboratory Manual. Addison Wesley Publishing Company.


Carolina M, Pereira N & Andrade A. 1999. Thermophilic microorganism and their polymer–hidrolytic enzyme. Brazilian Archives of Biology and Technol. 12: 12-130. Cordeiro CA, Martin ML & Luciano AB. 2002. Production and properties of -amylase from thermophilic Bacillus sp. Brazilian Journal of Microbiology. 33: 57– 61. De Carvalho RV, Correa T & da Silva J. 2008. Properties of an amylase from thermophillic Bacillus sp. Brazillian Journal of Microbiology. 39: 102-107. De Rossa M, Gambacorta A & Gliozzi A. 1986. Structure, Biosynthesis and Physicochemichal Properties of Archaebacterial Lipids. Microbiological Reviews. 50: 70-80. De Rossa M, Morana A, Riccio A, Gambacorta A, Trincone A & Incani, O. 1994. Lipid of the archaea: a new tool for bioelectronic. Biosens. Bioelectr. 9: 669– 675. Dwidjoseputro D. 1989. Dasar – Dasar Mikrobiologi. Djambatan. Jakarta. Erickson HM. 1992. Usage recommendations for -amylase: maximizing enzyme activity while minimizing enzyme-artifact binding residues. The 1992 Book And Paper Group Annual.p. 24–33. Everly C & Alberto J. 2000. Stressors, stress and survival: overview. Front Bioscience. 5: 780–86. Fu Shaw J., Fu Pang L & Chiu Chen S. 1995. Purification and properties of an extracellular -amylase from Thermus sp. Bot. Bull. Acad. Sin. 36: 195-200. Hagihara H, Igarashi K & Hayashi Y. 2001. Novel -amylase that is highly Resistant to chelating reagents and chemical oxidants from the Alkaliphilic Bacillus Isolate KSM-K38. Applied and Environmental Microbiology. 67: 1744–1750. Haki GD & Rakshit SK. 2003. Developments in industrially importants thermostable enzymes: a review. Bioresource Technol. 89: 17- 34. Haq I, Ashraf H, Qadeer MA & Iqbal J.2005. A source of alpha amylase production by Bacillus licheniformis. Bioresource Technol. 96: 1201-1204.


Hartuti MS. 2006. Isolasi dan Karakterisasi Bakteri Termofilik Penghasil Enzim Amilase dari kawasan wisata Pemandian Air Panas Pawan-Roka Hulu. Skripsi. Unversitas Riau. Herbert R & Sharp R.1992. Molecular Biology and Biotechnology of Extremophiles. Chapman and Hall, New York. Hibino Y, Nosoch Y & Samejima J. 1974. Structur stabillity relationship in proteins: new approach to stability enzymes. Biochem. 75: 553–561. Holt JG. 1994. Bergey’s manual of determinative bacteriology. William & Wilkins, United Stated of Amerika. Hyun HH. & Zeikus JG. 1985. General biochemial characterization of thermostable extracellular ß-amylase from Clostridium thermosulfurogenes. Appl Environ Microbiol. 49: 1162–167. Igarshi YH, Hiroshi H, Katsuhisha S & Mikio S. 1998. Enzymatic properties of a novel liquefying-amylase from an alkaliphilic Bacillus Isolate and entire nucleotida and amino acid sequences. Appl Environ Microbiol 64: 3282–3289. Illanes A. 1999. Stability of biocatalysts. Electronic Journal of Biotechnology. 2: 1-9. Junaidi HM. 2008. Deteksi produksi Amilase. http://www.blogger.com/profile/. <1 Juni 2008)> Kombong H . 2004. Evaluasi daya hidrolitik enzim glukoamilase dari filtrat kultur Aspergillus niger. Jurnal Ilmu Dasar. 5: 16–20. Kumar S & Nussinov R. 2001. How do thermophillic protein deal with heat ? A review. Cell. Moll. Life Sci. 58: 1216– 233. Liu Q. 2005. Understanding Starch and Their Role in Foods. Taylor & Francis Group, LLC. Madi E, Antranikian G, Ohmiya, K & Gottschalk. 1987. Thermostable amylolytic enzyme from a new Clostridiumisolates . Appl Environ Microbiol. 53: 1661-1667. Maier RM, Pepper IL & Gerba CP. 2000. Environmental Microbiology. Academic Press. London.


Maxwell A. 1999. DNA Gyrase and the mechanism of DNA supercoiling. Dept. Biochemistry of Leichester . Mohan C. 2003. Buffers. EMD Bioscience Calbiochem. Germany. Morrison LE & Tanner FW. 1921. Aerobic thermophilic bacteria from water in studies on thermophilic bacteria. Journal Bacteriol. p. 343–366. Muchtadi S, Nurleni & Made. 1992. Enzim dalam Industri Pangan. Institut Pertanian Bogor. Murray RK, Granner DK, Mayes PA & Rodwell VW. 2003. Biokimia Harper. ECC Penerbit Buku Kedokteran. Jakarta. Nickerson WJ & Brown RG. 1965. Advanced in Applied Microbiology. Academic Press. 7: 275. Oboh G. 2005. Isolation and Characterization of amylase from fermentedcassava (Manihot esculenta Crantz) waste water. African Journal of Biotechnology. 4: 1117–1123. Palmer T. 1985. Understanding Enzyme. Ellishorwood Publisher. Pandey A, Nigam P, Soccol CR, Soccol VT, Singh D & Mohan R. 2000. Advance In microbial amylases. Biotechnol. Appl. Biochem.31: 135–152. Pelczar MJ & Chan EC. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi. Universitas Indonesia Press. Poedjiadi A. 1994. Dasar – dasar Biokimia. Penerbit Universitas Indonesia. Poernomo AT & Purwanto DA. 2003. Uji aktifitas crude enzim proteolitik Bacillus subtilis FNCC 0059 hasil fermentasi curah. Majalah Farmasi Airlangga. 3: 103–107. Properties of enzymes isolated from thermophilic microbes. http://www.osmania.ac.in/Microbiology. <12 Oktober 2007> Rath CC & Subramanyam VR. 1998. Isolation of thermophilic bacteria from hot spring of Orissa, India. Geobios. 25: 113-119.


Reddy NS, Nimmagadda A & Rao KR. 2003. An overview of themicrobial -Amylase family. African Journal of Biotechnology. 2: 645–648. Rothschild LJ & Mancinelli RL. 2001. Life in extreme environments. Nature. 409: 1092-1011. Sale BS. 1961. Fundamental Principles of Bacteriology. Mc. Graw Hill Book Company, Inc. Santos EO & Martin ML. 2003. Effect of the Medium Composition on Formation of Amylase by Bacillus sp. Brazilian Archives of Biology and Technology. 46: 129–134. Silva T, Tony M, Derlene A & Carvalho, AF. 2005. Production of Saccharogenic and Dextinogenic Amylases by Rhizomucor pusilus A 13.36. The Journal of Microbiology. 43: 561 – 568. Singleton R & Amelunxen RE. 1973. Proteins from Thermophilic Microorganism. Bacteriological Review. 37 : 320–342. Sivaramakrishnan S, Gangadharan D, Nampoothiri KD, Sossol CR & Pandey A.2006. α-amylase from microbial sources- An overview on recent developments. Food. Technol. Biotechnol. 44: 173-184. Swammy MV, Saerami N & Seenayya G. 1994. β-amylase from Clostridium thermocelluum SS8 a thermophillic, anaerobic, cellulolytic bacterium. Lett. App. Microbial.18: 301–304. Swammy MV & Seenayya G. 1996. Thermostable Pullulanase and -amylases activity from Clostridium thermosulforogenes SV9 Optimization of Culture condition for enzyme productions. Process Biochem. 157– 162. Syu MJ & Chen YH. 1997. A study on the -amylase fermentation perfomed by Bacillus amyloliquefaciens. Chem. Eng. Journal. 65: 237–247. Tarigan J. 1988. PengantarMikrobiologi. Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Pengembangan Lembaga Pendidikan Tenaga Kependidikan. Thiel T. 1999. Introduction to Bacteria. In Science in The Real World. Dept. of Biology Univ. of Missouri –St. Louis.


Viara N, Elena P & Elka I. 1993. Purification and Characterization of thermostable Bacillus stearothermophilus alpha - amylase. Biotechnol. Appl. Biochem. 12: 427- 435. Vieille C & Zeikus G. 2001. Hyperthermophilic Enzymes: Source, Uses, and Molecular Mechanism for Thermostability. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 65: 1–43. Vihinen M & Mantsala P. 1990. Characterization of an thermostable Bacillus stearothermophilus alpha-amylase. Biotechnol. App. Biochem. 12: 427-433. Walter WW & Nagesh S. 1965. Microbial Amylases. Advanced in Applied Microbiology. Academic Press. 7: 273–304. Yitnosumarto S. 1991. Percobaan: Perancangan, Analisis danInterpretasinya. P.T. Gramedia Pustaka Utama, Jakarta.


LAMPIRAN


LAMPIRAN 1. Isolasi Bakteri Dari Sampel Air Panas

Dipipet 0,1 ml

Disebar pada media agar selektif termofil Diinkubasi pada suhu 65°C selama 48 jam

Tiap isolat berbeda diambil satu ose Digores pada media agar selektif amilase (media agar + pati) Diinkubasi 24 jam pada suhu 65°C

Ditetesi larutan iodin

Bla terdapat zona bening pada media berarti pati dipecah oleh enzim amilase bakterial (pati + iodin berwarna biru kehitaman)

`

Sampel air panas Penen

Kultur campuran bakteri termofil isolat air panas Penen

Kultur murni bakteri termofil amilolitik isolat air panas Penen

Bakteri termofil penghasil enzim amilase isolat air panas Penen


LAMPIRAN 2. Uji Adanya Produksi Enzim Amilase Oleh Isolat Bakteri

tiap isolat tunggal

Diambil dengan ose Masukkan dalam larutan fisiologis divortex Disamakan keruhnya dengan larutan Mac Farland 108

Dipipet 5 µl Masukkan dalam media Agar+pati1% inkubasi 72 jam 65°C

isolat bakteri tumbuh

Ditetesi larutan iodin

menghasilkan zona zona bening

zona bening diukur dengan jangka sorong dipilih 3 yang terbesar zona beningnya

hasil pengenceran

isolat menghasilkan enzim amilase


LAMPIRAN 3. Karakterisasi Isolat Bakteri Penghasil Enzim Amilase

Isolat tunggal bakteri Penghasil enzim amilase

Karakteristik makroskopis

Karakteristik mikroskopis

Karakteristik biokimia sederhana

- Warna koloni - Bentuk koloni dari permukaan - Bentuk koloni dilihat dari samping - Tepi koloni dilihat dari atas

- Pewarnaan gram - Bentuk sel - Penataan sel - Pewarnaan spora

- Uji katalase - Uji Sitrat - Uji TSIA - Uji SIM - Uji gelatinase

Hasil pengamatan


LAMPIRAN 4. Produksi Enzim Amilase Dan Ekstraksi Enzim Dari Kultur

Diambil satu ose Dilarutkan dalam media produksi amilase yang sudah disterilisasi Diinkubasi pada suhu 65°C selama 72 jam pada shaker waterbath kecepatan 150 rpm

Disentrifuge selama 20 menit Kecepatan 6000 rpm Supernatan disedot pelan dengan mikropipet, supernatan ini adalah bagian yang mengandung enzim kasar amilase

Isolat tunggal penghasil amilase

Kultur bakteri dengan produksi enzim amilase

Supernatan yang mengandung amilase kasar

Uji pengaruh suhu inkubasi & pH substrat terhadap aktivitas amilase kasar


LAMPIRAN 5. Pembuatan Larutan Standar Glukosa

`

Dididihkan selama 5 menit

dinginkan dengan air mengalir selama 15 menit

ditambah aquabidest 20 ml

diabsobansi pada panjang gelombang 540 nm dengan spektrofotometer

Dibuat larutan glukosa 1000 µg/ml sebanyak 100 ml

Diencerkan menjadi berbagai konsentrasi dari 80–260 µg/ml

Tiap konsentrasi dibuat dalam tabung reaksi berbeda masing-masing 1 ml lalu tiap tabung ditambah reagen DNS 1,5 ml

Kurva standart glukosa


LAMPIRAN 6. Pengukuran Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar

Diambil 1 ml Masukkan ke tabung reaksi Tambahkan 1% larutan pati dalam larutan sitrat buffer fosfat pada pH 6,5 Diinkubasi pada waterbath suhu 40°C, 50°C, 60°C, 65°C, 70°C dan 80°C selama 20 menit Setelah 20 menit reaksi dihentikan dengan menambah 2 ml reagen DNS ke dalam tiap tabung reaksi Dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit Didinginkan dengan air mengalir selama 15 menit Ditambah 20 ml aquabidest Determinasi intensitas warnanya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm. Diplotkan dengan larutan standart glukosa

Ekstrak amilase dari supernatan

Data hasil pengujian


LAMPIRAN 7. Pengukuran Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Kasar

Diambil 1 ml Masukkan ke tabung reaksi Tambahkan 1% larutan pati dalam larutan sitrat buffer fosfat pada variasi pH 4,0, pH 5,0, pH 6,0, pH 7,0, pH 8,0, pH 9,0 pH 7,0, pH 8,0, pH 9,0 Diinkubasi pada waterbath suhu 65°C selama 20 menit Setelah 20 menit reaksi dihentikan dengan menambah 2 ml reagen DNS ke dalam tiap tabung reaksi Dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit Didinginkan dengan air mengalir selama 15 menit Ditambah 20 ml aquabidest Determinasi intensitas warnanya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm. Diplotkan dengan larutan standart glukosa


Ekstrak kasar amilase dari isolat terpilih


LAMPIRAN 8. Pembuatan Larutan Blanko Diambil 2ml Dipanaskan hingga mendidih selama 20 menit Ditambah larutan pati 1% dalam sitrat buffer fosfat sampai pH 6,5 Diinkubasi 20 menit pada variasi suhu 65°C Setelah 20 menit reaksi dihentikan dengan menambah 2 ml reagen DNS ke dalam tiap test tube Dipanaskan hingga mendidih selama 5 menit Didinginkan 15 menit dengan air mengalir Ditambah 20 ml aquabidest

Determinasi intensitas warnanya pada spektrofotometer dengan panjang gelombang 540 nm.


Ektrak kasar enzim amilase


LAMPIRAN 9. Hasil Uji Diameter Zona Bening Hidrolisa Pati

Isolat Diameter(mm) Urutan terbesar

PN1 29.93 2 PN2 14.55 10 PN3 20.88 4 PN4 27.33 3 PN5 13.56 12 PN6 15.95 7 PN7 13.85 11 PN8 12.96 13 PN9 31.58 1

PN10 11.33 16 PN12 14.85 9 PN13 11.63 15 PN14 18.42 6 PN15 18.9 5 PN16 12.3 14


LAMPIRAN 10. Analisis Varians Untuk Aktifitas Enzim Tabel 1. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Termofil Kasar dari Isolat Bakteri Termofil Penen PN1

SK db JK KT F hit

F.05=3,11

perlakuan F.01=5,06 5 128883.84 25776.77

Galat Percob. 12 2402.16 200.18

Total 17 128.77 **

KK = 0.0666117 x 100% 6.66%

Tabel 2. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Termofil Kasar dari Isolat Bakteri Termofil Penen PN4

SK db JK KT F hit

F.05=3,11 perlakuan F.01=5,06

5 276812.28 55362.46 Galat Percob.

12 7588.82 632.40 Total

17 87.54 **

KK = 0.0008759 x 100% 8.760%


Tabel 3. Pengaruh Suhu Inkubasi Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Termofil Kasar dari Isolat Bakteri Termofil Penen PN9

SK db JK KT F hit

F.05=3,11 perlakuan F.01=5,06

5 91215.2697 18243.05 Galat Percob.

12 1781.59 148.47 Total

17 122.88 **

KK = 0.0482981 x 100% 4.82%

Tabel 4. Pengaruh pH Terhadap Aktivitas Enzim Amilase Termofil Kasar dari Isolat Bakteri Termofil Penen PN1

SK db JK KT F hit

F.05=3,11 perlakuan F.01=5,06

5 91215.2697 18243.05 Galat Percob.

12 1781.59 148.47 Total

17 122.88 ** KK = 0.0482981 x 100% 4.82%



SK db JK KT F hit

F.05=3,11 perlakuan F.01=5,06

5 1283.60 7485.93 Galat Percob.

12 21.41 52.04 Total

17 143.86 ** KK = 0.0475116 x 100% 4.75%


SK db JK KT F hit

F.05=3,11 perlakuan F.01=5,06

5 4106.87418 23951.29 Galat Percob.

12 175.113939 425.53 Total

17 56.29 **

KK = 0.0742378 x 100% 7.42%


LAMPIRAN 11. Kurva Standar Glukosa


LAMPIRAN 12. Foto-Foto Pewarnaan Bakteri Isolat Penen

Foto 1. Pewarnaan Gram Isolat PN9 dengan Perbesaran 600x (12,5 x 40 ) Gram positif bentuk pseudobasil

Foto 2. Pewarnaan Gram Isolat PN4 dengan Perbesaran 600x (12,5 x 40 ) Gram


positif bentuk pseudobasil

Foto 3. Pewarnaan Gram Isolat PN1 dengan Perbesaran 600x (12,5 x 40 ) Gram positif bentuk pseudobasil

Foto 4. Pewarnaan Spora PN4 / SP5, dengan Perbesaran 600x (12,5 x 400)


Foto 5. Pewarnaan Spora PN1/Sp1 dengan Perbesaran 600x (12,5 x 40)

Foto 6. Pewarnaan Spora PN9/SP10 dengan Perbesaran 600x (12,5 x 40)


isolasi bakteri dan uji aktivitas amilase termofil

Documents