isolasi dan identifikasi molekuler bakteri …repository.unimus.ac.id/2717/2/manuscript.pdfisolasi...
TRANSCRIPT
1
*Corresponding Author :
Nining Mony
Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semrang 50273
E-mail: [email protected]
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI
PENGHASIL ENZIM PROTEASE PADA TEMPE GEMBUS PASCA
FERMENTASI 48 JAM BERDASARKAN ANALISIS GEN 16S rRNA
Manuscript
Disusun oleh :
Nining Mony
G1C217189
PROGRAM STUDI D IV ANALIS KESEHATAN
FAKULTAS ILMU KEPERAWATAN DAN KESEHATAN
UNIVERSITAS MUHAMMADIYAH SEMARANG
2018
http://repository.unimus.ac.id
2
*Corresponding Author :
Nining Mony
Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semrang 50273
E-mail: [email protected]
1
http://repository.unimus.ac.id
3
*Corresponding Author :
Nining Mony
Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semrang 50273
E-mail: [email protected]
2
http://repository.unimus.ac.id
4
*Corresponding Author :
Nining Mony
Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semrang 50273
E-mail: [email protected]
ISOLASI DAN IDENTIFIKASI MOLEKULER BAKTERI
PENGHASIL ENZIM PROTEASE PADA TEMPE GEMBUS PASCA
FERMENTASI 48 JAM BERDASARKAN ANALISIS GEN 16S rRNA
Nining Mony1, Stalis Norma Ethica
2, Ana Hidayati Mukromah
3
1. Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semrang
2. .Laboratorium Paologi Klinik Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhmmadiyah
Semarang
3. Laboraorium Biologi Molekuler Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhmmadiyah
Semarang
Info Artikel Abstrak
Keywords:
Identifikasi molekuler,
bakteri proteolitik, gen
16S rRNA, Bacillus
cereus
Enzyme is a complex molecule of proteins are produced by living and
working cells as catalyst in various chemical processes in the body . In
medical world, enzyme proteases used as medical therapy for treatment
of tumors , inflammation, an abnormality of blood and arrangement of
immunity . The purpose of this research is to know the presence of
bacteria producing protease that is found in the tempe gembus after
fermentation 48 hours, as well as to find out the type of bacteria
producing protease that is found in tempe gembus after fermentation 48
hours based on 16S rRNA gene analysis. The process of isolation and
purification bacteria colonies is done on media nutrient agar by using
speread method, while production of enzyme proteases test carried out
using selective media skim milk Agar (SMA). Molecular identification
process based on 16S rRNA gene sequence analysis done by Polymerase
Chain Reaction (PCR), and followed by sequencing. From the process of
isolation obtained results in from of a single isolate bacterial have
proteolytic activity is demonstrated by the existence of a clear zone of
Skim Milk Agar media that have a sizeable diameter is 85.00 mm.
Based on 16S rRNA gene sequence analysis showed that proteolytic
bacteria isolates in this study, That isolation ISTD 2.1 has a semblance of
98% 16S rRNA gene fragments with isolates of bacteria Bacillu cereus
KAVK5 ( genbank the access codes: kp792776.1 ) . Based on the results
of this research it can be concluded that isolates ISTD 2.1 potential
producers of proteolytic enzymes and based on molecular identification
of isolates, ISTD, exercised 2.1 expressed as Bacillus cereus ISTD1
(Indonesian Soybean Tempeh Day-1).
http://repository.unimus.ac.id
5
*Corresponding Author :
Nining Mony
Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semrang 50273
E-mail: [email protected]
PENDAHULUAN
Tempe merupakan makanan tradisional
khas dan telah dikenal lama di fermentasi
Indonesia. Dalam SNI 3144 - 2009 tempe
didefinisikan sebagai produk makanan hasil
biji kedelai oleh jamur tertentu, berbentuk
padatan kompak, berbau khas serta berwarna
putih atau sedikit keabu-abuan, dan beraroma
khas tempe. Salah satu yang mendukung
popularitas tempe di kalangan internasional
adalah kandungan gizi tempe yang cukup
tinggi. Berdasarkan kandungan nutrisi makro
pada tempe, 100 g tempe segar dapat
berkontribusi pada 16.9-17.9 g protein, 20-20.1
g lemak, dan 21.5-27.6 g karbohidrat dengan
energi sebesar 350.5-380.8 kalori (Efriwati dan
Nuraida 2013).
Bakteri merupakan salah satu
mikroorganisme penghasil enzim yang paling
banyak digunakan sebagai sumber enzim.
Bakteri lebih dianggap menguntungkan karena
pertumbuhannya cepat, dapat tumbuh pada
substrat yang relatif murah dan mampu
menghasilkan enzim (Akhdiya, 2003).
Protease adalah enzim yang berperan
dalam reaksi biokatalis yang
menyebabkanpemecahan protein. Enzim
protease dapat dihasilkan oleh tanaman, hewan
maupun mikroorganisme seperti bakteri.
Indonesia merupakan salah satu negara yang
telah memanfaatkan enzim protease dalam
bidang industri. Protease digunakan dari
berbagai aplikasi industri seperti detergen,
farmasi, produk-produk kulit dan produk-
produk makanan (Fatoni dkk., 2008).
Identifikasi 16S rRNA dapat dilakukan
dengan metode Polymerase Chain Reaction
(PCR). PCR merupakan suatu metode
molekuler untuk membuat salinan segmen
spesifik dari suatu DNA. Metode ini jauh lebih
cepat daripada pengklon gen dengan DNA
plasmid atau DNA faga dan seluruhnya
dilakukan in vitro (Campbell, 2002). Gen
pengkode 16S rRNA terdapat bagian
penyimpan yangberguna untuk mendisain
primer universal PCR yang mampu
memperbanyak beberapa fragmen gen 16S
rRNA dari semua bakteri patogen dan
nonpatogen. Fragmen ini termasuk bagian
hipervariable yang tidak mudah termutasi dan
mengandung tanda urutan spesifik spesies yang
berguna untuk mengidentifikasi bakteri hingga
ke level spesies (Israhmadini, 2008).
Penelitian ini perlu dilakukan karena
pada penelitian sebelumnya telah dilaporkan
adanya bakteri penghasil dari protease yang
dihasilkan dari fermentasi tempe gembus.
Namun belum ada laporan tentang isolasi
bakteri proteolitik dari sampel yang sama pasca
fermentasi. Penelitian ini adalah bagian dari
penelitian tentang keanekaragaman bakteri
proteolitik yang terdapat pada bahan makanan
sumber protein hasil fermentasi yang ada di
Indonesia.
METODE dan BAHAN
Jenis penelitian yang digunakan
merupakan analisis deskriptif.
Alat dan bahan yang digunakan dalam
penelitian adalah cawan petri, mikropipet,
inkubator, autoklaf, oven, hot plate, tabung
reaksi, erlenmeyer, rak tabung, gelas ukur,
laminar, lampu spirtus, ose jarum, pinset,
neraca analitik, mikrotube, waterbath, vortex,
termal cyler, cetakan gel agarose, alat
elektroforesis, power supply, ultraviolet
transilluminator, dan tabung ependrof.
Bahan yang dibutuhkan dalam penelitian
ini adalah sampel tempe gembus, NaCl
fiologis, dH2O, kapas dan kasa, plastik dan
plastik wrap, aluminium foil, kertas label,
media Skim Milk Agar, aquades, Nuclease free
water (NFW), Promega Kit, Etanol absolut
70%, TE Buffer, DNA Template (isolat DNA
genom /total), PCR Master Mix (Promega),
Primer Forward 8F 16S rRNA, Primer Reverse
1492R 16S rRNA, gel agarose, Loading dye,
Larutan Tris Borat EDTA, media Nutrien
http://repository.unimus.ac.id
6
*Corresponding Author :
Nining Mony
Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semrang 50273
E-mail: [email protected]
Agar, dan Ethidium Bromida
HASIL PENELITIAN
Gambaran Sampel
Setelah dilakukan penelitian mengenai
isolasi dan identifikasi molekuler bakteri
penghasil protease pada tempe gembus pasca
fermentasi 48 jam maka diperoleh hasil
sebagai berikut:
Setelah difermentasi 2 hari tempe
gembus yang awalnya semua putih berubah
menjadi sedikit kecoklatan disertai tekstur
lembek dan sedikit berair serta agak berbau,
tertera pada Gambar 1
(a) (b)
Gambar 1. (a) Tempe gembus sebelum
fermentasi 48 jam (b) Tempe
gembus pasca fermentasi 48 jam
Isolasi dan Identifikasi Koloni Bakteri
Total bakteri koloni yang ditemukan
dari isolasi satu sampel tempe gembus pasca
fermentasi 48 jam didapatkan sebanyak 5
koloni bakteri murni dengan morfologi
koloni yang berbeda. Karakteristik morfologi
pada masing-masing koloni bakteri yang
didapatkan dari isolasi tempe gembus pasca
fermentasi 48 jam, koloni dapat dilihat pada
gambar 2 dan tabel 1
(a) ISTD2.1 (b) ISTD2.2 (c) ISTD2.3
(d) ISTD2.4 (e) ISTD2.5
Gambar 2. (a) Karakteristik morfologi isolat
bakteri ISTD2.1 (b) bakteri
ISTD2.2 (c) bakteri ISTD2.3 (d)
bakteri ISTD2.4 (e) bakteri
ISTD2.5
Tabel 1 Morfologi Koloni Bakteri
Dari Tabel 1. Diketahui mayoritas
bakteri berbentuk bulat. Sedangkan dari
karakteristik warna mayoritas warna koloni
putih dan kuning. Selanjutnya ditemukan
klobi yang mempunyai tepi rata. Dari segi
elevasi, semua kloni mempunyai elevasi
cambung dan mempunyai ukuran besar, keil
dan sedang dengan kosisten tidak berlendir
Pewaarnaan Gram
Koloni bakteri yang ditemukan pada
isolasi bakteri pada sampel tempe gembus
pasca fermentasi 48 jam diidentifikasi
karakteristik dan jernihnya berdasarkan
pewarnaan Gram.
Hasil pewarnaan Gram koloni bakteri
didapatkan dari isolasi tempe gembus pasca
fermentasi 48 jam dapat dilihat pada tabel 2
Tabel 2. Pewarnan Gram Bakteri
Sampel Hasil Pewarnaan Gram
http://repository.unimus.ac.id
7
*Corresponding Author :
Nining Mony
Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semrang 50273
E-mail: [email protected]
ISTD2.1 Basil Gram-negatif
ISTD2.2 Basil Gram-positif
ISTD2.3 Basil Gram-positif
ISTD2.4 Kokus Gram-negatif
ISTD2.5 Basil Gram-positif
Berdasarkan Tabel 2 pewarnaan Gram
yang telah dilakukan, mayoritas bakteri
berbentuk kokus dan merupakan kelompok
Gram-positif. Namun demikian ditemukan
pula bakteri yang berbentuk basil baik Gram-
positif maupun Gram-negatif. Dari koloni
yang ada, dipilih satu isolat dengan bentuk
sel yang unik yaitu isolat kode ISTD2.1
untuk dilanjukan pada uji penghasilan enzim
protease menggunakan media Skim Milk
Agar (SMA).
Uji Enzimatik Penghasil Protease
Koloni bakteri yang telah diisolasi dan
identifikasi kemudian dilakukan uji
enzimatik untuk mengetahui kemampuan
bakteri dalam memecah protein.
Hasil uji enzimatik penghasil protease
isolate ISTD2.1 yang dilakukan pada media
skim milk agar dapat dilihat pada gambar 3
sebagai berikut:
Gambar 3. Uji enzimatik protease pada media
susu milk agar
Pada gambar 3 dapat dilihat aktivitas
protease isolat ISTD2.1 pada media agar
yang mengandung substrat susu milk agar.
Terlihat adanya zona bening atau zona
protease yang memenuhi permukaan petri
disekitar koloni bakteri.
Berdasarkan hasil uji enzimatik
gambar 3, isolat ISTD2.1 mempunyai
aktivitas proteolitik dengan diameter zona
bening yang relatif besar yaitu 85,00 mm.
Pengukuran dilakukan menggunakan alat
jangka sorong. Selanjutnya dilakukan isolasi
genom bakteri penghasil protease untuk
keperluan identifikasi molekuler
Tabel 3. Hasil Nilai Absorbansi isolasi
DNA genom isolat ISTD2.1
No
Sampel
ID
Nucleic
Acid
Conc
A260 A280 260/
280
1
ISTD2.1
54.5 ng/µl
1.091
0.458
2.38
Dari tabel 3 perhitungan nilai
absorbansi pada merupakan hasil kemurnian
isolat DNA genom bakteri berupa nilai
absorbansi. Isolat DNA genom yang
diperoleh akan digunakan sebagai template
atau cetakan dalam proses PCR untuk
amplifikasi fragmen gen 16S rRNA bakteri.
Berdasarkan hasil perhitungan absorbansi
dapat dikatakan genom bakteri dengan
kemurnian yang cukup dapat digunakan
sebagai template untuk PCR gen 16S rRNA.
Isolasi DNA dilakukan dengan tujuan
untuk memisahkan DNA dari bahan lain.
Prinsip metode ini yaitu isolasi Genom
dilakukan dengan cara penghancur (lisis),
ekstraksi atau pemisahan DNA dari bahan
padat seperti protein dan pemurnian DNA,
sel tersebut diharapkan akan pecah dan DNA
genom keluar dari sel. Hasil isolasi DNA
genom yang ditunjukkan pada gambar 4.
memperlihatkan adanya satu pita DNA yang
menujukkan adanya DNA genom dari hasil
isolasi.
Hasil amplifiksi dicek dengan uji
elektroforesis, dan hasilnya ditunjukkan pada
gambar 4 adalah sebagai berikut:
http://repository.unimus.ac.id
8
*Corresponding Author :
Nining Mony
Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semrang 50273
E-mail: [email protected]
(b)
No
Sampel
ID
Nucleic
Acid
Conc
A260 A280 260/
280
1
ISTD2.1
54.5 ng/µl
1.091
0.458
2.38
(a)
No
Sampel
ID
Nucleic
Acid
Conc
A260 A280 260/
280
1
ISTD2.1
54.5 ng/µl
1.091
0.458
2.38
Gambar 4. Hasil Amplifikasi Fragmen 16S
rRNA isolasi ISTD2.1 (a) Marker
(b) Sampel ISTD2.4
Pada gambar 4 dapat dilihat hasil
amplifikasi gen 16S rRNA pada gel
elektroforesis berupa pita atau band DNA
tunggal berukuran sekitar 1500 bp. Karena
hasil amplifikasi 16S rRNA didapatkan pita
gen 16S rRNA pada 1500 bp yang sesuai
dengan ukuran gen tersebut pada bakteri,
maka pekerjaan penelitian dapat dilanjutkan
ke tahap sekuensing.
Hasil Sekuensing
Dari hasil sekuensing Gen 16S rRNA
didapatkan kemiripan 98% dengan fragmen
gen 16S ribosomal RNA isolate bakteri
Bacillus cereus strain KAVK5 (Genbank
kode akses : KP792776.1) sehingga isolat
diberi nama Bacillus cereus ISTD1 (ISTD1 =
Indonesian Soybean Tempeh Day-1).
DISKUSI
Penelitian ini diawali dengan
pengenceran 10-1-10-
5. Tempe utuh pasca
fermentasi 48 jam ditimbang sebanyak 1
gram kemudian dimasukkan dalam tabung
dan diberi label tanpa pengenceran. Dari 1
tabung dipipet 1 ml lalu dimasukkan ke
dalam tabung II kemudian dihomogenkan
diberi label 10-1. Perlakuan ini dilakukan
berulang kali sampai pengenceran 10-5. Dari
masing – masing pengenceran di ambil 1 ml
lalu diratakan diatas media Nutrient Agar
menggunakan triangle. Kemudian di inkubasi
selama 24-48 jam pada temperatur 37oC.
Pengamatan tentang karakeristik
morfologi koloni bakteri perlu dilakukan agar
bakteri tidak menumpuk dan memudahkan
pengamatan morfologi koloni (sitasi). Setelah
pengamatan morfologi koloni dilajutkan
dengan pewarnaan Gram yang dibaca pada
mikroskop cahaya untuk melihat jenis bakteri
Gram-negatif dan Gram-positif. Pada
penelitian ini isolat ISTD2.1 diketahui
merupakan bakteri basil Gram-negatif.
(Jawetz, dkk., 2004).
Menurut klasifikasinya bakteri dibagi
menjadi 2 yaitu bakteri Gram-positif dan
bakteri Gram-negatif. Beberapa bakteri
Gram-positif dan bakteri Gram-negatif
merupakan flora normal. Flora normal adalah
mikroorganisme yang menempati suatu
daerah tanpa menimbulkan penyakit pada
inang yang ditempati.
Poernomo dan Purwanto (2003),
menyatakan bahwa zona bening terjadi
apabila protein yang terdapat dalam media
susu skim dihidrolisis oleh enzim
ekstraseluler menjadi asam amino yang dapat
digunakan secara langsung oleh sel sebagai
sumber nutrisi. Hal ini dilakukan karena sel
tidak mampu memanfaatkan protein yang
bersifat makromolekul secara langsung untuk
ditransfer ke dalam sel.
Gen 16S rRNA dapat digunakan
sebagai indikator identifikasi
mikroorganisme yang bersifat universal
berukuran sekitar 1500 pb. Dengan demikian
identifikasi suatu bakteri dapat dilakukan
dengan mengamplifikasi daerah 16S rRNA
dari genom bakteri (Rinata, 2011).
Bacillus cereus ialah bakteri berbentuk
batang yang berspora dan bersifat Gram-
positif, selnya berukuran besar dibandingkan
dengan bakteri batang lainnya serta tumbuh
secara aerob fakultatif. Untuk membedakan
Bacillus cereus dengan Bacillus lainnya
digunakan ciri morfologi dan biokimia.
Bacillus cereus merupakan salah satu jenis
bakteri yang masuk ke dalam genus Bacillus.
yang banyak ditemukan pada makanan dan
dapat menyebabkan sakit pada manusia
sehingga digolongkan ke dalam bakteri
patogen. Bakteri ini mampu menghasilkan
1500
bp
http://repository.unimus.ac.id
9
*Corresponding Author :
Nining Mony
Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semrang 50273
E-mail: [email protected]
spora yang tahan terhadap panas dan proses
dehidrasi (Nurwidiani, 2010).
Pada penelitian ini bakteri Bacillus
cereus ditemukan pada tempe gembus pasca
fermentasi 48 jam. Hal ini kemungkinan
disebabkan oleh adanya kontaminan terhadap
makanan lain saat proses pembuatan tempe
gembus yang tidak steril dilakukan.
Kesimpulan
Berdasarkan hasil penelitian yang
berjudul Isolasi dan Identifiksi Molekuler
Bakteri Penghasil Enzim Protease Pada
Tempe Gembus Pasca Fermentasi 48 Jam
Berdasarkan Analisis Gen 16S rRNA dapat
disimpulkan dari kelima isolasi bakteri yang
berhasil disolasi dari sampel tempe gembus
pasca fermentasi 48 jam, terdapat satu isolate
bakteri, yaitu ISTD2.1 yang kemudian diberi
label ISTD2.1 yang memiliki aktivitas
protease ditandai dengan terbentuknya zona
bening yang berdiameter 85,00 mm
disekelilingi koloni bakteri pada medium
Skim Milk Agar. Kemudin Proses
identifikasi molekuler isolat ISTD2.1
menghasilkan sekuen gen 16S rRNA dengan
urutan nukleotida yang menunjukkan tingkat
kesamaan dengan urutan nukleotida gen 16S
rRNA bakteri Bacillus cereus. Maka
disimpulkan bahwa isolasi dengan sampel
ISTD2.1 merupakan akteri Bacillus cereus.
Saran
Disarankan dilakukan isolasi bakteri
enzim penghasil proetase pada produk hasil
fermentasi makanan lain.
Ucapan Terima Kasih
Penulis ucapkan terima kasih kepada
ibu Dr. Stalis Norma Ethica, M. Si, selaku
pembimbing pertama yang telah banyak
memberi waktu, semangat, ilmu dan
bimbingan selama penulisan skripsi ini.
Ibu Dr. Ana Hidayati Mukromah,
M.Si, selaku pembimbing kedua yang telah
memberikan waktu ilmu dan membimbing
selama menulis skripsi ini.
Ibu Andri sukeksi, SKM., M.Si, selaku
ketua program studi diploma IV analis
kesehatan universitas muhammadiah
semarang, kepada kedua orang tua saya
Ayahanda Mansur Mony, ibunda Sattia Ridi
yang telah memberikan do'a dan bimbingan
secara materal dan moril, serta semua pihak
yang tidak dapat saya sebutkan satu-persatu
yang turut membantu dalam menyelesaikan
penulisan skripsi ini
REFERENSI
Dewi, R.S. & Aziz, S., 2011. Isolasi
Rhizopus oligosporus pada beberapa
inokulum tempe di kabupaten banyumas.
Molekul, 6, pp.93–104.
Ethica, S.N., Nataningtyas, D.R., Lestari, P.,
Istini, I., Semiarti, E., Widada, J. and
Raharjo, T.J., 2013. Comparative Evaluation
of Conventional Versus Rapid Methods for
Amplifiable Genomic DNA Isolation of
Cultured Azospirillum sp. JG3. Indonesian
Journal of Chemistry, 13(3), pp.248-253.
Fatchiyah, Estri, L. A, Sri, W., dan Sri, R.
2011. Biologi Molekular Prinsip Dasar
Analisis. Erlangga. Jakarta.
Jawetz, E., J, Melnick dan Adelberg. 2004.
Mikrobiologi Kedokteran Edisi 23. EGC.
Jakarta
Kuswanto, R. K., Sudarmadji, Slamet. 1989.
Mikrobiologi Pangan. Yogyakarta: UGM.
Nicholl, dan Soeka, Y.S. 2011. Kemampuan
Bacillus lichenoformis Dalam Mempreduksi
Enzim Protease Yang Bersifat Alkali dan
Termofilik. 20. 2.
Poernomo AT, DA Purwanto, 2003. Uji
aktivitas crude enzim proteolitik Bacillus
subtilis FNCC 0059 hasil fermentasi curah.
Majalah Farmasi Airlagga. 3(3):103-107.
Rinanta, R. 2011. Analisis Sekuensing 16S
rRNA diBidang Mikroorganisme.Vol 11 No3
Sambrook J, dan Russel, D.W. 2001.
Molecular Cloning A Laboratory Manual. Ed
ke-3. Cold Spring Habor: Cold Spring
Laboratory Pres. ISBN: 0-87969-576-3
Sambrook J, Russell DW. 1989. Molecular
Cloning : A Laboratory Manual 3 rdedition.
New York : Laboratory Pr.
http://repository.unimus.ac.id
10
*Corresponding Author :
Nining Mony
Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas
Muhammadiyah Semrang 50273
E-mail: [email protected]
Sambrook, J.R. and Russel, D.W., 2001. DW
2001. Molecular Cloning: A Laboratory.
Sirvia, M.O, dkk. 2011. Isolasi Bakt
http://repository.unimus.ac.id
11
*Corresponding Author :
Nining Mony
Program Studi DIV Analis Kesehatan Fakultas Ilmu Keperawatan dan Kesehatan Universitas Muhammadiyah
Semrang 50273
E-mail: [email protected]
http://repository.unimus.ac.id