isolasi dan uji aktivitas antidenaturasi protein...

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIDENATURASI

PROTEIN SENYAWA METABOLIT SEKUNDER

DARI FRAKSI ETIL ASETAT RIMPANG TEMU

GIRING (Curcuma heyneana Val)

SKRIPSI

LULUK MUCHOYARATUL HIDAYAH

11141020000063

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

AGUSTUS 2018

ii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIDENATURASI

PROTEIN SENYAWA METABOLIT SEKUNDER

DARI FRAKSI ETIL ASETAT RIMPANG TEMU

GIRING (Curcuma heyneana Val)

SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar sarjana Farmasi

LULUK MUCHOYARATUL HIDAYAH

11141020000063

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

AGUSTUS 2018

iii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS

Skripsi ini adalah karya saya sendiri, dan semua sumber baik yang dikutip

maupun dirujuk telah saya nyatakan dengan benar.

vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRAK

Nama : Luluk Muchoyaratul Hidayah

Program Studi : Farmasi

Judul Skripsi : Isolasi dan Uji Aktivitas Antidenaturasi Protein Senyawa

Metabolit Sekunder dari Fraksi Etil Asetat Rimpang Temu Giring

(Curcuma heyneana Val)

Aktivitas biologis temu giring telah dilaporkan diantaranya sebagai antibakteri,

antioksidan, antelmintik, antihiperglikemik dan antinyeri, namun masih terbatas

pada pengujian aktivitas antiinflamasi. Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi

senyawa metabolit sekunder dari rimpang temu giring (Curcuma heyneana Val),

menentukan strukturnya, dan menguji aktivitasnya sebagai antidenaturasi protein.

Pemisahan dan pemurnian dari fraksi etil asetat menggunakan berbagai metode

kromatografi dan menghasilkan senyawa F4149 sebanyak 319 mg. Analisa data

spektroskopi menggunakan GCMS dan 1H-NMR mengindikasikan bahwa senyawa

F4149 memiliki berat molekul 234,1 m/z dengan 5 metil, O-CH2, dan sisanya

merupakan CH/CH2 alifatik. Pola sinyal seperti ini sesuai dengan struktur dari

senyawa sesquiterpen yang merupakan senyawa dominan yang ditemukan pada

Curcuma heyneana Val. Berdasarkan hasil uji aktivitas antidenaturasi protein,

senyawa F4149 pada konsentrasi 0,1-100 ppm menunjukkan hasil persentase

inhibisi berbeda bermakna.

Kata kunci : Temu giring (Curcuma heyneana Val), antidenaturasi

protein, antiinflmasi, Bovine Serum Albumin.

vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

ABSTRACT

Name : Luluk Muchoyaratul Hidayah

Program Study : Pharmacy

Title : Isolation and Antidenaturation of Protein Assays of

Secondary Metabolites Compound from Rhizomes of

Curcuma heyneana Val.

Curcuma heyneana Val has been reported to have antibacterial, antioxidant,

anthelmintic, antihyperglycemic and analgesic activities, however are still limited

to antiinflammatory assays. The objectives of this research were to isolate a

secondary metabolite compound from rhizomes of Curcuma heyneana Val,

elucidated the structure, and determined its antidenaturation of protein activity.

12,73 g ethyl acetate fraction was separated and further purified by using

chromatographic method to give 319 mg of F4149. Analysis of the GCMS and 1H-

NMR spectroscopic data of F4149 indicated that this compound has molecular

formula at 234,1 m/z with 5 methyls, one methylenoxy, and the remains of the

CH/CH2 aliphatic structure. Pattern of this signal is in accordance to the

sesquiterpenes skeleton, which is found as the major compound in the Curcuma

heyneana Val. F4149 at a concentration of 0,1-100 ppm showed that the percentage

inhibition of antidenaturation protein were significantly different.

Keywords: Curcuma heyneana Val, Antidenaturation of Protein,

Antiinflammatory, Bovine Serum Albumin.

viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

KATA PENGANTAR

Puji syukur senantiasa saya panjatkan kehadirat Ilahi Rabbi, Tuhan Yang

Maha Esa, atas segala rahmat, karunia, hidayah serta inayah-Nya, saya dapat

menyelesaikan penulisan skripsi ini. Penulisan skripsi ini dilakukan untuk

memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana Farmasi pada Fakultas

Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

Saya sepenuhnya menyadari, bahwa tanpa bantuan, arahan dan bimbingan

dari berbagai pihak, dari awal masa perkuliahan sampai pada penyusunan skripsi

ini, sangatlah sulit dan penuh rasa tanggung jawab untuk menyelesaikan skripsi ini.

Oleh karna itu, saya mengucapkan terima kasih kepada:

1. Ibu Ismiarni Komala, M.Sc., Ph. D., Apt. selaku pembimbing pertama dan Ibu

Dr. Azrifitria, M.Si., Apt. selaku pembimbing kedua yang telah meluangkan

waktu, tenaga, pikiran untuk membimbing dan mengarahkan, memberikan

ilmu, masukan dan saran, sejak proposal skripsi, pelaksanaan penelitian sampai

pada penyusunan skripsi.

2. Dr. Arief Soemantri, SKM., M.Kes selaku Dekan Fakultas Ilmu Kesehatan

Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

3. Ibu Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt selaku Kepala Jurusan Program Studi Farmasi

Fakultas Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta.

4. Segenap Bapak dan Ibu dosen yang telah memberikan ilmu dan pengetahuan

hingga penulis dapat menyelesaikan studi di jurusan Farmasi Fakultas Ilmu

Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.

5. Kedua Orang tua saya, Samsul Huda dan Muisyaroh Huda, adik saya Saadatul

Mu’awanah serta keluarga yang terus memberi dukungan moril maupun

materil.

6. Sahabat-sahabat saya Puspitasari, Fauziah HB, Syifa Munika, Muhaiminul

Maulidza, Cut Balqis, Revy Aprillia, Corry Priscilliana, Dea Raudya, Divya

Anjani, Ramadhani, Hadi Azmi, Fariz Agus, Indah Meliani, Dena Fijanatin

yang selalu mengingatkan dan memberi dukungan kepada penulis.

ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

7. Teman-teman seperjuangan cepet s.farm Firman, Rizka, Nehta, Ferani, Putri

serta teman angkatan 2014 yang sama-sama berjuang selama 4 tahun untuk

menyelesaikan pendidikan ini.

8. Ka Walid, Ka Eris, Mba Rani, Ka Zaenab dan Pak Rahmadi yang telah menjadi

sahabat di laboratorium selama penelitian.

9. Serta semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang turut

membantu menyelesaikan skripsi ini.

Penulis menyadari bahwa skripsi ini masih belum sempurna. Oleh karena

itu, kritik dan saran yang membangun sangat penulis harapkan guna tercapainya

kesempurnaan skripsi ini. Akhirnya, dengan segala kerendahan hati, penulis

berharap semoga hasil penelitian ini dapat bermanfaat baik bagi kalangan akaemis

dan dunia ilmu pengetahuan, khususnya bagi mahasiswa farmasi, serta masyarakat

pada umumnya.

Jakarta, 8 Agustus 2018

Penulis

x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR ISI

COVER ................................................................................................................... i

COVER .................................................................................................................. ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ............................................... iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................ iv

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................... v

ABSTRAK ............................................................................................................ vi

ABSTRACT ......................................................................................................... vii

KATA PENGANTAR ........................................................................................ viii

DAFTAR ISI .......................................................................................................... x

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiii

DAFTAR TABEL .............................................................................................. xiv

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xv

DAFTAR SINGKATAN .................................................................................... xvi

BAB I PENDAHULUAN ...................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ......................................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah .................................................................................... 3

1.3 Tujuan Penelitian ...................................................................................... 3

1.4 Manfaat Penelitian .................................................................................... 3

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................... 4

2.1 Temu Giring (Curcuma heyneana Valeton & Zijp) ................................. 4

2.1.1 Klasifikasi Tanaman (GBIF) ............................................................. 4

2.1.2 Deskripsi Tanaman............................................................................ 4

2.1.3 Kandungan Kimia ............................................................................. 5

2.1.4 Kegunaan........................................................................................... 5

2.2 Inflamasi ................................................................................................... 5

2.3 Ekstrak dan Ekstraksi ............................................................................... 6

2.3.1 Ekstraksi Cara Dingin ....................................................................... 6

2.3.2 Ekstraksi Cara Panas ......................................................................... 7

2.4 Pelarut ....................................................................................................... 8

2.4.1 Metanol ............................................................................................. 8

2.4.2 Etanol ................................................................................................ 8

xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

2.4.3 Etil Asetat .......................................................................................... 9

2.4.4 n-Heksana .......................................................................................... 9

2.5 Kromatografi ............................................................................................ 9

2.5.1 Kromatografi Lapis Tipis .................................................................. 9

2.5.2 KLT Preparatif ................................................................................ 10

2.5.3 Kromatografi Kolom ....................................................................... 11

2.5.4 GC-MS (Gas Chromatography – Mass Spectroscopy) ................... 12

2.6 Spektrofotometer UV-Visible ................................................................. 12

2.7 Spektroskopi NMR (Nucleic Magnetic Resonance)............................... 13

2.8 Bovine Serum Albumin (BSA) ................................................................ 13

2.9 Skrining Fitokimia .................................................................................. 14

BAB III METODOLOGI PENELITIAN ......................................................... 15

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ................................................................ 15

3.2 Alat dan Bahan ....................................................................................... 15

3.3 Prosedur Kerja ........................................................................................ 16

3.3.1 Determinasi Tumbuhan ................................................................... 16

3.3.2 Penyiapan Simplisia ........................................................................ 16

3.3.3 Pembuatan Ekstrak .......................................................................... 16

3.3.4 Penapisan Fitokimia ........................................................................ 17

3.3.5 Penentuan Pola Kromatogram......................................................... 18

3.3.6 Isolasi dan Pemurnian Senyawa ...................................................... 19

3.3.7 Uji Kemurnian Senyawa Hasil Isolasi ............................................ 20

3.3.8 Penentuan Struktur Molekul Senyawa Hasil Isolasi ....................... 21

3.3.9 Uji In Vitro Aktivitas Antiinflamasi ............................................... 21

BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................ 23

4.1 Determinasi ............................................................................................ 23

4.2 Preparasi Sampel .................................................................................... 23

4.3 Ekstraksi ................................................................................................. 23

4.4 Penapisan Fitokimia ............................................................................... 24

4.5 Penentuan Pola Kromatogram Ekstrak Etanol Rimpang Temu Giring

dengan GCMS ................................................................................................... 25

4.6 Isolasi Senyawa Murni ........................................................................... 25

4.7 Uji Kemurnian Senyawa dengan KLT Dua Dimensi ............................. 32

4.8 Penentuan Struktur Senyawa .................................................................. 32

xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

4.9 Uji Aktivitas Antidenaturasi Protein ...................................................... 36

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN .............................................................. 38

5.1 Kesimpulan ............................................................................................. 38

5.2 Saran ....................................................................................................... 38

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 39

LAMPIRAN ......................................................................................................... 43

xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1. Curcuma heyneana Valeton & Zijp…………………………….. 4

Gambar 4.1. Pola GC Ekstrak Etanol Rimpang Temu Giring………………... 25

Gambar 4.2. Hasil KLT Fraksi Heksan dan Etil Asetat………………………. 26

Gambar 4.3. Pola GC Fraksi Etil Asetat Rimpang Temu Giring……………... 27

Gambar 4.4. Pola MS Fraksi Etil Asetat Rimpang Temu Giring……………... 28

Gambar 4.5. Hasil KLT Vial F Nomor 41-49………………………………… 30

Gambar 4.6. Bagan Isolasi Senyawa F4149…………………………………... 31

Gambar 4.7. Hasil KLT Dua Dimensi………………………………………… 32

Gambar 4.8. Pola GC Senyawa F4149……………………………………….. 33

Gambar 4.9. Pola MS Senyawa F4149……………………………………….. 34

Gambar 4.10. Spektrum Hasil Analisis Senyawa F4149 Menggunakan

1H-NMR………………………………………………………… 35

xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR TABEL

Tabel 4.1. Rendemen Ekstrak Etanol Temu Giring……………………………. 24

Tabel 4.2. Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak Etanol Temu Giring…………… 24

Tabel 4.3. Persen Rendemen Fraksi Hasil Partisi……………………………… 26

Tabel 4.4 Bobot Fraksi A-F…………………………………………………… 29

Tabel 4.5. Karakterisitik Senyawa F4149……………………………………… 30

Tabel 4.6. Hasil Analisis Senyawa F4149 Menggunakan 1H-NMR…………… 35

Tabel 4.7. Aktivitas Antidenaturasi Protein Natrium Diklofenak……………... 36

Tabel 4.8. Aktivitas Antidenaturasi Protein Senyawa F4149…………………. 37

xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Rimpang Temu Giring (Curcuma heynenana Val) ........................ 43

Lampiran 2. Bagan Alur Kerja ............................................................................ 44

Lampiran 3. Skema Kerja Isolasi Metabolit Sekunder dari Ekstrak Fraksi Etil

Asetat Rimpang Temu Giring (Curcuma heyneana Val) ..................................... 45

Lampiran 4. Alur Uji Aktivitas Antidenaturasi Protein In Vitro ......................... 46

Lampiran 5. Analisis statistik .............................................................................. 47

Lampiran 6. Hasil Determinasi Rimpang Temu Giring (Curcuma heyneana Val)

............................................................................................................................... 49

Lampiran 7. Dokumentasi Pembuatan Ekstrak Rimpang Temu Giring (Curcuma

heyneana Val) ....................................................................................................... 50

Lampiran 8. Dokumentasi Uji Penapisan Fitokimia Rimpang Temu Giring

(Curcuma heyneana Val) ...................................................................................... 51

Lampiran 9. Hasil Kromatografi Lapis Tipis ...................................................... 52

Lampiran 10. Dokumentasi Uji Aktivitas Antidenaturasi Protein secara In Vitro

............................................................................................................................... 53

Lampiran 11. Perhitungan Konsentrasi Senyawa F4149 dan Natrium Diklofenak

............................................................................................................................... 54

Lampiran 12. Perhitungan Persentase Inhibisi Natrium Diklofenak ................... 56

Lampiran 13. Perhitungan Persentase Inhibisi Senyawa F4149 ......................... 57

Lampiran 14. Data Absorbansi Natrium Diklofenak dan Senyawa F4149 ......... 58

Lampiran 15. Hasil H-NMR senyawa F4149 ...................................................... 60

xvi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

DAFTAR SINGKATAN

1H-NMR 1H- Nuclear Magnetic Resonance (Resonansi Magnetik Inti

Proton

CDCl3 Deuterium Kloroform

COX Siklooksigenase

F4149 Hasil Kromatografi Kolom Fraksi F, vial No. 41-49

GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectroscopy

KLT Kromatografi Lapis Tipis

NMR Nuclear Magnetic Resonance (Resonansi Magnetik Inti)

Rf Retardation Factor

δH Pergeseran Kimia Proton

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Tanaman obat sudah digunakan sejak dahulu oleh masyarakat Indonesia

untuk mengatasi masalah kesehatan mulai dari mencegah dan mengobati suatu

penyakit. Kekayaan alam Indonesia yang sangat beragam menjadi sumber bahan

obat alam dan tradisional yang digunakan secara turun temurun. Hasil penelitian

yang sudah banyak dilakukan menunjukkan bahwa pada tumbuhan obat yang

berperan dalam perannya sebagai obat yaitu berdasarkan kandungan senyawa

metabolit sekunder yang dikandungnya. Senyawa metabolit sekunder merupakan

senyawa kimia yang umumnya mempunyai kemampuan bioaktifitas sehingga

banyak digunakan sebagai obat tradisional. Sebagian besar tanaman obat telah

dilakukan identifikasi senyawa fitokimianya. Senyawa metabolit sekunder dari

kelompok fenolik dan flavonoid diketahui merupakan senyawa yang berkontribusi

pada aktivitas biologis dari suatu tanaman (Tanaya dkk, 2015).

Tanaman obat yang khasiatnya telah diketahui dan digunakan secara turun-

menurun yaitu tanaman rempah. Salah satu rempah yang dikenal di Indonesia

adalah tanaman temu-temuan (Zingiberaceae) yang merupakan tanaman daerah

tropis yang memiliki berbagai manfaat terutama untuk kesehatan.

Temu giring (Curcuma heyneana Val) adalah salah satu keluarga

Zingiberaceae yang biasa digunakan masyarakat Indonesia terutama daerah Jawa,

karena dipercaya memiliki khasiat sebagai obat antelmintik, obat kulit, agen

hepatoprotektor dan sebagai pelancar menstruasi (Diastuti, 2014). Rimpang temu

giring (Curcuma heyneana Val) mengandung senyawa kurkumin yang dapat

memberi warna kuning, minyak atsiri 0,8-3%, amilum, damar, lemak, tanin,

saponin dan flavonoid (Santoso H.B, 2008). Pada penelitian sebelumnya tentang

investigasi fitokimia dari temu giring (Curcuma heyneana Val) didapatkan variasi

tipe sesquiterpen seperti germakron, dihidrokurdion, isokurkuminol, kurkumino,

kurkumanolid A dan B, zerumbon, dan oxykurkuminol, dimana telah dilaporkan

menunjukkan antiinflamasi, antikanker dan memblok kanal Ca2+. Berdasarkan hasil

penelitian Woong Cho dkk (2009) telah mengisolasi senyawa sesquiterpen yaitu

2

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

zedoarondiol dari temu giring yang memiliki efek sebagai antiinflamasi dengan

mekanisme penghambatan iNOS, COX-2 dan sitokin pro-inflamasi. Dalam

penelitian Intanningrum (2011), peneliti telah megisolasi senyawa metabolit

sekunder ekstrak etil asetat temu giring (Curcuma heyneana Val) dan didapatkan

hasil senyawa golongan kurkuminoid yaitu demetoksikurkumin.

Temu giring (Curcuma heyneana Val) telah dilaporkan memiliki berbagai

aktivitas biologis diantaranya sebagai antibakteri, antioksidan, antelmintik,

antihiperglikemik dan antinyeri, namun masih terbatas pada pengujian aktivitas

antiinflamasi terhadap tanaman tersebut. Uji pendahuluan telah dilakukan terhadap

rimpang temu giring (Curcuma heyneana Val) yaitu dengan melihat aktivitas

antidenaturasi protein dan dengan melihat pola kromatogram dengan GCMS dan

KLT. Ekstrak temu giring memiliki senyawa major bila dilihat dari hasil GCMS

dan KLT serta hasil yang positif dalam menghambat denaturasi protein. Oleh

karena itu, perlu dilakukan isolasi untuk mengetahui senyawa metabolit sekunder

dan pengujian aktivitas biologis antidenaturasi protein terhadap temu giring

(Curcuma heyneana Val) dimana berdasarkan kandungan kimia dari tanaman dan

beberapa penelitian sebelumnya menunjukkan bahwa tanaman temu giring

(Curcuma heyneana Val) memiliki potensi sebagai antiinflamasi.

Inflamasi merupakan suatu respon protektif normal terhadap luka jaringan

yang disebabkan oleh trauma fisik, zat kimia yang merusak, atau zat-zat

mikrobiologik. Inflamasi adalah usaha tubuh untuk menginaktifasi atau merusak

organisme yang menyerang, menghilangkan dan mengatur derajat perbaikan

jaringan (Mycek dkk, 2001). Kerusakan sel akibat dari inflamasi terjadi pada

membran sel, menyebabkan leukosit melepaskan enzim lisosom dan jalur

siklooksigenase (COX) dalam metabolisme arakhidonat menghasilkan

prostaglandin yang memiliki berbagai efek pada pembuluh darah, ujung saraf, dan

pada sel yang terlibat dalam peradangan (Katzung, 2010).

Dalam penelitian ini, metode uji antiinflamasi senyawa metabolit sekunder

hasil isolasi ekstrak etil asetat temu giring (Curcuma heyneana Val) menggunakan

metode penghambatan denaturasi protein dengan Bovine Serum Albumin (BSA)

(Williams et al., 2008). Salah satu penyebab penyakit inflamasi dan artritis adalah

terjadinya denaturasi protein pada jaringan. Oleh karena itu, dibutuhkan suatu agen

3


tertentu yang dapat mencegah denaturasi protein yang akan bermanfaat pada

pengembangan obat antiinflamasi (Chatterjee et al., 2012).

Berdasarkan hal tersebut, maka dapat dilakukan penelitian untuk menguji

aktivitas antidenaturasi protein senyawa metabolit sekunder dari fraksi etil asetat

temu giring (Curcuma heyneana Val) secara in vitro.

1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan uji pendahuluan yang telah dilakukan terhadap ekstrak etanol

temu giring dengan melihat hasil pola kromatogram GCMS dan KLT serta uji

aktivitas antidenaturasi proteinnya, terdapat ketertarikan untuk melakukan isolasi

terhadap kandungan senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam ekstrak temu

giring (Curcuma heyneana Val) yang kemudian senyawa yang didapatkan diuji

aktivitas antidenaturasi proteinnya.

1.3 Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk :

1. Isolasi kandungan senyawa metabolit sekunder dari fraksi etil asetat temu

giring (Curcuma heyneana Val)

2. Elusidasi struktur senyawa hasil isolasi dari fraksi etil asetat temu giring

(Curcuma heyneana Val).

3. Menguji aktivitas antidenaturasi protein dari senyawa metabolit sekunder

yang diisolasi.

1.4 Manfaat Penelitian

Penelitian ini memberikan informasi secara ilmiah tentang kandungan

senyawa metabolit sekunder dari ekstrak etil asetat temu giring (Curcuma heyneana

Val) beserta aktivitas antidenaturasi proteinnya serta dapat memberikan nilai

ekonomi jika nantinya terbukti bahwa senyawa metabolit sekunder ekstrak etil

asetat temu giring (Curcuma heyneana Val) memiliki aktivitas antidenaturasi

protein secara in vitro.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Temu Giring (Curcuma heyneana Valeton & Zijp)

Gambar 2.1. Curcuma heyneana Valeton & Zijp

(Sumber : Koleksi Pribadi, 19 Maret 2018)

2.1.1 Klasifikasi Tanaman (GBIF)

Kingdom : Plantae

Divisi : Tracheophyta

Kelas : Liliopsida

Ordo : Zingiberales

Famili : Zingiberaceae

Genus : Curcuma L.

Spesies : Curcuma heyneana Valeton & Zijp

2.1.2 Deskripsi Tanaman

Terna berbatang semu, tinggi sampai 2 m, rimpang terbentuk dengan

sempurna, bercabang ke segala arah, kuat, bila dipotong bagian dalamnya berwarna

putih dan ditengah berwarna kekuningan. Jumlah helaian daun tiap pohon antara 2

helai sampai 9 helai, bentuk lonjong sampai lanset, pangkal lancip sampai luncip,

berwarna hijau keunguan dibagian tengah, ukuran panjang 31 cm sampai 80 cm,

lebar 10 cm sampai 18 cm, tangkai daun lokos atau berbulu, panjang 43 cm sampai

80 cm, daun pelindung banyak tersusun saling menutupi, bentuk bundar telur

sungsang sampai bundar elip, ujung sempit. Perbungaan lateral, berupa bulir,

5


tangkai ramping dan berbulu, panjang sampai 37 cm, dibawah bulir tedapat sisik

yang bentuknya seperti pita, ujung tumpul dan berbulu halus, ukuran panjang 8 cm

sampai 12 cm, lebar 2 cm sampai 3 cm, dibagian pangkal perbungaan terdapat daun

yang mirip sisik, jumlahnya 4 helai, bulir berbentuk silindir, biasanya melebar pada

bagian ujung, panjang 9 cm sampai 23 cm, lebar 4 cm sampai 6 cm (DepKes, 1989).

2.1.3 Kandungan Kimia

Rimpang temu giring (Curcuma heyneana Val) mengandung senyawa

kurkumin yang dapat memberi warna kuning, minyak atsiri 0,8-3%, amilum,

damar, lemak, tanin, saponin, dan flavonoid (Putra, 2015).

2.1.4 Kegunaan

Secara tradisional rimpang temu giring mempunyai khasiat antara lain

sebagai obat luka. Minyak atsiri yang terkandung dalam temu giring berpotensi

sebagai antijamur dan dikembangkan menjadi sediaan krim (Rahmawati dkk,

2010).

2.2 Inflamasi

Inflamasi merupakan suatu respon protektif normal terhadap luka jaringan

yang disebabkan oleh trauma fisik, zat kimia yang merusak atau atau zat-zat

mikrobiologik. Inflamasi juga merupakan usaha tubuh untuk menginaktivasi atau

merusak organisme yang meyerang, menghilangkan zat iritan dan mengatur derajat

perbaikan jaringan (Mycek, 2001).

Tujuan inflamasi yaitu untuk memperbaiki jaringan yang rusak serta

mempertahankan diri terhadap infeksi. Tanda-tanda inflamasi adalah berupa

kemerahan (rubor), panas (kalor), nyeri (dolor), pembengkakan (tumor) (Semiawan

dkk, 2015).

Pengobatan inflamasi mempunyai dua tujuan utama. Pertama meringankan

rasa nyeri yang merupakan gejala awal yang terlihat; dan kedua, memperlambat

atau membatasi proses perusakan jaringan (Semiawan dkk, 2015). Faktor-faktor

yang memicu penyembuhan luka meliputi suplai darah yang baik ke daerah cedera,

usia muda, nutrisi yang baik, pendekatan tepi luka yang baik, dan fungsi leukosit

serta respon peradangan yang normal. Penyembuhan luka dapat terganggu atau

6


lambat jika ada pemberian kortikosteroid atau adanya benda asing, jaringan

nekrotik atau infeksi pada luka (Price and Wilson, 2002).

2.3 Ekstrak dan Ekstraksi

Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi senyawa

aktif dari simplisia nabati atau simplisia hewani menggunakan pelarut yang sesuai,

kemudian semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang

tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan.

Sebagain besar ekstrak dibuat dengan mengekstraksi bahan baku obat secara

perkolasi. Seluruh perkolat biasanya dipekatkan secara destilasi dengan

pengurangan tekanan, agar bahan sesedikit mungkin terkena panas (DepKes, 2000).

Ekstraksi adalah kegiatan penarikan kandungan kimia yang dapat larut

sehingga terpisah dari bahan yang tidak dapat larut dengan menggunakan pelarut

cair. Senyawa aktif yang terdapat dalam berbagai simplisia dapat digolongkan

kedalam golongan minyak atsiri, alkaloida, flavonoida dan lain-lain. Dengan

diketahuinya senyawa aktif yang dikandung simplisia akan mempermudah

pemilihan pelarut dan cara ekstraksi yang tepat (DepKes, 2000).

Ada beberapa metode ekstraksi yang dikenal. Beberapa metode ekstraksi

dengan menggunakan pelarut dibagi menjadi dua cara, yaitu cara panas dan cara

dingin (DepKes, 2000).

2.3.1 Ekstraksi Cara Dingin

a) Maserasi

Maserasi adalah proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan

pelarut dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada suhu kamar.

Proses ekstraksi dilakukan dengan cara 10 bagian simplisia dengan derajat halus

yang cocok dimasukkan dalam bejana, dituangkan 75 bagian cairan penyari, ditutup

dan dibiarkan selama 5 hari terhindar dari cahaya sambil berulang-ulang diaduk,

lalu dipekatkan dengan penguapan dan tekanan pada suhu rendah 50 oC hingga

konsentrasi yang dikehendaki. Cara ekstraksi ini sederhana dan mudah dilakukan,

tetapi membutuhkan waktu yang lama (DepKes, 2000).

7


b) Perkolasi

Perkolasi adalah ekstraksi dengan pelarut yang selalu baru sampai sempurna

(exhaustive extraction) yang umumnya dilakukan pada temperatur ruangan. Proses

terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahap maserasi antara, tahap perkolasi

sebenarnya (penetasan/penampungan ekstrak), terus menerus sampai diperoleh

ekstrak (perkolat) yang jumlahnya 1-5 kali bahan (DepKes, 2000).

2.3.2 Ekstraksi Cara Panas

a) Refluks

Refluks merupakan ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik didihnya,

selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif konstan dengan

adanya pendingin balik. Umumnya dilakukan pengulangan proses pada residu

pertama sampai 3-5 kali sehingga dapat termasuk proses ekstraksi sempurna

(DepKes, 2000).

b) Sokhlet

Sokhlet merupakan salah satu metode esktraksi yang digunakan untuk

menarik senyawa organik dari jaringan tanaman kering (kayu, biji, akar, daun).

Sokhletasi merupakan ekstraksi cara panas dengan menggunakan pelarut yang

selalu baru mulai dari pelarut non polar (petroleum eter, kloroform) kemudian

dilanjutkan dengan pelarut yang lebih polar (etil asetat, alkohol). Ekstraksi ini

umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga ekstraksi berjalan secara

kontinyu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan adanya pendingin balik

(DepKes, 2000).

c) Digesti

Digesti adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinyu) pada

temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan (kamar), yaitu secara umum

dilakukan pada temperatur 40 – 50 oC (DepKes, 2000).

d) Infus

Infus adalah ekstraksi dengan pelarut air pada temperatur penangas air

(bejana infus tercelup dalam penangas air mendidih, temperatur terukur 96 – 98 oC)

selama waktu tertentu (15 – 20 menit) (DepKes, 2000).

8


e) Dekok

Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama (≤30 oC) dan temperatur

sampai titik didih air (DepKes, 2000).

2.4 Pelarut

Dalam proses ekstraksi suatu bahan tanaman, banyak faktor yang dapat

mempengaruhi kandungan senyawa hasil ekstraksi diantaranya : jenis pelarut,

konsentrasi pelarut, metode ekstraksi dan suhu yang digunakan untuk ekstraksi

(Senja dkk, 2014).

Suatu senyawa menunjukkan kelarutan yang berbeda pada pelarut yang

berbeda kepolarannya (Pranoto dkk, 2012).

2.4.1 Metanol

Metanol digunakan sebagai pelarut maserasi karena mampu melarutkan

hampir semua organik, baik polar, semi polar maupun non polar. Selain itu, metanol

mempunyai titik didih yang cukup rendah (64,5 oC), sehingga lebih mudah untuk

memisahkannya (Tanaya dkk, 2015). Menurut Harborne, semua flavonoid baik

dalam bentuk glikosida maupun flavonoid dalam bentuk bebas dapat larut dalam

pelarut metanol.

2.4.2 Etanol

Etanol disebut juga etil alkohol yang di pasaran lebih dikenal sebagai alkohol

merupakan senyawa organik dengan rumus kimia C2H5OH. Dalam kondisi kamar,

etanol berwujud cairan yang mudah menguap, mudah terbakar, tak berwarna

(Munawaroh dkk, 2010).

Pelarut etanol merupakan pelarut universal yang paling banyak digunakan

dalam proses isolasi senyawa organik bahan alam, karena etanol dapat

meningkatkan permeabilitas dinding sel simplisia sehingga proses ekstraksi lebih

efisien dalam menarik komponen polar hingga semipolar dan memiliki titik didih

rendah 78,37 oC serta tidak beracun, larut dalam air dan pelarut organik (Wati dkk,

2017).

9


2.4.3 Etil Asetat

Pelarut semipolar misalnya etil asetat dapat menarik senyawa fenol dan

terpenoid, sedangkan pelarut polar seperti metanol dapat menarik senyawa alkaloid

kuartener, komponen fenolik, karotenoid, dan tannin (Pranoto dkk, 2012).

2.4.4 n-Heksana

Heksana adalah sebuah senyawa hidrokarbon alkane dengan rumus kimia

C6H14. Awalan heks- merujuk pada enam karbon atom yang terdapat pada heksana

dan akhiran –ana berasal dari alkana, yang merujuk pada ikatan tunggal yang

menghubungkan atom-atom karbon tersebut. Dalam keadaan standar senyawa ini

merupakan cairan tak berwarna yang tidak larut dalam air (Munawaroh dkk, 2010).

2.5 Kromatografi

Pemisahan dan pemurnian kandungan tumbuhan terutama dilakukan dengan

menggunakan teknik kromatografi. Kromatografi adalah teknik pemisahan suatu

campuran berdasarkan perbedaan migrasi analit diantara dua fase, yaitu fase diam

dan fase gerak, dimana fase diamnya dapat berupa zat padat atau zat cair dan fase

geraknya dapat berupa gas atau zat cair (Sudjadi, 1985).

2.5.1 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi Lapis Tipis adalah salah satu metode pemisahan kromatografi

yang fleksibel dan banyak digunakan. Peralatan dan bahan yang dibutuhkan untuk

melaksanakan pemisahan dan analisis sampel dengan metode KLT cukup

sederhana yaitu sebuah bejana tertutup (chamber) yang berisi pelarut dan lempeng

KLT (Wulandari, 2011).

Pelaksanaan analisis dengan KLT diawali dengan menotolkan alikuot kecil

sampel pada salah satu ujung fase diam (lempeng KLT), untuk membentuk zona

awal. Kemudian sampel dikeringkan. Ujung fase diam yang terdapat zona awal

dicelupkan ke dalam fase gerak (pelarut tunggal ataupun campuran dua sampai

empat pelarut murni) di dalam chamber. Jika fase diam dan fase gerak dipilih

dengan benar, campuran komponen-komponen sampel bermigrasi dengan

kecepatan yang berbeda selama pergerakan fase gerak melalui fase diam. Hal ini

disebut dengan pengembangan kromatogram. Ketika fase gerak telah bergerak

sampai jarak yang diinginkan, fase diam diambil, fase gerak yang terjebak dalam

10


lempeng dikeringkan, dan zona yang dihasilkan dideteksi secara langsung (visual)

atau dibawah sinar ultraviolet (UV) baik dengan atau tanpa penambahan pereaksi

penampak noda yang cocok (Wulandari, 2011).

Perbedaan migrasi merupakan hasil dari perbedaan tingkat afinitas masing-

masing komponen dalam fase diam dan fase gerak. Kecepatan migrasi komponen

sampel tergantung pada sifat fisika kimia dari fase diam, fase gerak dan komponen

sampel. Retensi dan selektivitas kromatografi juga ditentukan oleh interaksi antara

fase diam, fase gerak dan komponen sampel yang berupa ikatan hydrogen,

pasangan elektron donor atau pasangan elektron-akseptor (transfer karge), ikatan

ion-ion, ikatan ion-dipol, dan ikatan van der Waals (Wulandari, 2011).

Pada Kromatografi Lapis Tipis, identifikasi awal suatu senyawa didasarkan

pada perbandingan nilai Rf dibandingkan Rf standar. Nilai Rf umumnya tidak sama

dari laboratorium ke laboratorium bahkan pada waktu analisis yang berbeda dalam

laboratorium yang sama, sehingga perlu dipertimbangkan penggunaan Rf relatif

yaitu nilai Rf noda seyawa dibandingkan noda senyawa lain dalam lempeng yang

sama. Faktor-faktor yang menyebabkan nilai Rf bervariasi meliputi dimensi dan

jenis ruang, sifat dan ukuran lempeng, arah aliran fase gerak, volume dan komposisi

fase gerak, kondisi kesetimbangan, kelembaban, dan metode persiapan sampel KLT

sebelumnya. Konfirmasi identifikasi dapat diperoleh dengan mengerok noda dalam

lempeng kemudian analit dalam lempeng dielusi dan dideteksi dengan spektrometri

inframerah (IR), spektrometri Nuclear Magnetic Resonance (NMR), spektrometri

massa, atau metode spektrometri lain jika senyawa hasil elusi cukup tersedia.

Metode identifikasi ini juga dapat menggunakan untuk menandai zona langsung

pada lapisan (Wulandari, 2011).

2.5.2 KLT Preparatif

Kromatografi lapis tipis preparatif (KLTP) adalah salah satu metode yang

memerlukan pembiayaan paling murah dan memakai peralatan paling dasar.

Ketebalan penjerap (adsorben) yang paling sering dipakai pada KLTP adalah

sekitar 0,5-2 mm. Ukuran pelat kromatografi biasanya 20 x 20 cm atau 20 x 40 cm.

Pembatasan ketebalan lapisan dan ukuran pelat sudah tentu mengurangi jumlah

bahan yang dapat dipisahkan dengan KLTP. Penjerap yang paling umum digunakan

11


ialah silika gel dan dipakai untuk pemisahan campuran senyawa lipofil maupun

campuran senyawa hidrofil (Hostettmann, et al., 1995)

Cuplikan pada KLTP dilarutkan dalam sedikit pelarut sebelum ditotolkan

pada pelat KLTP. Pelarut yang baik adalah pelarut atsiri (heksana, diklorometana,

etil asetat), karena jika pelarut kurang atsiri akan terjadi pelebaran pita. Konsentrasi

cuplikan harus sekitar 5%-10%. Cuplikan ditotolkan berupa pita yang harus

sesempit mungkin karena pemisahan tergantung pada lebar pita (Hostettmann, et

al., 1995)

Pengembangan plat KLT preparatif dilakukan dalam bejana kaca yang dapat

menampung beberapa plat. Bejana dijaga tetap jenuh dengan pelarut pengembang

dengan bantuan kertas saring yang diletakkan berdiri disekeliling permukaan

bagian dalam bejana. Kebanyakan penjerap KLT preparatif mengandung indikator

fluoresensi yang membantu mendeteksi letak pita yang terpisah pada senyawa yang

menyerap sinar ultraviolet (Hostettmann, et al., 1995).

2.5.3 Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang digunakan

untuk memisahkan senyawa-senyawa dalam jumlah banyak berdasarkan adsorpsi

dan partisi (Gritter, et al., 1991). Kromatografi kolom membutuhkan zat terlarut

yang terdistribusi diantara dua fase, satu diantaranya fase diam dan yang lainnya

fase gerak. Fase gerak membawa zat terlarut melalui media, hingga terpisah dari

zat terlarut lain yang terelusi lebih awal atau akhir. Umumnya zat terlarut dibawa

melewati media pemisah oleh aliran suatu pelarut berbentuk cairan atau gas yang

disebut pelarut (Harborne, 1987).

Pada kromatografi kolom, tabung pemisah diisi penjerap. Penjerap yang biasa

digunakan ialah silika gel. Pengisian ini harus dilakukan secara berhati-hati dan

merata. Penjerap dapat dikemas dalam tabung dengan cara basah maupun kering

(Harborne, 1987).

Fraksi yang diperoleh dari kolom kromatografi ditampung dan dimonitor

dengan kromatografi lapis tipis. Fraksi-fraksi yang memiliki pola kromatogram

yang sama digabung kemudian pelarutnya diuapkan sehingga akan diperoleh

beberapa fraksi. Noda pada plat KLT dideteksi dengan lampu ultraviolet pada

12


panjang gelombang 254 nm atau 366 nm untuk senyawa-senyawa yang mempunyai

gugus kromofor (Stahl, 1969).

2.5.4 GC-MS (Gas Chromatography – Mass Spectroscopy)

GCMS saat ini menjadi alat yang handal untuk penentuan struktur molekul

senyawa organik, khususnya untuk senyawa organik yang cukup volatil. Bahkan,

beberapa senyawa yang memiliki titik didih cukup tinggi, seperti minyak dengan

asam lemak rantai panjang, masih dapat dianalisis langsung dengan GCMS,

sedangkan jika dianalisis dengan GC saja (tanpa MS) harus diesterifikasi terlebih

dahulu untuk menurunkan titik didih. Hal ini disebabkan pada GCMS, perangkat

MS dilengkapi sistem vakum hingga 10-6 torr yang sangat membantu dalam proses

penguapan cuplikan (Panji, 2012).

GCMS juga tidak memerlukan senyawa standar seperti pada analisis dengan

GC, karena spektrum senyawa standar pembanding sudah ada di dalam memory

bank/basis data computer. Dengan demikian analisis dengan GCMS menjadi lebih

mudah (Panji, 2012).

GC dan MS sangat compatible (cocok), karena senyawa yang keluar dari

kolom GC berupa gas atau uap, dan yang dibutuhkan oleh MS juga senyawa dalam

fasa uap. Banyak senyawa volatil yang dapat dianalisis dengan GCMS tanpa

bantuan spektroskopi lainnya (Panji, 2012).

2.6 Spektrofotometer UV-Visible

Spektrofotometer sesuai dengan namanya adalah alat yang terdiri dari

spektrometer dan fotometer. Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum

dengan panjang gelombang tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas

cahaya yang ditransmisikan atau yang diabsorpsi. Jadi spektrofotometer digunakan

untuk mengukur energi secara relatif jika energi tersebut ditransmisikan,

direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang gelombang. Kelebihan

spektrofotometer dibandingkan fotometer adalah panjang gelombang dari sinar

putih dapat lebih terseleksi dan ini diperoleh dengan alat pengurai seperti prisma,

grating ataupun celah optis (Khopkar, 2003).

Interaksi senyawa organik dengan sinar ultraviolet dan sinar tampak, dapat

digunakan untuk menentukan struktur molekul senyawa organik. Bagian dari

13


molekul yang paling cepat bereaksi dengan sinar tersebut adalah elektron-elektron

ikatan dan elektron-elektron nonikatan (elektron bebas). Sinar ultra lembayung dan

sinar tampak merupakan energi, yang bila mengenai elektron-elektron tersebut,

maka elektron akan tereksitasi dari keadaan dasar ke tingkat energi yang lebih

tinggi, eksitasi elektron-elektron ini, direkam dalam bentuk spektrum yang

dinyatakan sebagai panjang gelombang dan absorbansi, sesuai dengan jenis

elektron-elektron yang terdapat dalam molekul yang dianalisis. Makin mudah

elektron-elektron bereksitasi makin besar panjang gelombang yang diabsorbsi,

makin banyak elektron yang bereksitasi makin tinggi absorban (Suhartati, 2017).

2.7 Spektroskopi NMR (Nucleic Magnetic Resonance)

Dasar spektroskopi NMR (Nucleic Magnetic Resonance) adalah resonansi

dari spin inti atom penyusun molekul akibat pengaruh dari medan magnet luar.

Resonansi terjadi antara frekuensi presesi spin inti atom (dalam hal ini adalah atom

H untuk H-NMR) dengan frekuensi radio yang sengaja diberikan (Panji, 2012).

Resonansi Magnet Inti yang dikenal ada dua macam, yaitu Resonansi Magnet

Inti Atom Hidrogen atau Resonansi Magnet Proton/Proton Magnetic Resonance

(H-NMR) dan Resonansi Magnet Inti Atom Karbon (13C-NMR). Penggunaan 13C-

NMR sampai saat ini tidak seluas H-NMR. Identifikasi terbentuknya trans-

poliisoprena dari hasil isomerisasi cis-poliisoprena merupakan salah satu manfaat

13C-NMR (Panji, 2012).

Pada H-NMR, yang dilihat hanya sifat magnet inti atom-atom H dalam suatu

molekul. Sifat magnet atom H berbeda-beda tergantung di mana atom H tersebut

terikat. Resonansi dari proton ini juga akan memberikan informasi tentang

lingkungannya, serta proton tetangganya (Panji, 2012).

2.8 Bovine Serum Albumin (BSA)

Bovine Serum Albumin (BSA) adalah protein globular yang berukuran besar

(66.000 Dalton). BSA merupakan rantai polipeptida tunggal yang teridiri dari

sekitar 583 residu asam amino. Pada pH 5-7 mengandung 17 jembatan disulfida

intrasin dan 1 kelompok sulfihidril. Albumin merupakan kelompok potein yang

larut dalam air. Stabilitas larutan BSA sangat baik. Bahkan, albumin sering

14


digunakan sebagai stabilisator untuk protein terlarut lainnya (misalnya, enzim

labil). Namun, albumin mudah menggumpal akibat adanya pemanasan. Ketika

dipanaskan pada suhu 50 0C atau lebih albumin akan membentuk agregat hidrofobik

yang tidak kembali ke monomer pada saat didinginkan. Pada suhu rendah, agregasi

juga mungkin terjadi tetapi relatif lebih lambat (www.sigma-aldrich.com).

2.9 Skrining Fitokimia

Skrining fitokimia merupakan analisis kualitatif terhadap senyawa-senyawa

metabolit sekunder. Suatu ekstrak dari bahan alam terdiri atas berbagai macam

metabolit sekunder yang berperan dalam aktivitas biologinya. Senyawa-senyawa

tersebut dapat diidentifikasi dengan pereaksi-pereaksi yang mampu memberikan

ciri khas dari setiap golongan dari metabolit sekunder (Harborne,1987).

Senyawa metabolit sekunder yang biasanya dilakukan penapisan fitokimia

pada tumbuhan biasanya antara lain alkaloid, flavonoid, saponin, tannin, terpenoid

dan steroid.

http://www.sigma-aldrich.com/


BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan mulai bulan Februari 2018 – Mei 2018 dan bertempat

di Laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia dan Laboratorium Penelitian I

Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat

Alat yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : Gas Chromatography-

Mass Spectrometry (Agilent 7890A), Nuclear Magnetic Resonance (Jeol, 500

MHz), seperangkat alat vaccum rotary evaporator (EYELA), water bath (SB-1000

EYELA), spektrofotometri UV-Visible (HITACHI), plat aluminium TLC silica gel

60 F245 (MERCK), chamber KLT, blender, kolom kromatografi, statif, timbangan

analitik (AND), pH meter (HORIBA), labu erlenmeyer (SCHOTT DURAN), labu

ukur 100 ml, 25 ml, 10 ml, 5 ml (IWAKI PYREX), beker gelas (SCHOTT

DURAN), gelas ukur 100 ml (YZ), corong (SCHOTT DURAN), tabung reaksi

(IWAKI PYREX), rak tabung reaksi, spatula, botol gelap, batang pengaduk, pipet

tetes, mikro pipet (Eppendorf), vortex, aluminium foil, kertas berlabel, kertas

saring, kapas.

3.2.2 Bahan

Sampel tumbuhan yang digunakan adalah rimpang temu giring (Curcuma

heyneana Val) yang diperoleh pada bulan Agustus 2017 dari Balai Penelitian

Tanaman Rempah dan Obat (Balitro) yang selanjutnya dideterminasi di Herbarium

Bogoriense (LIPI), Cibinong, Bogor.

Media uji yang digunakan adalah Bovine Serum Albumin (BSA) yang

diperoleh dari Sigma-Aldrich (PT. ELO KARSA UTAMA Jakarta)

Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : silica gel 60

(MERCK), n-heksan, etil asetat, etanol 70%, metanol, aqua pro injeksi, NaCl, Tris

base dan Tris buffer saline. Reagen kimia antara lain : dragendrof, mayer, asam

16


sulfat, natrium hidroksida, asam asetat glasial, kloroform, ferri klorida, asam

klorida, asam asetat anhidrat. Standar obat kimia yang digunakan sebagai kontrol

positif adalah Natrium Diklofenak (Sigma).

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Determinasi Tumbuhan

Untuk memastikan kebenaran simplisia yang digunakan dalam penelitian ini,

maka perlu dilakukan determinasi di Pusat Penelitian Herbarium Bogoriense, LIPI,

Cibinong, Bogor.

3.3.2 Penyiapan Simplisia

Bahan yang digunakan sebagai simplisia dalam penelitian ini adalah temu

giring (Curmcuma heyneana Val) yang diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman

Rempah dan Obat (Balitro) pada bulan Agustus 2017. Simplisia temu giring

(Curcuma heyneana Val) dilakukan sortasi basah untuk memisahkan kotoran atau

bahan-bahan asing lainnya yang terdapat pada rimpang. Selanjutnya simplisia

dikering anginkan. Simplisia yang telah kering kemudian disortasi kering dan

dihaluskan dengan menggunakan blender. Serbuk simplisia disimpan dalam wadah

tertutup rapat dan terhindar dari cahaya matahari.

3.3.3 Pembuatan Ekstrak

Prosedur ekstraksi menggunakan metode ekstraksi cara dingin dengan teknik

maserasi. Pelarut yang digunakan adalah etanol 70%. Serbuk simplisia sebanyak

1600 gram dari temu giring (Curcuma heyneana Val) dimasukkan kedalam wadah

gelap sehingga terhindar dari cahaya matahari. Kemudian ditambahkan pelarut

etanol kedalam botol maserasi dan dilakukan maserasi selama 3-4 hari, dengan

sesekali pengadukan. Setelah proses ekstraksi selesai, filtrat disaring menggunakan

kapas dan kertas saring untuk memisahkan filtrat dan ampas. Filtrat yang diperoleh

kemudian diuapkan dengan vacuum rotary evaporator sehingga diperoleh ektrak

kental.

17


3.3.4 Penapisan Fitokimia

1) Uji Alkaloid

Ekstrak dilarutkan dengan larutan asam klorida encer, kemudian disaring.

Filtrat yang dihasilkan dapat dilakukan pengujian dengan cara Tes Mayer dan Tes

Dragendroff (Tiwari, et al, 2011).

a. Tes Mayer

Filtrat dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan reagen mayer

(potassium mercuri iodide). Terbentuknya endapan warna kuning menunjukkan

adanya senyawa alkaloid.

b. Tes Dragendroff

Filtrat dimasukkan ke dalam tabung reaksi, lalu ditambahkan reagen

dragendroff (larutan potassium bismuth iodide). Terbentuknya endapan warna

merah menunjukkan adanya senyawa alkaloid.

2) Uji Saponin

Ekstrak etanol temu giring (Curcuma heyneana Val) dilakukan pengujian

dengan tes Foam dengan melarutkan ekstrak ke dalam 2 ml aquades di dalam

tabung reaksi, kemudian larutan dikocok. Terbentuknya foam tidak kurang dari 10

menit menunjukkan adanya senyawa saponin (Tiwari, et al, 2011).

3) Uji Tanin

Sebanyak 0,5 gram ekstrak etanol dari temu giring (Curcuma heyneana Val)

dididihkan dalam 10 ml air di dalam tabung reaksi dan kemudian disaring.

Ditambahkan beberapa tetes FeCl3 0,1% dan diamati. Jika terjadi perubahan warna

hijau kecokelatan atau biru kehitaman menunjukkan adanya senyawa tanin

(Ayoola, et al, 2008).

4) Uji Fenol

Ekstrak etanol dari temu giring (Curcuma heyneana Val) dilakukan pengujian

dengan tes Ferric Chloride. Ekstrak ditambahkan 3 – 4 tetes larutan FeCl3.

Terbentuknya warna hitam kebiru-biruan menunjukkan adanya senyawa fenol

(Tiwari, et al, 2011).

18


5) Uji Flavonoid

Ekstrak etanol dari temu giring (Curcuma heyneana Val) diletakkan di dalam

plat tetes lalu ditambahkan beberapa tetes NaOH. Terbentuknya kuning intens yang

jika ditambahkan dengan larutan asam, warna kuning akan memudar, hal ini

menunjukkan adanya senyawa flavonoid (Tiwari et al, 2011).

6) Uji Steroid dan Terpenoid

a. Tes Salkowski

Sejumlah ekstrak dilarutkan dalam kloroform dan disaring. Kemudian filtrat

ditambahkan beberapa tetes asam sulfat dan dikocok. Terbentuknya warna merah

kecokelatan mengindikasikan adanya senyawa terpenoid (Ayoola, et al, 2008).

b. Tes Lieberman Buchard

Sejumlah ekstrak dilarutkan dalam kloroform dan disaring, filtrat

ditambahkan beberapa tetes asam asetat anhidrat, kemudian dipanaskan dan

didinginkan. Selanjutnya larutan ditambahkan beberapa tetes asam sulfat.

Terbentuknya cincin cokelat mengindikasikan adanya senyawa steroid (Tiwari, et

al, 2011).

3.3.5 Penentuan Pola Kromatogram

1) Kromatografi Lapis Tipis

Ekstrak temu giring (Curcuma heyneana Val) yang didapat, dilakukan analisa

menggunakan KLT untuk mengamati pola pemisahannnya. Fase diam pada plat

KLT adalah silika gel 60 GF. Plat silika gel dibuat dengan ukuran lebar 1 cm dan

panjang 5 cm pada ujung atas dan bawah diberi batas 0,5 cm. Selajutnya fase gerak

dibuat dari n-heksana dan etil asetat dengan berbagai perbandingan. Fase gerak

yang telah dibuat, dimasukkan ke dalam bejana KLT dan dijenuhkan terlebih

dahulu dengan kertas saring.

Ekstrak yang akan diuji kemudian dilarutkan dalam etanol hingga larut

sempurna. Setelah itu ditotolkan pada batas bawah plat KLT dengan menggunakan

pipa kapiler dan dibiarkan hingga mengering. Plat KLT yang telah ditotol kemudian

dimasukkan kedalam bejana KLT yang berisi fase gerak. Ketika fase gerak telah

mencapai batas akhir elusi, plat KLT diangkat dan dikeringkan.

19


Bercak yang dihasilkan kemudian diamati dibawah lampu UV pada panjang

gelombang 254 nm dan 366 nm. Dari hasil KLT, dilihat dan ditentukan kombinasi

sistem fase gerak yang memberikan pola pemisahan yang baik.

2) GCMS

Ekstrak yang didapat kemudian dilakukan analisa pola kromatogram dengan

instrumen GCMS. Optimasi alat dilakukan menggunakan kolom HP-5MS (30 m x

– 0,25 mm ID x 0,25 µm) suhu awal 70 oC selama 2 menit, dinaikkan ke suhu 285

oC dengan kecepatan 20 oC/min selama 20 menit. Suhu MSD 285 oC. Kecepatan

aliran yang digunakan 1,2 mL/min dengan split 1:100. Parameter scanning

dilakukan dari massa paling rendah yaitu 35 sampai paling tinggi 550.

3.3.6 Isolasi dan Pemurnian Senyawa

1) Fraksinasi

Pemisahan senyawa yang terkandung dalam ekstrak temu giring dilakukan

dengan menggunakan cara ekstraksi cair-cair. Ekstrak etanol temu giring (Curcuma

heyneana Val) yang akan difraksinasi dilarutkan terlebih dahulu dengan pelarut

etanol hingga larut sempurna kemudian dicampurkan dengan pelarut n-heksan ke

dalam corong pisah. Setelah corong pisah dikocok perlahan beberapa menit

kemudian dibiarkan hingga terbentuk batas yang jelas antara fraksi n-heksan dan

etanol. Proses fraksinasi dikatakan selesai apabila pelarut telah berubah warna

menjadi lebih jernih. Setelah dilakukan fraksinasi pelarut n-heksan kemudian

dilanjutkan dengan pelarut etil asetat dan dilakukan sama seperti fraksinasi n-

heksan.

2) Kromatografi Kolom

Pemisahan dengan kromatografi kolom dilakukan terhadap ekstrak etil asetat

temu giring (Curcuma heyneana Val) dengan menggunakan fase diam silika gel 60.

Kolom dipasang pada statif. Pada ujung bagian bawah dalam kolom diberi kapas

kemudian dialiri dengan pelarut n-heksana. Kolom yang digunakan berdiameter 3

cm dan tinggi 73 cm. Silika gel 60 (fase diam) sebanyak 150 g yang telah ditimbang

kemudian dimasukkan ke dalam gelas beker dan ditambahkan pelarut n-heksana

secukupnya lalu diaduk, selanjutnya dimasukkan ke dalam kolom sedikit demi

sedikit sambil diketuk perlahan hingga silika memadat dan permukaannya rata.

20


Sebanyak 12,73 g ekstrak yang telah ditimbang kemudian dilarutkan dengan

etanol 70% secukupnya. Kemudian diletakkan diatas silika gel yang telah siap dan

dielusi dengan fase gerak. Campuran pelarut sebagai fase gerak dengan kepolaran

bertingkat yaitu digunakan n-heksana, etil asetat, dan etanol dengan berbagai

perbandingan. Fase gerak dibuat sebanyak 250 mL dimasukkan ke dalam kolom

sedikit demi sedikit sambil kran dibuka, eluat yang keluar dari kolom ditampung

dalam vial dan diberi nomor.

Uji dengan KLT dilakukan pada setiap vial dengan eluen yang sesuai.

Kemudian setiap fraksi dilakukan penggabungan berdasarkan kesamaan pola

kromatogramnya dan dilakukan pemurnian.

3) Kromatografi Lapis Tipis

Pengujian dengan KLT dilakukan dengan menggunakan plat silika gel 60 GF

sebagai fase diam. Plat silika gel dibuat dengan ukuran lebar 1 cm dan panjang 5

cm pada ujung atas dan bawah diberi batas 0,5 cm. Untuk menentukan pengembang

yang optimum, dicoba berbagai komposisi pengembang.

KLT diujikan terhadap ekstrak etil asetat temu giring (Curcuma heyneana

Val) hasil partisi. KLT juga diujikan terhadap fraksi yang didapatkan seteah

dilakukan pemisahan (kromatografi kolom). Ekstrak atau fraksi yang akan diuji

dilarutkan dalam beberapa mililiter pelarut yang sesuai, lalu ditotolkan pada titik

awal pergerakan dengan menggunakan pipa kapiler. Setelah totolan kering,

dilakukan pengelusian di dalam bejana KLT yang telah dijenuhkan dan ditutup

rapat. Lempeng dikeluarkan dan dikeringkan setelah eluen mencapai garis atas.

Bercak diamati secara visual, dengan lampu UV pada panjang gelombang 254 nm

dan 366 nm.

3.3.7 Uji Kemurnian Senyawa Hasil Isolasi

1) Kromatografi Lapis Tipis Dua Dimensi

Uji kemurnian senyawa dilakukan dengan menggunakan kromatografi lapis

tipis dua dimensi. KLT dua dimensi dilakukan terhadap senyawa yang didapat dari

hasil kromatografi lapis tipis preparatif. Plat KLT dibuat dengan bentuk bujur

sangkar yang setiap sisinya memiliki ukuran 5 cm. Kemudian senyawa yang ingin

diuji kemurniannya ditotolkan pada salah satu sisi plat dengan pipa kapiler,

selanjutnya plat KLT dielusi dengan fase gerak yang sesuai dan dibiarkan

21


mengering. Kemudian plat KLT diputar 90o dan dielusi kembali dengan

menggunakan fase gerak yang sama, bercak dilihat dibawah lampu UV 254 nm.

3.3.8 Penentuan Struktur Molekul Senyawa Hasil Isolasi

1) Analisa Struktur Senyawa Menggunakan 1H – NMR

Senyawa isolat yang telah didapatkan kemudian diidentifikasi struktur

molekul dengan menggunakan instrumen yaitu 1H – NMR (Proton Nuclear

Magnetic Resonance) dengan sistem konsol D22, yang beroperasi pada frekuensi

500 MHz (1H) dan 125 MHz (13C). Senyawa isolat murni dilarutkan dengan 1 ml

pelarut khusus untuk NMR. Kemudian dianalisa dengan menggunakan 1H – NMR.

Sebelum pengujian, terlebih dahulu dilakukan penyesuaian pada perlakuan

terhadap sampel, pelarut yang digunakan, dan pengaturan instrumen.

3.3.9 Uji In Vitro Aktivitas Antiinflamasi

a. Pembuatan Tris-Buffer Saline (TBS)

Sebanyak 0,121 gram tris base dan 0,87 gram NaCl ditambahkan aqua pro

injeksi sebanyak 90 mL. Selanjutnya pH diatur dengan asam asetat glasial hingga

pH 6,2 – 6,5 kemudian dicukupkan dengan aqua pro injeksi hingga volume 100 mL.

(Mohan, 2003).

b. Pembuatan Larutan 0,2% BSA dalam TBS

Sebanyak 0,2 gram Bovine Serum Albumin (BSA) dimasukkan ke dalam labu

ukur 100 mL. Kemudian ditambahkan dengan larutan TBS hingga volume 100 mL

(William, et al, 2008).

c. Pembuatan Larutan Kontrol Negatif

Sebanyak 50 µL pelarut metanol ditambahkan dengan larutan 0,2% BSATBS

ke dalam labu ukur hingga volume 5 mL.

d. Pembuatan Larutan Kontrol Positif

Sebanyak 250 mg natrium diklofenak dilarutkan dengan metanol kemudian

dicukupkan dengan metanol hingga volume 25 mL di dalam labu ukur, sehingga

didapatkan larutan dengan konsentrasi 10.000 ppm sebagai larutan induk. Larutan

induk dengan konsentrasi 10.000 ppm dibuat seri konsentrasi larutan kontrol positif

menjadi 1000 ppm, 100 ppm dan 10 ppm. Kemudian diambil 50 µL dari tiap seri

konsentrasi dan ditambahkan dengan larutan 0,2% BSATBS hingga volume 5 mL.

22


e. Pembuatan Larutan Uji (Ekstrak etanol)

Sebanyak 10 mg ekstrak etanol temu giring (Curcuma heyneana Val)

dilarutkan dengan metanol hingga volume 1 mL dalam tube eppendorf sehingga

didapatkan larutan dengan konsentrasi 10.000 ppm yang dijadikan sebagai larutan

induk. Dari larutan induk kemudian dibuat larutan dengan seri konsentasi 1000

ppm, 100 ppm, 10 ppm dan 1 ppm.

f. Pengukuran Aktivitas Antiinflamasi

Diambil sebanyak 50 µL dari setiap konsentrasi larutan (kontrol negatif,

kontrol positif, dan larutan uji), kemudian ditambahkan larutan 0,2% BSATBS

hingga volume 5 mL. Dari campuran tersebut akan menghasilkan konsentrasi 0,01

sampai 100 ppm. Larutan kemudian dipanaskan dan di shacker pada suhu 72 0C

selama 5 menit. Setelah dipanaskan larutan didiamkan selama 20 menit pada suhu

ruang, selanjutnya larutan divortex dan diukur absorbansinya dengan

spektrofotometer UV-Visible pada λ 660 nm (Komala et al, 2015,2017).

g. Perhitungan Presentase Penghambatan Denaturasi Protein

Presentase penghambatan denaturasi protein diukur dengan menggunakan

rumus sebagai berikut :

% inhibisi = Abs kontrol negatif − Abs larutan uji

Abs kontrol negatif 𝑥 100

Senyawa yang menghambat denaturasi protein lebih besar dari 20% dianggap

memiliki sifat antiinflamasi dan dapat digunakan sebagai nilai acuan untuk

pengembangan obat (Williams, et al, 2008).

h. Analisis Data

Data yang diperoleh dianalisis dengan uji saphiro-wilk untuk melihat

distribusi data dan dianalisa dengan uji levene untuk melihat homogenitas data. Jika

data terdistribusi normal dan homogen, maka dilanjutkan dengan uji Analisa

Varians (ANOVA) sehingga diperoleh apakah perbedaan yang diperoleh bermakna

atau tidak. Jika data tidak terdistribusi normal atau tidak homogen, maka

dilanjutkan dengan uji non parametrik kruskal-wallis. Jika hasil uji kruskal-wallis

berbeda bermakna, maka dilanjutkan dengan uji Beda Nyata Terkecil (BNT)

(Santoso, 2007).


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Determinasi

Determinasi rimpang temu giring (Curcuma heyneana Val) dilakukan di

Herbarium Bogoriense Bidang Botani, Puslit Biologi, LIPI, Cibinong, Bogor pada

tanggal 22 Desember 2017 dengan hasil determinasi membuktikan bahwa

tumbuhan yang digunakan yaitu tumbuhan Curcuma heyneana Val dengan famili

Zingiberaceae (Lampiran 6).

4.2 Preparasi Sampel

Tanaman yang digunakan pada penelitian ini adalah rimpang temu giring

(Curcuma heyneana Val) yang diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Rempah

dan Obat (Balitro) yang selanjutnya dideterminasi di Herbarium Bogoriense (LIPI),

Cibinong, Bogor.

Sebanyak 10 Kg rimpang temu giring segar disiapkan. Rimpang temu giring

dibersihkan dari kotoran yang menempel dengan dicuci menggunakan air mengalir

hingga bersih. Rimpang temu giring kemudian dirajang tipis dan dikering anginkan

di dalam ruangan yang terhindar dari cahaya untuk mencegah terjadinya paparan

cahaya matahari langsung yang berpotensi merusak senyawa yang terkandung.

Setelah kering kemudian dihaluskan menggunakan blender hingga menjadi serbuk.

Rimpang temu giring dihaluskan dengan tujuan untuk memperbesar luas

permukaan sehingga memperbesar kontak dengan pelarut dan proses ekstraksi

dapat berjalan lebih maksimal. Hasil penyiapan ini mendapatkan berat bersih

serbuk simplisia sebanyak 1,95 Kg.

4.3 Ekstraksi

Ekstraksi dilakukan dengan cara dingin (maserasi). Proses ekstraksi dengan

teknik maserasi dilakukan dengan beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada

suhu ruang. Teknik maserasi dipilih karena memiliki kelebihan yaitu mudah

dilakukan dan tidak perlu pemanasan sehingga memperkecil kemungkinan senyawa

menjadi rusak dan terurai. Serbuk rimpang temu giring sebanyak 1,6 Kg dilakukan

24


maserasi dengan pelarut etanol 70%. Proses maserasi dilakukan hingga hasil

maserat mendekati hampir tidak berwarna. Penyaringan hasil maserasi dilakukan

selama tiga hari sekali menggunakan kertas saring. Selama proses maserasi,

dilakukan pengocokan setiap 24 jam sekali dengan tujuan untuk memaksimalkan

proses penyarian metabolit sekunder yang terkandung dalam rimpang temu giring.

Maserat yang telah disaring kemudian dipekatkan dengan menggunakan

vacuum rotary evaporator dengan suhu ± 38 oC. Hasil ekstrak kental temu giring

yang didapatkan sebanyak 129,95 gram. Rendemen kemudian dihitung terhadap

berat awal simplisia.

% 𝑟𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛 =𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑝𝑒𝑟𝑜𝑙𝑒ℎ (𝑔)

𝐵𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑙𝑖𝑠𝑖𝑎 𝑎𝑤𝑎𝑙 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑡𝑖𝑚𝑏𝑎𝑛𝑔 (𝑔) 𝑥 100 %

Tabel 4.1. Rendemen Ekstrak Etanol Temu Giring

Total Simplisia (Kg) Ekstrak Bobot (g) % Rendemen

1,6 Kg Etanol 129,95 8,121

4.4 Penapisan Fitokimia

Hasil uji penapisan fitokimia ekstrak etanol temu giring (Curcuma heyneana

Val) dapat dilihat pada Tabel 4.2. (Lampiran 8):

Tabel 4.2. Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak Etanol Temu Giring

NO Golongan Kimia Hasil Pengamatan

1 Alkaloid -

2 Saponin +

3 Tanin +

4 Fenol -

5 Flavonoid +

6 Terpenoid +

7 Steroid -

25


4.5 Penentuan Pola Kromatogram Ekstrak Etanol Rimpang Temu Giring

dengan GCMS

Pola kromatogram GCMS dari ekstrak etanol rimpang temu giring terlihat

memiliki puncak tinggi pada waktu retensi 10,099 menit, 10,322 menit dan 10,423

menit. Hasil dari pola kromatogram ini dijadikan pedoman untuk proses isolasi

lebih lanjut.

Gambar 4.1. Pola GC Ekstrak Etanol Rimpang Temu Giring

4.6 Isolasi Senyawa Murni

4.5.1 Fraksinasi

Sebanyak 40,85 g ekstrak etanol rimpang temu giring dipisahkan dengan

proses partisi cair-cair. Pemisahan senyawa dengan partisi cair-cair didasarkan pada

perbedaan kepolaran. Senyawa yang bersifat nonpolar akan tertarik pada pelarut

nonpolar begitu pula untuk senyawa yang bersifat semipolar dan polar. Partisi cair-

cair dilakukan dengan menggunakan corong pisah. Ekstrak etanol rimpang temu

giring yang telah ditimbang selanjutnya dilarutkan dengan pelarut etanol, kemudian

dilakukan partisi dengan pelarut yang kepolarannya semakin meningkat yaitu n-

heksana dan etil asetat. Proses partisi dikatakan selesai apabila pelarut telah berubah

warna menjadi lebih jernih. Hasil dari partisi kemudian dipekatkan dengan vacuum

26


rotary evaporator dan didapatkan ekstrak kental etil asetat temu giring sebanyak

12,73 g.

Tabel 4.3. Persen Rendemen Fraksi Hasil Partisi

Total Simplisia (g) Fraksi Bobot (g) % Rendemen

40,85 N-heksana 5,1 12,48

Etil Asetat 12,73 31,16

4.5.2 Analisa Awal Fraksi Etil Asetat Menggunakan KLT

Identifikasi menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) dilakukan untuk

mendeteksi keberagaman kandungan senyawa yang terdapat pada suatu ekstrak dan

kemungkinan kemudahan dari kandungan senyawa tersebut untuk diisolasi.

Kromatografi lapis tipis menggunakan dua fase yang terdiri dari fase diam berupa

silika gel 60 F254 dan fase geraknya merupakan pengembang yang terdiri dari

beberapa tingkatan kepolaran.

Analisa awal dengan KLT menggunakan pengembang n-heksana dan etil

asetat perbandingan 4:1. Fase gerak yang telah dibuat kemudian dimasukkan ke

dalam bejana KLT dan dipastikan kejenuhannya menggunakan kertas saring.

Ekstrak yang akan diuji dilarutkan sedikit dalam pelarut etanol kemudian ditotolkan

pada batas bawah KLT menggunakan pipa kapiler dan dibiarkan hingga mengering.

Plat KLT yang telah mengering kemudian dimasukkan ke dalam bejana untuk

dilakukan proses pengelusian. Ketika fase gerak telah mencapai batas atas, plat

KLT kemudian diangkat dan dibiarkan mengering untuk selanjutnya diamati

dibawah sinar UV.

(a) 254 nm (b) 365 nm

Gambar 4.2. Hasil KLT Fraksi Heksan dan Etil Asetat (4:1)

27


Berdasarkan pola bercak pada plat KLT ini dapat dideteksi keberagaman

senyawa yang terdapat dalam setiap fraksi, baik fraksi n-heksana maupun fraksi etil

asetat. Hasil kromatografi lapis tipis menunjukkan bahwa fraksi etil asetat memiliki

senyawa yang dapat diisolasi dengan mudah bila dibandingkan dengan fraksi n-

heksana. Pada hasil KLT fraksi etil asetat terlihat bercak yang sudah terpisah. Oleh

karena itu fraksi yang dilanjutkan untuk diisolasi adalah fraksi etil asetat.

4.5.3 Analisa Awal Fraksi Etil Asetat Menggunakan GCMS

Hasil analisa GCMS dari fraksi etil asetat rimpang temu giring menunjukkan

puncak tinggi pada waktu retensi 11,216 menit. Pada waktu retensi tersebut

diidentifikasi memiliki berat molekul 340,9 m/z. Pola kromatogram dari fraksi etil

asetat temu giring menunjukkan pola yang sesuai dengan hasil GCMS ekstrak

etanol rimpang temu giring.

Gambar 4.3. Pola GC Fraksi Etil Asetat Rimpang Temu Giring

28


Gambar 4.4. Pola MS Fraksi Etil Asetat Rimpang Temu Giring

4.5.4 Kromatografi Kolom Fraksi Etil Asetat

Isolasi ekstrak fraksi etil asetat dilakukan dengan menggunakan kromatografi

kolom. Kolom yang digunakan yaitu berdiameter 3 cm dan panjang 73 cm. Jumlah

ekstrak fraksi etil asetat yaitu sebanyak 12,73 gram. Silika gel yang digunakan

sebanyak 150 gram. Fase gerak yang digunakan dengan sistem gradien yaitu

dengan kepolaran yang bertingkat dari perbandingan pelarut nonpolar (n-heksana),

semipolar (etil asetat), dan polar (metanol), sebagai berikut :

a. n-heksana : etil asetat

- perbandingan 5:5

- perbandingan 4:6

- perbandingan 3:7

- perbandingan 2:8

- perbandingan 1:9

b. etil asetat 100%

c. etil asetat : metanol (kenaikan perbandingan 20%)

- perbandingan 8:2

- perbandingan 6:4

- perbandingan 4:6

- perbandingan 2:8

d. metanol 100%

29


Setiap fase gerak dibuat sebanyak 250 mL. Hasil elusi yang telah ditampung

dalam vial kemudian dianalisa dengan menggunakan kromatografi lapis tipis untuk

melihat pola bercak dibawah lampu UV 254 nm.

Kromatografi kolom fraksi etil asetat menghasilkan 170 vial dan dilakukan

KLT pada setial vial dengan nomor ganjil. Hasil KLT dengan spot yang sama

kemudian digabungkan dan didapatkan 6 fraksi A-F (Lampiran 10). Fraksi A terdiri

dari vial 1-7. Fraksi B terdiri dari vial 8-26. Fraksi C terdiri dari vial 27-37. Fraksi

D terdiri dari vial 38-49. Fraksi E terdiri dari vial 50-69. Fraksi F terdiri dari vial

73-87.

Berdasarkan hasil analisa menggunakan KLT, fraksi F memiliki bercak yang

tunggal pada panjang gelombang 254 nm. Selain itu fraksi F memiliki bobot yang

lebih banyak dibandingkan dengan fraksi yang lain sehingga fraksi F diputuskan

untuk diisolasi lebih lanjut dengan dimurnikan menggunakan kromatografi kolom

kembali. Jumlah fraksi F yaitu sebanyak 643 mg.

Tabel 4.4 Bobot Fraksi A-F

Fraksi Nomor Vial Bobot (mg)

A 1-7 444

B 8-26 217

C 27-37 418

D 38-49 433

E 50-69 503

F 73-87 643

Kromatografi kolom kedua dilakukan untuk proses pemurnian pada fraksi

gabungan F. Kolom yang digunakan lebih kecil dari kolom pertama yaitu

berdiameter 2 cm dan tinggi kolom 35 cm. Fase diam yang digunakan yaitu silika

gel 60 sebanyak 17 gram. Fase gerak yang digunakan yaitu n-heksana 100%,

campuran n-heksana:etil asetat dengan perbandingan kepolaran meningkat

(kenaikan perbandingan 20%) dan etil asetat 100%. Setiap perbandingan fase gerak

dibuat 150 mL. Jumlah vial yang didapatkan sebanyak 83 vial. Berdasarkan hasil

identifikasi pola kromatogram menggunakan KLT terlihat awal bercak pada vial

nomor 41 dan bercak mulai tidak terlihat pada vial nomor 51 sehingga dilakukan

30


penggabungan vial 41-49. Setelah dilakukan penggabungan, fraksi F4149

kemudian di KLT dan didapatkan hasil yaitu bercak tunggal yang jelas.

(a) (b)

Gambar 4.5. Hasil KLT Vial F Nomor 41-49

(a) Pada Panjang Gelombang 254 nm, (b) Pada panjang Gelombang 365 nm

Tabel 4.5 Karakteristik Senyawa F4149

Bentuk : Minyak

Warna : Kuning

Kelarutan : Etil Asetat

Bau : Aroma Temu

Bobot : 319 mg

Eluen : N-heksana : Etil (3:2)

Rf : 0,32

31


Ekstrak Etanol Temu Giring

Fraksi A

vial 1-7

444 mg

Fraksi B

vial 8-26

217 mg

Fraksi C

vial 27-37

418 mg

Fraksi D

vial 38-49

433 mg

Fraksi E

vial 50-69

503 mg

Fraksi F

vial 73-87

643 mg

Kromatografi Kolom II

Senyawa F4149

319 mg

Fraksi Etil Asetat

Kromatografi

Kolom I

Gambar 4.6. Bagan Isolasi Senyawa F4149

32


4.7 Uji Kemurnian Senyawa dengan KLT Dua Dimensi

KLT dua dimensi digunakan untuk menguji kemurnian suatu senyawa dengan

melihat bercak yang dihasilkan dengan kromatografi secara dua arah. Plat KLT

dibuat dengan bentuk persegi yang setiap sisinya memiliki ukuran yang sama yaitu

5 cm. Senyawa F4149 ditotolkan pada salah satu sisi plat dengan pipa kapiler

kemudian dielusi dengan fase gerak yang sesuai. Eluen yang digunakan untuk

mengelusi senyawa F4149 adalah n-heksana : etil asetat (2 :3). Plat KLT yang telah

mencapai batas atas kemudian dibiarkan hingga mengering dan selanjutnya

dilakukan pengelusian kembali dengan cara plat KLT diputar 90o.

Senyawa dapat dikatakan murni apabila memiliki bercak tunggal setelah

dilakukan pengujian dengan KLT dua dimensi. Hasil KLT dua dimensi senyawa

F4149 menunjukkan bercak tunggal dengan nilai Rf 0,32 dan titik leleh 111-1140C.

(a) (b)

Gambar 4.7 Hasil KLT Dua Dimensi

(a) Pada Panjang Gelombang 254 nm, (b) Pada Panjang Gelombang 365 nm

4.8 Penentuan Struktur Senyawa

4.8.1 GC-MS

Senyawa F4149 yang telah diisolasi kemudian dilakukan analisa pola

kromatogram dengan GCMS. Optimasi alat GCMS yaitu menggunakan kolom HP-

5MS (30 m x 0,25 mm ID x 0,25 μm) suhu awal 70oC selama 2 menit, dinaikkan

ke suhu 2850C dengan kecepatan 20oC/min selama 20 menit. Suhu MSD 285oC.

33


Kecepatan aliran yang digunakan 1,2 mL/min dengan split 1:100. Parameter

scanning dilakukan dari massa paling rendah yaitu 35 sampai paling tinggi 550.

Senyawa F4149 diidentifikasi dengan melihat waktu retensi dan pola

fragmentasi yang terlihat. Kromatogram isolat F4149 menunjukkan satu puncak

tunggal pada waktu retensi 11,2 menit dan berat molekul 234,1 m/z dengan

fragmentasi massa 216,1 m/z; 191,1 m/z; 173,1 m/z; 149 m/z; 123 m/z; 107 m/z;

81 m/z; 65 m/z; dan base peak 43 m/z. Dari satu puncak kromatogram yang

dihasilkan mengindikasikan bahwa isolat F4149 telah murni sehingga dapat

dilanjutkan untuk diidentifikasi lebih lanjut.

Gambar 4.8 Pola GC Senyawa F4149

34


Gambar 4.9. Pola MS Senyawa F4149

4.8.2 Resonansi Magnetik Inti Proton (1H-NMR)

Isolat yang didapatkan dari hasil kromatografi kolom kemudian dilakukan

identifikasi struktur molekul dengan menggunakan Nuclear Magnetic Resonance

proton (1H-NMR). Spektroskopi NMR merupakan salah satu instrumen yang

digunakan untuk menentukan struktur senyawa organik. Analisis struktur kimia

dengan 1H-NMR memungkinkan untuk mengetahui adanya proton dalam suatu

struktur molekul. Data yang dihasilkan dari 1H-NMR berupa pergeseran kimia yang

dapat dianggap sebagai ciri bagian tertentu dari suatu struktur molekul dan dapat

membantu mengidentifikasi tiap gugus suatu senyawa. Analisa 1H-NMR dilakukan

dengan menggunakan pelarut CDCl3, sistem konsol DD2 yang beroperasi pada

frekuensi 500 MHz (1H).

Analisa dengan 1H-NMR dilakukan terhadap senyawa F4149 yang telah

dilarutkan dengan CDCl3, maka diperoleh data spektrum NMR (lampiran 15). Hasil

analisa 1H-NMR mengindikasikan senyawa F4149 memiliki 5 metil pada δH 1,17

(d, 6H, 2CH3); δH 1,80 (s, 3H, CH3); δH 1,90 (s, 3H, CH3); dan δH 2,01 (s, 3H, CH3).

Pada δH 4,10 terdapat O-CH2 (d, 2H, OCH2), dan CH/CH2 pada masing-masing

pergeseran kimia 1,63-1,77 (m, 5H, CH/CH2); δH 1,91-1,98 (m, 4H, CH/CH2); δH

1,37; 2,57; 2,79; 2,93 (d, 1H- CH).

35


Gambar 4.10. Spektrum Hasil Analisis Senyawa F4149 Menggunakan 1H-NMR

Tabel 4.6. Hasil Analisis Senyawa F4149 Menggunakan 1H-NMR

Pergeseran Kimia

(δH)

Perkiraan

Jumlah H

Perkiraan Gugus

Fungsi

1,17 (d, 6H) 2 CH3

1,24 (t, 4H) 2 CH2

1,37 (t, 1H) CH

1,63-1,77 (m, 5H) CH/CH2

1,80 (s, 3H) CH3

1,90 (s, 3H) CH3

1,91-1,98 (m, 4H) CH/CH2

2,01 (s, 3H) CH3

2,57 (d, 1H) CH

2,79 (d, 1H) CH

2,93 (d, 1H) CH

4,10 (q, 2H) CH2-O

36


Pola struktur senyawa F4149 mirip dengan pola struktur senyawa

sesquiterpen yang juga merupakan senyawa major yang terkandung pada Curcuma

heyneana Val (Diastuti, dkk. 2014). Struktur senyawa F4149 belum dapat dianalisa

karena keterbatasan spektrum yang ada sehingga informasi yang dibutuhkan untuk

menganalisa struktur senyawa tidak cukup.

4.9 Uji Aktivitas Antidenaturasi Protein

Senyawa F4149 dilakukan uji aktivitas antidenaturasi protein secara In Vitro.

Natrium diklofenak digunakan sebagai kontrol positif yang memiliki aktivitas

antiinflamasi. Uji aktivitas antidenaturasi protein dilakukan dengan menggunakan

Bovine Serum Albumin karena memliki keuntungan yaitu praktis dan sederhana

dalam pengerjaan. Berdasarkan salah satu penyebab dari inflamasi yaitu terjadinya

denaturasi protein, oleh karena itu digunakan prinsip ini untuk melihat suatu

senyawa dalam mencegah denaturasi pada protein.

4.9.1 Hasil uji aktivitas antidenaturasi protein dari natrium diklofenak

Natrium diklofenak dengan variasi konsentrasi 0,1 ppm, 1 ppm, 10 ppm, dan

100 ppm kemudian dilakukan uji aktivitas antidenaturasi protein. Hasil uji aktivitas

antidenaturasi protein dari natrium diklofenak dapat dilihatr pada tabel 4.7 :

Tabel 4.7. Aktivitas Antidenaturasi Protein Natrium Diklofenak

Konsentrasi (ppm) Absorbansi ± SD % Inhibisi

Kontrol Negatif 0,577 ± 0,055 0

0,1 1,071± 0,086 - 85,6

1 0,679 ±0,002 - 17,6

10 0,454 ± 0,001 21,3

100 0,001 ± 0,0005 99,8

Aktivitas antidenaturasi protein natrium diklofenak pada konsentrasi 0,1 ppm

(-85,6%), 1 ppm (-17,6%), 10 ppm (21,3%) dan 100 ppm (99,8%). Aktivitas

antidenaturasi protein natrium diklofenak mulai terlihat pada konsentrasi 10 ppm.

Pada konsentrasi 10 ppm dan 100 ppm nilai persentase inhibisi denaturasi protein

lebih besar dari 20%. Persentase inhibisi tertinggi natrium diklofenak pada

konsentrasi 100 ppm sebesar 99,8%.

37


4.9.2 Hasil uji aktivitas antidenaturasi protein dari senyawa F4149

Senyawa F4149 dilakukan uji aktivitas antidenaturasi protein dengan variasi

konsentrasi yaitu 0,01 ppm, 0,1 ppm, 1 ppm, 10 ppm, dan 100 ppm. Hasil uji

aktivitas antidenaturasi protein senyawa F4149 dapat dilihat pada tabel 4.8 :

Tabel 4.8. Aktivitas Antidenaturasi Protein Senyawa F4149

Konsentrasi (ppm) Absorbansi±SD % inhibisi

Kontrol Negatif 0,148±0,037 0

0,1 0,056±0,002 62,33

1 0,068±0,002 54,03

10 0,064±0,004 56,95

100 0,098±0,005 33,63

Berdasarkan data hasil uji antidenaturasi protein di atas, senyawa F4149

memiliki potensi sebagai antiinflamasi karena dapat menghambat denaturasi

protein dengan persentase inhibisi >20%. Denaturasi protein adalah sebuah proses

dimana protein kehilangan struktur tersier dan struktur sekunder oleh senyawa

eksternal, seperti asam kuat atau basa kuat, garam organik, pelarut organik dan

pemanasan (Verma et al, 2011). Faktor-faktor yang menyebabkan terjadinya

denaturasi protein yaitu suhu, pH, tekanan, aliran listrik, adanya campuran bahan

kimia, alkohol, dan agen pereduksi. Metode yang digunakan untuk mendenaturasi

protein pada penelitian ini adalah dengan menggunakan panas atau suhu tinggi.

Suhu tinggi dapat meningkatkan energi kinetik dan menyebabkan molekul

penyusun protein bergerak atau bergetar sangat cepat sehingga mengacaukan ikatan

molekul. Protein yang terdenaturasi akan menyebabkan berkurangnya kelarutan

dalam cairan sehingga mudah mengendap.

Berdasarkan hasil data analisa statistik uji antidenaturasi protein dapat

disimpulkan bahwa perbedaan berbagai konsentrasi senyawa F4149 berbeda

bermakna dalam menghambat denaturasi protein.


BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

1. Senyawa hasil isolasi F4149 memiliki organoleptis berbentuk minyak dan

berwarna kekuningan dengan hasil KLT menghasilkan nilai Rf 0,32 dengan

pengembang n-heksana : etil asetat (3 : 2).

2. Hasil analisa 1H-NMR mengindikasikan senyawa F4149 memiliki 5 metil

pada δH 1,17 (d, 6H, 2CH3); δH 1,80 (s, 3H, CH3); δH 1,90 (s, 3H, CH3); dan

δH 2,01 (s, 3H, CH3). Pada δH 4,10 terdapat O-CH2 (d, 2H, OCH2), dan

CH/CH2 pada masing-masing pergeseran kimia 1,63-1,77 (m, 5H, CH/CH2);

δH 1,91-1,98 (m, 4H, CH/CH2); δH 1,37; 2,57; 2,79; 2,93 (d, 1H- CH).

3. Hasil uji antidenaturasi protein menunjukkan bahwa senyawa F4149

berpotensi sebagai antiinflamasi dan menunjukkan perbedaan bermakna

antar variasi konsentrasi.

5.2 Saran

1. Perlu dilakukan pengambilan sampel yang lebih banyak sehingga senyawa

yang diisolasi lebih banyak

2. Diperlukan data lebih lanjut untuk penentuan struktur dari senyawa F4149

yang meliputi 13C-NMR dan NMR dua dimensi (HMBC, HSQC dan

NOESY).

3. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut untuk melihat proses aktivitas

antiinflamasi dari senyawa F4149 dan perlu dilakukan uji pada konsentrasi

yang lebih kecil.


DAFTAR PUSTAKA

Ayoola et al. 2008. Phytochemical Screening and Antioxidant Activities of Some

Selected Medicinal Plants Used for Malaria Therapy in Southwestern Nigeria.

Nigeria : Tropical Journal of Pharmaceutical Research; 7 (3); 1019-1024.

Cho, Woong, dkk. 2009. Zedoarondiol isolated from the rhizoma of Curcuma

heyneana is involved in the inhibition of iNOS, COX-2 and pro-inflammatory

cytokines via the downregulation of NF-κB pathway in LPS-stimulated

murine macrophages. Seoul, Korea : Elsevier B.V.

Chatterjee. P, Chandra. S, Dey. P, Bhattacharya. S. 2012. Evaluation of

antiinflammatory effects of green tea and black tea: A comparative in vitro

study. J. Adv. Pharm. Tech. Res.

Departemen Kesehatan RI. 1989. Vademenkum Bahan Obat Alam. Jakarta :

Direktoral Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan.

Departemen Kesehatan RI. 2000. Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan

Obat. Jakarta : Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan

Diastuti, Hartiwi, dkk. 2014. Antibacterial Activity of Germacrane Type

Sesquiterpenes from Curcuma heyneana Rhizomes. Bandung : Indo. J. Chem

32-36.

Gritter, R, J., Bobbits, J.M, dan A. E. Schwarting, 1991. Introduction to

Chromatography (Pengantar Kromatografi), Edisi ke-2, diterjemahkan oleh

K. Padmawinata, Bandung: Penerbit ITB.

Harborne, J.B. 1987. Metode Fitokimia : Penuntun Cara Modern Menganalisis

Tumbuhan. Penerjemah : Kosasih P, Soediro Iwang. Bandung : Penerbit ITB

Hal 6-17

Hostettman, K, Hostettman, M, Maerston. 1995. Preparative Chromatography

Technique:Application in Natural Product Isolation. (diterjemahkan Oleh

Kosasih P) Bandung: Penerbit ITB.

Intanningrum, Reisma Ragil. 2011. Isolasi dan Karakterisasi Senyawa Metabolit

Sekunder Ekstrak Etil Asetat dalam Rimpang Temu Giring (Curcuma

heyneana Val). Skripsi. Universitas Negeri Yogyakarta.

40


Katzung, B, G. 2010. Farmakologi Dasar dan Klinik Edisi X. Jakarta : Buku

Kedokteran EGC

Khopkar, S.M. 2003. Kimia Analitis. Jakarta : UI Press.

Komala, Ismiarni et al. 2015. Antioxidant and Anti-inflammatory Activity of the

Indonesian Ferns, Nephrolepis falcate and Pyrrosia lanceolata. Ciputat :

International Journal Pharm Sci, Vol 7, Issue 12, 162-165

Komala, Ismiarni et al., 2017. Microwave Assisted Synthesis of p-

Methoxycinnamamides and p-methoxy-β-nitrostyrenes from ethyl p-

methoxycinnamate and Screening their Anti-inflammatory Activity. Fakultas

Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Mohan. 2003. Buffers: A guide for the preparation and use of buffers in biological

systems. Germany: Calbiochem.

Munawaroh, Safaatul dkk. 2010. Ekstraksi Minyak Daun Jeruk Purut (Citrus

hystrix D.C.) dengan Pelarut Etanol dan n-Heksana. Semarang : Jurnal

Kompetensi Teknik.

Mycek, M, J., Harvey, R, A., dan Champe C, C. 2001. Farmakologi Ulasan

Bergambar Edisi II. Jakarta : Widya Medika.

Panji, Tri. 2012. Teknik Spektroskopi untuk Elusidasi Struktur Molekul.

Yogyakarta: Graha Ilmu.

Pranoto, Eunika Noviana, dkk. 2012. Kajian Aktivitas Bioaktif Ekstrak Teripang

Pasir (Holothuria scabra) terhadap Jamur Candida albicans. Semarang :

Jurnal Prikanan, Volume 1, Nomor 2.

Price, Sylvia A ; Lorraine M. Wilson. 2002. Patofisiologi : Konsep Klinis, Proses-

proses Penyakit (Diterjemahkan oleh Brahm U. Penit, dkk) Jakarta : Penerbit

Buku Kedokteran, EGC.

Putra, Aditya Maulana Perdana. 2015. Uji Daya Hambat Ekstrak Etanol Rimpang

Temu Giring (Curcuma heyneana Val) Terhadap Pertumbuhan Escherichia

coli secara In Vitro. Banjarmasin : Jurnal Ilmiah Manuntung, 68-74

Rahmawati, Dewi, dkk. 2010. Formulasi Krim Minyak Atsiri Rimpang Temu

Giring (Curcuma heyneana Val & Zijp) : Uji Sifat Fisik dan Daya Antijamur

terhadap Candida albicans secara In Vitro. Surakarta : Majalah Obat

Tradisional, 56-63.

41


Saifudin, Azis, dkk. 2013. Sesquiterpenes from the Rhizomes of Curcuma

heyneana. Jepang : ACS Publications.

Santoso, H.B. 2008. Ragam dan Khasiat Tanaman Obat. Yogyakarta : Agro Media

Santoso, S. 2007. Menguasai Statistik di Era Informasi dengan SPSS 15. Jakarta :

PT Elex Media Komputindo Kelompok Gramedia.

Semiawan, Ferry, dkk. 2015. Aktivitas Antiinflamasi Ekstrak Daun Kerehau

(Callicarpa longifolia L.). Samarinda : Jurnal Sains dan Kesehatan Vol 1

No.1

Senja, Rima Yulia, dkk. 2014. Perbandingan Metode Ekstraksi dan Variasi Pelarut

terhadap Rendemen dan Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kubis Ungu

(Brassica oleracea L. var. capitata f. rubra). Jogja : Traditional Medicine

Journal.

Stahl, E. 1969. Apparatus and General Techniques in TLC. dalam : Stahl, E. (ed).

Thin Layer Chromatography a Laboratory Handbook. Terj. Dari

Dunnschicht chromatographie, oleh Ashworth, M.R.F. Berlin: Springer-

Verlag, 61-77.

Sudjadi. 1985. Penentuan Struktur Senyawa Organik Cetakan I. Jakarta : Ghalia

Suhartati, Tati. 2017. Dasar-Dasar Spektrofotometri UV-Vis dan Spektrofotometri

Massa untuk Penentuan Struktur Senyawa Organik. Bandar Lampung :

AURA Anugrah Utama Raharja.

Sukari, Mohd. Aspollah, dkk. 2010. Bioactive sesquiterpenes from Curcuma

ochrorhiza and Curcuma heyneana. Malaysia : Taylor & Francis Group.

Tanaya, Vivi, dkk. 2015. Fraksi Semi Polar dari Daun Mangga Kasturi (Mangifera

casturi Kosterm). Malang : Kimia Student Journal, Vol. 1 No.1

Tiwari, et al. 2011. Phytochemical Screening and Extraction; A review.

Internationale Pharmaceutical Sciencia Vol 1 Issue 1.

Verma et al. 2011. Anti Denaturation and Antioxidant Activities of Annona

cherimola In Vitro. India: International Journal of Phrma and Bio Sciences.

Wati, Mila, dkk. 2017. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Metabolit Sekunder dari

Fraksi Etil Asetat pada Daun Berwarna Merah Pucuk Merah (Syzygium

myrtifilium Walp.). Kalimantan Timur : Jurnal Kimia Mulawarman Volume

14 Nomor 2.

42


Williams, LAD, et al. 2008. The In Vitro Antidenaturation Effects Induced by

Natural Product and Non-steroidal Compounds in Heat Treated

(Immunogenic) Bovine Serum Albumin is Proposed as a Screening Assay for

the Detection of Anti-inflammatory compounds, without the Use of Animals,

in the Early Stages of The Drug Discovery Process. West Indian : Medical

Journal 57 (4):327.

Wulandari, Lestyo. 2011. Kromatografi Lapis Tipis. Jember : PT. Taman Kampus

Presindo

43


LAMPIRAN

Lampiran 1. Rimpang Temu Giring (Curcuma heynenana Val)

(Sumber : Koleksi Pribadi)

44


Lampiran 2. Bagan Alur Kerja

Curcuma heyneana

Valeton & Zijp

Simplisia

Curcuma heyneana Val

Dibersihkan, disortasi basah,

dikeringkan dan dihaluskan

Ekstrak kental

Curcuma heyneana Val

Fraksi N-heksana Fraksi Etil Asetat

KLT

Kromatografi kolom I

Fraksi

KLT

Kromatografi kolom II

GCMS NMR

Uji Aktivitas Antidenaturasi Protein BSA

Dimaserasi dengan etanol 70%,

disaring dan dipekatkan dengan

Rotary Evaporator

Dilakukan partisi cair-cair

45


Lampiran 3. Skema Kerja Isolasi Metabolit Sekunder dari Ekstrak Fraksi Etil

Asetat Rimpang Temu Giring (Curcuma heyneana Val)

Sampel temu giring

Serbuk simplisia

kering

Ekstrak kental etanol

Ekstrak kental n-heksana Ekstrak kental etil asetat

Fr. A

(1-7)

Fr. B

(8-26)

Fr. C

(27-37)

Fr. D

(38-49)

Fr. E

(50-69)

Fr. F

(73-87)

Vial

(41-49)

Uji kemurnian dengan KLT

dua dimensi dan GCMS Senyawa murni

(319 mg)

Penentuan struktur dengan

GCMS dan H-NMR

Uji aktivitas

antidenaturasi protein

46


Lampiran 4. Alur Uji Aktivitas Antidenaturasi Protein In Vitro

Larutan konsentrasi 10 ppm, 100 ppm, 1000 ppm dan 10.000 ppm

senyawa F4149 dalam metanol

Diambil sebanyak 50 µL

dengan mikropipet ke dalam

labu ukur 5 mL

Larutan 0,2% BSA dalam TBS

hingga volume mencapai 5 mL

Larutan 5 ml terdiri dari laruttan 0,2% BSA

dan larutan uji dalam tabung reaksi

Dipanaskan di waterbath pada suhu 72 oC

selama 5 menit dan didiamkan pada suhu

ruang selama 20 menit

Setelah larutan 5 mL tersebut didinginkan kemudian di vortex

dan dilakukan pengukuran % inhibisi denaturasi protein

menggunakan alat spektrofotometer UV-Visible pada panjang

gelombang 660 nm

47


Lampiran 5. Analisis statistik

1. Uji Normalitas Shapiro-wilk

Tujuan : Untuk melihat data persentase inhibisi denaturasi protein

terdistribusi normal atau tidak.

Hipotesis :

Ho : Data persentase inhibisi denaturasi protein terdistribusi normal

Ha : Data persentase inhibisi denaturasi protein tidak terdistribusi

normal

Pengambilan keputusan :

Jika nilai signifikan ≥ 0,05, maka Ho diterima

Jika nilai signifikan ≤ 0,05, maka Ho ditolak

Hasil uji normalitas data persentase inhibisi denaturasi protein

One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test

Inhibisi

N 15

Normal Parametersa,b Mean 57.4193540

Std. Deviation 9.13687630

Most Extreme Differences Absolute .189

Positive .105

Negative -.189

Test Statistic .189

Asymp. Sig. (2-tailed) .157c

Keputusan : Data persentase inhibisi denaturasi protein terdistribusi normal

2. Uji Homogenitas Levene

Tujuan : Untuk melihat data persentase inhibisi denaturasi protein homogen

atau tidak.

Hipotesis :

Ho : Data persentase inhibisi denaturasi protein bervariasi homogen

Ha : Data persentase inhibisi denaturasi protein tidak bervariasi

homogen

48





Hasil uji homogenitas data persentase inhibisi denaturasi protein

Test of Homogeneity of Variances

Inhibisi

Levene Statistic df1 df2 Sig.

2.984 4 10 .073

Keputusan : Data persentase inhibisi denaturasi protein bervariasi homogen

3. Uji Analisis Varian (ANOVA) Satu Arah

Tujuan : Untuk mengetahui ada atau tidaknya perbedaan data persentase

inhibisi denaturasi protein

Hipotesis :

Ho : Data persentase inhibisi denaturasi protein tidak berbeda secara

bermakna

Ha : Data persentase inhibisi denaturasi protein berbeda secara

bermakna




ANOVA

Inhibisi

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups 1092.618 4 273.154 35.876 .000

Within Groups 76.138 10 7.614

Total 1168.755 14

Keputusan : Data persentase inhibisi denaturasi protein berbeda secara

bermakna

49


Lampiran 6. Hasil Determinasi Rimpang Temu Giring (Curcuma heyneana Val)

50


Lampiran 7. Dokumentasi Pembuatan Ekstrak Rimpang Temu Giring (Curcuma

heyneana Val)

Simplisia Temu Giring Botol maserasi Penyaringan maserat

Fraksi Etil Asetat Ekstrak etanol Pemekatan ekstrak

51


Lampiran 8. Dokumentasi Uji Penapisan Fitokimia Rimpang Temu Giring

(Curcuma heyneana Val)

No. Uji Metode Hasil

1 Flavonoid

Alkaline reagent test:

Cuplikan ekstrak pada plat tetes + beberapa

tetes NaOH → kuning intens + beberapa

tetes HCl encer

(+) Positif

2 Terpenoid/

steroid

Lieberman-Buchard :

2 ml larutan ekstrak diuapkan dalam cawan

porselen → residu yang terbentuk + 0,5 ml

kloroform + 0,5 ml asam asetat anhidrat + 2

ml H2SO4 pekat melalui dinding tabung

(+) terpenoid : membentuk cincin

kecoklatan atau violet

(+) steroid : membentuk cincin biru

kehijauan

(+) Terpenoid

(-) Steroid

3 Alkaloid

Meyer Test

Cuplikan ekstrak dilarutkan kedalam 10 ml

campuran aquades : HCl 2 N (9:1) + saring

filtrat + teteskan pereaksi meyer → (+)

terbentuk endapan putih

(-) Negatif

4 Senyawa

Fenol

Ferric Chloride Test :

Kocok cuplikan ekstrak dengan eter pada

tabung reaksi kemudian pindahkan

kedalam plat tetes + 3-4 tetes larutan

FeCl3 → (+) apabila terbentuk warna biru

kehitaman

(-) Negatif

5 Saponin

Foam test :

0,5 mg ekstrak kental + 2 ml aquades +

kocok kuat hingga berbusa + diamkan

selama 10 menit → (+) apabila busa tetap

stabil

(+) Positif

6 Tannin

Ferric Chloride Test

Ekstrak dalam 10 ml aquades dipanaskan

dalam tabung reaksi + saring + filtrat

ditambahkan FeCl3 → (+) apabila

terbentuk warna biru, hijau, atau biru

kehijauan

(+) Positif

SEBELUM SESUDAH

52


Lampiran 9. Hasil Kromatografi Lapis Tipis

No KLT Keterangan

1

Fraksi A, B, C, D, E, F

Eluen:

n-heksana : etil asetat

(4 :1)

2

Vial F 29 – 49

Eluen :

n-heksana : etill asetat

(3 :2)

3

Vial F 41 – 59

Eluen :

n-heksana : etill asetat

(2 :3)

53


Lampiran 10. Dokumentasi Uji Aktivitas Antidenaturasi Protein secara In Vitro

Sebelum dipanaskan

Suhu waterbath 72 oC Dipanaskan selam 5

menit Divortex

Setelah dipanaskan

54


Lampiran 11. Perhitungan Konsentrasi Senyawa F4149 dan Natrium Diklofenak

1. Konsentrasi senyawa F4149

Sejumlah 10 mg senyawa F4149 dilarutkan dalam 1 mL metanol sehingga

didapat konsentrasi larutan induk 10.000 ppm

10 𝑚𝑔

1 𝑚𝐿=

10,000 𝜇𝑔

1 𝑚𝐿= 10,000 𝑝𝑝𝑚

Pengenceran Konsentrasi : Konsentrasi Akhir setelah

Pencampuran Ekstrak dengan

Larutan 0,2 % BSA hingga 5 mL

1,000 ppm 10,000 ppm menjadi 100 ppm

V1 x 10,000 ppm = 1 mL x 1,000 ppm

V1 = 100 µL

10,000 ppm x 50 μL = M1 x 5 mL

M1 = 100 ppm

100 ppm 1000 ppm menjadi 10 ppm

V1 x 10,000 ppm = 1 mL x 100 ppm

V1 = 10 µL

1000 ppm x 50 μL = M1 x 5 mL

M1 = 10 ppm


V1 x 10,000 ppm = 5 mL x 10 ppm

V1 = 5 µL

100 ppm x 50 μL = M1 x 5 mL

M1 = 1 ppm

10 ppm menjadi 0,1 ppm

10 ppm x 50 μL = M1 x 5 mL

M1 = 0,1 ppm

55


2. Konsentrasi larutan natrium diklofenak

Sejumlah 250 mg natrium diklofenak dilarutkan dalam 25 mL metanol

sehingga didapat konsentrasi larutan induk 10.000 ppm

250 𝑚𝑔

25 𝑚𝐿=

250,000 𝜇𝑔

25 𝑚𝐿= 10,000 𝑝𝑝𝑚

Pengenceran Konsentrasi : Konsentrasi Akhir setelah

Pencampuran Ekstrak dengan

Larutan 0,2 % BSA hingga 5 mL

1,000 ppm 10,000 ppm menjadi 100 ppm

V1 x 10,000 ppm = 1 mL x 1,000

ppm V1 = 100 µL

10,000 ppm x 50 μL = M1 x 5 mL

M1 = 100 ppm


V1 x 10,000 ppm = 1 mL x 100 ppm

V1 = 10 µL

1000 ppm x 50 μL = M1 x 5 mL

M1 = 10 ppm


V1 x 10,000 ppm = 5 mL x 10 ppm

V1 = 5 µL

100 ppm x 50 μL = M1 x 5 mL

M1 = 1 ppm

10 ppm menjadi 0,1 ppm

10 ppm x 50 μL = M1 x 5 mL

M1 = 0,1 ppm

56


Lampiran 12. Perhitungan Persentase Inhibisi Natrium Diklofenak

1. Konsentrasi 0,1 ppm

% inhibisi = 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑓 − 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡𝑎𝑛 𝑢𝑗𝑖

𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑓 X 100 %

= 0,577 − 1,071

0,577 X 100%

= -85,6%

2. Konsentrasi 1 ppm



= 0,577 − 0,679

0,577 X 100%

= -17,6%




= 0,577 − 0,454

0,577 X 100%

= 21,3%



𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑓 X 100%

= 0,577 − 0,001

0,577 X 100%

= 99,8%

57


Lampiran 13. Perhitungan Persentase Inhibisi Senyawa F4149

1. Konsentrasi 0,1 ppm



= 0,148 − 0,056

0,148 X 100%

= 62,33%




= 0,148 − 0,068

0,148 X 100%

= 54,03%




= 0,148 − 0,064

0,148 X 100%

= 56,95,%



𝑎𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝑛𝑒𝑔𝑎𝑡𝑖𝑓 X 100%

= 0,148 − 0,098

0,148 X 100%

= 33,63%

58


Lampiran 14. Data Absorbansi Natrium Diklofenak dan Senyawa F4149

1. Natrium Diklofenak

Konsentrasi

(ppm)

Absorbansi Absorbansi

Rata-Rata

% Inhibisi Simpangan

Deviasi

Negatif

0,513

0,577

0 %

0,055 0,611

0,607

0,1

1,168

1,071

-85,6 %

0,086 0,999

1,048

1

0,681

0,679

-17,6 %

0,002 0,676

0,681

10

0,453

0,454

21,3 %

0,001 0,455

0,456

100

0,001

0,001

99,8 %

0,0005 0,001

0,000

59


2. Senyawa F4149

Konsentrasi

(ppm)

Absorbansi Absorbansi

Rata-Rata

% Inhibisi Simpangan

Deviasi

Negatif

0,170

0,148

0 %

0,037 0,105

0,171

0,1

0,051

0,056

62,33 %

0,002 0,065

0,052

1

0,069

0,068

54,03 %

0,002 0,066

0,070

10

0,060

0,064

56,95 %

0,004 0,068

0,064

100

0,093

0,098

33,63 %

0,005 0,103

0,100

60


Lampiran 15. Hasil H-NMR senyawa F4149

61


62


isolasi dan uji aktivitas antidenaturasi protein...

Documents