isolasi, identifikasi dan uji aktivitas antioksidan...

i

ISOLASI, IDENTIFIKASI DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN

SENYAWA FLAVONOID FRAKSI METANOL DAN FRAKSI ASETON

DAUN TANAMAN ADAM HAWA (Rhoeo discolor (L'Hér.) Hance)

DENGAN METODE 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl (DPPH)

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.)

Program Studi Farmasi

Oleh:

Deriven Samurai Teweng

NIM : 138114046

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA

2016

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

ii


iii


iv

HALAMAN PERSEMBAHAN

Saya persembahkan skripsi ini untuk Tuhan Yesus yang telah

membimbing setiap langkah hidup dan pekerjaan saya dan selalu berada di

manapun saya berada Papa, Mama, Kakak, Sahabat yang selalu mendukung saya

dari jauh. Teman-teman tercinta yang selalu memberikan motivasi, menjadi

tempatcurahan hati dalam senang ataupun sedih, dan selalu menemani.


v


vi


vii


viii


ix

DAFTAR ISI

HALAMAN SAMPUL .................................................................................... i HALAMAN JUDUL ........................................................................................ ii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .............................................. iii HALAMAN PENGESAHAN .......................................................................... iv HALAMAN PERSEMBAHAN ...................................................................... v PRAKATA ....................................................................................................... vi PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .......................................................... vii PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI ............................................ viii DAFTAR ISI .................................................................................................... ix DAFTAR TABEL ............................................................................................ x DAFTAR GAMBAR ....................................................................................... xi DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................... xii ABSTRAK ....................................................................................................... xiii ABSTRACT ....................................................................................................... xiv PENDAHULUAN ........................................................................................... 1 METODE PENELITIAN ................................................................................. 2 HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................................ 5 KESIMPULAN ................................................................................................ 13 DAFTAR PUSTAKA ...................................................................................... 14 LAMPIRAN ..................................................................................................... 16 BIOGRAFI PENULIS ..................................................................................... 38


x

DAFTAR TABEL

Tabel I. Nilai Rf yang dihasilkan pada KLTP............................................ ..........7

Tabel II. Identifikasi Senyawa Flavonoid Isolat Fraksi Metanol................. ..........8

Tabel III. Identifikasi Senyawa Flavonoid Isolat Fraksi Aseton................... ..........8

Tabel IV. Nilai IC50 antara Rutin, Fraksi Aseton dan Fraksi Metanol...................12


xi

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Struktur Dasar Antosianidin...................................................................8

Gambar 2. Struktur Antosianidin Memiliki Aktivitas Antioksidan.........................9

Gambar 3. Reaksi antara Senyawa Antosianidin dan DPPH...................................9

Gambar 4. Grafik Konsentrasi Rutin terhadap Persen Hambat (%IC)..................10

Gambar 5. Grafik Konsentrasi Fraksi Metanol terhadap Persen Hambat (%IC) ..11

Gambar 6. Grafik Konsentrasi Fraksi Aseton terhadap Persen Hambat (%IC).....11


xii

DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1.Tanaman Adam Hawa ............................................................... ........16 Lampiran 2.Determinasi Tanaman Adam Hawa ........................................... ........17 Lampiran 3.Sampel Daun Adam Hawa ........................................................ ........18 Lampiran 4.Ekstrasi dan Fraksinasi .............................................................. ........18 Lampiran 5.Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid .............................. ........20 Lampiran 6.Uji Aktivitas Antioksidan (DPPH) ............................................ ........23 Lampiran 7.Hasil Uji Statistik....................................................................... ........35


xiii

Abstrak

Senyawa antioksidan adalah senyawa yang dapat menstabilkan radikal bebas.

Daun adam hawa (Rhoeo discolor (L'Her.) Hance.) yang berwarna ungu diduga

mengandung senyawa flavonoid yaitu antosianidin sebagai senyawa antioksidan.

Penelitian ini bertujuan mengetahui jenis antosianidin dan aktivitas antioksidan

yang dinyatakan sebagai nilai IC50 pada fraksi metanol dan aseton ekstrak etanol

96% daun adam hawa. Serbuk simplisia daun adam hawa dimaserasi dengan

etanol 96% dan diremaserasi hingga hasil filtrat jernih. Ekstrak etanol 96%

difraksinasi dengan metode dekantasi menggunakan pelarut n-heksan, aseton dan

metanol. Fraksi aseton dan metanol yang diperoleh diisolasi dengan KLT

preparatif dengan fase diam silika gel 60 F254 dan fase gerak n-butanol: asam

asetat : air (4:1:5). Isolat diidentifikasi senyawa antosianidin dengan pereaksi

geser dan diuji aktivitas antioksidan untuk mendapatkan nilai IC50 fraksi dengan

metode 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl (DPPH). Fraksi metanol diduga terdapat

senyawa antosianidin yaitu malvidin dengan nilai IC50 yaitu 827,805 ± 32,710

µg/mL sedangkan fraksi aseton diduga terdapat senyawa antosianidin yaitu

pelargonidin/peonidin dengan nilai IC50 yaitu 790,159 ± 29,623 µg/mL. Hasil

yang diperoleh menunjukkan bahwa fraksi metanol dan aseton ekstrak etanol 96%

daun adam hawa mengandung senyawa antosianidin dan memiliki aktivitas

antioksidan.

Kata Kunci : Adam Hawa, Rhoeo discolor (L'Hér.) Hance, antosianidin, DPPH,

IC50.


xiv

Abstract

Antioxidant compound is compound that can stabilize free radicals. Adam and eve

(Rhoeo discolor (L'Her.) Hance.) leaf has purple colour which it contain flavonoid

compound that are anthocyanidin as an antioxidant compound. This study aims to

determine the type of anthocyanidin and antioxidant activity expressed as IC50

value in methanol and acetone fraction at 96% ethanol extract of the leaves Adam

and eve. It’s simplicia powder leaves macerated with 96% ethanol and

remaserated until a clear filtrate result. 96% ethanol extract was fracted with

solvent n-hexane, acetone and methanol. Acetone and methanol fraction obtained

was isolated by preparative TLC with silica gel 60 F254 stationary phase and n-

butanol: acetic acid: water (4: 1: 5) mobile phase. Isolates were identified

compounds with reagents and tested the antioxidant activity of fractions to obtain

IC50 value by 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl (DPPH) method. Methanol fraction

contain anthocyanidin compound which it estimated malvidin with IC50 value is

827.805 ± 32.710 µg/mL and acetone fraction anthocyanidin compound which it

estimated pelargonidin / peonidin with IC50 value is 790.159 ± 29.623 µg/mL.

The results showed that methanol and acetone fraction 96% ethanol extract of the

leaves adam and eve contain anthocyanidin compound have antioxidant activity.

Keywords: Adam and eve, Rhoeo discolor (L'Her.) Hance, anthocyanidin, DPPH,

IC50.


1

PENDAHULUAN

Perubahan yang terjadi pada kondisi lingkungan dan pola hidup masyarakat,

terutama pola makan dan kebiasaan buruk di kota-kota besar pada negara berkembang

seperti Indonesia menjadikan tubuh lebih mudah terkena berbagai jenis penyakit,

khususnya penyakit yang disebabkan oleh radikal bebas. Radikal bebas tersebut dapat

menyebabkan timbulnya penyakit degenertif seperti kanker, penyakit kardiovaskular,

kerusakan hati dan penuaan dini (Musaforah, 2015).

Senyawa yang dapat menstabilkan radikal bebas tersebut ialah senyawa

antioksidan. Salah satu tanaman yang dapat digunakan sebagai sumber antioksidan ialah

adam hawa (Rhoeo discolor (L'Hér.) Hance). Adam hawa termasuk dalam famili

Commelinaceae dan suku gawar-gawaran yang berasal dari Meksiko dan Hindia Barat.

Tanaman ini sering ditanam sebagai tanaman hias karena daunnya yang berwarna

keunguan dan dikenal juga digunakan sebagai etnobotani, yang mungkin dikaitkan dengan

antibakteri dan antioksidan (Tan et al.,2014).

Berdasarkan penelitian Avila et al. (2003), melakukan uji aktivitas antioksidan

DPPH ekstrak etanol 96% daun adam hawa dengan konsentrasi 1, 10, dan 100 µg/mL

dengan masing-masing persen hambat yaitu 67, 68, dan 79%. Penelitian Sitorus et al.

(2012) melakukan isolasi dengan KLT preparatif dan identifikasi senyawa flavonoid pada

ekstrak etanol 95% daun adam hawa serta senyawa flavonoid yang diperoleh adalah

antosianidin. Antosianidin merupakan aglikon antosianin yang terbentuk bila antosianin

dihidrolisis dengan asam. Antosianidin ini larut dalam metanol, etanol, aseton, atau

kloroform (Harborne, 1996).

Ekstrak yang diperoleh masih mengandung banyak senyawa didalamnya sehingga

perlu dilakukan pemisahan (fraksinasi). Oleh karena itu, ekstrak etanol 96% daun adam

hawa akan dilakukan fraksinasi dengan metode dekantasi menggunakan pelarut n-heksan,

aseton dan metanol. Setelah mendapat fraksi aseton dan metanol, dilakukan isolasi dengan

KLT preparatif. Hasil isolasi akan diidentifikasi menggunakan pereaksi geser dan diuji

aktivitas antioksidan pada fraksi yang mengandung antosianidin dengan metode DPPH.

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui jenis antosianidin dan aktivitas antioksidan

(IC50) fraksi aseton dan metanol ekstrak etanol 96% daun adam hawa.


2

METODE PENELITIAN

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun adam hawa (CV. Merapi

Farma Herbal) diambil pada bulan Agustus 2016 sebagai bahan utama, metanol pro

analisis (E.Merck), AlCl3 5% (E.Merck), NaOH 2M (E.Merck), dan HCl (E.Merck), etanol

96% (CV. General Labora), n-heksan teknis (CV. General Labora), aseton teknis (CV.

General Labora), alumunium foil, DPPH (Aldrich), lempeng KLT Silika Gel 60 F254

(E.Merck), rutin (Sigma), n-butanol (E.Merck), asam asetat (E.Merck), dan aquadest (CV.

General Labora).

Alat yang digunakan meliputi Shaker (Innova TM 2100), vortex (Janke &

Kunkel), spektrofotometer UV-Vis (Shimadzu UVmini-1240 single beam A10935105039

CD, mikropipet (20-200) µL (Acura 825, Socorex), UV cabinet (CAMAG), timbangan

analitik METTLER TOLEDO (max 3100 g, min 0,5 g), timbangan analitik OHAUS (max

210 g, min 0,0001 g), vakum penguap putar (vaccum rotary evaporator) (Buchi R-

210,Jerman), Oven (Memmert 30-1060), ayakan no. mesh 40, blender, sentrifugator (PLC-

03), waterbath, peralatan gelas.

Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman adam hawa menggunakan seluruh bagian tanaman (daun,

batang, akar, bunga dan buah) yang dilakukan secara benar berdasarkan buku acuan Flora

Untuk Sekolah di Indonesia Tahun 1992 yang terdapat di Laboratorium Kebun Obat

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta, untuk proses determinasi

dibantu oleh tenaga ahli (determinator).

Pengumpulan Bahan Uji

Bahan uji yang digunakan adalah daun tanaman adam hawa yang diperoleh dari

CV. Merapi Farma, Yogyakarta. Daun yang diambil yaitu daun tua (bukan daun kuning).

Daun dipetik satu persatu secara manual. Kriteria daun yang digunakan yaitu daun utuh,

segar, berbentuk pedang dengan panjang 15 - 30 cm dan lebar 2,5 - 5,5 cm, ujung daun

runcing, permukaan daun gundul serta warna daun di permukaan atas hijau dan di bagian

bawah berwarna merah ungu.

Pembuatan Simplisia

Daun adam hawa yang diperoleh dari CV. Merapi Herbal Farma, ditimbang

kurang lebih 1 kg kemudian disortasi basah. Hasil sortasi dicuci dan ditiriskan sampai sisa

air menghilang serta dipotong-potong menjadi beberapa bagian. Daun adam hawa


3

dikeringkan dalam oven dengan bantuan blower pada suhu 40ºC. Daun adam hawa

dikatakan kering jika daun dapat hancur ketika diremas dengan tangan. Daun adam hawa

yang telah dikeringkan kemudian diserbuk menggunakan blender, lalu diayak

menggunakan ayakan nomor mesh 40.

Ekstraksi Daun Tanaman Adam Hawa

Serbuk kering daun adam hawa ditimbang kurang lebih 50 g kemudian dimaserasi

dengan pelarut etanol 96% sebanyak 250 mL. Maserasi meliputi pengadukan selama 6 jam

dengan shaker, kemudian didiamkan selama 18 jam. Hasil maserat dan sisa serbuk

dipisahkan. Sisa serbuk dimaserasi kembali dengan pelarut etanol 96% hingga filtrat hasil

maserasi jernih. Hasil maserat digabung dan dipekatkan dengan vaccum rotary evaporator

pada suhu kurang lebih 40ºC. Kemudian ekstrak dipekatkan kembali dengan waterbath

hingga bobot tetap sehingga diperoleh ekstrak kental etanol 96% dan dihitung

rendemennya.

Fraksinasi Ekstrak Daun Tanaman Adam Hawa

Ekstrak etanol 96% kental ditimbang kurang lebih 5 g, ekstrak dibagi menjadi dua

dan masing-masing 2,5 g ekstrak ditambahkan dengan n-heksan sebanyak 50 mL,

kemudian dipisahkan antara yang larut dan tidak larut dalam n-heksan. Ekstrak yang tidak

larut dalam n-heksan ditambahkan 50 mL pelarut aseton, dipisahkan antara yang larut dan

tidak larut dalam aseton. Ekstrak yang larut dalam aseton disebut fraksi aseton. Ekstrak

yang tidak larut dalam aseton ditambahkan 50 mL metanol, dipisahkan antara yang larut

dan tidak larut dalam metanol. Ekstrak yang larut dalam metanol disebut fraksi metanol.

Masing-masing hasil fraksi aseton dan metanol digabung dan dipekatkan dengan vaccum

rotary evaporator pada suhu kurang lebih 40oC. Kemudian tiap fraksi dipekatkan kembali

dengan waterbath hingga bobot tetap dan dihitung rendemennya.

Isolasi Fraksi

Pada isolasi dengan KLT preparatif digunakan plat silika gel 60 F254 dengan

ukuran 10 cm x 20 cm. Plat KLT diaktifasi dengan cara dipanaskan pada suhu 100 ºC

selama 1 jam dalam oven. Masing-masing fraksi aseton dan fraksi metanol ditimbang 100

mg dilarutkan dengan 10 mL etanol 96%, kemudian larutan fraksi diinjeksikan 25,0 µL

dengan mikropipet sepanjang plat pada jarak 1 cm dari garis bawah dan 1 cm dari garis

tepi serta 1 cm antar spot. Selanjutnya dielusi dengan fase gerak n-butanol : asam asetat :

air (BAA) (4:1:5). Setelah fase gerak sampai pada garis batas, elusi dihentikan. Pita yang

terbentuk masing-masing diukur harga Rf nya. Pita-pita diperiksa di bawah sinar UV pada


4

254 nm dan 366 nm. Pita-pita yang diperoleh dari hasil KLT preparatif dikerok pada fase

diam yang telah dielusikan, lalu serbuk dilarutkan dengan metanol p.a. sebanyak 10 mL

dan disentrifugasi selama 15 menit dengan kecepatan 5000 rpm untuk mengendapkan fase

diamnya (silika gel), lalu supernatannya diambil sebagai isolat.

Identifikasi Senyawa Flavonoid Isolat

Isolat yang didapatkan dari masing-masing fraksi aseton dan fraksi metanol

diidentifikasi dengan spektrofotometer UV-Vis. Setiap isolat dari fraksi aseton dan fraksi

metanol diambil 1 - 2 mL, kemudian diukur pada panjang gelombang dengan rentang 200-

600 nm. Bila spektrum panjang gelombang menunjukkan spektrum khas flavonoid pada

pita II (240-285) nm dan pita I (300-550) nm (Harbone,1996), isolat ditambahkan larutan

pereaksi geser seperti AlCl3 5% (6 tetes)/HCl (3 tetes) dan NaOH 2M (3 tetes) secara

bergantian kemudian diukur panjang gelombangnya (λ).

Uji Aktivitas Antioksidan

Uji pendahuluan (penentuan panjang gelombang DPPH dan operating time (OT))

Larutan DPPH dibuat dengan konsentrasi 40 µg/mL, kemudian larutan DPPH

diukur spektrum serapan menggunakan spektrofotometer UV/Vis pada panjang gelombang

400 nm hingga 600 nm dan ditentukan panjang gelombang maksimalnya (λmaks).

Setelah didapatkan λmaks, larutan DPPH 3,8 mL dimasukkan dalam tabung

ditambah 0,2 ml larutan standar rutin dengan masing-masing pada tiga tingkat konsentrasi

yaitu tinggi, sedang dan rendah yaitu 10 ; 30 ; 50 µg/mL pada titik waktu 0; 5; 10; 15; 20;

25; 30; 35; 40; 45; 50; 55 dan 60 menit pada panjang gelombang maksimum yang telah

diperoleh serta ditentukan operating time yang menunjukkan penurunan absorbansi yang

tidak signifikan (stabil).

Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Metanol, Fraksi Aseton dan Rutin

Fraksi metanol ditimbang 100,0 mg dan dilarutkan dalam 10,0 mL metanol p.a

hingga homogen (konsentrasi 10.000 µg/mL). Larutan fraksi diambil masing-masing 0,2;

0,4; 0,6; 0,8 dan 1,0 mL dimasukkan kedalam labu ukur 10,0 mL dan ditambahkan

volumenya dengan metanol p.a hingga batas tanda (konsentrasi 200; 400; 600; 800; dan

1.000 µg/mL). Fraksi aseton ditimbang 60,0 mg dan dilarutkan dalam 10,0 mL metanol p.a

hingga homogen (konsentrasi 6000 µg/mL). Larutan fraksi diambil masing-masing 0,3;

0,6; 0,9; 1,2 dan 1,5 mL dimasukkan ke dalam labu ukur 10,0 mL dan ditambahkan

volumenya dengan metanol p.a hingga batas tanda (konsentrasi 180; 360; 540; 720 dan 900

µg/mL).


5

Rutin digunakan sebagai baku pembanding, rutin ditimbang 10,0 mg dan dilarutkan

dalam 10 mL metanol p.a hingga homogen (konsentrasi 1.000 µg/mL). Larutan rutin

diambil masing-masing 0,2; 0,4; 0,6; 1; 1,4 mL, kemudian dimasukkan kedalam labu ukur

10 mL dan ditambahkan volumenya dengan metanol p.a hingga batas tanda (konsentrasi

20; 40; 60; 80; dan 100 µg/mL). Dari masing-masing konsentrasi larutan uji tiap fraksi

diambil 0,2 mL dimasukkan kedalam tabung reaksi, ditambahkan 3,8 mL DPPH 0,02

mg/mL, divortex hingga homogen, didiamkan selama OT dan diukur serapannya pada

panjang gelombang yang telah ditentukan. Pembanding rutin dilakukan pengujian yang

sama seperti pada fraksi. Dilakukan replikasi tiga kali.

Tata Cara Analisis Hasil

Hasil Uji Aktivitas Antioksidan

Untuk mendapatkan nilai IC50 berdasarkan presentase hambat terhadap radikal DPPH dari

masing-masing konsentrasi larutan sampel dengan rumus :

% hambat = ((abs kontrol – abs sampel) / abs kontrol) x 100%

(Marinova and Batchvarov, 2011).

Keterangan :

Abs kontrol : absorbansi larutan kontrol

Abs sampel : absorbansi larutan uji fraksi atau absorbansi rutin

Kemudian nilai IC50 yang didapat akan dilakukan uji normalitas Shapiro-wilk

taraf kepercayaan 95% dan uji T tidak berpasangan (terdistribusi normal) menggunakan

aplikasi R 3.2.4 untuk menentukan signifikansi perbedaan nilai IC50 fraksi metanol dan

fraksi aseton daun adam hawa yang diperoleh.

HASIL DAN PEMBAHASAN

Determinasi dilakukan untuk menentukan jenis tanaman yang digunakan dalam

penelitian. Hal itu dikarenakan tanaman memiliki berbagai jenis varietas. Hasil determinasi

menyimpulkan bahwa tanaman adam hawa yang digunakan adalah benar tanaman adam

hawa dengan nama ilmiah Rhoeo discolor (L'Hér.) Hance. Daun adam hawa yang telah

dikumpulkan dan ditimbang sebanyak 1 kg, kemudian daun dilakukan sortasi basah

bertujuan untuk memisahkan kotoran atau bahan asing yang melekat pada permukaan

daun. Kemudian daun dicuci dengan air bersih mengalir untuk menghilangkan kotoran atau

benda asing yang masih terdapat pada permukaan daun dan daun dipotong menjadi

beberapa bagian untuk mempercepat proses pengeringan. Proses pengeringan selama 12


6

hari menggunakan oven dengan bantuan blower untuk mengoptimalkan proses

pengeringan.

Setelah kering, daun adam hawa diserbuk dengan blender untuk memperkecil

ukuran serbuk kemudian diayak dengan ayakan mesh no.40 untuk menghomogenkan

ukuran serbuk. Dalam penelitian Sapri, Fitriani dan Narulita (2014), nomor mesh ayakan

yang digunakan mempengaruhi rendemen ekstrak yang diperoleh. Serbuk simplisia yang

diperoleh 49,49 g dengan rendemen sebesar 4,797 %b/b. Nilai rendemen serbuk kecil

diduga karena kandungan air yang tinggi dalam daun adam hawa.

Maserasi merupakan metode ekstraksi/ penyarian tidak menggunakan pemanasan

karena senyawa flavonoid tidak stabil pada suhu tinggi. Pelarut etanol 96% digunakan

untuk maserasi karena pelarut ini bersifat semipolar dan senyawa flavonoid larut dalam

etanol. Maserasi dibantu dengan shaker untuk meningkatkan kelarutan sehingga

mengoptimalkan proses ekstraksi. Remaserasi dilakukan untuk mendapatkan rendemen

ekstrak yang optimal. Maserat yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan vacuum

rotary evaporator. Keuntungan dari alat ini yaitu dapat mempercepat proses pemekatan

dengan panas yang tidak terlalu tinggi sehingga memperkecil kemungkinan rusaknya

senyawa flavonoid. Bobot ekstrak etanol 96% daun adam hawa yang diperoleh 7,7165 g

dengan rendemen sebesar 15,6075 %b/b.

Metode yang digunakan untuk memfraksinasi ekstrak adalah partisi padat-cair

(dekantasi). Prinsip metode dekantasi adalah pemisahan padatan dan cairan (pelarut)

berdasarkan bobot jenis (Saifudin, 2014). Ekstrak kental etanol 96% daun adam hawa

difraksinasi berturut-turut menggunakan pelarut berdasarkan tingkat kepolarannya yaitu n-

heksan (non polar), aseton (semi polar) dan metanol (polar). N-heksan digunakan untuk

menghilangkan senyawa-senyawa non polar seperti lemak dan klorofil. Pelarut aseton dan

metanol dipilih karena senyawa flavonoid terutama antosianin/antosianidin larut dalam

pelarut tersebut. Bobot fraksi metanol ekstrak etanol 96 % daun adam hawa dari dua kali

fraksinasi diperoleh 1,0944 g dengan rendemen sebesar 21,8871 %b/b. Bobot fraksi aseton

ekstrak etanol 96 % daun adam hawa dari dua kali fraksinasi diperoleh 0,3687 g dengan

rendemen sebesar 7,3737 %b/b. Hasil rendemen fraksi aseton kurang dari 10% atau lebih

kecil dari rendemen fraksi metanol diduga karena kemampuan aseton melarutkan ekstrak

etanol 96% daun adam hawa lebih rendah dari metanol.

Isolasi dilakukan dengan KLT preparatif yang bertujuan untuk memisahkan dan

memurnikan senyawa yang terdapat dalam fraksi metanol dan fraksi aseton ekstrak etanol


7

96% daun adam hawa. Fase diam yang digunakan ialah plat silika gel 60 F254 yang bersifat

polar, sedangkan fase gerak yang digunakan n-butanol : asam asetat : air (4:1:5) sebagai

fase gerak bersifat sangat polar karena mengandung air. Plat KLT silika gel 60 F254

diaktifasi dengan cara di oven pada suhu 100 ºC selama 1 jam untuk menghilangkan air

yang terdapat pada plat KLT. Kepolaran fase diam dan fase gerak hampir sama, tetapi

masih lebih polar fase gerak sehingga senyawa flavonoid yang dipisahkan terangkat

mengikuti aliran fase gerak, karena senyawa flavonoid bersifat polar.

Fase gerak yang dipakai dalam KLT ialah fase gerak campuan n-butanol : asam

asetat : air (BAA) (4:1:5) yang mampu memberikan pemisahan untuk senyawa flavonoid.

Karena dari komposisinya, fase gerak tersebut bersifat sangat polar sehingga bisa

memisahkan senyawa-senyawa flavonoid yang juga bersifat polar. Pemisahan senyawa

ditandai dengan nilai Rf yang berbeda (Gandjar dan Rohman, 2007) dan berikut hasil KLT

preparatif yang disajikan pada Tabel I.

Tabel I. Nilai Rf yang dihasilkan pada KLTP

Fraksi Nilai Rf Warna Pita dengan

Sinar UV

Keterangan

Aseton

Rf1 = 0,63

Rf2 = 0,90

Rf3 = 0,98

254 nm 366 nm

-

Senyawa flavonoid

Klorofil

Abu-abu

-

Hitam

Abu-Abu

Merah

Lembayung

Merah jingga

Metanol Rf1 = 0,88

Rf2 = 0,98

-

Hitam

Biru

Merah jingga

Senyawa flavonoid

Klorofil *Ket : tanda “-“ menunjukkan pita tidak terlihat atau bukan pita

Berdasarkan Tabel I, fraksi aseton terdapat 3 pita dan fraksi metanol terdapat 2 pita.

Kemudian semua pita tiap fraksi diisolasi dan diukur panjang gelombang maksimum isolat.

Fraksi aseton isolat 1 diperoleh serapan pada 207 nm, ini diduga bukan senyawa flavonoid

karena tidak termasuk dalam spektrum khas flavonoid pada pita II (240-285) nm dan pita I

(300-550) nm. Fraksi aseton isolat 2 diperoleh serapan pada 537 nm dan 277,5 nm

sedangkan fraksi metanol isolat 1 diperoleh serapan pada 537 nm dan 275 nm, kedua isolat

ini diduga merupakan senyawa flavonoid. Fraksi aseton isolat 3 dan fraksi metanol isolat 2

memiliki nilai Rf yang sama diduga merupakan klorofil karena pita berwarna hijau tanpa

dipaparkan sinar UV. Maka senyawa flavonoid pada fraksi aseton isolat 2 dan fraksi

metanol isolat 1 diidentifikasi dengan pereaksi geser disajikan pada Tabel II dan III.


8

Tabel II. Identifikasi Senyawa Flavonoid Isolat Fraksi Metanol (Harbone, 1996)

Pereaksi

λ (nm) Mula-Mula Pergeseran λ

(nm) Keterangan

Pita I Pita II Pita I Pita

II

Metanol 537 275 Tetap Tetap Antosianidin/

antosianin

Metanol + NaOH 2N - - - - Nihil

Metanol + AlCl3 5% 537 - Tetap - Tidak ada o-diOH

Metanol + AlCl3 5% + HCl 537 - Tetap - Tidak ada o-diOH

Tabel III. Identifikasi Senyawa Flavonoid Isolat Fraksi Aseton (Harbone, 1996)

Pereaksi λ (nm) Mula-Mula

Pergeseran λ

(nm) Keterangan

Pita I Pita II Pita I Pita II

Metanol 537 277,5 Tetap Tetap Antosianidin/

antosianin

Metanol + NaOH 2N - 276,5 - -0,5 Nihil

Metanol + AlCl3 5% 536,5 274,5 -0,5 -3,5 Tidak ada o-diOH

Metanol + AlCl3 5% + HCl 536,5 - -0,5 - Tidak ada o-diOH

Gambar 1. Struktur Dasar Antosianidin (Miguel, 2011)

Menurut Miguel (2011), beberapa gugus pengganti yang terikat pada struktur

dasar antosianin membentuk stuktur antosianidin dan warnanya yaitu pelargonidin

(orange), sianidin (orange-merah), peonidin (orange-merah), delphinidin (biru-merah),

petunidin (biru-merah) dan malvidin (biru-merah). Dari Tabel II dan III, bahwa kedua

fraksi diduga mengandung jenis senyawa flavonoid adalah golongan antosianin/

antosianidin. Pada hasil penambahan basa NaOH 2N, panjang gelombang tidak terdeteksi

pada pita I karena antosianin/antosianidin terdegradasi atau tidak stabil pada pH basa

(Lima et al., 2011). Fraksi metanol isolat 1 diduga merupakan senyawa malvidin karena


9

warna pita berwarna biru (Aziz dan Djamil, 2013) dan tidak memiliki respon terhadap

AlCl3 sedangkan fraksi aseton isolat 2 diduga merupakan senyawa peonidin/ pelargonidin

karena warna pita berwarna merah lembayung dan tidak ada respon terhadap AlCl3

(Lestario et al. 2009).

Uji aktivitas antioksidan menggunakan DPPH sebagai radikal bebas reaktif yang

akan distabilkan oleh senyawa antioksidan dengan mendonorkan atom hidrogen. Senyawa

flavonoid yaitu antosianidin memiliki aktivitas antioksidan karena memiliki gugus fenolik

yang ditunjukkan pada Gambar 1. Senyawa antosianidin dapat mendonorkan atom

hidrogen ketika bereaksi dengan DPPH sehingga DPPH menjadi stabil ditunjukkan pada

Gambar 2. Aktivitas antioksidan senyawa flavonoid (antosianidin) ditandai dengan

perubahan warna DPPH dari ungu menjadi kuning (Amic et al. 2003).

Gambar 2. Struktur Antosianidin Memiliki Aktivitas Antioksidan.

Gambar 3. Reaksi antara Senyawa Antosianidin dan DPPH.

Uji aktivitas antioksidan metode DPPH diawali dengan uji pendahuluan

menentukan panjang gelombang maksimum (λmaks) dan operating time. Panjang

gelombang maksimum digunakan karena menurut Gandjar dan Rohman (2007) pada

panjang gelombang tersebut perubahan sedikit konsentrasi akan menghasilkan perubahan

absorbansi yang signifikan sehingga pengukuran lebih peka atau sensitif. Penentuan λmaks

DPPH dengan konsentrasi 40 µg/ml didapatkan panjang gelombang maksimum sebesar

515 nm. Pada panjang gelombang tersebut DPPH memiliki serapan maksimal (Molyneux,

2004). Operating time (OT) atau waktu operasional digunakan untuk mengetahui waktu

yang dibutuhkan agar suatu reaksi berlangsung dengan optimal. Waktu operasional


10

ditentukan dengan mengukur hubungan antara waktu pengukuran dengan absorbansi

larutan DPPH setelah bereaksi dengan rutin. Pengukuran dilakukan sebanyak tiga kali

dengan konsentrasi rutin 10, 30 dan 50 µg/mL menggunakan λmaks yaitu 515 nm.

Penggunaan tiga konsentrasi tersebut diharapkan dapat menggambarkan waktu operasional

dari konsentrasi yang berbeda. Dari data waktu operasional yang diperoleh adalah 25

menit, yang berarti penurunan absorbansi optimal DPPH setelah bereaksi dengan rutin

pada waktu 25 menit.

Rutin digunakan sebagai pembanding dalam uji aktivitas antioksidan karena rutin

termasuk dalam golongan senyawa flavonoid yang mempunyai gugus fenolik yang telah

terbukti memiliki aktivitas antioksidan sehingga dapat digunakan sebagai pembanding

(kontrol positif) dalam uji aktivitas antioksidan (Lima et al., 2011). Alasan lain digunakan

rutin adalah rutin lebih stabil dari antosianin/antosianidin (Herrero, Hernandez and Frutoz,

2015) dan antosianin/antosinidin memiliki banyak jenis di pasaran. Rutin, fraksi metanol

dan fraksi aseton dibuat dengan menyiapkan lima konsentrasi sebagai seri dan dilakukan

replikasi sebanyak tiga kali. Uji ini melihat kemampuan rutin, fraksi metanol dan aseton

ekstrak etanol 96% daun adam hawa dapat menghambat aktivitas radikal bebas DPPH

(aktivitas antioksidan) sehingga diperoleh persen hambat (%IC).

Gambar 4.Grafik Konsentrasi Rutin terhadap Persen Hambat (%IC).

20 µg/mL 40 µg/mL 60 µg/mL 80 µg/mL100

µg/mL

Replikasi 1 18,8862 33,0509 45,3995 55,0848 73,0024

Replikasi 2 16,3573 27,8422 40,9513 51,9722 67,4014

Replikasi 3 17,5991 29,7203 44,289 54,1958 72,3776

01020304050607080

%IC

r = 0,9960

r = 0,9985

r = 0,9964


11

Gambar 5. Grafik Konsentrasi Fraksi Metanol terhadap Persen Hambat (%IC).

Gambar 6. Grafik Konsentrasi Fraksi Aseton terhadap Persen Hambat (%IC).

Pada Gambar grafik 1, 2 dan 3, dapat dilihat bahwa semakin tinggi konsentrasi

yang digunakan, aktivitas antioksidan (%IC) yang ditimbulkan juga semakin besar. Hal ini

disebabkan karena semakin banyak pula pendonor atom untuk radikal DPPH sehingga

radikal DPPH menjadi lebih stabil.

200µg/mL

400µg/mL

600µg/mL

800µg/mL

1.000µg/mL

Replikasi 1 28,9948 33,7629 40,9794 47,8093 55,9278

Replikasi 2 27,2379 32,4808 41,9437 48,5934 60,4859

Replikasi 3 25,3298 32,8496 39,1821 46,1741 58,3113

0

10

20

30

40

50

60

70

%IC

180µg/mL

360µg/mL

540µg/mL

720µg/mL

900µg/mL

Replikasi 1 21,134 28,0928 36,9845 45,4897 54,1237

Replikasi 2 24,6803 31,9693 40,4092 46,8031 57,4169

Replikasi 3 20,7124 30,7388 38,6544 43,9314 56,3325

0

10

20

30

40

50

60

70

%IC

r = 0,9965

r = 0,9919

r = 0,9913

r = 0,9992

r = 0,9972

r = 0,9928


12

Tabel IV. Nilai IC50 antara Rutin, Fraksi Aseton dan Fraksi Metanol

Rutin (Baku)

Replikasi IC50 (µg/mL) Rerata ± SD Intensitas

Antioksidan

1 67,550

70,484 ± 3,536 Kuat 2 74,410

3 69,492

Fraksi Metanol


Antioksidan

1 849, 382 827,805±

32,710 Lemah 2 790,169

3 843,864

Fraksi Aseton


Antioksidan

1 817,451 790,159 ±

29,623 Lemah 2 758,655

3 794,371

Dalam penelitian ini, uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH tidak

dilakukan validasi metode karena menggunakan metode standar (baku) dari metode blois

(Molyneux, 2004) sehingga hanya perlu verifikasi metode. Verifikasi metode dilakukan

dengan menetapkan presisi. Presisi dapat dilakukan dengan replikasi yang bertujuan untuk

melihat keterulangan hasil sehingga dapat menjamin mutu hasil uji (Gandjar dan Rohman,

2007). Nilai r menunjukan koefisien korelasi regresi linear antara konsentrasi dengan %IC,

dapat dilihat bahwa hubungan antara konsentrasi dengan %IC korelasinya berbanding

lurus, artinya semakin tinggi konsentrasi fraksi maupun baku maka %IC juga semakin

besar. Dilihat Gambar grafik 1, 2 dan 3, nilai r rutin, fraksi aseton dan fraksi metanol

mendekati 1, ini menunjukkan memiliki liniearitas yang baik. Persamaan regresi linear

yang didapatkan digunakan untuk menghitung IC50 sebagai parameter aktivitas

antioksidan.

IC50 adalah konsentrasi yang dapat menghambat 50% aktivitas radikal bebas

DPPH. Semakin kecil nilai IC50 yang didapat maka aktivitas antioksidan dari senyawa atau

fraksi tersebut semakin baik. Menurut Fidrianny, Darmawanti dan Sukrasno (2014),

tingkat aktivitas antioksidan dapat dikategorikan berdasarkan nilai IC50 yang yaitu sangat

kuat (150

µg/mL) sehingga dapat ditentukan intensitas antioksidan yang disajikan dalam Tabel IV.

Nilai IC50 fraksi metanol dan fraksi aseton sangat besar dibandingkan IC50 rutin, ini


13

menunjukkan bahwa fraksi metanol dan fraksi aseton memiliki aktivitas antioksidan lemah

dibandingkan rutin.

Penelitian Avila et al. (2003) melakukan uji aktivitas antioksidan DPPH pada

ekstrak etanol 96% daun adam hawa dengan konsentrasi 1, 10 dan 100 µg/mL dengan

masing-masing persen hambat yaitu 67, 68 dan 79%. Persen hambat yang diperoleh dari

fraksi metanol dan fraksi aseton lebih kecil dibandingkan ekstrak sehingga dapat dikatakan

aktivitas antioksidan fraksi lebih rendah dari ekstrak. Ini mungkin disebabkan karena pada

proses fraksinasi, senyawa antosianidin juga terlarut dalam pelarut non-polar (n-heksan)

sehingga kandungan antosianidin sebagai senyawa antioksidan dalam fraksi metanol dan

fraksi aseton sedikit.

Uji statistik dilakukan dengan aplikasi R 3.2.4 terhadap data yang diperoleh untuk

memastikan perbedaan yang bermakna antara nilai IC50 rutin, fraksi metanol dan fraksi

aseton ekstrak etanol 96% adam hawa. Pada uji normalitas, data yang didapatkan terbukti

terdistribusi normal apabila p-value >0,05. Hasil nilai p yang diperoleh ialah 0,5313

(rutin), 0,1613 (fraksi metanol) dan 0,7642 (fraksi aseton) terlihat p-value > 0,05, ini

menunjukkan bahwa rutin dan fraksi metanol, fraksi aseton ekstrak etanol 96% adam hawa

memiliki data yang terdistribusi normal dan dapat dilanjutkan untuk uji parametrik.

Uji statistik kedua yaitu uji parametrik (uji t tidak berpasangan). Uji ini bertujuan

untuk mengetahui apakah ada perbedaan antara IC50 rutin dan fraksi metanol, IC50 rutin

dan fraksi aseton ekstrak etanol 96% adam hawa. Hasil p-value yang diperoleh yaitu

0,0005456 dan 0,0004805 dimana p-value

14

DAFTAR PUSTAKA

Amic, D., Amic, D.D., Beslo D., Trinajstic, N., 2003. Structure-Radical Scavenging

Activity Relationships of Flavonoids. Croatica Chemica Acta, 76 (1), 55-61.

Avilaa, M., Gonzalez, A., Arriaga, M., Garzaa, M., Carmen, M., 2003. Antigenotoxic,

Antimutagenic and ROS Scavenging Activities Of A Rhoeo discolor Ethanolic

Crude Extract. Toxicology in Vitro, 17, 77–83.

Aziz, Z., Djamil, R., 2013. Isolasi Dan Identifikasi Senyawa Flavonoid Dari Fase N-

Butanol Daun Jeruk Purut (Citrus hystrix. DC). Seminar POKJANAS TOI ke-XLIV,

Palembang.

Fidrianny, I., Darmawanti, A., Sukrasno, 2014. Antioxidant Capacities From Different

Polarities Extracts of Cucurbitaceae Leaves Using Frap, DPPH Assays And

Correlation With Phenolic, Flavonoid, Carotenoid Content. International Journal of

Pharmacy nad Pharmaceutical Sciences, (6), 858-862.

Gandjar, I., G., Rohman, A., 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar, Yogyakarta,

252-256, 324, 354, 359, 480.

Global Biodiversity Information Facility, 2013. Rhoeo discolor (L'Hér.) Hance.

http://www.gbif.org/species/101345884, diakses pada tanggal 22 April 2016.

Harborne, J., 1996. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan.

Cetakan Ketiga, Penerjemah: Padmawinata, K. dan I. Soediro., Penerbit ITB,

Bandung, 71-80.

Herrero, J.A., Hernández, Frutos, M.J., 2015. Influence Of Rutin and Ascorbic Acid in

Colour, Plum Anthocyanins and Antioxidant Capacity Stability in Model Juices.

Food Chemistry, 173, 495-500.

Indrayudha, P., Wiyarti, D., Munawaroh, R., 2013. Aktivitas Antibakteri Fraksi Metanol

Ekstrak Etanol Daun Teh Hijau (Camellia Sinensis (L.) O.K) terhadap Streptococcus

mutans dan Lactobacillus acidophilus serta Bioautografinya. Naskah Publikasi,

Universitas Muhammadiyah Surakarta, Surakarta, 1-15.

Lestario, L.N., Lukito, D., Timotius, H., 2009. Kandungan Antosianin Dan Antosianidin

Dari Jantung Pisang Klutuk (Musa brachycarpa Back) Dan Pisang Ambon (Musa

acuminata Colla). J.Teknol dan Industri Pangan, 22 (2), 143-148.

Lima, A. D. J. B., Corrêa, A. D., Saczk, A. A., Martins, M. P., Castilho, R. O., 2011.

Anthocyanins, Pigment Stability And Antioxidant Activity In Jabuticaba (Myrciaria

cauliflora (Mart.) O. Berg). Rev. Bras. Frutic., Jaboticabal - SP, 33 (3), 877-887.

Marinova, G. and Batchvarov, V., 2011. Evaluation Of The Methods For Determination Of

The Free Radical Scavenging Activity By DPPH. Bulgarian Journal of Agricultural

Science, 17 (1), 11–24.

Miguel, M. G., 2011. Anthocyanins: Antioxidant and/or Anti-Inflammatory Activities.

Journal of Applied Pharmaceutical Science, 01(06), 7-15.

Molyneux, P., 2004. The Use of The Stable Free Radical DPPH for Estimating Antioxidant

Activity. Songklanakarin J. Sci. Technol., 26 (2), 211-219.

Musarofah, 2015. Tumbuhan Antioksidan. Penerbit PT Remaja Rosdakarya, Bandung, 1 -

21.

Saifudin, A., 2014. Senyawa Alam Metabolit Sekunder: Teori, Konsep, dan Teknik

Pemurnian. Edisi 1, Deepublish, Yogyakarta, 35,49-50.

Sapri, A., Fitriani, Narulita, R., 2014. Pengaruh Ukuran Serbuk Simplisia terhadap

Rendemen Ekstrak Etanol Daun Sirsak (Annona muricata L.) dengan Metode

Maserasi. Prosiding Seminar Nasional Kimia 2014, HKI Kaltim.


15

Sitorus, R. M. H., Wullur, A. C., Paulina, V.Y., Yam L., 2012. Isolasi Dan Identifikasi

Senyawa Flavanoid Pada Daun Adam Hawa (Rhoe discolor). Pharmacon, 1(1), 53-

57.

Steenis, V., Bloembergen, Eyma, P.J., 1992. FLORA Untuk Sekolah di Indonesia.

Percetakan Penebar Swadaya, Jakarta, 43-51,136-138.

Tan, J. B. L., Yap, W. J., Tan, S. Y., Lim, Y. Y., Lee, S. M., 2014. Antioxidant Content,

Antioxidant Activity, and Antibacterial Activity of Five Plants from the

Commelinaceae Family. Antioxidants, 3, 758-769.


16

Lampiran 1. Tanaman Adam Hawa

Gambar Tanaman Adam Hawa untuk Deteminasi Tanaman

Gambar Simplisia Daun Adam Hawa yang Telah Dikeringkan


17

Lampiran 2. Determinasi Tanaman Adam Hawa


18

Lampiran 3. Sampel Daun Adam Hawa

Data Penimbangan

Daun Adam Hawa

Berat Wadah (g) Berat Wadah +

Sampel (g)

Berat Wadah +

Sisa Sampel (g)

Berat Sampel (g)

349,59 1381,34 349,59 1031,75

Serbuk Simplisia Daun Adam Hawa


Sampel (g)

Berat Wadah +

Sisa Sampel (g)

Berat Sampel (g)

357,11 406,60 357,11 49,49

Rendemen Serbuk

%rendemen = bobot serbuk daun adam ha a

bobot sampel daun adam ha a 00

%rendemen = 49,49 g

03 ,75 g x 100 % = 4,797 %b/b

Lampiran 4. Maserasi dan Fraksinasi

Sampel : Serbuk digunakan dalam maserasi


Sampel (g)

Berat Wadah +

Sisa Sampel (g)

Berat Sampel (g)

1,419 50,952 1,511 49,441

Penimbangan Ekstrak

Sampel : Ekstrak Etanol 96%

Bobot Ekstrak (g)

Wadah 65,1005

Wadah + isi 72,8170

Isi 7,7165

Rendemen Ekstrak

%rendemen = bobot ekstrak etanol 96 daun adam ha a

bobot serbuk daun adam ha a x 100 %


19

%rendemen = 7,7 65 g

49,44 g x 100 % = 15,6075 %b/b

Fraksinasi

Penimbangan ekstrak untuk fraksinasi

Wadah I

(g)

Wadah II

(g)

Wadah

I + Isi

(g)

Wadah

II + Isi

(g)

Isi I

(g)

Isi II

(g)

Total

Ekstrak

(g)

64,3918 62,7236 66,8910 65,2246 2,4992 2,5010 5,0002

Penimbangan Fraksi Aseton

Bobot Fraksi (g)

Wadah 48,7934

Wadah + isi 49,1621

Isi 0,3687

Penimbangan Fraksi Metanol

Bobot Replikasi 2 (g)

Wadah 46,0354

Wadah + isi 47,1298

Isi 1,0944

Rendemen Fraksi

%rendemen = bobot fraksi ekstrak etanol 96 daun adam ha a

bobot ekstrak etanol 96 daun adam ha a x 100 %

Fraksi Aseton

%rendemen = 0,3687 g

5,000 g x 100 % = 7,3737 %b/b

Fraksi Metanol

%rendemen = ,0944 g

5,000 g x 100 % = 21,8871%b/b


20

Lampiran 5. Isolasi dan Identifikasi Senyawa Flavonoid

Penimbangan Fraksi Metanol (100 mg)

Wadah (g) Wadah + Isi (g) Isi (g)

46,6766 46,7769 0,1003

Penimbangan Fraksi Aseton (100 mg)

Wadah (g) Wadah + Isi (g) Isi (g)

62,1265 65,2272 0,1007

Gambar Hasil elusi KLTP Fraksi Aseton Ekstrak Etanol 96% Daun Tanaman Adam Hawa

pada UV 254 nm

Gambar Hasil elusi KLTP Fraksi Aseton Ekstrak Etanol 96% Daun Tanaman Adam Hawa

pada UV 366 nm


21

Gambar Hasil elusi KLTP Fraksi Metanol Ekstrak Etanol 96% Daun Tanaman Adam

Hawa pada UV 254 nm

Gambar Hasil elusi KLTP Fraksi Metanol Ekstrak Etanol 96% Daun Tanaman Adam

Hawa pada UV 366 nm

Gambar Spektra Fraksi Metanol Isolat 1 dalam Metanol


22

Gambar Spektra Fraksi Metanol Isolat 1 dalam Metanol + NaOH 2N

Gambar Spektra Fraksi Metanol Isolat 1 dalam Metanol + AlCL3 5% + HCL

Gambar Spektra Fraksi Aseton Isolat 2 dalam Metanol


23

Gambar Spektra Fraksi Aseton Isolat 2 dalam Metanol + NaOH 2N

Gambar Spektra Fraksi Aseton Isolat 2 dalam Metanol + AlCL3 5% + HCL

Lampiran 6. Uji Aktivitas Antioksidan (DPPH)

Penimbangan DPPH (10 mg)

Replikasi Wadah (g) Wadah + Isi (g) Isi (g)

1 50,3486 50,3586 0,0100

2 50,0332 50,0434 0,0100

3 62,5513 62,5612 0,0099

4 62,5484 62,5584 0,0100

Pengenceran

- Replikasi 1

a. Konsentrasi Stok DPPH (100 µg/mL)

10 mg/ 100 mL = 0,1 mg/ mL = 100

µg/mL

b. Konsentrasi Seri DPPH (40 µg/mL)

M1 x V1 = M2 x V2

100 µg/mL x V1 = 40 µg/mL x 100 mL

V1 = 40 mL


24

- Replikasi 2


10 mg/ 100 mL = 0,1 mg/ mL = 100

µg/mL


M1 x V1 = M2 x V2

100 µg/mL x V1 = 40 µg/mL x 100 mL

V1 = 40 mL

-Replikasi 3

a. Konsentrasi Stok DPPH (99,0 µg/mL)

9,90 mg/ 100 mL = 0,0990 mg/ mL =

99,0 µg/mL


M1 x V1 = M2 x V2

99 µg/mL x V1 = 40 µg/mL x 100 mL

V1 = 40,40 mL

- Replikasi 4


10 mg/ 100 mL = 0,1 mg/ mL = 100

µg/mL


M1 x V1 = M2 x V2

100 µg/mL x V1 = 40 µg/mL x 100 mL

V1 = 40 mL

Penentuan Panjang Gelombang

Panjang gelombang maksimum yang didapat dengan konsentrasi DPPH 40 µg/mL adalah

515 nm

Gambar Spektra DPPH dengan Konsetrasi 40 µg/mL


25

Penentuan OT

Waktu

(menit)

Konsentrasi Rutin (µg/mL) Keterangan

10 30 50

5 0,777 0,615 0,463

10 0,778 0,610 0,445

15 0,785 0,606 0,439

20 0,790 0,601 0,434

25 0,787 0,601 0,431 OT

30 0,794 0,603 0,435

35 0,800 0,604 0,435

40 0,807 0,610 0,439

45 0,813 0,613 0,439

50 0,818 0,616 0,441

55 0,822 0,614 0,437

60 0,829 0,617 0,439

Konsentrasi Stok Rutin (1000 µg/mL)

10 mg/ 10 mL = 1 mg/ mL = 1000

µg/mL

b.Konsentrasi Seri Rutin

- Konsentrasi Seri (10 µg/mL)

M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 10 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,1 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 30 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,3 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 50 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,5 mL

Penimbangan Rutin (10 mg)


1 50,0590 50,0690 0,0100

2 64,6723 64,6823 0,0100

3 65,6337 65,6438 0,0101

Pengenceran

- Replikasi 1

a. Konsentrasi Stok Rutin (1000 µg/mL)

10 mg/ 10 mL = 1 mg/ mL = 1000

µg/mL




26

M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 20 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,2 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 40 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,4 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 60 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,6 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 80 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,8 mL

Konsentrasi Seri (100 µg/mL)

M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 100 µg/mL x 10 mL

V1 = 1,0 mL

- Replikasi 2


10 mg/ 10 mL = 1 mg/ mL = 1000

µg/mL



M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 20 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,2 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 40 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,4 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 60 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,6 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 80 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,8 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1000 µg/mL x V1 = 100 µg/mL x 10 mL

V1 = 1,0 mL

- Replikasi 3


10 mg/ 10 mL = 1 mg/ mL = 1010

µg/mL


- Konsentrasi Seri (20,2 µg/mL)

M1 x V1 = M2 x V2


27

1010 µg/mL x V1 = 20 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,199 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1010 µg/mL x V1 = 40 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,399 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1010 µg/mL x V1 = 60 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,599 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1010 µg/mL x V1 = 80 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,799 mL


M1 x V1 = M2 x V2

1010 µg/mL x V1 = 100 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,998 mL

y = -0,0053x + 0,7745

R² = 0,9933

r = 0,9966

Ablanko = 0,826

y = -0,0053x + 0,7745

R² = 0,9933 0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

an

si

µg/mL

Grafik Replikasi 1 Konsentrasi Rutin Vs Absorbansi

Y-Values

Linear (Y-Values)

Konsentrasi

(µg/mL)

Absorbansi

20 0,670

40 0,553

60 0,451

80 0,371

100 0,223

Konsentrasi

(µg/mL)

%IC

20 18,8862

40 33,0509

60 45,3995


28

y = 0,6513x + 6,0048

50 = 0,6513x + 6,0048

x = (50 – 6,0048) / 0,6513

x = 67,5498 µg/mL = IC50

R² = 0,992

r = 0,9960

y = 0,6513x + 6,0048

R² = 0,992

0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 20 40 60 80 100 120

%IC

µg/mL

Grafik Replikasi 1 Konsentrasi Rutin Vs %IC

Y-Values

Linear (Y-Values)

y = -0,0054x + 0,8358

R² = 0,9971 0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

an

si

µg/mL


Y-Values

Linear (Y-Values)

80 55,0848

100 73,0024


29

y = -0,0054x + 0,8358

R² = 0,9971

r = 0,9985

Ablanko = 0,862

y = 0,6311x + 3,0394

50 = 0,6311x + 3,0394

x = (50 -3,0394)/ 0,6311

X = 74,410 µg/mL = IC50

R² = 0,9971

r = 0,9985

y = 0,6311x + 3,0394

R² = 0,9971 010

20

30

40

50

60

70

80

0 20 40 60 80 100 120

%IC

µg/mL


Y-Values

Linear (Y-Values)

Konsentrasi

(µg/mL)

Absorbansi

20 0,721

40 0,622

60 0,509

80 0,414

100 0,281

Konsentrasi

(µg/mL)

%IC

20 16,3573

40 27,8422

60 40,9513

80 51,9722

100 67,4014


30

y = -0,0058x + 0,8286

R² = 0,9928

r = 0,9964

Ablanko = 0,858

y = -0,0058x + 0,8286

R² = 0,9928

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0 20 40 60 80 100 120

Ab

sorb

an

si

µg/mL


Y-Values

Linear (Y-Values)

y = 0,6702x + 3,4266

R² = 0,9928 0

10

20

30

40

50

60

70

80

0 20 40 60 80 100 120

%IC

µg/mL


Y-Values

Linear (Y-Values)

Konsentrasi

(µg/mL)

Absorbansi

20 0,707

40 0,603

60 0,478

80 0,393

100 0,237


31

y = 0,6702x + 3,4266

50 = 0,6702x + 3,4266

x = (50 – 3,4266) / 0,6702

X = 69,492 µg/mL = IC50

R² = 0,9928

r = 0,9964

Baku Rutin

Replikasi Nilai IC50 (µg/mL)

Total

Nilai IC50

Rata-Rata

Nilai IC50 (µg/mL)

SD CV (%)

1 67,550

211,452 70,484 3,536 5,017 2 74,410

3 69,492

Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi

Peninbangan Fraksi

Penimbangan Fraksi Metanol Replikasi (100 mg)


1 61,1018 61,2018 0,1000

2 63,1681 63,2681 0,1000

3 60,6083 60,7083 0,1000

Penimbangan Fraksi Aseton Replikasi (60 mg)


1 44,5160 44,5760 0,0600

2 63,8779 63,9379 0,0600

3 61,3538 61,4138 0,0600

Konsentrasi

(µg/mL)

%IC

20 17,5991

40 29,7203

60 44,2890

80 54,1958

100 72,3776


32

Pengenceran Fraksi Metanol

*Untuk Replikasi 1,2 dan 3

a. Konsentrasi Stok Fraksi Metanol

(10.000 µg/mL)

100 mg/ 10 mL = 10 mg/ mL = 10.000

µg/mL

b.Konsentrasi Fraksi Metanol


M1 x V1 = M2 x V2

10.000 µg/mL x V1 = 200 µg/mL x 10

mL

V1 = 0,2 mL


M1 x V1 = M2 x V2

10.000 µg/mL x V1 = 400 µg/mL x 10

mL

V1 = 0,4 mL


M1 x V1 = M2 x V2

10.000 µg/mL x V1 = 600 µg/mL x 10

mL

V1 = 0,6 mL


M1 x V1 = M2 x V2

10.000 µg/mL x V1 = 800 µg/mL x 10

mL

V1 = 0,8 mL

Konsentrasi Seri (1.000 µg/mL)

M1 x V1 = M2 x V2

10.000 µg/mL x V1 = 1.000 µg/mL x 10

mL

V1 = 1,0 mL


33

Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Metanol

Diketahui :

Replikasi 1 Akontrol = 0,776



Replikasi

Konsentrasi

Fraksi

(µg/mL)

Absorbansi %IC Persamaan

regresi

IC50

(µg/mL)

1

200

400

600

800

1000

0,551

0,514

0,458

0,405

0,342

28,9948

33,7629

40,9794

47,8093

55,9278

y = 0,034x +

21,121

R² = 0,9930

r =0,9965

849, 382

2

200

400

600

800

1000

0,569

0,528

0,454

0,402

0,309

27,2379

32,4808

41,9437

48,5934

60,4859

y = 0,0413x +

17,366

R² = 0,9838

r = 0,9919

790,169

3

200

400

600

800

1000

0,566

0,509

0,461

0,408

0,316

25,3298

32,8496

39,1821

46,1741

58,3113

y = 0,0396x +

16,583

R² = 0,9826

r = 0,9913

843,864

Total IC50 (µg/mL) 2483,415

Rata-Rata IC50 (µg/mL) 827,805

SD 32,710

CV (%) 3,951

Pengenceran Fraksi Aseton

*Untuk Replikasi 1,2 dan 3

a. Konsentrasi Fraksi Aseton (6.000

µg/mL)

60 mg/ 10 mL = 6,0 mg/ mL = 6.000

µg/mL

b.Konsentrasi Fraksi Aseton


M1 x V1 = M2 x V2

6.000 µg/mL x V1 = 180 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,3 mL


M1 x V1 = M2 x V2


34

6.000 µg/mL x V1 = 360 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,6 mL


M1 x V1 = M2 x V2

6.000 µg/mL x V1 = 540 µg/mL x 10 mL

V1 = 0,9 mL


M1 x V1 = M2 x V2

6.000 µg/mL x V1 = 480 µg/mL x 10 mL

V1 = 1,2 mL


M1 x V1 = M2 x V2

6.000 µg/mL x V1 = 900 µg/mL x 10 mL

V1 = 1,5 mL

Uji Aktivitas Antioksidan Fraksi Aseton

Diketahui :




Replikasi

Konsentrasi

Fraksi

(µg/mL)

Absorbansi %IC Persamaan

regresi

IC50

(µg/mL)

1

180

360

540

720

900

0,612

0,558

0,489

0,423

0,356

21,1340

28,0928

36,9845

45,4897

54,1237

y = 0,0463x +

12,152

R² = 0,9985

r =0,9992

817,451

2

180

360

540

720

900

0,589

0,532

0,446

0,416

0,333

24,6803

31,9693

40,4092

46,8031

57,4169

y = 0,0446x +

16,164

R² = 0,9942

r = 0,9971

758,655

3

180

360

540

720

900

0,601

0,525

0,465

0,425

0,331

20,7124

30,7388

38,6544

43,9314

56,3325

y = 0,0469x +

12,744

R² = 0,9857

r = 0,9928

794,371

Total IC50 (µg/mL) 2370,477

Rata-Rata IC50 (µg/mL) 790,159

SD 29,623

CV (%) 3,749


35

Lampiran 7. Hasil Uji Statistik

Uji Normalitas


36

Uji T tidak berpasangan


37


38

BIOGRAFI PENULIS

Penulis skripsi yang berjudul “Isolasi, Identifikasi dan Uji

Aktivitas Antioksidan Senyawa Flavonoid Fraksi Metanol Dan

Fraksi Aseton Daun Tanaman Adam Hawa (Rhoeo discolor

(L'Hér.) Hance) dengan Metode 2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl

(DPPH)” memiliki nama lengkap Deriven Samurai Teweng.

Dilahirkan di Palangkaraya pada tanggal 01 April 1995 dari

pasangan Bapak Samurai Teweng dan Ibu Maknawati. Penulis

telah menyelesaikan pendidikan SD Katolik Santo Don Bosco

Palangkaraya pada tahun 2007, lalu melanjutkan pendidikan di

SMP Katolik Santo Paulus Palangkaraya pada tahun 2007 hingga

2010. Penulis menempuh Sekolah Menengah Atas di SMA Negri

2 Palangkaraya pada tahun 2010 hingga 2013. Penulis melanjutkan pendidikan tinggi di

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma pada tahun 2013 hingga 2016. Selama

menjadi mahasiswa di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma, penulis cukup aktif

dalam kegiatan kemahasiswaan dan kepanitiaan di Universitas Sanata Dharma antara lain:

panitia Rapat Anggota Tahunan (RAT) dan Anggota Koperasi Mahasiswa Universitas

Sanata Dharma (2014 dan 2015); Relawan Pengajar dalam Program USD Mengajar

(2015); Asisten Dosen Praktikum Botani Farmasi (2014), Asisten Dosen Praktikum

Mikrobiologi (2016), Asisten Dosen Praktikum Farmakognosi-Fitokimia dan Kimia

Analisis (2015 dan 2016).


isolasi, identifikasi dan uji aktivitas antioksidan...

Documents