isolasi, karakterisasi, dan uji aktivitas antioksidan ...digilib.unila.ac.id/58335/3/skripsi tanpa...
TRANSCRIPT
ISOLASI, KARAKTERISASI, DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN
SENYAWA ASAM KLOROGENAT DARI BIJI KOPI HIJAU ROBUSTA
(Coffea canephora Pierre ex A. Froehner)
(Skripsi)
Oleh
VALENTINO BUDI PRATAMA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS LAMPUNG
BANDAR LAMPUNG
2019
ABSTRAK
ISOLASI, KARAKTERISASI, DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN
SENYAWA ASAM KLOROGENAT DARI BIJI KOPI HIJAU ROBUSTA
(Coffea canephora Pierre ex A. Froehner)
Oleh
Valentino Budi Pratama
Telah diisolasi senyawa asam klorogenat dan kafein hidrat dari biji kopi hijau
robusta (Coffea canephora Pierre ex A. Froehner) yang diambil dari Kecamatan
Padang Cermin, Kabupaten Pesawaran, Provinsi Lampung. Tujuan penelitian ini
untuk mendapatkan senyawa asam klorogenat yang memiliki aktivitas sebagai
antioksidan. Isolasi asam klorogenat dilakukan dengan maserasi menggunakan
metanol selama 3x24 jam, kemudian ekstrak dipartisi menggunakan n-heksana dan
etilasetat, dilanjutkan dengan pemurnian menggunakan kromatografi kolom dan
penentuan konsentrasi menggunakan HPLC (High performance liquid
chromatography). Karakterisasi senyawa dilakukan secara spektroskopi UV-Vis
dan inframerah, serta uji aktivitas antioksidan dilakukan dengan menggunakan
metode DPPH (1,1-difenil-2-pikrilhidrazil). Hasil isolasi diperoleh fraksi yang
belum murni dengan konsentrasi asam klorogenat sebesar 210,36 mg/L dan serbuk
putih hidrat sebanyak 125 mg dengan titik leleh sebesar 222-224oC, memiliki
spektrum UV-Vis, inframerah dan nilai Rf kromatogram lapis tipis yang masing-
masing sesuai dengan standar asam klorogenat dan kafein hidrat. Pada uji aktivitas
antioksidan, fraksi asam klorogenat memiliki aktivitas antioksidan yang kuat
dengan nilai IC50 sebesar 6,6601 mg/L dan serbuk kafein hidrat yang kurang aktif
sebagai antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 667,8132 mg/L.
Kata kunci: aktivitas antioksidan, asam klorogenat, biji kopi hijau robusta, kafein
hidrat.
ABSTRACT
ISOLATION, CHARACTERIZATION, AND ACTIVITY TEST OF
ANTIOXIDANT CHLOROGENIC ACID COMPOUND FROM ROBUSTA
GREEN BEANS COFFEE (Coffea canephora Pierre ex A. Froehner)
By
Valentino Budi Pratama
Chlorogenic acid and caffeine hydrate compounds have been isolated from robusta
green beans coffee (Coffea canephora Pierre ex A. Froehner) taken from Padang
Cermin District, Pesawaran Regency, Lampung Province. The purpose of this study
was to obtain chlorogenic acid compounds which have antioxidant activity.
Chlorogenic acid isolation was carried out by maceration using methanol for 3x24
hours, then the extract was partitioned using n-hexane and ethylacetate, followed
by purification using column chromatography and determination of concentration
using HPLC (High performance liquid chromatography). Characterization of
compounds was carried out by UV-Vis and infrared spectroscopy, and the
antioxidant activity test was carried out using the DPPH (1,1-diphenyl-2-
pikrilhidrazil) method. The isolated results obtained by the pure fraction with
chlorogenic acid concentration of 210.36 mg / L and white powder hydrate as much
as 125 mg with a melting point of 222-224oC, have a UV-Vis spectrum, infrared
and thin layer chromatogram Rf values each of which corresponds to standard
chlorogenic acid and caffeine hydrate. In the antioxidant activity test, the
chlorogenic acid fraction had a strong antioxidant activity with an IC50 value of
6.6601 mg/L and caffeine hydrate powder which was less active as an antioxidant
with an IC50 value of 667.8132 mg/L.
Keywords: antioxidant activity, chlorogenic acid, robusta green beans coffee,
caffeine hydrate.
ISOLASI, KARAKTERISASI, DAN UJI AKTIVITAS ANTIOKSIDAN
SENYAWA ASAM KLOROGENAT DARI BIJI KOPI HIJAU ROBUSTA
(Coffea canephora Pierre ex A. Froehner)
Oleh
Valentino Budi Pratama
Skripsi
Sebagai Salah Satu Syarat untuk Mencapai Gelar
SARJANA SAINS
Pada
Jurusan Kimia
Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS LAMPUNG
BANDAR LAMPUNG
2019
RIWAYAT HIDUP
Penulis adalah anak pertama dari tiga bersaudara dari pasangan Budi Sugiartono
dan Kuswandani. Di Jakarta, pada tanggal 14 Februari 1997 lahirlah seorang anak
pertama bernama Valentino Budi Pratama.
Penulis yang berdarah jawa ini mengawali pendidikan formalnya di TK Al-Fajar 2
pada tahun 2002, kemudian melanjutkan pendidikan di SD Jaya Suti Abadi yang
diselesaikan pada tahun 2009. Pendidikan di SMP Negeri 3 Tambun Selatan
diselesaikannya pada tahun 2012 dan dilanjutkan di SMA Negeri 3 Tambun
Selatan yang diselesaikan pada tahun 2015. Pada tahun 2015 penulis diterima di
jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Pengetahuan Alam Universitas Lampung
melalui jalur undangan Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri
(SNMPTN).
Selama menempuh pendidikan di jurusan kimia, penulis telah aktif berorganisasi.
Penulis pernah menjadi kader muda Himaki periode 2015-2016 dan anggota
bidang Sains dan Penalaran Ilmu Kimia (SPIK) Himaki FMIPA Unila periode
2016-2018. Tidak hanya itu, penulis juga pernah menjadi anggota bidang
Informasi dan Komunikasi (Infokom) ROIS FMIPA Unila periode 2015-2016
serta menjadi generasi muda BEM FMIPA Unila pada tahun yang sama. Selain
berorganisasi di dalam fakultas, penulis juga berorganisasi di tingkat universitas
yaitu sebagai anggota muda Unit Kegiatan Mahasiswa Penelitian (UKMP) periode
2015-2016 dan menjadi Kepala Departemen Riset dan Penalaran pada organisasi
yang sama periode 2017-2018.
Selama menjalani perkuliahan, penulis menjadi salah satu mahasiswa penerima
beasiswa peningkatan prestasi akademik (PPA) 2 tahun berturut-turut pada
periode 2017 dan 2018. Penulis juga aktif menjadi asisten praktikum di
Laboratorium Kimia Organik dan asisten di Laboratorium Kimia Dasar FMIPA
Universitas Lampung. Sepanjang tahun 2018, penulis menjadi asisten praktikum
Kimia Dasar jurusan Kimia Fakultas MIPA, asisten praktikum Kimia Organik I
dan asisten praktikum Kimia Organik II jurusan Kimia Fakultas MIPA. Pada
tahun 2019, penulis dipercaya kembali untuk menjadi asisten praktikum Kimia
Organik II jurusan Kimia Fakultas MIPA. Tidak hanya itu, pada tahun 2018-2019
penulis dipercaya untuk menjadi bagian peneliti oleh tim peneliti Balai Riset dan
Standarisasi Industri (Baristand) Bandar Lampung bekerja sama dengan jurusan
Kimia Fakultas MIPA.
Penulis pernah meraih beberapa capaian prestasi dalam mengharumkan nama
almamater Universitas Lampung. Pada tahun 2016, penulis meraih juara 3 lomba
karya tulis ilmiah nasional di Universitas Negeri Semarang dan pada tahun yang
sama juga meraih juara 2 lomba karya tulis ilmiah nasional di Universitas Riau.
Pada tahun 2017, penulis kembali meraih juara 3 lomba karya tulis ilmiah
nasional di Institut Teknologi Sepuluh Nopember dan juara 1 pada lomba yang
sama di Universitas Hasanuddin. Pada tahun 2018, penulis meraih juara 1
kembali pada lomba karya tulis ilmiah nasional di Institut Pertanian Bogor.
Selain pada kegiatan lomba akademik, penulis juga pernah mendapatkan dana
hibah penelitian dari Kemenristekdikti pada Program Kreativitas Mahasiswa
(PKM) tahun 2016 dan 2019. Melalui capaian prestasi tersebut, penulis menerima
penghargaan Dean Award (Penghargaan Dekan) dalam kategori Mahasiswa
Peraih Prestasi tingkat Nasional pada tahun 2017 dan 2018. Pada tahun terakhir
2019, penulis masih diberi kesempatan untuk menjadi pemakalah pada seminar
Internasional Sains dan Teknologi di Bengkulu.
MOTTO
“Allah akan meninggikan orang-orang yang beriman di antaramu dan orang-orang yang diberi ilmu pengetahuan
beberapa derajat“ (Q.S. Al-Mujadalah : 11)
“Man jadda wa jadda (siapa yang bersungguh-sungguh dia yang akan berhasil)“
“You don’t have time to be timid. You must be bold and daring!” (Beauty and The Beast)
“Jadilah bintang-bintang yang berkilauan di langit tanpa melupakan bersama siapa ia bersinar“
(Valentino Budi Pratama)
Puji dan Syukur Kepada Allah SWT Atas Rahmat dan Hidayah-Nya Penulis Mempersembahkan Karya Sederhana Ini Teruntuk:
Mama dan Papa tercinta Yang telah membesarkan, mendidik, mendo’akan, dan memberikan kasih sayang kepada penulis. Semoga Allah SWT membalas semua kebaikan
yang selalu diberikan kepada penulis.
Kakak-Kakak Penulis dan Keluarga Besar Yang memberikan dukungan, saran, dan semangat.
Ibu Prof. Dr. Tati Suhartati, M.S. dan Ibu Dra. Husniati, M.Si. Yang telah sabar membimbing, memberikan ilmu, motivasi, serta saran selama di perkuliahan. Semoga Allah SWT membalas semua kebaikan
yang telah diberikan kepada penulis.
Dr. Kamisah D. Pandiangan, M.Si., Seluruh Dosen, Guru, Staf Administrasi¸ dan Teman-Teman yang telah memberikan Ilmu,
Motivasi, Saran yang positif kepada penulis
Almamater Tercinta, Universitas Lampung
SANWACANA
Alhamdulillah segala puji hanya bagi Allah SWT, atas rahmat dan ridho-Nya
sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul “Isolasi, Karakterisasi,
dan Uji Aktivitas Antioksidan Senyawa Asam Klorogenat dari Biji Kopi Hijau
Robusta (Coffea canephora Pierre ex A. Froehner) “. Skripsi ini merupakan salah
satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains Jurusan Kimia Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam (FMIPA) Universitas Lampung.
Penulis menyadari bahwa penyelesaian skripsi ini tidak lepas dari bimbingan dan
bantuan dari berbagai pihak. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan terima
kasih kepada:
1. Mutiara hidupku yang paling berharga, Papa Budi dan Mama Kuswandani
yang telah melahirkan, mendidik, memberikan kasih sayang, dukungan, doa,
motivasi, dan pengorbanan yang tidak ternilai harganya kepada penulis.
Semoga Allah membalas kebaikan Mama dan Papa dengan kebaikan yang
lebih banyak dan semoga Allah satukan keluarga kita di surga-Nya kelak.
2. Prof. Dr. Tati Suhartati, M.S., selaku Pembimbing I yang telah sabar
membimbing, selalu memberikan motivasi, dukungan, mengarahkan penulis
selama penelitian dan penulisan skripsi.
3. Dra. Husniati, M.Si., selaku Pembimbing II yang telah mempercayakan penulis
dalam mengerjakan penelitian ini yang selalu memberikan dukungan,
bimbingan dan mengarahkan penulis saat melakukan penelitian.
4. Dr. Kamisah D. Pandiangan, M.Si., selaku Pembahas yang banyak
memberikan masukan positif, motivasi, dan membangun kepada penulis dalam
proses penyelesaian skripsi ini.
5. Drs. R. Supriyanto, M.Si., selaku Pembimbing Akademik yang banyak
memberikan masukan positif serta motivasi selama kegiatan akademik kepada
penulis.
6. Dr. Noviany, M.Si., selaku Kepala Laboratorium Kimia Organik atas segala
kebaikannya yang memudahkan penulis dalam melakukan penelitian di
Laboratorium.
7. UPT. Laboratorium Terpadu dan Sentra Inovasi Teknologi (LTSIT)
Universitas Lampung atas dukungannya yang memudahkan penulis dalam
melakukan penelitian di Laboratorium.
8. Balai Riset dan Standarisasi Industri (Baristand) Bandar Lampung atas
kepercayaan dan dukungannya dalam melaksanakan penelitian dengan topik ini.
9. Dr. Suripto Dwi Yuwono, M.T., selaku Ketua Jurusan Kimia FMIPA
Universitas Lampung.
10. Drs. Suratman Umar, M.Sc., selaku Dekan FMIPA Universitas Lampung.
Terima kasih banyak penulis ucapkan atas segala keteladanan yang beliau
berikan.
11. Bapak dan Ibu dosen Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung yang telah
memberikan ilmu dan keteladanan yang berharga kepada penulis selama
menempuh pendidikan di Universitas Lampung.
12. Para staf dan laboran yang ada di Jurusan Kimia FMIPA Universitas Lampung,
khususnya Mba Wiwit, Mas Nomo, dan Pak Gani. Terima kasih atas segala
bantuan yang telah diberikan kepada penulis.
13. Adik-adikku tersayang; Vanesa Kusuma Putri dan Verina Andini Putri.
Semoga kalian semua menjadi anak yang shalihah, berbakti kepada Mama dan
Papa, serta bermanfaat bagi agama dan umat.
14. Keluarga besar UKM-Penelitian Universitas Lampung, teruntuk Kak Mahmud,
Kak Erzal, Mba Mei, Mba Nay, Mba Vina, Yoga, Rita, Aulia, Desy, Sinta,
Etika, Yesi, Sulis, Fikri dan rekan-rekan lainnya. Berjuang bersama kalian
adalah pengalaman yang sangat berharga dan tak terlupakan. Semoga
persaudaraan ini terus terjalin hingga surga kelak.
15. Himpunan Mahasiswa Kimia (Himaki). Terima kasih telah membuat penulis
lebih berani dan mengenal arti dari kekeluargaan. Pengalaman bersama kalian
akan selalu teringat.
16. Sahabat-sahabatku sejak SMP yang berharga; Iqbal, Pipit, Indi, Ratih, dan
Billy. Terima kasih telah mengisi hidupku dengan candaan dan kerecehan
kalian. Semoga persahabatan ini terus terjalin hingga surga kelak dan diberikan
perlindungan oleh Allah.
17. Partner terbaikku; Mona Dwi Fenska. Terima kasih atas segala kebaikan dan
dukungan yang tulus kepada penulis. Semoga persahabatan ini terus terjalin
hingga surga-Nya kelak. Keteladananmu akan selalu ku ingat.
18. Rekan-rekan penelitian seperjuanganku; Mentari Yunika Sari, Risqy Putra
Haryansyah, Zuwita Wulandari, dan Rinda Harijuliatri S.Si. Terima kasih
sudah menemani hari-hariku di Laboratorium Kimia Organik. Juga untuk Mba
Laili Dini Ariza dan Mba Khalimatus Sadiah yang juga menjadi rekan
seperjuanganku, terima kasih atas segala pelajaran dan dukungan yang
diberikan kepada penulis.
19. Keluargaku “Chem15try“ dan “Kimia Men“. Terima kasih telah memberikan
kenangan indah, dukungan, semangat, serta keceriaan kepada penulis selama
menempuh pendidikan di Kampus.
20. Keluargaku “Penghuni Lab Organik“; Tosa Kusmijiyanto, Isnaini Hidayati,
Eva Nur Indriana, Hanif Amrullah, Ilham, Irfan, May, dan Novita, serta teman-
teman lain yang cukup panjang jika harus disebutkan satu persatu. Terima
kasih atas segala hal yang sudah kita lakukan bersama-sama. Semoga kita
menjadi orang-orang yang sukses di dunia dan akhirat kelak.
21. Kakak-kakak dan adik-adik tingkatku di Jurusan Kimia FMIPA Univesitas
Lampung. Teruntuk adikku Icha dan Ulfi, terima kasih atas kerjasama dan
canda tawanya. Semoga sains menjadikan kita semakin beriman kepada Allah.
22. Semua pihak yang telah membantu dan mendukung penulis dalam
menyelesaikan skripsi ini. Mohon maaf jika penulis tidak bisa sebut satu
persatu.
Penulis tentu menyadari bahwa dalam penulisan skripsi ini masij jauh dari
kesempurnaan. Oleh karena itu, penulis sangat mengharapkan kritik dan saran
untuk skripsi ini. Semoga skripsi ini dapat memberikan manfaat bagi orang
banyak secara umum dan secara khusus menjadi tambahan informasi bagi peneliti
yang berfokus pada pengembangan senyawa bahan alam.
Bandar Lampung, Juli 2019
Penulis,
Valentino Budi Pratama
DAFTAR ISI
Halaman
DAFTAR TABEL..................................................................................................... iii
DAFTAR GAMBAR ................................................................................................ iv
I. PENDAHULUAN.............................................. ................................................... 1
A. Latar Belakang .................................................................................................. 1
B. Tujuan Penelitian .............................................................................................. 4
C. Manfaat Penelitian ............................................................................................ 4
II. TINJAUAN PUSTAKA ...................................................................................... 5
A. Rubiaceae ......................................................................................................... 5
B. Kopi Robusta .................................................................................................... 7
C. Asam Klorogenat .............................................................................................. 10
D. Fenilpropanoid .................................................................................................. 15
E. Ekstraksi Senyawa Fenilpropanoid ................................................................... 17
F. Pemisahan Senyawa Secara Kromatografi ........................................................ 18
1. Kromatografi lapis tipis (KLT) ..................................................................... 20
2. Kromatografi kolom (KK) ............................................................................ 21
3. Kromatografi cair tekanan sedang (MPLC) .................................................. 22
4. Kromatografi cair kinerja tinggi (HPLC) ...................................................... 25
G. Analisis Kemurnian .......................................................................................... 26
H. Identifikasi Senyawa Organik Secara Spektroskopi ......................................... 26
1. Spektroskopi Ultraungu-Tampak (UV-Vis) .................................................. 26
2. Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) ....................................... 27
I. Uji Aktivitas Antioksidan................................................................................... 29
III. METODE PENELITIAN ................................................................................. 31
A. Waktu dan Tempat Penelitian ........................................................................ 31
ii
B. Alat dan Bahan ............................................................................................... 32
1. Alat-alat yang digunakan ........................................................................... 32
2. Bahan-bahan yang digunakan .................................................................... 32
C. Prosedur Penelitian ........................................................................................ 33
1. Pengumpulan dan Persiapan sampel.......................................................... 33
2. Ekstraksi .................................................................................................... 33
3. Partisi ......................................................................................................... 33
4. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ............................................................... 34
5. Kromatografi Kolom (KK) ........................................................................ 35
6. Analisis Kemurnian ................................................................................... 35
7. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) ............................................... 36
8. Kromatografi Cair Tekanan Sedang (MPLC) ........................................... 36
9. Spektrofotometri Ultraungu-Tampak (UV-Vis) ........................................ 37
10. Spektrofotometri Fourier Transform Infrared (FT-IR)........................... 37
11. Uji Aktivitas Antioksidan dengan metode DPPH ................................... 37
12. Uji Bioaktivitas Antibakteri..................................................................... 39
IV. HASIL DAN PEMBAHASAN .......................................................................... 40
A. Isolasi Senyawa Asam Klorogenat ................................................................ 40
B. Analisis Kemurnian ....................................................................................... 55
1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) ............................................................... 55
2. Penentuan Titik Leleh ................................................................................ 57
3. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) Analisis ................................. 58
C. Analisis Spektrofotometri .............................................................................. 59
1. Analisis Spektrofotometri Ultraungu-tampak (UV-Vis) ........................... 59
2. Analisis Spektrofotometri Inframerah (FT-IR) ......................................... 63
D. Uji Aktivitas Antioksidan .............................................................................. 66
E. Uji Bioaktivitas Antibakteri ........................................................................... 69
V. SIMPULAN DAN SARAN ................................................................................. 71
A. Simpulan ........................................................................................................ 71
B. Saran .............................................................................................................. 72
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................................... 73
LAMPIRAN .............................................................................................................. 80
1. Diagram Alir Penelitian .................................................................................. 81
2. Perhitungan Koefisien Absorpsivitas ............................................................. 86
3. Perhitungan Uji Aktivitas Antioksidan........................................................... 87
4. Perhitungan Uji Bioaktivitas Antibakteri ....................................................... 89
5. Pembuatan Serium Sulfat ............................................................................... 91
6. Hasil Identifikasi/Determinasi Tumbuhan...................................................... 92
DAFTAR TABEL
Tabel Halaman
1. Kandungan Kimia yang Terdapat pada Biji Kopi Robusta ................................. 9
2. Komponen Asam Klorogenat dan Kafein (mg/g biji kopi) pada Biji Kopi
Hijau di Berbagai Daerah .................................................................................... 12
3. Komponen Asam Klorogenat dan Kafein (mg/g biji kopi) pada Biji Kopi
Sangrai di Berbagai Daerah ................................................................................ 12
4. Penggolongan Kromatografi Berdasarkan Fasa Diam dan Fasa Gerak .............. 19
5. Karakteristik Frekuensi Uluran Beberapa Gugus Fungsi (Banwell and
McCash, 1994) .................................................................................................... 28
6. Data Kuantitatif HPLC Analisis Fraksi A4ak25vw ............................................ 59
7. Perbandingan Data IR Senyawa Isolat A4js dengan Kafein Anhidrat dan
Kafein Hidrat (Nolasco et al., 2006) ................................................................... 65
8. Hasil Pengukuran Absorbansi dan % Inhibisi Standar Asam Klorogenat dan
Standar Asam Askorbat terhadap DPPH ............................................................. 67
9. Hasil Pengukuran Absorbansi dan % Inhibisi Fraksi A4ak25vw dan Senyawa
Isolat A4js terhadap DPPH ................................................................................. 67
10. Perbandingan Nilai IC50 Fraksi A4ak25vw dengan Standar Asam Klorogenat
dan Standar Asam Askorbat ................................................................................ 69
11. Ukuran Zona Hambat dari Senyawa Isolat A4js terhadap E. coli ....................... 70
12. Ukuran Zona Hambat dari Senyawa Isolat A4js terhadap B. subtilis ................. 70
DAFTAR GAMBAR
Gambar Halaman
1. Buah Kopi Robusta (Prastowo dkk., 2010) ......................................................... 8
2. Struktur Asam Klorogenat .................................................................................. 10
3. Struktur Kimia Pembentuk Asam Klorogenat (Jaiswal et al., 2010) .................. 11
4. Kerangka Dasar Fenilpropanoid ......................................................................... 15
5. Struktur Beberapa Contoh Fenilpropanoid ......................................................... 16
6. Skematik dari MPLC Sederhana (Hostettmann and Terreaux, 2000) ................. 23
7. Pengisian Kering pada MPLC Kolom Kaca (Hostettmann et al., 1997) ............ 24
8. Reaksi Penangkapan Radikal DPPH oleh Antioksidan (Prakash et al., 2001) ... 29
9. Biji Kopi Hijau Robusta Setelah Dikeringkan .................................................... 40
10. Biji Kopi Hijau Robusta yang Sudah Dihaluskan ............................................... 41
11. Proses Maserasi Biji Kopi Hijau Robusta ........................................................... 41
12. Ekstrak Pekat Biji Kopi Hijau Robusta ............................................................... 42
13. Partisi dengan Pelarut n-heksana ........................................................................ 43
14. Partisi dengan Pelarut EtOAc .............................................................................. 44
15. Fraksi Hasil Pemekatan (a) Fraksi Heksana, (b) Fraksi EtOAc, dan (c) Fraksi
Metanol ............................................................................................................... 44
v
16. Proses Kromatografi Kolom dengan Polyamide ................................................. 45
17. Kromatogram KLT Fraksi-fraksi Hasil KK Polyamide Menggunakan Eluen
5% Asam Asetat dalam Metanol ......................................................................... 45
18. Fraksi A3, A4, dan A5 ........................................................................................ 46
19. Kromatogram Fraksi A3, A4, dan A5 Menggunakan Eluen Metanol:Akuades
(8:2) ..................................................................................................................... 46
20. Kromatogram Fraksi A4 Menggunakan Eluen Heksana:IPA (6:4) .................... 47
21. Kromatogram Fraksi A5 Hasil KK Silika Menggunakan Eluen Metanol:
Akuades (85:15) .................................................................................................. 48
22. Kromatogram Fraksi A4 Hasil KK Silika Menggunakan Eluen Metanol:
Akuades (85:15) .................................................................................................. 49
23. Kromatogram Fraksi A4aa-ak Menggunakan Eluen Metanol:Akuades (3:7) .... 50
24. Kromatogram Fraksi A4aa-ak Hasil KK Polyamide Menggunakan Eluen
Metanol:Akuades (7:3) ........................................................................................ 50
25. Kromatogram Fraksi A4ak25 Hasil KK Silika Menggunakan Eluen Metanol:
Akuades (1:1) ...................................................................................................... 51
26. Kromatogram MPLC Fraksi A5g-j Menggunakan Eluen Metanol:Akuades
(3:7) ..................................................................................................................... 52
27. Kromatogram Fraksi F3.1 Hasil MPLC Menggunakan Eluen Metanol:Akuades
(85:15) ................................................................................................................. 53
28. Kromatogram MPLC Fraksi A5l-ae Menggunakan Eluen Metanol:Akuades
(3:7) ..................................................................................................................... 54
29. Kromatogram Fraksi F3.2 Hasil MPLC Menggunakan Eluen Metanol:Akuades
(85:15) ................................................................................................................. 54
30. Perbandingan Kromatogram Padatan Amorf A4jn dan A4os Menggunakan
3 Sistem Eluen (a) Aseton:Akuades 1:9, (b) Metanol:Akuades 1:1, (c)
Metanol:Etilasetat 3:7 ......................................................................................... 55
vi
31. Perbandingan Kromatogram Fraksi A4ak25vw Menggunakan 3 Sistem Eluen
(a) Metanol:Akuades 1:1, (b) Metanol:Etilasetat 3:7, (c) IPA:Akuades 1:1 ....... 56
32. Kromatogram (a) Standar Asam Klorogenat, (b) Fraksi A4ak25vw .................. 58
33. Spektrum UV-Vis Fraksi A4ak25vw dan Standar Asam Klorogenat dalam
MeOH .................................................................................................................. 60
34. Spektrum UV-Vis Senyawa Isolat A4js dalam (a) MeOH dan (b) MeOH
+NaOH ................................................................................................................ 61
35. Spektrum UV-Vis (a) Senyawa Isolat A4js dan (b) Senyawa Kafein
(Palled et al., 2017) ............................................................................................. 62
36. Spektrum IR Senyawa Isolat A4js ...................................................................... 63
37. Struktur Kafein .................................................................................................... 66
38. Kurva Regresi Linier Fraksi A4ak25vw ............................................................. 68
I. PENDAHULUAN
A. Latar Belakang
Sektor perkebunan di Indonesia setiap tahunnya mengalami perkembangan yang
sangat pesat. Salah satu komoditas andalan dalam sektor perkebunan Indonesia
adalah kopi. Kopi merupakan salah satu minuman yang sering dikonsumsi oleh
masyarakat Indonesia. Menurut Fujioka dan Shibamoto (2008), kopi menempati
urutan kedua dari semua komoditas pangan yang dikonsumsi dan diperdagangkan
di seluruh dunia. Sudah ada 80 spesies kopi yang diidentifikasi di dunia, namun
dua spesies kopi yang sering dibudidayakan dan memberikan nilai ekonomis
adalah kopi arabika (Coffea arabica) dan kopi robusta (Coffea canephora) (Farah,
2012).
Berdasarkan data dari Direktorat Jenderal Perkebunan (2014), Provinsi Lampung
sangat berperan terhadap pertumbuhan produksi kopi nasional dengan produksi
pada tahun 2014 mencapai 131.515 ton. Di pasaran nasional, kopi Lampung sudah
cukup dikenal. Kopi di Provinsi Lampung pada umumnya adalah kopi jenis
robusta. Kopi robusta dan arabika memiliki perbedaan dalam aspek fisik dan
komposisi kimia. Rasa yang dihasilkan dari 2 jenis kopi ini juga berbeda, kopi
arabika diduga menghasilkan rasa dan aroma yang lebih unggul sedangkan kopi
2
robusta menghasilkan rasa yang lebih pahit. Banyaknya perbedaan pada 2 jenis
kopi ini tentu berhubungan dengan komponen kimia yang terkandung dalam 2
jenis kopi tersebut (Jaiswal et al., 2014).
Menurut Mulato et al. (2001), kopi mengandung berbagai jenis senyawa, antara
lain kafein, asam klorogenat, trigonelin, karbohidrat, lemak, asam amino, asam
organik, aroma volatil, dan mineral. Sedangkan menurut Mursu et al. (2005), kopi
juga mengandung beberapa komponen fenolik selain tokoferol yang menunjukkan
kapasitas antioksidan seperti asam klorogenat, asam kafeat, asam ferulat, dan
asam p-kumarat yang terdapat dalam bentuk bebas. Asam yang dominan pada biji
kopi adalah asam klorogenat yaitu sekitar 8% pada biji kopi atau 4,5% pada kopi
sangrai. Selama penyangraian sebagian besar asam klorogenat menjadi asam
kafeat dan asam kuinat (Aziz et al., 2009).
Biji kopi hijau robusta paling banyak mengandung asam klorogenat dibandingkan
dengan biji kopi hijau arabika. Berdasarkan penelitian Farah (2012), biji kopi
hijau robusta memiliki nilai kandungan asam klorogenat sebesar 6,1-11,3 mg/g,
sedangkan biji kopi hijau arabika sebesar 4,1-7,9 mg/g. Namun, perbedaan
kandungan asam klorogenat tidak hanya didasarkan pada jenis saja, ada faktor lain
yang mempengaruhi perbedaan asam klorogenat seperti faktor genetik, praktek
pengolahan penanaman oleh petani, iklim, jenis tanah, dan lingkungan sekitar.
Banyaknya penelitian dan artikel yang berfokus pada kafein yang terkandung
dalam biji kopi menyebabkan senyawa lain yang bermanfaat seperti asam
3
klorogenat belum banyak diteliti dan diketahui oleh masyarakat luas sehingga
perlu dicari metode yang tepat untuk mengisolasi asam klorogenat.
Pada penelitian ini akan dilakukan isolasi senyawa asam klorogenat dari biji kopi
hijau robusta (C. canephora L). Pada penelitian terdahulu, dua isomer asam
klorogenat berhasil diisolasi dari biji kopi robusta Lampung dengan massa
masing-masing 3,1 mg dan 4,3 mg. Asam klorogenat diisolasi menggunakan
metode kromatografi kolom terbuka dengan fasa diam silika octadecylsilyl (ODS)
C18 dengan eluen bergradien 10% (v/v) metanol : air (Sukohar et al., 2011).
Namun penggunaan fasa diam silika ODS masih terbilang tidak ekonomis dilihat
dari harganya yang cukup mahal. Berdasarkan penelitian terdahulu yang telah
dilakukan, maka perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dengan menggunakan fasa
diam yang jauh lebih ekonomis namun tetap memiliki hasil isolasi yang sama.
Selain itu, adanya aktivitas senyawa asam klorogenat pada biji kopi yang dapat
menghasilkan efek farmakologi dijadikan sebagai dasar penelitian ini.
Metode isolasi dilakukan dengan cara maserasi menggunakan pelarut metanol dan
partisi menggunakan pelarut n-heksana dan etil asetat. Oleh karena asam
klorogenat merupakan senyawa polar maka akan larut dengan baik dalam pelarut
polar, salah satunya yaitu metanol. Selain itu, akan dilakukan pula fraksinasi
terhadap sampel menggunakan berbagai jenis kromatografi seperti kromatografi
kolom (KK), kromatografi lapis tipis (KLT) dan kromatografi cair tekanan sedang
(MPLC). Identifikasi kemurnian senyawa dilakukan dengan menggunakan
kromatografi lapis tipis, uji titik leleh, dan kromatografi cair kinerja tinggi
4
(HPLC) analisis. Identifikasi struktur molekul dilakukan dengan menggunakan
spektroskopi Ultraungu-tampak (UV-Vis), dan inframerah (IR). Setelah dihasilkan
senyawa murni, dilakukan uji aktivitas antioksidan dengan metode DPPH.
B. Tujuan Penelitian
Tujuan penelitian ini adalah sebagai berikut:
1. Mengisolasi asam klorogenat dari biji kopi hijau robusta (C. canephora L)
dari Kabupaten Pesawaran, Provinsi Lampung, Indonesia.
2. Mengkarakterisasi asam klorogenat yang terdapat dalam biji kopi hijau
robusta menggunakan analisis spektrokopi UV-Vis dan FTIR.
3. Menguji aktivitas antioksidan asam klorogenat hasil isolasi.
C. Manfaat Penelitian
Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi dan memperkaya
pengetahuan serta wawasan mengenai metode isolasi asam klorogenat dari biji
kopi hijau robusta (C. canephora L) dan kemampuan aktivitas antioksidan
senyawa asam klorogenat hasil isolasi. Informasi tersebut diharapkan dapat
memperkaya pengetahuan mengenai senyawa bahan alam dari biji kopi hijau
robusta (C. canephora L) yang berpotensi sebagai pengobatan terapi alternatif dan
pengembangan obat baru pada penelitian lebih lanjut di masa depan.
II. TINJAUAN PUSTAKA
A. Rubiaceae
Keluarga Rubiaceae memiliki persebaran yang cukup luas, sebagian besar
terkonsentrasi di daerah tropis. Menjadi salah satu yang terbesar di kelas
Magnoliopsida, Rubiaceae menempati urutan keempat dalam keragaman spesies
di antara Angiosperms (Mabberley, 1997). Ini mencakup sekitar 637 genus dan
13.000 spesies (Pereira, 2010). Menurut klasifikasi Robbrecht (1988), keluarga
Rubiaceae dibagi menjadi empat subfamilies: Rubioideae, Cinchonoideae,
Antirheoideae dan Ixoroideae. Namun, penelitian yang lebih baru menyarankan
keluarga ini untuk dibagi menjadi tiga subfamilies: Rubioideae, Cinchonoideae
dan Ixoroideae, karena beberapa penulis tidak mengenali Antirheoideae sebagai
subfamili (Bremer, 2009).
Keluarga Rubiaceae dicirikan oleh produksi metabolit bioaktif dengan potensi
farmakologis yang besar. Metabolit ini dapat digunakan sebagai penanda
chemotaxonomic bahkan untuk genus dan subfamilies (Mongrand et al., 2005).
Senyawa fitokimia dapat menjadi senyawa yang berguna untuk
mengkarakterisasi, menggambarkan dan mengklasifikasikan spesies tanaman.
Distribusi metabolit sekunder di Rubiaceae mengikuti pola yang dapat membantu
6
mengkarakterisasi kelompok botani (subfamili, suku atau genus). Pola-pola ini
relatif terhadap kemotaksonomi sering digunakan untuk menetapkan asal botani
(Mabberley, 1997).
Dalam beberapa tahun terakhir, spesies Rubiaceae telah dipelajari secara
menyeluruh dari sudut pandang fitokimia. Namun, sangat sedikit studi yang
menggunakan pengetahuan ini sebagai bahan dalam studi taksonomi. Ketika
melakukan studi bioprospecting tanaman, semua informasi botani dan
kemotaksonomi sangat penting, karena meningkatkan kemungkinan menemukan
senyawa bioaktif, yang memungkinkan penemuan obat baru yang berasal dari
alam (Pereira, 2010). Keluarga Rubiaceae menyajikan keragaman besar senyawa
seperti iridoid, alkaloid indol, antrakuinon, terpenoid (diterpenes dan triterpen),
flavonoid dan turunan fenolik lainnya, dengan penekanan pada produksi alkaloid
bioaktif (Farias, 2006).
Jumlah produk yang dideskripsikan, keragaman struktural dan aktivitas
farmakologis yang dilaporkan untuk berbagai spesies Rubiaceae menunjukkan
keluarga ini menjadi sumber zat bioaktif baru yang menjanjikan, yang dapat
menimbulkan produk baru sebagai molekul aktif atau bahkan prototipe obat.
Banyak dari tanaman ini telah digunakan secara luas dalam pengobatan tradisional
dan beberapa menunjukkan anti-inflamasi, analgesik, antibakteri, mutagenik,
antivirus, antioksidan, efek pada penyakit pembuluh darah serta aktivitas pada
sistem saraf pusat (Heitzman et al., 2005).
7
Di subfamili Ixoroideae, genus Coffea adalah salah satu yang paling penting
secara ekonomi, terutama spesies Coffea arabica, yang dikenal sebagai kopi, yang
memiliki kafein sebagai salah satu komponen kimianya yang utama. Zat ini
bertindak sebagai stimulan sistem saraf pusat, serta vasokonstriktor, bronkodilator
dan diuretik, selain menjadi salah satu komponen obat migrain (Simoes et al.,
2004).
B. Kopi Robusta
Tumbuhan kopi robusta (Coffea canephora Pierre ex A. Froehner) termasuk ke
dalam genus Coffea sp., Famili Rubiaceae. Sebagai salah satu famili Rubiaceae,
jumlah spesies kopi mencapai lebih dari 70 spesies, namun terdapat 2 (dua)
spesies utama yang paling banyak diperdagangkan yaitu Coffea arabica L. (64%)
dan C. canephora Pierre ex A. Froehner (36%) (Pohlan and Janssens, 2010).
Tumbuhan ini terdapat pada daerah tropis seperti di Asia Tenggara dan sebagian
Amerika Selatan. Taksonomi tumbuhan kopi robusta adalah sebagai berikut.
Kingdom : Plantae
Divisi : Magnoliophyta
Sub Divisi : Spermatophyta
Kelas : Magnoliopsida
Ordo : Rubiales
Famili : Rubiaceae
Genus : Coffea
Spesies : Coffea canephora
(Cronquist, 1981).
8
Kopi robusta memiliki daun berbentuk bulat telur dengan ujung agak meruncing.
Daun tumbuh berhadapan dengan batang, cabang, dan ranting-rantingnya.
Permukaan atas daun mengkilat, tepi rata, pangkal tumpul, panjang 5-15 cm, lebar
4,0-6,5 cm, pertulangan menyirip, tangkai panjang 0,5-1,0 cm, dan berwarna hijau
(Najiyati dan Danarti, 2012).
Gambar 1. Buah Kopi Robusta (Prastowo dkk., 2010)
Kopi robusta (Coffea canephora) berada di Indonesia pada tahun 1900, kopi ini
tahan penyakit karat daun, dan memerlukan syarat tumbuh dan pemeliharaan yang
ringan, sedangkan produksinya jauh lebih tinggi. Oleh karena itu kopi ini cepat
berkembang dan mendesak kopi-kopi lainya. Saat ini lebih dari 90% dari areal
pertanaman kopi Indonesia terdiri atas kopi Robusta (Prastowo et al., 2010). Kopi
Buah
Daun
Ranting
9
robusta merupakan tanaman perdu yang dapat tumbuh baik pada dataran rendah
dengan ketinggian 800 dpl serta tumbuh optimum pada temperatur antara 22-
30oC. Tanaman kopi tersebut akan mulai berbunga pada umur antara 1 sampai 2
tahun dan melakukan penyerbukan silang dengan bantuan angin atau serangga
(Pohlan and Janssens, 2010).
Secara kimia, kopi robusta umumnya memiliki kandungan seperti kafein, asam
klorogenat, trigonelin, karbohidrat, lemak, asam amino, asam organik, aroma
volatil dan mineral dapat menghasilkan efek menguntungkan dan membahayakan
bagi kesehatan penikmat kopi (Hidgon and Frei, 2006). Berdasarkan penelitian
Farah (2012), kopi robusta memiliki kandungan sebagai berikut.
Tabel 1. Kandungan Kimia yang Terdapat pada Biji Kopi Robusta
Komponen Konsentrasi (g/100g)
Biji Kopi Hijau Biji Kopi Sangrai
Sukrosa 0,9-4,0 1,6
Gula Pereduksi 0,4 0,3
Polisakarida 48-55 37
Lignin 3,0 3,0
Pektin 2,0 2,0
Protein 10,0-11,0 7,5-10,0
Asam Amino Bebas 0,8-1,0 Tidak terdeteksi
Kafein 1,5-2,5 2,4-2,5
Trigonelin 0,6-0,7 0,7-0,8
Asam Nikotinik - 0,014-0,025
Minyak kopi
(trigliserida,
sterol/tokoferol)
7,0-10,0 11,0
Diterpen 0,2-0,8 0,2
Mineral 4,4-4,5 4,7
Asam Klorogenat 6,1-11,3 3,3-3,8
Asam Alifatik 1,0 1,6
Asam Kuinat 0,4 1,0
10
Golongan asam pada kopi akan mempengaruhi mutu dan memberikan aroma serta
citarasa yang khas. Asam yang dominan pada biji kopi adalah asam klorogenat
yaitu sekitar 8 % pada biji kopi atau 4,5 % pada kopi sangrai. Selama
penyangraian sebagian besar asam klorogenat menjadi asam kafeat dan asam
kuinat (Yusianto, 2014).
C. Asam Klorogenat
Asam klorogenat adalah suatu senyawa yang termasuk ke dalam komponen
fenolik dan fenilpropanoid, mempunyai sifat yang larut dalam air dan terbentuk
dari esterifikasi asam kuinat dan asam trans-sinamat tertentu seperti asam kafeat,
asam ferulat, dan asam p-kumarat (Susan et al, 2015). Asam klorogenat dapat
melindungi tumbuhan kopi dari mikroorganisme, serangga dan radiasi UV.
Subgrup utama dari isomer asam klorogenat pada kopi adalah asam caffeoylquinic
(CQA), asam feruloylquinic (FQA), asam dicaffeoylquinic (diCQA) dan asam p-
couma-roylquinic (p-CQA) pada jumlah yang lebih kecil (Farah et al., 2006).
Gambar 2. Struktur Asam Klorogenat
Menurut Farah dan Carmen (2006), asam klorogenat pada biji kopi terdiri dari 9
isomer utama di antaranya 3 isomer dari CQA (3-, 4- dan 5-CQAs), 3 isomer dari
CQAs (3,4-,3,5-. dan 4,5-diCQAs) dan tiga dari FQAs (3-,4-, dan 5-FQA).
11
Gambar 3. Struktur Kimia Pembentuk Asam Klorogenat (Jaiswal et al., 2010)
Proses penyangraian pada suhu di atas 180-200oC dapat menyebabkan perubahan
besar dalam komposisi kimia dan aktivitas biologis kopi sebagai akibat dari hasil
reaksi Maillard dan Strecker. Banyak penelitian yang melaporkan bahwa dengan
dilakukannya proses penyangraian, asam klorogenat dapat terurai menjadi derivat
fenol dan dapat menyebabkan nilai kandungannya menjadi berkurang di dalam
biji kopi tersebut (Moon et al., 2009). Menurut Farah dan Carmen (2006), pada
proses penyangraian, diCQA mengalami hidrolisis menjadi monoester dan asam
kafein namun pada proses ini, fenol yang bersifat volatil meningkat. Sekitar 5,5%
asam klorogenat kopi Robusta berubah menjadi 1.5-γ-kuinolakton selama proses
penyangraian.
12
Menurut Moon et al (2009), nilai asam klorogenat pada biji kopi hijau berbeda
dengan biji kopi yang sudah disangrai. Selain itu, setiap daerah penghasil kopi
juga memberikan nilai kandungan asam klorogenat yang berbeda. Hasil tersebut
ditunjukkan pada Tabel 2 dan 3.
Tabel 2. Komponen Asam Klorogenat dan Kafein (mg/g biji kopi) pada Biji Kopi
Hijau di Berbagai Daerah
Komponen Kolombia Etiophia Guatemala Indonesia
3-CQA 2,45±0,18 1,76±0,09 2,26±0,10 3,57±0,11
5-CQA 29,64±2,08 29,39±1,07 28,76±0,99 24,27±1,05
4-CQA 3,73±0,24 2,97±0,15 3,46±0,19 3,57±0,12
5-FQA 1,04±0,05 0,92±0,10 0,95±0,09 0,92±0,02
4-FQA 0,15±0,01 0,15±0,00 0,14±0,01 0,17±0,01
3,4-diCQA 0,85±0,15 0,60±0,05 0,77±0,03 0,87±0,04
3,5-diCQA 2,35±0,30 1,89±0,11 1,85±0,06 1,14±0,06
4,5-diCQA 1,43±0,32 0,98±0,08 1,13±0,09 0,92±0,09
pH 5,78 5,68 5,70 5,85
Kafein 10,54±0,19 8,27±0,28 9,28±0,69 7,53±0,38
Tabel 3. Komponen Asam Klorogenat dan Kafein (mg/g biji kopi) pada Biji Kopi
Sangrai di Berbagai Daerah
Komponen Kolombia Etiophia Guatemala Indonesia
3-CQA 0,78±0,03 1,64±0,09 0,94±0,01 0,69±0,01
5-CQA 1,42±0,01 1,08±0,05 1,67±0,05 1,18±0,00
4-CQA 0,86±0,04 0,68±0,01 1,02±0,02 0,77±0,00
5-FQA 0,14±0,00 0,10±0,02 0,09±0,00 0,08±0,01
4-FQA 0,08±0,00 0,06±0,01 0,09±0,00 0,09±0,00
3,4-diCQA 0,04±0,00 0,03±0,00 0,04±0,00 0,02±0,00
3,5-diCQA 0,02±0,00 0,00±0,00 0,02±0,00 0,01±0,01
4,5-diCQA 0,01±0,01 0,00±0,00 0,02±0,00 0,06±0,00
pH 5,66 5,73 5,61 5,67
Kafein 11,86±0,20 9,38±0,27 10,41±0,03 1,33±0,06
13
Asam klorogenat memiliki efek farmakologis yang penting untuk kesehatan
diantaranya berperan penting dalam mencegah berbagai penyakit yang
berhubungan dengan stress oksidatif seperti kanker, kardiovaskular, penuaan, dan
penyakit neurodegenerative (Belay and Gholap, 2009). Kardiovaskular ini
berhubungan dengan hipertensi. Hipertensi merupakan penyakit yang dapat
menimbulkan komplikasi dan kerusakan organ tubuh seperti jantung, ginjal, mata,
dan pembuluh darah (Wang et al., 2009). Namun hipertensi dapat diobati dengan
menggunakan asam klorogenat. Mekanisme asam klorogenat dalam menurunkan
tekanan darah tinggi melibatkan nitrat oksida (NO). Hipertensi disebabkan adanya
peningkatan kadar hidrogen peroksida dan anion superoksida. Anion superoksida
ini menguras bioavabilitas NO (nitrat oksida) dalam jaringan endotel dengan cara
bereaksi dengan NO untuk menghasilkan peroksi nitrit (ONOO-). Dengan
demikian, NO akan berkurang dan meningkatkan tekanan darah. Asupan asam
klorogenat dapat meningkatkan bioavabilitas NO pada pasien hipertensi karena
asam ferulat, metabolit 5-CQA, membuang superoksida, dan memperlihatkan efek
hipotensi di SHR (Watanabe et al., 2006).
Efek farmakologi asam klorogenat yang lainnya yaitu sebagai hepatoprotektif.
Kerusakan hati dapat disebabkan karena konsumsi obat yang berlebih seperti
parasetamol. Hasil menunjukkan bahwa asam klorogenat dapat mencegah
nekrosis hati disebabkan karena obat parasetamol. Namun mekanismenya belum
diketahui secara pasti (Ji et al., 2013). Berdasarkan penelitian Zong et al. (2014)
dan Zhou et al. (2010), asam klorogenat berpengaruh pada penambahan CCl4
secara in vivo. CCl4 diaktifkan oleh sistem sitokrom p450 untuk memberikan
14
radikal triklorometil (CCl3) dan kemudian dikombinasikan dengan oksigen untuk
membentuk radikal triklorometil peroksil yang dapat menyebabkan kerusakan
pada organ hati.
Pada penelitian secara in vitro, Sato et al. (2011) berhasil menunjukkan bahwa
asam klorogenat mempunyai kumpulan vixinal hidroksil pada residu aromatis.
Senyawa tersebut mempunyai fungsi sebagai antimutagenik, antikanker, dan
aktivitas antioksidan yang bekerja pada ROS (Reactive Oxygen Spesies). ROS
dapat menyebabkan iskemia dan kerusakan pada usus. Antioksidan dapat
menghapus ROS dan meningkatkan hasil. Asam klorogenat mempunyai banyak
gugus hidroksil yang berpengaruh terhadap aktivitas antioksidan (Sukohar et al.,
2011).
Konsumsi asam klorogenat pada kopi dapat menurunkan resiko diabetes mellitus
tipe 2 (Ong et al., 2013 dan Wen et al., 2011). Antidiabetes adalah salah satu
khasiat dari senyawa asam klorogenat. Senyawa tersebut dapat menstimulasi
uptake glukosa pada otot skeletal dengan melalui aktivasi AMPK. Aktivitas
AMPK mempunyai dampak yang positif yaitu dapat mengarahkan hasil metabolit
zat yang bermanfaat seperti penurunan produksi glukosa dalam hati dan sintesis
lemak. Selain itu, asam klorogenat dapat menghambat ekspresi G6Pase hati dan
aktivitas steatosis hati. Asam klorogenat dapat menghambat sintesis asam lemak
baik secara in vitro ataupun in vivo. Asam lemak bebas adalah bahan esensial
penghambat sintesis molekul lipid yang lebih komplek seperti trigliserida dan
triasigliserida sehingga meningkatkan profil lipid dan uptake glukosa otot rangka,
15
meningkatkan glukosa puasa, toleransi glukosa dan sensitivitas insulin. Setelah
dilakukan penelitian, efek asam klorogenat akan menunjukkan hasil yang baik
setelah 15 hari diberikan pada hewan uji (Ong et al., 2013). Mekanisme
antidiabetes dari asam klorogenat yaitu dengan mengubah tingkat mineral darah
maka dapat menghambat besi dan menyerap zink. Kadar zat besi tinggi
berkontribusi dalam produksi radikal (Aidilla et al., 2013).
Asam klorogenat dapat dijadikan sebagai antivirus hepatitis B. Aktivitas anti
HBV pada biji kopi lebih besar dibandingkan yang sudah disangrai karena
kandungan asam klorogenatnya yang lebih banyak (Wang et al., 2009). Selain itu,
asam klorogenat diduga mempunyai aktivitas farmakologi sebagai antikanker.
Penelitian tentang antikanker asam klorogenat perlu dikembangkan agar dapat
dijadikan alternatif terapi dalam pengobatan antikanker (Sukohar et al., 2011).
D. Fenilpropanoid
Fenilpropanoid adalah senyawa fenol alam yang mempunyai cincin aromatik
dengan rantai samping terdiri atas tiga atom karbon. Secara biosintesis senyawa
ini turunan asam amino protein aromatik, yaitu fenilalanin dan fenilpropanoid,
dapat mengandung satu sisa C6 – C3 atau lebih (Hart, 2003).
Gambar 4. Kerangka Dasar Fenilpropanoid
16
Fenilpropanoid yang paling tersebar luar ialah asam hidroksisinamat, suatu
senyawa yang penting, bukan saja sebagai bangunan dasar lignin tetapi juga
berkaitan dengan pengaturan tumbuh dan pertahanan terhadap penyakit. Senyawa
yang termasuk dalam golongan fenilpropanoid antara lain hidroksikumarin,
fenilpropena, dan lignan. Empat macam asam hidroksisinamat umumnya terdapat
dalam tumbuhan dan pada kenyataannya hampir terdapat dimana-mana. Keempat
asam itu ialah asam ferulat, sinapat, kafeat, dan p-kumarat. Struktur beberapa
contoh fenilpropanoid tumbuhan terlihat pada Gambar 5.
Gambar 5. Struktur Beberapa Contoh Fenilpropanoid
Cara memisahkannya sederhana dan dengan mudah dideteksi pada kromatogram
kertas karena berfluoresensi dengan sinar UV (derajat warna biru dan hijau yang
berbeda). Paling sedikit enam asam sinamat lain telah diketahui, tetapi keenamnya
terdapat nisbi langka. Contohnya, asam isoferulat (3-hidroksi-4-metoksi sinamat),
asam o-kumarat, dan asam p-metoksi sinamat. Asam hidroksisinamat biasanya
terdapat dalam tumbuhan sebagai ester dan dapat diperoleh dengan hasil baik
dengan cara hidrolisis basa lemah, karena dengan hidrolisis asam panas bahan
akan hilang akibat dekarboksilasi menjadi hidroksistirena yang bersesuaian. Asam
kafeat biasanya terdapat sebagai ester asam kuinat dan ester ini diberi nama asam
klorogenat. Diketahui juga isomernya (misal asam isoklorogenat), turunannya
dengan gula (misalnya kafeoil glukosa), dan turunannya dengan asam organik
17
(misalnya asam rosmarinat, asam kafeoil tartrat). Dari segi taksonomi kimia
bentuk gabungan asam kafeat yang berbeda-beda itu mempunya arti penting
(Harborne, 1987).
Kumarin tumbuhan yang paling tersebar luas ialah senyawa induknya yaitu
kumarin sendiri yang terdapat dalam lebih dari 27 suku. Kumarin biasa terdapat
dalam rerumputan serta tumbuhan makanan ternak, dan biasa dikenal sebagai
bahan atsiri berbau wangi yang dilepaskan oleh jerami yang baru dibabat.
Hidroksikumarin dijumpai pula dalam berbagai suku tumbuhan yang paling
umum ialah turunan dari umbeliferon (7-hidroksikumarin), eskuletin (6,7-
dihidroksikumarin), atau skopoletin (6-metoksi-7-hidroksikumarin).
Hidroksikumarin yang lebih langka ialah dafnetin (7,8-dihidroksikumarin) dari
Daphne dan fraksetin (6-metoksi-7,8-dihidroksikumarin) dari Fraxinus. Dalam
tumbuhan terdapat kumarin yang lebih rumit, misalnya furanokumarin dengan
contoh psoralen, tetapi ini biasanya terbatas pada beberapa suku seperti Rutaceae
dan Umbelliferae (Murray et al.,1982).
E. Ekstraksi Senyawa Fenilpropanoid
Ekstraksi merupakan proses penarikan zat pokok yang diinginkan dari bahan
(sampel) menggunakan pelarut yang sesuai. Proses ekstraksi dihentikan apabila
tercapai kesetimbangan antara konsentrasi senyawa dalam pelarut dan bahan.
Setelah proses ekstraksi, ekstrak kasar yang diperoleh dipisahkan dari sampel
dengan penyaringan. Ekstraksi terdiri dari beberapa metode seperti maserasi,
perkolasi, destilasi uap, sokletasi, dan refluks. Pemilihan metode ekstraksi
18
tergantung dari sifat bahan dan senyawa target yang akan diisolasi. Proses
ekstraksi yang berasal dari tumbuhan atau bahan alam dapat dilakukan
menggunakan metode maserasi. Metode maserasi dapat menghindari senyawa-
senyawa yang bersifat termolabil (Mukhriani, 2014).
Maserasi merupakan proses perendaman sampel dengan pelarut organik yang
digunakan pada temperatur ruang. Proses ini sangat menguntungkan dalam isolasi
senyawa bahan alam karena dengan perendaman sampel tumbuhan akan terjadi
pemecahan dinding dan membran sel akibat perbedaan tekanan antara di dalam
dan di luar sel sehingga senyawa metabolit sekunder yang ada dalam sitoplasma
akan terlarut dalam pelarut organik dan ekstraksi senyawa akan sempurna karena
dapat diatur lama perendaman yang dilakukan (Lenny, 2006). Hal tersebut
didasarkan pada teori ”Like Dissolves Like” yaitu pelarut sejenis akan melarutkan
molekul yang sejenis (Keenan, 1990). Proses maserasi ini dilakukan beberapa kali
dan ekstrak kemudian disatukan lalu dipekatkan dengan menggunakan penguap-
putar vakum (Markham, 1988). Setelah dilakukan proses ekstraksi, tahap isolasi
selanjutnya adalah fraksinasi senyawa dengan menggunakan beberapa jenis
metode pemisahan kromatografi antara lain kromatografi kolom, kromatografi
lapis tipis, kromatografi cair tekanan sedang (MPLC), dan kromatografi cair
kinerja tinggi (HPLC).
F. Pemisahan Senyawa secara Kromatografi
Tahap isolasi setelah proses ekstraksi adalah fraksinasi senyawa dengan
menggunakan kromatografi. Metode kromatografi adalah pemisahan berdasarkan
19
perbedaan laju perpindahan dari komponen-komponen dalam campuran yang
terdistribusi diantara dua fasa, yaitu fasa diam (stationer) dengan permukaan yang
luas berupa zat padat dan fasa gerak (mobile) berupa cairan atau gas (Murniasih,
2003). Pemisahan dengan metode kromatografi dilakukan dengan memanfaatkan
sifat-sifat fisik dari sampel, seperti kelarutan, adsorbsi, dan kepolaran. Kelarutan
merupakan kecenderungan molekul untuk dapat melarut dalam cairan. Adsorpsi
penyerapan merupakan kecenderungan molekul untuk melekat pada permukaan
serbuk halus (Day dan Underwood, 1981).
Berdasarkan Johnson and Stevenson (1991), terdapat beberapa jenis fasa diam dan
fasa gerak yang dipartisi, sehingga kromatografi digolongkan menjadi beberapa
golongan seperti pada Tabel 4.
Tabel 4. Penggolongan Kromatografi Berdasarkan Fasa Diam dan Fasa Gerak
Fasa diam Fasa gerak Sistem kromatografi
Padat Cair Cair-adsorpsi
Padat Gas Gas-adsorpsi
Cair Cair Cair-partisi
Cair Gas Gas-partisi
Kromatografi digunakan pada beberapa teknik pemisahan berdasarkan pada
migration medium yang berbeda, yaitu distribusinya terhadap fase diam dan fase
gerak. Ada 3 hal yang harus diperhatikan pada teknik ini, pertama yaitu harus
terdapat medium perpindahan tempat, yaitu tempat terjadinya pemisahan. Kedua
harus terdapat gaya dorong agar spesies dapat berpisah sepanjang migration
medium. Ketiga harus terdapat gaya tolakan selektif. Gaya yang terakhir ini dapat
20
Rf =
menyebabkan pemisahan dari bahan kimia yang dipertimbangkan (Sienko dan
Marcus, 1984).
1. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Kromatografi lapis tipis adalah suatu teknik pemisahan komponen-komponen
campuran senyawa-senyawa yang melibatkan partisi suatu senyawa di antara
padatan penyerap (adsorbent, fasa diam) yang dilapiskan pada pelat kaca atau
plastik kaku dengan suatu pelarut (fasa gerak) yang mengalir melewati adsorbent
(padatan penyerap). Pengaliran pelarut dikenal sebagai proses pengembangan oleh
pelarut (elusi). Karena kesederhaan dan kecepatan analisisnya, KLT mempunyai
peranan penting dalam pemisahan senyawa-senyawa yang volatilitasnya relatif
rendah, baik senyawa organik maupun senyawa anorganik (Khopkar, 2003).
Kromatografi Lapis Tipis ialah metode pemisahan fisikokimia yang terdiri atas
bahan berbutir-butir (fase diam), ditempatkan pada penyangga berupa pelat gelas,
logam, atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan dipisah, berupa larutan,
ditotolkan berupa bercak atau pita. Setelah pelat atau lapisan diletakkan di dalam
bejana tertutup rapat yang berisi larutan pengembang yang cocok (fase gerak),
pemisahan terjadi selama perambatan kapiler (pengembangan). Selanjutnya,
senyawa yang tidak berwarna harus ditampakkan (dideteksi) (Stahl, 1985).
Metode KLT dapat dihitung nilai Retention factor (Rf) dengan persamaan :
Jarak yang ditempuh senyawa
Jarak tempuh pelarut
21
2. Kromatografi Kolom (KK)
Fase diam dengan pemisahan berdasarkan perbedaan adsorpsi ada dua jenis yaitu
fasa normal yang bersifat polar dan fase terbalik (reversed phase) yang bersifat
non polar. Fasa normal yang umum digunakan adalah silika gel alumina dimana
pemisahan terjadi karena perbedaan daya serap yang disebabkan perbedaan
kepolaran komponen yang akan dipisahkan. Pada fase normal yang kepolarannya
paling rendah atau non polar akan keluar (terelusi) paling awal dan yang paling
polar akan terelusi paling akhir. Konsep pemilihan fase diam adalah berdasarkan
kepolaran komponen-komponen yang akan dipisahkan yaitu fase normal untuk
yang polar dan fase balik untuk yang non polar. Bila komponen –komponen yang
akan dipisahkan adalah semi polar (amfifilik) seperti lipid dan minyak atau lemak
maka dapat digunakn fase normal maupun fase terbalik (Ibrahim, 2013).
Kromatografi cair yang dilakukan dalam kolom besar merupakan metode
kromatografi terbaik untuk pemisahan dalam jumlah besar (lebih dari 1 g). Pada
kromatografi kolom, campuran yang akan dipisahkan diletakkan berupa pita pada
bagian atas kolom penyerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam, dan
tabung plastik. Pelarut atau fasa gerak dibiarkan mengalir melalui kolom karena
aliran yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan. Pita
senyawa pelarut bergerak melalui kolom dengan laju yang berbeda, memisah, dan
dikumpulkan berupa fraksi ketika keluar dari kolom (Firdaus, 2011).
Berdasarkan penelitian Hamid et al. (2010), berhasil mengisolasi senyawa dengan
kerangka fenilpropanoid dengan menggunakan fasa diam poliamida pada
22
kromatografi kolom. Eluen yang digunakan adalah air:metanol (100:0) meningkat
sampai ke metanol 100%. Poliamida tersedia secara komersial untuk kromatografi
terutama dari jenis Perlon (polikaprolaktam), Nilon jenis (poli-hexamethylene
diamine adipate) atau Polyclar (polyvinylpyrrolidone, PVP). Semua memiliki
kapasitas tinggi untuk bahan fenolik dan semua membentuk ikatan hidrogen kuat
dengan gugus hidroksil fenolik melalui fungsi karbonida amida mereka (Andersen
dan Sowers, 1968). Elusi fenolik dari kolom poliamida tergantung pada
kemampuan pelarut untuk menggantikan fenol di situs ikatan hidrogen, dalam hal
pelarut hydrophilie digunakan, atau pada kemampuan pelarut untuk membentuk
ikatan yang lebih kuat dengan fenol daripada poliamida (misalnya urea). Kekuatan
keterikatan senyawa fenolik sangat bergantung pada jumlah dan jenis ikatan
hidrogen yang terbentuk (Endres, 1969), sehingga dengan menggunakan fase
diam poliamida, asam klorogenat dapat terikat dan terpisahkan dari senyawa lain.
3. Kromatografi Cair Tekanan Sedang (MPLC)
Kromatografi cair tekanan sedang (MPLC) adalah salah satu dari berbagai teknik
kromatografi kolom preparatif. Pemisahan di bawah tekanan membuat
penggunaan ukuran partikel yang lebih kecil mendukung kemungkinan dan
meningkatkan keragaman fase stasioner yang dapat digunakan. MPLC
memungkinkan pemurnian jumlah senyawa yang besar dan tidak seperti
kromatografi kolom terbuka, pemisahan yang lebih cepat dan lebih baik diperoleh.
Pengepakan material dengan ukuran partikel yang lebih rendah di bawah tekanan
meningkatkan kualitas pemisahan dan terlebih lagi fase padat dapat digunakan
kembali (Conway dan Petroski, 1995).
23
Instrumentasi terdiri dari pompa untuk pengiriman pelarut, sistem injeksi sampel,
dan kolom. Pemisahan produk dapat diikuti secara manual dengan pemantauan
dengan kromatografi lapis tipis (KLT) atau secara otomatis dengan detektor dan
perekam yang terhubung ke arah luar kolom. Senyawa yang terpisah kemudian
dikumpulkan dengan cara kolektor fraksi. Gambaran skematis dari pengaturan
MPLC sederhana ditunjukkan pada Gambar 6.
Gambar 6. Skematik dari MPLC Sederhana (Hostettmann and Terreaux, 2000)
Metode pengisian yang berbeda dijelaskan untuk mengemas kolom MPLC.
Metode ini berbeda dibandingkan dengan pengemasan fasa diam pada kolom
terbuka. Kolom yang diisi harus memiliki homogenitas optimal dan kerapatan
yang baik. Dua metode yang paling sering digunakan: pengisian kering dan
metode slurry. Pengisian kering umumnya digunakan untuk silika gel. Metode ini
biasanya memberikan kerapatan pengepakan 20% lebih baik daripada metode
slurry. Teknik dengan istilah ‘ketuk-dan penuh’ dapat digunakan dengan ukuran
partikel lebih besar dari 20, 30, 30 μm. Namun ketika menerapkan tekanan eluen
hingga 40 bar, kepadatan pengepakan pada fase diam yang diperoleh mungkin
24
tidak memadai. Pengepakan dengan metode slurry ini di bawah tekanan nitrogen
memungkinkan penggunaan gel silika ukuran partikel 15μm dan menyediakan
kerapatan tinggi (Hostettmann and Terreaux, 2000).
Pengisian dilakukan secara manual dengan menghubungkan reservoir ke bagian
atas kolom, yang kemudian diisi dengan fase diam kering sampai mengandung
kira-kira cukup fasa hingga 10% lagi dari kolom (Gambar 7). Sistem ini kemudian
dihubungkan ke tabung nitrogen dan tekanan 10 bar diterapkan (dengan
stopkontak kolom terbuka) sampai tingkat bahan kemasan tetap konstan. Katup
nitrogen dapat ditutup dan tekanan perlahan-lahan turun ke atmosfer. Vakum pada
kolom keluar digunakan sebagai alternatif untuk tekanan nitrogen. Mekanisme
otomatis telah disarankan untuk secara perlahan dan pengisian kolom yang
homogen (3-4 g/menit). Melewati fase gerak melalui kolom menginduksi
kompresi fase diam, yang dikompensasi oleh penambahan silika gel lebih lanjut.
Gambar 7. Pengisian Kering pada MPLC Kolom Kaca (Hostettmann et al., 1997)
25
Metode slurry adalah metode alternatif untuk mengemas silika gel, dengan
ketidaknyamanan dari kepadatan kemasan yang lebih rendah. Namun, pengisian
dengan slurry adalah metode yang disukai untuk pengepakan fase terikat. Slurry
dipersiapkan dengan menunda secara homogen sejumlah fase diam yang tepat
dalam eluen. Campuran tersebut kemudian dituangkan ke dalam kolom dan eluen
dilewatkan melalui kolom sampai tingkat fase stasioner konstan.
4. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)
Kromatografi cair kinerja tinggi (atau kromatografi cair tekanan tinggi, HPLC)
adalah bentuk khusus kromatografi kolom yang umumnya digunakan dalam
biokimia dan analisis untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan mengukur
senyawa aktif. HPLC terutama menggunakan kolom yang menyimpan material
pengepakan (fase diam), pompa yang menggerakkan fase gerak melalui kolom,
dan detektor yang menunjukkan waktu retensi molekul. Waktu retensi bervariasi
tergantung pada interaksi antara fase diam, molekul yang dianalisis, dan pelarut
yang digunakan (Martin dan Guiochon, 2005).
Sampel yang akan dianalisis diperkenalkan dalam volume kecil ke aliran fase
gerak dan terbelakang oleh interaksi kimia atau fisik tertentu dengan fase diam.
Jumlah keterbelakangan tergantung pada sifat analit dan komposisi fase diam dan
bergerak. Waktu ketika suatu analit elusi tertentu (keluar dari akhir kolom)
disebut waktu retensi. Pelarut umum yang digunakan termasuk kombinasi yang
dapat dicampur air atau cairan organik (yang paling umum adalah metanol dan
asetonitril) (Liu dan Lee, 2006).
26
Pemisahan telah dilakukan untuk mengubah komposisi fase gerak selama analisis;
ini dikenal sebagai elusi gradien. Gradien memisahkan campuran analit sebagai
fungsi afinitas analit untuk fase gerak saat ini. Pilihan pelarut, aditif dan gradien
tergantung pada sifat fase diam dan analit. Umumnya pengujian senyawa
dilakukan menggunakan HPLC. Parameter dari pengujian ini harus sedemikian
hingga puncak bersih dari sampel yang diketahui diamati dari kromatografi
(Abidi, 1991).
G. Analisis Kemurnian
Analisis kemurnian senyawa hasil isolasi dilakukan dengan kromatografi lapis
tipis (KLT) dan uji titik leleh. Senyawa hasil analisis dikatakan murni apabila
memberikan noda tunggal pada KLT dengan variasi eluen (Setyowati et al.,
2007). Titik leleh sangat penting dalam identifikasi dan pengukuran kemurnian
senyawa organik padat. Penggunaan titik leleh ini didasarkan pada fakta bahwa
semua senyawa murni mempunyai titik leleh yang tajam ketika berubah sempurna
dari padat ke cair pada tekanan udara 1 atm. Jika suhu dinaikkan, molekul
senyawa akan menyerap energi. Semakin tinggi suhu maka akan semakin banyak
energi yang diserap sehingga akan menaikkan gerakkan vibrasi dan rotasi molekul
(Hadiprabowo, 2009).
H. Identifikasi Senyawa Organik Secara Spektroskopi
1. Spektroskopi Ultraungu-Tampak (UV-Vis)
Serapan molekul di daerah ultraungu-tampak menggambarkan struktur elektronik
dari suatu molekul. Penyerapan sejumlah energi menghasilkan sejumlah
27
percepatan dari elektron dalam orbital tingkat dasar ke orbital yang berenergi
lebih tinggi dalam keadaan tereksitasi. Spektrofotometer ini berguna pada sistem
konjugasi (Silverstein et al.,1986).
Metode spektrofotometer UV-Vis dapat digunakan untuk menganalisis asam
klorogenat secara kuantitatif dan kualitatif. Serapan spektrum UV-Vis asam
klorogenat diukur pada panjang gelombang 200-500 nm pada suhu kamar.
Didapatkan wilayah asam klorogenat memiliki 2 titik maksimum yaitu pada
puncak pertama di panjang gelombang 217 nm dengan bahu di 240 nm dan
puncak kedua pada panjang gelombang 324 nm dengan bahu di 296 nm (Belay
dan Gholap, 2009).
2. Fourier Transform Infrared Spectroscopy (FTIR)
Pada Spektroskopi Inframerah (FTIR), senyawa organik akan menyerap berbagai
frekuensi radiasi elektromagnetik sinar inframerah. Molekul-molekul senyawa
akan menyerap sebagian atau seluruh radiasinya (Supratman, 2010). Penyerapan
ini berhubungan dengan adanya sejumlah vibrasi yang terkuantisasi dari atom-
atom yang berikatan secara kovalen pada molekul. Penyerapan ini juga
berhubungan dengan adanya perubahan momen dipol dari ikatan kovalen pada
waktu terjadinya vibrasi (Supriyanto, 1999).
Penggunaan spektrum inframerah dalam menentukan struktur senyawa organik
berada antara 650-4000 cm-1. Daerah di bawah frekuensi 650 cm-1 dinamakan
daerah inframerah jauh dan daerah di atas frekuensi 4000 cm-1 dinamakan
28
inframerah dekat (Sudjadi, 1983). Daerah antara 1400-4000 cm-1 merupakan
daerah khusus yang berguna untuk identifikasi gugus fungsional. Daerah ini 19
menunjukkan absorpsi yang disebabkan oleh vibrasi uluran. Daerah antara 1400-
700 cm-1 (daerah sidik jari) seringkali sangat rumit karena menunjukkan absorpsi
yang disebabkan oleh vibrasi uluran dan tekukan (Fessenden dan Fessenden,
1986). Karakteristik frekuensi uluran dari beberapa gugus molekul ditunjukkan
pada Tabel 5.
Tabel 5. Karakteristik Frekuensi Uluran Beberapa Gugus Fungsi (Banwell and
McCash, 1994)
Gugus Frekuensi uluran
(cm-1) Gugus
Frekuensi uluran
(cm-1)
3600 2930
3400 2860
3300 1470
3060
1200-1000
3030 1650
2870 1600
1460
1200-1000
1375
1200-1000
1750-1600
29
I. Uji Aktivitas Antioksidan
Antioksidan adalah substansi yang dalam konsentrasi rendah sudah dapat
menghambat atau menangkal proses oksidasi dan juga merupakan senyawa
pemberi elektron (donor elektron) yang dapat menghambat reaksi oksidasi dengan
mengikat radikal bebas dan molekul yang sangat reaktif. Antioksidan dibutuhkan
untuk menghambat reaksi oksidasi oleh radikal bebas yang dapat menyebabkan
kerusakan sel dan biomolekul DNA, protein, dan lipoprotein di dalam tubuh yang
akhirnya dapat memicu terjadinya penyakit-penyakit degeneratif (Sunardi, 2007).
Metode yang paling sering digunakan untuk menguji aktivitas antioksidan
tanaman obat adalah metode uji dengan menggunakan radikal bebas 2,2-difenil-1-
pikrilhidrazil (DPPH). Metode DPPH merupakan metode sederhana dan tidak
membutuhkan biaya tinggi dalam menentukan kemampuan antioksidan. Metode
DPPH dapat digunakan untuk sampel berupa padatan maupun cairan (Prakash et
al., 2001). Mekanisme reaksi penangkapan radikal dapat dilihat pada Gambar 9.
Gambar 8. Reaksi Penangkapan Radikal DPPH oleh Antioksidan (Prakash et al.,
2001)
Gugus kromofor dan auksokrom pada radikal bebas DPPH memberikan
absorbansi maksimum pada panjang gelombang 517 nm sehingga menimbulkan
30
warna ungu. Warna DPPH akan berubah dari ungu menjadi kuning seiring dengan
penambahan antioksidan yaitu saat elektron tunggal pada DPPH berpasangan
dengan hidrogen dari antioksidan. Hasil dekolorasi oleh antioksidan setara dengan
jumlah elektron yang tertangkap (Dehpour et al., 2009).
III. METODE PENELITIAN
A. Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian ini dilakukan pada bulan Januari 2019 – Juni 2019, bertempat di
Laboratorium Kimia Organik Jurusan Kimia Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam Universitas Lampung. Determinasi tumbuhan untuk
menentukan spesies dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang Botani Pusat
Penelitian Biologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong, Jawa
Barat. Preparasi sampel dilakukan di Balai Riset dan Standardisasi Industri
(Baristand) Bandar Lampung.
Analisis spektroskopi yang digunakan adalah Spektroskopi Ultraungu-Tampak
(UV-Vis) dilakukan di Balai Riset dan Standardisasi Industri (Baristand) Bandar
Lampung. Spektroskopi Fourier Trasform Infra Red (FT-IR) dilakukan di
Laboratorium Kimia Organik Bahan Alam (KOBA) Institut Teknologi Bandung.
Kromatografi Cair Tekanan Sedang (MPLC) Preparatif dan analisis Kromatografi
Cair Kinerja Tinggi (HPLC) dilakukan di Laboratorium Terpadu Sentra Inovasi
dan Teknologi Universitas Lampung. Uji aktivitas antioksidan senyawa hasil
isolasi dilakukan di Balai Riset dan Standardisasi Industri (Baristand) Bandar
Lampung.
32
B. Alat dan Bahan
1. Alat-alat yang Digunakan
Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi alat-alat gelas, pipet tetes,
neraca analitik, kertas saring, vacuum rotary evaporator, satu set alat
Kromatografi Lapis Tipis (KLT), Kromatografi Kolom (KK), Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi (HPLC) Shimadzu LC Solution, Kromatografi Cair Tekanan
Sedang (MPLC) Butchi Fraction Collector, freeze dryer, lampu UV 256 nm dan
366 nm, pipet kapiler, alat pengukur titik leleh MP-10 Stuart, Spektrofotometer
FT-IR Prestige 21 Shimadzu, dan Spektrofotometer Ultraungu-Tampak (UV-Vis)
Shimadzu. Alat yang digunakan untuk uji aktivitas antioksidan adalah tabung
reaksi, pipet tetes, dan alumunium foil.
2. Bahan-bahan yang Digunakan
Bahan yang digunakan adalah biji kopi hijau robusta (Coffea canephora Pierre ex
A. Froehner) yang diperoleh dari Kecamatan Padang Cermin, Kabupaten
Pesawaran, Provinsi Lampung, Indonesia yang telah dideterminasi sebelumnya.
Pelarut yang digunakan untuk ekstraksi dan kromatografi berkualitas teknis yang
telah didestilasi sedangkan untuk analisis spektrofotometer berkualitas pro-
analisis (p.a). Bahan kimia yang digunakan meliputi metanol (CH3OH), n-heksana
(n-C6H14), etil asetat (C4H8O2), kloroform (CHCl3), aseton (C2H6O), akuades
(H2O), serium sulfat (CeSO4) 15%, asam sulfat (H2SO4) 15%, diklorometana
(CH2Cl2), fasa diam poliamida, octadesylsilyl (ODS) C18 dan silika gel Merck 60
GF 254. Selain itu, terdapat bahan-bahan yang digunakan untuk uji aktivitas
antioksidan antara lain 2,2-difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) dan akuades steril.
33
C. Prosedur Penelitian
1. Pengumpulan dan Persiapan Sampel
Sampel berupa biji kopi hijau robusta (C. canephora Pierre ex A. Froehner) yang
telah dipisahkan dari kulit tanduknya. Buah kopi robusta dicuci terlebih dahulu
dengan air dan dipisahkan dari kulitnya, kemudian dikeringkan dengan cara di
oven dengan suhu 40oC hingga kering. Selanjutnya, biji kopi kering yang didapat
dipisahkan dari kulit arinya dan digiling hingga menjadi serbuk halus. Serbuk
halus ini yang kemudian digunakan sebagai sampel.
2. Ekstraksi
Metode ekstraksi yang dilakukan adalah metode maserasi dengan menggunakan
pelarut metanol (MeOH), yaitu serbuk halus biji kopi hijau robusta ditimbang
sebanyak 500 gram, kemudian dimaserasi dengan 2L metanol sebanyak 3 kali
pengulangan, masing-masing selama 24 jam. Ekstrak hasil maserasi kemudian
disaring dengan kertas saring. Setelah tiga kali pengulangan, filtrat hasil
perendaman diperoleh dan residu merupakan produk sisa dari proses ini. Filtrat
yang diperoleh dipekatkan dengan rotary evaporator dengan kecepatan 120–150
rpm dan suhu 35–40oC. Ekstrak pekat yang diperoleh lalu ditimbang.
3. Partisi
Ekstrak pekat yang diperoleh kemudian dilakukan ekstraksi kembali dengan
metode partisi. Partisi atau ekstraksi cair-cair dilakukan pada corong pisah
menggunakan n-heksana dan etil asetat. Maserat metanol dipartisi dengan 3x350
mL n-heksana, campuran dikocok hingga terlihat pemisahan lalu dipisahkan
34
menghasilkan fraksi n-heksana dan fraksi metanol. Setelah dipisahkan, fraksi
metanol ditambah 40% akuades dan dipartisi kembali dengan 3x350 mL etil
asetat, campuran dikocok hingga terlihat pemisahan lalu dipisahkan menghasilkan
fraksi etil asetat dan fraksi metanol-H2O. Masing-masing fraksi yang diperoleh
dipekatkan menggunakan rotary evaporator. Fraksi air dipekatkan menggunakan
freezedry
4. Kromatografi Lapis Tipis (KLT)
Uji KLT dilakukan terhadap fraksi-fraksi yang akan difraksinasi dan juga fraksi-
fraksi yang didapat setelah perlakuan fraksinasi. Uji KLT dilakukan menggunakan
sistem campuran eluen menggunakan pelarut metanol, akuades, asam asetat, n-
heksana, etil asetat, diklorometana, dan kloroform. Sampel yang akan difraksinasi
terlebih dahulu diencerkan menggunakan metanol (pelarut yang sesuai), kemudian
sampel ditotolkan menggunakan pipet kapiler ke plat C18 atau silika. Langkah
selanjutnya adalah mengelusi plat tersebut ke dalam eluen metanol/akuades atau
campuran eluen yang lainnya dan kemudian dilihat di bawah lampu UV lalu
dibandingkan dengan standar asam klorogenat. Hasil kromatogram selanjutnya
disemprot dengan larutan serium sulfat (CeSO4) untuk menampakkan bercak/noda
dari komponen senyawa tersebut. Larutan serium sulfat merupakan larutan
penampak noda yang spesifik terhadap bahan-bahan alam. Fraksi yang
menghasilkan pola pemisahan dengan Rf (Retention factor) yang sama pada
kromatogram, digabung, dan dipekatkan sehingga diperoleh beberapa fraksi
gabungan. Campuran eluen yang menunjukkan pola pemisahan yang baik akan
digunakan pada fraksinasi lebih lanjut.
35
5. Kromatografi Kolom (KK)
Hasil dari fraksi-fraksi gabungan tersebut selanjutnya dilakukan fraksinasi
menggunakan teknik kromatografi kolom. Teknik ini menggunakan fase diam
berupa adsorben poliamida yang dilarutkan dalam pelarut yang akan digunakan
dalam proses pengelusian. Slurry dari poliamida dimasukkan terlebih dahulu ke
dalam kolom, atur fasa diam hingga rapat (tidak berongga) dan rata. Kemudian
sampel yang sudah dilarutkan dengan sedikit akuades dimasukkan ke dalam
kolom yang telah berisi poliamida. Pada saat sampel dimasukkan, usahakan
kolom tidak kering atau kehabisan eluen karena akan mengganggu kerapatan fasa
diam (Gritter et al., 1992). Selanjutnya kolom dielusi dengan campuran eluen
H2O:metanol (100:0) dilanjutkan sampai persentase metanol 100%.
6. Analisis Kemurnian
Uji kemurnian dilakukan dengan metode KLT dan uji titik leleh. Uji kemurnian
secara KLT menggunakan beberapa campuran eluen. Kemurnian suatu senyawa
ditunjukkan dengan timbulnya satu noda yang sama dibandingkan dengan standar
senyawa menggunakan berbagai campuran eluen yang digunakan, kemudian
disemprot menggunakan larutan serium sulfat untuk menampakkan bercak/noda
dari komponen senyawa tersebut.
Uji titik leleh, sebelum dilakukan pengukuran, pipet kapiler dan alat pengukur
titik leleh tersebut dibersihkan terlebih dahulu karena pengotor akan
mempengaruhi temperature titik leleh kristal yang diperoleh. Kristal yang
berukuran besar, kristal terlebih dahulu digerus hingga berbentuk serbuk.
36
Kemudian kristal yang akan ditentukan titik lelehnya diletakkan pada lempeng
kaca, diambil sedikit dengan menggunakan pipet kapiler. Alat dihidupkan dan
titik leleh diamati dengan bantuan kaca pembesar. Titik leleh senyawa ditentukan
pada suhu saat kristal pertama kali meleleh.
7. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)
Fraksi-fraksi hasil fraksinasi juga dianalisis kemurnian dan kadar asam klorogenat
dengan HPLC. Sampel diinjeksikan pada HPLC yang sebelumnya sudah
disiapkan dengan kolom ODS C18, fasa gerak akuades:asetonitril (4:1), dan
detector photo diode array (PDA). Puncak serapan sampel yang dihasilkan
kemudian dibandingkan dengan puncak serapan standar asam klorogenat pada
waktu retensi yang sama. Konsentrasi asam klorogenat pada sampel ditentukan
melalui perhitungan kurva regresi linier dari standar asam klorogenat. Adanya
puncak serapan lain menunjukkan adanya senyawa metabolit sekunder lain yang
memiliki kemiripan sifat dengan asam klorogenat sehingga perlu dilakukan
pemurnian lebih lanjut. Kemurnian senyawa pada HPLC ditentukan dengan
adanya puncak serapan tunggal pada waktu retensi yang sama dengan standar
asam klorogenat.
8. Kromatografi Cair Tekanan Sedang (MPLC)
Proses pemurnian senyawa asam klorogenat juga dilakukan dengan MPLC. Fraksi
hasil fraksinasi diinjeksikan pada MPLC preparatif yang sebelumnya sudah
disiapkan dengan kolom ODS C18 dan fasa gerak metanol:air (3:7). Asam
klorogenat murni diperoleh dan ditampung pada waktu retensi tertentu sesuai
37
dengan standar asam klorogenat. Hasil fraksi setelah MPLC kemudian dianalisis
kemurnian, penentuan konsentrasi, dan dikarakterisasi lebih lanjut.
9. Spektrofotometri Ultraungu-Tampak (UV-Vis)
Sampel sebanyak 0,0001 g berupa kristal murni dilarutkan dalam 10 mL metanol,
lalu diencerkan sampai diperoleh tingkat serapan puncak utama di sekitar 0,6.
Larutan ini digunakan sebagai persediaan selama pengukuran. Pertama, sampel
diukur serapan maksimumnya dalam metanol. Selanjutnya larutan persediaan
dibagi menjadi beberapa bagian (Markham, 1988).
10. Spektrofotometri Fourier Transform Infrared (FT-IR)
Sampel kristal hasil isolasi yang telah murni dianalisis menggunakan
Spektrofotometer Inframerah. Kristal yang telah murni dibebaskan dari air
kemudian digerus bersama-sama dengan halida anorganik, KBr. Gerusan kristal
murni dengan KBr dibentuk menjadi lempeng tipis atau pelet dengan bantuan alat
penekan berkekuatan 8-10 ton cm2. Kemudian pelet tersebut diukur puncak
serapannya (Sudjadi, 1983). Informasi Spektroskopi Inframerah menunjukkan
tipe-tipe dari adanya gugus fungsi dalam suatu molekul (Pavia, 1970).
11. Uji Aktivitas Antioksidan dengan metode DPPH
a. Metode Kualitatif
Ekstrak yang mengandung senyawa asam klorogenat ditotolkan pada
lempeng silika gel GF254 lalu dielusi dengan perbandingan fase gerak
butanol:asam asetat:air (4:1:5). Setelah proses elusi selesai, lempeng
38
dikeringkan dan disemprot dengan larutan DPPH 0,1mM dalam metanol.
Komponen ekstrak yang bersifat antioksidan menghasilkan bercak kuning
pucat dengan latar belakang ungu dalam waktu 30 menit (Supiyanti dkk.,
2010).
b. Metode Kuantitatif
Penentuan aktivitas antioksidan dilakukan dengan cara sebanyak 2,0 mL
DPPH 0,1 mM dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan 2,0 mL
asam askorbat dengan konsentrasi tertentu (1, 2, 4, 6, 8, 10 ppm) kemudian
divortex 1 menit sampai homogen lalu didiamkan 30 menit dalam tabung
gelap. Fraksi hasil isolasi diperlakukan sama dengan ekstrak. Serapan diukur
secara spektrofotometri UV-Vis pada panjang gelombang 515,4 nm. Blanko
yang digunakan adalah metanol (Supiyanti dkk., 2010).
Aktivitas antioksidan dihitung sebagai persentase inhibisi terhadap DPPH.
Kemudian dihitung % inhibisi antara sampel dan asam askorbat dengan
rumus:
% Inhibisi =𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 − 𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑠𝑎𝑚𝑝𝑒𝑙
𝐴𝑏𝑠𝑜𝑟𝑏𝑎𝑛𝑠𝑖 𝑘𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙𝑥 100%
Keterangan:
Serapan kontrol : Serapan DPPH dengan konsentrasi 0,1 mM
Serapan sampel : Serapan hasil reaksi antara 2,0 mL DPPH konsentrasi 0,1
mM dengan 2,0 mL fraksi hasil isolasi
39
Setelah diperoleh % inhibisi dari masing-masing konsentrasi kemudian
dihitung nilai IC50. Nilai % inhibisi dimasukkan dalam kurva persamaan
regresi linier dan diperoleh persamaan garis y = a + bx. Nilai IC50 adalah
konsentrasi sampel yang diperlukan untuk memberikan % inhibisi sebesar
50%.
12. Uji Bioaktivitas Antibakteri
Pada penelitian ini, pengujian bioaktivitas antibakteri terhadap senyawa hasil
isolasi menggunakan metode Difusi Agar Kirby and Bauer. Sebanyak 4,2 gram
Nutrient Agar (NA) ditambahkan 150 mL aquades kemudian dimasukkan dalam
erlenmeyer dan dipanaskan hingga NA larut. Media agar yang sudah larut
kemudian disterilkan menggunakan autoclave selama 15 menit. Media yang
disterilkan dimasukkan ke dalam laminar air flow selama 15 menit. Setelah itu,
media dituangkan ke dalam cawan petri yang sudah disterilkan.
Bakteri sebanyak 1 ose yang dimasukkan ke dalam akuades steril dan
dihomogenkan ke dalam media agar setelah media di dalam cawan petri memadat,
dituangkan suspensi bakteri Bacillus subtilis/E. coli. Pada penelitian ini, kontrol
positif yang digunakan berupa amoxycilin untuk bakteri Bacillus subtilis dan
kontrol positif kloramfenikol untuk bakteri E. coli. Sementara kontrol negatif yang
digunakan berupa pelarut sampel, yaitu metanol. Kemudian cawan petri ditutup
dan dibungkus kembali dengan kertas dan disimpan dalam inkubator selama 24
jam (Jawetz and Adelbergs, 2005). Kemudian zona bening diukur diameternya
menggunakan jangka sorong dan dilakukan analisis lebih lanjut.
V. SIMPULAN DAN SARAN
A. Simpulan
Berdasarkan pembahasan hasil penelitian yang telah dilakukan, maka diperoleh
simpulan sebagai berikut :
1. Pada penelitian ini telah diisolasi dan diidentifikasi dua senyawa berupa
fraksi dengan konsentrasi asam klorogenat sebesar 210,36 ppm dan serbuk
putih hidrat sebanyak 125 mg yang karakterisasinya masing-masing mirip
dengan senyawa asam klorogenat dan kafein hidrat dengan titik leleh sebesar
222-224oC dari fraksi polar biji kopi hijau robusta (Coffea canephora Pierre
ex A. Froehner).
2. Berdasarkan uji aktivitas antioksidan, fraksi asam klorogenat dinyatakan aktif
sebagai antioksidan dengan nilai IC50 sebesar 6,6601 ppm sedangkan serbuk
putih kafein hidrat dinyatakan kurang aktif sebagai antioksidan dengan nilai
IC50 sebesar 667,8132 ppm.
72
B. Saran
Berdasarkan penelitian yang telah dilakukan, terdapat saran untuk penelitian
selanjutnya yaitu :
1. Penelitian lebih lanjut terhadap fraksi lain sampel biji kopi hijau robusta
(Coffea canephora Pierre ex A. Froehner) sehingga dapat diperoleh senyawa
asam klorogenat yang lebih banyak dari sebelumnya.
2. Melakukan pemurnian lebih lanjut terhadap fraksi asam klorogenat dengan
instrument yang lebih mudah menghilangkan pengotor, misalnya HPLC
preparatif.
3. Melakukan analisis struktur lebih lanjut menggunakan spektrofotometri
massa dan NMR.
4. Melakukan uji aktivitas biologis lain seperti uji antijamur, antikanker,
maupun antimalaria untuk senyawa hasil isolasi yang telah murni.
DAFTAR PUSTAKA
Abidi, S. L. 1991. High-performance liquid chromatography of phosphatidic acids
and related polar lipids. Journal of Chromatography. 587. Hlm. 193-203.
Aidilla, M., Jonathan M. H., Michael J. C., Kevin D. C., Vance B.M. 2013.
Suplementation of a High-Fat Diet with Chlorogenic Acid Is Associated
with Insulin Resistance and Hepatic Lipid Accumulation in Mice. Journal
of Agricultural Food Chemistry. 61. Hlm. 4371-4378.
Andersen, R. A. and Sowers, J. A. 1968. Isolation Techniques for Flavonoids.
Phytochemistry. 7. Hlm. 293.
Aziz, T., Ratih C., Asima F. 2009. Pengaruh Pelarut Heksana dan Etanol, Volume
Pelarut dan Waktu Ekstraksi Terhadap Hasil Ekstraksi Minyak Kopi.
Jurnal Teknik Kimia. 1(16). Hlm. 1-4.
Banwell, C.N. and E.M. Mc Cash. 1994. Fundamental of Molecular
Spectroscopy. Mc Graw-Hill Book Company. London. Hlm 1204-1206.
Belay, A. and Gholap, A.V. 2009. Characterization and Determination of
Chlorogenic Acids (CGA) in Coffee Beans by UV-Vis Spectroscopy.
African Journal of Pure and Applied Chemistry. 3(11). Hlm. 234-240.
Brain, M., Bryant, C.W., Cunningham, M. 2000. How Caffeine Works.
http://science.howstuffworks.com/caffeine.html. Diakses pada 27 Mei
2019.
Bremer, B. 2009. A review of molecular phylogenetic studies of rubiaceae 1.
Annals of Missouri Botanical Garden. 96. Hlm. 4–26.
Conway, W.D. and Petroski, R.J. 1995. Modern Countercurrent Chromatography.
American Chemical Society Symposium Series 593. Washington DC.
Cornard, J.P., Lapouge, C., Dangleterre, L., Allet, B. 2008. Complex of Lead (II)
by Chlorogenic Acid: Experimental dan Theoritical Study. Journal of
Physical Chemistry. 128. Hlm. 12475-12484.
74
Cronquist, A., 1981, An Integrated System of Classification of Flowering Plants.
Columbia University Press. New York. Hlm. 477.
Day, R. A. and Underwood, A. L. 1981. Analisis Kimia Kuantitatif. Erlangga.
Jakarta. Hlm. 486-487.
Dehpour, A. A., Ebrahimzadeh, M. A., Fazel, N. S., and Mohammad, N. S. 2009.
Antioxidant Activity of Methanol Extract of Ferula Assafoetida and Its
Essential Oil Composition. Grasas Aceites. 60(4). Hlm. 405-412.
Direktorat Jenderal Perkebunan. 2014. Statistik Perkebunan Indonesia Komoditas
Kopi. Direktorat Jenderal Perkebunan. Jakarta. Hlm. 15.
Endres, H. 1969. In Thin-Layer Chrornatography (ed. E. Stahl). George Allen and
Unwin Ud, London. Springer-Verlag, Berlin. Hlm. 41.
Farah, A. 2012. Coffee: Emerging Health Effects and Disease Prevention,
First Edition. John Willey & Sons, Inc and Institute of Food
Technologists: Wiley-Blackwell Publising Ltd. USA.
Farah, A. and Carmen, M. D. 2006. Phenolic Compounds in Coffee. Brazilian
Journal of Plant Physiology. 18(1). Hlm. 23-36.
Farah, A., Tomas D. P., Daniel P. M., Luiz C. T., and Peter R.M. 2006.
Chlorogenic Acids and Lactones in Regular and Water-Decaffeinated
Arabica Coffees. Journal of Agricultural Food Chemistry. 54(2). Hlm.
374-381.
Farias, F.M. 2006. Psychotria myriantha müll arg. (rubiaceae): Caracterização
dos alcalóides e avaliação das atividades antiquimiotáxica e sobre o
sistema nervoso central. Ph.D. Thesis. Universidade Federal do Rio
Grande do Sul, Porto Alegre. Brazil.
Fessenden, R. J. and Fessenden, J. S. 1986. Kimia Organik Jilid I. Alih Bahasa
Hadyana Pujaatmaka. Erlangga. Jakarta. Hlm. 525.
Firdaus. 2011. Teknik dalam Laboratorium Kimia Organik. Laporan Hibah
Penulisan Buku Ajar, Jurusan Kimia, FMIPA. Universitas Hasanudin.
Makassar.
Fujioka, K. and Shibamoto, T. 2008. Cholorogenic Acid and Caffeine Contents in
Various Commercial Brewed Coffes. Food Chemistry. 106. Hlm. 217-221.
Gritter, R.J., J.M. Bobbitt, dan A.E. Schwarting. 1992. Pengantar Kromatografi.
Alih Bahasa Kosasih Padmawinata. Institut Teknologi Bandung. Bandung.
Hlm. 266.
75
Hadiprabowo, T. 2009. Optimasi Sintesis Analog Kurkumarin 1,3-Bis-(4-
Hidroksi-3-Metoksi Benzilidin) Urea pada Rentang pH 3-4. (Skripsi).
Universitas Muhammadiyah Surakarta. Surakarta. Hlm 10-11.
Hamid, R., Monsef, E., Reza H., Ahmad R., Shahverdi, M. R., Khorramizadeh.
Mohsen, A. 2010. Flavonoids, cinnamic acid and phenyl propanoid from
aerial parts of Scrophularia striata, Pharmaceutical Biology. 48(3). Hlm.
333-336.
Harborne, J. B. 1987. Metode Fitokimia: Penuntun Cara Modern Menganalisis
Tumbuhan. Terjemahan Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro.
Penerbit Institut Teknologi Bandung. Bandung.
Hart, H., Craine L.E., dan D.J. Hart. 2003. Kimia Organik Edisi Kesebelas.
Erlangga. Jakarta.
Heinrich, M., Barnes, J., Gibbons, S., Williamso, E. M. 2004. Fundamental of
Pharmacognosy and Phytotheraphy. Elsevier. Hungary.
Heitzman, M.E., Neto, C.C., Winiarz, E., Vaisberg, A.J., Hammond, G.B. 2005.
Ethnobotany, phytochemistry and pharmacology of Uncaria (Rubiaceae).
Phytochemistry. 66. Hlm. 5–29.
Hidgon, J.V., Frei B. 2006. Coffee and Health: a Review of Recent Human
Research. Critical Reviews in Food Science and Nutrition. 46. Hlm. 101-
123.
Hostettmann, K., and Terreaux, C. 2000. Medium-Pressure Liquid
Chromatography. Academic Press. University of Lausanne. Switzerland.
Hlm. 3296-3299.
Hostettmann, K., Terreaux, C., Marston, A. and Potterat, O. 1997. The Role of
Planar Chromatography in the Rapid Screening and Isolation of Bioactive
Compounds from Medicinal Plants. Journal of Planar Chromatography.
10. Hlm. 251-257.
Ibrahim, S. 2013. Teknik Laboratorium Kimia Organik. Graha Ilmu. Yogyakarta.
Jaiswal, R., Maria, A. P., Pinkie, J. E., Nikolai, K. 2010. Profile and
Characterization of the Chlorogenic Acid in Green Robusta Coffee Beans
by LC-MS: Identification Seven New Classes of Compounds. Journal of
Agricultural Food Chemistry. 58(15). Hlm. 8722-8737.
Jawetz, M. dan Adelbergs. 2005. Mikrobiologi Kedokteran Edisi 1. Salemba
Medika. Jakarta. Hlm 196-198.
76
Ji, Lili., Ping J., Bin L., Yuchen S., Xin W., Zhengtao W. 2013. Chlorogenic
acid, a dietary polyphenol, protects acetaminophen-inducted liver injury
and its mechanism. Journal of Nutritional Biochemistry. 24. Hlm. 1911-
1919.
Johnson, L.E. dan Stevenson, R. 1991. Dasar Kromatografi Cair. Alih bahasa
Kosasih Padmawinata. Institut Teknologi Bandung. Bandung. Hlm 365.
Keenan, C. W., Kleinfelter D. C., dan Wood, J. H. 1990. Ilmu Kimia untuk
Universitas. Erlangga. Jakarta.
Khopkar, S. M. 2003. Konsep Dasar Kimia Analitik. Diterjemahkan oleh A.
Saptorahardjo. Penerbit Universitas Indonesia. Jakarta. Hlm 84-311.
Lenny, S. 2006. Senyawa Flavonoida, Fenilpropanoida, dan Alkaloida. Karya
Ilmiah. Departemen Kimia Fakultas MIPA Universitas Sumatera Utara.
Medan. Hlm. 6-7.
Liu, Y. and Lee M. L. 2006. Ultrahigh pressure liquid chromatography using
elevated temperature. Journal of Chromatography. 1104(1-2). Hlm. 198–
202.
Mabberley, D. J. 1997. The Plant-book: A Portable Dictionary of the Vascular
Plants Utilizing Kubitzki's the Families and Genera of Vascular Plants.
2nd ed. Cambridge University Press. Cambridge.
Markham, K.R. 1988. Cara Mengidentifikasi Flavonoid. Penerbit ITB. Bandung.
Hlm. 1-113.
Martin M., Guiochon, G. 2005. Effects of high pressures liquid chromatography.
Journal of Chromatography. A. 7(1-2). Hlm. 16-38.
Mongrand, S., Badoc, A., Patouille, B., Lacomblez, C., Chavent, M., Bessoule,
J.J. 2005. Chemotaxonomy of the Rubiaceae family based on leaf fatty
acid composition. Phytochemistry. 66. Hlm. 549–559.
Moon, Joon-Kwan., Hyui Sun Y., Takayuki S. 2009. Role of Roasting Condition
in the Level of Chlorogenic Acid Content in Coffee Beans: Correlation
with Coffee Acidity. Journal of Agricultural Food Chemistry. 57(12).
Hlm. 5365-5369.
Mukhriani. 2014. Ekstraksi, Pemisahan Senyawa, dan Identifikasi Senyawa Aktif.
Jurnal Kesehatan. 7(2). Hlm. 361-362.
Mulato, S., Widyotomo S., dan Lestari, H. 2001. Pelarutan Kafein Biji Kopi
Robusta dengan Kolom Tetap Menggunakan Pelarut Air. Pelita
Perkebunan. 17(2). Hlm. 97-109.
77
Mumin, A., Kazi, F.A., Zainal, A., Zakir, H. 2006. Determination and
Characterization of Caffeine in Tea, Coffew, and Soft Drink by Solid
Phase Extraction and High Performance Liquid Chromatography (SPE-
HPLC). Malaysian Journal of Chemistry. 8. Hlm. 45-51.
Murniasih, T. 2003. Metabolit Sekunder dari Spons Sebagai Bahan Obat-obatan.
Oseana. 28(3). Hlm. 27-33.
Murray., R. D., H. J. Mendes., S. A Brow. 1982. The Natural Coumarin. Jhon.
Willey and Son Ltd. New York.
Mursu, J., S. Vautilanen., T. Nurmi., G. Alfthan., J.K. Firtanen., T.H. Rissanen.,
P. Happonen., K. Nyyssonen., J. Kaikkonen., R. Salonen and J.K. Salonen.
2005. The Effects of Coffee Consumption on Lipid Peroxidation and
Plasma Total Homocysteine Concentrations a Clinical Trial Free Radical
Biology and Medicine. Hlm. 15-17.
Najiyati, S dan Danarti. 2012. Kopi, Budidaya dan Penanganan Lepas Panen. PT.
Penebar Swadaya. Jakarta.
Nolasco, M.M., Amado, A.M., Ribeiro-Claro, P.J.A. 2006. Computational-
Assisted Approach to the Vibrational Spectra of Molecular Crystals: Study
of Hydrogen-Bonding and Pseudo-Polymorphism. Journal of Physical
Chemistry. 7. Hlm. 2150-1261.
Ong, Khang Wei., Annie H., Kwong H.T. 2013. Anti-diabetic and Anti-Lipidemic
Effects of Chlorogenic Acid are Mediated by AMPK Activation.
Biochemical Pharmacology. 85. Hlm. 1341-1351.
Palled, P.J., Dushyanth, R.V., Mannor, V.S., Bharat, C. 2017. Validated
Isocratic/Gradient RP-HPLC for Simultaneous Estimation of Paracetamol
Ibuprofen and Caffeine in Marketed Formulations Using Diclofenac as
Internal Standard. Analytical Chemistry: An Indian Journal. 17. Hlm. 3-4.
Pavia, D.L., G.M. Lampman, and G.S. Knitz. 1990. Introduction to Organic
Laboratory Techniques a Conteporery Approach, Second edition. Sainders
College Publishing. New York.
Pereira, C.G., Meireles, M.A.A. 2010. Supercritical fluid extraction of bioactive
compounds: Fundamentals, applications and economic perspectives. Food
Bioprocess Tech. 3. Hlm. 340–372.
Pohlan, H.A.J., dan Janssens, M.J.J. 2010. Growth and Production of Coffee.
Dalam Verheye, W.H (ed). Soils, Plant Growth, and Crop Production –
Volume III. EOLSS Publishers. Nottingham.
Prakash, A., Rigelhof, F., and Miller, E. 2001. Antioxidant Activity: Medallion
Laboratories. Analytical Progress. 19(2). Hlm. 1-4.
78
Prastowo, B., Karmawati, E., Rubijo., Siswanto., Indrawanto, C., Munarso, S.J.
2010, Budidaya dan Pasca Panen Kopi. Pusat Penelitian dan
Pengembangan Perkebunan. Bogor. Hlm. 15.
Robbrecht, E. 1988. Tropical woody Rubiaceae. Opera Botanica Belgica. Belgia.
1. Hlm. 599–602.
Sato, Yuki., Shirou I., Toshimitsu K., Jiro O., Masaki K., Takeshi H. 2011. In
vitro and In Vivo Antioxidant properties of Chlorogenic acid and caffeic
acid. International Journal of Pharmaceutics. 403. Hlm. 136-138.
Setyowati, E.P., U.A. Jenie, Sudarsono, B. Kardono, R. Rahmat, dan E. Meiyanto.
2007. Isolasi Senyawa Sitotoksik Spons Kaliapsis. Majalah Farmasi
Indonesia. 18(4): 183–189.
Sienko, Plane, and Marcus. 1984. Experimental Chemistry, 6th Edition. Mc Graw
Hill Book Co. Singapore.
Silverstein, R.M., G.B. Bassler, dan T.C.D. Morcill. 1986. Penyelidikan
Spektrometrik Senyawa Organik. Alih Bahasa: A.J. Hartomo dan Anny
Victor Purba. Erlangga. Jakarta. Hlm 191–195.
Simoes, C.M.O., Schenkel, E.P., Gosmann, G., Mello, J.C.P., Mentz, L.A.,
Petrovick, P.R. 2004. Farmacognosia: Da planta ao medicamento, 6th ed.
UFSC University Press. Florianópolis, Brazil. Hlm. 1104.
Stahl, E. 1985. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi.
Diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata dan Iwang Soediro. Institut
Teknologi Bandung. Bandung. Hlm 3–17.
Sudjadi. 1983. Penentuan Struktur Senyawa Organik. Ghalia Indonesia. Jakarta.
Hlm. 283.
Sukohar, Asep., Setiawan., Firman F.W., Herry S.S. 2011. Isolasi dan
Karakterisasi Senyawa Sitotoksik Kafein dan Asam Klorogenat dari Biji
Kopi Robusta Lampung. Jurnal Medika Planta. 1(4).
Sunardi, K. I. 2007. Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Belimbing Wuluh
(Averrhoa blimbi L) terhadap 1,1-diphenyl-2-pikrilhidrazyl (DPPH).
Seminar Nasional Teknologi. Hlm. 1-9.
Supiyanti, W., Wulansari E.D., Kusmita, L. 2010. Uji Aktivitas Antioksidan dan
Penentuan Kandungan Antosianin Total Kulit Buah Manggis (Garcinia
mangostana L.). Sekolah Tinggi Ilmu Farmasi Yayasan Pharmasi
Semarang. Semarang. 15(2). Hlm. 64-70.
Supratman, U. 2010. Elusidasi Struktur Senyawa Organik. Widya Padjadjaran.
Bandung. Hlm. 94-102.
79
Supriyanto, R. 1999. Buku Ajar Kimia Analitik III. FMIPA Universitas Lampung.
Bandar Lampung. Hlm 2–3.
Susan, Hall., Ben D., Shailendra A., Andrew K., Devinder A., Catherine M. 2015.
A Review of the Bioactivity of Coffee, Caffeine and Key Coffee
Constituens on Inflammatory Responses Linked to Depression. Food
Research International. 76. Hlm. 626-636.
Tasmin, N., Erwin., Kusuma, I. 2014. Isolasi, Identifikasi dan Uji Toksisitas
Senyawa Flavonoid Fraksi Kloroform dari Daun Terap (Artocarpus
Odoratissimus Blanco). Jurnal Kimia Mulawarman. 12(1).
Wang, Gui-Feng., Li-Ping S., Yu-Dan R., Qun-Fang L., Hou-Fu L et all. 2009.
Antihepatitis B Virus Activity of Chlorogenic Acid, Kuinat Acid and
Caffeic Acid In Vivo and In Vitro. Antiviral Research. 83. Hlm. 186-190.
Watanabe, Takuya., Yoichi A., Yuki M., Tatsuya K., Wataru O., Yasushi K.
2006. The Blood Pressure-Lowering Effect and Safety of Chlorogenic
Acid from Green Coffee Bean Extract in Essential Hypertension. Clinical
and Experimental Hypertension. 28. Hlm. 439-449.
Wen-Yuan Lin., F. Xaiver P.S., Ching-Chu C., Lance E.D., Chiu-Shong L., Tsai-
Chung L. 2011. Coffee Consumption Inversely Associated with Type 2
Diabetes in Chinese. European Journal of Clinical Investigation. 41(6).
Hlm. 659-666.
Yusianto., Dwi N. 2014. Mutu Fisik dan Citarasa Kopi Arabika yang Disimpan
Buahnya Sebelum di-Pulping. Pelita Perkebunan. 30(2). Hlm. 137-158.
Zhou, D.N., Ruan, J.L., Xiong, Z.M., Fu, W., Wei, A.H. 2010. Antioxidant and
hepatoprotective activity of ethanol extract of Arachinodes exilis (Hance)
Ching. Journal of Ethanopharmacol. 129(2). Hlm. 232-237.
Zong,-Xi Sun., Song L., Zhi-quan Z., Rui-qiang S. 2014. Protective Effect of
Chlorogenic Acid Against Carbon Tetrachlorida-Induced Acute Liver
damage in Rats. Chinese Herbal Medicine. 6(1). Hlm. 36-41.