isolatie en karakterisering van kameel antilichaam fragmenten...
TRANSCRIPT
VRIJE UNIVERSITEIT BRUSSEL
Faculteit WetenschappenVakgroep Toegepaste Biologische Wetenschappen
Onderzoeksgroep UltrastructuurAcademiejaar 2000 – 2001
Isolatie en karakterisering van kameelantilichaam fragmenten tegen het prostaat-
specifiek antigen
Promotor: Scriptie voorgedragen tot het behalen van de graad vanBio-ingenieur in de Cel- en Genbiotechnologie
Prof. Dr. S. Muyldermans Saerens Dirk
2
De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen
en delen er van de kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de
beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting
uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.
Auteur Promotor
Dirk Saerens Serge Muyldermans
Professor Doctor
3
Woord vooraf
Vooreerst wil ik Prof. Dr. Serge Muyldermans danken voor de zeer interessante scriptie. Ook zijn
opvolgen van resultaten en bijstaan met raad stelde ik erg op prijs.
Daarnaast mag ik zeker niet vergeten iedereen van de onderzoeksgroep ULTR te bedanken voor
hun bereidwilligheid om me met raad en daad bij te staan bij het oplossen van de
wetenschappelijke en soms minder wetenschappelijke problemen.
Vooral het Camel deel van de ULTR onderzoeksgroep wil ik ten zeerste bedanken voor de steun
en de bemoedigende sfeer in het labo tijdens het werken aan de thesis.
Tenslotte staken mijn ouders en familie me steeds een hart onder de riem, wanneer het werk
minder vorderde, en zonder Katja zou het resultaat van de thesis zeker niet zo mooi geweest zijn.
4
Inhoudsopgave
1 Inleiding ................................................................................................................................................ 6
2 Literatuurstudie – Overzicht van de bestaande literatuur ................................................................... 10
2.1 Kameel antilichamen.................................................................................................................. 10
2.1.1 Algemeenheden over immuniteit....................................................................................... 10
2.1.2 Humoraal antwoord ........................................................................................................... 11
2.1.3 Isotypen in humorale antwoord ......................................................................................... 11
2.1.4 Antigen bindende site ........................................................................................................ 12
2.1.5 Generatie van diversiteit voor antigen herkenning............................................................ 12
2.1.6 Humoraal antwoord in Camelidae..................................................................................... 13
2.1.7 Verschillen tussen conventionele en zware keten antilichamen........................................ 14
2.1.8 Ontogenie van de zware keten antilichamen ..................................................................... 16
2.1.9 Antigenisch repertorium.................................................................................................... 16
2.1.10 Structuren van VHH’s ....................................................................................................... 17
2.1.11 VHH-antigen binding ........................................................................................................ 18
2.1.12 Biotechnologische Applicatie............................................................................................ 20
2.1.13 Filamenteuze bacteriofaag display van antilichamen ........................................................ 22
2.2 Prostaat-specifiek antigen .......................................................................................................... 24
2.2.1 Prostaatkanker ................................................................................................................... 24
2.2.2 Kallikrein serine protease familie...................................................................................... 25
2.2.3 Prostaat-specifiek antigen.................................................................................................. 26
2.2.4 Enzymatische reacties van PSA ........................................................................................ 28
2.2.5 Interactie van PSA met protease inhibitoren ..................................................................... 29
2.2.6 Epitoop mapping van PSA ................................................................................................ 31
2.2.7 Mogelijke diagnostische testen.......................................................................................... 32
2.2.8 Verbeterde diagnostische testen ........................................................................................ 33
2.2.9 Laatste ontwikkelingen...................................................................................................... 36
2.3 Doelstelling ................................................................................................................................ 36
3 Materiaal en methoden........................................................................................................................ 38
3.1 Micro-organismen (Escherichia coli) ......................................................................................... 38
3.2 Media en Buffers........................................................................................................................ 38
3.3 Plasmiden en vectoren................................................................................................................ 41
3.3.1 pHEN4............................................................................................................................... 41
3.3.2 pHEN6............................................................................................................................... 42
3.3.3 pHEN7............................................................................................................................... 43
3.4 Primers ....................................................................................................................................... 44
5
3.5 PCR reactie................................................................................................................................. 44
3.6 Kolonie PCR en fingerprinting................................................................................................... 45
3.7 DNA agarose gels....................................................................................................................... 45
3.8 DNA digestie.............................................................................................................................. 46
3.9 Zuivering van DNA fragment uit agarose gel ............................................................................ 47
3.10 Ligatie van DNA fragment met vector of plasmide en zuivering/ontzouting ............................ 47
3.11 Plasmide transformatie in E.coli cellen...................................................................................... 48
3.12 Expressie test, maken van periplasmatisch extract .................................................................... 48
3.13 DNA Miniprep protocol ............................................................................................................. 49
3.14 SDS-PAGE................................................................................................................................. 50
3.15 Western Blot............................................................................................................................... 51
3.16 Immunisering van kameel .......................................................................................................... 52
3.17 Fractionatie van IgG subklassen ................................................................................................ 52
3.18 VHH bibliotheek constructie...................................................................................................... 53
3.19 Panning en selectie van antigen bindende kameel antilichaam fragmenten............................... 53
3.20 Expressie en zuivering van VHH fragmenten............................................................................ 54
3.21 ELISA......................................................................................................................................... 55
3.21.1 Faag ELISA ....................................................................................................................... 55
3.21.2 Solid fase ELISA ............................................................................................................... 56
3.21.3 Dose-respons ELISA......................................................................................................... 56
3.21.4 Competitieve ELISA ......................................................................................................... 56
3.21.5 Spiking ELISA................................................................................................................... 57
4 Resultaten en bespreking .................................................................................................................... 58
4.1 Aangewende proteïne hulpmiddelen .......................................................................................... 58
4.2 Immuunantwoord ....................................................................................................................... 59
4.3 Aanmaken van een VHH bibliotheek......................................................................................... 62
4.4 In vitro selectie of panning......................................................................................................... 64
4.5 Antigen bindende kameel antilichaam fragmenten afzonderen ................................................. 67
4.6 Productie van cAbPSA3, 11, 15 en 20 ....................................................................................... 69
4.7 Karakterisering van cAbPSA3, 11, 15 en 20.............................................................................. 70
5 Besluit ................................................................................................................................................. 77
6 Samenvatting....................................................................................................................................... 79
7 Literatuurlijst....................................................................................................................................... 81
6
1 Inleiding
Na longkanker is prostaatkanker de meest voorkomende doodsoorzaak bij mannen, in de wereld.
De beste manier om prostaatkanker aan te pakken is het vroege opsporen via diagnostische testen.
Het prostaat-specifiek antigen (PSA) wordt algemeen aanvaard als een prostaat tumormerker. Via
deze tumormerker kan men metingen uitvoeren die een snelle diagnose van prostaat kanker
mogelijk maken. Door PSA kan een vroege opsporing van prostaatkanker gedaan worden, als het
nog in een geneesbaar stadium zit. Het PSA is lid van de kallikrein gen familie, die codeert voor
serine proteasen. De fysiologische hoofdfunctie van PSA is het vervloeien van semen coagulum.
Onder invloed van PSA vindt de digestie van semenogelines en fibronectines plaats. Normaal
wordt al het geproduceerde PSA getransporteerd naar het semen plasma, maar een kleine fractie
kan geabsorbeerd worden in de bloedstroom. Een belangrijke proportie van het PSA in semen
plasma en bloed serum is intern geknipt en als dus danig biologisch inactief. In de bloedstroom
wordt de enzymatische activiteit van PSA gereguleerd door verschillende serum protease
inhibitoren zoals alpha-1-antichymotrypsine, alpha-2-macroglobuline en alpha-1-protease
inhibitor. Het PSA in complex met alpha-1-antichymotrypsine is de meest voorkomende vorm
van PSA in het bloed serum. Bij prostaatkanker lekt meer PSA in de bloedcirculatie, met een
hogere PSA concentratie in het bloed als gevolg. Om een effectieve en specifieke prostaatkanker
diagnose te kunnen stellen, moet de verhouding van de hoeveelheid vrij, ongecomplexeerd PSA
tot de totale hoeveelheid PSA in het serum gemeten worden. Want deze verhouding ligt lager bij
patiënten met de kwaadaardige vorm van prostaatkanker, dan bij patiënten met de goedaardige
vorm. Deze PSA metingen worden in commerciële testen gedaan met monoklonale antilichamen
tegen verschillende vormen van PSA, meerbepaald de vrije, ongecomplexeerde vorm van PSA,
de gecomplexeerde vorm van PSA met alpha-1-antichymotrypsine en een monoklonaal
antilichaam tegen de totale hoeveelheid PSA (som van vrij, ongecomplexeerd PSA en
gecomplexeerd PSA).
Voor een biotechnologische toepassing, zijn er telkens kleinere moleculen nodig die specifiek
hun antigen herkennen. Productie en toepassing van kleine entiteiten die enkel het variabele
domein van de zware keten van conventionele antilichamen bevat, werd gedaan. Maar hieraan
zijn verschillende nadelen verbonden, zoals kleverigheid van de entiteit, lagere antigen bindende
capaciteit,… De productie en toepassing van kameel enkel domein antilichaam fragmenten
afgeleid van de kameel zware keten antilichamen, vermijdt al deze nadelen. Verschillende
eigenschappen zoals hoge oplosbaarheid, hoge stabiliteit, goede affiniteit maken de kameel
7
antilichaam fragmenten uitstekende hulpmiddelen in biotechnologische toepassing. Een heel
voordelige eigenschap van kameel antilichamen is het feit dat ze de mogelijkheid vertonen om
epitopen op het antigen te herkennen, die conventionele antilichamen moeilijk kunnen bereiken,
meerbepaald de actieve site van een enzym. De actieve site van een enzym bevindt zich meestal
in een moeilijk te bereiken caviteit van het enzym en die caviteit is dus moeilijker bereikbaar dan
een oppervlakte epitoop. Kameel antilichamen hebben nu de eigenschap boven conventionele
antilichamen om die caviteiten toch als immunogeen te beschouwen en zodanig de enzymen te
kunnen inhiberen. Het gebruik van kameel antilichaam fragmenten wordt in deze scriptie
aangewend om PSA specifiek bindende fragmenten af te zonderen en te karakteriseren, met
mogelijkheid om ze in een prostaatkanker diagnostische test te gebruiken. De aangewende
methode start vanaf de immunisering van een kameel met PSA, waarna uit het bloed de
lymfocyten afgezonderd worden. Uit cDNA, geprepareerd vanaf mRNA uit deze lymfocyten,
worden de antigen-bindende genfragmenten van de zware keten antilichamen gekloneerd en een
bibliotheek wordt gemaakt in een fagmide vector. Een in vitro selectie, meerbepaald
verschillende ronden van panning, vindt plaats om aanrijking in PSA specifieke kameel
antilichaam fragmenten te verkrijgen. Na screening van een aantal kolonies kan men PSA
specifieke kameel antilichaam fragmenten isoleren. De nodige karakterisering volgt door middel
van ELISA, SDS-PAGE en Western Blots. Om een diagnostische test te produceren moeten er
minimaal twee van de volgende drie verschillende kameel antilichaam fragmenten geïsoleerd
worden: één die de totale hoeveelheid PSA kan herkennen, één voor enkel het gecomplexeerde
PSA en één voor het vrije PSA.
8
Afkortingen
In deze scriptie werden de volgende afkortingen gebruikt.
− (RT-) PCR: (reverse transcriptase-) polymerase chain reaction
− A2M (of AMG): alpha-2-macroglobuline
− ABTS: 2,2’-azino-di(3-ethylbenzythiazoline-6-sulfonzuur)
− ACT: alpha-1-antichymotrypsine
− Amp: ampicilline
− API: alpha-1-protease inhibitor
− APS: ammonium persulfaat
− BCIP: 5-bromo-4-chloro-3-indolylfosfaat
− BPH: benign prostatic hyperplasia
− BSA: bovine serum albumine
− cDNA: copy DNA
− CDR: complement determining region
− DNA: desoxyribonucleic acid
− dNTP: deoxyribonucleic acid triphosphate
− dsDNA: dubbelstrengig DNA
− DTT: dithiotreitol
− EDTA: ethyleendiaminetetra-acetaat dinatrium
− ELISA: enzym linked immunosorbent assay
− FR: framework region
− Fv: variabel fragment van een antilichaam
− HCAb: heavy chain antibody
− hK2: human glandular kallikrein 2
− IMAC: immobilised metal affinity chromatography
− IPTG: isopropyl β-D-thiogalactopyranoside
− Kan: kanamycine
− mRNA: messenger ribonucleic acid
− MW: molecular weight
− NBT: nitro blauw tetralozium
− OD: optische densiteit
9
− PBS: phosphate buffered saline
− PCa: prostaat carcinoma
− PEG: polyethyleenglycol
− pNPP: p-nitrophenyl fosfaat
− PSA: prostaat-specifiek antigen
− PSAD: PSA densiteit
− scFv: single chain Fv
− SDS: natrium dodecylfosfaat
− SDS-PAGE: SDS poly-acrylamide gel electroforese
− ssDNA: enkelstrengig DNA
− Temed: N, N, N’, N’-tetramethylethyleendiamine
− Tris: hydroxymethyl-aminomethaan
− VHH: variabel domein van de zware keten van zware keten antilichamen
10
2 Literatuurstudie – Overzicht van de bestaande literatuur
2.1 Kameel antilichamen
2.1.1 Algemeenheden over immuniteit
Bij het continue gevecht tegen vreemde componenten hebben gewervelde dieren een immuun
systeem ontwikkeld. Een antigen is een molecule waartegen het mogelijk is om de productie van
antilichamen te induceren. Antigenen bestaan onder verschillende vormen: kleine haptenen
gebonden op een drager, carbohydraten, lipopolysacchariden, proteïnen en DNA. Het immuun
systeem werkt via een leer proces, waarbij het eerste contact met een antigen leidt tot een ziekte
of intoxicatie, maar het tweede contact resulteert in een verdediging tegen het antigen, omdat het
immuun systeem leert van het antigen te herkennen en te verwijderen uit het biologisch systeem.
Het immuun systeem werkt op twee verschillende manieren, via de humorale en cellulaire
immuniteit. De humorale immuniteit wordt veroorzaakt door antilichamen, die hoofdzakelijk
aanwezig zijn in de bloedbaan (Roitt, 1988).
Een antilichaam is een Y-vormig molecule, waarin de domeinen die de tips vormen van de armen
(Fab) binden met het antigen en de domeinen die de stengel (Fc) vormen verantwoordelijk zijn
voor de effectorfuncties, die het antigen elimineren (Padlan, 1994). Deze immunoglobulines
vertegenwoordigen 20% van de totale proteïne hoeveelheid in het bloed. Bij de toediening van
bijna elke mogelijke vreemde stof, aan een gewerveld dier, zal een humoraal antwoord opgewekt
worden. Het opgewekte humorale antwoord wordt gegenereerd door de lymfocyten, die ongeveer
20% van de witte bloed cellen in het lichaam voorstellen. Als een gewervelde geconfronteerd
wordt met een vreemde stof voor de eerste keer in zijn bestaan, dan zullen er enkele dagen
overgaan vooraleer er antilichamen in het bloed detecteerbaar zijn tegen deze vreemde stof. Men
krijgt een primair immuunantwoord. Echter bij herhaalde confrontaties met die welbepaalde
vreemde stof, zullen specifieke antilichamen tegen deze vreemde stof sneller gegenereerd worden
en aanwezig blijven in het bloed. Men zegt dat een geheugen is opgebouwd tegen de specifieke
vreemde stof. Hier spreekt men over een secundaire immuunantwoord.
11
2.1.2 Humoraal antwoord
De unieke functie van een antilichaam is de mogelijkheid om te binden met een hoge affiniteit op
een kleine regio van het antigen. Deze interactie tussen antilichaam en antigen behelst hydrofobe
krachten, Van der Waals interacties, ionische krachten, maar geen enkele covalente binding is
aanwezig tussen antilichaam en antigen. Het deel van het antigen dat herkend wordt door het
antilichaam wordt het epitoop genoemd. Elke antigen bezit over het algemeen verschillende
overlappende of niet-overlappende epitopen. Meestal wordt een polyklonaal antwoord opgewekt
tegen elk antigen. Als het antilichaam bindt op het antigen, dan zal er een brede waaier van
biologische functies nodig zijn om te zorgen voor de afbraak en verwijdering van het antigen. De
inductie van deze biologische functies gebeurt door het Fc stuk van het antilichaam (Roitt, 1988).
Structureel is het antilichaam opgebouwd uit twee identieke zware en twee identieke lichte
ketens, die bij elkaar gehouden worden door verschillende disulfide bruggen. Het moleculaire
gewicht van een antilichaam bedraagt 150 kDa, waarbij elke zware keten een moleculair gewicht
van 50 kDa en elke lichte keten een moleculair gewicht van 25 kDa heeft. Elke zware en lichte
keten bestaat respectievelijk uit vier en twee opgevouwen domeinen. De zware keten is
opgebouwd uit de domeinen VH, CH1, CH2 en CH3. Bij de lichte keten vinden we enkel VL en
CL. De algemene structuur van zo een domein is globulair met een klassiek β-pleated sheet
tertiaire structuur. In elke keten, worden eenheden van 110 aminozuren opgevouwen tot
compacte domeinen, waarbij elk domein één enkele interne disulfide brug bezit en die de twee β-
sheets verbindt. Het variabele domein bestaat uit negen β-strands, opgevouwen in twee sheets
gepakt tegen elkaar en gestabiliseerd door een disulfide brug. Het constante domein bevat zeven
β-strands. De eerste twee van de vier domeinen van de zware keten interageren met de lichte
keten om het Fab stuk te vormen. Het Fab stuk zorgt voor de herkenning van het antigen. Een
hinge regio volgt deze twee domeinen en laat toe aan het antilichaam om een onafhankelijke
beweging te verrichten tussen het Fab en Fc stuk. Deze hinge regio wordt gevolgd door de twee
constante domeinen van de zware keten. Het Fab en Fc stuk worden dus verbonden door de hinge
regio (Padlan, 1994; Roitt, 1988).
2.1.3 Isotypen in humorale antwoord
Verschillende klassen van antilichamen worden gedefinieerd op basis van hun distributie in
verschillende organen en weefsels en ook op basis van hun verschillende effectorfunctie.
Onderling verschillen de antilichaam klassen in half-leven, distributie doorheen het hele lichaam,
12
mogelijkheid om complement te activeren en hun binding op cel gebonden Fc receptoren. Deze
verschillen zijn te wijten aan het Fc deel en er kunnen 5 verschillende klassen aangeduid worden:
IgA, IgG, IgM, IgD en IgE. De 5 klassen bezitten elke hun eigen biologisch karakter. De IgGs
zijn de meest overvloedige in de interne lichaamvloeistof en zijn hoofdzakelijk extra vasculair.
IgA wordt enkel gevonden in muceuze secreties en slijmvliezen. IgM komen voor onder de vorm
van pentameren en zijn op die manier efficiënt in het aggregeren van de antigenen, ze zijn op die
manier ook verantwoordelijk voor het primaire immuunantwoord. IgD wordt enkel gevonden op
de celmembraan van de lymfocyten en worden geassocieerd met geheugen B-cellen. De IgE zijn
verantwoordelijk voor het parasitaire immuunantwoord en verdediging van de externe
lichaamsoppervlakken. Het Fc stuk van het antilichaam verzorgt de verschillende biologische
effectorfuncties (Roitt, 1988).
2.1.4 Antigen bindende site
Bij het vergelijken van de sequenties van antilichamen valt op dat het N-terminale deel van de
zware en lichte keten heel wat variatie vertoont, waar de rest van de delen van de zware en lichte
keten relatief geconserveerd zijn. In deze variabele regio’s vindt men drie hypervariabele
sequenties terug. Deze segmenten noemt men de CDR’s (Complement Determining Regions),
omdat men de hypothese naar voren bracht dat deze zouden samenkomen aan één zijde van het
variabele domein en een oppervlakte vormen die complementair is met het antigen. De enorme
diversiteit in de sequenties van de CDR’s zorgt voor een onmetelijke diversiteit in antigen
specificiteit door de variatie in vorm en natuur van de antigen bindende oppervlakte. Volgens
Kabat et al. (1991) worden de residu’s in de variabele regio’s geclassificeerd als hypervariabel
(CDR) of framework (FR) residu. De FR’s bezitten een grote graad van conservatie doorheen de
IgG moleculen, vooral sommige posities zijn belangrijk voor stabiliteit en opvouwing van het
domein (Chothia & Lesk, 1987). Bepaalde residu’s in FR’s en CDR’s hebben vaste oriëntatie in
antilichamen en dit kan gebruikt worden voor model binding van de gecombineerde sites naar een
beperking van de conformaties en posities van de lussen.
2.1.5 Generatie van diversiteit voor antigen herkenning
Elk antigen kan herkend worden door een antilichaam. Om zo een grote diversiteit aan
antilichamen te kunnen opbouwen met maar een beperkt aantal genen, zijn er verschillende
mechanismen voorhanden. Om een lichte keten te produceren, moeten verschillende
13
gensegmenten associëren. Een Vλ/κ gen associeert met een J-gen en met een Cλ/κ gen. Om een
zware keten te verkrijgen, wordt een willekeurig V-, D- en J-gen door DNA recombinatie bij
elkaar gevoegd en geassocieerd met het constante gedeelte van een bepaald isotype. De V-genen
coderen voor de CDR1 en CDR2 en het DJ gedeelte zorgt voor de CDR3 sequentie. De
recombinatie tussen een VDJ combinatie gebeurt ad random en zorgt voor een extra diversiteit.
Verder kunnen additionele nucleotiden geïnsereerd worden aan de 5’ terminale regio van het D-
en J-segment. Dit proces wordt verricht door het enzym terminaal deoxynucleotidyl transferase.
De paring van een zware keten met een lichte keten zorgt ook voor extra diversiteit. De laatste
hulp voor de broodnodige diversiteit is afkomstig vanwege de verhoogde somatische
hypermutatie. Deze mutaties zijn een resultaat van enkele nucleotidensubstituties en ze komen
enkel voor in de variabele regio’s, dus zowel in de FR’s als in de CDR’s. Ze vinden plaats bij de
generatie van het immunologisch geheugen en zorgen voor een hoger wordende affiniteit van de
geproduceerde antilichamen voor het antigen (Tonegawa, 1981).
2.1.6 Humoraal antwoord in Camelidae
De familie van de Camelidae is de enige overlevende van de suborde van de Tylopoda, afkomstig
vanuit het Eoceen. De leden van de Camelidae familie zijn de kameel, de dromedaris en de lama.
Bij het onderzoeken van hun humorale immuniteitssysteem zijn interessante eigenschappen naar
voor gekomen. Hun bloed bevat niet alleen de verwachte conventionele antilichamen bestaande
uit twee zware en twee lichte ketens, maar er zijn ook antilichamen aanwezig die alleen bestaan
uit twee zware ketens. Bij Camelidae bestaat een belangrijk aandeel van het natuurlijke
antilichaam repertorium uit antilichamen die geen lichte keten bevatten. De antilichamen die
enkel opgebouwd zijn uit zware ketens worden zware keten antilichamen genoemd (HCAb :
Heavy Chain Antibody, gedefinieerd als een immunoglobuline zonder lichte keten). Ze zijn
functioneel in antigenbinding (Hamers-Casterman et al., 1993). Deze zware keten antilichamen
hebben de kleinste natuurlijk voorkomende antigen bindende sites, bestaande uit één enkel
domein met enkel drie antigen bindende lussen, equivalent met de CDR1, 2 en 3 van VH’s. De
zware keten antilichamen komen voor als een IgG isotype. Hun moleculaire gewicht bedraagt
ongeveer 95 kDa, dit in tegenstelling tot de 150 kDa voor conventionele antilichamen. Voor de
zware keten antilichamen kunnen verschillende subklassen gedefinieerd worden. In het geval van
de dromedaris, behoren de subklassen IgG2 en IgG3 tot de zware keten antilichamen, waarbij de
IgG2 waarschijnlijk een 35 aminozuur lange hinge en IgG3 een 12 aminozuren lange hinge
bevatten (Vu et al., 1997).
14
2.1.7 Verschillen tussen conventionele en zware keten antilichamen
De zware keten antilichamen in Camelidae verschillen van de conventionele antilichamen in
verscheidene aspecten. De polypeptide keten van de zware keten antilichamen is significant
korter dan die van de zware keten van de conventionele antilichamen. Dit komt doordat het CH1
domein, dat normaal interageert met de lichte keten, verdwenen is bij de zware keten
antilichamen (figuur 1).
Fig. 1. Schematische voorstelling van conventioneel antilichaam (links) en zware keten antilichaam (rechts) naar
Muyldermans & Lauwereys (1999). Voor de conventionele antilichamen zijn de domeinen VL en CL voor de lichte
keten en VH, CH1, CH2 en CH3 voor de zware keten weergegeven. Voor de zware keten antilichamen zijn de
domeinen VHH, CH2 en CH3 weergegeven. Het CH1 domein is afwezig bij zware keten antilichamen.
Het variabele domein van de zware keten van de zware keten antilichamen, afgekort als VHH,
vertoont enkele opmerkzame aminozuur substituties in hun framework. Dit is om functioneel te
kunnen zijn met de afwezigheid van het VL domein en deze aminozuur substituties worden niet
gevonden in de zware ketens van conventionele antilichamen. Normaal wordt het translatie
product van het immunoglobuline zware keten mRNA getransporteerd naar het endoplasmatisch
reticulum. De zware keten polypeptide wordt dan gebonden met chaperone proteïnen (BiP),
welke normaal moeten verplaatst worden door de lichte keten om de secretie van het antilichaam
te bewerkstelligen. De chaperone proteïnen binden normaal op het CH1 en VH domein van de
zware keten, maar omdat bij de zware keten antilichamen van Camelidae het CH1 domein
15
afwezig is, kunnen de chaperone proteïnen er niet op binden en zal de zware keten niet in het
endoplasmatisch reticulum blijven en onmiddellijk gesecreteerd worden (Vu et al., 1997).
Deze zware keten aanpassingen bij de Camelidae worden geconcentreerd gevonden in het gebied
dat overeenkomt met de VH zijde, die interageert met de VL zijde in conventionele antilichamen.
Bij verwijdering van het VL domein, komt er een groot hydrofoob gebied vrij voor solvent bij de
VH, dit leidt tot kleverigheids- en aggregatieproblemen. De grootte van het geëxposeerd
hydrofoob oppervlak bedraagt tussen de 500 en 800 Ǻ.
Er zijn echter mutaties ontstaan die ervoor zorgen dat het voor solvent extra toegankelijk gebied
meer hydrofiel wordt gemaakt (figuur 2). De eerste duidelijke mutatie is de substitutie van
leucine 11 naar een serine, wat een iets hydrofieler karakter heeft. In de conventionele
antilichamen zorgt leucine 11 voor een ball-and-socket joint via interactie met fenylalanine 149
en proline 150 van het CH1 domein (Lesk & Chothia, 1988). Deze joint zorgt voor een juiste
oriëntatie om het domein op de correcte manier te laten interageren met de lichte keten. Deze
ball-and-socket joint vergemakkelijkt ook de beweging om de verscheidene interacties van het
antilichaam voor antigen interactie en effectorfunctie te bewerkstelligen. Al de andere
aminozuren substituties komen voor in framework 2 (figuur 2), dat normaal interageert met het
VL domein, het zijn de substituties Val37Phe/Tyr, Gly44Glu/Gln, Leu45Arg/Cys en
Trp47Gly/Ser/Leu/Phe (Riechmann & Muyldermans, 1999).
Fig. 2. Schematische illustratie van de verschillen tussen VH en VHH gebaseerd op sequentie vergelijking (naar
Muyldermans & Lauwereys (1999). De relatieve positie van de antigen binding lussen (CDR1, 2 en 3) zijn gegeven,
16
de blauwe segmenten stellen de vier framework regio’s (FR) voor. De mogelijke extra disulfide brug tussen CDR1 en
CDR3 is in groen weergegeven, samen met de framework aminozuur substituties in VHH.
Deze substituties in VHH’s laten de structuur van de hoofdketen onveranderd in het opgevouwen
domein ten opzichte van de VH’s, maar zorgen voor een hydrofieler oppervlak, zodanig dat het
geïsoleerde domein meer oplosbaar wordt in het solvent.
2.1.8 Ontogenie van de zware keten antilichamen
Het genoom van de Camelidae bevat zowel VH als VHH kiembaan genen, waarbij de VHH
genen telkens in het FR2 de hierboven vermelde substituties en een extra cysteïne in de CDR1 of
op positie 45 bezitten (Nguyen et al., 1998). De genen, coderende voor de VHH’s, kunnen
onderverdeeld worden in zeven subklassen, afhankelijk van de positie van het cysteïne in de
CDR1 en de lengte van de CDR2. Vijf van de zeven subklassen komen zeker voor met
gerecombineerde DJ segmenten (Nguyen et al., 2000). Bij de zware keten antilichamen ziet men
een afwezigheid van het CH1 domein, alhoewel het aanwezig is in de kiembaan, maar tijdens de
mRNA processing eruit wordt gespliced (Nguyen et al., 2000). Een ander typische eigenschap
van de zware keten antilichamen is dat de CDR3 lus gemiddeld langer is dan bij conventionele
antilichamen (Muyldermans et al., 1994). Doordat er in CDR1 en CDR3 meestal een cysteïne zit,
leidt dit tot de vorming van een interlus disulfidebrug. De cysteïne in de CDR1 is gecodeerd in de
kiembaan, maar de cysteïne in de CDR3 is niet aanwezig in de kiembaan, maar wordt
geïntroduceerd bij het recombinatieproces van de VHH-D-J gen segmenten.
2.1.9 Antigenisch repertorium
Omdat de zware keten antilichamen enkel drie CDR’s bevatten voor antigen binding, in
tegenstelling tot de zes CDR’s bij conventionele antilichamen, kan verondersteld worden dat het
antigen bindend vermogen kleiner zou zijn. Alhoewel werd gevonden dat zware keten
antilichamen bij een geïmmuniseerde of zieke kameel een heel breed antigen bindend vermogen
bezitten (Hamers-Casterman et al., 1993). Alles wijst erop dat Camelidae een efficiënt humoraal
immuunsysteem bezit, dat grotendeels gebaseerd is op zware keten antilichamen en dat daardoor
de zware keten antilichamen andere strategieën ontwikkelden om hun antigen bindend landschap
te kunnen verbreden (Muyldermans et al., 2001; Nguyen et al., 2000). Reeds een honderdtal
VH/VHH genfragmenten zijn geïdentificeerd. De VHH fragmenten zijn aparte entiteiten uit de
evolutie en niet afkomstig uit mutaties van de VH genen. Zowel de VH als de VHH
17
genfragmenten zijn hoogstwaarschijnlijk aanwezig op hetzelfde functionele chromosoom, omdat
hetzelfde D-segment werd gevonden in conventionele als zware keten antilichamen (Nguyen et
al., 2000). Het is wel nog onverklaard of de kiembaan VH’s en VHH’s interspersed of clustered
liggen op diezelfde locus van het chromosoom. Bij het vergelijken van de kiembaan en cDNA
sequenties, blijkt het belang van somatische hypermutatie in het genereren van het VHH
repertorium (Vu et al., 1997).
2.1.10 Structuren van VHH’s
Vergelijkingen van de sequenties van mens en muis antilichamen, lieten zien dat aanwezigheid
van specifieke aminozuren op specifieke plaatsen in de CDR’s, kan leiden tot een gelimiteerd
aantal structuren, canonieke structuren genoemd (Al-Lazikani et al., 1997; Chothia & Lesk,
1987). Vele van de sequentie variaties in de hypervariabele regio’s leidt enkel tot een modificatie
van de antigen bindende oppervlakte. Hoewel, sequentie variaties op sommige specifieke posities
in zowel framework als hypervariabele regio’s zorgen voor een andere canonieke structuur. De
relatie tussen VHH lus structuur en canonieke structuur blijkt minder strikt te zijn dan bij
conventionele antilichamen. De H1, H2 en H3 lussen worden gedefinieerd als het solvent
bereikbaar deel van de overeenkomstige CDR in de natieve 3D structuur.
Er werd voor zware keten antilichamen gevonden dat de H1 en H2 lussen alternatieve
conformaties dan de reeds gedefinieerde conformaties konden aannemen (Decanniere et al.,
2000). De kristal structuren van VHH moleculen onthult dat de structuren van de eerste en
tweede hypervariabele lussen, verschillen van die in de VH moleculen, alhoewel de sequentie
context van deze lussen heel gelijkend zijn in VHH en VH moleculen. Voor de VH zijn er zes
verschillende H1-H2 lus combinaties mogelijk (Chothia et al., 1992). Vijf van de zes kunnen
voorspeld worden via algoritmen die gebaseerd zijn op lengte van de lus en de aanwezigheid van
welbepaalde aminozuren op sleutelposities. Voor de VHH’s daarentegen blijkt het dat er meer
dan tien verschillende lus conformaties mogelijk zijn (Decanniere et al., 2000; Nguyen et al.,
2000). Dit leidt uiteindelijk tot een grotere structurele diversiteit om te kunnen interageren met
het antigen.
De H1 regio is verbreed zodat de meer stroomopwaarts gelegen aminozuren ook gebruikt
worden. Deze vergroting van de CDR1 leidt uiteindelijk tot een grotere variabiliteit. Men weet
dat hot spots voor hypermutatie TAC/T (enkel voor de aminozuurposities 27 en 29) of AGC/T
18
zijn en sommige nucleotidensequenties zijn veranderd in deze hot spots in het geval van VHH’s.
Het kan gebeuren dat grotere CDR1 lussen voorkomen door nucleotiden inserties, die dan op hun
beurt leiden tot een groter antigen bindend oppervlak. Ook kortere en langere H2 lussen zijn
gevonden in VHH gen fragmenten.
De CDR3 lengte van een VHH is gemiddeld langer dan die van een VH, daarenboven is de
CDR3 ook meer toegankelijk voor het solvent, wat ook leidt tot een groter beschikbaar oppervlak
voor antigen herkenning (Muyldermans et al., 2001). Uit verschillende VHH-antigen structuren is
afgeleid dat de CDR3 lus bijdraagt tot 50 tot 75% van de totaal antigen interagerend oppervlak.
Een extra disulfide brug is meestal aanwezig in de VHH, door de aanwezigheid van extra
cysteïne residu’s in de CDR1 lus of op posities 45 of 50 en in de CDR3 lus. Deze disulfide brug
stabiliseert de langere lus en zou mogelijk nieuwe lus structuren kunnen induceren (Decanniere et
al., 2000).De extra disulfide brug leidt tot een nieuwe variëteit van antigen bindende lussen. De
lengte en variabiliteit van de CDR3 reflecteert ook het VDJ diversificatie proces. Een lange
CDR3 wordt gevonden in verschillende organismen met een lage VH diversiteit. Deze lange
uitpuilende (protruding) lussen van tien aminozuren of meer blijken uniek te zijn voor de antigen
binding sites van het zware keten antilichamen. De langere CDR3 in Camelidae in tegenstelling
tot muis of mens zou kunnen compenseren voor het verlies van de contacten van de VL met het
antigen (Muyldermans et al., 1994). De aanwezigheid van langere CDR1, 2 en 3 lussen laten toe
dat andere canonieke structuren kunnen voorkomen, wat aanleiding geeft tot een vergroting van
het structureel repertorium van de antigen bindende site en uiteindelijk tot het compenseren van
het verlies van het VL domein.
2.1.11 VHH-antigen binding
Verschillende VHH-complex kristalstructuren gaven extra informatie over de manier van binden
van het antigen op de VHH. Voor het cAbLys3-HEL complex (HEL = kip lysozyme), waar de
VHH het lysozyme competitief inhibeert, werd gevonden dat tien aminozuren van de CDR3 zich
bevinden in de actieve site van het lysozyme. De uitpuilende lus van de CDR3 bootst het
natuurlijke substraat van het lysozyme na (Desmyter et al. 1996). Dat zo een uitpuilende lus nog
niet gevonden is in conventionele antilichamen, kan erop wijzen dat de Camelidae met de zware
keten antilichamen andere epitopen kan binden dan conventionele antilichamen.
19
In het geval van de cAbRN05-RNase A complex, werd vastgesteld dat enkel residu’s van de
CDR1 en CDR3 contact maken met het antigen, wat leidt tot een kleiner VHH-antigen
interagerende oppervlakte van 570 Ǻ² (Decanniere et al., 1999). Normaal ligt de antigen
interagerende oppervlakte tussen 600 en 800 Ǻ². Toch is het mogelijk om met zo een kleinere
antigen interagerende oppervlakte, een affiniteitsconstante in de nanomolaire range te verkrijgen.
Het is best mogelijk dat deze hoge affiniteit te verklaren is doordat het antigen herkennende
proces bewerkstelligd wordt door Van der Waals interacties en waterstofbruggen, gemedieerd
door een overgrote meerderheid van hoofdketen atomen. Bij conventionele antilichamen worden
de antigen bindende krachten vooral verzorgd door zijketen atomen. Het lijkt erop dat zware
keten antilichamen een verschillende strategie hanteren om te kunnen interageren met het
antigen.
De structuur van het cAbCA05-carbonic anhydrase complex laat zien dat de interactie van de
VHH met het antigen alleen gebeurt via de residu’s van de CDR3 lus. De CDR3 is verdeeld in
een N-terminaal en C-terminaal deel, doordat een cysteïne aanwezig is als middelpunt en dat een
disulfide brug maakt (Desmyter et al., 2001). Het N-terminaal gedeelte van de CDR3 lus plooit
terug over de CDR1 en CDR2 lussen. Het C-terminaal gedeelte echter plooit over de voormalige
VL zijde en verbergt de overblijvende hydrofobe residu’s van het solvent. Beide delen van de
CDR3 lus participeren in carbonic anhydrase binding via een plat oppervlakte.
Deze verschillende VHH-antigen complex structuren openbaren een divers structureel
repertorium van antigen bindende sites van de VHH’s en ook nieuwe canonieke structuren
werden geïdentificeerd (Muyldermans et al, 2001). Conventionele antilichamen binden het
antigen door te interageren via een vlak oppervlak. Alhoewel hapteen binding kan voorkomen
door de vorming van een caviteit in de zes CDR regio’s van het antilichaam (Spinelli et al.,
2000).
Zware keten antilichamen kunnen het antigen binden op verschillende manier. Eerst en vooral
kunnen de zware keten antilichamen interageren zoals de conventionele antilichamen via een vlak
structuur oppervlak met het antigen (Decanniere et al., 1999). Daarnaast kan de interactie met
grote caviteiten gebeuren via een uitpuilende lus, die ook in de enzym actieve sites kan binden
(Desmyter et al., 1996). Haptenen kunnen gebonden worden door een caviteit te generen met de
drie CDR lussen (Spinelli et al., 2000). Het is overduidelijk dat VHH’s het antigen kunnen
binden met een nanomolaire affiniteit voor het antigen met een enkele CDR (Desmyter et al.,
20
2001), waar conventionele antilichamen op zijn minst drie CDR lussen nodig hebben om te
kunnen interageren met het antigen. Dit wil zeggen dat de herkenning van meerdere, variabele
epitopen, qua structuur en sequentie, kan gebeuren door zware keten antilichamen, wat de deur
opent naar een verschillende toepassingen.
2.1.12 Biotechnologische Applicatie
Om tot een biologische applicatie te komen, wordt er steeds gezocht naar kleinere moleculen die
antigenen specifiek herkennen met een hoge affiniteit. Van kleinere moleculen wordt verwacht
dat ze een lagere immunogeniciteit, snellere bloed verwijdering, hogere weefsel penetratiegraad
en lagere aspecifieke binding vertonen. Productie van kleine entiteiten, die enkel het variabele
domein bevatten van de zware keten van de conventionele antilichamen werd geprobeerd. Maar
men stootte op verschillende nadelen zoals kleverigheid vanwege de solvent toegankelijkheid van
de hydrofobe residu’s, normaal interagerend met de lichte keten en een gereduceerde antigen
bindende capaciteit ten opzichte van een intacte VH-VL antigen bindende site.
De productie van enkel domein antilichamen, afgeleid van kameel zware keten antilichamen,
vermijdt echter al deze negatieve eigenschappen. Deze VHH’s binden specifiek aan een
welbepaald antigen met een nanomolaire affiniteit (dit is in hetzelfde affiniteitsgebied als scFv).
VHH’s tegen alle soorten antigenen kan men verkrijgen door immunisering van kamelen met het
antigen. Na een immunisering protocol, worden de periferale bloed lymfocyten gezuiverd uit het
bloed en het mRNA wordt geïsoleerd vanuit de cellen. De genen die coderen voor de VHH
domeinen worden geamplifieerd vanaf cDNA, verkregen vanaf mRNA, door PCR met één set
primers. De geamplifieerde genen worden gekloneerd in een fagmide vector en kleine
bibliotheken van 106 tot 107 transformanten zijn voldoende om een representatief antigen bindend
repertorium te bestrijken, als men start vanaf 5x106 lymfocyten.
21
Fig. 3. Isolatie van recombinante VHH’s met gekende antigen specificiteit. De weg van kameel immunisering tot
oplosbaar antigen specifiek eiwit wordt getoond (naar Muyldermans & Lauwereys, 1999).
Het VHH gen wordt geïnsereerd stroomopwaarts van het minor coat gen 3 proteïne van de M13
filamenteuze faag. Door deze manier van werken, wordt na de bibliotheek te infecteren met
helperfagen, de productie van faag partikels mogelijk die een VHH-g3p fusieproteïne op hun tip
bezitten. Het corresponderende VHH gen wordt in het faag partikel verpakt. De recombinante
fagen worden blootgesteld aan verschillende opeenvolgende ronden van in vitro selectie,
genaamd panning. Het verkrijgen van antigen specifieke VHH’s door panning wordt verkozen
boven de screening van individuele kolonies, omdat de panning condities ook selecteren voor
binders met de hoogste affiniteit voor het antigen en diegene die goed uitgedrukt worden in
bacteriën. Een aanrijking in specifieke fagen wordt bereikt na twee tot drie selectieronden. De
analyse van individuele klonen, na de panning procedure, leidt tot de identificatie van
verschillende VHH’s specifiek voor het welbepaalde antigen (figuur 3). Met behulp van deze
methode kunnen specifieke VHH’s tegen het antigen met een goede affiniteit verkregen worden
in een korte tijdsperiode (Ghahroudi et al., 1997).
De hoge oplosbaarheid tot 10 mg/ml, hoge stabiliteit, goede affiniteit en geen VH-VL dissociatie
door verdunning wegens het enkel domein karakter, maken VHH’s een krachtige hulpmiddel in
de biotechnologie. De goede expressie in E.coli en makkelijke zuivering maken VHH’s goede
applicatie model systemen (Nguyen et al., 2001). Een heel opmerkelijke eigenschap, enkel bij de
VHH’s, is het feit dat in circa 50% van de gevallen VHH’s die opgewekt zijn tegen een enzym,
22
de mogelijkheid bezitten om dat enzym te inhiberen (Lauwereys et al., 1998; Conrath et al.,
2001). Het is algemeen geweten dat de actieve site van een enzym zich meestal bevindt in een
caviteit en dat deze caviteiten over het algemeen minder immunogeen zijn dan andere delen van
het proteïne. Deze eigenschap van VHH’s, dat ze de mogelijkheid hebben om epitopen te
herkennen, die niet herkend worden door conventionele antilichamen, geven de VHH’s een
bijkomend voordeel in biotechnologische toepassingen (Conrath et al., ingediend bij JBC). In
verschillende toepassingen is het juist behulpzaam om een inhibitorische VHH te kunnen
gebruiken als hulpmiddel. De inhibitorische VVH’s kunnen helpen in het begrijpen van het
enzymatisch mechanisme of kan aangewend worden bij de inactivatie van een enzym in een
bepaald proces. Deze inhibitorische VHH’s kunnen op basis van hun CDR sequenties ook
aanleiding geven tot het ontwerpen van inhibitorische peptiden.
Antitumor antilichamen kunnen zorgen voor een selectiviteit in hun doelwit en kunnen ook
gebruikt worden om therapeutische agentia te transporteren naar de plaats van de tumor. Muis
monoklonale antilichamen, die gegenereerd werden door de hybridoma technologie, vertonen
sommige nadelen als ze gebruikt worden in klinische testen, mede door hun grootte en hoge
immunogeniciteit. Hun grotere omvang geeft een lagere tumorweefsel penetratie. Daarom hebben
kleinere fragmenten een hogere tumor penetratie en snellere bloed verwijdering. Enkel domein
antilichamen kunnen aangewend worden onder bispecifieke of bivalente vorm, gekoppeld aan
een drug of toxine (Conrath et al., 2001). Het wordt verwacht dat de VHH ook toepassingen zal
vinden in diagnostiek en therapeutische hulpmiddelen, zeker wanneer men een economisch
productie, kleine grootte en een robuuste entiteit nastreeft.
2.1.13 Filamenteuze bacteriofaag display van antilichamen
De filamenteuze fagen bezitten een aantal eigenschappen, die hun gebruik voordelig maakt in het
klonen en screenen van het Ig repertorium. De fagen lyseren hun gastheer cellen niet en laten toe
van een groter dan normaal DNA molecule op te nemen in hun faag partikel. Men kan ook zorgen
dat het product van het gekloneerde gen vertoond wordt op de faag oppervlakte. De
gastheercellen verkrijgen ook immuniteit tegen een verdere faag infectie, zodat het mogelijk is
om monospecificiteit te hebben voor het vertoonde vreemde proteïne. De filamenteuze fagen
bezitten ook een immense selectie kracht, waardoor de mogelijkheid bestaat om specifieke genen
op te sporen, die oorspronkelijk slechts 1/1010 aanwezig waren.
23
De filamenteuze bacteriofagen zijn een groep van heel gerelateerde virussen, dewelke alleen
gram-negatieve bacteriën kunnen infecteren via hun vertoonde oppervlakte proteïne, het gen 3
proteïne, waarmee ze zich vasthechten op de F pilus van de bacteriële membraan. De fagen zijn
900 nm lang en 6 tot 10 nm dik en zijn de smalste gekende virussen. Deze mannelijk-specifieke
bacteriofagen beschikken over een kleine, enkelstrengige, circulair DNA genoom. De
genoomgrootte bedraagt ongeveer 6400 basenparen en codeert voor 10 proteïnen, die nodig zijn
voor infectie, biosynthese en generatie van nieuwe faag partikels (Smith & Petrenko, 1997).
De virus mantel bestaat uit een groot mantel proteïne van 2700 tot 3000 kopijen, welk het product
is van het gen VIII (gp8), en vier kleinere proteïnen, de producten van genen III, VI, VII en IX.
Deze zijn allemaal aanwezig in een vijftal kopijen. Het gen 3 product (g3p) of het adsorptie
proteïne wordt verankerd aan een uiteinde van het faag partikel mantel via het C-terminaal
domein. Het N-terminaal domein is geëxposeerd en medieert de aanhechting op de F pilus van de
bacterie. Bij herkenning en aanhechting van de faag partikels, wordt het groot mantel proteïne
verwijderd, terwijl het virale DNA samen met het g3p wordt getransporteerd tot binnen in de
bacterie. Het infecterende ssDNA wordt onmiddellijk omgezet naar een dsDNA. Terwijl de virale
proteïnen worden getranscripteerd, wordt ook het virale genoom geamplifieerd. De assemblage
van nieuwe faag partikels wordt verricht in het bacteriële membraan en het periplasma. De
infectie van de bacterie door de faag lyseert de bacterie niet, maar vertraagd wel de bacteriële
groei, die leidt tot een permanente infectie van de bacterie.
Er werden speciale filamenteuze kloneringsvectoren ontwikkeld. Een grote regio met gen III en
f1 origin of replication (ORI) van het wilde type M13 werd geïntegreerd in een plasmide (term
fagmide). Dit chimaere plasmide kan propageren zoals een elke andere plasmide in een bacterie
of kan verpakt worden in een faag partikel. Dit laatste wordt geholpen door een helper faag
(M13KO7), die een mutatie draagt in de ORI en draagt ook een antibiotica resistentie merker.
Door die mutatie in de ORI zal er weinig helper faag genoom worden geamplifieerd en dus een
meerderheid van recombinante fagmide ingekapseld worden in nieuwe faag partikels. Sommige
fagmide vectoren dragen een amber stop codon tussen het gen III en het vreemde gen. Dit laat
een gemakkelijke switching toe tussen oppervlakte gebonden uitdrukking en gesecreteerde en
oplosbare expressie van het vreemde gen alleen, door gebruik te maken van suppressor of non-
suppressor bacterie stammen.
24
Het faag display systeem kan men gebruiken om antilichamen of antilichaam fragmenten uit te
drukken om de tip van het faag partikel. Hierdoor kan men de hybridoma technologie omzeilen.
De enige limitering in de faag antilichaam technologie is de grootte van de bibliotheek, die
gelimiteerd is door de transformatie efficiëntie in bacteriën. Die gaat maximaal tot een grootte
van 109 klonen. Het gebruik van deze faag display procedure op de selectie van kameel
antilichaam fragmenten vertoont de volgende voordelen. Vooreerst wordt het immuunsysteem
van de Camelidae geëxploiteerd om te zorgen voor generatie en maturatie van in vivo bindende
fragmenten tegen het antigen. Hierdoor is er later geen nood om de binders te optimaliseren qua
affiniteit of specificiteit. Slecht één enkel VHH gen fragment moet gekloneerd worden, dit is in
tegenstelling tot het kloneren van de VL en VH voor het repertorium na te bootsen van muis of
mens in vitro via scFv’s. Er komt slechts één enkele familie van VHH’s voor in de Camelidae,
zodat in essentie slecht één enkele set primers nodig is om het hele repertorium te kloneren. Als
laatste voordeel is een VHH fragment van de kameel zware keten antilichamen een enkel domein
antilichaam. De vouwing in een functioneel proteïne wordt hierdoor vergemakkelijkt. Bovendien
moet de stabiliteit van een enkel domein antilichaam hoger zijn dan de antigen bindende
fragmenten van conventionele antilichamen, omdat er geen dissociatie kan gebeuren van de VH-
VL paren bij verdunning (Muyldermans & Lauwereys, 1999). De intrinsieke stabiliteit van het
kameel antilichaam fragment is hoger dan een Fab, Fv of scFv, want het is zuurbestendig, het
heeft een reversiebele denaturatie/renaturatie. Het herkent verschillende epitopen, zowel
inhibitorische epitopen als epitopen die ook herkend worden door conventionele antilichamen.
Door genetische engineering kunnen er reactieve groepen gekoppeld worden aan het kameel
antilichaam fragment om de immobilisatie op bio-chips te vergemakkelijken.
2.2 Prostaat-specifiek antigen
2.2.1 Prostaatkanker
Prostaatkanker is de meest voorkomende kanker bij mannen in de Verenigde Staten en de tweede
meest voorkomende doodsoorzaak bij mannen na longkanker wereldwijd. Er werd vooropgesteld
dat bijna 39 miljoen mannen in Noord-Amerika, Europa en Japan prostaatkanker hebben
(Andriole et al., 1994). De incidentie van prostaatkanker varieert evenwel bij vergelijking van
verschillende landen. De oorzaak van deze wijde variatie in verschillende landen is nog een
raadsel, alhoewel raciale en etnische factoren, verschillen in levensstijl en dieet wel degelijk een
25
invloed op de incidentie van prostaatkanker kunnen hebben. De beste manier om prostaatkanker
aan te pakken, is het vroeg opsporen via diagnostische testen en/of biopsieën. Er werd
vastgesteld dat, bij prostaatkanker, tumorcellen verschillende antigenen uitdrukken, wat
aanleiding kan geven tot een herkenning van deze vreemde antigenen door het immuunsysteem.
Voor prostaatkankerdetectie zijn reeds verschillende antigenen de revue gepasseerd, enkel het
prostaat-specifiek antigen (PSA) wordt algemeen aanvaard als een prostaat tumormerker, zodanig
dat het PSA 15 jaar geleden werd geïntroduceerd in de urologie als prostaat tumormerker (Woolf
et al., 1999). Het PSA is de eerste tumormerker die aanvaard werd door de Food and Drug
Administration in de Verenigde Staten als een hulpmiddel in de diagnose van prostaatkanker in
populatie screening programma’s (Diamandis, 2000). PSA wordt nu zelfs wereldwijd gebruikt als
een prostaatkanker biomerker in populatie screening, diagnose en opvolgen van patiënten met
prostaatkanker. Eén van de grote voordelen van het gebruik van PSA als tumormerker is zijn
weefselspecificiteit, omdat enkel de prostaat het PSA aanmaakt (Belldegrum et al., 1998).
Door de introductie van PSA metingen in de klinische praktijk kan een snellere diagnose van
prostaatkanker gemaakt worden. Alhoewel voor vele patiënten de diagnose niet vlug genoeg kan
gebeuren, want 30 tot 40% van de mannen met klinisch gelokaliseerde tumoren hebben reeds
metastasen. Als prostaatkanker reeds in een vroeg stadium wordt opgespoord, is het potentieel
geneesbaar door radicale prostaatectomie voor patiënten met een tumor, die beperkt is tot de
prostaat (Chan et al., 1987). Door de ontdekking van PSA mag men hopen op een vroege
opsporing van prostaatkanker in een geneesbaar stadium. Er is dus een grote nood aan verbeterde
detectiemethoden van prostaatkanker, zolang de tumor beperkt blijft tot de prostaatklier zelf. Men
aanvaardt dat een combinatie van serum PSA concentratie en rectaal onderzoek met een
ultrasonografie in patiënten een betere methode is om prostaatkanker te detecteren dan rectaal
onderzoek alleen.
2.2.2 Kallikrein serine protease familie
De kallikrein familie is een subfamilie van de proteolytische enzymen superfamilie. Het prostaat-
specifiek antigen is lid van de kallikrein gen familie. Deze familie bestaat uit minstens 14 genen,
die alle coderen voor serine proteasen en die veel structurele gelijkenissen en significante
homologieën dragen. Origineel werden kallikrein proteasen geïdentificeerd door hun
mogelijkheid om kininen vrij te maken uit hoog moleculair gewicht substraten (Lundwall &
Lilja, 1987). Juist omdat PSA een lid is van de kallikrein familie is het mogelijk dat zijn
26
biologische functies gerelateerd kunnen worden aan de activiteit van de andere kallikrein
proteasen. De primaire structuur van PSA vertoont extensieve homologie met de humane
kallikrein familie (Lundwall & Lilja, 1987).
Het PSA wordt, zoals de andere leden van de kallikrein familie, aangemaakt als een pre-pro-
vorm, meer bepaald als een enkele polypeptide keten van 261 aminozuren. De eerste 17
aminozuren worden verondersteld van het signaal peptide te zijn, wat zorgt voor het transport
naar het endoplasmatisch reticulum. Na verwijdering van de eerste 17 residu’s van de N-
terminale zijde van de pre-pro-vorm van PSA, bereikt de pro-vorm van PSA (zymogen vorm) de
celmembraan en wordt vervolgens gesecreteerd in het kanaalsysteem van de prostaat (Noldus et
al., 1997). Een kleine hoeveelheid van het geproduceerde PSA komt eveneens in de
bloedcirculatie terecht (figuur 4).
Fig. 4. Productie van PSA in de prostaat epitheel cellen (prostatic epithelial cells) en secretie naar het kanaalsysteem
van de prostaat (prostate gland lumen) en naar de bloedcirculatie (blood vessel) (naar Belldegrum et al., 1998).
De secretie van PSA uit de prostaat epitheel cellen gebeurt onder de vorm van een pro-enzym
(pro-PSA), die geactiveerd moet worden door de verwijdering van de eerste zeven aminozuren.
Dit activeringsproces wordt gemedieerd door human glandular kallikrein 2 (hK2) (Diamandis,
2000; Nurmikko et al., 2000). De actieve vorm van PSA kan dan zijn fysiologische substraten
hydrolyseren (figuur 5).
2.2.3 Prostaat-specifiek antigen
Het prostaat-specifiek antigen is één van de drie meest overvloedige prostaat gesecreteerde
proteïnen in het humane semen (Lilja et al., 1991). De prostaat maakt naast PSA ook
27
voornamelijk hK2 en prostase aan. Het PSA is een enkele polypeptide keten glycoproteïne van
237 aminozuren met vier carbohydraat zijketens. Het moleculair gewicht van de niet-
geglycosyleerde vorm van het proteïne bedraagt 27 kDa. De geglycosyleerde vorm van PSA heeft
een moleculair gewicht van 33 kDa. De site voor N-glycosylatie werd geïdentificeerd op het
aminozuur residu asparagine 45. De rest van de glycosylaties vindt men op de O-geglycosyleerde
residu’s serine 69, threonine 70 en serine 71 (Watt et al., 1986). Het protease bezit vijf disulfide
bruggen, om zijn natieve 3D structuur in stand te houden (Zhang et al., 1995; Michel et al.,
1999).
Functioneel is het een orgaanspecifiek, kallikrein gelijkend serine protease geproduceerd door de
prostaat epitheel cellen langsheen de kanalen van de prostaatklier (figuur 4). Het PSA is
orgaanspecifiek, maar niet ziektespecifiek omdat het PSA uitgedrukt wordt bij zowel goed- als
kwaadaardige processen in de prostaat epitheel cellen. Onder normale fysiologische condities
wordt PSA gesecreteerd in het lumen van de prostaatkanalen. PSA wordt in hoge concentraties
gevonden in het semen plasma en is een belangrijk deel van de prostaatsecreties. De hoofdfunctie
van PSA is het vloeibaar maken van het semen coagulum (figuur 5). Normaal wordt slechts een
kleine proportie van het geproduceerde PSA geabsorbeerd in de bloedcirculatie. De typische
concentratie in het semen plasma bedraagt tussen 0,5 en 5 mg/ml. De concentratie van PSA in de
bloedcirculatie bedraagt slechts enkele ng/ml (Noldus et al., 1997).
Fig. 5. Productie als pro-PSA, activering hoogstwaarschijnlijk door hK2, regulatie door inhibitoren en effect op
semen vervloeiing (uit Diamandis, 2000).
28
Het PSA gezuiverd uit semen plasma is heel heterogeen. Het blijkt dat ongeveer 65% van het
PSA in semen plasma intact en enzymatisch actief is. 35% is echter inactief, blijkbaar door een
interne knipping van de polypeptide keten (Leinonen et al., 1996). De meest voorkomende
knipping in PSA, die PSA enzymatisch inactief maakt, is deze tussen de aminozuren lysine 145
en lysine 146 (Lilja et al., 1992). De peptide knipping tussen deze twee residu’s zorgt voor twee
vrije uiteinden, die hoogstwaarschijnlijk de proteïne conformatie beïnvloedt (Nurmikko et al.,
2000). Deze knipping van PSA gaat gepaard met een reductie van pI en wordt geassocieerd met
de verdere degradatie van PSA (Zhang et al., 1995). Ook kunnen knippingen van aminozuren aan
het carboxyl uiteinde van PSA, veranderingen teweeg brengen in de conformatie van het proteïne
en PSA enzymatisch inactief maken. De rest van het PSA geïsoleerd uit semen plasma, geeft een
beperkte chymotrypsine activiteit bij een pH optimum van 7,8 (Lilja et al., 1992). Deze
chymotrypsine gelijkende activiteit van PSA is consistent met de primaire structuur van PSA en
met de PSA gemedieerde knippingen die gebeuren aan de carboxyl termini van bepaalde tyrosine
en leucine residu’s in het substraat semenogeline. Uiteindelijk kan men uit semen plasma vijf
isovormen van PSA zuiveren, twee intacte isoenzymen en drie geknipte vormen van PSA (Zhang
et al., 1995; Wang et al., 2000).
2.2.4 Enzymatische reacties van PSA
De algemeen aanvaarde enzymatische omzetting die onder invloed van PSA plaatsvindt, is de
digestie van de semenogelines (semenogeline I en II) en fibronectinen (Robert et al., 1997). Deze
biologische substraten zijn in heel hoge concentratie aanwezig in het semen plasma en PSA zorgt
voor de vervloeiing van de semen coagulum na de ejaculatie. Het semen coagulum bestaat voor
het grootste deel uit hoog moleculair gewichtsproteïnen of semenogelines. Het semen plasma
wordt aangemaakt door de semen vesikels in de prostaat. Dit PSA gemedieerd enzymatisch
proces heeft als biologische functie ervoor te zorgen dat de mobiliteit van de sperma cellen
drastische verhoogd wordt.
De karakteristieke proteolytische reactie wordt gekenmerkt door de katalytische triade,
opgebouwd uit de aminozuren histidine, aspartaat en serine in de actieve site. De katalytische site
regio bestaat uit de katalytische triade, residu’s die de oxyanion hole vormen en hoofdketen
substraat bindende residu’s. De substrate specificity pocket van PSA gelijkt op die van
chymotrypsine. Het residu aan de bodem van de substrate specificity pocket is hetzelfde in PSA
en chymotrypsine (Vihinen, 1994). Al de gekende serine protease structuren bestaan uit
29
structureel geconserveerde regio’s en variabele regio’s die de geconserveerde verbinden. De
structurele geconserveerde regio’s bevatten onder meer de katalytische triade. Het grote verschil
tussen serine proteasen onderling zijn de variabele regio’s, waarbij de oppervlaktelussen
verschillen in lengte. De katalytische residu’s zijn geconserveerd en de substraat specificiteit
wordt verkregen door verschillen in de substraat herkenning regio’s (Vihinen, 1994). De
katalytische site van zowel PSA als hK2 zijn zeer geconserveerd. De residu’s die de katalytische
triade vormen en diegene voor de oxyanion hole zijn heel geconserveerd. De knipplaatsen in
proteïnen, die substraat zijn van PSA, vertonen veel leucine en tyrosine residu’s. De sites voor
knipping werden geïdentificeerd als α-carboxyl uiteinden van enkel hydrofobe residu’s zoals
tyrosine, leucine, valine en fenylalanine en enkele basische residu’s zoals histidine, lysine en
arginine (Watt et al., 1986; Wu et al., 2000).
2.2.5 Interactie van PSA met protease inhibitoren
Een belangrijk aandeel van het gezuiverde PSA vanuit semen plasma en bloed serum is intern
geknipt en dus biologisch inactief. De aanwezigheid van verschillende protease inhibitoren in
semen plasma kan in verband staan met deze geknipte vorm. In de bloedcirculatie wordt de
proteolytische activiteit van PSA geïnhibeerd door vorming van irreversibele complexen met
serum protease inhibitoren specifiek voor serine proteasen, meer bepaald serpines (figuur 6). De
meest voorkomende serum protease inhibitoren waarmee PSA interageert zijn alpha-1-
antichymotrypsine (ACT) en alpha-2-macroglobuline (A2M) en alpha-1-protease inhibitor (API)
(Zhou et al., 1993; Christensson et al., 1990).
Fig. 6. Productie, secretie en interactie van PSA met inhibitoren A2M (of AMG) en ACT in de bloedcirculatie (naar
Belldegrum et al., 1998).
30
In het semen plasma zijn de grote immunoreactieve vormen van PSA, het PSA-ACT complex,
complex tussen PSA en proteïne C inhibitor en vrij PSA. 70% van het PSA in semen plasma
komt voor als een enkele polypeptide keten enzymatisch actief molecule, waar ongeveer 30%
geknipt is en geen enzymatische activiteit vertoont (Zhang et al., 1995). Omdat geen vrij protease
kan gedetecteerd worden in semen plasma bij een grote overmaat aan inhibitoren, zal de 30 kDa
vorm van PSA ofwel een pro-enzym zijn ofwel een geïnactiveerde vorm. Afhankelijk van het
knipping patroon in de polypeptide hoofdketen, kan het PSA een partiële enzymatische activiteit
behouden.
De binding van proteasen met A2M wordt veroorzaakt door een capture mechanisme, waarbij de
actieve proteasen een peptide binding in de doelwit regio van de protease inhibitor knippen.
Hierdoor verandert de conformatie van de inhibitor en omgeeft zo het protease (Lilja et al.,
1991). Op basis van het gegeven dat A2M verschillende vormen van PSA snel en efficiënt kan
binden, is het mogelijk dat A2M een belangrijke rol in het metabolisme van PSA speelt. Het
complexeren van PSA met A2M resulteert in een compleet verlies van de antigenische epitopen
van PSA (Leinonen et al., 1997). In geval van complex vorming van PSA met ACT blijven een
beperkt aantal epitopen vrij op het PSA.
De 80 tot 90 kDa grote entiteit van PSA in complex met ACT is de predominante moleculaire
vorm in serum. De kleinere moleculaire vorm van serum PSA is de ongeveer 30 kDa fractie die
niet bindt met een protease inhibitor (Lilja et al., 1992). Een heel klein deel van PSA in serum is
ook gecomplexeerd met API. Omdat de structuren van API en ACT zo verschillend zijn, is het
mogelijk dat de bindende epitopen van PSA in het PSA-API complex, verschillen van die van het
PSA-ACT complex (Zhang et al., 1999). Het ACT is één van de grote lever-gesecreteerde
protease inhibitoren in het bloed (Christensson et al., 1993).
Het PSA gebonden met ACT start pas met dissociëren na een lange incubatie tijd (10 dagen) bij
37°C (Leinonen et al., 1996). Gevormd aan een molaire verhouding van 1:1, zijn de inhibitor
complexen tussen PSA en ACT in vitro heel stabiel. De stabiliteit kan verhoogd worden door de
incubatie buffer een pH te geven tussen 6,8 en 7,4 en door een 100 tot 1000 molaire overmaat aan
ACT toe te voegen. De PSA-inhibitor complexen zijn extreem stabiel onder de meeste condities.
Het vrije PSA is stabiel gedurende vier weken bij incubatie bij 35°C (Pettersson et al., 1995).
31
Er werd geen correlatie gevonden tussen de mate van uitdrukking van ACT en de proportie van
PSA gecomplexeerd met ACT. De proportie van het ACT complex neemt toe bij verhoogde PSA
concentraties. Het complex tussen PSA en ACT is van covalente oorsprong. De covalente
binding gebeurt tussen het serine 189 residu van de actieve site van PSA en het leucine 360
residu van ACT. Bij alkalische pH waarden kan een hydrolytische breking van deze covalente
binding optreden. Nadat deze binding gebroken is, ondergaat ACT een grote conformationele
verandering, doordat bij breking van de leucine 360 – serine 361 peptide binding, het niet meer
kan binden aan enzymatisch actief PSA. Het vrijgemaakte PSA is evenwel enzymatisch actief in
een enkele polypeptide keten vorm en kan een nieuwe covalente binding aangaan met een andere
ACT molecule, indien deze molecule zich in functionele conformatie bevindt (Peter et al., 2000;
Pettersson et al., 1995).
2.2.6 Epitoop mapping van PSA
Antigenische determinanten als binding doelwitten van antilichamen kunnen opgedeeld worden
in twee categorieën: lineaire (sequentiële, continue) en niet-lineaire (conformationele,
discontinue). Lineaire epitopen bestaan uit aminozuur residu’s die elkaar opvolgen in de primaire
sequentie. Niet-lineaire epitopen worden opgebouwd uit aminozuur residu’s die van elkaar
verwijderd liggen in de primaire sequentie, maar bij elkaar gebracht worden als het proteïne zijn
natieve 3D vorm aanneemt (Corey et al., 1997).
Weinig is geweten over de antigenische determinanten van PSA die verantwoordelijk zijn voor
antilichaam herkenning. Toch zijn er zes grote antigenische regio’s ontdekt op PSA. De inhibitie
van PSA enzymatische activiteit en hindering van PSA-ACT associatie door monoklonale
antilichamen kan niet gebruikt worden om te voorspellen of deze monoklonale antilichamen
binden op vrij PSA, PSA-ACT complex of beide, want er bestaan meerdere vormen van vrij PSA
in bloedserum: nicked (inactief) PSA en actief PSA (Stenman et al., 1991). Sommige
monoklonale antilichamen kunnen de PSA-ACT associatie blokkeren, door periferale occlusie
van de binding site of door inductie van conformationele veranderingen in PSA (Corey et al.,
1997). Een onafhankelijke methode om de karakterisering van de binding doelwitten van de anti-
PSA monoklonale antilichamen te bestuderen is het effect na te gaan op de enzymatische
activiteit van PSA. Deze activiteit is essentieel voor de vorming van PSA-ACT complex, wat
impliceert dat antilichamen, die de activiteit van PSA beïnvloeden, geassocieerd kunnen worden
32
met de epitopen nabij de ACT binding site. Deze welbepaalde epitopen kunnen leiden tot de
mogelijkheid om vrij PSA te detecteren ten opzichte van het complex.
Van de zes antigenische regio’s van PSA, worden er vier herkend door monoklonale antilichamen
in vrij PSA en PSA-ACT. Eén antigenische regio is niet bereikbaar in PSA-ACT en één regio
associeert met antilichamen die een sterke voorkeur hebben voor vrij PSA (Corey et al., 1997).
Deze regio voor het vrije PSA bestaat uit de kallikrein lus: residu’s 84 tot 91 (Michel et al.,
1999). De antilichamen die alleen aan het vrij PSA binden, worden verwacht van de ACT-PSA
associatie te inhiberen. Omdat PSA enzymatische activiteit nodig is voor de ACT binding, zou dit
fenomeen eerst te wijten zijn aan de sterische hindering van de ACT binding pocket of aan
conformationele wijzigingen van het PSA door de interactie met het antilichaam. De associatie
van verscheidene monoklonale antilichamen verhinderen de ACT binding op PSA, en toch
kunnen deze antilichamen het PSA-ACT complex binden. Dit wijst erop dat de eisen voor ACT
associatie, een juist opgevouwen actieve site, strikter zijn dan voor de binding van de
monoklonale antilichamen (Corey et al., 1997).
2.2.7 Mogelijke diagnostische testen
Bij prostaatkanker dringt PSA in de bloedcirculatie, wat leidt tot een hogere PSA concentratie in
het bloed. Hierdoor kan een meting van de hoeveelheid serum PSA een belangrijke merker zijn
voor de diagnose en behandeling van prostaatkanker. De PSA concentratie in het serum verhoogt
bij kwaadaardige vorm van prostaat kanker (PCa), alsook in patiënten met bacteriële prostatitis of
de goedaardige vorm van prostaat kanker: benign prostatic hyperplasia (BPH). Ook de zymogen
vorm van PSA wordt gevonden in het serum van prostaatkankerpatiënten. Omdat het zymogen
niet actief is, kan het geen complexen aangaan met serpines en blijft dus in vrije vorm in de
bloedcirculatie (Nurmikko et al., 2000). Verschillende onderzoekers gebruiken een serum PSA
waarde groter dan 4,0 ng/ml door de Hydritech Tandem test en/of een abnormale digitaal rectaal
onderzoek als een criterium voor mogelijke aanwezigheid van prostaatkanker (Catalona et al.,
1991). Maar er zijn echter ook significante problemen bij het gebruik van serum PSA metingen
als een screening hulpmiddel. Het blijkt dat ongeveer 20% van de klinisch significante kankers
worden geassocieerd met PSA waarden in de normale fysiologische range. Daarenboven wijzen
verscheidene studies op het feit dat patiënten met BPH ook verhogingen van serum PSA
vertonen. Deze nadelen beperken evenwel de efficiëntie van PSA alleen als screening hulpmiddel
in de strijd tegen prostaatkanker. De sensitiviteit van serum PSA metingen wordt gedefinieerd als
33
het percentage van de patiënten met prostaat kanker (PCa) die PSA waarden hebben, die boven
de beslissingswaarde liggen. De specificiteit van serum PSA metingen wordt echter gedefinieerd
als het percentage van de patiënten welke PSA waarden hebben die lager liggen dan of gelijk zijn
aan de beslissingswaarde (Chan et al., 1987). De sensitiviteit van PSA is relatief hoog, maar de
specificiteit is laag, zodat een verhoogde PSA waarde niet al de patiënten met prostaatkanker
identificeert met een voldoende graad van selectiviteit. De kans bestaat eveneens dat een patiënt
met BPH, gezien wordt als PCa patiënt.
2.2.8 Verbeterde diagnostische testen
Om een verbeterd gebruik van PSA als indicator van prostaat kanker aan te wenden, zijn
verschillende strategieën naar voren gebracht.Vele studies suggereren dat de ratio van serum PSA
tot prostaat klier volume (PSA index of densiteit) een waarde heeft als indicator van mogelijke
kwaadaardige prostaatkanker. Andere data ondersteunen de seriële metingen van serum PSA als
een diagnostische test. Ook de snelheid van aangroei van de serum PSA waarde (PSA velocity)
kan gezien worden als een sensitieve indicator van kwaadaardigheid van de prostaatkanker over
een periode van verschillende jaren. Een recente ontwikkeling in prostaatkanker diagnostische
tests op basis van serum PSA, is gevonden bij het vergelijken van de vrije versus totale
hoeveelheid PSA in het serum. Omdat PSA eveneens is gevonden bij gezonde mannen zonder
prostaatkanker, bestaat de moeilijkheid in het gebruik van deze tumormerker bij het definiëren
van de normale waarden van serum PSA.
Een verhoogde lekkage van PSA naar de bloedcirculatie, blijkt de oorzaak te zijn van de meeste
PSA verhogingen bij prostaataandoeningen. Andere factoren, naast kwaadaardige prostaatkanker,
die zorgen voor een verhoging van serum PSA zijn BPH, trauma en ontsteking van de prostaat.
Met de bedoeling van een verhoogde PSA meting te definiëren, werd een normale PSA
distributie voor mannen zonder prostaat aandoeningen gedetermineerd door gebruik te maken van
de Tandem-R test (Hybritech, San Fransisco, CA, USA). De specificiteit van een test is van heel
groot belang omdat een hogere waarde betekent dat er drastisch minder biopsieën moeten verricht
worden onder mannen met een verhoogde serum PSA drempel, maar toch geen kwaadaardige
prostaat kanker (PCa) vertonen.
Vier methode zijn bekend om de specificiteit van PSA tests naar prostaatkanker te verbeteren
(Belldegrum et al., 1998).
34
1. PSA densiteit (PSAD) wordt gedefinieerd als de ratio van serum PSA tot het volume van
de prostaatklier. Omdat prostaatkankercellen meer PSA in de circulatie sturen dan
hyperplastische cellen, kan het begrijpelijk zijn dat, als een patiënt PSA waarden heeft
boven deze die verwacht worden bij een hyperplastische klier van dezelfde grootte, het
verschil kan gemaakt worden tussen PCa en BPH.
2. Een andere manier om de specificiteit te verbeteren is het meten van de PSA velocity.
Men gelooft dat de prostaatgroeisnelheid kan opgevolgd worden door jaarlijkse PSA
waarden en dat bij incidentie van prostaatkanker een substantiële verhoging kan
waargenomen worden. Echter wegens de op dagelijkse basis fluctuerende PSA waarden,
door biologische en analytische variaties, mislukt het gebruik van metingen van de PSA
velocity om te specificiteit van PSA testen te verbeteren.
3. De volgende wijze om prostaatkankerdetectie te vergemakkelijken is het aanwenden van
leeftijd specifieke PSA referentie waarden. Ze zijn gebaseerd op het feit dat de PSA
waarden verhogen met de leeftijd en dat de PSA drempelwaarde specifieker is voor elke
leeftijdscategorie. Maar eens te meer tonen niet alle uitgevoerde studies het voordeel aan
van leeftijd specifieke drempelwaarden doorheen alle leeftijdsgroepen.
4. De meest verheugende vooruitgang in het onderzoek naar prostaatkanker is de ontdekking
van verschillende vormen van PSA. Er werden sterke aanwijzingen gevonden dat er een
correlatie bestaat tussen de gecomplexeerde vorm van PSA en prostaatkanker. Door een
gebrek aan ACT productie in BPH, kan dit leiden tot de verhoogde vorming van PSA-
ACT complex bij de prostaatkankerpatiënten. Het verklaart natuurlijk ook de verschillen
in hoeveelheid vrij PSA tussen BHP en PCa.
Voor de studie van PSA in serum zijn er drie testen ontwikkeld (Christensson, 1993). Een eerste
(T) test detecteert de epitopen van PSA, die beschikbaar zijn zowel op vrij PSA als op PSA dat
complexen vormt met protease inhibitoren, zoals ACT.
Fig. 7. De T test detecteert de totale hoeveelheid PSA in een staal.
Een tweede (C) test is er één die enkel PSA detecteert onder de vorm van complex met ACT.
35
Fig. 8. De C test detecteert enkel het PSA dat gecomplexeerd is met ACT.
De laatste (F) test zal enkel het PSA detecteren dat geen complex kan vormen.
Fig. 9. De F test detecteert enkel het vrije PSA in het staal.
Door deze drie testen te gebruiken in de meting van de verschillende vormen van PSA in het
serum, werd nu duidelijk dat de proportie van PSA-ACT complex hoger is in patiënten met PCa
dan in BHP (Christensson et al., 1993; Lilja et al., 1992; Stenman et al., 1991). De concentratie
van vrij PSA, dat geen complex vormt, is lager in patiënten met PCa dan die patiënten met BHP.
Een betere discriminatie kan verkregen worden door de ratio vrij PSA tot totaal PSA te gebruiken
in plaats van de ratio gecomplexeerd PSA tot totaal PSA (Pettersson et al., 1995). De standaard
voor PCa patiënten is 90% PSA-ACT en 10% vrij PSA. De ratio van deze verschillende vormen
van PSA, die zijn gevonden in serum, is representatief voor patiënten met prostaatkanker
(Rafferty et al., 2000). De verlaagde ratio van vrij PSA tot totaal PSA in het serum van
prostaatkankerpatiënten kan veroorzaakt worden door verschillende processen op het cellulaire
niveau (Jung et al., 2000):
(a) een veranderde synthese van ACT in neoplastische cellen, vergeleken met goedaardige
cellen. Deze leidt tot een verhoogde vorming van PSA-ACT complex reeds vroeg in
kwaadaardige cellen, juist voor de vrijlating in de bloedcirculatie
(b) het vrijmaken van verschillende proporties van enzymatische inactieve PSA vormen, die
op een verschillende wijze reageren met ACT in de bloedcirculatie
36
(c) de veranderde glycosylatiegraad van PSA in neoplastische cellen, leidend tot
karakteristieke verschillen in de verwijdering van PSA isovormen uit het bloed.
2.2.9 Laatste ontwikkelingen
De laatste jaren zijn er studies gemaakt naar het examineren van het ejaculaat om een meer
specifieke en minder ingrijpende methode voor opsporing en karakterisering van prostaatkanker
te vinden. De basis van de studie is de veronderstelling dat van alle mogelijk onderzochte
weefsels en vloeistoffen, de inhoud van het ejaculaat het best de cellulaire disfunctie van de
prostaatklier kan reflecteren (Clements et al., 2000). Op gelijkaardige manier dat de ratio van vrij
PSA tot totaal PSA in serum een gemakkelijke manier is om te differentiëren tussen goedaardige
(BPH) en kwaadaardige (PCa) vorm van prostaatkanker, moet er ook een gelijkaardige correlatie
bestaan in het ejaculaat supernatans. Het ejaculaat of semen plasma werd over het algemeen niet
beschouwd als een mogelijke bron van selectieve merkers voor prostaataandoeningen. Alhoewel
de veranderingen in serum PSA bij prostaatziekten gecorreleerd kunnen worden met een
verandering in lekkage in de bloed circulatie door afbraak van de prostaat cel architectuur. Er
wordt verwacht dat de waarden van PSA in semen plasma lager zijn bij mannen met een
kwaadaardige prostaatziekte. Telkens komt men het probleem tegen dat de ratio van vrij PSA tot
totaal PSA in semen plasma of bloed serum afhankelijk is van de leeftijd van de persoon in
kwestie. Een ander probleem is dat de vrije, geknipte vormen van PSA in serum misschien op een
verschillende manier wordt herkend in de PSA tests. Het blijkt echter dat er ook verschillen zijn
in de waarden van geknipte vormen van PSA, aanwezig in het serum van mannen met BHP of
PCa. Het ejaculaat kan dus ook als een potentiële indicator gebruikt worden van urogenitale
ziekten. Metingen van serum PSA bieden verschillende voordelen: economisch haalbaar,
makkelijk uitvoerbaar, gemakkelijk aanvaard door de patiënt en objectieve resultaten.
2.3 DoelstellingWe hebben tot doel kameel antilichaam fragmenten af te zonderen tegen het prostaat-specifiek
antigen. Door middel van kameel immunisering met een halfgezuiverde PSA mengsel, kan men,
na verschillende PCR reacties, de VHH genen kloneren in een fagmide vector. Na verschillende
ronden van in vitro selectie (panning), kunnen verschillende PSA specifieke kameel antilichamen
fragmenten geïdentificeerd worden. Om een mogelijke prostaatkanker test te produceren, moeten
er zeker twee verschillende kameel antilichaam fragmenten gevonden worden: één VHH die een
epitoop herkent op totaal PSA (som van oplosbaar vrij PSA en PSA-ACT complex) en één VHH
37
die enkel een epitoop op vrij PSA detecteert of één VHH die enkel het PSA-ACT complex
herkent. Het epitoop voor herkenning van totaal PSA is een epitoop dat niet te dicht gelegen is bij
de actieve site van PSA, want complex vorming van PSA met ACT zal zorgen voor een
blokkering van de actieve site van PSA. Voor de detectie van alleen het oplosbare vrije PSA zal
best een VHH afgezonderd worden, die een epitoop van PSA herkent, dat ligt in de buurt van de
actieve site van PSA en niet kan herkent worden als ACT gebonden is op PSA. Een epitoop om
enkel gecomplexeerd PSA te detecteren, zal overeenkomen met het zoeken naar een VHH die
bindt op PSA-ACT. Een andere vereiste voor een prostaatkanker test, is de mogelijkheid van de
kameel antilichaam fragmenten om met een voldoende hoge affiniteit en specificiteit het vrije
PSA en/of het gecomplexeerde PSA uit een bloed- of semenstaal te vangen.
38
3 Materiaal en methoden
3.1 Micro-organismen (Escherichia coli)
De volgende 2 E.coli stammen werden gebruikt:
E.coli TG1 (Sambrook & Russell, 1989)
K12, ∆(lac-pro), supE, this, hsdD5/F’traD36, proA+B+, laclq, lacZ∆M15
E.coli WK6
∆(lac-proAB), galE, StrA/F’, laclq, lacZ∆M15, proA+B+
3.2 Media en Buffers
LB medium (Luria-Bertani medium, pH 7,0)
Bacto-tryptone 10 g
Bacto-yeast extract 5 g
NaCl 10 g
H2O tot 1 liter eindvolume
2x TY medium (pH 7,0)
Bacto-tryptone 16 g
Bacto-yeast extract 10 g
NaCl 5 g
H2O tot 1 liter eindvolume
TB (Terrific Broth)
Bacto-tryptone 12 g
Bacto-yeast extract 24 g
Glycerol 4 ml
KH2PO4 2,31 g
K2HPO4 12,54 g
H2O tot 1 liter eindvolume
SOB
Bacto-tryptone 20 g
Bacto-yeast extract 5 g
NaCl 0,5 g
KCl 1,86 g
39
H2O tot 1 liter eindvolume
PBS
136 mM NaCl
2,6 mM KCl
10 mM Na2HPO4
1,5 mM NaH2PO4 (pH 7,4)
PBS-caseïne
PBS + 1% (w/v) caseïne
PBST
PBS + 0,05% (v/v) ‘Tween 20’
TE
10mM Tris-HCl (pH 8,0)
1 mM EDTA (pH 8,0)
Tris-Glycine
50mM Tris
0,38% Glycine
0,1% SDS
TES
0,2 M Tris-HCl (pH 8,0)
0,5 mM EDTA
0,5 M sucrose
10x TBE
108 g Tris
55 g boorzuur
9,3 g EDTA
H2O tot 1 liter eindvolume
DNA loading buffer
0,25% bromofenol blauw
0,25% xyleen cyanol FF
15% Ficoll (Type 400, Pharmacia)
in H2O
10x Laemmli buffer (pH 8,3)
30,3 g Tris
144 g glycine
40
10 g SDS
H2O tot 1 liter eindvolume
Protein loading buffer
7 ml 0,5 M Tris (pH 6,8)
3 ml 100% glycerol
1 g SDS
1,2 mg bromofenol blauw
Staining solution (kleuren SDS-PAGE)
0,125 g Coomassie R250
50% methanol
10% azijnzuur
H2O tot 100 ml eindvolume
Destaining solution (ontkleuren SDS-PAGE)
100 ml 100% azijnzuur
400 ml methanol
500 ml H2O
Transfer buffer
14,4 g glycine
3 g Tris
200 ml methanol
H2O tot 1 liter eindvolume
Blot/ELISA buffer (pH 9,8)
1 M diethanolamine
1mM MgSO4
PEG oplossing
20% PEG
2,5 M NaCl
1x ABTS
450 ml 50 mM citroenzuur (pH 4,0)
100 mg ABTS
Amp 1000x stockoplossing = 100 mg/ml opgelost in 70% ethanol
Kan 1000x stockoplossing = 70 mg/ml opgelost in H2O
IPTG 1 M in H2O opgelost
41
3.3 Plasmiden en vectoren
Alle gebruikte vectoren beschikken over het gen voor ampicilline resistentie. Elke incubatie van
E.coli cellen gebeurt met gebruik van ampicilline in het medium.
3.3.1 pHEN4
--TTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGC
79 SfiI NcoI
CCAGGTGCAGCTGCAGGAGCTCGAGGATCCGGTCACCGTCTCCAGCGGCCGC
Pst XhoI NotI/EagI
TACCCGTACGACGTTCCGGACTACGGTTCCGGCCGAGCATAG ACTGTTG---
--------------------------Dec-tag-------------------------- EagI amber
Fig. 10. pHEN4 vector. Relevante genen, regio’s en restrictie enzym sites zijn weergegeven. Daaronder een
voorstelling van de multiple cloning site van de vector (positie 79 tot 204), met de polylinker en een decapeptide tag
(haemaglutinine tag). Belangrijke restrictie enzym sites zijn onderlijnd.
42
De pHEN4 vector heeft een PelB signaal sequentie om te zorgen dat het VHH fragment naar het
periplasma getransporteerd wordt. Achter het VHH fragment is een haemaglutinine tag die
detectie in ELISA en Western Blot mogelijk maakt. Deze tag wordt gevolgd door het gen3, dat
zorgt voor de aanmaak van het fusie eiwit VHH-gen3p. Deze fagmide vector is geschikt voor de
pannings. Tussen de tag en het gen3 zit een amber stopcodon (TAG) dat in een suppressor E.coli
stam (zoals TG1) partieel gesuppresseerd wordt.
3.3.2 pHEN6
---GACGTGCAGCTGCAGGCG ----------//---------- CAGGTCACCGTCTCCTCA
95 BstEII 484
------------------------------------------cAbPSA11----------------------------------------------
CGCGGCCGCCACCACCATCACCATCAC TAA TAGAATTC---
--------------His6-tag--------------ochre amber
Fig. 11. pHEN6-cAbPSA11. Relevante genen, regio’s en restrictie enzym sites zijn weergegeven. Daaronder een
deel van de sequentie met de BstEII site en de His6-tag.
43
Deze vector is grotendeels gelijkend aan de vector pHEN4, maar de haemaglutinine tag en de
gen3 sequentie zijn vervangen door een His6-tag. Deze vector wordt gebruikt voor eenvoudige
productie en snelle zuivering van VHH’s als oplosbaar eiwit door IMAC.
3.3.3 pHEN7
--TTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGCTCGAGGA
79 SfiI NcoI PstI XhoI
TCCGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACTCGGCCGC
NotI --------------His6-tag-------------
AGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCCGCATAGACTGTT--
-------------------------------c-myc-tag------------------------------------------amber 236
Fig. 12. pHEN7 vector. Relevante genen, regio’s en restrictie enzym sites zijn weergegeven. Daaronder, een deel van
de sequentie van de vector (positie 79 tot 236), met de polylinker en de twee tags (hexahistidine en c-myc). Restrictie
enzym sites zijn onderlijnd.
44
De pHEN7 vector heeft de eigenschappen van de vorige vectoren. Het bezit een His6- en c-myc-
tag alsook het gen3 voor gebruik in panning.
3.4 PrimersTabel 1. Alle gebruikte PCR primers voor de amplificatie van de VHH genen. De restrictie enzym sites zijn
onderlijnd.
Primer naam Nucleotidensequentie 5’-3’
Call001 GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG
Call002 GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC
SM017 CCAGCCGGCCATGGCTGATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG
NcoI
SM018 CCAGCCGGCCATGGCTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG
NcoI
A4Short CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGC
SfiI NcoI
FR4FOR = 38 GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT
NotI BstEII
3.5 PCR reactie
Met behulp van een PCR reactie kan men via specifieke primers een gewenst stuk van een DNA
sequentie amplifiëren om dan in verdere manipulaties te gebruiken.
Praktische uitvoering
De PCR reacties werden uitgevoerd volgens de instructies van de enzym leverancier. PCR reactie
mengsel met DNA primer 1 en 2:
− 1 tot 10 ng template DNA (dit is meestal 1 tot 2 µl)
− 5 µl 10x PCR buffer
− 1 tot 2 µl primer 1 (20 µM)
− 1 tot 2 µl primer 2 (20 µM)
− 0,2 tot 1 µl Taq DNA polymerase (als laatste toevoegen)
− 1 µl dNTP (20 mM)
− aanlengen met H2O tot 50 µl
45
Bij elke uitvoering van een PCR werd een negatieve controle toegevoegd, om mogelijke
contaminaties na te gaan bij het bereiden van het PCR reactie mengsel.
Het volgende standaard programma kan algemeen gebruikt worden:
5’ op 94°C
25 tot 30 cycli van:
− 20’’ tot 1’ op 94°C
− 20’’ tot 1’ op 50 tot 58°C
− 20’’ tot 1’ op 72°C
7’ tot 10’ op 72°C
3.6 Kolonie PCR en fingerprinting
Een snelle manier om de kolonies met de juiste VHH fragment insert te detecteren is via de zeer
gevoelige PCR techniek. Via de specifiek aangepaste primers kan men uit de cellen selectief
screenen voor het gewenste fragment. Voor de kolonie PCR om VHH fragmenten te screenen
werden de primers A4Short en 38 gebruikt. Om identieke of verschillende amplificatie producten
te onderscheiden werd een fingerprinting uitgevoerd door restrictie enzym digestie.
Praktische uitvoering
Aan de PCR tube werd een op een tip geprikte kolonie toegevoegd. Goed mengen en roeren van
de tip in de PCR tube. Het standaard PCR programma is zoals bovenstaand weergegeven, met de
tijdsduur van de cycli stappen op 25’’ en de annealing temperatuur op 58°C. Na het uitvoeren
van de PCR, werd aan elke 50 µl PCR tube de benodigde restrictie enzymen toegevoegd:
− 1 µl HinfI (10 U/µl)
− 6 µl 10x restrictie enzym buffer
De restrictie reactie werd geïncubeerd bij 37°C voor minstens één uur. Dit restrictie mengsel
werd op een 2% agarose-1000 gel geladen om het restrictiepatroon te fingerprinten.
3.7 DNA agarose gels
Onder invloed van een elektrisch veld worden de DNA moleculen op basis van hun lengte
gezeefd doorheen de agarose gel. Deze methode is zeer hulpzaam en snel tijdens
kloneringtechnieken en laat toe om op een efficiënte en snelle manier te bepalen of het gewenste
plasmide al dan niet is opgenomen door de bacterie of om te zien of een PCR reactie al dan niet
het correcte fragment heeft geamplifieerd.
46
Praktische uitvoering
Voor scheiding van fragmenten groter dan 200 bp en maximum 1,5 kbp, werd een scheiding op
1% agarose gel in 1x TBE buffer verricht. Voor de detectie van DNA werd ethidiumbromide
gebruikt, aan ongeveer een concentratie van 0,2 µg/ml in de agarose gel. Bij de scheiding werd
een voltage van 100 tot 150 V aangewend. Om fragmenten met een lengte kleiner dan 200 bp te
scheiden (fingerprinting) werd een 2% agarose-1000 gel gebruikt. Als basenpaar merker werd
gebruik gemaakt van de Smartladder (Eurogentec) die tevens de mogelijkheid verschaft om de
concentratie of hoeveelheid van het DNA op gel te bepalen.
Bij elke agarose gel wordt de volgende basepaar merker (Smartladder van Eurogentec)
toegevoegd. Het aantal baseparen wordt samen met de hoeveelheid weergegeven.
3.8 DNA digestie
Om een DNA fragment in een plasmide te kloneren dienen beide allereerst gedigereerd te worden
met de gepaste restrictie enzymen. Om een fragment uit een vector te halen, wordt er geknipt met
restrictie enzymen die het fragment flankeren.
Praktische uitvoering
Alle restrictie enzym reacties werden uitgevoerd volgens de instructies van de enzym leverancier.
Aan 100 ng tot 1 µg DNA template DNA werd het volgende toegevoegd:
− 1 µl restrictie enzym (dit is 10 U)
− 1/10 volume van totale reactiemengsel 10x restrictie enzym buffer
De rest van het mengsel werd aangelengd met H2O. De restrictie werd gedaan voor minstens 1
uur bij de optimale werkingstemperatuur van het welbepaalde restrictie enzym. Afhankelijk van
de hoeveelheid te knippen DNA werd het reactie mengsel langer geïncubeerd. Als een vector
47
werd gedigereerd dan diende deze gezuiverd te worden na digestie. De band met de gepaste
lengte werd uit de gel gesneden en het vector DNA werd door middel van de JetSorb kit
(Genomed) uit de agarose gel gezuiverd. Voor de pHEN4/pHEN7 - pHEN6 herklonering stap
werden de enzymen NcoI en BstEII gebruikt om zowel de VHH PCR fragmenten als pHEN6
vector te digereren. De restrictie werd uitgevoerd overnacht. Een zuiveringstap werd gedaan aan
de hand van de Qiagen PCR Purification kit en protocol. Het digestie mengsel kan desgewenst
gestockeerd worden op –20°C voordat de zuivering van het fragment of vector kan beginnen.
3.9 Zuivering van DNA fragment uit agarose gel
Praktische uitvoering
Jetsorb Kit (Genomed) zuivering werd gedaan volgens bijgeleverd protocol van de leverancier.
3.10 Ligatie van DNA fragment met vector of plasmide enzuivering/ontzouting
Om twee of meerdere fragmenten DNA met elkaar te verbinden wordt het T4 DNA ligase enzym
toegevoegd om de compatibele uiteinden met elkaar te verbinden. Men dient wel rekening te
houden met de aard van de uiteinden van de fragmenten, want sticky-sticky ligatie zal
verschillend verlopen dan een blunt-blunt ligatie. Ook kunnen de verhoudingen van fragment tot
vector verschillen om een efficiënte ligatie te verkrijgen.
Praktische uitvoering
Voor een herklonering ligatie werd de ligatie reactie uitgevoerd in een volume van 50 µl met
daarin 5 µl T4 DNA ligase en 5 µl 10x ligase buffer, voor een bibliotheek ligatie werd gewerkt
met volumes tot 500 µl. De rest van het ligatie mengsel bevat de vector en de fragmenten en H2O
om tot het juiste eindvolume te komen. De ligatie reactie voor een herklonering werd gedaan bij
kamertemperatuur voor minstens één uur, echter bij een ligatie voor het maken van een
bibliotheek werd de reactie gedaan overnacht bij 16°C. Om het ligase enzym te inactiveren, werd
het reactie mengsel eerst voor een tiental minuten opgewarmd bij 65°C, zodanig dat het ligase
enzym niet kan tussenkomen in de volgende stappen van de ligatie. Aan het geïnactiveerde ligatie
mengsel werd voor zuivering éénzelfde volume fenol/chloroform (1/1) toegevoegd en dit werd
voor 30’’ gevortext. Na een korte centrifugatie van 1’ bij 13000 rpm stelde het fasenevenwicht
zich in: het geligeerde DNA bevond zich in de bovenste fase. Om de daaropvolgende
transformatie te laten verlopen met een maximale transformatie efficiëntie werd het ligatie
48
mengsel eerst gezuiverd om alle contaminerende zouten te verwijderen. Dit werd verricht via
gebruik van de QiaQuick PCR Purification Kit van Qiagen.
3.11 Plasmide transformatie in E.coli cellen
Het gezuiverde DNA, plasmide of vector, kan via electroporatie in competente E.coli cellen
getransformeerd worden om het gewenste proteïne aan te maken. Het gezuiverde DNA kan
afkomstig zijn van een plasmide preparatie of van een bibliotheek ligatie.
Praktische uitvoering
Juist voor gebruik bij transformatie werd SOC milieu aangemaakt:
25 ml SOB milieu met:
− 0,4% glucose oplossing
− 10 mM MgSO4
− 10 mM MgCl2
Het te transformeren DNA wordt in H2O opgelost, aan een maximaal volume, dat 1/10 is van het
celsuspensievolume. Het reactiemengsel werd overgebracht naar een 1 mm electroporatiecuvet en
de electroporatie werd verricht in een electroporatie toestel (Bio-Rad). Het voltage voor de
electroporatie was 1,8 kV. Meteen na de electroporatie werd 1 ml SOC milieu toegevoegd en
geïncubeerd bij 37°C voor minstens één uur. Bij het gebruik van puur plasmide vanuit een
plasmide preparatie werden er verdunningen uitgeplaat, bij niet zuiver plasmide of ligatie
mengsel, werd geen verdunning uitgeplaat. Van het reactiemengsel werd 100 tot 150 µl uit op
geschikte antibiotica platen en overnacht geïncubeerd bij 37°C.
3.12 Expressie test, maken van periplasmatisch extract
Om te screenen of er duidelijke expressie is van VHH fragmenten specifiek voor het antigen, kan
een kleine expressie test verricht worden, met als voordeel een heel snelle screening van een
groot aantal kolonies. Alle expressievectoren bevatten de PelB signaal sequentie zodanig dat het
recombinant proteïne na expressie getransporteerd wordt naar het periplasma. Om de proteïnen
uit dit periplasma te krijgen, moet men een osmotische shock geven, zodat de buiten membraan
permeabel wordt en de periplasmatische proteïnen in het supernatans lekken. Deze osmotische
shock is mild om niet de hele bacteriële celwand te breken en alle mogelijke bacteriële
cytosolische proteïnen in het supernatans te verkrijgen. Het extract kan gebruikt worden voor
detectie van het proteïne in Western Blot en detectie in ELISA.
49
Praktische uitvoering
Het maken van het periplasmatisch extract werd gedaan volgens Skerra & Plückthun (1988).
− 10 ml TB medium, met juiste antibiotica, incuberen met afzonderlijke kolonie of
bacteriën uit een glycerol stock.
− Bij 37°C al schuddend incuberen tot een OD600nm tussen de 0,3 en 0,5 bereikt wordt en
dan de cultuur induceren door toevoegen van 1 M IPTG tot een eindconcentratie van 1
mM.
− Productie van VHH fragmenten werd gedaan overnacht bij 37°C.
− Cellen afcentrifugeren aan 3000 tot 4000 rpm voor 5’ tot 10’.
− Bacterieel pellet resuspenderen in 200 tot 300 µl (= 1 volume) TES en voor 20’ op ijs
incuberen.
− 300 tot 450 µl (= 1,5 volume) TES/4 toevoegen en incuberen op ijs voor 30’.
− Centrifugatie aan 13000 rpm voor 20’.
Het supernatans bevat de periplasmatische proteïnen, waarin de periplasmatische eiwitten zitten,
en is klaar voor verdere experimenten.
3.13 DNA Miniprep protocol
De uitvoering van de plasmide bereidingen werd gedaan volgens de instructies in de
handleidingen van de kits (Qiagen Qiaquick).
Praktische uitvoering
− 10 ml LB milieu, met het juiste antibiotica, incuberen met juiste kolonie.
− Overnacht schuddend incuberen bij 37°C.
− Culturen afcentrifugeren bij 3000 tot 4000 rpm voor 10’.
− Nu werd het Qiaprep Miniprep Kit protocol gevolgd.
− DNA precipitatie: 1/10 volume 3 M NaAcetaat toevoegen, samen met 2 volumes
100% ethanol.
− Mengsel minstens 20’ incuberen op –80°C of ten minste één uur bij –20°C.
− Centrifugatie bij 13000 rpm voor 20’.
− Pellet wassen met 300 µl 70% ethanol en drogen op 37°C.
Gedroogd pellet resuspenderen in 20 µl H2O of TE.
50
3.14 SDS-PAGE
Detectie van een proteïne uit een mengsel of bepaling van de zuiverheid van een bepaald proteïne
in een mengsel kan gedaan worden via SDS-PAGE. De scheiding is gebaseerd op basis van het
moleculair gewicht van het proteïne en op basis van de lading. Het principe is dat de proteïnen
gedenatureerd worden door middel van de SDS dat zich rond de proteïnen gaat binden en een
nagenoeg uniforme negatieve lading geeft per eenheid van polypeptide lengte. Het mengsel wordt
onder invloed van een elektrisch veld gebracht waardoor de proteïnen door de acrylamide gel
migreren en waarbij de grootste proteïnen het traagste migreren. De proteïnen worden als het
ware door de gel getrokken die als een zeef fungeert. De mobiliteit van de meeste proteïnen onder
deze condities is lineair met het logaritme van hun moleculaire massa. Dit is een eenvoudige en
snelle methode die algemeen toegepast wordt. De proteïnen kunnen na elektroforese eenvoudig
gevisualiseerd worden door kleuring met Coomassie blauw. De methode hier gebruikt volgt
diegene beschreven door Laemmli (1970).
Praktische uitvoering
De volgende oplossingen zijn voor twee 12% SDS geltabs:
Running gel:
− 3,3 ml H2O
− 4 ml 30% Acryl/bis acrylamide (verhouding 29/1)
− 2,5 ml 1,5 M Tris pH 8,8
− 100 µl 10% SDS
− 100 µl 10% APS
− 5 µl Temed (crosslinker)
Stacking gel:
− 3,4 ml H2O
− 830 µl 30% Acryl/bis acrylamide (verhouding 29/1)
− 630 µl 1M Tris pH 6,8
− 50 µl 10% SDS
− 50 µl 10% APS
− 5 µl Temed
Eerst werd de running gel gegoten, ongeveer 4 ml per geltab. Als de running gel gepolymeriseerd
was, werd de stacking gel erop gegoten. Voor de proteïne benchmark (GibcoBRL) werd maar 5
µl geladen. Het voorbereiden van de proteïne stalen gebeurt door de stalen te koken met DTT of
mercaptoethanol en protein loading buffer voor de gereduceerde stalen of alleen met loading
51
buffer voor niet-gereduceerde stalen. De gel werd gelopen aan een voltage van 135 V in de
stacking gel en 180 V in de running gel. De gel kan dan gebruikt worden in een Coomassie
kleuring of een Western Blot.
Voor de Coomassie kleuring laten we de gel een 30’ incuberen in een Coomassie kleurstof,
daarna spoelen we met water en doen we destaining solution erbij, totdat de meestal blauwe
kleuring uit de gel is gediffuseerd en de gel doorzichtig wordt. De gel werd dan tussen 2 cellofaan
lagen gelegd en overnacht gedroogd.
Zowel voor SDS-PAGE als Western Blot wordt dezelfde MW merker gebruikt. De verschillende
MW’s worden weergegeven.
3.15 Western Blot
Bij de techniek van Western Blotting gaat men na of een band op de gewenste hoogte op de SGS-
PAGE gel wel degelijk het gewenste proteïne is. Men kan na transfer van de proteïnen naar een
nitrocellulose membraan onder invloed van een elektrische veld, het gewenste proteïne detecteren
door middel van antilichamen, gericht tegen één welbepaald epitoop van het proteïne, of van
polyklonale antilichamen, gericht tegen verschillende epitopen; het is evident dat polyklonale
antilichamen een hogere achtergrond zullen opleveren dan monoklonale antilichamen door
mogelijke kruisreacties. Men gaat dus het liefst gebruik maken van monoklonale antilichamen
indien ze beschikbaar zijn.
Praktische uitvoering
De Western Blots werden uitgevoerd in een semi-dry blotting machine, met de volgende
opstelling volgens het principe van de semi-dry blot. Alle filters en membraan werden eerst
natgemaakt in transfer buffer. Eerst werd een laag van 3 Whatman filter papiertjes gelegd als
52
onderlaag. Hierop werd het nitrocellulose membraan geplaatst, met de SDS-PAGE gel erop. Dit
werd afgedekt met een nieuwe reeks van 3 Whatman filter papiertjes. De blotting gebeurde voor
35’ aan 225 mA, het voltage mag maximum tot aan 60 V gaan, omdat anders de kans bestaat dat
de gel oververhit en de blotting mislukt. Het blotmembraan werd geïncubeerd in PBS+caseïne
overnacht, om alle open ruimte te volzetten met niet-significante proteïnes. Dit noemt de
overcoating. De wasbeurt, die toegepast werd tussen elke stap, bestaat uit vijfmaal spoelen met
PBS of PBST. De geblotte proteïnes werden dan gevisualiseerd door verschillende antilichamen
(aan een verdunning van 1/1000, zie resultaten) aan een incubatieperiode van telkens voor elk
antilichaam van één uur. De ontwikkeling in een blot buffer met 0,05 mg/ml BCIP (Sigma) en 0,2
mg/ml NBT (Sigma). De kleurreactie werd beëindigd door het reactiemengsel met H2O weg te
spoelen.
3.16 Immunisering van kameel
Door een kameel te immuniseren zal een humorale of antilichaam respons opgebouwd worden
tegen het subcutane ingespoten antigen. De periferale bloed lymfocyten moeten afgezonderd
worden om de VHH genfragmenten te kunnen kloneren.
Praktische uitvoering
Een kameel kreeg zesmaal een antigen dosis van 1 mg. Voor de eerste immunisering werd het
antigen gemengd in Compleet Freund’s Adjuvans, al de volgende boosts verder uitgevoerd in
Incompleet Freund’s Adjuvans. Na dit immunisering protocol, werd niet-gecoaguleerd bloed
verkregen van de kameel en hieruit werd lymfocyten bereid. De werkwijze ging volgens Uni-Sep
(WAK-Chemie, Duitsland). De cellen werden geteld en aliquots van 5x106 werden gepelleteerd
en bewaard op –80°C tot verder gebruik.
3.17 Fractionatie van IgG subklassen
Door de scheiding van de IgG subklassen kan men voor het maken van de bibliotheek een goed
beeld hebben van de respons van de antilichamen op het ingespoten antigen.
Praktische uitvoering
De scheiding van de IgG subklassen werd verricht door differentiële adsorptie op Hitrap-proteïne
A en Hitrap-proteïne G kolommen (Pharmacia). IgG3 en IgG1 subklassen werden geëlueerd van
een proteïne G kolom bij respectievelijk pH 3,5 met een acetaat buffer en pH 2,7 met een
glycine-HCl buffer (Hamers-Casterman et al., 1993). De flow-through werd geladen op een
53
proteïne A kolom, om de elutie van geabsorbeerde IgG2 subklasse te verrichten bij pH 3,5 met
een acetaat buffer. Voor de concentratie bepaling werd een spectrofotometrische meting gedaan
bij 280nm, waarbij ε1% gelijk is aan 13,5 voor alle IgG subklassen.
3.18 VHH bibliotheek constructie
De periferale bloed lymfocyten bevatten de genen voor de VHH fragmenten. mRNA wordt
afgezonderd en de VHH genfragmenten worden selectief geamplifieerd, na aanmaak van cDNA.
Nadien worden de VHH genfragmenten gekloneerd in een speciale vector (pHEN4 of pHEN7),
geschikt voor in vitro selectie door panning.
Praktische uitvoering
Het mRNA werd geïsoleerd vanuit de lymfocyten (Ready-to-go kit, Pharmacia) en cDNA werd
geprepareerd (Ready-to-go Beads, Pharmacia). Met de specifieke DNA primers Call001 en
Call002, die respectievelijk binden aan de leader nucleotidensequentie en op het CH2 exon
sequentie van de zware keten van de antilichamen, kon het genfragment geamplifieerd worden
dat codeert voor de variabele regio, eventueel het CH1 domein, hinge en deel van het CH2
domein van de zware keten van de antilichamen. Het juiste gen fragment, dat de VHH
fragmenten bevat, werd gescheiden van de andere gen fragmenten door scheiding in en zuivering
uit agarose gel. Een reamplificatie van de VHH gen fragmenten via een geneste PCR met primers
die annealen respectievelijk op FR1 en FR4, werd verricht met de primers SM017/018 (in
equimolaire hoeveelheid) en 38 voor de eerste van de twee geneste PCR reacties. Deze PCR gaf
fragmenten van ongeveer 420 bp weer. De tweede van de geneste PCR werd gedaan met de
primers A4Short en 38, die de restrictie sites NcoI en NotI bevatten. Bij deze PCR werden
fragmenten van ongeveer 400 bp verkregen. Met behulp van deze restrictie sites werden de finale
PCR producten gekloneerd in de pHEN4 vector volgens Ghahroudi (1997).
3.19 Panning en selectie van antigen bindende kameel antilichaamfragmenten
Door gebruik te maken van faag display, werden de VHH fragmenten uitgedrukt op de tip van de
fagen. Drie ronden in vitro selectie voor het antigen bij coating van 10 µg/well, werden verricht
om specifieke VHH fragmenten aan te rijken. Deze in vitro selectie techniek werd panning
genoemd (Smith & Petrenko, 1997).
Praktische uitvoering
54
Een aliquot van de bibliotheek met een grootte van 6x106 werd opgegroeid tot exponentiële fase
in 300 ml 2x TY medium, dat ampicilline en 1% glucose bevat. Aan de cellen werden M13K07
(KanR) helperfagen toegevoegd aan een concentratie van 1011 pfu/ml en dit mengsel werd aan
kamer temperatuur gehouden zonder te schudden voor een periode van 30 minuten. Vervolgens
werd kanamycine toegevoegd en de cultuur werd met hevig schudden geïncubeerd bij 37°C
overnacht. De volgende morgen werden de cellen gepelleteerd door centrifugatie voor 30’ aan
8000 rpm en aan het supernatans, dat de fagen bevat, werd 20% (v/v) PEG oplossing toegevoegd.
Dit mengsel werd een half uur op ijs geïncubeerd, waarna de geprecipiteerde fagen werden
afgecentrifugeerd bij 4000 rpm voor een half uur. Het pellet werd geresuspendeerd in PBS en de
OD260nm werd gemeten met de spectrofotometer om een indicatie van de hoeveelheid fagen te
hebben (OD260nm = 1 => 3x1010 pfu/ml). De overnacht met antigen gecoate well werd gewassen
met PBS en ongeveer 1011 fagen werden toegevoegd. De incubatie werd gedaan voor een uur
lang bij kamer temperatuur. Alle ongebonden fagen werden weggewassen door 20 maal te
wassen met PBS of PBST. De gebonden faag partikels werden geëlueerd van de microtiter platen
met 100 µl 100 mM triëthylamine pH 10,0. Na 10 minuten werd het eluaat naar een Eppendorf
tube overgebracht en geneutraliseerd door toevoegen van 100µl 1 M Tris-HCl pH 7,4 en dit werd
gebruikt om exponentieel groeiende E.coli TG1 cellen te infecteren. Dit om een nieuwe ronde
van panning te kunnen starten. Telkens werden verschillende verdunning gemaakt van de
geëlueerde fagen in 10 mM MgCl2 om de titer te bepalen en een idee te hebben van de aanrijking.
De aanrijkingsfactor werd berekend door de verhouding te nemen van het aantal geëlueerde fagen
in de antigen gecoate wells tot de niet gecoate wells. Na de laatste ronde panning werden
individuele kolonies opgepikt en hun VHH fragmenten werden geïnduceerd door 1mM IPTG in
een kleine 10 ml TB cultuur. Het periplasmatisch extract werd aangemaakt vanaf deze culturen
en getest in ELISA op mogelijke specifieke antigen herkenning.
3.20 Expressie en zuivering van VHH fragmenten
De vectoren voor panning en productie zijn anders geconstrueerd en om betere opbrengsten te
hebben moet men de inserties herkloneren van display vectoren pHEN4 of pHEN7naar de
productie vector pHEN6.
Praktische uitvoering
De klonen die na aanrijking positief scoorden in ELISA, werden geherkloneerd in de vector
pHEN6 door gebruik te maken van de restrictie enzymen NcoI en BstEII en getransformeerd in
E.coli WK6 cellen. Grote schaal productie van VHH fragmenten werd bekomen door de
55
bacteriën te groeien bij 37°C in TB medium, gesupplementeerd met 0,1% glucose en ampicilline,
tot een OD600nm van 0,6 tot 0,9 en dan geïnduceerd met 1mM IPTG. De VHH productie gebeurde
voor 16 uur bij 28°C. Na het pelleteren van de cellen door centrifugatie voor 7’ bij 8000 rpm,
werd een osmotische schok gegeven, volgens het protocol van de expressie test maar nu met een
groter volume TES en TES/4, om de periplasmatische proteïnen te verzamelen in het supernatans.
Het periplasmatisch extract werd gescheiden van de celresten door centrifugatie voor 30’ bij
15000 rpm. Het supernatans bevat de periplasmatische eiwitten, waaraan 3 ml Ni-NTA superflow
(Qiagen) oplossing werd toegevoegd. Dit werd dan geïncubeerd al schuddende voor minstens één
uur. Dit werd geladen op een lege kolom en na wassen van de niet-gebonden proteïnen met
fosfaat buffer bij pH 6,0, werden de gebonden proteïnen geëlueerd met een acetaat buffer bij een
pH van 4,7. De adsorptie werd gemeten op een spectrofotometer bij 280 nm en vanuit de
aminozuur sequentie, werd de extinctie coëfficiënt berekend om zo de concentratie van
geproduceerd VHH fragment te verkrijgen. Een gelfiltratie van het gezuiverd VHH fragment kan
gebeuren om extra zuiverheid te hebben en om nog contaminerende zouten te verwijderen. Eerst
werd de geëlueerd fractie geconcentreerd op Vivaspin concentrators met een MW drempel
waarde van 5 kDa (Vivascience). Dit concentraat werd geladen op een Superdex-75 16/60
gelfiltratie kolom (Pharmacia).
3.21 ELISA
De ELISA techniek is enorm krachtig om kleine hoeveelheden materiaal te detecteren in een
mogelijk gecontamineerde pool. Bijna alle mogelijk proteïne materiaal kan gedetecteerd worden
door gebruik te maken van monoklonale antilichamen. Als er geen monoklonale antilichamen
beschikbaar zijn, kan men nog altijd beroep doen op polyklonale antilichamen.
Praktische uitvoering
Er zijn vele verschillende manieren om deze techniek te gebruiken. De wasstap bestaat telkens uit
vijfmaal PBST toe te voegen aan de wells en weg te spoelen. De incubatie periode van
antilichamen, VHH fragmenten of antigenen bedroeg telkens één uur bij kamer temperatuur. De
OD bij 405 nm werd gemeten met behulp van een Ultra Microplate Reader (Bio-Tek
Instruments), een tiental minuten tot een half uur na toevoegen van substraat pNPP.
3.21.1 Faag ELISA− ELISA plaat (Nunc) coaten aan 1 µg/ml antigen in PBS en overnacht incuberen op
4°C.
56
− Wasstap en ELISA plaat overcoaten met PBS+caseïne incuberen voor minstens één
uur bij kamer temperatuur.
− Wasstap en fagen uit verschillende ronden panning toevoegen aan éénzelfde aantal
per well en één uur incubatie bij kamer temperatuur.
− Wasstap, maar nu werden de ongebonden fagen weggewassen door 20 keer PBST
toevoeging en weg te spoelen.
− Anti-M13 monoklonaal antilichaam toevoegen aan een verdunning van 1/1000 voor
faag detectie.
− Wasstap en het konijn anti-muis monoklonaal antilichaam (Sigma), geconjugeerd met
een alkaline fosfatase, toevoegen aan een 1/1000 verdunning. De anti-muis
antilichamen zijn gekoppeld aan een alkaline fosfatase dat zorgt voor een omzetting
van een substraat pNPP naar een gele kleur. De OD werd gemeten op 405 nm.
3.21.2 Solid fase ELISA
− ELISA plaat coaten overnacht bij 4°C met het antigen aan een concentratie van 1
µg/ml in PBS.
− Wasstap en overcoating door PBS+caseïne.
− Wasstap en het VHH fragment in gezuiverde of periplasmatische vorm tegen het
antigen erop brengen in geconcentreerde of verdunde vorm.
− Wasstap en het anti-HIS6-tag (pHEN6 en pHEN7) (Serotec) of anti-c-myc-tag
(pHEN7) monoklonaal antilichaam toevoegen aan een verdunning van 1/1000.
− Wasstap en incubatie met konijn anti-muis monoklonaal antilichaam.
− Wasstap, fosfatase ELISA substraat toevoegen en de OD405nm meten.
3.21.3 Dose-respons ELISA
− ELISA plaat coaten met 1 µg/ml antigen en overnacht incuberen bij 4°C.
− Wasstap en overcoating door PBS+caseïne.
− Wasstap en seriële verdunningsreeks van het gezuiverde VHH fragment aanbrengen.
− De verdere ontwikkeling is analoog aan de solid fase ELISA.
3.21.4 Competitieve ELISA
− ELISA plaat coaten met 1 µg/ml antigen en overnacht incubatie bij 4°C.
− Wasstap en overcoating met PBS+caseïne.
57
− Wasstap en toevoegen van laagste hoeveelheid VHH fragment, waarbij nog maximaal
signaal kon worden verkregen vanuit de dose-respons ELISA.
− Wasstap en een seriële verdunningsreeks van vrij antigen opgelost in PBS toevoegen
om in competitie te treden met de reeds gebonden VHH fragmenten.
− Wasstap en verdere ontwikkeling is analoog aan de ontwikkeling bij de solid fase
ELISA.
3.21.5 Spiking ELISA
− ELISA plaat coating met gezuiverd VHH fragment aan een concentratie van 1 tot 10
µg/ml en overnacht incubatie bij 4°C.
− Wasstap en overcoating met PBS+caseïne.
− Wasstap en een seriële verdunning van vrij antigen, in een pool van andere proteïnen,
toevoegen.
− Wasstap en detectie van het gebonden antigen gedaan met een monoklonaal
antilichaam tegen het antigen of een mengsel van IgG subklassen van de
geïmmuniseerde kameel. De verdere ontwikkeling ging via respectievelijk een anti-
muis monoklonaal antilichaam of een anti-kameel polyklonaal konijn serum.
− Wasstap en verdere ontwikkeling is analoog aan de ontwikkeling bij de solid fase
ELISA.
58
4 Resultaten en bespreking
4.1 Aangewende proteïne hulpmiddelenWe hebben verschillende fysiologische vormen van het PSA antigen voorhanden (figuur 13). Een
veelgebruikte vorm is het halfgezuiverde PSA mengsel vanuit semen plasma. Hierin zijn zowel
het PSA-ACT complex als het vrije PSA in oplossing aanwezig. De halfgezuiverde vorm van
PSA (EuroGenetics) werd gebruikt om de kameel te immuniseren. Andere hulpmiddelen zijn
gezuiverd PSA uit semen plasma (EuroGenetics, Sigma) , gezuiverd en gebiotinyleerd PSA uit
semen plasma (EuroGenetics), gezuiverd ACT (Sigma) en een PSA specifiek monoklonaal
antilichaam, geproduceerd in muis (EuroGenetics).
Fig. 13. 12,5% SDS-PAGE van proteïne hulpmiddelen. Slot 1: MW merker; slot 2: halfgezuiverde PSA mengsel uit
semen plasma; slot 3: gezuiverd PSA uit semen plasma; slot 4 gezuiverd, gebiotinyleerd PSA; slot 5: gezuiverd
ACT; slot 6: PSA specifiek monoklonaal antilichaam; slot 7: gereduceerd PSA specifiek monoklonaal antilichaam.
Het halfgezuiverde PSA mengsel, dat gebruikt werd voor de immunisering, geeft twee
belangrijke banden van respectievelijk ongeveer 30 en 85 kDa. Er zijn ook nog verschillende
contaminaties aanwezig in het halfgezuiverde PSA mengsel. De moleculaire gewichten van de
twee belangrijkste banden komen overeen met de aanwezigheid van vrij PSA (30 kDa) en PSA
gecomplexeerd met ACT (85 kDa) in het halfgezuiverde PSA mengsel en deze vormen worden
gevonden in patiënten met prostaat kanker (Zhou et al., 1993). Door het gebruik van dit
halfgezuiverde mengsel bestaat de kans dat, bij de immunisering van de kameel, ook een
humoraal antwoord wordt opgewekt tegen het ACT dat gecomplexeerd is met PSA. Het
gezuiverde PSA uit semen plasma en gebiotinyleerd PSA migreren tot op een overeenkomstige
plaats met het vrije PSA uit het halfgezuiverde PSA mengsel. Deze vorm van PSA in semen
59
plasma is mogelijk een mengsel van zowel enzymatisch actief als geknipt, en daardoor inactief
vrij PSA. Het gezuiverde alpha-1-antichymotrypsine (ACT) heeft op SDS-PAGE een moleculair
gewicht tussen 55 en 60 kDa. Het PSA specifieke monoklonale antilichaam migreert ongeveer tot
op 160 kDa en de gereduceerde vorm ervan vertoont 3 banden, respectievelijk 50, 35 en 30 kDa.
De 50 kDa band stemt overeen met de zware keten en de 25 kDa band met de lichte keten. De
extra 35 kDa grote band bij de reductie van het PSA specifieke monoklonaal antilichaam is
mogelijk een geglycosyleerde lichte keten of een afbraakproduct van de zware keten, doordat
meerdere malen de stock met PSA specifiek monoklonaal antilichaam ingevroren en ontdooid
moest worden voor gebruik in allerlei experimenten.
4.2 ImmuunantwoordEen mannelijke dromedaris werd zesmaal geïmmuniseerd met een dosis PSA van 1 mg. Het
bloed werd afgenomen drie dagen na de laatste immunisering en onderzocht op een specifieke
antilichaam respons tegen het PSA. Vanuit het serum werden de IgG subklassen gefractioneerd in
de conventionele immunoglobulines (IgG1) en de zware keten immunoglobulines (IgG2 en
IgG3), door middel van differentiële adsorptie op proteïne G en proteïne A, zoals Hamers-
Casterman et al. (1993). De subklassen IgG1 en IgG3 binden op proteïne A en proteïne G en
IgG2 bindt enkel op proteïne A. Met een verschillende pH kunnen de IgG1 en IgG3 van de
proteïne G kolom geëlueerd worden. De flow-through van de proteïne G kolom wordt geladen op
proteïne A kolom, zodat IgG2 kan gezuiverd worden. De opbrengsten voor IgG1, IgG2 en IgG3
bedragen respectievelijk 1,5; 0,5 en 1,5 mg per ml dromedaris serum. De zuiverheid van de IgG
subklassen kon bepaald worden door SDS-PAGE (figuur 14).
Fig. 14. 12,5% SDS-PAGE van gezuiverde IgG subklassen. Slot 1: MW merker; slot 2: IgG1; slot 3: IgG1
gereduceerd; slot 4: IgG2; slot 5: IgG2 gereduceerd; slot 6: IgG3; slot 7: IgG3 gereduceerd.
Het moleculaire gewicht van IgG1, IgG2 en IgG3 bedraagt respectievelijk ongeveer 150, 90 en
90 kDa onder niet-gereduceerde condities. Bij reduceerde condities bedraagt het moleculair
60
gewicht van subklassen IgG1, IgG2 en IgG3 respectievelijk 55/25, 45 en 45 kDa en zijn in
overeenstemming met de resultaten beschreven in Muyldermans & Lauwereys (1999). We zien
evenwel dat de zuivering van de IgG2 subklasse niet optimaal is en er nog contaminaties
overblijven na differentiële adsorptie op proteïne A en proteïne G, maar deze geven geen
hindering bij het ontwikkelen van ELISA’s of Western Blots.
Het humorale antwoord in elke subklasse werd nagegaan (figuur 15). Seriële verdunningen van
de IgG subklassen werden gebruikt in een solid fase ELISA met PSA en ACT als gecoat antigen
en de detectie werd bekomen door konijn anti-dromedaris serum tegen de IgG subklassen en anti-
konijn IgG alkalisch fosfatase conjugaat tegen het konijn serum.
0 1 2 3 4 50,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
OD 40
5nm
concentratie IgG (µg/ml)
Fig. 15. Solid fase ELISA met PSA specifieke IgG’s. PSA werd geïmmobiliseerd aan 1 µg/ml op een microtiter
plaat. Gebonden subklassen IgG1 (■); IgG2 (●) en IgG3 (▲) werden gedetecteerd met konijn anti-dromedaris serum
tegen de IgG subklassen en anti-konijn IgG alkalisch fosfatase conjugaat tegen het konijn serum.
Het immuunantwoord voor elke IgG subklasse is ongeveer even groot. Evenwel ligt het antwoord
van de IgG3 lichtjes hoger dan de conventionele IgG1 en IgG2. Men mag dus stellen dat zowel
voor conventionele als zware keten antilichamen een PSA specifiek immuunantwoord opgewekt
werd. Het zou dus mogelijk moeten zijn om PSA specifieke kameel antilichaam fragmenten te
identificeren door panning. Eenzelfde solid fase ELISA werd gedaan met als gecoat antigen ACT
61
aan 1 µg/ml, maar hierbij werd een veel lagere respons teruggevonden (resultaten niet
weergegeven).
Omdat we een verschillende positieve respons kregen in ELISA met de IgG subklassen tegen
PSA of ACT, gaat men na welke vormen van PSA in het halfgezuiverde PSA mengsel herkend
worden door middel van een Western Blot experiment (figuur 16).
Fig. 16. 12,5% SDS-PAGE van halfgezuiverde PSA mengsel (Coomassie gekleurd) en Western Blot van gezuiverde
IgG subklassen op halfgezuiverde PSA mengsel (bruin gekleurd). Slot 1, 4 & 5: MW merker; slot 2 & 3:
halfgezuiverde PSA mengsel; slot 6: detectie van het halfgezuiverde PSA mengsel door IgG1; slot 7: detectie van het
halfgezuiverde PSA mengsel met IgG2; slot 8: detectie van het halfgezuiverde PSA mengsel met IgG3.
De SDS-PAGE laat een patroon zien van drie banden voor het halfgezuiverde PSA mengsel.
Zoals hierboven beschreven is de bovenste band het PSA-ACT complex van ongeveer 85 kDa en
de middelste is het vrije PSA met een moleculair gewicht van ongeveer 30 kDa. De minder goed
zichtbare band, van ongeveer 11 kDa, is mogelijk een afbraakproduct van het ACT (Christensson,
1990). Dit wordt vrijgesteld bij het vormen van het PSA-ACT complex. PSA knipt namelijk een
stuk van ACT bij het vormen van het covalente complex tussen PSA en ACT.
We zien een duidelijke respons in Western Blot voor elke IgG fractie op zowel het PSA-ACT
complex als het vrije PSA. De respons voor de IgG1 subklasse is evenwel hoger dan voor de
IgG2 en 3 subklasse, dit is te verklaren op verschillende manieren. Men kan een hogere titer
hebben voor de IgG1 subklasse, het kan zijn dat de HCAb’s meer conformationele epitopen
herkennen, of het kan ook een combinatie van de voorgaande redenen zijn. Voor de IgG1
subklasse wordt ook een goede respons gegeven voor het afbraakproduct van ACT. Zelfs enkele
contaminaties in de antigen pool worden herkend. Men kan hieruit besluiten dat de immunisering
van de dromedaris met het halfgezuiverde PSA mengsel een specifiek immuunantwoord heeft
opgewekt tegen zowel het PSA in vrije als gecomplexeerde vorm. Het moet dus mogelijk zijn om
62
de VHH genen te kloneren en kameel antilichaam fragmenten te selecteren die kunnen binden op
PSA in vrije of gecomplexeerde vorm. Het kan zelfs mogelijk zijn om kameel antilichaam
fragmenten te selecteren die ACT herkennen. Men moet echter weten dat in Western Blot de
proteïnen in een gedenatureerde vorm voorkomen en de IgG’s voornamelijk kunnen binden op
lineaire epitopen en veel minder op de conformationele epitopen. Voor het PSA specifieke
monoklonaal werd eveneens vastgesteld in Western Blot dat het een conformationeel epitoop
herkent op PSA (resultaten niet weergegeven).
4.3 Aanmaken van een VHH bibliotheekNa zes immuniseringen van een dromedaris, werd 50 ml bloed afgenomen, waarbij EDTA
toegevoegd werd tegen coagulatie. Een extra 10 ml bloed werd afgenomen om serum te bereiden.
Uit het antigecoaguleerde bloed van de geïmmuniseerde dromedaris, werden de witte bloedcellen
geïsoleerd door middel van evenwichtscentrifugatie in ficoll, waarbij de rode en niet de witte
bloedcellen in de ficoll-fase kunnen pelleteren. Uit 5x106 lymfocyten werd het mRNA geïsoleerd
en in een volgende stap werd cDNA gemaakt via RT-PCR met gebruik van een oligo dT primer.
Dit cDNA werd gebruikt als template om de genen te amplifiëren die coderen voor het variabele
domein van de zware keten antilichamen. Een eerste amplificatie werd gedaan om alle mogelijke
VH genfragmenten te verkrijgen (Ghahroudi et al., 1997) met PCR primers Call001 en Call002.
Deze primers annealen in het geval van Call001, de leader signaal sequentie van de VH genen, en
in het geval van Call002, een sequentie in het midden van het CH2 domein van de zware keten.
Via deze amplificatie krijgt men een patroon van drie banden wanneer de PCR producten op 1%
agarose gel geladen worden (figuur 17). De bovenste band, corresponderend met het hoogste
moleculaire gewicht, stemt overeen met de fragmenten die de VH, CH1, hinge en stuk van CH2
exon van de conventionele antilichamen bevatten (moeilijk te zien op figuur 17), de andere twee
banden stemmen overeen met de fragmenten die de VHH, hinge en stuk van CH2 exon van zware
keten antilichamen bevatten. Het bovenste fragment bevat het CH1 exon, waardoor de lengte van
het geamplifieerde materiaal 400 bp groter is dan de lengte van de twee andere banden, die dit
CH1 exon niet bevatten. Ten minste twee populaties van genen worden geamplifieerd voor de
zware keten antilichamen, namelijk een populatie met korte hinge (IgG3) en een populatie met
lange hinge (IgG2), wat op een 1% agarose gel resulteert in twee banden met een klein verschil in
grootte. De twee banden corresponderend met de VHH fragmenten werden tezamen uit gel
gesneden en gezuiverd.
63
Fig. 17. PCR 1: 1% agarose gel in 1x TBE van de amplificatie van het cDNA met Call001 en Call002. 10 µl van elk
staal werd geladen. Slot 1: MW merker (123 bp ladder, beginnende vanaf onderaan met 123 bp, volgende banden
zijn telkens veelvouden van 123 bp); slot 2: PCR met 1 µl template cDNA; slot 3: PCR met 3 µl template cDNA; slot
4: PCR met 6 µl template cDNA; slot 5: negatieve controle.
Op de gezuiverde pool van DNA werd een geneste PCR uitgevoerd om voldoende fragment aan
te maken in een formaat dat klonering in een fagmide vector toelaat. De eerste PCR van de
geneste PCR wordt uitgevoerd met SM017/018 en 38 en men krijgt een band van ongeveer 400
bp op 1% agarose gel. De tweede wordt verricht met de primers A4Short en 38 en ook hier wordt
een band van 400 bp gedetecteerd op 1% agarose gel. Deze beide PCR’s leveren het volledig gen,
coderend voor het variabele domein van de zware keten antilichamen, met de bijhorende restrictie
enzym sites nodig voor de klonering in de fagmide vector pHEN4 (figuur 18). Op deze manier
werd 10 µg gezuiverd VHH pool DNA aangemaakt die in de volgende stap gebruikt wordt voor
de aanmaak van een bibliotheek.
Fig. 18. Schematische voorstelling van de drie PCR reacties. Eerste PCR werd gedaan met Call001 en Call002. De
geneste PCR’s werden gedaan met eerst SM017/018 en 38, daarna met A4Short en 38. De verkregen PCR
fragmenten werd geknipt met NcoI en NotI.
64
De gezuiverde VHH-PCR fragmenten werden geknipt met de restrictie enzymen NcoI en NotI,
gezuiverd en vervolgens geligeerd in de pHEN4 vector, eveneens geknipt met NcoI en NotI en
zorgvuldig gezuiverd zoals vermeld in de materialen en methoden (figuur 19). De ligatie werd
overnacht bij 16°C uitgevoerd met verscheidene fragment/vector verhoudingen (molaire
verhoudingen) van 1/1, 3/1, 10/1. Voor de bibliotheek constructie werd de fragment/vector
verhouding 3/1 gebruikt, omdat die de beste resultaten gaf om een voldoende grote bibliotheek te
construeren. Na ligatie werd het geligeerde materiaal op verschillende manieren gezuiverd om uit
te maken welke zuiveringsmethode resulteert in de beste transformatie efficiëntie. De efficiëntie
werd bekomen met een fenol/chloroform extractie gevolgd door DNA precipitatie met ethanol.
Fig. 19. pHEN4 en PCR 3: 1% agarose gel in 1x TBE. Slot 1: 5 µl Smartladder; slot 2: 5 µl pHEN4 (NcoI/NotI); slot
3: 5 µl van de geamplifieerde VHH genen na digestie met NcoI/NotI en na zuivering.
Het extensief gezuiverd, geligeerd materiaal werd getransformeerd in verse TG1 E.coli cellen,
om maximale electrocompetentie te verkrijgen. Door overnacht ligatie van 3 µg pHEN4
(NcoI/NotI) met 3 µg VHH pool (NcoI/NotI) op 16°C werd een bibliotheek met een grootte van
6x106 individuele transformanten verkregen. Via kolonie PCR werd aangetoond dat meer dan
75% van de transformanten van de bibliotheek de vector met een VHH gen insert van de correcte
lengte bevatten.
4.4 In vitro selectie of panningDe bibliotheek, die de genen voor de VHH’s omvat, dient gescreend te worden voor mogelijke
specifieke VHH’s tegen PSA. Doordat de genen in een fagmide vector gekloneerd werden, kan
men door additie van helperfagen aan de bacteriële cultuur van de VHH bibliotheek, de productie
van recombinante fagen verkrijgen. Deze recombinante fagen drukken op hun tip het fusie eiwit
van gen3 met de VHH uit. Op deze manier werd het VHH repertorium uitgedrukt op
filamenteuze fagen na infectie van de bibliotheek met helper fagen. De selectie van de virions,
65
die een fusie-eiwit VHH-gen3 uitdrukken specifiek voor PSA, werd uitgevoerd via in vitro
selectie: panning (Hoogenboom & Chames, 2000). De in vitro selectie werd uitgevoerd door een
hoge concentratie aan PSA (100 µg/ml) te coaten in een microtiter well. 1011 virions, afkomstig
na de rescue van de bibliotheek, werden op het gecoate antigen geladen. Aspecifieke virions
werden verwijderd door middel van een extensieve wassing, de specifieke virions werden
vervolgens van het antigen geëlueerd door een pH schok te geven. De geëlueerde virions werden
gebruikt om exponentieel groeiende TG1 E.coli cellen te infecteren. Op deze manier werden de
geëlueerde virions in grotere hoeveelheid aangemaakt en gebruikt voor een volgende
selectieronde. Na drie opeenvolgende selectie ronden op solid fase PSA coating, PSA gebonden
op PSA specifiek monoklonaal antilichaam coating en ACT coating, werd een duidelijke
aanrijking in antigen specifieke virions gevonden. Door een verdunningsreeks van de geëlueerde
virions, na infectie van TG1 E.coli cellen, uit te platen op ampicilline kan de aanrijking
gedetecteerd worden in het stijgend aantal kolonies bij de geëlueerde virions gebonden op PSA
ten opzichte van geëlueerde virions gebonden op een niet-gecoate plaat (aspecifiek bindende
virions).
Na elke ronde van panning werden gezuiverde virions bijgehouden om via een faag ELISA de
toename aan PSA specifieke virions te detecteren (figuur 20). De faag ELISA wordt verricht
zoals een solid fase ELISA met een coating van 1µg/ml PSA. Telkens wordt hetzelfde aantal
fagen (108 of 109 per well) toegevoegd en na een uur incubatie worden de ongebonden, niet-
antigen-specifieke fagen weggewassen. De antigen specifieke, gebonden fagen worden
gedetecteerd met een anti-M13 horseradisch peroxidase conjugaat.
66
1 2 30,00
0,25
0,50
0,75
1,00
1,25
OD
405n
m
Selectie ronden
Fig. 20. Faag ELISA bij coating van 1µg/ml PSA. Horizontaal gelijnd: PSA solid fase coating; kruislings gelijnd:
PSA gebonden op PSA specifiek monoklonaal antilichaam solid fase coating.
Men ziet dat na 3 ronden van panning er een duidelijke aanrijking gebeurd is van PSA specifieke
virions. De aanrijking is duidelijk groter voor virions die specifiek het PSA, gebonden op een
PSA specifiek monoklonaal antilichaam, herkennen.
De aanrijking kan men ook formuleren in een aanrijkingsfactor na elke ronde van panning (tabel
2). Deze aanrijkingsfactor wordt gedefinieerd als de verhouding van het aantal antigen specifieke
kolonies tot het aantal kolonies uit niet-PSA gecoate wells (Ghahroudi et al., 1997).
Tabel 2. Aanrijkingsfactoren van de verschillende selectiemethoden na elke ronde panning.
1e ronde 2e ronde 3e ronde
PSA 2 12 40
PSA-mAb 3,5 2 3
ACT - 350 750
Een duidelijke aanrijking is gevonden voor PSA en ACT coating, minder voor de PSA gebonden
op PSA specifiek monoklonaal antilichaam. Het verschil tussen de aanrijking gezien in faag
ELISA of bij de aanrijkingsfactoren is te wijten een het feit dat bij de aanrijkingsfactoren er een
groot aantal kolonies te zien waren bij platen van enkel gecoat met PSA specifiek monoklonaal
67
antilichaam. Het is dus best mogelijk dat het grotere signaal in faag ELISA te wijten is aan
virions die specifiek binden op het PSA gebonden op het PSA specifieke monoklonaal
antilichaam. Want bij de aanrijkingsfactoren werd vastgesteld dat de bacterie cellen, die
geïnfecteerd zijn geweest door aspecifiek bindende fagen, sneller groeien dan de bacterie cellen
die geïnfecteerd zijn geweest door PSA bindende fagen.
4.5 Antigen bindende kameel antilichaam fragmenten afzonderenVan 20 willekeurig gekozen kolonies, na de derde ronde panning, werd het periplasmatisch
extract gemaakt en getest op expressie van PSA specifieke VHH. Detectie gebeurde door middel
van PSA en ACT rechtstreekse coating op microtiter platen en PSA gebonden op een PSA
specifiek monoklonaal antilichaam, rechtstreeks gecoat op microtiter plaat. Er werden voor ACT,
PSA rechtstreekse coating of PSA gebonden op PSA specifiek monoklonaal antilichaam
respectievelijk 16, 5 en 7 positieve signalen op 20 kolonies gevonden.
De genfragmenten van de klonen, die positief waren in solid fase ELISA, werden door PCR
geamplifieerd en gedigereerd met het frequent knippend restrictie enzym HinfI. Op die manier
werd van de positieven, 4 verschillende restrictie patronen geïdentificeerd die PSA bonden en
slechts 1 patroon voor ACT binding. Dit werd bevestigd door DNA sequentie (figuur 21). Het
cAbPSA11 is afgezonderd na panning met PSA gebonden op monoklonaal antilichaam, de
overige cAbPSA’s zijn afgezonderd na panning met PSA rechtstreekse coating. Het cAbACT16
is eveneens afgezonderd uit een rechtstreekse coating van ACT op microtiter plaat.
68
Fig. 21. Aminozuursequenties van cAb-PSA3, 11, 15, 20 en cAb-ACT16, geallinieerd tegenover de humane VH
consensussequentie. Rood omkaderd is de CDR gedefinieerd volgens Kabat et al. (1991), de geel gekleurde residu’s
zijn de solvent geëxposeerde lus residu’s volgens Chothia & Lesk (1987), de groene gekleurde residu’s zijn
kameelspecifieke aminozuren in VH, de blauwe residu’s zijn de lysines die bruikbaar zijn voor chemische
immobilisatie en de paars gekleurde residu’s zijn VHH specifieke residu’s. Een – geeft aan dat hetzelfde residu
gevonden werd in de cAb sequentie als in de humane VH consensus, een spatie geeft een deletie weer tegenover de
humane consensus sequentie.
De aminozuur residu’s in het paars stellen de framework substituties voor die zorgen voor het
hydrofieler karakter van de VHH ten opzichte van de VH. De substituties die hier voorkomen zijn
de leucine 11 naar een serine, de valine 37 naar fenylalanine (cAbPSA3, 11 en 20) of tyrosine
(cAbPSA15 en cAbACT16), glycine 44 naar glutamaat (cAbPSA3, 11, 20 en cAbACT16) of
glutamine (cAbPSA15), leucine 45 naar arginine voor alle cAbs, tryptofaan 47 naar alanine
(cAbPSA20) of valine (cAbPSA11) of glycine (cAbPSA3) of leucine (cAbACT16). De rode
kaders geven de CDR’s weer volgens Kabat et al. (1991). De cAbPSA11, 15, 20 en cAbACT16
hebben allen een eerste hypervariabele lus regio van 10 aminozuur residu’s, de cAbPSA3 heeft
slechts een lengte van 7 aminozuur residu’s. In de CDR1 van cAbPSA15, 20 en cAbACT16 is er
een extra cysteïne aangetroffen, deze zal met de extra cysteïnes in de CDR3 zorgen voor een
interlus disulfide brug. De lengte van de CDR2 bedraagt voor alle cAbs 16 of 17 aminozuur
residu’s. Voor de CDR3 is er ofwel een lengte van 12 en 13 aminozuur residu’s voor
respectievelijk cAbPSA15 en cAbACT16, ofwel een lengte van 16 aminozuurresidu’s voor
69
cAbPSA3, 11 en 20. In cAbPSA15 vindt men ook een deletie terug van de 2 aminozuur residu’s
glutamine en glycine in de FR4. De deleties op deze plaatsen zijn waarschijnlijk te wijten aan het
gebruik van truncated primers tijdens de PCR amplificatie.
4.6 Productie van cAbPSA3, 11, 15 en 20Om een betere productie en zuivering van de kameel antilichaam fragmenten te bekomen, werden
alle verschillende positieven geherkloneerd in de vector pHEN6 zoals vermeld in de materiaal en
methoden (figuur 22). Deze vector geeft betere opbrengsten dan de pHEN4/pHEN7 vectoren en
draagt enkel de His6-tag. Om de hoeveelheid geproduceerd cAbPSA te bepalen werd een OD
meting gedaan bij 280 nm. Met behulp van de theoretisch bepaalde extinctiecoëfficiënten
(PCGene) kon vervolgens gemakkelijk de concentratie berekend worden (tabel 3).
Tabel 3. Productie en zuivering van cAbPSA3, 11, 15 en 20. De theoretische extinctiecoëfficiënten (M-1 cm-1) zijn
verkregen door het ingeven van de aminozuursequenties in het programma PCGene.
cAbPSA Theoretische
extinctiecoëfficiënt
(M-1 cm-1)
Totaal gezuiverd (mg) Opbrengst (mg/liter
cultuur)
3 28260 20,8 5,8
11 21860 30,6 8,5
15 23950 6 1,7
20 30350 14,1 3,9
Het verschil tussen de pHEN4 en pHEN6 vector is de afwezigheid van het gen3 in pHEN6, zoalszichtbaar op een 1% agarose gel (figuur 22).
Fig. 22. pHEN6 en pHEN4 vectoren na zuivering. 1% agarose gel in 1x TBE van telkens 5 µl per slot. Slot 1: MW
merker; slot 2: pHEN 6; slot 3: pHEN4. Beide vectoren, pHEN6 en pHEN4, zijn geknipt met respectievelijk
NcoI/BstEII en NcoI/NotI.
70
4.7 Karakterisering van cAbPSA3, 11, 15 en 20Vanuit de DNA sequentie werd de aminozuur sequentie bepaald. De voorspelde moleculaire
gewichten zijn respectievelijk 14535, 14652, 13960 en 14850 voor cAbPSA3, 11, 15 en 20. Om
na te gaan of de kameel antilichaam fragmenten wel degelijk gezuiverd zijn na IMAC werden
van elke cAbPSA binder een paar µg op SDS-PAGE gezet, in zowel natieve als gereduceerde
vorm (figuur 23).
Fig. 23. 12,5% SDS-PAGE van cAb-PSA3, 11, 15, 20, telkens onder zowel gereduceerde als niet-gereduceerde
vorm. Slot 1: MW merker; slot 2: cAbPSA3; slot 3: cAbPSA3 gereduceerd; slot 4: cAbPSA11; slot 5: cAbPSA11
gereduceerd; slot 6 cAbPSA15; slot 7: cAbPSA15 gereduceerd; slot 8: cAbPSA20; slot 9: cAbPSA20 gereduceerd.
De theoretische moleculaire gewichten komen overeen met de experimenteel bepaalde
moleculaire gewichten. Enkel bij het cAbPSA11 wordt bij het niet-gereduceerde slot een extra
band gevonden met een experimenteel bepaald moleculair gewicht van 30 kDa. Dit is mogelijk
een dimere vorm van het cAbPSA11. Ondanks het feit dat er geen extra cysteïne zit in de CDR1
of CDR3, kan er toch een reductie optreden van het dimeer naar een monomeer vorm van
cAbPSA11. Een mogelijke verklaring is het aannemen van een intermoleculaire domain
swapping tussen verschillende cAbPSA11’s, waarbij zelfs naast dimeren, ook trimeren en
tetrameren kunnen gevormd worden (figuur 24) (Zegers et al., 1999).
71
Fig. 24. 12,5% SDS-PAGE van cAb-PSA11. Slot 1: MW merker; slot 2: 10 µg in PBS; slot 3: 5 µg in PBS.
De multimere vormen kunnen gevormd zijn bij het maken en zuiveren van het periplasmatisch
extract. We hebben evenwel een hoge opbrengst voor de cAbPSA11. Daardoor is het mogelijk
dat bij de translatie in E.coli, de kameel antilichaam fragmenten samenkomen en reeds dimeren
vormen bij het opvouwen van de kameel antilichaam voordat er transport gebeurd naar het
periplasma. Men zou dit kunnen tegengaan door het maken en zuiveren van het periplasmatisch
extract onder denaturerende condities. Daarna kan men het cAbPSA11 opnieuw renatureren naar
een monomere vorm.
We hebben vier PSA specifieke kameel antilichaam fragmenten gezuiverd. Nu moet men nagaan
of ze wel degelijk binden in gezuiverde vorm. We ondernemen hiervoor een solid fase ELISA op
twee verschillende manieren. Aan de ene kant coat men het halfgezuiverde PSA aan een
concentratie van 1 µg/ml. Aan de andere kant coat men eerst overnacht een PSA specifiek
monoklonaal antilichaam en daarna laat men het halfgezuiverde PSA mengsel op dit PSA
specifiek monoklonaal antilichaam binden (figuur 25). Men onderzoekt de respons van de
gezuiverde kameel antilichaam fragmenten op deze twee verschillende manieren van coating.
Men gebruikt verdunningreeksen van kameel antilichaam fragmenten tussen 50 µg/ml tot 5x10-4
µg/ml.
72
1E-4 1E-3 0,01 0,1 1 100,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
OD 40
5nm
Concentratie cAb (µg/ml)
Fig. 25. Dose-respons ELISA van cAbPSA11 (●) op PSA gebonden op PSA specifiek monoklonaal antilichaam;
cAbPSA15 (■) op rechtstreekse PSA coatings; cAbPSA20 (▲) op rechtstreekse PSA coatings.
We hebben geconstateerd dat het cAbPSA11 duidelijk bindt op het PSA dat gebonden is op PSA
specifiek monoklonaal antilichaam. Er was evenwel een lichte respons op rechtstreekse PSA
coating (niet weergegeven). De cAbPSA15 en 20 gaven enkel een duidelijke respons op
rechtstreekse PSA coating op microtiter plaat. Dit kan men verklaren door het feit dat ofwel het
PSA specifieke monoklonale antilichaam hetzelfde epitoop bindt als de cAbPSA15 en 20. Een
andere mogelijke verklaring is dat de structuur van PSA bij rechtstreekse coating en binding op
PSA specifiek monoklonaal antilichaam wel degelijk verschillend is (Wu et al., 2000). Een
Western Blot met cAbPSA detectie van PSA gescheiden door SDS-PAGE, geeft geen respons.
Ze herkennen dus een conformationeel en geen lineair epitoop op PSA. De 3D vorm van PSA
kan mogelijk een andere conformatie aannemen naargelang PSA rechtstreeks gecoat is op
microtiter plaat of gebonden is op PSA specifiek monoklonaal antilichaam. Naar alle
waarschijnlijkheid bindt cAbPSA11 de natieve 3D conformatie van PSA en binden de
cAbPSA15 en 20 een semi-gedenatureerde conformatie van PSA. Voor cAbPSA3 werd geen
respons meer gevonden, alhoewel het testen van het periplasmatisch extract tweemaal een
positief resultaat gaf. Mogelijk heeft dit te maken met contaminaties in het periplasmatisch
extract.
73
Om een idee te krijgen van de grootte orde van de affiniteit van de cAbs ligt, kan men een
competitieve ELISA doen (Friguet et al., 1985). Eerst wordt een microtiter plaat gecoat met het
PSA rechtstreeks voor cAbPSA15 en 20 of het PSA, dat gebonden is op PSA specifiek
monoklonaal antilichaam voor cAbPSA11. Het PSA wordt dan gedetecteerd met de laagste
concentratie aan kameel antilichaam fragment, waarbij nog een maximaal signaal verkregen werd
uit curve van de dose-respons ELISA. Voor elke cAbPSA werd deze waarde genomen op
ongeveer 1 µg/ml. Dan wordt een verdunningsreeks van half of volledig gezuiverd PSA
toegevoegd aan de microtiter plaat. Zo ontstaat er een competitie tussen het rechtstreeks gecoate
PSA of het PSA, dat gebonden is op PSA specifiek monoklonaal antilichaam, en het PSA in
oplossing. Het kameel antilichaam fragment zal een evenwicht vinden in het binden van het vrije,
in oplossing zijnde, PSA en het gecoate of gebonden PSA op de microtiter plaat. De laatste stap
is het detecteren van de hoeveelheid van overgebleven cAb op de microtiter plaat. Met de
verkregen curve kan men een idee krijgen van de KD van het kameel antilichaam fragment
(figuur 26).
0,1 1 10 100 10000,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
OD
405n
m
Concentratie toegevoegd vrij PSA (nM)
Fig. 26. Competitieve ELISA van cAbPSA11 (■ = PSA pool ; ▲= PSA puur); cAbPSA15 (● = PSA pool ; ▼= PSA
puur ).
74
We krijgen een soort sigmoïdale curve waarbij het buigpunt van de curve een redelijke
overeenkomst geeft met de reële KD van het kameel antilichaam fragment voor het antigen. We
hebben verschillende vormen van PSA antigen gebruikt en we zien dat het cAbPSA11 een hogere
affiniteit heeft voor het gezuiverde PSA dan het halfgezuiverde PSA. Maar hierin kunnen ook
meetfouten zitten door het foutieve en moeilijke inschatten van de concentratie van PSA in het
halfgezuiverde PSA mengsel. De KD van cAbPSA11 voor gezuiverd PSA zou in de buurt van 50
nM liggen. Bij het cAbPSA15 zien we enkel een competitie voor het halfgezuiverde PSA
mengsel en niet voor het gezuiverde PSA. Dit kan men verklaren door het feit dat het epitoop dat
herkend wordt door cAbPSA15 in het halfgezuiverde PSA afwezig is in het gezuiverde PSA. Als
we aannemen dat het gezuiverde PSA in een natieve 3D conformatie zit, dan kan het dus
mogelijk zijn dat het PSA in het halfgezuiverde PSA mengsel in een half of volledig
gedenatureerde conformatie zit. Dit is ook een tweede aanwijzing voor de mogelijkheid dat
cAbPSA15 en 20 binden op een nicked PSA conformatie. We kunnen evenwel een indicatie
geven van de KD van cAbPSA15 voor het halfgezuiverde PSA mengsel. Die ligt in de buurt van
60 nM. Voor het cAbPSA20 werd geen enkele respons verkregen, zowel voor half gezuiverd als
volledig gezuiverd PSA.
Een belangrijke vereiste voor elk kameel antilichaam fragment tegen PSA, is de mogelijkheid om
heel lage concentraties/hoeveelheden van PSA te kunnen detecteren in bloed- of semenstalen.
Om dit te testen doet men een spiking ELISA (figuur 27). Op een microtiter plaat gecoat met
cAbPSA’s worden oplossingen met verschillende PSA concentraties vanaf 1 µg/ml tot 0,001
µg/ml gebracht, onder condities van PSA als enige opgelost eiwit of PSA samen met andere
eiwitten (BSA en/of caseïne) in oplossing. De detectie van het gebonden PSA op het cAb gebeurd
door een PSA specifiek monoklonaal antilichaam voor cAbPSA11 of een duo van PSA specifiek
gezuiverde kameel IgG met konijn anti-kameel anti-serum voor cAbPSA15. Om de gevoeligheid
na te gaan, worden op microtiter plaat verschillende concentraties van 10 µg/ml tot 0,25 µg/ml
aan cAbPSA gecoat.
75
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,00,0
0,5
1,0
1,5
2,0
OD
405n
m
Concentratie zuiver PSA (µg/ml)
Fig. 27. Spiking ELISA van cAbPSA11. Verschillende hoeveelheiden cAbPSA11 werden gecoat op microtiter plaat.
■ = 5 µg/ml in PBS; ● = 5 µg/ml in PBS met 0,5 mg/ml BSA en caseïne; ▲ = 1 µg/ml in PBS; ▼ = 1 µg/ml in PBS
met 0,5 mg/ml BSA en caseïne; ↵ = 0,25 µg/ml in PBS; + = 0,25 µg/ml in PBS met 0,5 mg/ml BSA en caseïne.
Voor de spiking ELISA met cAbPSA15 werd het moeilijk om een specifieke curve te verkrijgen,
want het konijn anti-kameel serum gaf een positieve respons op het cAb. Zodanig kunnen we
deze capturing van PSA door cAbPSA15 moeilijk detecteren, mede omdat het gebruik van PSA
specifiek monoklonaal antilichaam niet mogelijk was. Het is dus heel waarschijnlijk dat
cAbPSA15 een conformatie van PSA bindt, die niet door het PSA specifiek monoklonaal
antilichaam wordt herkend. Voor aspecifieke eiwitten werden zowel caseïne als BSA apart of
tezamen in oplossing getest en ze gaven analoge resultaten. Enkel de resultaten voor het mengsel
van BSA en caseïne zijn weergegeven op figuur 27. Hier zijn enkel de relevante waarde
aangegeven, want vanaf een concentratie van 5 µg/ml cAbPSA11 coating werd het maximum van
de curve bereikt. Bij een concentratie lager dan 0,1 µg/ml gezuiverd PSA in oplossing werd geen
signaal meer verkregen.
76
Een kleine samenvatting van de cAbs wordt hier geven.
Tabel 4. Binding van verschillende kameel antilichaam fragmenten geïsoleerd uit PSA geïmmuniseerde kameel.
Coating
Binder
Caseïne PSA mAb mAb+PSA ACT
cAbPSA11 - - - + -
cAbPSA15 - + - - -
cAbPSA20 - + - - -
cAbACT16 - - - - +
Van de 4 verschillende PSA bindende kameel antilichaam fragmenten blijven er maar 3 effectief
bindende kameel antilichamen over. Het cAbPSA3 gaf in gezuiverde vorm geen respons meer.
Enkel het cAbPSA11 en 15 gaven een respons bij de competitieve ELISA, zodat een grote orde
van affiniteit voor PSA kan bepaald worden voor deze cAbPSA’s. Ze liggen in de range van 50
tot 60 nM. Voor een mogelijk gebruik in PSA diagnostische testen moet ook een goede capturing
kunnen gebeuren van PSA in oplossing. Enkel het cAbPSA11 kan PSA uit oplossing binden,
maar dit is echter met een te lage gevoeligheid, zodat het onder deze vorm niet bruikbaar is in de
vooropgestelde diagnostica.
77
5 Besluit
Een kameel werd verschillende malen geïmmuniseerd met het halfgezuiverde PSA mengsel. Uit
het serum van de geïmmuniseerde kameel werden via differentiële adsorptie op proteïne A en
proteïne G kolom de verschillende IgG subklassen gezuiverd. Een PSA specifiek
immuunantwoord werd vastgesteld voor zowel de conventionele (IgG1) als zware keten
antilichamen (IgG2 en IgG3) in solid fase ELISA en ook voor zowel vrij als gecomplexeerd PSA
in Western Blot. De immunisering van de kameel met het halfgezuiverde PSA mengsel is
geslaagd, zodat het mogelijk moet zijn om PSA specifieke kameel antilichaam fragmenten af te
zonderen.
Bloed werd afgetapt en de periferale bloedlymfocyten werden via een evenwichtscentrifugatie
geïsoleerd. Uit de lymfocyten werd mRNA afgezonderd. Het cDNA werd bereid vanaf dit
mRNA. Via een eerste PCR reactie met de primers Call001 en Call002 kon men al de mogelijke
VH genfragmenten amplifiëren. Door middel van een geneste PCR met primers die specifiek de
VHH genfragmenten herkennen, werden unieke restrictie enzym sites toegevoegd aan de VHH
genfragmenten. Door restrictie en extensieve zuivering van zowel fragment als fagmide vector
werd, na ligatie en transformatie in TG1 E. coli, een bibliotheek van 6x106 individuele
transformanten verkregen. De kwaliteit werd getest en men kwam op een percentage juiste insert
van 75. Met een in vitro selectie techniek, meerbepaald panning, werden verschillende klonen
geïsoleerd, wiens periplasmatisch extract in een ELISA experiment het PSA herkent. Uit
fingerprinting analyse met het restrictie enzym HinfI werden 4 verschillende kameel VHH
fragmenten geïdentificeerd. Door DNA sequentie onderzoek werd dit bevestigd. Al de
geïdentificeerde kameel antilichaam fragmenten bezitten de specifieke VHH aminozuur
substituties in hun FR2.
Om tot karakterisering over te gaan van de kameel antilichaam fragmenten, werden ze eerst in
een productie vector geherkloneerd om ze dan in bulk te produceren. Voor elk werd hierdoor een
goede opbrengst verkregen en de zuivering werd bekomen via IMAC. Op SDS-PAGE werd de
zuiverheid van de geproduceerde kameel antilichaam fragmenten getest en men zag eveneens dat
de experimenteel bepaalde moleculaire gewichten overeenkwamen met de theoretisch bepaalde
moleculaire gewichten. Elk kameel antilichaam fragment is degelijk gezuiverd geweest, enkel
werd vastgesteld dat het cAbPSA11 in een dimere vorm kon voorkomen. Al de rest van de
geproduceerde kameel antilichaam fragmenten gaven het juiste MW op SDS-PAGE.
78
Vervolgens werd een solid fase ELISA experiment verricht om de respons van de
geïdentificeerde kameel antilichaam fragmenten tegen het PSA rechtstreeks gecoat of gebonden
op PSA specifiek monoklonaal antilichaam na te gaan. Het cAbPSA11 herkent enkel het PSA
gebonden op PSA specifiek monoklonaal antilichaam. De cAbPSA15 en 20 herkennen enkel de
PSA rechtstreeks gecoat op microtiter plaat. Het verschil tussen deze PSA specifieke kameel
antilichaam fragmenten is doordat bij het coaten van PSA rechtstreeks op microtiter plaat, de
conformatie van PSA drastisch veranderd en dus een invloed heeft op de epitoop herkenning van
zowel monoklonaal antilichaam als kameel antilichaam fragment.
Om een idee van de range te krijgen van de cAb affiniteit voor PSA, werd een competitieve
ELISA uitgevoerd volgens Friguet et al. (1985). Hierbij werd een waarde van 50 en 60 nM
gevonden voor respectievelijk cAbPSA11 en cAbPSA15. Het cAbPSA11 herkent evenwel het
volledig gezuiverde PSA beter dan het halfgezuiverde PSA mengsel. Dit is waarschijnlijk te
wijten aan de aanwezigheid van verschillende contaminaties in het halfgezuiverde PSA mengsel.
Het cAbPSA15 kon niet weggecompetiteerd worden door zuiver PSA, maar wel door het
halfgezuiverde PSA mengsel. Deze discrepantie tussen het volledig gezuiverde PSA en het
halfgezuiverde PSA mengsel bij competitie met cAbPSA15, kan te wijten zijn aan de hogere
proportie van nicked (inactief) PSA in het halfgezuiverde PSA mengsel. Het cAbPSA15 herkent
mogelijk een gedenatureerd epitoop van PSA.
Voor een PSA diagnostische test moet het mogelijk zijn om met een kameel antilichaam fragment
PSA te kunnen binden uit oplossing. Hiervoor werd een spiking ELISA experiment gedaan
waarbij nagegaan werd in welke mate een bepaalde hoeveelheid van PSA, alleen of met
irrelevante proteïnen in oplossing, kon gebonden worden op een kameel antilichaam fragment.
Enkel voor cAbPSA11 werd een positief resultaat gevonden. Echter is de gevoeligheid van het
cAbPSA11 te laag om extreem lage hoeveelheden van een paar ng/ml PSA in bloed te kunnen
detecteren met de nodige graad van voldoening.
79
6 Samenvatting
Omdat prostaatkanker de tweede meest voorkomende doodsoorzaak is bij mannen, zoekt men
naar middelen om prostaat kanker te behandelen en te voorkomen. Sinds de ontdekking van het
prostaat-specifiek antigen (PSA) is de diagnose bij prostaatkanker patiënten in een
stroomversnelling gekomen. Door middel van een eenvoudige meting van verschillende vormen
van PSA in het serum van de mogelijke prostaatkanker patiënt kan snel een diagnose gesteld
worden. De scriptie bestaat erin binders te zoeken tegen het prostaat-specifiek antigen. PSA, lid
van de serine protease familie, is een antigen dat specifiek door de prostaat klier cellen wordt
uitgescheiden en in de bloedbaan wordt geïnhibeerd door het serpine, alpha-1-antichymotrypsine
(ACT). In de bloedbaan komt het PSA grotendeels voor onder een vrije vorm of als een complex
met alpha-1-antichymotrypsine. Er werden meerdere studies verricht waarbij de concentraties van
verschillende vormen van PSA in de bloedbaan werden gecorreleerd met de incidentie van
prostaat kanker, maar deze bleken inaccuraat te zijn. Het grootste probleem bleek dat men geen
onderscheid kon maken tussen de goedaardige of kwaadaardige vorm van prostaat kanker.
Recentere studies wijzen op het feit dat metingen van de verhouding van de vrije vorm van PSA,
in complex met alpha-1-antichymotrypsine, tot de totale hoeveelheid PSA in de bloedbaan, een
beter resultaat geeft. Hierdoor kan een duidelijk onderscheid gemaakt worden in de diagnose
tussen de goedaardige of kwaadaardige vorm van prostaat kanker. Meerbepaald de verhouding
van de hoeveelheid vrije vorm van PSA tot de totale hoeveelheid PSA in het bloedplasma is lager
bij patiënten met de kwaadaardige vorm van prostaat kanker dan met de goedaardige vorm van
prostaat kanker. De huidige diagnostische tests bepalen deze ratio met behulp van een simpele
bloedtest en dit geeft een indicatie welke vorm van prostaat kanker men heeft. Deze manier van
een primair bloedonderzoek is veel handiger dan alle mogelijke prostaat kanker patiënten een
digitaal rectaal onderzoek laten ondergaan. Nu worden deze snelle diagnoses uitgevoerd door
commerciële kits die gebruik maken van monoklonale antilichamen gericht tegen het PSA en
alpha-1-antichymotrypsine.
Antilichamen worden algemeen gebruikt als onderzoekshulpmiddel en hebben veel toepassingen
in diagnostische en therapeutische doelen. In de ULTR onderzoeksgroep heeft men de expertise
om kameel antilichaam fragmenten af te zonderen uit het bloed van geïmmuniseerde kamelen. De
kameel antilichaam fragmenten zijn enkel domein antilichamen. Ze hebben vele voordelen over
de conventionele monoklonale antilichamen: resistentie tegen zuur, temperatuur en chemicaliën
en gemakkelijke oppervlakte immobilisatie zonder de antigen bindende capaciteit te verliezen.
80
Voor diagnostiek zou men voordeel halen in het gebruik van kameel antilichaam fragmenten
boven de monoklonale antilichamen. We zoeken naar binders tegen het PSA door een kameel te
immuniseren, door een normaal immunisering protocol te hanteren. Na verschillende inspuitingen
met mg hoeveelheden PSA, heeft men bloed genomen van de met PSA geïmmuniseerde kameel.
Uit dit bloed werden de B-lymfocyten geïsoleerd en daaruit mRNA afgezonderd. cDNA werd
bereid vanaf het mRNA en op het totale cDNA werd een geneste PCR uitgevoerd. De delen van
antilichamen die specifiek zorgen voor binding met hun antigen werden zo geamplifieerd. Deze
worden in een fagmide vector geligeerd om een kameel antilichaam fragment bibliotheek te
verkrijgen. Door gebruik te maken van de panning techniek met behulp van M13 filamenteuze
fagen, kan men overgaan tot het zoeken naar de specifieke PSA binders. Na verschillende ronden
van in vitro selectie, panning, komt men tot een aanrijking van PSA bindende kameel antilichaam
fragmenten. Deze specifieke PSA binders kunnen dan opgepikt en tot expressie gebracht worden
in E.coli. Zo werden 3 verschillende binders tegen PSA (cAbPSA11, cAbPSA15 en cAbPSA20)
en 1 tegen ACT (cAbACT16) geïdentificeerd. De affiniteiten van cAbPSA11 en 15 bedragen
respectievelijke 50 nM voor volledig gezuiverd PSA en 60 nM voor het halfgezuiverde PSA. Het
cAbPSA11 en cAbPSA15 herkennen verschillende epitopen op PSA: cAbPSA11 een
conformationeel epitoop en cAbPSA15 een gedenatureerd epitoop. Met cAbPSA11 kon een
capturing gedaan worden van PSA uit oplossing, maar de gevoeligheid is te laag om te kunnen
aanwenden in een diagnostische test.
81
7 Literatuurlijst
1. Al-Lazikani, B., Lesk, A.M., Chothia, C. (1997). Standard conformations for the
canonical structures of immunoglobulins. Journal of Molecular Biology, 273, 927-948.
2. Andriole, G.L. & Catalona W.J. (1994). Prostate carcinoma. Annual Review of Medicine,
45, 351-359.
3. Belldegrum, A., Kirby, R.S., Oliver, R.T.D. (1998). New perspectives in prostate cancer.
Isis Medical Media, Oxford, 429 pp.
4. Catalona, W.J., Smith, D.S., Ratliff, T.L. et al. (1991). Measurement of prostate-specific
antigen in serum as a screening test for prostate cancer, The New England Journal of
Medicine, 324 (17), 1156-1161.
5. Chan, D.W., Bruzek, D.J., Oesterling, J.E., Rock, R.C., Walsh, P.C. (1987). Prostate-
specific antigen as a marker for prostatic cancer: a monoclonal and a polyclonal
immunoassay compared, Clinical Chemistry, 33 (10), 1916-1920.
6. Chothia, C. & Lesk, A.M. (1987). Canonical structures for the hypervariable regions of
immunoglobulins. Journal of Molecular Biology, 196, 901-917.
7. Christensson, A., Laurell, C.B., Lilja, H. (1990). Enzymatic activity of prostate-specific
antigen and its reactions with extracellular serine protease inhibitors.European Journal of
Biochemistry, 194 (3), 755-763
8. Christensson, A.,Björk, T., Nilsson, O. et al. (1993).Serum prostate specific antigen
complexed to alpha-1-antichymotrypsin as an indicator of prostate cancer. Journal of
Urology, 150, 100-105.
9. Clements, J.A., Merritt, T., Devoss, K. et al. (2000). Inactive free: total prostate specific
antigen ratios in ejaculate form men with suspected and known prostate cancer, compared
with yound control men, British Journal of Urology International, 86, 453-458.
10. Conrath, K.E. (2001) Exploring camel single-domain antibody fragments for
biotechnological applications. Scriptie, Vrije Universiteit Brussel, 150 pp.
11. Conrath, K.E., Lauwereys, M., Galleni, M. et al. (2001). Beta-lactamase inhibitors
derived from single-domain antibodies elicited in Camelidae. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy, 45 (10).
12. Conrath, K.E., Lauwereys, M., Wyns, L., Muyldermans, S. (2000). Camel single-domain
antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs.
Journal of Biological Chemistry, 276 (10), 7346-7350.
82
13. Conrath, K.E., Stijlemans, B., Wyns, L. et al. (2001). Differential epitope recognition by
single-domain antibody fragments generated in Camelids against the Trypanosome
Variant Surface Glycoprotein. Journal of Biological Chemistry, Submitted.
14. Corey, E., Wegner S.K., Corey, M.J., Vessella, R.L. (1997). Prostate-specific antigen:
characterization of epitopes by synthetic peptide mapping and inhibition studies. Clinical
Chemistry, 43 (4), 575-584.
15. Decanniere, K., Desmyter, A., Lauwereys, M., Ghahroudi, M.A., Muyldermans, S.,
Wyns, L. (1999). A single-domain antibody fragment in complex with RNase A: non-
canonical loop structures and nanomolar affinity using two CDR loops. Structure, 7 (4),
361-370.
16. Decanniere, K., Muyldermans, S., Wyns, L. (2000). Canonical antigen-binding loop
structures in immunoglobulins: more structures, more canonical classes? Journal of
Molecular Biology, 300, 83-91.
17. Desmyter, A., Decanniere, K., Muyldermans, S., Wyns, L. (2001). Antigen specificity and
high affinity binding provided by one single loop of a camel single-domain antibody.
Journal of Biological Chemistry, 276, 26285-26290.
18. Desmyter, A., Transrue, T.R., Ghahroudi, M.A. et al. (1996). Crystal structure of a camel
single-domain VH antibody fragment in complex with lysozyme. Nature Structural
Biology, 3 (9), 803-811.
19. Diamandis, E.P. (2000). Prostate-specific antigen: a cancer fighter and a valuable
messenger? Clinical Chemistry, 46 (7), 896-900.
20. Friguet, B., Chafotte, A.F., Djavadi-Ohaniance, L., Goldberg, M.E., 1985. Measurement
of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked
immunosorbent assay. Journal of Immunological Methods, 77 (2), 305-319.
21. Ghahroudi, M.A. (1997). Generation and characterization of phage-displayed camel
single-domain antibodies. Scriptie, Vrije Universiteit Brussel, 161 pp.
22. Ghahroudi, M.A., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. (1997).
Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain
antibodies. FEBS Letters, 414, 521-526.
23. Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S. et al. (1993). Naturally occurring
antibodies devoid of light chains. Letters to Nature, 363, 446-448.
24. Hoogenboom, H.R. & Chames, P. (2000). Natural and designer binding sites made by
phage display technology. Immunology Today, 21 (8), 371-377.
83
25. Jung, K., Brux, B., Lein, M. et al. (2000). Molecular forms of prostate-specific antigen in
malignant and benign prostatic tissue: biochemical and diagnostic implications. Clinical
Chemistry, 46 (1), 47-54.
26. Kabat, E., Wu, T.T., Perry, H.M., Gottesman, K.S., Foeller, C. (1991). Sequence of
proteins of immunological intrest. US Public Health Services, NIH Bethesda, M.D.,
Publication No. 91-3242
27. Lauwereys, M., Ghahroudi, M.A., Desmyter, A. et al. (1998). Potent enzyme inhibitors
derived from dromedary heavy-chain anitbodies. The EMBO Journal, 17 (13), 3512-3520.
28. Leinonen, J., Zhang, W.M., Stenman, U.H. (1996). Complex formation between PSA
isoenzymes and protease inhibitors. Journal of Urology, 155, 1099-1103.
29. Lesk, A.M. & Chothia, C. (1988). Elbow motion in the immunoglobulins involves a
molecular ball-and-socket joint. Nature, 355, 188-190.
30. Lilja, H., Christensson, A., Dahlén, U. et al. (1991). Prostate-specific antigen in serum
occurs predominantly in complex with α1-antichymotrypsin. Clinical Chemistry, 37 (9),
1618-1625.
31. Lilja, H., Cockett, A.T.K., Abrahamsson, P.A. (1992). Prostate-specific antigen
predominantly forms a complex with α1-antichymotrypsin in blood. Cancer Supplement,
70 (1), 230-234.
32. Lundwall, A. & Lilja, H.(1987). Molecular cloning of human prostate specific antigen
cDNA. FEBS letters, 214 (2), 317-322.
33. Michel, S., Deléage, G., Charrier, J.P. et al. (1999). Anti-free postate specific antigen
monoclonal antibody epitopes defined by mimotopes and molecular modeling. Clinical
Chemistry, 45 (5), 638-650.
34. Muyldermans, S. & Lauwereys, M. (1999). Unique single-domain antigen binding
fragments derived from naturally occurring camel heavy-chain antibodies. Journal of
Molcular Recognition, 12,131-140.
35. Muyldermans, S., Atarhouch, T., Saldanha, J., Barbosa, J.A.R.G., Hamers, R. (1994).
Sequence and structure of VH domains from naturally occuring camel heavy chain
immunoglobulins lacking light chians. Protein Engineering, 7 (9), 1129-1135.
36. Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. (2001). Recognition of antigens by single-
domain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in
Biochemical Sciences, 26 (4), 230-235.
37. Nguyen, V.K., Desmyter, A., Muyldermans, S. (2001). Functional heavy-chain antibodies
in Camelidae. Advances in Immunology, Submitted.
84
38. Nguyen, V.K., Hamers, R., Wyns, L., Muyldermans, S. (2000). Camel heavy-chain
antibodies: diverse germline VHH and specific mechanisms enlarge the antigen-binding
repertoire. The EMBO Journal, 19 (5), 921-930.
39. Nguyen, V.K., Muyldermans, S., Hamers, R. (1998). The specific variable domain of
camel heavy-chain antibodies is encoded in the germline. Journal of Molecular Biology,
275, 413-418.
40. Noldus, J., Chen, Z., Stamey, T.A. (1997). Isolation and characterization of free form
prostate specific antigen (f-PSA) in sera of men with prostate cancer. Journal of Urology,
158, 1606-1609.
41. Nurmikko, P., Väisänen, V., Piironen, T., Lindgren, S., Lilja, H., Pettersson, K. (2000).
Production and characterization of novel anti-prostate-specific antigen (PSA) monoclonal
antibodies that do not detect internally cleaved Lys145-Lys146 inactive PSA. Clinical
Chemistry, 46 (10), 1610-1618.
42. Padlan, E.A. (1994). Anatomy of the antibody molecule. Molecular Immunology, 31 (3),
169-217.
43. Peter, J., Unverzagt, C., Hoesel, W. (2000). Analysis of free prostate-specific antigen
(PSA) after chemical release from the complex with α1-antichymotrypsin (PSA-ACT),
Clinical Chemistry, 46 (6), 474-482.
44. Pettersson, K., Piironen, T., Seppälä, M. et al. (1995). Free and complexed prostate-
specific antigen (PSA): in vitro stability, epitope map, and development of
immunofluorometric assays for specific and sensitive detection of free PSA and PSA-α1-
antichymotrypsin complex, Clinical Chemistry, 41 (10), 1480-1488.
45. Rafferty, B., Rigsby, P., Rose, M., Stamney, T., Das, R.G. (2000). Reference reagents for
prostate-specific antigen (PSA): establishment of the first international standards for free
PSA and PSA (90:10). Clinical Cheminstry, 46 (9), 1310-1317.
46. Riechman, L., Muyldermans, S. (1999). Single domain antibodies: comparison of camel
VH and camelised human VH domains. Journal of Immunological Methods, 231, 25-38.
47. Robert, M., Gibbs, B.F., Jacobson, E., Gagnon, C. (1997). Characterisation of prostate-
specific antigen proteolytic activity on its major physiological substrate, the sperm
motility inhibitor precursor/semenogelin I. Biochemistry, 36, 3811-3819.
48. Roitt, I. (1988). Essential Immunology. Blackwell Scientific Publications, London, 286
pp.
49. Sambrook., J. & Russell, D.W. (1989). Molecular Cloning – A laboratory manual. Cold
Spring Harbor Laboratory Press, New York.
85
50. Skerra, A. & Plückthun, A. (1988). Assembly of functional immunoglobulin Fv fragments
in Escherichia coli. Science, 240, 1038-1041.
51. Smith, G.P. & Petrenko, V.A. (1997). Phage Display. Chemical Review, 97, 391-410.
52. Spinelli, S., Frenken, L., Hermans, P., Verrips, T., Brown, K., Tegioni, M., Cambillau, C.
(2000). Camelid heavy-chain variable domains provide efficient combining sites to
haptens. Biochemistry, 39, 1217-1222.
53. Stenman, U.H., Leinonen, J., Alfthan, H., Rannikko, S., Tuhkanen, K., Alfthan, O.
(1991). A complex between prostate-specific antigen and α1-antichymotrypsin is the
major form of prostate-specific antigen in serum of patients with prostatic cancer: assay of
the complex improves clinical sensitivity for cancer, Cancer Research, 51, 222-226.
54. Tonegawa, S., Sakano, H., Kurosowa, K., Weigert, M. (1981). Identification of D
segments of immunoglobulin heavy chain genes and their rearrangement in T-lymfocytes.
Nature, 290, 562-565.
55. Vihinen, M. (1994). Modeling of prostate specific antigen and human glandular kallikrein
structures. Biochemical and Biophysical Research Communication, 204 (3), 1251-1256.
56. Vu, K.B, Ghahroudi, M.A., Wyns, L., Muyldermans, S. (1997). Comparison of llama VH
sequences from conventional and heavy chain antibodies. Molecular Immunology, 34 (16-
17), 1121-1131.
57. Wang, T.J., Slawin, K.M., Rittenhouse, H.G., Millar, L.S., Mikolajczyk, S.D. (2000).
Benign prostatic hyperplasia-associated prostate-specific antigen (BPSA) shows unique
immunoreactivity with anti-PSA monoclonal antibodies. European Journal of
Biochemistry, 267, 4040-4045.
58. Watt, K.W.K., Lee, P.J., M’Timkulu, T., Chan, W.P., Loor, R. (1986). Human porstate-
specific antigen: structural and functional similarity with serine proteases. Proceedings of
the National Academy of Sciences, 83, 3166-3170.
59. Woolf, S.H. & Rothemich, S.F. (1999). Screening for prostate cancer: the roles of science,
policy, and opinion in determining what is best for patients. Annual Review of Medecine,
50, 207-221.
60. Wu, P., Leinonen, J., Koivunen, E., Lankinen, H., Stenman, U.H. (2000). Identification of
novel prostate-specific antigen-binding peptides modulating its enzyme activity.
European Journal of Biochemistry, 267, 6212-6220.
61. Zegers, I., Deswarte, J., Wyns, L. (1999). Trimeric domain swapped barnase. Proceedings
of the National Academy of Sciences USA, 96 (3), 818-822.
86
62. Zhang, W.M., Finne, P., Leinonen, J., Vesalainen, S., Nordling, S., Stenman, U.H. (1999).
Measurement of the complex between prostate-specific antigen and α1-protease inhibitor
in serum. Clinical Chemistry, 45 (6), 814-821.
63. Zhang, W.M., Leihonen, J., Kalkkinen, N., Dowell, B., Stenman, U.H. (1995).
Purification and characterization of different molecular forms of prostate-specific antigen
in human seminal fluid. Clinical Chemistry, 41 (11), 1567-1573.
64. Zhou, A.M., Tewari, P.C., Bluestein, B.I., Caldwell, G.W., Larsen, F.L. (1993). Multiple
forms of prostate-specific antigen in serum: differences in immunorecognition by
monoclonal and polyclonal assays. Clinical Chemistry, 39 (12), 2483-2491.