issn 1517-1981 sn 1678-0434 novembro, 2016 outubro...
TRANSCRIPT
38ISSN 1517-1981
Outubro 2000ISSN 1678-0434Novembro, 2016
Influência da Temperatura eUmidade no Funcionamentode um Biossensor comMicrocantilever
ISSN
Novembro, 2016
1678-0434
38
São Carlos, SP2016
Alexandre MargaridoFernando M. Araujo MoreiraPaulo Sérgio de Paula Herrmann Jr
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
Embrapa Instrumentação
Influência da Temperatura eUmidade no Funcionamentode um Biossensor comMicrocantilever
Margarido, Alexandre Influência da temperatura e umidade no funcionamento de um biossensorcom microcantilever / Alexandre Margarido, Fernando M. Araujo-Moreira,Paulo Sérgio de Paula Herrmann Jr. -- São Carlos: Embrapa Instrumentação,2016. 28 p. – (Embrapa Instrumentação. Boletim de Pesquisa e desenvolvimento,ISSN: 1678-0434; 38).
1. Microscopio de força atômica. 2. MFA. 3. Microcantilever. 4. Biossensor.5. Amortecimento. I. Araujo-Moreira, Fernando M. II. Herrmann Junior, PauloSergio de Paula. III. Título. IV. Série.
© Embrapa 2016
M327i
CDD 21 ED. 543.0812502.82
Exemplares desta publicação podem ser adquiridos na:
Embrapa InstrumentaçãoRua XV de Novembro, 1452Caixa Postal 741CEP 13560-970 - São Carlos-SPFone: (16) 2107 2800Fax: (16) 2107 2902www.embrapa.br/instrumentacao
Comitê de Publicações da UnidadePresidente: João de Mendonça NaimeSecretária Executiva: Valéria de Fátima CardosoMembros:Valéria de Fátima CardosoCinthia Cabral da CostaElaine Cristina ParisMaria Alice MartinsCristiane Sanchez FarinasMembro Suplente: Paulo Renato Orlandi LassoRevisor editorial: Valéria de Fátima CardosoRevisor de texto: Letícia PatraconNormalização bibliográfica: Valéria de Fátima CardosoTratamento das ilustrações: Valentim MonzaneEditoração eletrônica: Valentim MonzaneCapa: Foto da Capa:
1ª edição1ª impressão (2016): tiragem 300
Alexandre MargaridoAlexandre Margarido
Todos os direitos reservadosA reprodução não-autorizada desta publicação, no todo ou em parte,
constitui violação dos direitos autorais (Lei nº 9.610).Dados internacionais de Catalogação na publicação (CIP)
Embrapa Instrumentação
Sumário
Resumo ................................................................................................ 5
Abstract ............................................................................................... 6
Introdução ............................................................................................ 7
Materiais e Metodos.............................................................................. 10
Resultados e Discussões ....................................................................... 13
Conclusão .......................................................................................... 23
Referências ......................................................................................... 24
Resumo
O microscópio de força atômica (MFA) pode utilizar um microcantilever ( C) como biossensor, por meio de transdução de processos químicos ou físicos em uma resposta mecânica. Biossensores de mC permitem a detecção através da variação de sua frequência de ressonância ou pela indução de tensões superficiais que podem provocar torções na haste. Neste contexto, serão analisados o fator qualidade (Q), em detrimento ao amortecimento gerado pela camada funcional (funcionalização ou revestimento biológico) e o Drive Amplitude (mV) que exibe a energia necessária pelo sistema para manter a mesma amplitude de vibração, em condições diferentes de temperatura e umidade relativa (UR%). Foram testados os dois principais métodos de funcionalização citados na literatura, em que foi correlacionado o efeito da espessura da camada funcional com o desvio na frequência de ressonância. Foi comprovado que quanto mais fina e uniforme for a camada funcional, o biossensor terá um comportamento mais próximo a de um mC sem revestimento, que é considerado a condição ideal, pois é menos susceptível a mudanças ambientais.
Palavras-chave: Microscópio de força atômica, MFA, microcantilever, biossensor, amortecimento.
m
¹ Engenheiro da computação, Doutor, São Carlos, SP² Engenheiro elétrico, Doutor, Pesquisador, Embrapa Instrumentação, São Carlos, SP³ Engenheiro de materiais, Doutor, Professor, Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, SP
Alexandre Margarido¹Fernando M. Araujo Moreira²Paulo Sérgio de Paula Herrmann Jr³
Influência da Temperatura eUmidade no Funcionamentode um Biossensor comMicrocantilever
Abstract
The atomic force microscope (AFM) can use a microcantilever (mC) as biosensor transduction through chemical or physical means into a mechanical response. Biosensor of mC allow detection through the variation of its resonant frequency or the induction of surface tensions that may cause twisting of the rod. In this context, we will analyze the quality factor (Q) over the damping generated by the functional layer (functionalization or organic coating) and Drive Amplitude (mV) that displays the energy required by the system to maintain the same amplitude of vibration, under conditions different temperature and humidity (UR%). The two main functionalization methods cited in the literature were tested, it was correlated the effect of the thickness of the functional layer with the deviation in the resonance frequency. It was confirmed that the thin and uniform is the functional layer, the biosensor will have a behavior closer to that of an uncoated mC, which is considered the ideal condition, because it is less susceptible to environmental changes.
Index terms: Atomic Force Microscope, AFM, microcantilever, biosensor, damping.
The Influence of theTemperature and Humidityin a MicrocantileverBiosensor Response
Introdução
A microscopia de força atômica (AFM do inglês, Atomic Force Microscopy) é uma metodologia derivada da família do SPM, (do inglês, Scanning Probe Microscopy) que consiste na varredura de uma sonda sobre uma superfície. Tal técnica vem proporcionando grandes conquistas em nanociência e nanotecnologia, destacando-se por ser uma técnica que permite mapear a topografia de uma amostra condutora, semicondutora e isolante, bem como moléculas biológicas em solução, desde a escala micrométrica até a atômica (SINGAMANENI et al., 2008).
O princípio básico do AFM consiste no emprego de uma haste (microcantilever - mC) com uma agulha (tip) de um lado e uma parte refletiva na outra face. Normalmente a haste do mC pode receber uma fina camada de ouro, alumínio ou de outros materiais para aumentar a reflexão do laser para um fotodetector de quatro quadrantes (Figura 1). O feixe refletido atinge uma posição sensível do fotodetector, onde a distância percorrida é proporcional à deflexão da haste. Dessa forma, pode-se também estipular a deflexão com grande precisão por intermédio de interferometria da reflexão da haste (RAITERI; GRATTAROLA; BERGER, 2002).
Figura 1. Método de detecção da deflexão ótica. A deflexão do mC é detectada utilizando um feixe de laser, que é refletido pela superfície do microcantilever. Z, F, h, l e w são respectivamente o comprimento da haste, força detectada, espessura, comprimento e largura do mC respectivamente (STEFFENS et al., 2012).
A constante de mola “k” do mC, traduz a rigidez da haste, ou seja, representa uma medida de sua dureza, e é estritamente dependente à sua geometria e material, para microcantilevers retangulares pode ser calculado de acordo com a Equação 1: [1]
onde k é a constante de mola do mC (N/m), E é o modulo de Young (ESi3N4 = 3 * 1011 N*m-2), l é o comprimento, h a espessura (m) e w a largura (m) (IMAMURA et al., 2016; SINGAMANENI et al., 2008).
7Influência da Temperatura e Umidade no Funcionamento de um Biossensor com Microcantilever
A seletividade, sensibilidade, reprodutibilidade e a miniaturização de sensores bioquímicos são desejáveis para inúmeras aplicações industriais, o que, consequentemente, implica em uma elevada complexidade, funcionalidade e compacidade. Sensores comerciais comumente traduzem a sensibilidade em propriedades elétricas, neste trabalho será analisada a resposta mecânica de uma micro-haste de Nitreto de Silício (Si3N4), chamado microcantilever (mC), os quais são muito utilizados na técnica de MFA. Estas hastes podem ser revestidas em apenas uma das faces ou em ambas, com uma camada biosensitiva (funcionalização).
Um biossensor é um sensor que, quando exposto a um tipo particular de substância (a substância a analisar – analito alvo), transforma uma informação química, por exemplo, como a polaridade ou a diferença de concentração, em um sinal analiticamente mensurável, tal como resistência elétrica, condutividade, diferença de potencial, frequência de ressonância, entre outros. Esta transformação é chamada de transdução de sinal e é de importância central para o funcionamento de qualquer sensor e/ou biossensor (OLIVEIRA et al., 2013; STEFFENS et al., 2012; STEFFENS et al., 2014).
A tecnologia empregada nos biossensores de mC é uma técnica de detecção com sensibilidade extremamente alta (podendo chegar a ppt) e com amplas aplicações na física, química e biologia. A adsorção de moléculas na superfície do mC ou mudanças extremas no ambiente, como por exemplo, densidade e viscosidade, são fatores que alteram sua frequência de ressonância (BUCHAPUDI et al., 2011; FAEGH et al., 2015).
O fator qualidade (Q) é o fator que determina a resolução de leitura do MFA e depende dos mecanismos de amortecimento presentes no mC ou no meio físico. Para os microcantilevers de modo NC operados no ar, Q é tipicamente da ordem de algumas centenas, mas pode chegar a centenas de milhares em pressão efetiva negativa e a baixas temperaturas, onde os ruídos são minimizados (WIESENDANGER, 1994). A otimização de microcantilevers, possibilitou um aumento do fator Q para valores tão elevados como 10.000. A operação em frequências altas, da ordem de 1,5 MHz permite uma resolução de massa teórica de cerca de 20 ag/Hz (FINOT et al., 2008).
O fator Q tende a infinito quando o amortecimento sobre a haste é mínimo, e este amortecimento pode ser ocasionado pelas partículas presentes no ambiente (meio mais denso), pressão e temperatura. O fator Q pode ser calculado a partir da equação 2: [2]
onde (Hz) é a frequência de ressonância de um oscilador amortecido, c é a constante de amortecimento e m é a massa (g) do oscilador. Elevando-se o fator Q aumenta-se a sensibilidade das medições e valores na faixa de 100-1.000 são típicos para essas medidas (BHUSHAN, 2010).
8Influência da Temperatura e Umidade no Funcionamento de um Biossensor com Microcantilever
O fator Q é também considerado a medida da largura da curva de ressonância e pode ser calculado dividindo-se o pico da frequência de ressonância w (Hz) pela largura à metade da potência máxima ( ) (Figura 2 (A)). O fator Q aumenta quanto mais estreito for o pico de ressonância (Figura 2 (B)), o que também aumenta a precisão da leitura equação 3 (Q CONTROL, 2011).
[3]
(A) (B)
Figura 2. (A) Fator Q em função da potência/média a meia altura e (B) comportamento do gráfico em função dos valores de Fator Q, adaptado de Q CONTROL (2011).
Em modo dinâmico, uma pequena alteração na massa do mC (∆m) provoca alteração na frequência de ressonância, que pode ser calculada por intermédio da equação 4: [4]
onde k é a constante de mola do mC (N/m), f0 e f1 são as frequências de ressonância inicial e após adsorção de massa (Hz), respectivamente. O mC é medido no MFA para obter a constante de mola (k) e frequência de ressonância e o fator Q antes da adição de massa. A frequência de ressonância e o fator Q são obtidos pelo ajuste dos dados dos espectros de vibração para a resposta da amplitude, comparado com um oscilador harmônico simples (BOWEN et al., 2010; SADER et al., 1999).
Quando ocorre adsorção na superfície de um microcantilever, a frequência de ressonância irá mudar de acordo com a lei de Hooke, que pode ser expressa pela equação 5:
[5]
onde é a massa adsorvida, que é muito menor que a massa efetiva do microcantilever, e são a variação da frequência de ressonância após a adsorção de massa e frequência de ressonância original, respectivamente (ONO et al., 2003).
9Influência da Temperatura e Umidade no Funcionamento de um Biossensor com Microcantilever
ϫ
A adsorção mínima de massa detectável é dependente da alteração mínima detectável da fase do sistema de ressonância (valor fixo, onde o ruído térmico e eletrônico do circuito de realimentação do AFM é levado em consideração) que pode ser expresso pela equação 6:
[6]
O fator Q domina a resolução de detecção de massa, onde o ar e a umidade são fatores dominantes na determinação do fator Q. Diminuindo-se o amortecimento causado pelo ar, pode-se melhorar significativamente o valor de Q e, desse modo, melhorar a resolução de detecção de massa do mC ressonante. Aparentemente, diminuindo-se as dimensões do mC, pode-se diminuir o efeito de amortecimento do ar. Entretanto, uma área de superfície mínima é necessária para capturar especificamente os analitos alvos, que são de dimensão nanométrica. Alternativamente, estudos teóricos e experimentais indicaram que a utilização de modos de ressonância de ordem superior podem efetivamente aumentar o fator Q e a resolução de detecção de massa (LI; LEE, 2012).
Neste trabalho, foram avaliadas através do modo dinâmico de leitura em MFA, as alterações das respostas de frequência de ressonância em mC funcionalizados utilizando duas metodologias de fixação da enzima Álcool desidrogenase em diferentes condições de temperatura e UR%.
Materiais e métodos
Instrumentação utilizada
A resposta de frequência do microcantilever durante a excitação é medida TMutilizando um Veeco V MFA – Dimension . O laser emitido de um diodo é
colimado e apontado para a ponta do mC, este é refletido para um fotodetector de quatro quadrantes. A resposta de um espectro de ressonâncias da excitação
TMde um mC é analisado pelo software NanoScope . O AFM Dimension Veeco V é equipado com um conjunto de cerâmicas piezoelétricas responsáveis pela movimentação e excitação da haste do mC dentro de uma faixa de frequências determinada pelas características do mC e do meio físico em que se encontra. Por intermédio da reflexão do laser em um fotodetector, o equipamento encontra a frequência de ressonância e mantém a excitação nesta frequência.
Reagentes usados nos experimentos
Todos os reagentes foram adquiridos da Sigma–Aldrich e utilizados como descrito a seguir: Álcool Desidrogenase de “Saccharomyces cerevisiae” (A7011); “(3-Aminopropyl) triethoxysilane” 99 % (APTES) (440140); Solução de Glutaraldeído (GLD) Grade I, 25 % em água (G5882); “11-Amino-1-undecanethiol hydrochloride” 99% (TIOL) (674397), Etanol puro 200 proof, para biologia molecular (E7023) e J.T.Baker- 18078-TOLUENO, PA, ACS, 99,5 %. A água foi purificada pelo sistema Milli-Q (Millipore Co. 18,0 MW*cm-1).
10Influência da Temperatura e Umidade no Funcionamento de um Biossensor com Microcantilever
Gás Nitrogênio 5.0 com pureza mínima de 99,999% e umidade inferior a 2ppm-mol, Nitrogênio Líquido com pureza mínima de 99,999% e umidade inferior a 2ppm.
Microcantilevers
Os microcantilevers compostos de Nitreto de Silício foram adquiridos da NT-MDT, modelo NSG-10 e NSG-03, conforme Tabela 1.
Tabela 1. Características físicas dos microcantilevers utilizados.
Procedimento de funcionalização do microcantilever
Os mC foram imersos em solução Piranha (70% H2SO4 conc. em 30% H2O2,
1:1) por 5 min seguido de 3 imersões em H2O Milli-Q a 18,2 MW por 5 min e exposição a UV 240nm por 20 min para remoção de contaminantes metálicos e orgânicos da superfície.
A enzima Álcool Desidrogenase foi utilizada como elemento sensor e tem como substrato principal o etanol, seguido de metanol e isopropanol. Para imobilização da enzima foram utilizados os reagentes:
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES), Glutaraldehyde solution (GLD) 25% in H2O e 11-Amino-1-undecanethiol hydrochloride 99% (TIOL).
Para a imobilização da enzima na superfície do mC, é necessária a aplicação de um ou mais elementos (APTES, ouro, TIOL, glutaraldeído) de maneira que se estabeleça ligação covalente entre os componentes da camada funcional. Esta funcionalização foi realizada de duas maneiras distintas: pela formação de monocamadas auto organizadas (self assembled monolayer – SAM) e por ligações covalentes cruzadas entre os grupos amino do suporte com os grupos amino das biomoléculas, empregando-se reagentes bi ou multifuncionais (LOJOU; BIANCO, 2006).
11Influência da Temperatura e Umidade no Funcionamento de um Biossensor com Microcantilever
Modelo do µC NSG10 NSG03
Comprimento do µC (C) [µm] 95 ± 5 135 ± 5
Largura do µC (L) [µm] 30 ± 3 30 ± 3
Espessura do µC [µm] 2.0 ±0.5 1.5 ±0.5
Frequência de ressonância (KHz) 140 - 390 47 - 150
Constante de mola (K) [N/m] 3,1 – 37,6 0,35 – 6,1
Ativação por APTES: pode ser realizada diretamente no mC, por vaporização
modificando a superfície. Ocorre à formação de compostos de silano em
monocamadas sobre a superfície oxidada do silício com o grupo silanol ativo (Si-
OH), formando uma terminação NH2, possibilitando ligações covalentes com o
grupo amino do glutaraldeído (GLD), estes passos estão mostrados na Figura 3
(VASHIST et al., 2014).
Imediatamente após a limpeza dos mC, foram ativados com 40mL de vapor de
APTES com trietilamina 100%, por 40 minutos em um dissecador de 1L,
previamente purgado com gás Nitrogênio por 10 minutos para a eliminação do
oxigênio (figura 3, parte tracejado).
Figura 3. Esquema ilustrando a ativação com o reagente APTES em SAM.
Ativação com TIOL: Para a ligação do Tiol os mC de silício receberam uma
camada de ouro de 20,0 nm pela técnica de sputtering, lavados em solução
piranha por 5 minutos, seguido de água milli-Q e etanol por 5 minutos. Em
seguida foram depositados em um recipiente com solução de TIOL a 1mM
solubilizado em etanol 200 proof com o pH ajustado para 8.0 com trietilamina,
conforme demonstrado na área tracejada da Figura 4. Os mC permaneceram
nessa solução por 24 horas a 25ºC para a formação de uma monocamada
densa e organizada, com terminais NH2 livres.
Figura 4. Esquema ilustrando a ativação do microcantilever com o reagente
TIOL em SAM.
Ligação com a enzima álcool desidrogenase
Com a superfície do mC ativada (apenas o recobrimento com o TIOL ou APTES),
a funcionalização envolvendo a enzima foi realizada de duas formas diferentes:
12Influência da Temperatura e Umidade no Funcionamento de um Biossensor com Microcantilever
Ligação em camadas auto-organizadas
O mC foi submetido a uma solução de glutaraldeído a 2% em tampão 50 mM de
fosfato de sódio, pH 8,6 por 1h e após lavado com tampão para remover os
agentes não ligados. Em seguida foi mantido em uma solução de fosfato de
sódio pH 8,6 contendo a enzima na concentração de 26 mg/mL por 6 h a 25ºC.
Para finalizar, o mC foi lavado em tampão fosfato de sódio pH 8,6 para remoção
das enzimas não ligadas, formando assim monocamadas auto-organizadas
(SAM) com ligações covalentes, e armazenado a 8,0 ºC por 24 h antes de ser
utilizado.
Ligação covalente-cruzada
Foram depositados sobre a superfície do mC 10,0 (mL) da solução de tampão
fosfato de sódio pH 8,0 50,0 (mM) com enzima álcool desidrogenase na
concentração de 26,0 (mg/mL) acrescido de 2,0 (µL) de Glutaraldeído (25%),
foi diretamente adicionado sobre o mC ativado (APTES ou TIOL). Após 1 min o
microcantilever é removido da solução e mantido por 3h em temperatura
ambiente para finalizar a polimerização, seguido de armazenagem a 8,0 (ºC) por
24h. O tempo de exposição do mC ativado ao glutaraldeído com as enzimas
solubilizadas confere a espessura da camada funcional, fato este difícil de
controlar.
Resultados e discussões
Análise física do Microcantilever com MFA
O MFA utiliza o modo dinâmico para leituras de superfícies em modo de não
contato (NC) ou quasi non contact (quasi-NC ou tapping® mode) e também para
avaliar a condição de uso do mC antes de depois da varredura de uma amostra
para geração de imagem. A alteração na frequência de ressonância do mC indica
que ocorreu alteração de massa na superfície, sendo assim, pode ter adsorvido
material. Quando ocorre qualquer variação permanente na frequência de
ressonância original, o mC deve ser substituído, pois indica que a leitura da
superfície poderá não ocorrer de forma adequada.
O MFA Dimension Veeco V é equipado com um conjunto de cerâmicas
piezolétricas responsáveis pela movimentação e excitação do mC dentro de uma
faixa de frequências de 10 a 1000KHz. Através da reflexão do laser em um
fotodetector o equipamento identifica a frequência de ressonância e mantém a
excitação nesta frequência. Através da análise gráfica do valor de amplitude,
em volts (V), pela frequência (KHz) (Figura 5) é possível visualizar em tempo
real qualquer alteração na resposta de frequência de ressonância.
13Influência da Temperatura e Umidade no Funcionamento de um Biossensor com Microcantilever
Figura 5. Tela mC Tune do software Nanoscope V, utilizada para verificar a
frequência de ressonância para um microcantilever.
Microcantilevers novos com constante de mola k acima de 20,0 N/m e com
comprimento de até 140,0 mm, possuem frequência de ressonância acima de
100 KHz, geralmente apresentando um único e bem definido pico de frequência
de ressonância (harmônico) dentro da faixa de frequências (50 a 1000 KHz)
como pode ser visualizado na Figura 6(A), modelo NSG10 Q=400 (3.1 a 37,6
N/m). No entanto, mC com constantes de mola baixas, tendem a formar mais de
um harmônico, Figura 6 (B), modelo NSG03 Q=359 (0,36 a 6,1 N/m) e mC para
aplicação em modo contato com constantes de mola muito baixas (NanoWorld
38763f17l497 Q=300 (0.001 a 0.1 N/m com comprimento de 400mm), (Figura
6(C)), formam naturalmente vários harmônicos, o que inviabiliza sua utilização
para aplicações em modo dinâmico.
(A) (B)
(C)
Figura 6. Resposta de ressonância de mC sem
revestimento na faixa de 50 a 1000MHz para
os modelos (A) NT-MDT NSG10, (B) NT-MDT
NSG03 e (C) NanoWorld 38763f17l497 de modo contato.
14Influência da Temperatura e Umidade no Funcionamento de um Biossensor com Microcantilever
A aplicação de uma camada funcional bioativa gera um amortecimento para a vibração da haste, reduzindo o fator de qualidade Q e fazendo com que aumente o erro de leitura da frequência de ressonância devido ao alargamento da curva de ressonância (Figura 7(D)). Quanto maior este amortecimento, múltiplos harmônicos podem aparecer (Figura 7 (A), (B) e (C)). Múltiplos harmônicos próximos não são desejáveis (Figura 7 (B)), pois em aplicações como biossensor no modo dinâmico, ao se adsorver um analito alvo, a frequência de ressonância se altera podendo migrar de um pico para outro próximo, causando desvios na leitura.
(A) (B)
(C) (D)
Figura 7. Resposta da frequência de ressonância para mC funcionalizados. Nota-se que com valores de fator Q mais baixos, o espectro fica ruidoso e a ponta do pico deixa de ser estreita e tornando-se arredondada, com tendência de formação de vários harmônicos e diminuindo a acuracidade da leitura.
A funcionalização do mC aumenta a espessura e normalmente atua como um amortecedor, alterando a eficiência da excitação exigindo mais energia para manter a mesma amplitude de vibração (Drive Amplitude (mV)) e geralmente altera também a frequência de ressonância. Desta forma, o fator Q é reduzido e, por conseguinte, aumenta-se o erro de leitura.
Para melhores resultados de sensibilidade em biossensores operados em
condições ambiente, são preferencialmente utilizados mC de alta frequência
((tapping®) acima de 100 KHz) com comprimento entre 90-140 mm.
15Influência da Temperatura e Umidade no Funcionamento de um Biossensor com Microcantilever
Fatores como temperatura, UR%, pressão e densidade do meio afetam diretamente a energia necessária para manter a amplitude de vibração, principalmente em mC com recobrimento funcional.
Comparações dos diferentes mC e modos de funcionalização
Foram comparados a energia necessária para manter a mesma amplitude (Drive Amplitude) e fatores de qualidade de mC novos sem recobrimento e mC funcionalizados sob diferentes condições: (A) ar e pressão atmosférica de 690,7mm, 25ºC de temperatura e umidade de 50% (condições ambiente); (B) Ar sob pressão atmosférica de 690,7mm, a 25ºC e umidade de 15%; (C) Gás de Nitrogênio 5.0 sob pressão atmosférica de 690,7mm, a 25 ºC e 25 ºC e umidade de 0,001% e (D) Vapor de Nitrogênio Líquido sob pressão atmosférica de 690,7mm, a 25 ºC e -2ºC e umidade de 0,001%.
Neste experimento, três diferentes métodos de funcionalização foram testados nas seguintes condições:
1 – Funcionalização por monocamadas auto-organizadas (SAM) pela ativação com vapor de APTES, seguido de Glutaraldeído e após, imersão em solução tampão contendo a enzima alcool desidrogenase (somente ligações covalentes);
2 – Funcionalização pela ativação com vapor de APTES, seguida imersão com solução tampão 50 mM de fosfato de sódio pH 8.6 com enzima álcool desidrogenase e Glutaraldeído (2%) por 1 min, com formação de ligação covalente cruzada.
3 – Funcionalização com aplicação de 20 nm de ouro sobre a superfície do mC, seguido de ativação com solução de TIOL a 1 mM solubilizado em etanol puro por 24h, seguido de solução tampão com glutaraldeído a 2% por 1 h, solução tampão pH 8.0 com enzima álcool desidrogenase por 6 h, formação de monocamadas auto-organizadas (SAM).
Nos experimentos em que o mC foi apenas limpo em água milli-Q (Millipore Co. 18,0 MW*cm-1) e etanol puro, não ocorreram à ligação nem do glutaraldeído e nem ativação com APTES/TIOL. Este fato foi facilmente verificado após a limpeza com água para remover os reagentes não ligados, sendo que o mC continuou com a mesma frequência de ressonância e fator Q originais. A oxidação da superfície do mC é necessária para a ligação do APTES.
Caracterização da superfície funcionalizada com a enzima Álcool Desidrogenase
Por intermédio de imagens de MFA, foi possível calcular a espessura da camada funcional. Com a utilização de uma lâmina metálica afiada, com dureza inferior ao substrato para não deformar a superfície do mC, fez-se um risco sobre a superfície funcionalizada até tocar a superfície, removendo dessa forma apenas uma parte da camada funcional. A imagem foi feita sobre o degrau que se formou possibilitando estimar a espessura da camada.
16Influência da Temperatura e Umidade no Funcionamento de um Biossensor com Microcantilever
Para a funcionalização obtida com ativação via imersão, observou-se uma maior rugosidade e espessura média em torno de 19,39±4,7 nm (Figura 8), demonstrando que há fortes evidências da realização de ligação cruzada no momento da ativação, este fenômeno é descrito por Acres et al. (2012) e Vashist et al. (2014).
(A)
(B)
(C)
Figura 8. Microcantilever ativadocom solução de APTES a 2 %por imersão, com espessura médiaem torno de 19,39+-4,7 nm,imagem tratada pelo softwareGwyddion 4.2, planificada combase na região sem camadafuncional (risco). Em (A), vistasuperior, em (B), vista em 3D eem (C) um perfil da topografiacom a espessura de 10 pixels.
17Influência da Temperatura e Umidade no Funcionamento de um Biossensor com Microcantilever
No gráfico da Figura 8(C), está destacada em vermelho a região onde foi
efetuado o risco pela lâmina afiada. Nota-se que a região onde a funcionalização
permaneceu inalterada (interface entre as duas superfícies) salienta-se um
acúmulo de material (azul). Esse aspecto forma-se devido à lâmina repuxar parte
da camada funcional ao realizar o risco.
A imagem obtida pelo perfil da topografia da camada funcional realizada por
meio de ativação por vapor de APTES apresentou uma distribuição bem
uniforme com espessura média de 14,7±1,2 nm (Figura 9), onde se constatou
o aspecto mais próximo de uma formação em monocamadas. A espessura de
cada passo da funcionalização pode ser estimada baseada em informações
disponíveis na literatura sobre os reagentes utilizados, sendo de: Ativação com
APTES: 7 Å - glutaraldeído: 3,0 Å - Enzima Álcool Desidrogenase: 90,6 Å,
Total: 97,9 Å (ACRES et al., 2012).
(A)
(B)
(C)
Figura 9. Microcantilever ativado
com vapor de APTES, com
espessura média em torno de
14,7+-1,2 nm. Em (A), vista
superior, em (B), vista em 3D e
em (C) um perfil da topografia
com a espessura de 10 pixels.
18Influência da Temperatura e Umidade no Funcionamento de um Biossensor com Microcantilever
A espessura estimada de uma monocamada (SAM) com estes reagentes é no mínimo de 9,8 nm. Experimentalmente, o processo que mais se aproximou foi a funcionalização com ativação por intermédio de vapor de APTES (14,7±1,2 nm). Esta variação na espessura se deve ao fato tanto do APTES quanto ao glutaraldeído terem a possibilidade de formação de múltiplas camadas, e também deve se levar em consideração a presença de imperfeições na superfície do microcantilever. Constatou-se também na ativação por vapor de APTES uma melhor distribuição da camada funcional, com menos espaços, boa distribuição e baixa rugosidade.
Susceptibilidade à temperatura e umidade relativa para diferentes técnicas de funcionalização
Foram comparados mC novos (sem recobrimento) com mC funcionalizados por 3 diferentes métodos e analisados sob diferentes condições: (A) ar e pressão atmosférica de 690,7 mm, 25 ºC de temperatura e umidade relativa de 50 %; (B) Ar isento sob pressão atmosférica de 690,7 mm, a 25 ºC e umidade relativa de 15 %; e (C) Nitrogênio 5.0 com pureza mínima de 99,999 % e umidade relativa < 2 ppm-mol sob pressão atmosférica de 690,7 mm, a 25 ºC e (D) Vapor de Nitrogênio Líquido a -2 ºC com pureza mínima de 99,999 % e umidade relativa < 2 ppm.
Análise dos diferentes métodos de funcionalização
A seguir, são apresentadas tabelas para cada experimento, em que se variou as condições de temperatura e umidade relativa observando-se a variação da frequência de ressonância, fator qualidade, amplitude (RMS), Drive Amplitude e a área do gráfico para cada situação.
Microcantilever NSG10 – Novo, sem recobrimento
Na Tabela 2, os parâmetros e os resultados obtidos foram resumidos para cada experimento. Na Figura 10, observa-se a variação da frequência de ressonância nas diferentes condições de UR(%) e temperatura.
O equipamento de MFA está configurado para manter a mesma amplitude (RMS) amplitude, e para tal, o Drive Amplitude (mV) que corresponde a energia necessária para excitar o mC deve variar para se obter amplitudes próximas.
Tabela 2. Microcantilever NSG10 – sem recobrimento.
19Influência da Temperatura e Umidade no Funcionamento de um Biossensor com Microcantilever
Meio Temp (ºC)
UR (%)
Frequência (KHz)
Fator Q
RMS Área da Curva de Ressonância
(U.A.)
Drive Amplitude
(mV) Ambiente 25 45 190,90 303 0,50 1043,58 31,13 AR 25 15 190,93 307 0,50 1034,47 28,54 Nitrogênio 5.0 25 0,001 190,94 321 0,51 1062,49 26,86 Nitrog. Liq -2 0,001 190,99 317 0,48 1040,16 25,32
Figura 10. Resposta do mC sem revestimento às condições de: ar-ambiente com
50 % de umidade relativa, ar com 15 % de umidade relativa, gás nitrogênio 5.0
e vapor de nitrogênio líquido.
Para mC novos, sem recobrimento, notou-se que a área do gráfico permaneceu
praticamente constante nas diversas condições testadas. Observa-se que a
diminuição da umidade relativa e temperatura proporciona uma redução no
amortecimento da vibração da haste, comprovada pela diminuição da energia
necessária para manter a mesma amplitude (Drive Amplitude) o que acarretou
em um pequeno aumento na frequência de ressonância e no fator Q (Tabela 2,
Figura 10).
Microcantilever NSG10 – Funcionalizado em monocamadas auto-organizadas
(SAM) ativação em vapor de APTES.
Na Tabela 3, os parâmetros e os resultados obtidos para o biossensor
funcionalizado por meio de SAM. Na Figura 11, observa-se a variação da
frequência de ressonância para as diferentes condições de UR(%) e
temperatura.
Tabela 3. Microcantilever NSG10 – funcionalizado por monocamadas (SAM).
20Influência da Temperatura e Umidade no Funcionamento de um Biossensor com Microcantilever
Meio Temp (ºC) UR (%) Frequência
(KHz)
Fator Q RMS Área da Curva
de Ressonância
(U.A.)
Drive
Amplitude
(mV)
Ambiente 25 50 214,91 90 0,5 4832,88 29,30
AR 25 15 215,69 132 0,5 2996,70 26,25
Nitrogênio 5.0 25 0,001 215,69 139 0,5 3179,01 22,58
Nitrog. Liq -2 0,001 216,10 141 0,5 3199,74 21,06
Figura 11. Resposta do mC funcionalizado em camadas auto-organizadas (SAM) às condições de: ar-ambiente com 50 % de umidade relativa, ar com 15 % de umidade relativa, gas nitrogênio 5.0 e vapor de nitrogênio líquido.
A deposição de uma camada funcional organizada (SAM) comprovou que a variação da umidade relativa e a temperatura tiveram uma menor influência no amortecimento da haste, dentre os diferentes métodos de funcionalização é o comportamento que mais se assemelhou a um mC novo. A energia necessária para excitar o mC com a mesma amplitude de um mC sem recobrimento também se manteve próxima, indicando a melhor condição possível. O comportamento do gráfico (decaimento sem ruídos) apresentou-se bem similar ao de um mC novo não funcionalizado (Tabela 3, Figura 11).
Microcantilever NSG10 – ativado por vapor de APTES e funcionalizado por Ligação Covalente Cruzada
Na Tabela 4, os parâmetros e os resultados obtidos para o biossensor funcionalizado por meio ligação covalente cruzada (mais espesso). Na Figura 12, observa-se a variação da frequência de ressonância para as diferentes condições de UR(%) e temperatura.
Tabela 4. Microcantilever NSG10- ligação covalente cruzada.
21Influência da Temperatura e Umidade no Funcionamento de um Biossensor com Microcantilever
Meio Temp
(ºC)
UR (%) Frequência
(KHz)
Fator
Q
RMS Área da Curva
de Ressonância
(U.A.)
Drive
Amplitude
(mV)
Ambiente 25 50 169,40 93 0,57 3272,18 4166
AR 25 16 169,32 134 0,52 2928,03 1943
Nitrogênio
5.0 25 0,001 169,54 166 0,51 3102,41 1478
Nitrog. Liq -2 0,001 169,52 141 0,51 1298,24 2125
Figura 12. Resposta do mC funcionalizado com ligações covalentes cruzadas às
condições de: ar-ambiente com 50 % de umidade relativa, ar com 15 % de
umidade relativa, gás nitrogênio 5.0 e vapor de nitrogênio líquido.
A partir da aplicação de uma camada funcional desorganizada (mais espessa),
notou-se que a UR(%) e temperatura tiveram uma grande influência no
amortecimento da haste exigindo maior quantidade de energia do sistema para
manter a mesma amplitude de vibração. Com isso, pode-se visualizar que o
comportamento do gráfico (decaimento) apresenta oscilações próximas à base
(tende a gerar mais harmônicos), o que torna menos precisa a leitura de
frequência do mC (Tabela 4, Figura 12).
Microcantilever NSG10 – revestido com 20nm de ouro e funcionalizado por
SAM com Tiol
Na Tabela 5, os parâmetros e os resultados obtidos para o biossensor revestido
com 20nm de ouro e funcionalizado por meio de SAM. Na Figura 13, observa-se
a variação da frequência de ressonância para as diferentes condições de UR(%)
e temperatura.
Tabela 5. Microcantilever NSG10 - com recobrimento de ouro e funcionalizado
em monocamadas (SAM), ativado com Tiol.
22Influência da Temperatura e Umidade no Funcionamento de um Biossensor com Microcantilever
Meio Temp
(ºC)
UR (%) Frequência
(KHz)
Fator
Q
RMS Área da Curva de
Ressonância
(U.A.)
Drive
Amplitude
(mV)
Ambiente 25 50 226,00 93 0,5 3876,88 782,80
AR 25 16 227,79 249 0,51 1945,46 376,00
Nitrogênio 5.0 25 0,001 227,94 272 0,5 1675,74 368,00
Nitrog. Liq -2 0,001 228,26 372 0,54 1706,94 673,50
Figura 13. Resposta do mC revestido de ouro e funcionalizado em camadas auto-organizadas às condições de: ar-ambiente com 50% de umidade relativa, ar com 15% de umidade relativa, gás nitrogênio 5.0 e vapor de nitrogênio líquido.
Ao depositar-se 20,0 nm de ouro pela técnica de sputtering na superfície do µC, somado à camada funcional, o efeito da UR(%) e temperatura tornaram-se ainda mais drásticos para a variação de frequência de ressonância devido à formação de um bi-metal com o aumento da espessura, constatado também pela energia exigida para excitar o mC com a mesma amplitude (Driver amplitude).
Observou-se que quanto mais espessa a camada depositada sobre o mC o AFM necessitou de mais energia para manter aproximadamente a mesma amplitude, comprovando que a deposição em monocamadas sem a deposição de ouro na superfície obteve resultados mais próximos de um mC novo, sendo assim, melhor aplicado para biossensores.
Os resultados experimentais estão de acordo com os experimentos realizados por Chen et al.(1995).
Conclusão
Ao modificar a superfície da haste do microcantilever com camadas funcionais biotativas, confeccionadas com os mesmos reagentes, mas de técnicas diferentes, obtivemos comportamentos distintos de acordo com as condições a que foram aplicados.
Microcantilevers mais longos com menores constantes de mola são mais propensos às interferências do ambiente como umidade relativa e temperatura. Os experimentos mostraram que a camada funcional com estrutura organizada em monocamadas, gera um menor amortecimento superficial fazendo com que o comportamento seja mais parecido ao da mesma haste sem revestimento,
23Influência da Temperatura e Umidade no Funcionamento de um Biossensor com Microcantilever
com picos de resposta de frequência de ressonância bem definidos e com decaimento estável sem oscilações próximo à base, e sem a geração de outros harmônicos. Para os biossensores, ficou comprovado que a umidade relativa do ambiente é um fator determinante no amortecimento do microcantilever, tendo maior influência em revestimentos com maior espessura que possibilita maior adsorção. A funcionalização com deposição de ouro demonstrou que é necessário mais energia para se manter a mesma amplitude de vibração, e também tornou mais susceptível a mudanças na temperatura e umidade relativa. Quanto mais fina e organizada a camada funcional, preferencialmente sem a aplicação de camadas metálicas, a resposta melhor se assemelha a um µC novo, com pico de frequência de ressonância bem definido, alto fator Q e baixo ruído.
Agradecimentos
Este trabalho teve apoio da Embrapa Instrumentação, CNPq processo: 141267/2013-5
Ao Prof. Dr. Rubens Bernardes Filho e as técnicas Silviane Zanni Hubinger, Luis Aparecido de Godoy e Joana Bresolin pelo apoio, dedicação e atenção.
Referências
ACRES, R. et al. Molecular Structure of 3-Aminopropyltriethoxysilane Layers Formed on Silanol-Terminated Silicon Surfaces. Journal of Physical Chemistry C, [S. l.], v. 116, n. 10, p. 6289-6297, 2012.
BHUSHAN, B. (Ed.). Springer handbook of nanotechnology. 3rd. ed. rev. ext. Berlin: Springer, 2010. 1961 p.
BOWEN, J. et al. On the calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers modified by particle attachment and lamination. Measurement Science & Technology, [S. l.], v. 21, n. 11, n. 115106, 2010.
BUCHAPUDI, K. et al. Microcantilever biosensors for chemicals and bioorganisms. Analyst, [S. l.], v. 136, n. 8, p. 1539-1556, 2011.
CHEN, G. Y. et al. ADSORPTION-INDUCED SURFACE STRESS AND ITS EFFECTS ON RESONANCE FREQUENCY OF MICROCANTILEVERS. Journal of Applied Physics, [S. l.], v. 77, n. 8, p. 3618-3622, 1995.
FAEGH, S.; JALILI, N.; SRIDHAR, S. Ultrasensitive Piezoelectric-Based Microcantilever Biosensor: Theory and Experiment. Ieee-Asme Transactions on Mechatronics, [S. l.], v. 20, n. 1, p. 308-312, 2015.
FINOT, E.; PASSIAN, A.; THUNDAT, T. Measurement of mechanical properties of cantilever shaped materials. Sensors, [S. l.], v. 8, n. 5, p. 3497-3541, 2008.
24Influência da Temperatura e Umidade no Funcionamento de um Biossensor com Microcantilever
IMAMURA, G.; SHIBA, K.; YOSHIKAWA, G. Finite Element Analysis on Nanomechanical Detection of Small Particles : Toward Virus Detection. Frontiers in Microbiology, [S. l.], v. 7, 2016. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.3389/fmicb.2016.00488>. Acesso em: 11 ago. 2016.
LI, X.; LEE, D. Integrated microcantilevers for high-resolution sensing and probing. Measurement Science and Technology, [S. l.],v. 23, n. 2, 2012. DOI: 10.1088/0957-0233/23/2/022001.
LOJOU, E.; BIANCO, P. Application of the electrochemical concepts and techniques to amperometric biosensor devices. Journal of Electroceramics, v. 16, n. 1, p. 79-91, 2006.
OLIVEIRA, G. S. et al. Molecular modeling of enzyme attachment on AFM probes. J Mol Graph Model, v. 45, p. 128-36, 2013.
ONO, T. et al. Mass sensing of adsorbed molecules in sub-picogram sample with ultrathin silicon resonator. Review of Scientific Instruments, [S. l.], v. 74, n. 3, p. 1240-1243, 2003.
Q CONTROL. In: NANOSCOPE V: Controller Manual: NanoScope Software Version 8. Billerica: Bruker, 2011. p. 95.
RAITERI, R.; GRATTAROLA, M.; BERGER, R. Micromechanics senses biomolecules. Sensors and Actuators B-Chemical, [S. l.], v. 5, n. 1, p. 22-29, 2002.
SADER, J. E.; CHON, J. W. M.; MULVANEY, P. Calibration of rectangular atomic force microscope cantilevers. Review of Scientific Instruments, [S. l.], v. 70, n. 10, p. 3967-3969, 1999.
SINGAMANENI, S. et al. Bimaterial microcantilevers as a hybrid sensing platform. Advanced Materials, [S. l.], v. 20, n. 4, p. 653-680, 2008.
STEFFENS, C. et al. Atomic Force Microscopy as a Tool Applied to Nano/Biosensors. Sensors, [S. l.], v. 12, n. 6, p. 8278-8300, 2012.
STEFFENS, C. et al. Bio-inspired sensor for insect pheromone analysis based on polyaniline functionalized AFM cantilever sensor. Sensors and Actuators B-Chemical, [S. l.], v. 191, p. 643-649, 2014.
VASHIST, S. K. et al. Immobilization of antibodies and enzymes on 3-aminopropyltriethoxysilane-functionalized bioanalytical platforms for biosensors and diagnostics. Chem Rev, [S. l.], v. 114, n. 21, p. 11083-130, 2014.
WIESENDANGER, R. Scanning probe microscopy and spectroscopy: methods and applications. Cambridge: New York: Cambridge University Press, 1994. xxii, 637 p. ISBN 0521418100 0521428475.
25Influência da Temperatura e Umidade no Funcionamento de um Biossensor com Microcantilever
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
Embrapa Instrumentação
Rua XV de Novembro, 1452 - Caixa Postal 741 - CEP 13560-970 - São Carlos - SP
Telefone: (16) 2107 2800 - Fax: (16) 2107 2902
www.embrapa.br/instrumentacao