izbirni predmet, april/maj 2013 struktura in funkcija
TRANSCRIPT
IZBIRNI PREDMET, APRIL/MAJ 2013
STRUKTURA IN FUNKCIJA PROTEINOV
Matjaž Zorko
1. predavanje:
Od aminokislin do primarne strukture proteinov
DOSEGLJIVO: http://ibk.mf.uni-lj.si/teaching/objave/izbir1.htm
E-mail: [email protected]
POZOR: 20 standardnih in več100 nestandardnih AA
I. Lastnosti aminokislin
- klasifikacija
- velikost
- naboj
- polarnost
- hidrofobnost
- aromatične AK
- optična aktivnost
a C-atom
Klasifikacija (R!):
1. polarne:
2. hidrofobne
3. ‘posebne’
• bazične
• kisle
• nenabiti R
AROMATIC AA
1.
2.
3.
Velikost AK ostankov:
100-130 Da (110 Da),
z nekaj izjemami!
dodaj 18 (H2O) za maso AK!
odštej 56 za maso stranske verige
AK
ostanek
Pri zamenjavi ene AK za drugo lahko že samo zaradi razlike
v velikosti pride do velikih sprememb v molekuli protiena!
VELIKOST JE POMEMBNA PRI ZAMENJAVAH AMINOKISLIN (MUTACIJE)
Zamenjava Gly za Ala (-H za –CH3) v kolagenu močno oslabi trdnost vlakna.
NABOJ:
Določajo ga pKa vrednosti (25°C) in pH
Amino acid a-COOH group a-NH3+ group Side chain (R)
Alanine 2.3 9.9
Glycine 2.4 9.8
Phenylalanine 1.8 9.1
Serine 2.1 9.2
Valine 2.3 9.6
Aspartic acid 2.0 10.0 3.9
Glutamic acid 2.2 9.7 4.3
Histidine 1.8 9.2 6.0
Cysteine 1.8 10.8 8.3
Tyrosine 2.2 9.1 10.9
Lysine 2.2 9.2 10.8
Arginine 1.8 9.0 12.5
Pomembni so samo
Rs, N- in C- terminala
!
Naboj in polarnost/hidrofobnost določata značaj AK, njeno
interakcijo z vodo in navadno tudi njeno lokacijo v proteinu!
H
2.2
Paulingova elektronegativnost določa polarnost
(Cs = 0,7 ; F = 4,0)
Li
1
Be
1.5
B
2.0
C
2.5
N
3.0
O
3.5
F
4.0
Na
0.9
Mg
1.2
Al
1.5
Si
1.8
P
2.1
S
2.5
Cl
3.1
K
0.8
Ca
1.0
Ga
1.7
Ge
1.8
As
2.1
Se
2.4
Br
3.0
Rb
0.8
Sr
1.0
Ba
0.9
Sn
1.9
Sb
2
Te
2.1
I
2.6
Cs
0.7
Pb
2.3
Bi
2
Po
2
At
2.2
+
+
O H
HN H
HH
lone pair electrons
NH3 H2O
Za polarnost je pomembna razlika v elektronegativosti
CO2
O
H H
d-
d+ d+
H2O
d+
d+
d+
d+
d+
d+
d- d- d-
Polarnost kvantificiramo z dipolnim momentom: rz
d-
ne-polarno
polarno
nabito
O::C::O
Polarne skupine AK:
-OH, =C=O, -NH2, -SH
Hidrofobnost in hidrofilnost AK radikalov
a:
water
vapor
DX
XK
][
][
(a)
b: ecyclohexan
waterD
X
XK
][
][
(b)
voda : cikloheksan
voda : para
pola
rni
nepola
rni
Lys
H2O
C6H12
Aromatske AK (Phe, Tyr, Trp)
• velike
• resonanca: -OH v Tyr
disociira (pKa = 10,9)
• polarnost obroča:
specifične interakcije
• absorbirajo UV svetlobo,
pomembno za
identifikacijo proteinov
S,R-system
D,L-system
rotacija linearno
polarizirane svetlobe
(a = [a].l.c)
POMEN PRI
PREPOZNAVANJU:
E-S, R-H, Ag-Ab, itd
STANDARD! posebne funkcije!
D-AK ščitijo pred proteolitsko
razgradnjo
Funkcionalna superoksidna dismutaza: 153 D-aminokislin!
Neesencialne Esencialne
Alanine Histidine
Arginine Isoleucine
Asparagine Leucine
Aspartate Lysine
Cysteine Methionine
Glutamate Phenylalanine
Glutamine Threonine
Glycine Tryptophan
Proline Valine
Serine
Tyrosine
Bliskovit pregled sinteze proteinov
• DNA → primarni transkript (pre-mRNA)
• pre-mRNA se procesira
• mRNA je informacija za I. str. proteinov
• nastanek peptidnih vezi → polipeptidna veriga
• nekatere AK se modificirajo
• 1D → 3D struktura
• kontrola funkcionalne kvalitete
64 kodonov, vsi so v uporabi:
Nekateri proteini so inducibilni, drugi konstitutivni.
Indukcija b-galaktozidaze v E. coli.
Operonski sistem nadzoruje transkripcijo
+ :
- :
Regulacija izražanja genov pri prokariotih
Pri evkariotih je regulacija
ekspresije veliko kompleksnejša.
Sodeluje veliko regulatornih
proteinov.
Proteini, ki so potrebni za acilacijo
histonov in remodeliranje kromatina,
niso prikazani.
Transkripcija treh zaporednih genov v oocitih močerada Pleurodeles waltl
Sinteza pre-mRNA
Hitrost sinteze pre-mRNA in ‘natančnost’
• E. coli: 20 - 50 nukleotidov / sekundo
• več RNAP ‘dela’ simultano
• 1 napaka / ~104 nukleotidov (DNA replikacija: 1 napaka / ~107 nukleotidov
• zakaj to ni fatalno:
večina genov se velikokrat (stalno) prepisuje
degeneracija genetskega koda
niso vse zamenjave AK škodljive
velik del mRNA se izreže
Protismiselna veriga DNA (modro) in ustrezna mRNA (rdeče) za ovalbumin
½
AK
tRNA je adapter, ki
prevaja jezik nukleotidov
v jezik aminokislin. tRNA
mRNA (jezik nukleinskih kislin = zaporedje nukleotidov)
(jezik proteinov = zaporedje aminokislin)
Aktivacija AK –
vezava na tRNA.
Zelo specifična!
Aminoacil-tRNA-sintaza
‘Ribosomska sinteza’ proteinov: koncert za zelo velik orkester
polipeptidna veriga
Polipeptidna veriga raste na C-terminalni strani
katalizira rRNA!
Elongacija - veliko sodelujočih igralcev!
Energetsko potraten proces! Tvorba peptidne vezi je edergonska
reakcija, energija je potrebna za premik ravnotežja k produktom.
1 ATP za pripojitev AK na tRNA!
REZULTAT:
Polipeptidna veriga: PRIMARNA STRUKTURA PROTEINOV,
ki se po-translacijsko modificira in se zvije v 3D strukturo.
Peptidi se večinoma tudi sintetizirajo tako – končno
obliko dobimo po razcepljenju s proteazami. Nekateri se
sintetizirajo ne-ribosomsko (encimi).
MSH: melanocyte stimulating hormone
ACTH: adenocorticotropical hormone
Ne-ribosomska sinteza glutationa
-OOC-CH-CH2-CH2-C-N-CH-C-N-CH2-COO-
CH2
SH
H H
O O +NH3
g-Glu Cys Gly
Glu + Cys g-Glu Cys + Gly g-Glu Cys Gly
g-glutamil cysteine synthetase + ATP glutathione synthetase + ATP
ADP ADP
Po-translacijske modifikacije: dodatek novih funkcionalnih
skupin v AK (in drugi razlogi). Več kot 80 znanih.
Glavne modifikacije:
• proteolitično procesiranje
• spremenjeni konci
• glikozilacija
• dodatek lipida
• sulfacija
• g-karboksi-glutamat
• hidroksilacija
• fosforilacija
• ADP-ribozilacija
• -S-S- mostički
Proteolitično zorenje insulina
- 23 AA - 33 AA
Proteolitično procesiranje: ‘aktivacija’ encimov
Namen: biti aktiven na pravem mestu!
Glikozilacija: topnost, prepoznavanje, signaliziranje!
• Vezava na
• Asn: N-glikozil-
• Ser, Thr, Tyr, OH-Lys:
O-glikozil
• Dobimo "glikoprotein"
• Pogosto pri izvenceličnih
proteinih
Lipidacija: interakcija z membrano, 3D struktura
prenil
‘Lipidacija’, lipidni rafti in prenos signala
Modified Ras vezava v rafte
(neactiven, GDP) ali izven njih
(aktiven, GTP).
Majhne funkcionalne skupine
• fosforilacija
• g-karboksi-glutamate
• metilacija
• sulfacija
• hidroksilacija
Disulfidni mostički: stabilizacija 3D-strukture
ADP-ribozilacija.
CH2
HHOH OH
H HOOP
O
HHOH OH
H HO
CH2
N
N
N
NH2
OP
O
O
NO
(CH2)3
NH
C NH2+
protein
NH
O
H
CNH2
O
CH2
H
N
HOH OH
H HOOP
O
HHOH OH
H HO
CH2
N
N
N
NH2
OP
O
O
O
NO
H
CNH2
O
NH
+
+
(CH2)3
NH
C NH2+
protein
NH2
NAD+
nicotinamideArg
residue
ADP-ribosylated
protein
(nicotinamide
adenine
dinucleotide)
ADP-ribozilacijan Ga s PTX in CTX
GDP GTP
PTX CTX
X
hidroliza GTP
X
Gs Gi X
Gs Gi
Kompleksno procesiranje kolagena
Organizacija kolagena v različnih tkivih.
Kljub zelo podobni sekvenci pride do razlik v interakcijah med deli
kolagena, ker so po-translacijske modifikacije različne v različnih tkivih.
Po-translacijske modifikacije dokončno oblikujejo polipeptidno verigo. Nekatere
modifikacije prištejemo k primarni strukturi, nekatere pa ne – terminologija tu ni
dorečena. Pri kolagenu npr. hidroksi-Pro in hidroksi-Lys upoštevamo,
glikozilacije pa ne. K primarni strukturi nekateri štejejo tudi mesta (Cys), kjer se
vzpostavijo-SS- mostički.
Aminokislinsko sekvenco lahko določimo
Postopna identifikacija AK od N-konca proti C-koncu.
Zanesljivo se da to narediti le za peptide do cca 40 AK.
Ala – Phe - Arg Tyr - Lys Glu - Ser
tripsin
Ala - Phe - Arg - Tyr - Lys - Glu - Ser
kimotripsin
Ala – Phe Arg - Tyr Lys - Glu - Ser
Zato sekvenco razsekajo na peptide na dva
različna načina, določijo sekvenco vseh peptidov
in s poravnavo dobijo sekvenco proteina.
Sekvenco lahko določimo tudi
s sekvenciranjem gena ali z
masno spektrometrijo
Sekvence analiziramo in lahko dobimo pomembne podatke
EF-Tu protein (fragmenti)
• sorodnosti (molekularna evolucija)
• strukturi (napoved 3D strukture)
• lokaciji (intra/ekstra-celularnost, vgraditev v membrano)
• funkciji (sekvenčna sorodnost funkcijska sorodnost)
• napakah v delovanju (mutacije)
Analiza sekvence nam lahko da podatke o:
Evolucijsko drevo bakterij na osnovi sekvence GroEL (šaperon)
Napoved transmembranskih regij
Galparan/Transportan: napovedana
sekundarna struktura, amfipatičnost
in ‘3D-model’
TP-1: secondary structure prediction
Amino acid (number)
relia
bili
ty in
dex
(0
- 9)
0 5 10 15 20 25 30
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
Helix
Ext. (beta)
Loop
TP-1: predicted solvent accessibility
Amino acid (number)
rela
tive
solv
ent a
cces
sibi
lity
(0 -
9)
0 5 10 15 20 25 30
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
Soomets U., Hällbrink M., Zorko M., and Langel Ü. (1997) Curr. Top. Pept. Prot. Res. 2, 83-113
= TP
K