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2 7 4 J . P h y s i o l . ( 1 9 6 1 ) , 1 5 6 , p p . 2 7 4 - 2 9 3W i t h 1 1 t e x t - f i g u r e 8P r i n t e d i n G r e a t B r i t a i n

ADENOSINETRIPHOSPHATASE ACTIVITY AND THE ACTIVEMOVEMENTS OF ALKALI METAL IONSBY E . T . DUNHAM* AND I . M . GLYNN

From t h e P h y s i o l o g i c a l L a b o r a t o r y , U n i v e r s i t y o f C a m b r i d g e( R e c e i v e d 2 N o v e m b e r 1 9 6 0 )

I t i s now g e n e r a l l y a c c e p t e d t h a t t h e mammalian r e d c e l l , l i k e n e r v ea n d p r o b a b l y l i k e m o s t c e l l s , m a i n t a i n s i t s i o n i c c o m p o s i t i o n by pumpingp o t a s s i u m i n w a r d s a n d s o d i u m o u t w a r d s . I n r e d c e l l s t h e r e i s g o o de v i d e n c e t h a t t h e e n e r g y f o r t h i s p u m p i n g c o m e s f r o m g l y c o l y s i s ( D a n o w -s k i , 1 9 4 1 ; H a r r i s , 1 9 4 1 ; M a i z e l s , 1 9 4 9 ) . I t i s a l s o w e l l known f r o m t h ew o r k o f C l a r k s o n & M a i z e l s ( 1 9 5 2 ) , C a f f r e y , T r e m b l a y , G a b r i o & H u e n -n e k e n s ( 1 9 5 6 ) , a n d H e r b e r t ( 1 9 5 6 ) , t h a t t h e r e d c e l l membrane p o s s e s s e sa d e n o s i n e t r i p h o s p h a t a s e ( A T P - a s e ) a c t i v i t y . T h e e x p e r i m e n t s t o b e d e -s c r i b e d i n t h e p r e s e n t p a p e r w e r e d e s i g n e d t o s e e w h e t h e r t h i s A T P - a s ea c t i v i t y i s c o n n e c t e d w i t h t h e m e c h a n i s m s r e s p o n s i b l e f o r i o n t r a n s p o r t .A p r e l i m i n a r y a c c o u n t o f t h e s e e x p e r i m e n t s h a s a l r e a d y b e e n p u b l i s h e d(Dunham & G l y n n , 1 9 6 0 ) .F o u r f e a t u r e s c h a r a c t e r i s t i c o f t h e t r a n s p o r t s y s t e m a r e ( G l y n n , 1 9 5 7 a ) :1 . T h e a c t i v e m o v e m e n t s o f s o d i u m a n d p o t a s s i u m a r e l i n k e d , i n t h es e n s e t h a t t h e c e l l i s u n a b l e t o p u m p s o d i u m o u t u n l e s s p o t a s s i u m i sa v a i l a b l e o u t s i d e t o b e pumped i n ( H a r r i s & M a i z e l s , 1 9 5 1 ; S h a w , 1 9 5 4 ;G l y n n , 1 9 5 6 ) .2 . A c t i v e t r a n s p o r t i s p r e v e n t e d b y c a r d i a c g l y c o s i d e s a t c o n c e n t r a t i o n so f a b o u t 1 0 - 5 g / m l . ( S c h a t z m a n n , 1 9 5 3 ; Kahn & A c h e s o n , 1 9 5 5 ; G l y n n ,1 9 5 7 b ) .3 . M o d i f i e d c a r d i a c g l y c o s i d e s i n w h i c h t h e l a c t o n e r i n g i s s a t u r a t e d o ra t t a c h e d w i t h t h e o c c o n f i g u r a t i o n a t C 1 7 a r e much l e s s a c t i v e , o r i n a c t i v e( G l y n n , 1 9 5 7 b ) .4 . At much l o w e r c o n c e n t r a t i o n s o f g l y c o s i d e , i n h i b i t i o n c a n b e p r e v e n t e db y r a i s i n g t h e p o t a s s i u m c o n c e n t r a t i o n i n t h e f l u i d o u t s i d e t h e c e l l s( G l y n n , 1 9 5 7 b ) .

* U . S . P u b l i c H e a l t h S e r v i c e S p e c i a l R e s e a r c h F e l l o w . P r e s e n t a d d r e s s : D e p a r t m e n t o fP h y s i o l o g y , A l b e r t E i n s t e i n C o l l e g e o f M e d i c i n e o f Y e s h i v a U n i v e r s i t y , Ne w York C i t y ,N . Y . , U . S . A .

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ATP-ASE ACTIVITY AND ION MOVEMENTS 2 7 5W a s h e d human r e d c e l l g h o s t s h a v e b e e n i n c u b a t e d i n s a l t s o l u t i o n s

c o n t a i n i n g ATP, a n d t h e r a t e o f s p l i t t i n g h a s b e e n f o l l o w e d b y m e a s u r e -ment o f t h e i n o r g a n i c p h o s p h a t e f o r m e d . T h e r e s p o n s e o f t h e A T P - a s e t ot h e f a c t o r s known t o a f f e c t c a t i o n t r a n s p o r t h a s b e e n o b s e r v e d .

METHODSP r e p a r a t i o n o f g h o s t 8

F i r s t m e t h o d . F r e s h l y drawn h u m a n b l o o d was u s e d i n a l l e x p e r i m e n t s . C l o t t i n g wa sp r e v e n t e d w i t h h e p a r i n ( ' P u l a r i n ' , Evans M e d i c a l S u p p l i e s ) i n a c o n c e n t r a t i o n o f a b o u t5 0 0 0 u . / 1 0 0 m l . b l o o d . The b l o o d was c e n t r i f u g e d and t h e p l a s m a a n d b u f f y c o a t removedby s u c t i o n ; t h e c e l l s w e r e t h e n washed t h r e e t i m e s w i t h i s o t o n i c s a l i n e b y a l t e r n a t e r e -s u s p e n s i o n and s p i n n i n g . White c e l l s w e r e a l m o s t c o m p l e t e l y e l i m i n a t e d by r e m o v a l o f t h et o p - m o s t l a y e r o f c e l l s w i t h t h e s u p e r n a t a n t a f t e r e a c h w a s h .The c e l l s w e r e l y s e d b y a d d i n g t h e m q u i c k l y t o 1 0 v o l u m e s o f s t i r r e d i c e - c o l d g l a s s -d i s t i l l e d w a t e r c o n t a i n i n g 0 . 1 mm c y s t e i n e . Th e h a e m o l y s a t e was a l l o w e d t o s t a n d f o r1 0 m i n , and t h e c e l l s w e r e t h e n spun down ( 6 min a t 1 6 , 0 0 0 g ) and w a s h e d w i t h a b o u t 6v o l u m e s o f i c e - c o l d g l a s s - d i s t i l l e d w a t e r o f w h i c h t h e pH had b e e n a d j u s t e d t o b e t w e e n7 * 0 and 7 - 2 a n d t o w h i c h a t r a c e o f c y s t e i n e h a d b e e n a d d e d . The w a s h i n g wa s r e p e a t e d t woo r t h r e e t i m e s , u n t i l t h e s u p e r n a t a n t c o n t a i n e d o n l y a t r a c e o f p i n k c o l o u r a l t h o u g h t h ec e l l s r e m a i n e d d e f i n i t e l y p i n k . Some s a l t was a d d e d a t t h i s s t a g e ( t o g i v e a c o n c e n t r a t i o nb e t w e e n 1 / 3 i s o t o n i c and i s o t o n i c ) and t h e s u s p e n s i o n wa s p i p e t t e d i n t o t h e g r a d u a t e d t u b e si n w h i c h i n c u b a t i o n was t o b e c a r r i e d o u t . The q u a n t i t y o f c e l l s a d d e d t o e a c h t u b e w a sg e n e r a l l y t h a t w h i c h g a v e a h a e m a t o c r i t o f a b o u t 1 0 % d u r i n g i n c u b a t i o n ( c a l c u l a t e d o n t h eo r i g i n a l v o l u m e o f t h e c e l l s , n o t t h e v o l u m e o f t h e g h o s t s ) . The a d d i t i o n o f s a l t b e f o r e p i p e t t i n gwa s f o u n d t o b e n e c e s s a r y , s i n c e o t h e r w i s e t h e g h o s t s t e n d e d t o c l u m p , and r e p r o d u c i b l er e s u l t s c o u l d not b e o b t a i n e d .

S e c o n d m e t h o d . G h o s t s p r e p a r e d b y t h e method j u s t d e s c r i b e d were u s u a l l y s a t i s f a c t o r y ,b u t o c c a s i o n a l l y t h e a c t i v i t y wa s t wo o r t h r e e t i m e s a s g r e a t a s wa s e x p e c t e d a n d t h e r e w a sv e r y l i t t l e i n h i b i t i o n by c a r d i a c g l y c o s i d e s . As w i l l b e shown l a t e r , t h i s i s what w o u l d b ee x p e c t e d i f t h e p r e p a r a t i o n had b e e n c o n t a m i n a t e d w i t h c a l c i u m i o n s a n d , t h o u g h c a l c i u mc o n t a m i n a t i o n wa s n e v e r d e m o n s t r a t e d , i t wa s f o u n d t h a t t h e p r o p e r t i e s o f a s u p p o s e d l yc o n t a m i n a t e d p r e p a r a t i o n r e t u r n e d t o w a r d s n o r m a l i f t h e c e l l s were washed w i t h a n i s o t o n i cs o l u t i o n o f m a g n e s i u m c h l o r i d e o f a 1 mm s o l u t i o n o f e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t a t e .Th e p r o c e d u r e wa s t h e r e f o r e m o d i f i e d i n t h a t i s o t o n i c M g C 1 2 was u s e d t o wash t h e c e l l sb e f o r e l y s i s , and a f t e r l y s i s s t r o n g M g C 1 2 s o l u t i o n wa s a d d e d t o mak e t h e c o n c e n t r a t i o ni s o t o n i c a g a i n . The g h o s t s were t h e n washed i n t h e u s u a l w a y w i t h c h i l l e d n e u t r a l g l a s s -d i s t i l l e d water c o n t a i n i n g a t r a c e o f c y s t e i n e .

T h i r d m e t h o d . G h o s t s p r e p a r e d b y t h e s e c o n d method a l w a y s had a n o r m a l f r a c t i o n o fg l y c o s i d e - s e n s i t i v e a c t i v i t y , b u t t h e a b s o l u t e a m o u n t o f a c t i v i t y w a s u s u a l l y r a t h e r l o wand o c c a s i o n a l l y v e r y low-about 1 / 5 o f n o r m a l . I t wa s t h o u g h t t h a t t h e r e s t o r a t i o n o fi s o t o n i c i t y m i g h t h a v e m a d e m a n y o f t h e g h o s t s i m p e r m e a b l e t o ATP ( c f . S z e k e l y , M 6 i n y a i& S t r a u b , 1 9 5 2 ) , and i n one p r e p a r a t i o n w h o s e a c t i v i t y w a s v e r y l o w o n l y 1 / 5 o f t h e t o t a lv o l u m e o f t h e g h o s t s was f o u n d t o b e a c c e s s i b l e t o ATP. F r e e z i n g and t h a w i n g i n c r e a s e dt h e a c t i v i t y t o n o r m a l - p r e s u m a b l y b y m a k i n g t h e membranes l e a k y a g a i n - a n d i n t h et h i r d method t h e g h o s t s were f r o z e n and t h a w e d t w i c e , a f t e r w a s h i n g b u t b e f o r e t h e a d d i t i o no f s a l t .

R e a g e n sATP wa s o b t a i n e d f r o m t h e N u t r i t i o n a l B i o c h e m i c a l C o r p o r a t i o n , C l e v e l a n d , O h i o , and

wa s p u r i f i e d o n Dowex 1 i o n - e x c h a n g e c o l u m n s b y t h e f o l l o w i n g p r o c e d u r e : Th e ATPd i s o d i u m s a l t w a s d i s s o l v e d i n a s m a l l q u a n t i t y o f w a t e r , and s u f f i c i e n t NaOH a d d e d t o) by guest on August 7, 2012jp.physoc.orgDownloaded from J Physiol (

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2 7 6 E . T . DUNHAM AND I . M. GLYNNb r i n g t h e pH t o b e t w e e n 6 and 8 . T h i s s o l u t i o n was p o u r e d o n t o 4 c m ( 1 - 5 m l . ) c o l u m n s o fDowex 1 r e s i n , a l l o w i n g a b o u t 0 - 2 5 g ATP p e r c o l u m n . Each c o l u m n w a s t h e n washed w i t ha b o u t 5 0 m l . o f a s o l u t i o n c o n t a i n i n g 2 0 m - m o l e HC1 and 2 0 m - m o l e NH4C1 p e r l i t r e . T h i ss o l u t i o n b r o u g h t down t r a c e s o f a d e n o s i n e m o n o p h o s p h o r i c a c i d and a d e n o s i n e d i p h o s p h o r i ca c i d . A f t e r t h e a m m o n i u m i o n s had b e e n g o t r i d o f b y w a s h i n g e a c h c o l u m n w i t h a b o u t2 0 m l . o f d i s t i l l e d w a t e r , t h e ATP was e l u t e d w i t h a b o u t 1 0 ml o f c h i l l e d 2 5 0 m M - H C l . Th ee f f l u e n t was r e c e i v e d i n c h i l l e d t u b e s and i m m e d i a t e l y n e u t r a l i z e d w i t h an i c e - c o l d s o l u t i o no f t r i s h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e ( T r i s ) h y d r o x i d e . The c o n c e n t r a t i o n o f ATP wa sd e t e r m i n e d b y U . V . a b s o r p t i o n m e a s u r e m e n t s a t 2 5 9 m p . A f t e r u s e t h e r e s i n c o l u m n s w e r ewashed w i t h a b o u t 2 0 ml o f 1 M - H C l and t h e n w i t h w a t e r u n t i l t h e pH o f t h e e f f l u e n t wa sa b o u t 5 .S a l t & . E x c e p t w h e r e o t h e r w i s e s t a t e d , t h e s a l t s u s e d w e r e o f ' a n a l y t i c a l r e a g e n t g r a d e ' .The ' s p e c t r o s c o p i c a l l y p u r e ' s a l t s u s e d i n some o f t h e e x p e r i m e n t s w e r e s u p p l i e d byJ o h n s o n M a t t h e y and C o . L t d .

C a r d i a c g l y c o & i d e . S t r o p h a n t h i n was s u p p l i e d b y B r i t i s h Drug H o u s e s L t d . S c i l l a r e n Aand h e x a h y d r o s c i l l a r e n A w e r e a g i f t f r o m M e s s r s S a n d o z o f B a s l e . C y m a r i n and 1 7 c i -c y m a r i n w e r e a g i f t f r o m P r o f e s s o r R e i c h s t e i n o f B a s l e . Th e g l y c o s i d e s w e r e d i s s o l v e d i n8 0 % e t h a n o l (AR g r a d e ) , and t h e a l c o h o l i c s o l u t i o n s w e r e d i l u t e d w i t h w a t e r .

T r i 8 was t h e ' T r i s 1 2 1 g r a d e ' s u p p l i e d b y t h e Sigma C h e m i c a l Company, S t L o u i s , M i s s o u r i .C y s t e i n e was s u p p l i e d by t h e N u t r i t i o n a l B i o c h e m i c a l C o r p o r a t i o n .A l l r e a g e n t s w e r e m a d e u p i n g l a s s - d i s t i l l e d w a t e r .

P r o c e d u r eI n c u b a t i o n was c a r r i e d o u t i n 5 o r 1 0 m l . g r a d u a t e d t u b e s w i t h g l a s s s t o p p e r s . The r e a c t i o n

was g e n e r a l l y s t a r t e d b y t h e a d d i t i o n o f ATP i n a volume o f f l u i d e q u a l t o o n e t e n t h o f t h et o t a l v o l u m e , s o t h a t t h e c o o l i n g e f f e c t was s m a l l . At t h e e n d o f t h e i n c u b a t i o n p e r i o d t h et u b e s w e r e c o o l e d i n i c e d w a t e r f o r 1 m i n , and t h e n i c e - c o l d 5 5 % t r i c h l o r o a c e t i c a c i d wasa d d e d t o m a k e t h e f i n a l c o n c e n t r a t i o n 5 %. Th e t u b e s w e r e k e p t i n i c e d w a t e r u n t i l i t wasc o n v e n i e n t t o s p i n down t h e p r e c i p i t a t e d p r o t e i n and e s t i m a t e t h e i n o r g a n i c p h o s p h a t e i na p o r t i o n o f t h e s u p e r n a t a n t by t h e method o f F i s k e & Subbarow ( 1 9 2 5 ) . Th e c o o l i n g b e f o r et h e a d d i t i o n o f t r i c h l o r o a c e t i c a c i d was f o u n d t o b e n e c e s s a r y t o g e t c o m p l e t e d e p r o t e i n i z a -t i o n ; i f i t was o m i t t e d t h e s u p e r n a t a n t s l o o k e d c l e a r a f t e r s p i n n i n g b u t became c l o u d y ona d d i t i o n o f t h e s t r o n g l y a c i d p h o s p h o m o l y b d a t e . The n e e d t o c o o l c o u l d p r o b a b l y h a v e b e e na v o i d e d by t h e u s e o f m u c h l a r g e r v o l u m e s o f more d i l u t e t r i c h l o r o a c e t i c a c i d , b u t t h i s wouldh a v e p r o d u c e d a m u c h l a r g e r f i n a l volume and s o w o u l d h a v e d e c r e a s e d t h e s e n s i t i v i t y o ft h e m e t h o d . The t i m e d u r i n g w h i c h e a c h t u b e was k e p t i n i c e d w a t e r b e f o r e a n a l y s i s wasn o t e d , and a c o r r e c t i o n was made f o r t h e s m a l l n o n - e n z y m i c b r e a k d o w n o f ATP d u r i n gt h i s p e r i o d and d u r i n g t h e c o l o u r d e v e l o p m e n t . A s m a l l b l a n k c o r r e c t i o n was a l s o m a d e ,t o a l l o w f o r t h e t r a c e o f c o l o u r d e v e l o p e d i n s u p e r n a t a n t s f r o m c o n t r o l t u b e s t o w h i c h noATP had b e e n a d d e d . P r e l i m i n a r y t r i a l s s h o w e d t h a t t h e p r e s e n c e o f 1 mm c y s t e i n e ( t h ec o n c e n t r a t i o n u s e d i n a l l e x p e r i m e n t s ) d i d n o t a f f e c t t h e p h o s p h a t e d e t e r m i n a t i o n s , t h o u g hc o n c e n t r a t i o n s o f 5 mm o r more c a u s e d l a r g e e r r o r s .

I n e x p e r i m e n t s i n v o l v i n g l a r g e n u m b e r s o f t u b e s , t h e ATP was a d d e d s e r i a l l y a t 1 5 s e ci n t e r v a l s a t t h e b e g i n n i n g o f t h e e x p e r i m e n t , and t h e t u b e s w e r e removed f r o m t h e w a t e r -b a t h t o i c e d w a t e r a t 1 5 s e c i n t e r v a l s a t t h e e n d . T r i c h l o r o a c e t i c a c i d was a d d e d t o t h e t u b e si n t h e same o r d e r e x a c t l y 1 min l a t e r . Th e l a r g e number o f t u b e s u s e d i n some o f t h e e x p e r i -m e n t s a n d t h e n e c e s s i t y o f w a s h i n g t h e s y r i n g e a t c e r t a i n s t a g e s , t o a v o i d c o n t a m i n a t i o no f o n e t u b e b y t h e c o n t e n t s o f a n o t h e r , meant t h a t s o m e t i m e s t h e t u b e s a t t h e e n d o f ar u n h a d b e e n i n c u b a t e d a t 3 7 0 C f o r p e r h a p s 2 0 min l o n g e r t h a n t h o s e a t t h e b e g i n n i n g .F o r t u n a t e l y , i t was f o u n d t h a t i n c u b a t i o n i n t h e a b s e n c e o f ATP f o r 1 h r a t 3 7 0 C l e d t oa d e c r e a s e i n enzyme a c t i v i t y o f j u s t u n d e r 5 % , s o t h e c h a n g e i n a c t i v i t y b e t w e e n t h eb e g i n n i n g and end o f a r u n c o u l d b e n e g l e c t e d .


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ATP-ASE ACTIVITY AND ION MOVEMENTS 2 7 7RESULTSP r e l i m i n a r y e x p e r i m e n t s ( F i g s . 1 a n d l 2 ) s h o w e d t h a t , u n d e r t h e c o n -

d i t i o n s c h o s e n , t h e amount o f p h o s p h a t e f o r m e d i n a g i v e n t i m e wa sp r o p o r t i o n a l t o t h e q u a n t i t y o f c e l l s p r e s e n t ; f o r a g i v e n q u a n t i t y o f c e l l st h e a m o u n t - i n c r e a s e d l i n e a r l y w i t h t i m e f o r 1 1 h r . I n one o r t w o e x p e r i -m n e n t s t h e r e w a s a f a l l i n g o f f i n a c t i v i t y o f b e t w e e n 5 a n d 1 0 % d l u r i n g2 - 6 0 22 - 4

E2O0 J 2 2 - 0E Z 1 8 6- ~ ~ ~~ ~ ~ ~ ~ ~ ~~~~~-l6 ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ E~ 1 2 4i - 2 1 . 0

0 - 8-c~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~~c0 . 0 4 C L 00 - 2

05 1 . 0 1 5 2 - 0 3 0 6 0 9 0V o l u m e o f c e l l s ( m l . ) T i m e ( m i n )F i g . 1 F i g . 2

F i g . 1 . The e f f e c t o f enzyme c o n c e n t r a t i o n o n t h e r a t e o f l i b e r a t i o n o f p h o s p h a t ef r o m ATP b y r e d c e l l g h o s t A T P - a s e . G h o s t s w e r e p r e p a r e d b y t h e f i r s t m e t h o d .T e m p . 3 7 . 1 0 C;pH 7-1;ATP2 r x; M g 5 mM;Na 1 3 2 m M ; K 1 0 m m ; c y s t e i n e 1 m M ;e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t a t e 1 m m ; T r i s 2 8 m . D u r a t i o n 3 0 m i n . 0 g l y c o s i d ea b s e n t ; 0 s t r o p h a n t h i n 1 0 - g / m l .F i g . 2 . Time c u r v e f o r t h e l i b e r a t i o n o f p h o s p h a t e f r o m ATP b y r e d c e l l g h o s t si n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f s t r o p h a n t h i n . T h i s e x p e r i m e n t was d o n e on t h es a m e p r e p a r a t i o n and u n d e r t h e same c o n d i t i o n s a s t h a t shown i n F i g . 1 : s y m b o l sa s i n F i g . 1 .

t h e f i r s t h o u r ; t h e r e a s o n f o r t h i s w a s n e v e r d i s c o v e r e d . I n s u b s e q u e n te x p e r i m e n t s t h e amount o f p h o s p h a t e f o r m e d b y a g i v e n q u a n t i t y o f c e l l si n a f i x e d t i m e , u s u a l l y i h r o r 1 h r , w a s u s e d a s a m e a s u r e o f a c t i v i t y .

T h e e f f e c t 8 o f N a , K a n d c a r d i a c g l y c o s i d e sI f p a r t o f t h e A T P - a s e a c t i v i t y i s c o n n e c t e d w i t h t h e p u m p , a n d t h ep u m p o n l y p u m p s i f b o t h s o d i u m a n d p o t a s s i u m a r e p r e s e n t , o n e w o u l d


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2 7 8 E . T . DUNHAM AND I . M. GLYNNe x p e c t t o f i n d t h i s p a r t o f t h e a c t i v i t y d e p e n d e n t o n t h e p r e s e n c e o f b o t hs o d i u m a n d p o t a s s i u m . One m i g h t a l s o e x p e c t t h a t a n y a c t i v i t y w h i c ha p p e a r e d o n l y i n t h e p r e s e n c e o f b o t h s o d i u m a n d p o t a s s i u m w o u l d d i s -a p p e a r o n t h e a d d i t i o n o f c a r d i a c g l y c o s i d e s a t c o n c e n t r a t i o n s known t oi n h i b i t t h e p u m p . T h e s e e x p e c t a t i o n s a r e r e a l i z e d i n t h e r e s u l t s o f t w oe x p e r i m e n t s s h o w n i n T a b l e 1 .I t i s c l e a r t h a t a l a r g e p a r t o f t h e A T P - a s e a c t i v i t y o c c u r s i n t h e a b s e n c eo f a l k a l i m e t a l i o n s . A d d i t i o n o f s o d i u m a l o n e h a s n o e f f e c t ; a d d i t i o n o fp o t a s s i u m a l o n e h a s a v e r y s l i g h t e f f e c t ; a d d i t i o n o f b o t h t o g e t h e r c a u s e sa m a r k e d i n c r e a s e i n a c t i v i t y , a n d t h i s i n c r e a s e i s a b o l i s h e d by t h e c a r d i a cg l y c o s i d e s s t r o p h a n t h i n a n d s c i l l a r e n A . Some s i m i l a r r e s u l t s h a v er e c e n t l y b e e n r e p o r t e d by P o s t ( 1 9 5 9 ) .TABLE 1 . Th e e f f e c t s o f N a , K and c a r d i a c g l y c o s i d e s on t h e ATP-ase a c t i v i t y o f

r e d c e l l g h o s t s A c t i v i t y[ N a ] [ K ] ( m - m o l eE x p t . n o . ( m M ) ( m M ) P / i . c e l l s / h r )IG.4 0 0 0 - 7 50 - 7 80 1 6 0 - 8 20 - 8 41 6 0 0 - 7 3

0 - 8 31 6 1 6 1 - 3 41 - 3 7I n t h e p r e s e n c e o f s t r o p h a n t h i n 1 6 1 6 0 - 7 8( 1 0 - 4 g / m l . ) 0 - 8 5RP. 1 0 0 0 - 5 70 1 6 0 - 6 46 4 0 0 - 5 56 4 1 6 1 - 3 3I n t h e p r e s e n c e o f s c i l l a r e n A 6 4 1 6 0 - 5 8( 1 - 7 x 1 0 - 5 g / m l . )

C o n d i t i o n 8 o f e x p e r i m e n t a . G h o s t s p r e p a r e d by t h e t h i r d m e t h o d . D u r a t i o n 1 h r ; t e m p .3 7 0 C ; p H 7 - 0 ; ATP 1 - 5 m M ; M g 0 - 5 mm i n E x p t . I G . 4 , 0 - 9 6 mM i n E x p t . RP. 1 ; c y s t e i n e1 m m ; T r i s t o m a k e u p 1 6 0 m m ; ' S p e c p u r e ' Na and K .I t i s c o n v e n i e n t , i n w h a t f o l l o w s , t o r e f e r t o t h e a c t i v i t y t h a t d e p e n d s

o n t h e p r e s e n c e o f b o t h s o d i u m a n d p o t a s s i u m a s ' g l y c o s i d e - s e n s i t i v e 'a n d t o t h e r e m a i n d e r a s ' g l y c o s i d e - i n s e n s i t i v e ' . T h i s i s n o t meant t o i m p l yt h a t t w o s e p a r a t e e n z y m e s a r e r e s p o n s i b l e , t h o u g h t h e y m a y b e .

T h e e f f e c t o f pHF i g u r e 3 s h o w s t h e e f f e c t o f p H i n t h e p r e s e n c e a n d a b s e n c e o f c a r d i a cg l y c o s i d e s . T h e s o l u t i o n w a s b u f f e r e d w i t h 3 5 mm T r i s , b u t o v e r t h e

l o w e r r a n g e o f t h e c u r v e t h e b u f f e r i n g w a s p r o v i d e d m a i n l y b y t h e ATPi t s e l f . T h e q u a n t i t y o f h y d r o g e n i o n s l i b e r a t e d d u r i n g t h e h y d r o l y s i s wasc a l c u l a t e d t o b e i n s u f f i c i e n t t o u p s e t t h e p H i n a l l e x c e p t t h e l o w e s t twot u b e s , w h e r e a d r o p o f I i n p H p r o b a b l y o c c u r r e d d u r i n g t h e r u n .) by guest on August 7, 2012jp.physoc.orgDownloaded from J Physiol (

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ATP-ASE ACTIVITY AND ION MOVEMENTST h e r e s u l t s a r e n o t a c c u r a t e e n o u g h t o make i t w o r t h w h i l e t o p l o t t h ed i f f e r e n c e c u r v e , w h i c h w o u l d g i v e t h e p H s e n s i t i v i t y o f t h e g l y c o s i d e -s e n s i t i v e c o m p o n e n t , b u t i t i s o b v i o u s t h a t t h e e f f e c t s o f p H o n t h e t w o

c o m p o n e n t s a r e n o t v e r y d i f f e r e n t .1 2

1 - 0

- a 0 8I UE 0 6

0 - 40 - 2

I , . .5 6 7 8 9

p HF i g . 3 . The e f f e c t o f pH on t h e ATP-ase a c t i v i t y o f r e d c e l l g h o s t s . G h o s t s w e r e p r e -p a r e d by t h e s e c o n d m e t h o d . T e m p . 3 7 . 1 0 C ; ATP 1 - 5 m M; M g 2 m M; K 1 0 m m ;c y s t e i n e 0 - 7 5 m M; T r i s 3 5 - 3 m M; Na t o m a k e u p 1 6 0 m m . D u r a t i o n 1 h r .0 g l y c o s i d e a b s e n t ; * + s t r o p h a n t h i n 1 0 - 4 g / m l . I n t h i s e x p e r i m e n t t h e r e a c t i o nwas s t a r t e d b y t h e a d d i t i o n o f t h e g h o s t s u s p e n s i o n t o s o l u t i o n s a l r e a d y c o n -t a i n i n g ATP.

A c t i v a t i o n b y d i v a l e n t c a t i o n sT h e A T P - a s e s t u d i e d b y H e r b e r t ( 1 9 5 6 ) p r e s u m a b l y c o r r e s p o n d s t o

o u r ' g l y c o s i d e - i n s e n s i t i v e c o m p o n e n t ' , a s p o t a s s i u m was n o t p r e s e n t i nH e r b e r t ' s e x p e r i m e n t s . H e r b e r t ' s e n z y m e was s t r o n g l y a c t i v a t e d b ym a g n e s i u m i o n s ; c a l c i u m a c t i v a t e d w e a k l y when p r e s e n t a l o n e b u tr e v e r s e d t h e a c t i v a t i o n d u e t o m a g n e s i u m .T h e r e s u l t s g i v e n i n T a b l e 2 s h o w t h a t e v e n i f s o d i u m a n d p o t a s s i u ma r e b o t h p r e s e n t t h e r e i s v e r y l i t t l e a c t i v i t y i n t h e a b s e n c e o f m a g n e s i u m .T h e r e l a t i o n b e t w e e n a c t i v i t y a n d m a g n e s i u m c o n c e n t r a t i o n , b o t h i n t h ep r e s e n c e a n d a b s e n c e o f s t r o p h a n t h i n , i s s h o w n i n F i g . 4 . T h e d i f f e r e n c e ,r e p r e s e n t i n g t h e g l y c o s i d e - s e n s i t i v e c o m p o n e n t , i s s h o w n a s a d o t t e d l i n e .

S i n c e o n e wa y o f e x p l a i n i n g t h e a c t i v a t i n g e f f e c t o f m a g n e s i u m i s t o s u p p o s e t h a t ac o m p l e x o f M g and ATP i s t h e t r u e s u b s t r a t e , t h e c o n c e n t r a t i o n o f Mg-ATP c o m p l e x h a sb e e n c a l c u l a t e d f o r e a c h m a g n e s i u m c o n c e n t r a t i o n . From t h e t i t r a t i o n c u r v e s o f ATPb e t w e e n pH 8 and pH 2 i n t h e p r e s e n c e and a b s e n c e o f m a g n e s i u m , B u r t o n & K r e b s ( 1 9 5 3 )c o n c l u d e t h a t MgATP2- i s t h e p r i n c i p l e c o m p l e x . B u r t o n ( 1 9 5 9 ) h a s m e a s u r e d t h e f o r m a t i o nc o n s t a n t o f t h i s c o m p l e x , and AH f o r i t s f o r m a t i o n , b y an i n g e n i o u s method i n w h i c h t h e

2 7 9


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E . T . DUNHAM AND I . M. GLYNNTABLE 2 . D e p e n d e n c e o f t h e A T P - a s e a c t i v i t y o f r e d c e l l g h o s t s o n t h e

p r e s e n c e o f magnesium[ M g ] S t r o p h a n t h i n( m x ) ( g / m l . )

0

0

1 - 51 - 5

0

22

01 0 - 40

10-'

0

1 0 - 40

1 0 - 4

A c t i v i t y( m - m o l e P / l . c e l l s / h r )- 0 - 0 1 80 - 0 0 7- 0 - 0 6 0- 0 - 0 3 50 - 0 1 1- 0 - 0 1 10 - 4 2 50 - 2 4 5

0 - 0 3 60 - 0 6 00 - 0 5 50 - 0 4 30 - 0 4 60 - 0 3 10 - 4 9 0i 0 - 5 0 4I 0 - 2 7 10 - 2 8 1

C o n d i t i o n s o f e x p e r i m e n t 8 . G h o s t s were p r e p a r e d b y t h e s e c o n d m e t h o d and t h e n washedt h r e e t i m e s w i t h a b u f f e r e d i s o t o n i c s o l u t i o n o f sodium c h l o r i d e t o g e t r i d o f magnesiumbound t o f i x e d a n i o n s . D u r a t i o n 1 h r ; t e m p . 3 7 0 C ; pH 7 - 1 ; ATP 1 - 5 mx; Na 1 2 0 mm;K0 mx; c y s t e i n e 1 mM; T r i s 3 0 m M . ( T h e n e g a t i v e s i g n s a r i s e w h e n t h e c o l o u r d e v e l o p e di s l e s s t h a n t h e b l a n k . )

0 6

0 . 5

w 0 - 40-- 6 0-3E

P0-2

0.1

T o t a l . M g c o n c e n t r a t i o n ( m M )F i g . 4 . Th e e f f e c t o f M g on t h e ATP-ase a c t i v i t y o f r e d c e l l g h o s t s . Ghosts werep r e p a r e d b y t h e s e c o n d m e t h o d a nd t h e n washed t h r e e times with a b u f f e r e di s o t o n i c s o l u t i o n o f sodium c h l o r i d e t o g e t r i d o f Mg b o u n d t o f i x e d a n i o n s . Temp.3 7 0 C ; pH 7 - 1 ; ATP 1 - 5 mx; Na 1 2 0 mx; K 1 0 mx; c y s t e i n e 1 mx; T r i s 30 mx.D u r a t i o n 1 h r . ( 0 ) g l y c o s i d e a b s e n t ; ( 0 ) s t r o p h a n t h i n 1 0 - 4 g / m l . Th e d i f f e r e n c ebetween t h e t wo c u r v e s i s s ho wn b y t h e d o t t e d l i n e , whi c h t h e r e f o r e r e p r e s e n t s t h e' g l y c o s i d e - s e n s i t i v e ' c o m p o n e n t .

2 8 0

E x p t . n o .DD. 1

J D . 1


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ATP-ASE ACTIVITY AND ION MOVEMENTS 2 8 1c o n c e n t r a t i o n o f f r e e magnesium i s c a l c u l a t e d f r o m t h e a b s o r p t i o n s p e c t r u m o f 8 - h y d r o x y -q u i n o l i n e p r e s e n t i n t h e s o l u t i o n . From B u r t o n ' s d a t a r e f e r r i n g t o t h e f o r m a t i o n o f c o m p l e xa t 2 5 0 C and pH 8 and i n t h e p r e s e n c e o f 1 0 0 mm-K, i t i s p o s s i b l e t o c a l c u l a t e t h a t t h ea p p a r e n t f o r m a t i o n c o n s t a n t a t 3 7 0 C and pH 7 must b e a b o u t 1 4 0 0 0 , w h e r e t h e a p p a r e n tf o r m a t i o n c o n s t a n t i s d e f i n e d b y t h e r a t i o

[ M g A T P 2 - ][ M g 2 + ] [ A T P t 0 W f e e ]T h i s f i g u r e h a s b e e n u s e d t o c a l c u l a t e t h e c o n c e n t r a t i o n o f c o m p l e x a t e a c h c o n c e n t r a t i o no f magnesium i n t h e p r e s e n t e x p e r i m e n t s .

The f a l l i n g o f f i n g l y c o s i d e - s e n s i t i v e a c t i v i t y a t h i g h magnesium c o n c e n t r a t i o n s s u g g e s t st h a t f r e e m a g n e s i u m m i g h t c o m p e t e w i t h t h e c o m p l e x , a n d , i n f a c t , t h e o b s e r v e d r e l a t i o n s h i pb e t w e e n g l y c o s i d e - s e n s i t i v e a c t i v i t y and t h e c o n c e n t r a t i o n s o f c o m p l e x and o f f r e e m a g n e s i u mf i t s i m p l e c o m p e t i t i v e k i n e t i c s v e r y w e l l i f Km ( t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t o f t h e e n z y m e -s u b s t r a t e c o m p l e x ) i s 0 - 0 7 7 and K i ( t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t o f t h e enzyme i n h i b i t o rc o m p l e x ) i s 0 * 8 4 . H o w e v e r , when t h e s e v a l u e s f o r Km and K i a r e u s e d t o p r e d i c t t h e c h a n g ei n g l y c o s i d e - s e n s i t i v e a c t i v i t y i n a n e x p e r i m e n t i n w h i c h t o t a l magnesium i s k e p t c o n s t a n tand t o t a l ATP i s i n c r e a s e d ( s e e , f o r e x a m p l e , F i g . 5 ) , t h e r e s u l t s a r e w i l d l y o u t . A n o t h e rp o s s i b i l i t y t h a t h a s b e e n c o n s i d e r e d , s u g g e s t e d by t h e d r o p i n t h e l a s t p o i n t i n F i g . 5 , i st h a t Mg-ATP c o m p l e x i s t h e s u b s t r a t e and t h a t b o t h f r e e magnesium and f r e e ATP a c t a sc o m p e t i t i v e i n h i b i t o r s . I t s h o u l d t h e n b e p o s s i b l e t o f i n d v a l u e s f o r t h r e e c o n s t a n t s ,K m , K 1 and K j ( w h e r e K i and K j a r e t h e d i s s o c i a t i o n c o n s t a n t s o f t h e two e n z y m e - i n h i b i t o rc o m p l e x e s ) w h i c h a r e c o m p a t i b l e w i t h t h e r e s u l t s o f b o t h e x p e r i m e n t s . I n f a c t t h i s h a s n o tb e e n p o s s i b l e and t h e h y p o t h e s i s must b e r e j e c t e d .

1 2

i 0 - 8

0 E 0 - 6

0 - 2

0 . 5 1 - 0 15 2 - 0 2 - 5 3 0ATP c o n c e n t r a t i o n ( m M )

F i g . 5 . Th e e f f e c t o f ATP c o n c e n t r a t i o n on t h e A T P - a s e a c t i v i t y o f r e d c e l l g h o s t s .G h o s t s w e r e p r e p a r e d by t h e s e c o n d m e t h o d . T e m p . 3 7 0 C ; p H 7 - 1 ; M g 3 mM;Na 1 1 0 mM; K 1 0 m M; c y s t e i n e 1 m m ; T r i s 3 0 m y . D u r a t i o n 1 h r . ( 0 ) g l y c o s i d ea b s e n t ; ( 0 ) s t r o p h a n t h i n 104 g / m l . The d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t wo c u r v e s i sshown by t h e d o t t e d l i n e , w h i c h t h e r e f o r e r e p r e s e n t s t h e ' g l y c o s i d e - s e n s i t i v e 'c o m p o n e n t .


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2 8 2 E . T . DUNHAM AND I . M. GLYNNC a l c i u n m . I n t h e p r e s e n c e o f m a g n e s i u m q u i t e s m a l l a m o u n t s o f c a l c i u m

i n c r e a s e t h e A T P - a s e a c t i v i t y t w o - o r t h r e e f o l d ; h i g h e r c o n c e n t r a t i o n s o fc a l c i u m l e a d t o i n h i b i t i o n ( F i g . 6 ) . The optimum l e v e l o f c a l c i u m d e p e n d so n t h e m a g n e s i u m c o n c e n t r a t i o n ( F i g . 7 ) , b e i n g r o u g h l y t h r e e t i m e s a sh i g h when t h e m a g n e s i u m c o n c e n t r a t i o n i s r a i s e d by a f a c t o r o f t h r e e .

1 * 0

0 9

0 - 8

0 - 7

- < 0 30 - s

0 04 ) 0 - 5 0 - -E> 0 - 4

0 . 3

0 . 2 %

0{ 0 - 0 0 1 0 - 0 1 0 . 1 I 1 0C a c o n c e n t r a t i o n ( m M )

F i g . 6 . The e f f e c t o f c a l c i u m i n t h e p r e s e n c e o f m a g n e s i u m on t h e ATP-ase a c t i v i t yo f r e d c e l l g h o s t s . G h o s t s w e r e p r e p a r e d by t h e s e c o n d m e t h o d . T e m p . 3 7 0 C ;pH 7 - 0 ; ATP 1 - 5 mM; M g 2 m m ; Na 1 1 0 m M; K 2 0 m M; c y s t e i n e 1 mM; T r i s3 0 m m . D u r a t i o n 3 0 m i n . ( 0 ) g l y c o s i d e a b s e n t ; ( 0 ) s t r o p h a n t h i n 1 0 - 5 g / m l . ;( A ) K - f r e e , r e p l a c e d b y e x t r a T r i s . Th e d i f f e r e n c e b e t w e e n t h e t wo c u r v e s i sshown b y t h e d o t t e d l i n e , w h i c h t h e r e f o r e r e p r e s e n t s t h e ' g l y c o s i d e - s e n s i t i v e 'c o m p o n e n t . S e m i - l o g . s c a l e .

T h i s s u g g e s t s t h a t t h e i n h i b i t o r y e f f e c t o f c a l c i u m d e p e n d s o n a s t r a i g h tMg-Ca c o m p e t i t i o n . The a c t i v a t i o n by c a l c i u m a f f e c t s o n l y t h e g l y c o s i d e -i n s e n s i t i v e c o m p o n e n t ; t h e g l y c o s i d e - s e n s i t i v e c o m p o n e n t i s i n h i b i t e d e v e na t l o w c a l c i u m c o n c e n t r a t i o n s ( F i g . 6 ) . F i g u r e 6 a l s o s h o w s t h a t , a s m i g h t


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ATP-ASE ACTIVITY AND ION MOVEMENTS 2 8 3b e e x p e c t e d , t h e a b s e n c e o f p o t a s s i u m h a s much t h e same e f f e c t a s t h ep r e s e n c e o f s t r o p h a n t h i n .

1 * 2 5

1 * 0

-Z 0 7 5E -VE> 0 - 5Z4 . _

40 - 2 5

0 @ 0 0 1

* a

I t .* ,3b1 ... p;. . .Q 0 0 1 0 - 1 1 1 0

C a c o n c e n t r a t i o n ( m M )

2 - 0

1 8

1 6

1 - 4

1 2

1 ( 0 U1 00 - 8

0 - 6

0 - 4

0 - 2

F i g . 7 . The e f f e c t o f c a l c i u m a t two d i f f e r e n t l e v e l s o f magnesium on t h e ATP-asea c t i v i t y o f r e d c e l l g h o s t s . The d o t t e d l i n e s show t h e r a t i o o f Ca t o M g . G h o s t sw e r e p r e p a r e d b y t h e s e c o n d m e t h o d . ( T h e g h o s t p r e p a r a t i o n u s e d i n t h i s e x p e r i -ment i s d i f f e r e n t f r o m t h a t u s e d i n t h e e x p e r i m e n t shown i n F i g u r e 6 , and h a ss l i g h t l y l e s s a c t i v i t y . ) Temp. 3 7 0 C ; p H 7 0 ; ATP 1 - 5 mM; Na 1 1 0 m m ; K 2 0 m M;c y s t e i n e 1 mM; T r i s 3 0 mm. D u r a t i o n 1 h r . S e m i - l o g . s c a l e .M o l e c u l a r r e q u i r e m e n t s f o r i n h i b i t i o n

I t w a s m e n t i o n e d i n t h e i n t r o d u c t i o n t h a t c e r t a i n m o d i f i c a t i o n s t o t h ec a r d i a c g l y c o s i d e m o l e c u l e g r e a t l y r e d u c e t h e i n h i b i t o r y e f f e c t o n i o np u m p i n g . T h e f o r m u l a e o f t w o g l y c o s i d e s t h a t a r e p o w e r f u l i n h i b i t o r s o fi o n p u m p i n g , a n d o f t w o r e l a t e d c o m p o u n d s t h a t a r e much l e s s a c t i v e i nt h i s r e s p e c t , a r e s h o w n o n p . 2 8 4 .F i g u r e 8 s h o w s a ' d o s e - e f f e c t c u r v e ' f o r t h e i n h i b i t i o n o f t h e g l y c o s i d e -s e n s i t i v e c o m p o n e n t o f t h e g h o s t A T P - a s e b y s c i l l a r e n A . M a r k e d o n t h e

0

a


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E . T . DUNHAM AND I . M. GLYNNo r d i n a t e a r e t h e e f f e c t s o f 1 0 - 6 g / m l . o f c y m a r i n , 1 7 o c - c y m a r i n , a n dh e x a h y d r o s c i l l a r e n A . I t i s c l e a r t h a t c y m a r i n a n d s c i l l a r e n A a r e a b o u te q u a l l y e f f e c t i v e . H e x a h y d r o s c i l l a r e n A a t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 - 6 g / m l .i s l e s s e f f e c t i v e t h a n s c i l l a r e n A a t 1 0 - 7 g / m l . - i n o t h e r w o r d s i t h a s l e s st h a n o n e t e n t h o f t h e a c t i v i t y . 1 7 o c - c y m a r i n h a s n o a p p r e c i a b l e e f f e c t .

CH2-CH2CH C = O'CH2-O

( r h a m n o s e - g l u c o s e )S c i l l a r e n A* ( a c t i v e ) H e x a h y d r o s c i l l a r e n A

H

C 7 H , H 3 0 3 0 OH - C 7 H 3 0 3 0 - OH -( c y m a r o s e ) C y m a r i n ( a c t i v e ) 1 7 c c - C y m a r i n ( A l l o - c y m a r i n )

* I n t h e p a p e r b y G l y n n ( 1 9 5 7 b ) t h e f o r m u l a e o f s c i 1 l a r e n A and o f e m i c y m a r i n a r eu n f o r t u n a t e l y shown w i t h t h e wrong c o n f i g u r a t i o n a t C 1 7 .S o t h e same m o l e c u l a r f e a t u r e s seem t o b e i m p o r t a n t f o r A T P - a s e i n h i b i t i o na s a r e i m p o r t a n t f o r i n h i b i t i n g t h e i o n p u m p , a n d a l s o , i n c i d e n t a l l y , f o r' c a r d i o t o n i c ' a c t i o n ( W o l l e n b e r g e r , 1 9 5 4 ) . I n t h i s r e s p e c t t h e e f f e c t o fc a r d i a c g l y c o s i d e s o n t h e m e m b r a n e A T P - a s e d i f f e r s f r o m t h e i r e f f e c t o n

2 8 4

CH--CH" ' . 6 . 0


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ATP-ASE ACTIVITY AND ION MOVEMENTSt h e v i s c o s i t y o f c a r d i a c a c t i n s o l u t i o n s , f o r w h i c h t h e m o l e c u l a r r e q u i r e -m e n t s a r e much l e s s s t r i n g e n t ( H o r v a t h , K i r a l y & S z e r b , 1 9 4 9 ; S n e l l m a n &G e l o t t e , 1 9 5 0 ) .

C y m a r i n ( 1 0 - 6 g / m l . ) - _ 0

_ ' UH e x a h y d r o -s c i l l a r e n A ( 1 0 - 6 g . / m l . ) *

_ - c I

1 7 a - C y m a r i n ( 1 0 - 6 g / m I . ) 1 o -i o 0 9 1 0 - 8 1 0 F 7 1 0 - 6 i o - 11 - 1 x s c i l l a r e n A c o n c e n t r a t i o n ( g / m I . )

F i g . 8 . F e a t u r e s o f t h e c a r d i a c g l y c o s i d e m o l e c u l e r e q u i r e d f o r i n h i b i t i o n o f r e dc e l l g h o s t A T P - a s e . Th e c o n t i n u o u s l i n e i s a ' d o s e - e f f e c t ' c u r v e f o r s o i l l a r e n A . Th ee f f e c t s o f c e r t a i n r e l a t e d c o m p o u n d s a r e shown on t h e o r d i n a t e . G h o s t s were p r e -p a r e d by t h e t h i r d m e t h o d . T e m p . 3 7 - 1 ' C ; p H 7 . 1 ; ATP 1 5 m m ; M g 1 m m ; Na6 4 m M ;K 1 6 mM; c y s t e i n e 1 m m ; ' T r i s ' 8 0 m m . D u r a t i o n l h r . The t u b e s w e r e p l a c e di n t h e w a t e r - b a t h 4 5 min b e f o r e t h e a d d i t i o n o f ATP. S e m i - l o g . s c a l e .

T h e e f f e c t o f p o t a s 8 i n m o n i n h i b i t i o n b y c a r d i a c g l y c o s i d e 8T h e f o u r t h f e a t u r e o f t h e s o d i u m - p o t a s s i u m p u m p w a s t h a t i n h i b i t i o n

by v e r y l o w c o n c e n t r a t i o n s o f c a r d i a c g l y c o s i d e s c o u l d b e p r e v e n t e d b yr a i s i n g t h e p o t a s s i u m c o n c e n t r a t i o n o u t s i d e t h e c e l L s ( G l y n n , 1 9 5 7 b ) . T h ee f f e c t r e s e m b l e d c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n , t h o u g h c o m p e t i t i o n b e t w e e np o t a s s i u m i o n s a n d c a r d i a c g l y c o s i d e m o l e c u l e s d o e s n o t seem v e r y l i k e l ya n d t h e d a t a d i d n o t a c c u r a t e l y f i t s i m p l e c o m p e t i t i v e k i n e t i c s . T a b l e 3s h o w s t h e e f f e c t o f p o t a s s i u m c o n c e n t r a t i o n on t h e i n h i b i t i o n o f t h eg l y c o s i d e - s e n s i t i v e c o m p o n e n t o f t h e A T P - a s e b y s t r o p h a n t h i n a t ac o n c e n t r a t i o n o f 5 x 1 0 - g / m l . T h e d e c r e a s e i n i n h i b i t i o n a s t h e p o t a s s i u mc o n c e n t r a t i o n i s r a i s e d i s s t r i k i n g . Two e x p e r i m e n t s w i t h s l i g h t l y h i g h e rc o n c e n t r a t i o n s o f s t r o p h a n t h i n g a v e s i m i l a r r e s u l t s , e x c e p t t h a t t h er e v e r s a l w a s l e s s c o m p l e t e , a n d r e m a i n e d i n c o m p l e t e e v e n w h e n t h ep o t a s s i u m c o n c e n t r a t i o n was i n c r e a s e d f u r t h e r . T h u s , w i t h s t r o p h a n t h i na t a c o n c e n t r a t i o n o f 1 0 - 7 g / m l . i n h i b i t i o n o f t h e ' s e n s i t i v e ' c o m p o n e n td e c r e a s e d f r o m a b o u t 9 0 % w i t h 0 - 2 5 mm-K+ t o 1 8 % w i t h 8 mM-K+ a n dt h e n r e m a i n e d a t a b o u t t h i s l e v e l f r o m 1 5 t o 6 4 m M - K + . W i t h s t r o p h a n t h i na t 2 x 1 0 - 7 g / m l . i n h i b i t i o n was 3 5 % a t 8 m m - K + , 3 9 % a t 1 6 m m - K + , a n d

2 8 5


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E . T . DUNHAM AND I . M. GLYNN3 5 % a t 3 2 m M - K + , t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n t h e s e f i g u r e s n o t b e i n gs i g n i f i c a n t . T h e i n t e r p r e t a t i o n o f t h i s l e v e l l i n g o f f i s n o t c l e a r b u t i tc a n n o t b e e x p l a i n e d o n s i m p l e c o m p e t i t i v e k i n e t i c s . I t c o u l d c o n c e i v a b l yb e d u e t o a s e p a r a t e n o n - c o m p e t i t i v e i n h i b i t i o n , e i t h e r b y s t r o p h a n t h i ni t s e l f o r a n i m p u r i t y i n t h e s t r o p h a n t h i n p r e p a r a t i o n .

TABLE 3 . The e f f e c t o f p o t a s s i u m c o n c e n t r a t i o n on i n h i b i t i o n b y s t r o p h a n t h i no f t h e ' g l y c o s i d e - s e n s i t i v e ' ATP-ase a c t i v i t y o f r e d c e l l g h o s t s

T o t a l A c t i v i t y i n t h eg l y c o s i d e - p r e s e n c e o fs e n s i t i v e s t r o p h a n t h i na c t i v i t y ( 5 x 1 0 - 8 g / m l . )K c o n c n . ( m - m o l e P / ( m - m o l e P / I n h i b i t i o n( m M ) 1 . c e l l s / h r ) 1 . c e l l s / h r ) ( % )0 - 2 5 0 - 1 8 8 0 - 0 2 7 8 60 - 5 0 - 3 6 4 0 - 1 3 4 6 31 0 - 6 1 9 0 - 2 9 0 5 32 0 - 7 7 8 0 - 4 9 8 3 64 0 - 8 5 5 0 - 6 8 6 2 08 0 - 9 2 6 0 - 7 8 2 1 51 6 1 - 0 2 0 - 8 2 3 1 93 2 1 - 0 4 0 - 9 6 4 7

C o n d i t i o n 8 o f e x p e r i m e n t . G h o s t s p r e p a r e d b y t h e t h i r d m e t h o d . D u r a t i o n 1 h r ; t e m p .3 7 C ; p H 7 - 2 ; ATP 1 - 5 m m ; M g 0 - 5 m m ; Na 6 0 m m ; c y s t e i n e 1 m M; T r i s t o make u p1 6 0 m m. The t u b e s w e r e p l a c e d i n t h e w a t e r - b a t h an h o u r b e f o r e t h e a d d i t i o n o f ATP. Th et o t a l g l y c o s i d e - s e n s i t i v e a c t i v i t y was d e t e r m i n e d w i t h 1 0 - 4 g s t r o p h a n t h i n / m L . and a t i t sh i g h e s t a c c o u n t e d f o r 5 6 % o f t h e t o t a l ATP-ase a c t i v i t y ( s e e F i g . 9 ) .

S o d i u m a n d p o t a s i u m n i n t e r a c t i o nS o f a r n o t h i n g h a s b e e n s a i d a b o u t t h e c o n c e n t r a t i o n s o f s o d i u m a n d

p o t a s s i u m n e c e s s a r y t o a c t i v a t e t h e g l y c o s i d e - s e n s i t i v e c o m p o n e n t o f t h eA T P - a s e . F i g u r e 9 s h o w s t h a t w i t h 6 0 mM-Na+ p r e s e n t t h e a c t i v i t y i n -c r e a s e s w i t h i n c r e a s i n g p o t a s s i u m c o n c e n t r a t i o n up t o a b o u t 4 mm-K+ a n dt h e n l e v e l s o f f . T h e c o n c e n t r a t i o n o f p o t a s s i u m f o r h a l f - m a x i m u m a c t i v i t yi s a b o u t 1 mm. A s i m i l a r r e s u l t i s s h o w n b y t h e t o p c u r v e o f F i g . 1 0 .W h e n a c t i v i t y i s p l o t t e d a s a f u n c t i o n o f s o d i u m a t a f i x e d p o t a s s i u mc o n c e n t r a t i o n o f 1 6 mm ( F i g . 1 1 , t o p c u r v e ) , a c t i v i t y i n c r e a s e s up t o a b o u t3 2 mm-Na+ a n d t h e n l e v e l s o f f . T h e s o d i u m c o n c e n t r a t i o n f o r h a l f - m a x i m u ma c t i v i t y i s a b o u t 4 mm. H o w e v e r , t h e s e s t a t e m e n t s d o n o t a d e q u a t e l ys u m m a r i z e t h e b e h a v i o u r o f t h e A T P - a s e , b e c a u s e t h e e f f e c t o f s o d i u mc o n c e n t r a t i o n d e p e n d s o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f p o t a s s i u m a n d v i c e v e r s a .T h u s , i n F i g . 1 1 , a l t h o u g h w i t h 1 6 mm-K+ a c t i v i t y i n c r e a s e s w i t h i n c r e a s i n gs o d i u m c o n c e n t r a t i o n t i l l 3 2 mM-Na+ a n d t h e n l e v e l s o f f , w i t h o n l y0 - 5 mM-K+ t h e r e i s a n optimum a t 8 m m - N a + , a n d h i g h e r l e v e l s o f s o d i u mg i v e l e s s a c t i v i t y . S i m i l a r l y , l o o k i n g a t t h e r e s u l t s i n F i g . 1 1 t h e o t h e r wa yr o u n d , w i t h 6 4 mm-Na+ a c t i v i t y i n c r e a s e s a s p o t a s s i u m i s r a i s e d f r o m0 - 5 t o 2 t o 1 6 mm, b u t w i t h 2 mM-Na+ t h e r e i s s l i g h t l y l e s s a c t i v i t y a t

2 8 6


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14/20

ATP-ASE ACTIVITY AND ION MOVEMENTS 2 8 72 mM-K+ t h a n a t 0 * 5 mM-K+, a n d l e s s a g a i n a t 1 6 mM-K+. A g a i n , i nF i g . 1 0 , w i t h 6 4 mM-Na+ a c t i v i t y i s m o r e t h a n d o u b l e d a s p o t a s s i u m i sr a i s e d f r o m 0 * 5 t o 8 mm, w h i l e w i t h o n l y 2 mm-Na t h e r e i s a s l i g h t d e c r e a s ei n a c t i v i t y o v e r t h i s r a n g e .A l l t h e s e r e s u l t s m a y b e s u m m a r i z e d by s a y i n g t h a t b o t h s o d i u m a n dp o t a s s i u m a r e n e c e s s a r y , b u t t h a t f o r optimum a c t i v i t y t h e r a t i o b e t w e e nt h e m m u s t b e n e i t h e r t o o g r e a t n o r t o o s m a l l .

2 - 0

1 6

1 - 4- c

4 , 1 4 21 -.. = 1 0 2

l u -6E>- 0 - 8

0 - 6

0 - 4

0 - 2

0_ _ _ _ _ _ _ _t_ _ _ _ - _ _ _ _

4 8 1 2 1 6 2 0K c o n c e n t r a t i o n ( m M )

2 8 3 2

F i g . 9 . Th e e f f e c t o f p o t a s s i u m c o n c e n t r a t i o n on t h e ATP-ase a c t i v i t y o f r e d c e l lg h o s t s i n t h e p r e s e n c e and a b s e n c e o f s t r o p h a n t h i n . 6 0 mM-Na; 0 g l y c o s i d ea b s e n t ; 0 s t r o p h a n t h i n 1 0 - 4 g / m l . Th e r e s u l t s p l o t t e d h e r e w e r e o b t a i n e d on t h esame p r e p a r a t i o n , u n d e r t h e same c o n d i t i o n s a n d a t t h e s a m e t i m e a s t h o s e g i v e ni n T a b l e 3 .

DISCUSSIONT h e d e p e n d e n c e o f i o n t r a n s p o r t o n g l y c o l y s i s i n s o m e c e l l s , o n r e s p i r a -

t i o n i n o t h e r s , a n d o n e i t h e r i n y e t o t h e r s , s u g g e s t s t h a t e n e r g y ma y b es u p p l i e d t o t h e p u m p i n t h e f o r m o f ATP r a t h e r t h a n d i r e c t l y f r o m a n yo f t h e i n d i v i d u a l s t e p s i n g l y c o l y s i s o r r e s p i r a t i o n . S u p p o r t f o r t h i s i d e a

1 9 PHYSIO. CLVI) by guest on August 7, 2012jp.physoc.orgDownloaded from J Physiol (

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E . T . DUNHAM AND I . M. GLYNNc o m e s f r o m e x p e r i m e n t s w i t h d i n i t r o p h e n o l . D i n i t r o p h e n o l u n c o u p l e sr e s p i r a t i o n f r o m p h o s p h o r y l a t i o n a n d i s f o u n d t o i n h i b i t i o n p u m p i n g i nn e r v e a n d n u c l e a t e d r e d c e l l s , w h i c h d e p e n d o n r e s p i r a t i o n , b u t n o t i nm a m m a l i a n r e d c e l l s , w h i c h d e p e n d o n g l y c o l y s i s ( M a i z e l s , 1 9 5 4 ; H o d g k i n& K e y n e s , 1 9 5 5 ) . F u r t h e r s u p p o r t f o r t h e r o l e o f ATP c o m e s f r o m t h ee x p e r i m e n t s o f C a l d w e l l ( 1 9 5 6 ) o n s q u i d a x o n s , a n d o f Dunham ( 1 9 5 7 a , b )

2 4 6 8 10K c o n c e n t r a t i o n (mM)

1 2 14 1 6

F i g . 1 0 . Th e e f f e c t o f p o t a s s i u m c o n c e n t r a t i o n on t h e ATP-ase a c t i v i t y o f r e d c e l lg h o s t s a t t wo d i f f e r e n t sodium c o n c e n t r a t i o n s . G h o s t s were p r e p a r e d by t h e t h i r dm e t h o d . Temp. 3 7 . 1 0 C ; pH 7 . 1 ; ATP 1 * 5 mx; Mg 1 mx; c y s t e i n e 1 mm; T r i st o m a k e up 1 6 0 mx. Na and K were ' S p e c p u r e ' r e a g e n t s . D u r a t i o n 1 h r . V6 4 mm-Na; 0 2 mx-Na; A0 mm-Na.

a n d W h i t t a m ( 1 9 5 8 ) on mammalian r e d c e l l s , s h o w i n g a c o r r e l a t i o n b e t w e e nt h e r a t e o f i o n t r a n s p o r t a n d t h e c o n c e n t r a t i o n or r a t e o f s p l i t t i n g o f' e n e r g y - r i c h ' p h o s p h a t e . M o r e d i r e c t e v i d e n c e i s p r o v i d e d b y e x p e r i m e n t si n w h i c h ATP was i n j e c t e d i n t r a c e l i u l a r l y i n t o c y a n i d e - p o i s o n e d s q u i da x o n s ( C a l d w e l i & K e y n e s , 1 9 5 7 ) , o r i n c o r p o r a t e d i n t o ' r e c o n s t i t u t e d '

1 . 0

0 9

0 - 8

0 * 71 -_ 0 - 6

0 .0 O 5 SE> 4 0 44 . _

03

0 - 2

0 - 1

2 8 8


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ATP-ASE ACTIVITY AND ION MOVEMENTSg h o s t s ( G a r d o s , 1 9 5 4 ) , o r r e m o v e d f r o m i n t a c t r e d c e l L s b y p o i s o n i n gg l u c o s e - f r e e c e l l s w i t h i o d o a c e t a t e a n d t h e n a l l o w i n g t h e m t o p h o s p h o r y -l a t e a d d e d g l u c o s e ( D u n h a m , 1 9 5 7 b ) .

A - A..1 . _

L10

E

._i

< 0 - 5

* i * . * . . I8 1 6 2 4 3 2 4 0 4 8 5 6 6 4

N a c o n c e n t r a t i o n ( m M )F i g . 1 1 . The e f f e c t o f s o d i u m c o n c e n t r a t i o n o n t h e ATP-ase a c t i v i t y o f r e d c e l lg h o s t s a t t h r e e d i f f e r e n t p o t a s s i u m c o n c e n t r a t i o n s . G h o s t s w e r e p r e p a r e d by t h et h i r d m e t h o d . Temp. 3 7 . 2 0 C ; pH 7 - 2 ; ATP 1 . 5 mM; M g 0 O 5 mM; c y s t e i n e 1 m n l ;T r i s t o m a k e u p 1 6 0 m M. Na and K w e r e ' S p e c p u r e ' r e a g e n t s . D u r a t i o n 1 h r .A 1 6 m m - K , x 2 mM-K, 0 0 - 5 mM-K, M 1 6 mM-K + s t r o p h a n t h i n 1 0 - ' g / m l .

T h e r e s u l t s r e p o r t e d i n t h e p r e s e n t p a p e r s h o w t h a t t h e r e i s a c l o s ep a r a l l e l i s m b e t w e e n t h e p r o p e r t i e s o f a n A T P - a s e i n t h e r e d c e l l m e m b r a n e ,a n d t h e p r o p e r t i e s o f t h e p u m p r e s p o n s i b l e f o r s h i f t i n g i o n s a c r o s s t h a tm e m b r a n e . I t i s d i f f i c u l t t o a v o i d t h e c o n c l u s i o n t h a t t h e a c t i o n o f t h i sA T P - a s e s o m e h o w p r o v i d e s e n e r g y f o r t h e t r a n s p o r t o f s o d i u m a n dp o t a s s i u m .I f , a s s e e m s l i k e l y , t h e s o d i u m a n d p o t a s s i u m i o n s t h a t a c t i v a t e t h eA T P - a s e a r e a l s o t h e i o n s t h a t a r e pumped a c r o s s t h e m e m b r a n e , t h e n i tf o l l o w s t h a t e x t e r n a l p o t a s s i u m a n d i n t e r n a l s o d i u m a r e t h e a c t i v a t i n g i o n s .A s t h e g h o s t s u s e d i n t h e s e e x p e r i m e n t s w e r e h i g h l y p e r m e a b l e t o s o d i u ma n d p o t a s s i u m , t h e r e i s n o d i r e c t e v i d e n c e o n t h i s p o i n t , b u t t h e r e i s s o m e1 9 - 2

2 8 9


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E . T . DUNHAM AND I . M. GLYNNi n d i r e c t e v i d e n c e r e l a t i n g t o p o t a s s i u m i o n s . T h e p r e v e n t i o n b y p o t a s s i u mo f g l y c o s i d e i n h i b i t i o n i n i n t a c t c e l l s i s d u e t o e x t e r n a l p o t a s s i u m , b e c a u s e ,i n t h e r e l e v a n t e x p e r i m e n t s , t h e i n t e r n a l p o t a s s i u m w a s h i g h a n d r e m a i n e du n c h a n g e d . U n l e s s t h e r e s e m b l a n c e b e t w e e n t h i s e f f e c t a n d t h e p o t a s s i u mr e v e r s a l o f A T P - a s e i n h i b i t i o n i s c o i n c i d e n t a l , i t f o l l o w s t h a t t h e p r e v e n t i o no f A T P - a s e i n h i b i t i o n m u s t a l s o b e d u e t o e x t e r n a l p o t a s s i u m . I t i s n o tc e r t a i n t h a t t h e e f f e c t s o f p o t a s s i u m i n a c t i v a t i n g t h e A T P - a s e a n d i np r e v e n t i n g t h e i n h i b i t i o n o f t h e A T P - a s e o c c u r a t t h e s a m e s i t e , b u t i ts e e m s l i k e l y .

The i n t e r p r e t a t i o n o f t h e r a t h e r c o m p l i c a t e d r e l a t i o n s h i p b e t w e e ns o d i u m a n d p o t a s s i u m c o n c e n t r a t i o n a n d a c t i v i t y i s n o t c l e a r . I f t h e r e a r es i t e s w i t h d i f f e r e n t a f f i n i t i e s f o r Na + a n d K + a n d i f t h e r a t e o f ATPs p l i t t i n g d e p e n d s o n how t h e s e s i t e s a r e f i l l e d , t h e n a p o s s i b l e e x p l a n a t i o nw o u l d b e t h a t t o o h i g h a r a t i o o f K + t o Na + d i s p l a c e s Na+ f r o m t h e s o d i u ms i t e s a n d t o o l o w a r a t i o d i s p l a c e s K + f r o m t h e p o t a s s i u m s i t e s . H o w e v e r ,i t i s n o t n e c e s s a r y t o p o s t u l a t e t h e e x i s t e n c e o f s i t e s w i t h d i f f e r e n t a f f i n i t i e s .I f T r i s w e r e u n a b l e t o r e a c h t h e s i t e s a t w h i c h t h e a l k a l i m e t a l i o n se x e r t t h e i r e f f e c t s , t h e l o c a l c o n c e n t r a t i o n o f e a c h o f t h e s e i o n s w o u l dd e p e n d o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e o t h e r a n d m u t u a l i n t e r a c t i o n w o u l do c c u r . T h e r e a r e o t h e r p o s s i b i l i t i e s . A s e r i o u s l i m i t a t i o n o f t h e p r e s e n te x p e r i m e n t s i s t h a t b e c a u s e t h e g h o s t s u s e d w e r e h i g h l y p e r m e a b l e t oc a t i o n s i t w a s n o t p o s s i b l e t o v a r y t h e c o n c e n t r a t i o n o n t h e t w o s i d e s o ft h e membrane i n d e p e n d e n t l y . E x p e r i m e n t s w i t h r e l a t i v e l y i m p e r m e a b l eg h o s t s w o u l d b e h e l p f u l .I t h a s n o t b e e n p o s s i b l e t o d e c i d e w h e t h e r t h e ' g l y c o s i d e - s e n s i t i v e ' a n d' g l y c o s i d e - i n s e n s i t i v e ' c o m p o n e n t s o f t h e A T P - a s e a r e t w o s e p a r a t ee n z y m e s . T h e r a t i o b e t w e e n t h e s i z e o f t h e t w o c o m p o n e n t s d e p e n d s o nt h e m a g n e s i u m c o n c e n t r a t i o n a t w h i c h a c t i v i t y i s m e a s u r e d ( F i g . 4 ) .D i f f e r e n t p r e p a r a t i o n s h a v e s l i g h t l y d i f f e r e n t r a t i o s , a n d i n a g i v e np r e p a r a t i o n t h e r a t i o o f ' s e n s i t i v e ' t o ' i n s e n s i t i v e ' a c t i v i t y t e n d s t o d e -c r e a s e s l o w l y i f t h e e n z y m e i s s t o r e d f o r a w e e k a t 5 0 C . I n o n e e x p e r i m e n tt h e f r a c t i o n o f a c t i v i t y t h a t w a s s e n s i t i v e t o c a r d i a c g l y c o s i d e s w a s c o n -s i d e r a b l y i n c r e a s e d by h y p e r t o n i c i t y , b u t t h i s e f f e c t h a s n o t b e e n i n v e s t i -g a t e d f u r t h e r . A l l a t t e m p t s t o e x t r a c t t h e A T P - a s e i n t o s o l u t i o n h a v ef a i l e d . A c e t o n e , M o r t o n ' s ( 1 9 5 5 ) b u t a n o l p r o c e d u r e , v a r i o u s o t h e r a l c o h o l sa n d d i g i t o n i n h a v e b e e n t r i e d . S i n c e i t h a s n o t b e e n p o s s i b l e t o d e t a c ht h e g l y c o s i d e - s e n s i t i v e A T P - a s e f r o m t h e m e m b r a n e , a n d , u n d e r t h ee x p e r i m e n t a l c o n d i t i o n s u s e d , i t i s l i k e l y t h a t i n d i v i d u a l t r a n s p o r t u n i t si n t h e membrane r e m a i n e d i n t a c t a n d c o n t i n u e d t o p u m p s o d i u m o u t w a r d sa n d p o t a s s i u m i n w a r d s , i t m a y b e t h a t a n y o r a l l o f t h e o b s e r v e d a l t e r a t i o n si n A T P - a s e a c t i v i t y r e s u l t e d f r o m a p r i m a r y a c t i o n o n s o m e o t h e r c o m -p o n e n t o f t h e t r a n s p o r t s y s t e m . T h i s d o e s n o t a f f e c t t h e a r g u m e n t t h a t

2 9 d 9 0


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ATP-ASE ACTIVITY AND ION MOVEMENTSa c l o s e r e s e m b l a n c e b e t w e e n t h e p r o p e r t i e s o f t h e p u m p a n d o f t h e A T P - a s ep o i n t s t o a r o l e f o r t h e A T P - a s e i n i o n t r a n s p o r t .T h e e f f e c t o f c a l c i u m i n v e r y l o w c o n c e n t r a t i o n s i s r e m a r k a b l e , t h o u g hw h e t h e r i t h a s a n y p h y s i o l o g i c a l s i g n i f i c a n c e i s n o t c l e a r . I t ma y b es i g n i f i c a n t t h a t r e d c e l l s n o r m a l l y c o n t a i n n o a p p r e c i a b l e c a l c i u m( P o n d e r , 1 9 4 8 ) .

T h e r e i s e v i d e n c e t h a t a c t i v e m o v e m e n t s o f s o d i u m a n d p o t a s s i u ma c r o s s n e r v e a n d m u s c l e m e m b r a n e s r e s e m b l e t h o s e a c r o s s t h e r e d c e l lmembrane i n b e i n g l i n k e d ( K e y n e s , 1 9 5 4 ; H o d g k i n & K e y n e s , 1 9 5 5 ) ,i n b e i n g i n h i b i t e d by c a r d i a c g l y c o s i d e s ( M a t c h e t t & J o h n s o n , 1 9 5 4 ;E d w a r d s & H a r r i s , 1 9 5 7 ; C a l d w e l l & K e y n e s , 1 9 5 9 ) , a n d , i n n e r v e a n y w a y ,i n d e p e n d i n g o n e n e r g y f r o m ATP ( C a l d w e l l , 1 9 5 6 ; C a l d w e l l & K e y n e s ,1 9 5 7 ) . T h e q u e s t i o n t h e r e f o r e a r i s e s w h e t h e r a n A T P - a s e s i m i l a r t o t h a ti n r e d c e l l s m i g h t e x i s t i n n e r v e a n d m u s c l e m e m b r a n e s . I n m u s c l e ,w h e r e i t i s n o t p o s s i b l e t o g e t t h e membrane f r e e f r o m t h e c o n t e n t s o f t h ec e l l , a n d w h e r e t h e c o n t e n t s h a v e v e r y c o n s i d e r a b l e A T P - a s e a c t i v i t y ,t h i s i s n o t g o i n g t o b e a n e a s y q u e s t i o n t o a n s w e r . I n n e r v e , h o w e v e r , t h e r ei s s o m e e v i d e n c e t h a t s u c h a n A T P - a s e m a y e x i s t . L i b e t , i n 1 9 4 8 , d e -s c r i b e d A T P - a s e a c t i v i t y i n s q u i d a x o n s , a n d s h o w e d t h a t t h e a c t i v i t yr e m a i n e d b e h i n d when t h e a x o p l a s m w a s e x t r u d e d . H o w e v e r , n o t h i n g i sknown o f t h e e f f e c t s o f a l k a l i m e t a l i o n s o n t h i s e n z y m e , n o r i s i t knownw h e t h e r t h e a c t i v i t y i s i n t h e m i t o c h o n d r i a , o r a t t a c h e d t o t h e a x o nmembrane o r e v e n i n t h e n e u r i l e m m a . O f m o r e i n t e r e s t i s t h e A T P - a s ed e s c r i b e d b y S k o u ( 1 9 5 7 ) i n s u b m i c r o s c o p i c p a r t i c l e s o b t a i n e d f r o m f i n e l ym i n c e d c r a b n e r v e s . I n t h e p r e s e n c e o f m a g n e s i u m , t h i s A T P - a s e i sa c t i v a t e d t o s o m e e x t e n t b y s o d i u m a n d much m o r e b y s o d i u m p l u sp o t a s s i u m , a n d t h e s e p r o p e r t i e s l e d S k o u t o s u g g e s t t h a t t h e e n z y m e m a yb e r e s p o n s i b l e f o r s o d i u m a n d p o t a s s i u m t r a n s p o r t . U n f o r t u n a t e l y i t i sn o t known how t h e p a r t i c l e s c a r r y i n g t h e A T P - a s e a c t i v i t y a r e r e l a t e d t ot h e o r i g i n a l a x o n m e m b r a n e .T h e e n z y m e i n t h e r e d c e l l membrane r e s p o n s i b l e f o r t h e s p l i t t i n g o fATP h a s b e e n r e f e r r e d t o t h r o u g h o u t t h i s p a p e r a s an A T P - a s e b e c a u s ew h a t i s o b s e r v e d i s t h e f o r m a t i o n o f i n o r g a n i c p h o s p h a t e . B u t i t i s q u i t ep o s s i b l e t h a t p h o s p h a t e t r a n s f e r o c c u r s f i r s t , a n d i s f o l l o w e d more o r l e s si m m e d i a t e l y b y h y d r o l y s i s . I f p h o s p h a t e t r a n s f e r d o e s o c c u r , t h e p h o s -p h a t e m u s t f o r a t i m e b e a t t a c h e d t o s o m e c o n s t i t u e n t o f t h e m e m b r a n e ,a n d i t m i g h t b e p o s s i b l e t o i d e n t i f y t h e p h o s p h o r y l a t e d c o m p o u n d i f t h eATP s p l i t w e r e l a b e l l e d i n t h e t e r m i n a l g r o u p w i t h 8 2 p . H o w e v e r , a s t h ei n t e r m e d i a t e m i g h t b e h i g h l y u n s t a b l e , o r p r e s e n t o n l y i n t r a c e a m o u n t s ,o r b o t h , t h e m e t h o d m i g h t n o t w o r k .

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E . T . DUNHAM AND I . M. GLYNNSUMMARY

1 . T h e A T P - a s e a c t i v i t y o f human r e d c e l l g h o s t s h a s b e e n s h o w n t oc o n s i s t o f t w o c o m p o n e n t s .2 . T h e f i r s t c o m p o n e n t r e q u i r e s t h e p r e s e n c e o f m a g n e s i u m i o n s b u to c c u r s i n t h e a b s e n c e o f a l k a l i m e t a l i o n s a n d i s n o t i n h i b i t e d b y c a r d i a cg l y c o s i d e s . I n t h e p r e s e n c e o f m a g n e s i u m , a c t i v i t y i s g r e a t l y i n c r e a s e db y s m a l l a m o u n t s o f c a l c i u m b u t i n h i b i t e d b y l a r g e r a m o u n t s .3 . T h e s e c o n d c o m p o n e n t r e q u i r e s t h e p r e s e n c e o f m a g n e s i u m a n d a l s oo f b o t h s o d i u m a n d p o t a s s i u m i o n s . I t i s c o m p l e t e l y i n h i b i t e d b y c a r d i a cg l y c o s i d e s i n c o n c e n t r a t i o n s s u f f i c i e n t t o i n h i b i t i o n t r a n s p o r t i n i n t a c tr e d c e l l s . C a l c i u m i o n s i n h i b i t a t b o t h l o w a n d h i g h c o n c e n t r a t i o n s .4 . E x p e r i m e n t s w i t h c e r t a i n m o d i f i e d c a r d i a c g l y c o s i d e s s u g g e s t t h a tt h e s a m e m o l e c u l a r f e a t u r e s a r e i m p o r t a n t f o r i n h i b i t i o n o f t h e A T P - a s ea s f o r i n h i b i t i o n o f t h e i o n p u m p .5 . A T P - a s e i n h i b i t i o n b y v e r y l o w c o n c e n t r a t i o n s o f c a r d i a c g l y c o s i d e si s p r e v e n t e d b y r a i s i n g t h e p o t a s s i u m c o n c e n t r a t i o n , j u s t a s , i n i n t a c tc e l l s , i n h i b i t i o n o f t h e a c t i v e p o t a s s i u m i n f l u x b y l o w c o n c e n t r a t i o n s o fc a r d i a c g l y c o s i d e s m a y b e p r e v e n t e d b y r a i s i n g t h e p o t a s s i u m c o n c e n t r a t i o n .

6 . T h e e f f e c t o f p o t a s s i u m c o n c e n t r a t i o n o n t h e g l y c o s i d e - s e n s i t i v ec o m p o n e n t o f t h e A T P - a s e d e p e n d s o n t h e c o n c e n t r a t i o n o f s o d i u m a n dv i c e v e r s a .7 . T h e c l o s e r e s e m b l a n c e b e t w e e n t h e p r o p e r t i e s o f t h e g l y c o s i d e -s e n s i t i v e A T P - a s e a n d t h e i o n p u m p s u g g e s t s t h a t t h e y a r e i n t i m a t e l yc o n n e c t e d .We w i s h t o t h a n k Dr J . B . C h a p p e l l f o r s e v e r a l h e l p f u l d i s c u s s i o n s , P r o f e s s o r R e i c h s t e i na n d M e s s r s S a n d o z o f B a s l e f o r g i f t s o f c a r d i a c g l y c o s i d e s , and t h e U . S . P u b l i c H e a l t h S e r v i c e

f o r a g r a n t f o r a p p a r a t u s .REFERENCES

B u R T o N , K . ( 1 9 5 9 ) . F o r m a t i o n c o n s t a n t s f o r t h e c o m p l e x e s o f a d e n o s i n e d i - o r t r i - p h o s p h a t ew i t h m a g n e s i u m o r c a l c i u m i o n s . B i o c h e m . J . 7 1 , 3 8 8 - 3 9 5 .B u R T O N , K . & K R E B S , H . A . ( 1 9 5 3 ) . Th e f r e e - e n e r g y c h a n g e s a s s o c i a t e d w i t h t h e i n d i v i d u a ls t e p s o f t h e t r i c a r b o x y l i c a c i d c y c l e , g l y c o l y s i s and a l c o h o l i c f e r m e n t a t i o n and w i t h t h eh y d r o l y s i s o f t h e p y r o p h o s p h a t e g r o u p s o f ATP. B i o c h e m . J . 5 4 , 9 4 - 1 0 7 .C A P F R E Y , R. W . , TREMBLAY, R . , G A B R I O , B . W . & H U E N N E K E N S s , F . M. ( 1 9 5 6 ) . E r y t h r o c y t em e t a b o l i s m . I I . A d e n o s i n e t r i p h o s p h a t a s e . J . b i o l . C h e m . 2 2 3 , 1 - 8 .C A T D W E r L w , P . C . ( 1 9 5 6 ) . Th e e f f e c t o f c e r t a i n m e t a b o l i c i n h i b i t o r s on t h e p h o s p h a t e e s t e r so f t h e s q u i d g i a n t a x o n . J . P h y 8 i o l . 1 3 2 , 3 5 P .C A L D W E L L , P . C . & K E Y N E 8 , R . D . ( 1 9 5 7 ) . Th e u t i l i z a t i o n o f p h o s p h a t e bond e n e r g y f o rs o d i u m e x t r u s i o n . J . P h y s i o l . 1 3 7 , 1 2 - 1 3 P .C A , D w E L L , P . C . & KEYNEs, R . D . ( 1 9 5 9 ) . The e f f e c t o f o u a b a i n o n t h e e f f l u x o f s o d i u mf r o m a s q u i d g i a n t a x o n . J . P h y 8 i o l . 1 4 8 , 8 - 9 P .C L A R K S O N , E . M . & M A I Z E L S , M. ( 1 9 5 2 ) . D i s t r i b u t i o n o f p h o s p h a t a s e s i n h u m a n e r y t h r o -c y t e s . J . P h y 8 i o l . 1 1 6 , 1 1 2 - 1 2 8 .D A N o w s x i , T . S . ( 1 9 4 1 ) . The t r a n s f e r o f p o t a s s i u m a c r o s s t h e h u m a n b l o o d c e l l m e m b r a n e .J . b i o l . C h e m . 1 3 9 , 6 9 3 - 7 0 5 .

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ATP-ASE ACTIVITY AND ION MOVEMENTS 2 9 3DUNHAM, E . T . ( 1 9 5 7 a ) . P a r a l l e l d e c a y o f ATP a n d a c t i v e c a t i o n f l u x e s i n s t a r v e d h u m a ne r y t h r o c y t e s . F e d . P r o c . 1 6 , 3 3 .DUNHAM, E . T . ( 1 9 5 7 b ) . L i n k a g e o f a c t i v e c a t i o n t r a n s p o r t t o ATP u t i l i z a t i o n . P h y 8 i o l o g i s t ,1 , 2 3 .DUNHAM, E . T . & GLYNN, I . M. ( 1 9 6 0 ) . A d e n o s i n e t r i p h o s p h a t a s e a c t i v i t y and i o n move-m e n t s . J . P h y 8 i o l . 1 5 2 , 6 1 - 6 2 P .EDWARDS, C . & H A R R I S , E . J . ( 1 9 5 7 ) . F a c t o r s i n f l u e n c i n g t h e s o d i u m movement i n f r o gm u s c l e , w i t h a d i s c u s s i o n o f t h e mechanism o f s o d i u m movement. J . P h y s i o l . 1 3 5 , 5 6 7 - 5 8 0 .F I S K E , C . H . & SUBBAROW, Y . ( 1 9 2 5 ) . Th e c o l o r i m e t r i c d e t e r m i n a t i o n o f p h o s p h o r u s .J . b i o l . C h e m . 6 6 , 3 7 5 - 4 0 0 .GARDOS, G . ( 1 9 5 4 ) . Akkumulation d e r K a l i u m i o n e n d u r c h m e n s c h l i c h e B l u t k o r p e r c h e n .A c t a p h y s i o l . H u n g . 6 , 1 9 1 - 1 9 9 .GLYNN, I . M . ( 1 9 5 6 ) . So di um a nd p o t a s s i u m movements i n h u m a n r e d c e l l s . J . P h y s i o l .1 3 4 , 2 7 8 - 3 1 0 .GLYNN, I . M. ( 1 9 5 7 a ) . Th e i o n i c p e r m e a b i l i t y o f t h e r e d c e l l membrane. P r o g r . B i o p h y s . 8 ,2 4 1 - 3 0 7 .GLYNN, I . M. ( 1 9 5 7 b ) . Th e a c t i o n o f c a r d i a c g l y c o s i d e s on sodium and p o t a s s i u m movementsi n h u m a n r e d c e l l s . J . P h y s i o l . 1 3 6 , 1 4 8 - 1 7 3 .H A R R I S , E . J . & M A I Z E L S , M . ( 1 9 5 1 ) . Th e p e r m e a b i l i t y o f h u m a n r e d c e l l s t o s o d i u m .J . P h y s i o l . 1 1 3 , 5 0 6 - 5 2 4 .H A R R I S , J . E . ( 1 9 4 1 ) . Th e i n f l u e n c e o f t h e m e t a b o l i s m o f h u m a n e r y t h r o c y t e s o n t h e i rp o t a s s i u m c o n t e n t . J . b i o l . C h e m . 1 4 1 , 5 7 9 - 5 9 5 .HERBERT, E . ( 1 9 5 6 ) . A s t u d y o f t h e l i b e r a t i o n o f o r t h o p h o s p h a t e f r o m ATP b y s t o m a t a o fh u m a n e r y t h r o c y t e s . J . c e l l . c o m p . P h y s i o l . 4 7 , 1 1 - 3 6 .HODGKIN, A . L . & KEYNES, R . D . ( 1 9 5 5 ) . A c t i v e t r a n s p o r t o f c a t i o n s i n g i a n t a x o n s f r o mS e p i a and L o l i g o . J . P h y s i o l . 1 2 8 , 2 8 - 6 0 .HORVATH, I . , K I R A L Y , C . & S Z E R B , J . ( 1 9 4 9 ) . A c t i o n o f c a r d i a c g l y c o s i d e s on t h e p o l y -

m e r i z a t i o n o f a c t i n . N a t u r e , L o n d . , 1 6 4 , 7 9 2 .KAHN, J . B . , J R . , & A C H E S O N , G . H . ( 1 9 5 5 ) . E f f e c t s o f c a r d i a c g l y c o s i d e s and o t h e r l a c t o n e sand o f c e r t a i n o t h e r compounds on c a t i o n t r a n s f e r i n h u m a n e r y t h r o c y t e s . J . P h a r m a c o l .1 1 5 , 3 0 5 - 3 1 8 .KEYNES, R . D . ( 1 9 5 4 ) . Th e i o n i c f l u x e s i n f r o g m u s c l e . P r o c . R o y . S o c . B , 1 4 2 , 3 5 9 - 3 8 2 .L I B E T , B . ( 1 9 4 8 ) . A d e n o s i n e t r i p h o s p h a t a s e ( A T P - a s e ) i n n e r v e . F e d . P r o c . 7 , 7 2 .M A I Z E L S , M . ( 1 9 4 9 ) . C a t i o n c o n t r o l i n h u m a n e r y t h r o c y t e s . J . P h y s i o l . 1 0 8 , 2 4 7 - 2 6 3 .M A I Z E L S , M . ( 1 9 5 4 ) . C a t i o n t r a n s p o r t i n c h i c k e n e r y t h r o c y t e s . J . P h y s i o l . 1 2 5 , 2 6 3 - 2 7 7 .M A T c H E T T , P . A . & J O H N S O N , J . A . ( 1 9 5 4 ) . I n h i b i t i o n o f so di um a nd p o t a s s i u m t r a n s p o r ti n f r o g s a r t o r i i i n t h e p r e s e n c e o f o u a b a i n e . F e d . P r o c . 1 3 , 3 8 4 .M O R T O N , R . K . ( 1 9 5 5 ) . M e t h o d s o f e x t r a c t i o n o f e n z y m e s f r o m a n i m a l t i s s u e s . I I . B u t y l

a l c o h o l m e t h o d . I n M e t h o d s i n E n z y m o l o g y , v o l . 1 , e d . C O L O W I C K , S . P . & K A P L A N , N . 0 .Ne w Y o r k : A c a d e m i c P r e s s .PONDER, E . ( 1 9 4 8 ) . H e m o l y s i s a n d R e l a t e d P h e n o m e n a , p . 1 2 0 . Ne w Y o r k : G r u n e andS t r a t t o n .P O S T , R . ( 1 9 5 9 ) . R e l a t i o n s h i p o f a n ATP-ase i n h u m a n e r y t h r o c y t e membranes t o t h ea c t i v e t r a n s p o r t o f s o d i u m a n d p o t a s s i u m . F e d . P r o c . 1 8 , 1 2 1 .S c H A T Z M A N N , H. J . ( 1 9 5 3 ) . H e r z g l y k o s i d e a l s H e m m s t o f f e f u r d e n a k t i v e n Kalium u ndN a t r i u m t r a n s p o r t d u r c h d i e E r y t h r o c y t e u m e m b r a n . H e l v . p h y s i o l . a c t a , 1 1 , 3 4 6 - 3 5 4 .SHAW, T . I . ( 1 9 5 4 ) . Sodium and p o t a s s i u m m o v e m e n t s i n r e d c e l l s . P h . D . t h e s i s . U n i v e r s i t yo f C a m b r i d g e .S K O U , J . C . ( 1 9 5 7 ) . Th e i n f l u e n c e o f some c a t i o n s on a n a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t a s e f r o mp e r i p h e r a l n e r v e s . B i o c h i m . b i o p h y s . a c t a , 2 3 , 3 9 4 - 4 0 1 .S N m L L i A N , 0 . & G E L O T T E , B . ( 1 9 5 0 ) . A r e a c t i o n between a deaminase and h e a r t a c t i n ,a n d i n h i b i t i o n o f t h e e f f e c t w i t h c a r d i a c g l y c o s i d e s . N a t u r e , L o n d . , 1 6 5 , 6 0 4 .S Z P K E L Y , M . , M k N Y A I , S . & S T R A U B , F . B . ( 1 9 5 2 ) . V t b e r d e n M e c h a n i s m u s d e r o s m o t i s c h e nH a m o l y s e . A c t a p h y 8 i o l . H u n g . 3 , 5 7 1 - 5 8 4 .WHITTAM, R . ( 1 9 5 8 ) . P o t a s s i u m m o v e m e n t s and ATP i n h u m a n r e d c e l l s . J . P h y s i o l . 1 4 0 ,4 7 9 - 4 9 7 .WOLLENBERGER, A . ( 1 9 5 4 ) . N o n - s p e c i f i c i t y o f t h e e f f e c t o f c a r d i a c g l y c o s i d e s on t h ep o l y m e r i z a t i o n o f a c t i n . E x p e r i e n t i a , 1 0 , 3 1 1 - 3 1 2 .

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