jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí...
TRANSCRIPT
![Page 1: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/1.jpg)
Jak využít elektrochemii
ke studiu struktury a interakcí
nukleových kyselin a proteinů.
doc. RNDr. Miroslav Fojta, CSc.
Olomouc, 23. června 2010
![Page 2: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/2.jpg)
Nobelova cena za polarografii
(Jaroslav Heyrovský)
Elektrochemická aktivita DNA
(Emil Paleček)
![Page 3: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/3.jpg)
Elektrochemické metody … polarografie
-I
-E
Xm-nXmn e-
identifikace elektrochemicky aktivní látky
(co to je)
kvantifikace
(jaká je koncentrace)
kapající rtuťová elektroda
Elektrochemické metody …
![Page 4: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/4.jpg)
-I
-E
Xm Xm-n
n e-
•visicí rtuťová
kapková elektroda
•pevné elektrody
Xm Xm-n
n e-
Elektrochemické metody … voltametrie
![Page 5: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/5.jpg)
elektrochemie proteinů
![Page 6: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/6.jpg)
Elektrochemie proteinů
od dvacátých let XX. století (J. Heyrovský,
R. Brdička)
![Page 7: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/7.jpg)
+1 -1 -2
E/V
-I
WY
elektrochemická oxidace
tryptofanu a tyrozinu
signály peptidů
a proteinů
obsahujících
cystein (cystin)
UHLÍKOVÉ ELEKTRODY RTUŤOVÉ ELEKTRODY
redukce vazby S-Hg
redukce vazby
S-S (cystin)
Brdičkova reakce
(v přítomnosti Co)
katalytické
vylučování vodíku
prenatriová vlna
pík H
![Page 8: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/8.jpg)
Katalytické vylučování vodíku
(CHE)
V této oblasti potenciálu
je elektrochemicky
generována katalyticky
aktivní částice (R)
![Page 9: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/9.jpg)
Brdičkova reakce
Brdička, 1933: polarografické vlny v přítomnosti sérových proteinů a solí
kobaltu
![Page 10: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/10.jpg)
Brdičkova reakce a diagnostika rakoviny
-kdysi poměrně
rozšířený diagnostický
test
-dnes renesance tohoto
přístupu
-R. Kizek a spol
(MENDELU)
-rakovina a
metalothioneiny
![Page 11: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/11.jpg)
pík H: (pořád ještě) nový nástroj
studia proteinů
Tomschik et al., 1998
![Page 12: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/12.jpg)
• katalytický proces na rtuťové elektrodě, ne
zcela objasněný mechanismus (dusíkaté
skupiny; cystein není nezbytně nutný, ale výrazně
přispívá)
• vysoká citlivost detekce peptidů a bílkovin
• citlivost k
agregaci bílkovin
denaturaci bílkovin
změnám redox stavu peptidů a bílkovin
(-SH vs. –S-S-)
![Page 13: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/13.jpg)
agregace a-synucleinu
a-synuclein: hlavní součást tzv. Lewyho tělísek
spojených s Parkinsonovou chorobou
podléhá agregaci vedoucí k tvorbě fibrilárních struktur
pochopení mechanismu agregace a nalezení možností jejího
ovlivnění je důležité pro vývoj léčebných postupů
zdá se, že hlavní toxický efekt mají nízkomolekulární agregáty
v počáteční fázi agregace
![Page 14: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/14.jpg)
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
0 50 100 150 200 250
Norm
ali
zed
flu
ore
scen
ce
Time (h)
-30
-20
-10
0
10
20
195 215 235 255
0 h3 weeks
Wavelength (nm)
Pea
k h
eig
ht
Potential (V)
-50
450
950
1450
1950
-1.76 -1.74 -1.72 -1.7 -1.68
0 h 24 h
48 h 72 h
A
pík H: unikátní citlivost k počátečním změnám vedoucím k agregaci
(Masařík a kol., 2004)
pík H
CD
AFM
Co „vidí“ různé metody:
![Page 15: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/15.jpg)
pík HDLS
![Page 16: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/16.jpg)
Elektorchemie DNA
![Page 17: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/17.jpg)
Struktura DNA…
1953: James Watson, Francis Crick,
Rosalind Franklin, Maurice Wilkins:
dvoušroubovice DNA
1962: Nobelova cena (JW, FC, MW)
vysvětlení základních principů uchování,
předávání a exprese dědičné informace
![Page 18: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/18.jpg)
N
NH2
O
R
NNH
N
O
O
R
CH3
N
N
N
NH2
R
N
N
N
N
O
R
NH
NH2
purinové báze
thymin (T)
pyrimidinové báze
cytosin (C) adenin (A) guanin (G)
dvoušroubovice
O
O
P-OO
O
baseCH2
2-deoxyribóza
fosfát
nu
kle
oti
d
párování bazí v
řetězcích DNA
![Page 19: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/19.jpg)
1958 – 1960 Emil Paleček: polarografie DNA
![Page 20: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/20.jpg)
potential/V vs. SCE-2.0 -1.0 +1.0
-
+
curr
ent
GGox Aox
CA
redukce cytosinu + adeninu
oxidace
oxidace
guaninu a adeninu
rtuťové nebo amalgamové elektrody (převážně) uhlíkové elektrody
tvorba
7,8 –dihydroguaninu
N
NH2
O
R
N
N
N
N
NH2
R
N
N
N
N
O
R
NH
NH2
N
N
N
O
R
NH
NH2
N
N
N
NH2
R
N
![Page 21: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/21.jpg)
tensametrické signály DNA na rtuti
-1.5 -1.0 -0.5E/V
p.z.c.
double-
stranded
ds,
distorted
single-
stranded
12
3
vysoká citlivost ke struktuře DNA
![Page 22: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/22.jpg)
Detekce poškození DNA
![Page 23: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/23.jpg)
jednořetězcový zlom dvouřetězcový zlom
přerušení cukrfosfátové páteře DNA
„abazická“ místa
přerušení
N-glykosidické
vazby
kyslíkové radikály
činnost nukleáz
důsledek poškození bazí
spontánní hydrolýza
(depurinace)
důsledek poškození bazí
Nejčastější „produkty“ poškození DNA
![Page 24: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/24.jpg)
N
N
NH
N
O
NH2
R
NH
N
R
O
O
CH3N
R
NH2
O
N
N
N
NH
N
O
NH
R
OH
OH
OH
N
N
NH
N
O
NH2
R
Pt
N
N
NH
N
O
NH2
R
NH3H
3N
NH
N
R
O
O
NH
N
R
O
O
NH
N
R
O
O
CH3CH
3
guanin
N
N
N
N
NH2
R
N
N
NH
N
O
NH2
R
CH3
N+
N
NH
N
O
NH2
R
CH3
N
N
N
N+
NH2
RCH3
adenin
NH
N
R
O
O
OH
OH
CH3
N
N
NH
N
O
NH2
O
R
N
NN
N
R
N
cytosinthymin
Nejčastější „produkty“ poškození DNA
poškození bazí:chemické modifikace
alkylace bazí
oxidativní poškození
deaminace bazí
poškození UV zářením
(sluneční světlo)
reakce s metabolicky
aktivovanými karcinogeny
reakce s protinádorovými
léky
![Page 25: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/25.jpg)
• v podstatě jakékoli poškození DNA lze v
principu detekovat elektrochemicky
![Page 26: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/26.jpg)
DNA s konci a bez koncůnadšroubovicová otevřená kružnicová lineární
zlomy = poškození DNA – tedy možnost „měřit“ poškození DNA
![Page 27: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/27.jpg)
Rtuťová elektroda modifikovaná kovalentně uzavřenou kružnicovou
(nadšroubovicovou, sc) DNA: senzor pro látky indukující zlomy v DNA
scDNA·OH ocDNA
ACV
E/V -0.8-1.6
1
E/V -0.8-1.6
3 1
ACV
![Page 28: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/28.jpg)
similar responses to DNA damage like with the HMDE can be
obtained
• with mercury film electrodes (Kubičárová 2000)
• with amalgam electrodes (Cahová-Kuchaříková, Fadrná, Yosypchuk, Novotný
2004)
AC voltammograms of sc,
linear ds and denatured DNA
at m-AgSAE
changes in the peak 3 height (at m-
AgSAE) due to scDNA exposure to a
chemical nuclease Cu(phen)2
0
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
Cu(phen)2
![Page 29: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/29.jpg)
nebojte se rtuti!
nekouše!
![Page 30: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/30.jpg)
hybridizační sonda
sekvence sondy je navržena
(syntetizována) vzhledem k sekvenci
DNA, která nás zajímá
cílová DNA
je pomocí sondy detekována
GCTTATGCTGGAAT
CGAATACGACCTTA
CGAATACGACCTTA
GCTTATGCTGGAAT
Hybridizace DNA (RNA) je založena na principu tvorby
dvoušroubovice ze dvou komplementárních řetězců
![Page 31: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/31.jpg)
DNA „čipy“ („arrays“):
•aplikace mnoha sond současně
•aplikace různých (různě“barevných“) fluorescenčních značek
![Page 32: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/32.jpg)
Elektrochemický senzor pro hybridizaci DNA:
elektroda se zakotvenou hybridizační sondou na povrchu
•hybridizace s cílovou DNA se provede stejně
jako v případě optických senzorů
•odezvou na hybridizační událost je
elektrochemický (proudový) signál
I
E
samotná sonda
hybrid
![Page 33: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/33.jpg)
Dvoupovrchová strategie:
povrch H
detekční elektroda
•hybridizace se provede na jednom povrchu (H), který pro tento
účel optimalizován; nemusí mít vlastnosti elektrody
•účinné zachycení a separace cílové DNA
•poté je zachycená cílová DNA z povrchu H uvolněna
a elektrochemicky stanovena
![Page 34: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/34.jpg)
detekční elektroda
Dvoupovrchová strategie:
•hybridizace se provede na jednom povrchu (H), který pro tento
účel optimalizován; nemusí mít vlastnosti elektrody
•účinné zachycení a separace cílové DNA
•poté je zachycená cílová DNA z povrchu H uvolněna
a elektrochemicky stanovena
![Page 35: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/35.jpg)
Magnetické částice („kuličky“) nesoucí různé „biorekogniční
elementy“: všestranné využití v biopreparacích a bioanalýze
oligo(dT)n
streptavidin
protilátky
protein G
protein A
chelát kobaltu
biotinyl.
ss ODN
biotinylovaný
ds ODN
DNA-vazebný
protein
CoN
N
NN
protein
s „His-tagem“
specifická
protilátka
antigen
(protein)
specifická
protilátkabuňky
komplementární
NA řetězec
NA řetězec s
úsekem (A)n
![Page 36: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/36.jpg)
smíchání
inkubace
(vazba)
magnetická separace
promývání
magnetické
částice
odstranění
nespecifických
složek vzorku
další složka
molekulárního
„sendviče“
vstup
(původní vzorek+ matrice)
výstup
(separovaný
vzorek k analýze)
• proceduru lze snadno automatizovat
• kompatibilita s mikrofluidikou, „laboratoř na čipu“
![Page 37: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/37.jpg)
magnetická kulička s
hybridizační sondou
povrch H
cílová DNA
nespecifická
DNA
magnet
detekční elektroda
hybridizace
separace
uvolnění
cílové DNA
detekce
![Page 38: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/38.jpg)
značení a sekven(c)ování DNA
![Page 39: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/39.jpg)
chemická modifikace DNA
oxokomplexy osmia
![Page 40: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/40.jpg)
-selektivní značení ss konců
-detekce abazických míst,
nekanonických párů bazí, inzercí..
![Page 41: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/41.jpg)
Inkorporace značených nukleotidů
pomocí enzymů
![Page 42: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/42.jpg)
F. Sanger
2‘,3‘-dideoxynukleotidy:
terminátory syntézy DNA
(není kam napojit další
nukleotid)
značené dideoxy:
navázání značky podle
komplementární báze
napojování nukleotidů
přes 5‘-OH a 3‘-OH
![Page 43: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/43.jpg)
templát
primer
syntetizovaný úsek
Syntéza DNA in vitro („primer extension“)
Deoxynukleotid trifosfáty (dNTP)
DNA polymeráza
![Page 44: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/44.jpg)
templát
primer
ZNAČENÉ dNTP
DNA polymeráza
vložení značek do DNA pomocí DNA polymeráz
![Page 45: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/45.jpg)
F. Sanger
-směs normálních deoxy
a značených dideoxy
-pro každou bázi jiná barva
-různě dlouhé produkty,
dělení elektroforézou
-značka (barva) odpovídá
koncové bázi
![Page 46: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/46.jpg)
templát
primer
Detekce a identifikace mutací a polymorfismů
-důležité pro diagnostiku (určité mutace v určitých pozicích jsou spojeny s
určitým onemocněním)
-zjišťuje se, jaká (jedna) báze je v konkrétní pozici
G
GC
C T A
T A
![Page 47: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/47.jpg)
potential/V vs. SCE
G Gox Aox
CA
-1.5 -1.0 -0.5 0 0.5 1.0 1.5
13
Tox
Cox
G*
Fc conjugates [Os (bpy)3]3+/2+
nitrophenol
AQ
Os,L (farad)
Os,L (cat) carbon electrodes
mercury and amalgam electrodes
Značení DNA elektroaktivními skupinami
Proč, když je DNA sama elektroaktivní?-odlišení řetězců (hybridizace DNA: značení sond)
-zvýraznění inkorporovaných bazí (monitorování syntézy, SNP typing)
![Page 48: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/48.jpg)
Inkorporace do DNA pomocí DNA polymeráz, magnetická
separace a jednoduchá elektrochemická analýza
primer
template
5‘
3‘
DNA polymerase
dNFcTP (+dNTP)
DBstv
biotin
washing
heat or NaOH
measurement
primer
template
5‘
3‘
DNA polymerase
dNFcTP (+dNTP)
DBstv
biotin
washing
heat or NaOH
measurement
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
0
2
4
6
8
10
I [
A]
E [V]
UFc Gox
CATGGGCGGCATGGGAUFcAUFcAUFcAUFcAUFcA
primer
synthesized stretch
0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
0
2
4
6
8
10
I [
A]
E [V]
UFc Gox
CATGGGCGGCATGGGAUFcAUFcAUFcAUFcAUFcA
primer
synthesized stretch
Fc label guanine
dUFcTP+dATP
dUTP+dATP
dUFcTP+dATP, no polymerase
„cizí“ elektrochemicky aktivní
skupina: nový signál
![Page 49: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/49.jpg)
Identifikace jednonukleotidových polymorfismů
pomocí elektrochemie
-0.8 -0.4 0.0 0.4 0.8 1.2
-8
-6
-4
-2
0
2
4
I/A
E/V
…GCCC
dNTP mix:
APhNO2+CPhNH2+UOs+G
…TCCC
…ACCC
…ACCC
…GCCC
…TCCC
Os2+/3+
PhNO2
PhNH2
pomocí jednoduchých levných
elektrod (ne drahých sekvenátorů)
příslib pro levnou
decentralizovanou diagnostiku
![Page 50: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/50.jpg)
Enzymové značky:
biokatalytická amplifikace signálu
![Page 51: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/51.jpg)
substrát
produkt
obvykle se využívají biotinylované sondy a konjugáty (strept)avidinu s vhodným enzymem
tvorba elektroaktivního indikátoru
„biokatalytická“ amplifikace: jedna molekula enzymu přemění mnoho molekul substrátu
substrát substrát
substrát
substrátsubstrát
substrát
substrát
substrátsubstrát
produkt produkt
produktprodukt
produkt
produktprodukt
produkt
produkt
produkt
produkt
![Page 52: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/52.jpg)
electrode
A
BSA
BSABSA
BSABSA
BSABSA
B
BSABSA
BSA
BSA BSA
BSABSA BSA BSA
STV
ALP
STV
STVALP
ALP
OH
O
P
e-
N
biotinylated DNA
tDNA
biotinylated probe
electrode
A
BSA
BSABSA
BSABSA
BSABSA
electrodeelectrode
A
BSA
BSABSA
BSABSA BSABSA
BSABSA BSABSA
B
BSABSA
BSA
BSA BSA
BSABSA
BSA
BSA BSABSA BSA
BSABSA BSA BSA
STV
ALP
STV
STVALP
ALP
OH
O
P
e-
BSABSA BSABSA BSA BSABSA BSA
STV
ALP
STV
ALP
STVSTV
STVSTV
ALPALP
ALPALP
OH
O
P
e-
N
biotinylated DNA
tDNA
biotinylated probe
biotinylated DNA
tDNA
biotinylated probe
PEX-biotinylated DNA
electrode
A
BSA
BSABSA
BSABSA
BSABSA
B
BSABSA
BSA
BSA BSA
BSABSA BSA BSA
STV
ALP
STV
STVALP
ALP
OH
O
P
e-
N
biotinylated DNA
tDNA
biotinylated probe
electrode
A
BSA
BSABSA
BSABSA
BSABSA
electrodeelectrode
A
BSA
BSABSA
BSABSA BSABSA
BSABSA BSABSA
B
BSABSA
BSA
BSA BSA
BSABSA
BSA
BSA BSABSA BSA
BSABSA BSA BSA
STV
ALP
STV
STVALP
ALP
OH
O
P
e-
BSABSA BSABSA BSA BSABSA BSA
STV
ALP
STV
ALP
STVSTV
STVSTV
ALPALP
ALPALP
OH
O
P
e-
N
biotinylated DNA
tDNA
biotinylated probe
biotinylated DNA
tDNA
biotinylated probe
PEX-biotinylated DNA
• pomocí PEX se inkorporuje více
biotinylovaných nukleotidů
• na ně se naváže více molekul enzymu
• vyšší citlivost
hybridizace PEX inkorporace
jednorázové tištěné elektrody
Vícenásobná amplifikace signálu - příklad
![Page 53: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/53.jpg)
green plant
callus culture
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
plan
t-exp
ress
ion
callu
s-ex
pres
sion
plan
t-gen
e
callu
s-ge
ne
non-
com
pl con
trol
no p
robe
RT-PCR(expression)
genomic DNA
PCRcontrols
pla
nt
pla
nt
callu
s
callu
s
non-s
pecific
am
plic
on
no p
robe
I,
A
0
0.6
1.2
1.8
1 2 3 4
B
1 2 3 4
C
frrbcL
A
mRNA
protein
transcription
&splicing
translation
DNA
isolation
PCRgenomic
DNA
PCRRT
cDNA
RNA
isolation
total RNA
total DNAgenomic
DNA
PCR
RT-PCR
green plant
callus culture
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
1.4
1.6
1.8
plan
t-exp
ress
ion
callu
s-ex
pres
sion
plan
t-gen
e
callu
s-ge
ne
non-
com
pl con
trol
no p
robe
RT-PCR(expression)
genomic DNA
PCRcontrols
pla
nt
pla
nt
callu
s
callu
s
non-s
pecific
am
plic
on
no p
robe
I,
A
0
0.6
1.2
1.8
1 2 3 4
B
1 2 3 4
C
frrbcL
1 2 3 4
C
frrbcL
A
mRNA
protein
transcription
&splicing
translation
DNA
isolation
PCRgenomic
DNA
PCRRT
cDNA
RNA
isolation
total RNA
total DNA
mRNA
protein
transcription
&splicing
translation
DNA
isolation
PCRgenomic
DNA
PCRRT
cDNA
RNA
isolation
total RNA
total DNAgenomic
DNA
PCR
RT-PCR
Monitorování genové exprese
PEX
gen rbcL :
exprimován
pouze
v zelených
rostlinných
pletivech
![Page 54: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/54.jpg)
nanoparticle-based detection
systems
![Page 55: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/55.jpg)
x x
x x xx x
dissolving label
in suitable solventstripping
nanoparticle-based detection systems
• amplification: each particle contains many molecules (atoms) of the tracer
![Page 56: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/56.jpg)
![Page 57: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/57.jpg)
Detection in „solid state“: magnetic attraction of the
MB-DNA-nanoparticle assembly to the electrode
electrode
![Page 58: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/58.jpg)
![Page 59: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/59.jpg)
DNA (protilátky) značené uhlíkovými nanotrubičkami
modifikovanými alkalickou fosfatázou
![Page 60: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/60.jpg)
Modifikace povrchů elektrod
• vodivé filmy (+funkční skupiny)
• nanočástice (Au)
• uhlíkové nanotrubky (bývaly populárnější)
• grafenové listy (hit sezóny)
• zvětšení aktivního povrchu, imobilizace sond
• zlepšení přenosu elektronů, elektrokatalytické
vlastnosti
• mnoho autorů, mnoho publikací, některé dobré
![Page 61: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/61.jpg)
Zdrsněné elektrody z grafitu
nebo skelného uhlíku:
-amplifikace signálů volných purinových bazí
-i další purinové metabolity, které reakci s ionty
mědi tak ochotně nedávají
![Page 62: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/62.jpg)
výrazné (alespoň dva
řády) zvýšení citlivosti
pro některé analyty
(kyselina močová,
dopamin, ale nikoli
např. kyselina
askorbová)
není to jen efekt
velikosti povrchu!!!
selektivně ex situ!
vysoká citlivost
bez přídavku mědi
![Page 63: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/63.jpg)
XOXO
XO
alopurinol
oxypurinol
hypoxantin
xantin
kyselina močová
![Page 64: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/64.jpg)
monitorování enzymových přeměn in vitro
analýza moči pacientů
![Page 65: Jak využít elektrochemii ke studiu struktury a interakcí ...nanosystemy.upol.cz/upload/32/fojta_s_23_vi_2011.pdf · podléháagregaci vedoucík tvorběfibrilárníchstruktur pochopenímechanismu](https://reader031.vdocuments.net/reader031/viewer/2022022805/5cae0ebb88c99320458c58ab/html5/thumbnails/65.jpg)
Děkuji za pozornost