jedro - viii poglavlje stanica-cooper

Jezgra

Jezgrina ovojnica i promet između jezgre i citoplazme 223Unutarnja organizacija jezgre 335Jezgrica 339Jezgra za vrijeme mitoze 345KLJUČNI POKUS: identifikacija jezgrinih lokalizacijskih signala 330MOLEKULARNA MEDICINA: bolesti jezgrine lamine 340

Glavna karakteristika koja označava razliku između eukariotskih i prokariotskih stanica je prisustvo jezgre u eukariota. S obzirom da pruža smještaj staničnom genomu, jezgra služi i kao spremište genetske informacije, ali i kao stanični kontrolni centar. Unutar jezgre odvija se replikacija DNA, transkripcija, obrada RNA, a samo se završni stadij ekspresije gena (translacija) događa u citoplazmi.Kako odvaja genom od citoplazme, jezgrina ovojnica omogućuje odvijanje regulacije ekspresije gena mehanizmima koji su jedinstveni za eukariote. Dok se tranlacija prokariotske mRNA odvija za vrijeme dok transkripcija još traje, eukariotska mRNA prolazi različite oblike posttranskripcijske obrade prije nego bude transportirana iz jezgre u citoplazmu. Na taj način prisustvo jezgre omogućuje da se ekspresija gena regulira posttranskripcijskim mehanizmima, kao što je primjerice alternativno prekrajanje. Ograničavajući pristup određenim proteinima do genetskog materijala, jezgrina ovojnica također otvara nove mogućnosti za kontrolu ekspresije gena na nivou transkripcije. Primjerice ekspresija nekih eukariotskih gena kontrolirana je uz pomoć regulacije transporta transkripcijskih faktora iz citoplazme u jezgru – oblik regulacije transkripcije nedostupan prokariotima. Stoga odvajanje genoma od mjesta translacije mRNA igra ključnu ulogu u ekspresiji gena eukariota.

Jezgrina ovojnica i promet između jezgre i citoplazme

Jezgrina ovojnica odvaja sadržaj jezgre od citoplazme i ostvaruje strukturnu potporu jezgre. Dvije membrane ovojnice, djelujući kao barijere koje sprečavaju slobodan prolaz molekula između jezgre i citoplazme, održavaju jezgru u obliku drugačijeg biokemijskog odjeljka stanice. Jedini kanali kroz koje je omogućen prolaz su kompleksi jezgrinih pora, koji omogućuju reguliranu izmjenu molekula između jezgre i citoplazme. Selektivan promet proteina i različitih RNA molekula kroz komplekse jezgrinih pora ne ostvaruje samo karakterističan unutarnji sastav jezgre, nego ima ključnu ulogu u regulaciji ekspresije gena eukariota.

Struktura jezgrine ovojniceJezgrina ovojnica je kompleksne strukture, izgrađena je od dvije jezgrine membrane, priliježuće jezgrine lamine i kompleksa jezgrinih pora (slika 8.1). Jezgra je okružena sustavom dviju koncentričnih membrana, nazvanih unutarnja i vanjska jezgrina membrana. Vanjska jezgrina membrana nastavlja se na endoplazmatski retikul, tako da je prostor između vanjske i unutarnje jezgrine membrane direktno povezan sa lumenom endoplazmatskog retikula. Nadalje, vanjska jezgrina membrana funkcionalno je slična membranama endoplazmatskog retikula (vidi poglavlje 9) pa na svom citoplazmatskom licu nosi pričvršćene ribosome. Nasuprot tome, unutranja jezgrina membrana sadrži proteine specifične za jezgru, kao primjerice proteine koji se vezuju na matriks jezgrine lamine ( opisano dalje u tekstu).

www.perpetuum-lab.com 1

Ključna uloga jezgrinih membrana je u tome da djeluju kao barijera koja odvaja sadržaj jezgre od citoplazme. Poput ostalih staničnih membrana, svaka jezgrina membrana je fosfolipidni dvosloj propusan samo za male nepolarne molekule (vidi sliku 2.50). Ostale molekule nisu u mogućnosti proći kroz dvosloj. Unutranja i vanjska jezgrina membrana spajaju se na mjestima kompleksa jezgrinih pora, jedinih kanala kroz koje male polarne molekule i makromolekule mogu proći kroz jezgrinu ovojnicu (slika 8.2). Kao što će biti rečeno u slijedećem odijeljku, kompleks jezgrine pore je složena struktura odgovorna za selektivan promet proteina i različitih RNA molekula između jezgre i citoplazme.Priliježući uz unutarnju jezgrinu membranu smještena je jezgrina lamina, mreža koja ostvaruje strukturnu potporu jezgre (slika 8.3). Jezgrina lamina izgrađena je od jednog ili više srodnih proteina nazvanih lamini. Većina stanica sisavaca sadrži četiri različita lamina označena kao A, B1, B2 i C. Svi lamini su vlaknasti proteini težine 60-80 kilodaltona (kd) srodni proteinima intermedijarnih filamenata, pa se tako i lamini povezuju jedan s drugim da bi formirali filamente (slika 8.4). Prva faza ovog povezivanja je interakcija dvaju lamina da bi se formirao dimer u kojem su dijelovi α-heliksa dvaju polipeptidnih lanaca omotani jedan oko drugoga tvoreći strukturu nazvanu pletenica (eng. coiled coil). Ovi dimeri lamina udružuju se sada jedan s drugim i tvore filamente koji grade jezgrinu laminu. Povezivanje lamina sa unutarnjom jezgrinom membranom olakšano je zbog posttranslacijskog dodavanja lipida – točnije prenilacijom C-terminalnih cisteinskih ostataka (vidi sliku 7.32). Nadalje, lamini se vezuju na specifične proteine unutarnje membrane jezgre, ostvarujući njihovo povezivanje sa jezgrinom ovojnicom i lokalizirajući i organizirajući ih unuatar jezgre.Matriks od jezgrinih lamina, puno labavija struktura, proteže se i u unutrašnjost jezgre. Ovi lamini služe kao mjesta vezivanja kromatina. Kromatin je unutar jezgre organiziran u obliku velikih petlji DNA, a specifične regije ovih petlji vezane su na matriks od lamina. Normalna organizacija lamina ključna je za replikaciju DNA, a vjerojanto igra ulogu i u regulaciji transkripcije.

Kompleks jezgrine pore

Kompleksi jezgrinih pora su jedini kanali kroz koje male polarne molekule, ioni i makromolekule (proteini i RNA molekule) mogu putovati između jezgre i citoplazme. Kompleks jezgrine pore je izuzetno velika struktura promjera oko 120 nm i prosječne molekularne mase od oko 125 milijuna daltona – oko 30 puta veća od ribosoma. Kompleks jezgrine pore je u kralježnjaka sastavljen od 50 do 100 različitih proteina pora, od kojih je najveći dio prisutan u velikom broju kopija. Zbog kontrole prometa molekula između jezgre i citoplazme, kompleks jezgrine pore igra ključnu ulogu u fiziologiji eukariotskih stanica. RNA molekule sintetizirane u jezgri moraju se efikasno transportirati u citoplazmu gdje će služiti u procesu sinteze proteina. Nasuprot tome, proteini potrebni za različite funkcije jezgre (primjerice transkripcijski faktori) moraju se transportirati sa mjesta njihove sinteze - što je citoplazma, u jezgru. Nadalje, mnogi proteini se neprekidno prebacuju između jezgre i citoplazme.Ovisno o veličini, molekule mogu putovati kroz komplekse jezgrinih pora jednim od dva različita mehanizma (slika 8.5). Male molekule i neki proteini molekularne mase manje od otprilike 20 kd prolaze slobodno kroz jezgrinu ovojnicu u oba smjera: iz citoplazme u jezgru ili iz jezgre u citoplazmu. Ove molekule difundiraju pasivno kroz otvorene vodene kanale, čiji prosječan promjer iznosi 9 nm, a nalazi se unutar kompleksa jezgrine pore. Većina proteina i RNA molekula, naravno ne može proći kroz ove otvorene kanale. Umjesto toga, ove makromolekule prolaze kroz komplekse jezgrinih pora aktivnim procesom u kojem određeni


proteini i RNA molekule bivaju prepoznati i selektivno transportirani u određenom pravcu (iz jezgre u citoplazmu ili iz citoplazme u jezgru).Snimka kompleksa jezgrine pore uz pomoć elektronskog mikroskopa otkriva strukturu strukturu sa oktagonalnom simetrijom organiziranu oko velikog centralnog kanala (slika 8.6), što predstavlja put kojim proteini i RNA molekule prolaze kroz jezgrinu ovojnicu. Detaljna istraživanja strukture, uključujući analizu slike uz pomoć kompjutera, dovela su do razvitka trodimenzionalnog modela kompleksa jezgrine pore (slika 8.7). Ova istraživanja pokazuju da se kompleks jezgrine pore sastoji od 8 prečki složenih oko centralnog kanala. Prečke su povezane sa prstenom na jezgrinoj i citoplazmatskoj površini, a čitava struktura prečki i prstenova učvršćena je za jezgrinu ovojnicu na mjestima gdje se spajaju unutarnja i vanjska jezgrina membrana. Iz jezgrinog i citoplazmatksog prstena protežu se proteinski filamenti, formirajući na taj način strukturu poput koša na strani jezgre. Promjene konformacije centralnog kanala za vrijeme prolaza makromolekula uzrokuju promjenu otvora od 9 nm do čak 40 nm, što je dovoljno za prolaz najvećih čestica kroz jezgrinu ovojnicu.

Selektivni transport proteina u jezgru i iz jezgre

Temelj selektivnog transporta kroz jezgrinu ovojnicu najbolje je proučen i shvaćen za proteine koji ulaze u jezgru iz citoplazme. Ti su proteini odgovorni za sve aspekte strukture i funkcije genoma; tu su uključeni histoni, DNA polimeraze, RNA polimeraze, transkripcijski faktori, faktori prekrajanja, i mnogi drugi. Ovi su proteini usmjereni u jezgru uz pomoć specifične sekvence aminokiselina nazvane jezgrin lakalizacijski signal kojeg prepoznaju transportni receptori te usmjeravaju transport proteina kroz kompleks jezgrine pore. Prvi takav jezgrin lokalizacijski signal mapirali su i u detalje opisali Alan Smith i suradnici 1984.g. Ovi su istraživači proučavali T antigen majmunskog virusa 40 (SV40), tj. protein koji pokreće replikaciju viralne DNA u inficiranim stanicama, a kodiran je virusom (vidi poglavlje 5). Kao što je za očekivati za replikacijski protein, on se obično nalazi u u jezgri. Signal odgovoran za njegovu lokalizaciju u jezgri prvi put je identificiran pronalaskom mutacije jednog jedinog lizina u proteinu, a ta je mutacija spriječila njegov transport u jezgru i rezultirala nakupljanjem T antigena u citoplazmi. Nastavak istraživanja otkrio je da je jezgrin lokalizacijski signal T antigena sekvenca od sedam aminokiselina Pro-Lys-Lys-Lys-Arg-Val. Ne samo da je taj slijed neophodan za transport T antigena u jezgru, nego je dodatak istog na bilo koji normalni citoplazmatski protein uzrokovao akumulaciju tog proteina u jezgri.Od tada su identificirani jezgrini laklizacijski signali i na mnogim drugim proteinima. Neki od tih sljedova i, kao onaj na T antigenu su kratki odsječci bogati bazičnim aminokiselinama (lizin i arginin). Često su, naravno, aminokisleine koje čine jezgrin lokalizacijski signal smještene jedna do druge, ali često i nisu. Primjerice jezgrin lokalizacijski signal nukleoplazmina (protein uključen u uspostavu kromatina) sastoji se od dva dijela: para Lys-Arg iza kojeg slijede četiri lizina smještena deset aminokiselina nizvodno (slika 8.8). Obe su, i par Lys-Arg i slijed Lys-Lys-Lys-Lys potrebni za usmjeravanje proteina u jezgru, no onih deset aminokiselina između ovih sekvenci može biti mutirano bez utjecaja na lokalizaciju proteina u jezgru. S obzirom na građu od dva odvojena elementa ovakav jezgrin lokalizacijski signal nazivamo bipartit. Slični bipartitni signali izgleda funkcioniraju kao lokalizacijski signali za mnoge jezgrine proteine; stoga su izgleda učestaliji od jednostavnog lokalizacijskog signala T antigena. Dok je većina jezgrinih lokalizacijskih signala izgrađena od ovakvih bazičnih aminokiselina, te se često nazivaju bazični ili «klasični» jezgrini laokalizacijski signali, struktura aminokiselina ostalih jezgrinih lokalizacijskih signala znatno varira.Ključnu ulogu u ulasku proteina u jezgru kroz kompleks jezgrine pore imaju dva tipa proteina: receptor za transport u jezgru i mali protein vezan na GTP nazvan Ran, koji je


srodan Ras proteinu. Postoje dva tipa receptora za transport u jezgru (karioferinia): importini, koji transportiraju makromolekule iz citoplazme u jezgru, i eksportini, koji transportiraju makromolekule iz jezgre u citoplazmu (tabela 8.1) Neki importini (Kapβ1) djeluju združeno u heterodimeru sa adapterom karioferinom (Kapα) da bi usmjerili u jezgru proteine koji sadrže bazične jezgrine lokalizacijske signale. Za vrijeme ulaska proteina u jezgru, specifični importin prepoznaje jezgrin lokalizacijski slijed na proteinu kojeg treba prenijeti . Sposobnost da to učini potpomognuta je kroz inetrakciju sa Ran proteinom. Konformacija i aktivnost Ran proteina regulirana je vezivanjem GTP-a i njegovom hidrolizom, kao i kod Ras proteina (vidi sliku 7.36) ili kod različitih faktora translacije uključenih u sintezu proteina (vidi sliku 7.13). Enzimi koji kataliziraju izmjenu GDP-a za GTP na Ran proteinu lokalizirani su na unutarnjoj strani jezgrine ovojnice, dok se enzimi koji kataliziraju hidrolizu GTP-a u GDP nalaze na njezinoj citoplazmatskoj strani. Kao posljedica toga javlja se gradijent Ran/GTP kroz jezgrinu poru, sa većom koncentracijom Ran/GTP unutar jezgre i većom koncentracijom Ran/GDP u citoplazmi. Gradijent Ran/GTP je taj za kojeg se smatra da određuje smjer jezgrinog transporta.Ulazak proteina u jezgru kroz komplekse jezgrinih pora je ciklus sastavljen od pet koraka (slika 8.9). U prvom koraku, kompleks sastavljen od importina i Ran/GDP-a vezuje protein koji sadrži jezgrin lokalizacijski signal. U slijedećem koraku ovaj kompleks receptora i proteina koji se prenosi se vezuje na proteine citoplazmatskih filamenata kompleksa jezgrine pore. Transport se sada nastavlja postupnim vezivanjem na specifične proteine kompleksa jezgrine pore koji se nalaze sve dalje i dalje prema jezgrinoj strani kompleksa pore. Treći korak u prolasku proteina događa se u jezgri gdje se GDP vezan za Ran mijenja u GTP. To dovodi do promjene konformacije importina što uzrokuje odvajanje proteina koji se prenosi i njegovo otpuštanje u unutrašnjost jezgre. U četvrtom koraku, kompleks importin-Ran/GTP vraća se natrag kroz kompleks jezgrine pore. Zadnji korak se odvija u citoplazmi gdje se GTP hidrolizira u GDP da bi se obnovio kompleks Ran/GDP potreban za novi transport.Neki proteini ostaju nakon svog dolaska iz citoplazme u jezgri, ali mnogi drugi se stalno prebacuju između jezgre i citoplazme.. Neki od tih proteina djeluju kao nosači u transportu ostalih molekula kao što su primjerice RNA molekule; ostali koordiniraju funkcije jezgre i citoplazme ( regulirajući primjerice aktivnosti transkripcijskih faktora). Proteini su usmjereni na izlazak iz jezgre specifičnim slijedom aminokiselina nazvanim signal za izlazak iz jezgre. Kao i jezgrine lokalizacijske signale, tako i signale za izlazak iz jezgre prepoznaju receptori unutar jezgre, eksportini, koji usmjeravaju transport proteina kroz kompleks jezgrine pore u citoplazmu. Mnogi su eksportini članovi karioferinske obitelji proteina (vidi tabelu 8.1). Poput importina, eksportini se vezuju na Ran koji je potreban kako za izlazak proteina tako i za njegov ulazak u jezgru (slika 8.10). Međutim, kompleks Ran/GTP potiče formiranje stabilnih kompleksa između eksportina i proteina koje prenose, dok razdvaja komplekse importina i proteina koje oni prenose. Efekt vezivanja Ran/GTP kompleksa na eksportine diktira kretanje proteina koji nose signal za izlazak iz jezgre iz smjera jezgre prema citoplazmi. Stoga, eksportini formiraju stabilne komplekse sa proteinima koje prenose i Ran/GTP-om unutar jezgre. Nakon transporta prema citoplazmatskom licu jezgrine ovojnice, hidroliza GTP-a dovodi do odvajanja prenošenog proteina koji se otpušta u citoplazmu.

KLJUČNI POKUS


Identifikacija jezgrinih lokalizacijskih signala

Kratki slijed aminokiselina koji određuje nuklearnu lokalizaciju Daniel Kalderon, Bruce L. Roberts, William D. Richardson i Alan E. SmithNational Institute for Medical research, Mill Hill, LondonCell, Volume 39, 1984, pages 499-509

KontekstOdržavanje jezgre kao drugačijeg biokemijskog odjeljka stanice zahtjeva mehanizam kojim se ostvaruju razlike između proteina jezgre i citoplazme. Istraživanja provedena 1970-tih godina utvrdila su da male molekule brzo difundiraju kroz jezgrinu ovojnicu, ali većina proteina nema takove sposobnosti. Stoga se činilo da jezgrini proteini moraju biti specifično prepoznati i selektivno transportirani od mjesta njihove sinteze tj. sa ribosoma u citoplazmi do jezgre.Raniji eksperimenti Gunthera Blobela i suradnika utvrdili su da su proteini usmjereni na endoplazmatski retikul uz pomoć signalnog slijeda izgrađene od kratkih odsječaka aminokiselina (vidi poglavlje 9). U članku iz 1984.g. Alan Smith i suradnici proširili su ovakav pristup na usmjeravanje jezgrinih proteina prema jezgri i identificirali kratke sljedove aminokiselina koji služe kao jezgrin lokalizacijski signal.

EksperimentiKao model za proučavanje jezgrinog lokalizacijskog signala u životnjskoj stanici poslužio je T antigen virusnog proteina SV40. T antigen je protein težine 94 kd koji je potreban za replikaciju DNA virusa i običnose nalazi u jezgri stanica inficiranih sa SV40. Ranija istraživanja u laboratoriju Alana Smitha kao i u laboratoriju Janet Butel (Lanford i Butel, 1984, Cell 37: 801-813) pokazala su da mutacija Lys-128 u treonin ili asparagin spriječava normalnu akumulaciju T antigena u jezgrama stanica glodavaca i majmuna. Umjesto da se transportiraju u jezgru, ovi mutirani T antigeni ostaju u citoplazmi, što govori da je lizin 128 dio jezgrinog lokalizacijskog signala. Kalderon i suradnici testirali su ovu hipotezu upotrijebivši dva različita ekpserimentalna pristupa.Prvo, odredili su posljedice različitih delecija na unutarstaničnu lokalizaciju T antigena. Mutirani T antigeni sa delecijom koja odstranjuje aminokiseline između broja 1 i 126 ili između broja 136 i C terminalnog kraja lanca normalno se nakupljaju u jezgri. Nasuprot tome, mutirani protein sa delecijom aminokiselina između broja 127 i 132 zadržavao se u citoplazmi.Da bi utvrdili da li je upravo taj slijed aminokiselinska sposoban usmjeriti proteine u jezgru, istraživači su konstruirali kimere u kojima je slijed aminokiselina T antigena fuzioniran sa proteinima koji su normalno citoplazmatski. Ovi su eksperimenti utvrdili da je dodavanje slijeda aminokiselina T antigena od broja 126 do 132 na β-galaktozidazu ili piruvat-kinazu dovoljan da ove inače citoplazmatske proteine usmjeri u jezgru (vidi sliku). Ova kratka aminokiselinska sekvenca T antigena SV40 virusa funkcionira kao jezgrin lokalizacijski signal, koji je kako neophodan tako i dovoljan da usmjeri proteine na ulazak u jezgru.

Značenje Kalderon i suradnici u svom su članku iz 1984 pretpostavili da jezgrin lokalizacijski signal T antigena virusa SV40 «predstavlja prototip sličnih sekvenci ostalih jezgrinih proteina». Usmjeravajući proteine na ulazak u jezgru, ovi signali su ključ uspostave biokemijskog integriteta jezgre i održavanja osnovne podijele eukariotske stanice na jezgrin i citoplazmatski odijeljak. Danas se zna da jezgrine lokalizacijske signale prepoznaju citoplazmatski receptori koji transportiraju svoje supstrate-proteine kroz komplekse jezgrinih pora. Identifikacija


jezginih lokalizacijskih signala predstavlja ključni napredak u razumijevanju ulaska proteina u jezgru.

Slika

U stanice je mikroinjekcijom ubačena plazmidna DNA koja kodira kimerični protein u kojem su aminokiseline SV40 fuzionirane sa piruvat-kinazom. Stanična lokalizacija fuzioniranih proteina određena je imunofluorescentnom mikroskopijom. (A) Fuzionirani protein sadrži funkcionalni SV40 jezgrin lokalizacijski signal (aminokiseline od 126-132). (B) Jezgrin lokalizacijski signal inaktiviran delecijom aminokiselina 131 i 132.

Regulacija ulaska proteina u jezgru

Zanimljivi aspekt promatranja transporta proteina u jezgru je taj da je to zapravo novi (dodatni) nivo na kojem se aktivnost jezgrinih proteina može kontrolirati. Transkripcijski faktori su primjerice funkcionalni samo kada se nalaze u jezgri, tako regulacija njihovog ulaska i izlaska iz jezgre predstavlja novi način kontrole ekspresije gena. Kao što će biti navedeno u poglavlju 13, regulirani ulazak transkripcijskih faktora i protein-kinaza u jezgru igra ključnu ulogu u kontroli ponašanja stanice kao njezinog odgovora na promjene okoline, jer je tim načinom ostvaren mehanizam kojim signali primljeni na površini stanice mogu biti prenešeni u jezgru.U jednom od načina regulacije, transkripcijski faktori (ili neki drugi proteini) udružuju se sa citoplazmatskim proteinima koji maskiraju njihove jezgrine lokalizacijske signale; kako njihovi signali nisu više prepoznatljivi, oni ostaju u citoplazmi. Primjer takovog načina regulacije je transkripcijski faktor NF-κB koji aktivira transkripciju lakih lanaca κ-imunoglobulina u B limfocitima (slika 8.11). U nestimuliranim stanicama, NF-κB postoji kao inaktivan kompleks sa inhibitornim proteinom (IκB) u citoplazmi. Vezivanjem na IκB maskira se jezgrin lokalizacijski signal transkripcijskog faktora NF-κB i sprječava njegov transport u jezgru. U stimuliranim stanicama, IκB je fosforiliran i razgrađen proteolizom posredovanom ubikvitinom, što nadalje dozvoljava da NF-κB uđe u jezgru i aktivira transkripciju svojih ciljnih gena.Ulazak ostalih transkripcijskih faktora u jezgru reguliran je direktno njihovom fosforilacijom, a ne udruživanjem sa inhibitornim proteinima. Primjerice transkripcijski faktor kvasca SW15 ulazi u jezgru samo u određenoj fazi staničnog ciklusa (vidi sliku 8.11). Inače SW15 ostaje u citoplazmi zbog fosforiliranosti serinskih ostataka koji se nalaze tik do njegovog jezgrinog lokalizacijskog signala, te sprječavaju njegov ulazak u jezgru. Regulirana defosforilacija ovih mjesta aktivira SW15 u točno određenoj fazi staničnog ciklusa dozvoljavajući njegov transport u jezgru.

Transport RNA molekula

Dok se mnogi proteini selektivno transportiraju iz citoplazme u jezgru, većina RNA molekula izlazi iz jezgre u citoplazmu. Kako se proteini sintetiziraju u citoplazmi, izlazak mRNA, rRNA i tRNA predstavlja ključni korak u ekspresiji gena eukariotskih stanica. Isto kao i ulazak proteina, tako je i izlazak RNA molekula kroz komplekse jezgrinih pora aktivan proces koji zahtjeva energiju i protein koji veže GTP, Ran.


RNA molekule transportiraju se kroz jezgrinu ovojnicu u obliku ribonukleoproteinskih kompleksa (RNP-a) (slika 8.12). Neki proteini u kompleksu sadrže jezgrine izlazne signale koje prepoznaju transportni receptori za jezgru (vidi sliku 8.10). Pre-mRNA kao i mRNA vezane su sa najmanje 20 proteina (formirajući kompleks pre-mRNA-protein) za vrijeme obrade u jezgri i i transporta u citoplazmu (vidi poglavlje 6). Najmanje dva proteina mRNP sadrže jezgrine izlazne signale i smatra se da funkcioniraju kao nosači mRNA za vrijeme njezinog transporta u citoplazmu. Ribosomske RNA se prvo povezuju ribosomskim proteinima, a onda i sa s specifičnim proteinima za obradu RNA u jezgrici, i tako nastale 60S i 40S ribosomske podjedinice se transportiraju u citoplazmu (vidi sliku 8.28). Njihov izlazak iz jezgre potpomognut je jezgrinim izlaznim signalima prisutnim na proteinima kompleksa ribosomske podjedinice. Specifični proteini koji pomažu izlazak tRNA iz jezgre još nisu identificirani.Za razliku od mRNA, tRNA i rRNA čija se funkcija ostvaruje u citoplazmi, mnoge male RNA molekule (snRNA i snoRNA) funkcioniraju unutar jezgre kao komponentne mašinerije za obradu RNA. Možda iznenađujuće, ali snRNA molekule se u početku transportiraju iz jezgre u citoplazmu, da bi se tamo vezale sa proteinima i formirale funkcionalne snRNP-e te se nakon toga vratile u jezgru (slika 8.13). Proteini transportni receptorikoji se vezuju na 5' kapu snRNA molekula su izgleda uključeni u izlazak snRNA molekula u citoplazmu. Nasuprot tome, sljedovi prisutni na proteinima snRNP-a su ti koji su odgovorni za transport snRNP-a iz citoplazme u jezgru.

Unutarnja organizacija jezgre

Jezgra je puno više nego mjesto gdje se nalaze kromatin i RNA molekule, a jezgrini proteini slobodno putuju kroz vodenu otopinu. Umjesto toga, jezgra izgleda ima unutarnju strukturu koja organizira genetički materijal i određuje prostorni smještaj pojedinih funkcija unutar jezgre . Većina od navedenog, ako ne i sve, bazira se na visoko organiziranoj strukturi kromatina i njegovoj lokalizaciji unutar jezgre.

Kromosomi i struktura kromatina na višem nivou

Kromatin postaje visoko kondenziran za vrijeme mitoze da bi formirao kompaktne metafazne kromosome koji se raspoređuju među jezgrama stanica kćeri (vidi sliku 4.15). Za vrijeme interfaze, jedan dio kromatina (heterokromatin) ostaje visoko kondenziran i transkripcijski inaktivan; ostatak kromatina (eukromatin) se dekondenzira i raspoređuje po jezgri (slika 8.14), Stanice sadrže dva tipa heterokromatina. Konstitutivni heterokromatin sadrži sekvence DNA koje se nikad ne prepisuju, kao što su primjerice satelitne sekvence prisutne u centormerama. Fakultativni heterokromatin sadrži sekvence koje se ne prepisuju u proučavanoj stanici, ali se prepisuju u drugim tipovima stanica. Zaključno možemo reći da količina fakultativnog kromatina varira ovisno o transkripcijskoj aktivnosti stanice.Iako se čini da je interfazni kromatin jednoliko raspoređen po jezgri, kromosomi su zapravo raspoređeni na organiziran način i podijeljeni u diskretne funkcionalne domene koje imaju važnu ulogu u ekspresiji gena. Nasumična raspodjela kromatina unutar interfazne jezgre prvi puta je predložena 1885.g. od strane C. Rabla koji je predpostavio da svaki kromosom zauzima određeno područje, na način da su centromere i telomere prihvaćene za suprotne strane jezgrine ovojnice (slika 8.15). Osnovni model organizacije kromosoma potvrđen je više od sto godina nakon toga (1984) zahvaljujući detaljnom proučavanju politenih (gorostasnih) kromosoma žlijezda slinovnica Drosophile. Umjesto da se nasumce omataju jedan oko


drugog, svaki kromosom zauzima maleno područje jezgre (slika 8.16), a čvrsto su vezani za jezgrinu ovojnicu na više mjesta.Pojedini kromosomi zauzimaju određena mjesta unutar jezgre i kod jezgara stanica sisavaca (slika 8.17). Geni koji se aktivno prepisuju nalaze se na periferiji ovih područja, uz kanale koji odvajaju pojedine kromosome. Novoprepisane RNA molekule se izgleda otpuštaju u te kanale između kromosoma, gdje se događa i sama njihova obrada. Većina heterokromatina lokalizirana je na periferiji jezgre, jer su proteini vezani na heterokromatin vezani i na matriks jezgrine lamine. Kako različiti tipovi stanica eksprimiraju različite gene, njihov je heterokromatin različit i različite regije kromosoma se vezuju sa jezgrinom laminom u različitim tipovima stanica i tkiva. Neke stanice imaju centromere i telomere u nakupinama na suprotnim polovima, dok neke imaju kromosome raspoređene radijalno. Kako raspored i smještaj kromosoma unutar jezgre nije nasumičan, tako se uvelike razlikuje u različtim tkivima i različitm organizmima.Poput DNA u metafaznim kromosomima (vidi sliku 4.16), tako je i kromatin u interfaznoj jezgri organiziran u petlje koje sadrže otprilike 50-100 kb DNA. Dobar primjer takove organizacije u obliku petlji su aktivni kromosomi oocita vodozemaca koji se učestalo prepisuju. U njima se aktivni dijelovi DNA (gdje se vrši transkripcija) vrlo lijepo vide kao izvučene petlje dekondenziranog kromatina (slika 8.18). Ove kromatinske domene izgleda predstavljaju male funkcionalne jedinice koje neovisno jedna o drugoj reguliraju ekspresiju gena (vidi poglavlje 6).

Funkcionalne domene unutar jezgre

Unutarnja organizacija jezgre još je dublje razjašnjena nakon lokalizacije ostalih procesa u jezgri koji su ograničeni na određena područja jezgre. Veliki broj komponenti jezgre lokaliziran je na zasebna subnuklearne strukture i domene. Priroda i funkcija ovih substruktura jezgre još nije u potpunosti jasna, no razumijevanje organizacije funkcionalnih domena jezgre je još uvijek potpuno neistraženo područje stanične biologije. Jezgre stanica sisavaca imaju izgleda posebno grupirana mjesta replikacije DNA unutar kojih se događa replikacija više DNA molekula. Ta zasebna mjesta replikacije DNA definirana su eksperimentima u kojima su novosintetizirane DNA vizualizirane unutar jezgre (slika 8.19). To je postignuto označavanjem stanica bromodeoksiuridinom, analogom timidina koji se ugrađuje u DNA, a zatim se detektira bojenjem sa fluorescentnim antitijelima. U takovim eksperimentima, novoreplicirana DNA detektirana je u otprilike 200 zasebnih nakupina raspoređenih unutar jezgre. Kako je u diploidnoj stanici sisavaca aktivno otprilike 4000 ishodišta replikacije u bilo koje vrijeme, svaka od tih nakupina mora sadržavati otprilike 40 replikacijskih rašlji. Izgleda dakle da se replikacija DNA odvija u velikim strukturama koje sadrže veliki broj replikacijskih kompleksa organiziranih u zasebne funkcionalne domene, a koje su nazvane replikacijske tvornice.Geni koji se aktivno prepisuju raspoređeni su izgleda po jezgri, ali su komponente mašinerije prekrajanja koncentrirane u zasebnim subnuklearnim strukturnim domenama. Lokalizacija kompnenti prekrajanja u zasebne domene unutar jezgre dokazana je imunofluorescentnim bojenjem antitijelima na snRNP-ove i faktore prekrajanja (slika 8.20). Ove su komponente, umjesto raspršene jednoliko po jezgri, koncentrirane u 20-50 zasebnih struktura nazvanih jezgrine pjege. Misli se da su pjege zapravo mjesta pohrane komponenti prekrajanja, koje se zatim usmjeravaju iz pjega na mjesta transkripcije gdje se se događa obrada pre-mRNA.Osim pjega, jezgre sadrže nekoliko tipova morfološki različitih struktura ili domena. Tri glavna tipa takovih jezgrinih domena su jezgrice, Cajalova ili namotana tjelešca (slika 8.21) i PML tjelešca. Cajalova ili namotana tjelešca su bogata malim RNP-ima i vjeruje se da predstavljaju mjesta sastavljanja RNP-ova. Funkcija PML tjelešaca je nepoznata; ne posjeduju


RNP-ove, nisu mjesta replikacije ili transkripcije. Stoga, iako spomenuta jezgrina tjelešca pokazuju prisustvo u obliku substrukturalnih domena jezgre, njihova se funkcija mora razjasniti.

Jezgrica (nukleolus)

Najistaknutija substruktura jezgre je nukleolus ili jezgrica (vidi sliku 8.1), koja predstavlja mjesto transkripcije ribosomske RNA i njezine obrade, kao i mjesto sastavljanja ribosoma. Kao što je spomenuto u prethodnom poglavlju, stanice u određeno vrijeme trebaju veliki broj ribosoma da bi se mogla zadovoljiti potreba za i sintezom proteina. Aktivna stanica sisavaca koja raste sadrži primjerice 5-10 milijuna ribosoma koji se moraju sintetizirati svaki puta kada se stanica dijeli. Jezgrica je tvornica ribosoma, izgrađena na način da zadovolji reguliranu i efikasnu proizvodnju rRNA i sastavljanje ribosomskih podjedinica. Nedavna otkrića govore da jezgrice imaju i općenitiju ulogu u modifikaciji RNA, te da više tipova RNA molekula ulazi i izlazi iz jezgrice na specifičnim stadijima njihove obrade.

Geni za ribosomsku RNA i organizacija jezgrice

Jezgricu koja nije okružena membranom povezujemo sa kromosomskim regijama koje sadrže gene za 5.8S, 18S i 28S ribosomske RNA. Ribosomi viših eukariota sadrže četiri tipa rRNA označenih kao 5S, 5.8S, 18S i 28S rRNA (vidi sliku 7.4). 5.8S, 18S i 28S rRNA prepisuju se kao jedna molekula unutar jezgrice uz pomoć RNA polimeraze I, što daje 45S prekursor ribosomske RNA ( slika 8.22). 45S ribosomska pre-RNA obrađuje se do 18S rRNA koju nalazimo u maloj ribosomskoj podjedinici (40S) te do 5.8S i 28S ribosomskih RNA, dijelova velike ribosomske podjedinice (60S). Transkripcija 5S rRNA, koju također nalazimo u velikoj ribosomskoj podjedinici događa se van jezgrice, a katalizira ju RNA polimeraza III.Da bi spremno dočekale transkripciju velikog broja rRNA molekula, sve stanice sadrže veliki broj kopija gena za ribosomske RNA. Ljudski genom sadrži primjerice oko 200 kopija gena koji kodiraju za 5.8S, 18S i 28S rRNA i otprilike 2000 kopija gena za 5S rRNA. Geni za 5.8S, 18S i 28S grupirani su u područjima uzastopnih ponavljanja na pet različitih ljudskih kromosoma (kromosomi 13,14,15,21 i 22); geni za 5S ribosomsku RNA prisutni su u jednom području uzastopnog ponavljanja na kromosomu broj 1.Važnost proizvodnje ribosoma naročito je uočljiva u oocitama, u kojima su rRNA geni amplificirani da bi omogućili sintezu velikog broja ribosoma potrebnih za rani embrionalni razvitak. U oocitama Xenopusa geni za ribosomsku RNA amplificirani su otprilike 2000 puta što daje oko milijun kopija po stanici. Ti su amplificirani geni raspoređeni u tisućama jezgrica (slika 8.23), što rezultira brojem od oko 1012 ribosoma po oociti.Morfološki, jezgrice se sastoje od tri različite regije: fibrilarni centar, gusta fibrilarna komponenta i granularna kompnenta (slika 8.24). Misli se da ove različite regije predstavljaju mjesta napredovanja procesa transkripcije rRNA, njezine obrade i sastavljanja ribosoma. Modifikacija ostalih malih RNA molekula kao što je recimo čestica prepoznavanja signala (engl. signal recognition particle) (vidi poglavlje 9) događa se negdje drugdje u jezgrici.Nakon svake diobe stanice, jezgrice nastaju na dijelovima kromosoma koji sadrže gene za 5.8S, 18S i 28S rRNA, pa se te regije nazivaju nukleolarnim organizacijskim regijama. Formiranje jezgrica zahtijeva transkripciju 45S pre-rRNA, a to izgleda dovodi do fuzije malih prenukleolarnih tjelešaca koja sadrže faktore potrebne za obradu i ostale komponente jezgrice. Veličina jezgrice ovisi o metaboličkoj aktivnosti stanice, pa velike jezgrice nalazimo u


stanicama aktivno uključenim u sintezu proteina. Ova je razlika u veličini prvenstveno posljedica razlike u veličine granularne kompnente što odražava razinu formiranja ribosoma.MOLEKULARNA MEDICINA

Bolesti jezgrine lamine

BolestiEmery i Dreifuss opisali su 1966 novu mišićnu distrofiju vezanu na X kromosom. U ranoj fazi bolesti laktovi, vrat i pete pogođenih osoba postaju ukočeni, a često je prisutan i blok provodljivosti srca. Ovi se simptomi primjećuju u dobi od 10 godina, a uključuju hodanje na prstima zbog ukočenih ahilovih tetiva i teškoće u savijanju laktova. Srčani problemi javljaju se oko 20-te godine života te mogu zahtijevati ugradnju pacemakera. Dolazi do postepenog trošenja i slabosi u ramenima te mišićima gornjih ekstremiteta i mišićima nogu, ali to se događa sporo i ne predstavlja problem sve do starije dobi.Gotovo 30 godina kasnije istraživači su pokazali da su za X vezanu Emery-Dreifussovu mišićnu distrofiju odgovorne mutacije u transmembranskom proteinu. Protein su nazvali emerin po Alanu Emeryu. Ubrzo nako toga nekoliko je grupa istraživača otkrilo da se emerin nalazi na unutarnjoj jezgrinoj membrani, a da ga bolesnici sa Emery-Dreifuss mišićnom distrofijom nemaju. Ovakvo otkriće nije bilo očekivano; mutacije proteina jezgrine ovojnice eksprimirane u svim stanicama nedvojbeno su uzrokovale bolest specifičnu za jedno tkivo. Premda svim stanicama u tijelu nedostaje protein, patologija je vidljiva jedino na mišićima. Daljnja istraživanja su pokazala da ista distrofija može biti nasljedna, ali ne vezana za X kromosom. Obitelji sa takvom vrstom nasljeđivanja imale su mutacije u LMNA , genu koji kodira jezgrine lamine tipa A i C. Dakle, mutacije dvaju gena, jedan koji kodira protein unutarnje membrane jezgrine ovojnice i jedan koji kodira glavni jezgrin lamin uzrokuju identičnu kliničku sliku mišićne distrofije.Još je više iznendilo da su paralelna istraživanja različitih bolesti, Dunniganova parcijalna lipodistrofija i Charot-Marie-Toothov poremećaj tipa 2B1 dovela do različitih mutacija u LMNA genu. Prije toga liječnici su smatrali ove bolesti potpuno različitim kako po kliničkim manifestacijama tako i po načinu nasljeđivanja. . Novija istraživanja pokazuju da mutacije u jednom drugom proteinu unutarnje jezgrine membrane, receptoru B lamina, predstavljaju bazu za razvitak Pelger-Huet anomalije.

Molekularna i stanična osnovaVećina biologa je mislila da mutacije lamina moraju dovesti do općenitih nepravilnosti arhitekture jezgre i ozbiljnih problema u stanicama koje se brzo dijele. Usprkos tome , u pacijenata se zamijećuju samo minimalne promjene strukture jezgara. Stoga je zbunjujuće kako mutacije jezgrinih lamina ili proteina koji se na njih vezuju mogu uzrokovati različite tkivno specifične bolesti. Odgovor nam još nije poznat, ali postoje dvije glavne hipoteze. Prva hipoteza je hipoteza «ekspresije gena». Ona polazi od toga da je pravilna interakcija između dva proteina lamine, lamina A i C sa jezgrinom ovojnicom ključna za normalnu ekspresiju tkivno specifičnih gena. Transkripcijski inaktivni geni smješteni su uglavnom na periferiji jezgre, dok su oni koji se eksprimiraju koncentrirani u centru, specifično drugačije za svaki tip stanice. Dakle, osnova ovih bolesti bila bi promjena u ekspresiji gena uzrokovana defektnim interakcijama proteina.Prema hipotezi «mehaničkog stresa» se smatra da mutacije u kompleksu jezgrinih lamina i emerina dovodi do oslabljene strukture mreže citoskeleta. . U svim su stanicama naime, lamina, unutarnja jezgrina membrana i kompleksi jezgrinih pora čvrsto povezani. Ova hipoteza, koja je najbolje primjenjiva na mišićnu distrofiju, govori da bi jezgrina lamina


mogla biti indirektno povezana sa mišićnim citoskeletom preko filamenata kompleksa jezgrinih pora.

Prevencija i liječenjeOtkriće da mutacije proteina jezgine lamine uzrokuju naslijedne tkivno specifične bolesti bilo je iznenađujuće i promijenilo je način razmišljanja znanstvenika o jezgrinoj ovojnici. Stoga su potrebna daljnja istraživanja koja bi utvrdila da li je osnova patologije u svakoj od ovih bolesti mehanička regulacija ili ekspresija gena. Naravno, poznata molekularna priroda bolesti uvelike olakšava dijagnozu i povećava vjerojatnost da će se jednog dana naći prava terapija. Prvi korak u rasvjetljavanju problema je nedavno razvijeni mišji model gdje je izbačen gen LMNA. Kako se takvi zameci razvijaju, tako pokazuju simptome Emery-Dreifuss mišićne distrofije. Na kraju, znanstvenici su sada svjesni da nekoliko kongenitalnih bolesti koje se sporo razvijaju mogu biti novi članovi jezgrinih «laminopatija».

LiteraturaNagano, A., Koga,R., Ogawa,M., Kurano,Y., Kawada,J., Okada,R., Hayashi,Y.K., T.Tsukahara i K.Arahata 1996. emerin deficiency at the nucelar membrane in patients with Emery-Dreifuss muscular distrophy. Nat.Genet. 12:254-259.

Worman,H.J. i J.C.Courvalin 2002. The nuclear lamina and inherited disease. Trends Cell Biol. 12:591-598

SlikaJezgrina ovojnica sisavaca i jezgrina lamina. Unutarnja jezgrina membrana sadrži nekoliko integralnih proteina koji su u interakciji sa jezgrinim laminima. Najznačajniji predstavnici su transmembranski protein emerin i receptor B lamina (LBR). Lamina je također u inerakciji sa kromatinom.

Ribosomes – ribosomiNuclear pore – jezgrina poraOuter nuclear membrane – vanjska jezgrina membranaLBR-LBREmerin-emerinInner nuclear membrane – unutarnja jezgrina membranaLamina-laminaChromatin-kromatin

Transkripcija i obrada ribosomske RNA

Svaka nukleolarna organizacijska regija sadrži grupu uzastopno ponovljenih gena za ribosomsku RNA odvojenih jedan od drugog DNA razmaknicom koja se ne prepisuje. Ove gene vrlo aktivno prepisuje RNA polimeraza I, a sama je transkripcija vrlo lijepo vidljiva pod elektronskim mikroskopom (slika 8.25). Na takovim elektronsko mikroskopskim slikama svaka grupa uzastopno ponovljenih gena okružen je gusto pakiranim rastućim lancima RNA koji formiraju strukture poput božićnog drvca. Visoka gustoća rastućih lanaca RNA odražava zapravo molekule RNA polimeraze koje se pojavljuju maksimalnom gustoćom od otprilike jedne polimeraze na stotinu parova baza kalupa DNA.


U viših eukariota primarni prijepis gena za ribosomsku RNA je velika 45S pre-rRNA, koja sadrži 18S, 5.8S i 28S ribosomske RNA kao i područje razmaknice koje se prepisuje (slika 8.26). Vanjske transkribirane razmaknice prisutne su i na 5' i na 3' kraju pre-rRNA, a dvije unutarnje transkribirane razmaknice nalaze se između 18S, 5.8S i 28S sekvenci rRNA. Prvi korak obrade je cijepanje molekule unutar vanjske transkribirane razmaknice u blizini 5' kraja pre-rRNA, a događa se rano, na samom početku transkripcije. Za ovo cijepanje potreban je U3 mali jezgrin RNP (vidi dalje) koji ostaje vezan za 5' kraj pre-rRNA formirajući na taj način karakterističan čvorić vidljiv na slici 8.25. Kada je jedanput transkripcija završena, vanjska transkribirana razmaknica na 3' kraju molekule se odstranjuje. U ljudskim stanicama odmah poslije ovog koraka slijedi cijepanje na 5' kraju regije 5.8S što dovodi do stvaranja odvojenih prekursora 18S i 5.8S + 28S ribosomskih RNA. Dodatnim cijepanjima dobivamo zrele ribosomske RNA. Obrada je vrlo slična i u ostalih vrsta, iako postoje razlike u redu odvijanja pojedinih cijepanja.Uz cijepanje, obrada pre-rRNA uključuje određenu količinu baza koje bivaju modificarane dodatkom metilnih grupa na specifične baze i ostatke riboze, kao i konverziju uridina u pseudouridin (vidi sliku 6.40). U stanicama životinja obrada pre-rRNA uključuje metilaciju otprilike stotine ostataka riboze i desetine baza, kao i formiranje oko stotinu pseudouridina. Većina se ovih modifikacija događa brzo nakon sinteze pre-rRNA, premda se neke događaju i kasnije.Obrada pre-rRNA zahtijeva aktivnost i proteina i RNA molekula prisutnih u jezgri. Uključenost malih jezgrinih RNA (snRNA –small nuclear RNA) u obradu pre-rRNA obrađena je u poglavlju 6. Jezgrice sadrže više od 300 proteina i veliki broj (oko 200) malih RNA jezgrice (snoRNA – small nucelolar RNA) koje sudjeluju u obradi pre-rRNA. Isto kao i male jezgrine RNA tjelešaca za prekrajanje, tako su i snoRNA udružene sa proteinima te formiraju snoRNP. Pojedini snoRNP izgađen je od jedne jedine snoRNA udružene sa osam do deset proteina. snoRNP-ovi se tada slažu na pre-rRNA da bi formirali komplekse za obradu na način analogan onome kod formiranja tjelešaca za prekrajanje na pre-mRNA molekuli.Neke od snoRNA molekula odgovorne su za cijepanje pre-rRNA u 18S, 5.8S i 28S molekule. Na primjer, najčešći snoRNA jezgrice je U3, prisutan u otprilike 200.000 kopija po stanici. Kao što smo već napomenuli, U3 je nužno potreban za početno cijepanje pre-rRNA unutar razmaknica koje se prepisuju na 5' kraju. Slično tome, U8 snoRNA je odgovoran za cijepanje pre-rRNA na 5.8S i 28S, a U22 snoRNA za cijepanje pre-rRNA na 18S rRNA.Većina snoRNA ipak u sintezi rRNA djeluje kao vodič RNA molekula da bi se usmjerile na specifičnu modifikaciju pre-rRNA kao što je metilacija specifičnih riboznih ostataka i formiranje pseudouridina (slika 8.27). Većina snoRNA molekula sadrži kratke sekvence od otprilike 15 nukleotida koji su komplementarni sa 18S i 28S rRNA. Ono što je značajno je da te komplementarne regije uključuju mjesta modifikacije baza u rRNA. Komplementarnim sparivanjem sa specifičnim područjem pre-rRNA, snoRNA navode enzime odgovorne za metilaciju riboze i pseudouridilaciju prema ispravnom mjestu na pre-rRNA molekulama. Uz rRNA, ostale RNA molekule također zahtjevaju modificirane baze, pa se smatra da je lokalizacija snoRNA u jezgrici osnova za njezinu općenitiju ulogu u modifikaciji RNA molekula. Jedan od primjera je signalna prepoznajuća čestica RNA (vidi poglavlje 9).

Sastavljanje ribosoma

Formiranje ribosoma uključuje spajanje prekursora ribosomske RNA sa ribosomskim proteinima i 5S rRNA (slika 8.28). Geni koji kodiraju za ribosomske proteine prepisuju se izvan jezgrice uz pomoć RNA polimeraze II, a prepisane mRNA se prevode do proteina na ribosomima u citoplazmi. Ribosomski proteini se tada transportiraju iz citoplazme u jezgricu,


gdje se udružuju sa ribosomskim RNA molekulama da bi formirale preribosomske čestice. Premda se geni zs 5S rRNA također prepisuju van jezgrice, u ovom slučaju uz pomoć RNA polimeraze III, 5S ribosomske RNA se također spajaju sa preribosomskim česticama unutar jezgrice.Udruživanje ribosomskih proteina sa rRNA započinje za vrijeme dok se pre-rRNA još sintetizira, te se više od polovine ribosomskih proteina veže na pre-rRNA prije njezinog cijepanja. Ostatak ribosomskih proteina i 5SrRNA ugrađuju se u preribosomske čestice dok je cijepanje pre-rRNA u tijeku. Na početku sastavljanja ribosoma, obrada male i velike ribosomske podjedinice koje nastaju se razlikuje. Obrada male podjedinice, koja sadrži samo 18S rRNA jednostavnija je i uključuje samo četiri cijepanja uz pomoć endonukleaza. Završno cijepanje, da bi se dobila zrela 18S rRNA zapravo se događa nakon izlaska 40S podjedinice u citosol. Obrada velike podjedinice koja sadrži 28S, 5.8S i 5S ribosomske RNA uključuje obimna cijepanja nukleazama i potpuno se završava u jezgrici. Kao posljedica toga, većina preribosomskih čestica unutar jezgrice predstavlja prekursore velike (60S) podjedinice. Zadnji koraci sazrijevanja ribosoma događaju se nakon izlaska preribosomskih čestica u citoplazmu, formirajući aktivne 40S i 60S podjedinice eukariotskih ribosoma.

Jezgra za vrijeme mitoze

Jedinstvena značajka jezgre je da se razgrađuje i ponovno uspostavlja tijekom diobe većine stanica. Na početku mitoze kromosomi se kondenziraju, jezgrica nestaje i jezgrina ovojnica se raspada, a sve to dovodi do otpuštanja većine sadržaja jezgre u citoplazmu. Na kraju mitoze proces je obrnut: kromosomi se dekondenziraju, jezrina ovojnica se ponovno formira oko odvojenih setova kromosoma kćeri. Poglavlje 4 predstavlja iscrpnu diskusiju o mitozi; u ovom poglavlju ćemo razmotriti mehanizme uključene u razgradnju i ponovno formiranje jezgre. Proces je glavninom kontroliran reverzibilnom fosforilacijom i defosforilacijom jezgrinih proteina, djelomično zbog aktivnosti Cdc2 protein-kinaze, koja je ključni regulator mitoze u svim eukariotskim stanicama.

Raspadanje jezgrine ovojnice

U većine stanica razgradnja jezgrine ovojnice označava završetak profaze mitoze (slika 8.29). Usprkos tome , razgradnja jezgre nije univerzalna značajka mitoze i ne događa se u svim stanicama. Neki jednostanični eukarioti (.primjerice kvasci) prolaze tzv. zatvorenu mitozu u kojoj jezgrina ovojnica ostaje netaknuta (slika 8.30). U zatvorenoj mitozi kromosomi kćeri putuju na suprotne polove jezgre, koja se tada podijeli na dvije. Stanice viših eukariota, naravno najčešće prolaze otvorenu mitozu koja je karakterizirana razgradnjom jezgrine ovojnice. Kromosomi kćeri tada putuju na suprotne polove diobenog vretena, a nove se jezgre formiraju oko njih.Razgradnja jezgrine ovojnic, s kojom se istovremeno događa i razgradnja endoplazmatskog retikula, uključuje promjene svih svojih triju komponenata: jezgrine membrane se fragmentiraju u vezikule, kompleksi jezgrinih pora disociraju, a jezgrina lamina se depolimerizira. Najbolje shvaćen od svih ovih događaja je depolimerizacija jezgrine lamine – mreža filamenata koja priliježe uz unutarnju jezgrinu membranu. Jezgrina lamina izgrađena je od fibroznih proteina, lamina, koji se udružuju jedan s drugim da bi formirali filamente. Razgradnja jezgrine lamine je rezultat fosforilacije lamina, a ima za posljedicu razgradnju filamenata do pojedinačnih dimera lamina (slika 8.31). Fosforilaciju lamina katalizira protein-kinaza Cdc2, koju smo upoznali u poglavlju 7 (vidi sliku 7.41) a biti će detaljno obrađena u poglavlju 14 kao centralni regulator mitoze. Cdc2 (i ostale protein-kinaze aktivirane u


mitotičkim stanicama) fosforilira sve različite forme lamina, a tretiranje izoliranih jezgara sa Cdc2 dovoljno je da se inducira depolimerizacija jezgrine lamine. Nadalje, nužnost fosforilacije lamina za razgradnju jezgrine lamine pokazana je direktno konstruiranjem mutiranih lamina koji ne mogu biti fosforilirani. Kada su se geni koji kodiraju takove mutirane lamine ubacili u stanice, njihova ekspresija je blokirala normalnu razgradnju jezgrine lamine pri ulasku stanice u mitozu.Zajedno sa razgradnjom jezgrine lamine, jezgrina ovojnica se fragmentira u brojne vezikule (slika 8.32). Uz te vezikule ostaju vezani lamini tipa B, ali lamini tipa A i C se odvajaju od jezgrine membrane i otpuštaju kao slobodni dimeri u citosol. Ova se razlika javlja jer su lamini tipa B trajno modificirani dodatkom lipida (prenilne grupe), dok se C terminalne prenilne grupe sa lamina A i lamina C odstranjuju proteolizom onog momenta kada se ugrade u laminu. Kompleksi jezgrinih pora također disociraju u podjedinice kao rezultat fosforilacije nekoliko proteina jezgrinih pora. Integralni proteini jezgrine membrane isto bivaju fosforilirani za vrijeme mitoze, a fosforilacija tih proteina je vrlo vjerojatno važna u formiranju vezikula i odvajanju jezgrine membrane kako od kromosoma tako i od jezgrine lamine.

Kondenzacija kromosoma

Još jedna velika promjena u strukturi jezgre za vrijeme mitoze je kondenzacija kromosoma. Interfazni kromatin koji je već upakiran u nukleosome, kondenzira se još oko tisuću puta da bi formirao kompaktne kromosome vidljive u mitotičkoj stanici (slika 8.33). Ova je kondenzacija potrebna da bi se omogućilo kromosomima pomicanje po diobenom vretenu bez da se zapetljaju ili puknu za vrijeme raspoređivanja u stanice kćeri. DNA u tako jako kondenziranom obliku ne može se više prepisivati, tako da za vrijeme mitoze bila kakva sinteza RNA prestaje. Kako se kromosomi kondenziraju, a transkripcija prestaje, jezgrica također nestaje.Kondenzirana DNA metafaznih kromosoma organizirana je u velike petlje, svaka petlja je duljine otprilike stotinu kilobaza DNA pričvršćenih za proteinski kostur (vidi sliku 4.16). Osim njegove temeljne važnosti, sam mehanizam kondenzacije kromosoma za vrijeme mitoze nije shvaćen. Osnovna jedinica strukture kromatina je nukleosom koji se sastoji od 146 parova baza DNA namotanih oko srži histona koju čine po dvije molekule od svakog od histona H2A, H2B, H3 i H4 (vidi sliku 4.12). Jedna molekula histona H1 vezana je na DNA na mjestu gdje ova ulazi u srž nukleosoma, a inetrakcije među tim H1 histonima uključene su u smatanje kromatina na viši nivo, kompaktniju strukturu. Histon H1 je supstrat za Cdc2 protein-kinazu i fosforiliran je u većini stanica za vrijeme mitoze, što je u skladu sa njegovom ulogom u fosforiliranom obliku u kondenzaciji mitotičkih kromosoma. Noviji eksperimenti pak pokazuju da fosforilacija histona H1 nije neophodna za kondenzaciju kromosoma, pa je fosforilacija H1 dosta nejasna. Nasuprot tome, fosforilacija H3 histona potrebna je za kondenzaciju mitotičkih kromosoma, premda mehanizam kojim fosforilacija H3 djeluje na kondenzaciju kromosoma još uvijek nije jasan.Novijim istraživanjima identificiran je kompleks od pet proteina nazvanih kondenzin koji je evolucijski sačuvan u sisavaca. Kompleks sadrži dvije strukturne podjedinice koje su dio više klase proteina «strukturnog održavanja kromosoma» (SMC – structural maintenance of chromosome), i tri regulatorne podjedinice. Kompleks ima važnu ulogu u organizaciji normalnih interfaznih kromosoma kao i u daljnjoj kondenzaciji koja se događa za vrijeme mitoze. Neke od regulatornih podjedinica forsforiliraju se uz pomoć kinaza, među njima je Cdc2-kinaza, što može poslužiti kao veza za promjenu kondenzacije kromosoma u mitozi.


Zanimljivo je da sličan kompleks, nazvan kohezin, igra ulogu u sparivanju sestrinskih kromatida u metafazi.

Ponovno formiranje interfazne jezgre

Za vrijeme završavanja mitoze (telofaza) formiraju se dvije jezgre oko odvojenih setova kromosoma kćeri (vidi sliku 8.29). Dekondenzacija kromosoma i ponovno uspostavljanje jezgrine ovojnice je izgleda signalizirano inaktivacijom Cdc2, odgovornog za odvijanje početka mitoze fosforilacijom ciljnih proteina u koje su uključeni lamini. Napredovanje iz metafaze u anafazu uključuje aktivaciju ubikvitarnog proteolitičkog sustava koji inaktivira Cdc2 tako da razgrađuje njegovu regulatornu podjedinicu, ciklin B (vidi sliku 7.40). Inaktivacija Cdc2 dovodi do defosforilacije proteina koji su bili fosforilirani na početku mitoze, što rezultira izlaskom iz mitoze i ponovnim formiranjem interfazne jezgre.Prvi korak u ponovnom formiranju jezgrine ovojnice je vezivanje vezikula, koje su nastale za vrijeme razgradnje jezgrine membrane, na površinu kromosoma (slika 8.34). Ova interakcija membrana vezikula sa kromosomima je vjerojatno potpomugnuta i laminima i integralnim membranskim proteinima unutarnje jezgrine membrane. Vezikule se tada fuzioniraju da bi formirale dvostruku membranu koja okružuje kromosome. Nakon toga slijedi ponovno formiranje kompleksa jezgrinih pora, jezgine lamine kao i dekondenzacija kromosoma. Vezikule se prvo fuzioniraju tako da formiraju membrane oko svakog pojedinog kromosoma, a tada se sve zajedno fuzioniraju i formiraju jednu kompletnu jezgru.Početak ponovnog formiranja jezgrine ovojnice oko kondenziranih kromosoma isključuje citoplazmatkse molekule iz novo formirane jezgre. Nova se jezgra tada povećava uz pomoć selektivnog transporta jezgrinih proteina iz citoplazme. Kako se jezgrini lokalizacijski signali ne odvajaju od proteina koji se transportiraju u jezgru, isti jezgrini proteini koji su se otpustili u citoplazmu prilikom razgradnje jezgrine ovojnice na početku mitoze, mogu sada biti vraćeni natrag u jezgru, formiranu nakon završetka mitoze. Ran protein je uključen u mnoge korake ranog ponovnog formiranja jezgre. Kako se kromosomi dekondenziraju i započinje transkripcija gena za ribosomskie RNA tako se ponovno formira i jezgrica završavajući povratak iz mitoze u interfaznu jezgru.

SAŽETAK

JEZGRINA OVOJNICA I PROMET IZMEĐU JEZGRE I CITOPLAZME

Struktura jezgrine ovojnice: Jezgrina ovojnica odvaja sadržaj jezgre od citoplazme, održavajući jezgru kao zaseban biokemijski odijeljak koji udomljuje genetski materijal i služi kao mjesto transkripcije i obrane RNA molekula u eukariotskim stanicama. Jezgrina ovojnica sastoji se od vanjske i unutarnje jezgrine membrane koje su međusobno spojene na mjestima kompleksa jezgrinih pora, a ispod membrane priliježe jezgrina lamina.

Kompleks jezgrine pore: Kompleksi jezgrinih pora su veliki strukture koje ostvarju jedini put kojim velike molekule mogu putovati između jezgre i citoplazme. Male molekule mogu slobodno difundirati kroz otvorene kanale unutar kompleksa jezgrinih pora. Makromolekule se selektivno transportiraju uz utrošak energije.


Selektvini transport proteina u i iz jezgre: Proteini određeni za ulazak u jezgru nose jezgrin lokalizacijski signal kojeg prepoznaju receptori i usmjeravaju transport kroz kompleks jezgrine pore. Proteini koji putuju iz jezgre u citoplazmu i natrag nose signal za izlazak iz jezgre koji ih usmjerava na transport iz jezgre u citoplazmu. U većini je slučajeva potreban mali protein Ran vezan na GTP za translokaciju kroz kompleks jezgrine pore. On dirigira smjer transporta.

Regulacija ulaska i izlaska proteina iz jezgre: Aktivnost nekih proteina, kao što su transkripcijski faktori, kontrolirana je regulacijom njihovog ulaska i izlaska iz jezgre.

Transport RNA molekula: RNA molekule transportiraju se kroz komplekse jezgrinih pora u obliku ribonukleoproteinskih kompleksa. mRNA, rRNA i tRNA transportiraju se iz jezgre kako bi sudjelovale u sintezi proteina. Nekoliko vrsta male jezgrine RNA prvo se transportira iz jezgre u citoplazmu, gdje se spajaju sa proteinim i formiraju RNP-ove; zatim se vraćaju u jezgru.

UNUTARNJA ORGANIZACIJA JEZGRE

Kromosomi i struktura kromosoma na višem nivou: Interfazna jezgra sadrži transkripcijski inaktivan, visoko kondenziran heterokromatin i dekondenziran eukromatin. Interfazni kromosomi organizirani su unutar jezgre i podijeljeni na velike domene u obliku petlje koje funkcioniraju kao odvojene jedinice.

Funkcionalne domene unutar jezgre: Neke jezgrine komponente lokalizirane su u odvojenim subnuklearnim strukturama i domenama.

JEZGRICA

Geni za ribosomsku RNA i organizacija jezgrice: Jezgrica je povezana sa genima za ribosomske RNA. To je mjesto transkripcije i obrade rRNA, mjesto sastavljanja ribosoma kao i modifikacije nekolicine malih RNA molekula.

Transkripcija i obrada ribosomske RNA: Primarni transkript gena za ribosomsku RNA je 45S pre-rRNA koja obradom daje 18S, 5.8S i 28S ribosomske RNA. Obrada pre-rRNA i ostalih malih RNA molekulama događa se uz pomoć malih RNA jezgrice (snoRNA).

Uspostava ribosoma: Ribosomske podjedinice uspostavljaju se unutar jezgrice iz ribosomskih RNA i ribosomskih proteina.

JEZGRA ZA VRIJEME MITOZE

Razgradnja jezgrine ovojnice: Ulazak u mitozu signaliziran je aktivacijom Cdc2 protein-kinaze. U većini stanica jezgrina ovojnica se raspada na početku profaze. Depolimerizacija jezgrinih lamina je posljedica fosforilacije lamina uz pomoć Cdc2 i ostalih protein-kinaza.

Kondenzacija kromosoma: Fosforilacija histona H1 i H3 povezana je sa kondenzacijom mitotičkih kromosoma, a fosforilacija H3 histona potrebna je za pravilnu kondenzaciju kromosoma. Kompleks proteina nazvan kondenzin aktivira se uz pomoć fosforilacije Cdc2 i uključen je u kondenzaciju kromosoma.


Ponovno formiranje interfazne jezgre: Inaktivacija Cdc2 na kraju mitoze dovodi do ponovnog formiranja jezgrine ovojnice i dekondenzacije kromosoma. Jezgrini proteini se tada selektivno transportiraju u jezgru kroz komplekse jezgrinih pora.

KLJUČNE RIJEČI

jezgrina ovojnica, jezgrina membrana, jezgrina lamina, lamin

kompleks jezgrine pore

jezgrin lokalizacijski signal, Ran, karioferin, importin, eksportin, signal za izlazak iz jezgre

heterokromatin, eukromatin

jezgrica, organizacijska regija jezgrice

male jezgricine RNA (snoRNA)

Cdc2

Pitanja

1. Odvajajući transkrpciju od translacije, jezgrina ovojnica omogućuje eukariotima da reguliraju ekspresiju gena procesima koji nisu pronađeni u prokariota. Koji su to procesi karakteristični samo za eukariote?

2. Koje su dvije uloge lamina u strukturi i funkciji jezgre?

3. Ako u jaje žabe injicirate dva proteina, jedan veličine 15 kDa, a drugi od 100 kDa, obima nedostaju jezgrini laklizacijski signali, da li će ijedan ući u jezgru?

4. Što određuje smjer ulaska u jezgru?

5. Opiši kako aktivnost transkripcijskog faktora – regulatora gena može biti regulirana ulaskom u jezgru?

6. Proučavate transkripcijski faktor koji je reguliran fosforilacijom serinskih ostataka što inaktivira njegov jezgrin laklizacijski signal. Kako će mutacija tih serina u alanine


djelovati na unutarstaničnu lokalizaciju transkripcijskog faktora s obzirom na njegove ciljne gene?

7. Kako će inaktivacija mutacijom jezgrinog izlaznog signala na proteinu koji normalno putuje u i iz jezgre utjecati na njegovu unutarstaničnu raspodjelu?

8. Replikacija DNA se događa na oko 200 specifičnih mjesta ili replikacijskih tvornica. Kako ćete locirati ta mjesta u stanici sisavaca u kulturi?

9. Jezgrini lokalizacijski signali se ne odvajaju uz pomoć signalne peptidaze kao signalni peptidi ER. Predočujući promjene kroz koje prolaze jezgre za vrijeme staničnog ciklusa, predloži razlog zašto se jezgrini lokalizacijski signali ne odvajaju.

10. Koja je uloga protein-kinaze ovisne o ciklinima Cdc2 u pokretanju mitoze?


Slika 8.1 Jezgrina ovojnica (A) Elektronsko mikroskopska slika jezgre. Unutranja i vanjska jezgrina membrana povezane su na mjestima kompleksa jezgrinih pora (strelice). (B) Elektronsko mikroskopska slika prikazuje kontinuiranost jezgrine vanjske membrane sa endoplazmatskim retikulom. (C) Shematski prikaz jezgrine ovojnice. Unutarnja jezgrina membrana omeđena je jezgrinom laminom koja služi kao mjesto prihvaćanja kromatina. (A, David M. Phillips/Photo Researches, Inc.; B, courtesy of Dr. Werner W. Franke, German Cancer Research Center, Heidelberg.)

(A) nucleolus – jezgricachromatin – kromatin

(B) Endoplasmic retikulum – endoplazmatski retikulNuclear pore complex – kompleks jezgrine poreOuter membrane – vanjska membranaInner membrane – unutarnja membrana

(C)Perinuclear space – perinuklearni prostorOuter membrane – vanjska membranaInner membrane – unutarnja membranaSmooth endoplasmic reticulum – glatki endoplazmatski retikulRibosomes – ribosomiNuclear pore complex – kompleks jezgrine poreNuclear lamina – jezgrina laminaNucleolus – jezgricaChromatin – kromatinRough endoplasmic reticulum – hrapavi endoplazmatski retikul

Slika 8.2 Elektronsko mikroskopska slika jezgrinih pora Veliki broj jezgrinih pora (strelice) vidljiv nakon lom-smrznute preparacije jezgrine ovojnice. (photo Researches, Inc).

Slika 8.3 Elektronsko mikroskopska slika jezgrine lamineJezgrina lamina je mreža vlakana koja priliježu uz unutarnju jezgrinu membranu i protežu se u unutrašnjost jezgre. (iz U.Aebi, J. Cohn, L. Buhle and L. Gerace, 1986. Nature 323:560)

Slika 8.4 Model sastavljanja laminaPolipeptidi lamina formiraju dimere u kojima su centralne regije α-heliksa dvaju polipeptidnih lanaca omotane jedna oko druge. Daljnje sastavljanje može uključivati povezivanje glave sa repom dimera da bi se formirali linearni polimeri i postranično povezivanje polimera da bi se formirali filamenti (vlakna).Lamin polypeptide – polipeptid laminaDimer – dimerHead-to-tail association of dimers – povezivanje glave i repa dimeraSide-by-side associations of polymers – postranično povezivanje polimeraPolymer – polimer


Filament – filament (vlakno)

Slika 8.5 Promet molekula kroz komplekse jezgrinih poraMale molekule prolaze brzo pasivnom difuzijom kroz otvorene kanale unutar kompleksa jezgrine pore. Nasuprot tome, makromolekule se transportiraju selektivno, mehanizmom u kojem se troši energija, a koji je uključen najčešće u ulazak proteina u jezgru i izlazak RNA molekula u citoplazmu.

Passive diffusion – pasivna difuzijaEnergy-dependent transport – transport uz utrošak energijeProteins – proteiniSmall molecules – male molekuleNucleus – jezgraRNAs – RNA molekule

Slika 8.6 Elektronsko mikroskopska slika kompleksa jezgrinih poraGledani sprijeda, izolirani kompleksi jezgrinih pora izgledaju kao da su izgrađeni od osam strukturnih podjedinica koje okružuju centralni kanal. ( posredstvom Dr. Ron Milligan, The Scripps Research Institute.)

Slika 8.7 Model kompleksa jezgrine poreKompleks se sastoji od osam prečki pričvršćenih za prstenove na citoplazmatskoj i jezgrinoj strani jezgrine ovojnice. Kompleks prečki i prstenova okružuje centralni kanala. Citoplazmatski filamenti pružaju se iz citoplazmatskog prstena, a filamenti formiraju jezgrin koš koji strši iz jezgrinog prstena.

Cytoplasm – citoplazmaCytoplasmic filament – citoplazmatski filamentCytoplasmic ring – citoplazmatski prstenOuter nuclear membrane – vanjska jezgrina membranaSpoke-ring assembly – struktura prečki i prstenovaNuclear ring – jezgrin prstenCentral channel – centralni kanalNuclear basket – jezgrin košInner nuclear membrane – unutarnja membrana jezgreNucleus – jezgra

Slika 8.8 Jezgrini lokalizacijski signaliJezgrin lokalizacijski signal T antigena je jedan lanac aminokiselina. Nasuprot tome, jezgrin lokalizacijski signal nukleoplazmina je bipartit koji se sastoji od sekvence Lys-Arg i sekvence Lys-Lys-Lys-Lys locirane deset aminokiselina nizvodno.

T antigen – T antigenNucleoplasmin – nukleoplazmin


Table 8.1 Karioferini sa poznatim supstratima

Karioferin Organizam SupstratUlazak u jezgruKapα/Kapβ1 dimer čovjek Proteini sa jezgrinim

lokalizacijskim signalom izgrađenim od bazičnih aminokiselina (napr. nukleoplazmin)

snurportin čovjek snRNP-ovi (U1,U2,U4,U5)

Kapβ1 sam čovjek Cdk/ciklin kompleksiKapβ2 (transportin) čovjek Proteini vezani na mRNAKapβ3 čovjek Ribosomski proteiniImportin7/ Kapβ1 dimer čovjek Histon H1Izlazak iz jezgreCrm1 kralježnjaci Proteini sa jezgrinim

lokalizacijskim signalom bogatim leucinom

CAS čovjek KapαEksportin-t čovjek Transportne RNAEksportin4 miš Elongacijski faktor 5A

Slika 8.9 Ulazak proteina u jezgru kroz kompleks jezgrine poreProteini ulaze kroz kompleks jezgrine pore u pet koraka ciklusa. U prvom koraku protein sa jezgrinom lokalizacijskom sekvencom (NLS – nuclear localization sequence) prepoznaje importin koji je u kompleksu sa malim proteinom vezanim na GTP nazvanim Ran. U drugom koraku kompleks sačinjen od tereta (protein sa jezgrinom lokalizacijskom sekvencom), importina i Ran/GDP-a se vezuje na specifični protein citoplazmatskih filamenata unutar kompleksa jezgrine pore. U trećem koraku, kompleks se prebacuje kroz jezgrinu poru postupnim vezivanjem na proteine pore. U četvrtom koraku aktivnošću faktora koji izmjenjuje guanin (Ran GEF – guanin nucleotide excange factor) unutar jezgre se izmjenjuje GDP na Ran proteinu za GTP, tako se mijenja konfiguracija kompleksa, te se protein otpušta. U petom koraku, kompleks importin-Ran/GTP izlazi kro poru iz jezgre, a protein koji aktivira GTP-azu (Ran GAP) u citoplazmi hidrolizira GTP na Ran proteinu do GDP-a.protein – proteinNLS-NLSImportin-importinRan GAP – Ran GAPGDP-GDPRan GEF – Ran GEFGTP-GTPcytoplasm – citoplazmaNucleus - Jezgra

Slika 8.10 Izlazak proteina iz jezgre


Unutar jezgre formira se kompleks između proteina koji nosi jezgrin izlazni signal (NES – nuclear export signal), eksportina i Ran/GTP-a. Kako transport napreduje kroz kompleks jezgrine pore, tako RanGAP ( GTP-ase-activating protein) stimulira hidrolizu vezanog GTP-a što dovodi do formiranja Ran/GDP-a i otpuštanja proteina i eksportina u citoplazmu. Eksportin se tada transportira natrag u jezgru.

Exportin – eksportinNuclear export signal – jezgrin izlazni signalNucleus – jezgraCytoplasm – citoplazmaGTP-GTPRan-RanGDP-GDP

Slika 8.11 Regulacija ulaska transkripcijskih faktora u jezgruTranskripcijski faktor NF-κB održava se u citoplazmi kao inaktivan kompleks sa IκB što maskira njegovu jezgrinu lokalizacijsku sekvencu (NLS- nuclear localization sequence). Kao odgovor na određene vanstanične signale IκB se fosforilira I razgrađuje proteolizom, dozvoljavajući ulazak NF-κB u jezgru. Nasuprot tome, transkripcijski faktor kvasca SW15 održava se u citoplazmi fosforilacijom u blizini njegovog lokalizacijskog slijeda za jezgru . Regulirana defosforilacija izlaže NLS (jezgrin lokalizacijski signal) i omogućuje transport SW15 u jezgru u određenoj fazi staničnog ciklusa.

Phosphorylation and proteolysis of IκB – fosforilacija i proteoliza IκBCytoplasm – citoplazmaDephosphorylation – defosforilacijaImportin – importinNucleus – jezgrakratice – isto

Slika 8.12 Transport ribonukleoproteinskog kompleksaŽlijezda slinovnica insekata proizvodi velike ribonukleoproteinske komplekse (RNP) koji sadrže 35-40 kb RNA a ukupne mase su otprilike 30 milijuna daltona. Ova serija elektronsko mikroskopskih slika prikazuje prihvaćanje takovog RNP-a na kompleks jezgrine pore (A) odmatanje RNA za vrijeme njezinog prelaska u citoplazmu (B-D). (Iz H.Mehlin I sur., 1992. Cell 69:605).

Slika 8.13. Transport snRNA molekula između jezgre i citoplazmeMale jezgrine RNA (snRNA – small nucelar RNA) se prvo transportiraju iz jezgre u citoplazmu, gdje se vezuju sa proteinima i formiraju snRNP-e. Tako oformljeni snRNP-ovi se zatim transportiraju natrag u jezgru.

Protein binding – vezivanje proteinaNucleus – jezgraCytoplasm – citoplazmasnRNP- snRNPsnRNA-snRNA

Slika 8.14 Heterokromatin u interfaznoj jezgri


Eukromatin je raspoređen po jezgri. Heterokromatin je naznačen vrhovima strelica, a jezgrica strelicom. (prema Ada L.Olins i Donald E. Olins, Oak Ridge National Laboratory.)

Slika 8.15. Organizacija kromosomaReprodukcija crteža kromosoma u stanicama daždevnjaka. (A) kompletni kromosomi. (B) Samo telomere (locirane na jezgrinoj ovojnici). (Iz C.Rabl, 1885. Morphologishes Jahrbuch 10:214.)

Slika 8.16 Organizacija kromosoma Drosophile(A) Model jezgre koji prikazuje pet kromosomskih krakovau različitim bojama. Naznačenei su položaji centromera i telomera. (B) Dvije ruke kromosoma broj 3 prikazane da pokažu topološku separaciju među kromosomima. (Iz D. Mathog i sur., 1984. Nature 308:414.)

Centromeres – centromereTelomeres – telomere

Slika 8.17 Organizacija kromosoma u jezgri stanice sisavaca(A) probe na ponovljene sekvence kromosoma broj 4 hibridizirane su sa ljudskim stanicama. Dvije kopije kromosoma 4, identificirane žutom fluorescentnom bojom zauzimaju različita područja jezgre. (B) Model organizacije kromosoma. Kromosomi zauzimaju zasebna područja jezgre odvojena intrakromosomskim domenama u kojima se misli da se događa obrada RNA i transport. (A, posredstvom Thomasa Cremera, Ludwig Maximilians University, iz A.I. lamond i W.C. Earnshaw, 1998. Science 280: 547.)

Copies of chromosome 4 – kopije kromosoma 4Nuclear envelope – jezgrina ovojnicaInterchromosomal domain – interkromosomska domenaChromosome territories – kromosomska područja

Slika 8.18 Domene kromatinskih petljiSvjetlosno mikroskopska slika kromosoma oocita vodozemaca koja prikazuje dekondenzirane petlje kromatina koji se prepisuju kako se izvijaju iz osi visoko kondenziranog neprepisujućeg kromatina. (posredstvom Josepha Galla, Carnegie Institute.)

Slika 8.19 Mjesta replikacije DNANovoreplicirana DNA označena je kratkom ekspozicijom stanica bromodeoksiuridinu koji se ugradio u DNA na mjesto timidina. Ova zamjena omogućuje direktnu detekciju novnosintetizirane DNA imunofluorescentnim bojenjem jezgara sa antitijelima na bromodeoksiuridin. Obratite pažnju da je novoreplicirana DNA prisutna u zasebnim područjima raspršenim po jezgri. (posredstvom Ronalda Berezneya, SUNY/Buffalo.)

Fluorescent foci of DNA replication – fluorescentna područja replikacije DNA

Slika 8.20 Lokalizacija komponenti prekrajanjaBojenje imunofluorescentnim antitijelima ukazuje da su faktori prekrajanja koncentrirani u zasebnim domenama unutar jezgre. (posredstvom Davida L. Spectora, Cold Spring Harbour Laboratory.)

Slika 8.21 Cajalova tjelešca u jezgri


(A) Slika jezgre HeLa stanice dobivena diferencijalnom interferentnom kontrasnom mikroskopijom. Strelice prikazuju dva Cajalova tjelešca. (B) Imunofluorescentno bojenje iste jezgre sa antitijelima na protein koilin (zeleno) i fibrilarin (crveno). Fibrilin je prisutan i u gustoj fibrilarnoj zoni jezgrice i u Cajalovim tjelešcima. Koilin je prisutan samo u Cajalovim tjelešcima. (Iz J.G.Gall, 2000. Ann.Rev.Cell Dev.Biol. 16:273.)

Slika 8.22 Geni ribosomske RNASvaki rRNA gen je jedna transkripcijska jedinica koja sadrži 18S, 5.8S i 28S rRNA i sekvence razmaknice. Geni za ribosomsku RNA grupirani su u područja uzastopnih ponavljanja i odvojenisekvencom razmaknice koja se ne prepisuje .

rRNA gene – gen za rRNAnontranscribed spacer – razmaknica koja se ne prepisuje transcription – transkripcijatranscribed spacers – razmaknica koja se prepisuje 45S pre-rRNA – 45S pre-rRNA

Slika 8.23 Jezgrice u oocitama vodozemcaAmplificirani geni za rRNA u oocitama Xenopusa nakupljeni su u brojnim jezgricama (tamno obojene točke). (Iz D.D.Brown i I.B. Dawid, 1968. Science 160:272

Slika 8.24 Struktura jezgriceElektronsko mikroskopska slika pokazuje fibrilarni centar (FC), gustu fibrilarnu komponentu (DFC – dense fibrilar component) i granularnu kompnentu (G) jezgrice. (posredstvom Davida L. Spectora, Cold Spring Harbor Laboratory.)

sve kratice isto

Slika 8.25 Transkripcija gena za rRNAElektronsko mikroskopska slika kromatina jezgrice koja prikazuje tri gena za rRNA odvojena DNA razmaknicom koja se ne prepisuje. Svaki gen za rRNA okružen je područjem rastućeg lanca RNA molekule što rezultira pojavom božićnog drvca. (posredstvom O.L. Millera, Jr.)

Slika 8.26 Obrada pre-rRNAPre-rRNA transkript 45S sadrži vanjske transkribirane razmaknice (ETS – external transcribed spacers) na oba kraja molekule i unutarnje transkribirane razmaknice ( ITS – internal transcribed spacers) između sekvenci 18S, 5.8S i 28S rRNA. Pre-rRNA obrađuje se nizom cijepanja molekule (pokazano za ljudsku pre-rRNA) što dovodi do zrele rRNA.

Mature rRNAs – zrele rRNA molekuleostalo sve isto

Slika 8.27 uloga snoRNA u modifikaciji baza pre-rRNAsnoRNA sadrže kratke sekvence komplementarne sa rRNA. Komplementarnim sparivanjem baza između snoRNA i pre-rRNA usmjeravaju se enzimi koji kataliziraju modifikaciju baza (napr. metilacija) na točna mjesta pre-rRNA.

kratice isto

Slika 8.28 Slaganje ribosoma


Ribosomski proteini ulaze iz citoplazme u jezgricu i vezuju se na pre-rRNA prije njezinog cijepanja. Kako se pre-rRNA obrađuje, ostali ribosomski proteini i 5S rRNA (koja se sintetizira na drugom mjestu u jezgri) vezuju se na nju i formiraju se preribosomske čestice. Zadnji korak sazrijevanja događa se nakon izlaska preribosomskih čestica u citoplazmu, a to dovodi do formiranja 40S i 60S ribosomskih podjedinica.

Nucleus – jezgraNucleolus – jezgricaRibosomal proteins-ribosomski proteiniPre-rRNA - pre-rRNAPreribosomal particles – preribosomske česticeCytoplasm – citoplazma40S subunit – 40S podjedinica60S subunit – 60S podjedinica

Slika 8.29 Jezgra za vrijeme mitozeMikroskopske slike prikazuju progresivne stadije mitoze u biljnoj stanici. Za vrijeme profaze kromosomi se kondenziraju, jezgrica nestaje, a jezgrina ovojnica se raspada. U metafazi se kondenzirani kromosomi smještaju u centar diobenog vretena. Kromosomi kćeri tada putuju prema suprotnim polovima diobenog vretana (anafaza), a za vrijeme telofaze kromosomi se dekondenziraju, a jezgre se ponovo formiraju. Kromosomi su obojeni plavo, a mikrotubuli diobenog vretena crveno. ( posredstvom Andrew S. Bajer, University of Oregon.)

Prophase – profazaPrometaphase – prometafazaMetaphase – metafazaAnaphase – anafazaTelophase – telofaza

Slika 8.30 Zatvorena i otvorena mitozaU zatvorenoj mitozi jezgrina ovojnica ostaje intaktna a kromosomi putuju prema suprotnim polovima diobenog vretena unutar jezgre. U otvorenoj mitozi jezgrina ovojnica se raspada i ponovno formira oko dva seta odvojenih kromosoma.

Closed mitosis – zatvorena mitozaSpindle – diobeno vretenoOpen mitosis – otvorena mitoza

Slika 8.31 Raspadanje jezgrine lamineJezgrina lamina sastoji se od mreže filamenata lamina. Za vrijeme mitoze Cdc2 i ostale protein-kinaze fosforiliraju lamine što uzrokuje disocijaciju filamenata u slobodne dimere lamina.

Lamin filament – filament laminaPhosphorylation – fosforilacijaLamin dimers – dimeri lamina

Slika 8.32 Razgradnja jezgrine membraneKako jezgrina lamina disocira tako se jezgrina membrana fragmentira u vezikule. Lamini tipa B ostaju vezani na vezikule, dok se lamini tipa A i C otpuštaju kao slobodni dimeri.


Nuclear membranes – jezgrine membraneNuclear lamina – jezgrina laminaMitosis – mitozaFree dimers of lamins A i C – slobodni dimeri lamina tipa A i CNuclear membrane vesicles – vezikule jezgrine membraneLamin B bound to vesicles – lamin tipa B vezan na vezikule

Slika 8.33 Kondenzacija kromosomaElektronsko mikroskopska slika kondenzacije pojedinačnih kromosoma za vrijeme profaze mitoze (K.G. Murti/Visuals Unlimited.)

Slika 8.34 Ponovno formiranje jezgrine ovojnicePrvi korak ponovnog formiranja jezgrine ovojnice je vezivanje membranskih vezikula na kromosome, koje je vjerojatno potpomognuto integralnim membranskim proteinima i laminima tipa B. Tada se vezikule fuzioniraju, ponovno se uspostavlja jezgrina lamina, a kromosomi se dekondenziraju.

Nuclear membrane vesicles – vezikule jezgrine membraneLamins – laminiChromosomes – kromosomiIntegral membrane proteins – integralni membranski proteiniVesicles bound to chromosomes – vezikule vezane na kromosomeVesicle fusion – fuzija vezikulaChromosome condensation – kondenzacija kromosomaFusion of vesicles surrounding individual chromosomes – fuzija vezikula koje okružuju pojedine kromosomeReassembly of nuclear lamina and nuclear pore complexes – ponovno sastavljanje jezgrine lamine i kompleksa jezgrinih poraNuclear pore complex – kompleks jezgrine poreDecondensed chromatin – dekondenzirani kromatinNuclear lamina – jezgrina laminaNuclear membranes – jezgrine membrane


jedro - viii poglavlje stanica-cooper

Documents