Szélessáv a HLA-genotipizálásban

Új generációs amplikonszekvenálás a molekuláris diagnosztikában

Jóri BalázsIstenhegyi Géndiagnosztika

Human Leukocita Antigén• Környezet vs egyed interakció

– Idegen felismerése, közömbösítése• immunglobulinok, T- és B-sejt receptorok • dinamikus struktúrák

– Saját megkülönböztetése, egyedi jellegek alapján• örökletes, • nagyon polimorf gének • MHC – HLA

• Jelentőség– Allorecognition immunreaktivitás pl

transzplantációkor– TBC, lepra asszociál HLA-DR2-vel erős v gyenge

válasz– Autoimmun betegségek

(Coeliac disease, diabetes I, lupus)– Egyedazonosítás

• HLA– Embrionális kor– Thymus (T-limfociták érése)– Chr.VI, p kar, 4MB

11

http://en.wikipedia.org/wiki/Human_leukocyte_antigen

Human Leukocita Antigén• HLA Class I:

– HLA-A, -B, -C, -G, -E– Polimorf: • HLA-A-a1, • HLA-B-a1, • HLA-C-a1

• HLA Class II:– HLA-DR, -DQ, -DP, -DO

• Membránban rekombinálódhat apai és anyai allotípus variábilis fenotípus

http://www.matud.iif.hu/05jun/05.html

http://www.ebi.ac.uk/imgt/hla/stats.html

HLA tipizálás• Szerotipizálás (PROT)

– Sejtfelszíni markerek– Több, mint 100 szerotípus– CDC-teszt– HTS: OVSZ Luminex, xMAP-tech– nem pontosan mutatja idegen polimorf.

immunogenitását• Genotipizálás (DNS)

– PCR-SSP• Szekvencia specifikus primer• Kevés variancia, véges számú

– Sanger-szekvenálás• FW és REV primerek setje• Sangert zavarják az allotípusok klónozni kell• HTS-t igényel! Pl. automata

– NGS• Platformon belül klonális assay• Nagy felbontású adat

http://www.szote.u-szeged.hu/medcentrum/transf/eloadasok/HLArendszer.pdf

NGS-amplikon szekvenálás

• emPCRklonális amplifikáció• MR és HR primer kit

250-700bp termékek:– Sanger-méretűek– 454 Long Read Tech

• Felbontás– 10 minta MR/run vagy

5 minta HR/run– 40MB data/run– 3 nap/run– Akár 5000 szekv./exon

GSGType HLA• Workflow

• 5-10 minta• DNS izolálás • PCR MR/HR kit• Termék tisztítás, kvantitalás, poolozás• EmPCR• EmPCR tisztítása• GS Junior run• Connexio szoftver kiértékelés

• 18-22 ezer szekvencia/ minta

• Coverage 50x-7000x• Heti 5-20 minta

kapacitás

Kapcsolat

Jóri BalázsIstenhegyi Géndiagnosztikai,

Nőgyógyászati és Családtervezési Centrum

1125 Budapest, Istenhegyi út 29-31.Tel.: (+36 1) 224 5442Fax: (+36 1) 224 5445

E-mail: info@gendiagnosztika.hu Web: www.gendiagnosztika.hu