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ANNÉE 2015
THÈSE / UNIVERSITÉ DE RENNES 1 sous le sceau de l’Université Européenne de Bretagne
pour le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ DE RENNES 1 Mention : chimie
Ecole doctorale Sciences de la matière
présenté par
Jérémy Desneux Préparée à l’unité de recherche Gestion environnementale et traitement
biologique des déchets Irstea Rennes
Etude de la survie et de la viabilité de Listeria
monocytogenes dans les effluents d’élevages porcins
Thèse soutenue à Rennes le 7 décembre 2015 devant le jury composé de :
Edward Topp Directeur de recherche, Agriculculture and Agri-Food Canada / rapporteur
Fabienne Petit Professeur, Université de Rouen / rapporteur Martine Denis Directeur de projets recherche, ANSES Ploufragan / examinateur
Pascal Piveteau Maître de conférences, Université de Bourgogne, Dijon / examinateur
Isabelle Deportes Ingénieur ADEME Angers / examinateur Anne-Marie Pourcher Directeur de recherche, Irstea Rennes / directeur de thèse
Remerciements Ce travail de thèse a été réalisé au sein de l’Irstea de Rennes dans l’équipe SAFIR de l’Unité de Recherche Gestion environnementale et traitement biologique des déchets, grâce au support financier de l’Irstea et de l’Agence de l’Environnement et de la Maîtrise de l’Energie. Merci à ces deux partenaires de m’avoir fait confiance. Un grand merci également à José Martinez qui m’a accueilli à l’Irstea de Rennes. Egalement merci à Fabrice Béline pour m’avoir accueilli dans son unité. Merci à Patrick Dabert et Anne Trémier qui m’ont accueilli dans leurs équipes. Je remercie le jury d’avoir accepté d’évaluer mon travail, en particulier Edward Topp et Fabienne Petit, de me faire l’honneur de rapporter mon travail. Je tiens à remercier Pascal Piveteau pour avoir accepté de participer à mon jury de thèse et pour son aide dans la mise en place de l’étude transcriptomique et pour l’analyse des résultats. J’exprime toute ma gratitude à Martine Denis et à Isabelle Déportes pour avoir accepté de juger ce travail. Un énorme merci à ma directrice de thèse, Anne-Marie Pourcher. Merci pour toute ton aide et ta patience. Je suis ravi d’avoir travaillé en ta compagnie car, outre ton appui scientifique, tu as toujours été là pour me soutenir et me conseiller au cours de ces trois années. MERCI Merci à Alain Hartmann, responsable de l’équipe MERS à l’INRA de Dijon, pour m’avoir accueilli dans son laboratoire pour les extractions d’ARN. Merci à Marianne Chemaly pour son aide et sa collaboration pour la réalisation du plan d’expérience et l’analyse statistique. Merci à Carlos Blanco, responsable de l’équipe DUALS de l’Université de Rennes, pour m’avoir permis de réaliser quelques manips dans son laboratoire et pour ses conseils. Merci à Gwennola Ermel d’avoir accepté d’être membre de mon comité de pilotage à mi-parcours. Merci à Annie Trautwetter et à toute l’équipe pédagogique de l’Université de Rennes pour leurs précieux conseils lors de mes missions d’enseignement. Merci à l’ensemble du personnel d’Irstea qui a aidé à la réalisation de ce travail. Merci plus particulièrement aux doctorants (Cyril, Faustine, Jordan, Romain, Henry, Axelle et Simon), aux stagiaires que j’ai eu la chance (ou malchance) d’encadrer (Moana, Fabrice et Audrey), aux CDDistes (Lucas, Etienne, Samuel et Anne-Laure), sans oublier évidemment Christine et tous les autres, pour ces bons moments passés ensemble, au labo ou ailleurs. Merci spécial à Anne-Laure pour son initiation à QIIME.
Ces remerciements ne sauraient être complets si je n’y incluais pas mes parents, mon frère et ma belle-famille pour l’aide morale, le soutien sans faille et la motivation qu’ils m’apportent au quotidien. Et enfin, Clémentine pour son soutien, sa confiance, ses encouragements et quelques fois sa patience tout au long de ces années. Un énorme merci à vous tous.
Liste des publications et communications scientifiques
Articles :
Desneux, Jérémy, Pourcher, Anne-Marie. Comparison of DNA extraction kits and
modification of DNA elution procedure for the quantitation of subdominant bacteria
from piggery effluents with real-time PCR. MicrobiologyOpen 2014,3:437-445.
Jérémy Desneux, Marianne Chemaly, Anne-Marie Pourcher. Experimental design for
the optimization of propidium monoazide treatment to quantify viable and non-viable
bacteria in piggery effluents. BMC Microbiology 2015, 15:164.
Desneux, Jérémy, Biscuit Audrey, Picard Sylvie, Pourcher Anne-Marie. Fate of viable
but non-culturable Listeria monocytogenes in pig manure microcosms. Soumise à
FEMS Microbiology Ecology.
Communications par affiches :
Desneux jérémy, Ziebal Christine, Boscher Evelyne, Diara Arnaud, Perrot Morgane,
Denis Martine, Pourcher Anne-Marie. Etude de la survie et de la diversité de L.
monocytogenes dans les effluents d’élevages porcins. Ve journées de l’Association
Francophone d’Ecologie Microbienne, septembre 2013, Parent.
Desneux Jérémy, Biscuit Audrey, Picard Sylvie, Pourcher Anne-Marie. Survival of
viable Listeria monocytogenes cells during livestock manure storage determined by
molecular and culture assays. FEMS, juin 2015, Maastricht.
Communications orales :
Desneux Jérémy, Biscuit Audrey, Picard Sylvie, Pourcher Anne-Marie. Behavior of L.
monocytogenes strains in swine manure microcosm as determined by molecular and
culture assays. XVII International Congress on Animal Hygiene, juin 2015, Košice,
Slovakia.
Pourcher Anne-Marie , Ziebal Christine , Boscher Evelyne , Picard Sylvie , Perrot
Morgane, Desneux Jérémy, Diara Arnaud , Denis Martine 2015. Survey of Listeria
monocytogenes in raw and treated manures from two pig farms. XVII International
Congress on Animal Hygiene, juin 2015, Košice, Slovakia.
1
Table des matières
Introduction générale .............................................................................................................................. 1
Chapitre 1 : Etude bibliographique .......................................................................................................... 5
1 L’élevage porcin, source d’effluents valorisables, mais aussi réservoir de micro-organismes
pathogènes .............................................................................................................................................. 6
1.1 L’élevage porcin en France ...................................................................................................... 6
1.2 Le Lisier .................................................................................................................................... 7
1.2.1 Composition chimique du lisier porcin ............................................................................ 7
1.2.2 Contamination chimique ................................................................................................. 9
1.2.3 Filière de traitement des lisiers porcins ........................................................................ 10
1.3 Microbiologie du lisier ........................................................................................................... 12
1.3.1 Flore bactérienne dominante ........................................................................................ 12
1.3.2 Flore pathogène des lisiers ............................................................................................ 13
1.3.3 Voies de dissémination des micro-organismes pathogènes issus des effluents
d'élevages porcins dans l’environnement ..................................................................................... 15
2 Listeria monocytogenes, bactérie pathogène ubiquiste ............................................................... 17
2.1 Description de Listeria monocytogenes ................................................................................ 17
2.1.1 Découverte de L. monocytogenes ................................................................................. 17
2.1.2 Classification du genre Listeria ...................................................................................... 17
2.1.3 Caractères d'identification bactériologique .................................................................. 19
2.1.4 Caractères sérologiques de L. monocytogenes. ............................................................ 20
2.1.5 Caractéristiques génomiques de L. monocytogenes ..................................................... 21
2.1.6 Pan-génome et détermination génétique des lignées de L. monocytogenes ............... 23
2.2 Pathogénicité de L. monocytogenes ...................................................................................... 24
2.2.1 Epidémiologie ................................................................................................................ 24
2.2.2 Listériose et symptomatologie ...................................................................................... 27
2.2.3 Processus infectieux ...................................................................................................... 28
2.2.4 Génomique du processus infectieux ............................................................................. 30
2.3 Réservoirs et capacité de survie de L. monocytogenes dans l’environnement .................... 31
2.3.1 Portage chez l’Homme et présence dans les effluents de stations d'épuration ........... 31
2.3.2 Portage de L. monocytogenes par les animaux ............................................................. 32
2.3.3 Présence de L. monocytogenes dans les productions alimentaires .............................. 33
2.3.4 Prévalence dans les élevages et les effluents d’élevages ............................................. 34
2.3.5 Prévalence de L. monocytogenes dans les sols ............................................................. 36
2
2.3.6 Persistance dans les effluents d’élevages et impact des traitements ........................... 37
2.3.7 Persistance de L. monocytogenes dans les sols............................................................. 39
2.3.8 Transfert de L. monocytogenes du sol aux végétaux .................................................... 43
3 Réponse au stress et formes viables mais non cultivables de L. monocytogenes ........................ 45
3.1 Facteurs de stress et mécanismes d’adaptation chez L. monocytogenes ............................. 45
3.1.1 Notions générales sur le stress microbien .................................................................... 45
3.1.2 Réponse au stress chez L. monocytogenes ................................................................... 46
3.1.3 Régulateurs globaux en réponse à un stress ................................................................. 46
3.1.4 Mécanismes mis en jeux en réponses à des stress spécifiques .................................... 47
3.2 L’état Viable mais non Cultivable comme forme de résistance au stress ............................. 54
3.2.1 Caractéristiques de l’état VNC ....................................................................................... 55
3.2.2 Modifications morphologiques et physiologiques ........................................................ 55
3.2.3 Modification du protéome ............................................................................................ 56
3.2.4 Pouvoir pathogène et adhérence .................................................................................. 58
3.3 Induction de l’état VNC ......................................................................................................... 58
3.3.1 Condition environnementales ....................................................................................... 58
3.3.2 Régulateurs impliqués dans la formation des VNC ....................................................... 60
3.3.3 Ressuscitation des bactéries en état VNC ..................................................................... 60
3.3.4 Etat VNC chez L. monocytogenes .................................................................................. 62
3.4 Détection des microorganismes en état VNC ....................................................................... 64
3.4.1 Les techniques disponibles ............................................................................................ 64
3.4.2 Le Propidium Monoazide (PMA) ................................................................................... 70
4 Objectif du doctorat ...................................................................................................................... 75
Chapitre 2 : Optimisation des paramètres de la qPCR couplée au propidium monoazide (qPCR-PMA)
permettant de quantifier les formes VNC de L. monocytogenes dans les lisiers et les effluents de
lagune .................................................................................................................................................... 77
1 Avant-propos ................................................................................................................................. 78
2 Article ............................................................................................................................................ 79
3 Bilan ............................................................................................................................................... 88
Chapitre 3 : Etude du comportement des formes viables non cultivables de L. monocytogenes dans les
lisiers et l’effluents de lagune de deux élevages porcins ....................................................................... 89
1 Avant-propos ................................................................................................................................. 90
2 Abstract ......................................................................................................................................... 92
3 Introduction ................................................................................................................................... 93
4 Materiel and method .................................................................................................................... 95
4.1 Bacterial strains ..................................................................................................................... 95
3
4.2 Characteristics of the treatment processes .......................................................................... 95
4.3 Chemical characterisation of manure and lagoon effluent ................................................... 95
4.4 Preparation of the microcosms ............................................................................................. 95
4.5 Quantification of autochthonous L. monocytogenes in raw manures and lagoon effluents 96
4.6 Quantification of Rifr strains in the microcosms ................................................................... 96
4.7 Cultural method .................................................................................................................... 96
4.8 Propidium monoazide (PMA) treatment ............................................................................... 97
4.9 DNA extraction and quantification of L. monocytogenes and total bacteria ........................ 97
4.10 T90 calculations and statistical analysis ................................................................................ 98
4.11 Pyrosequencing of 16S rDNA gene sequences ..................................................................... 99
4.12 Analysis of pyrosequencing data using the QIIME pipeline ................................................. 99
5 Results ......................................................................................................................................... 100
5.1 Persistence of inoculated strains in manures and lagoons ................................................. 100
5.2 Comparison of the level of the cultivable, viable, and total bacteria ................................. 102
5.3 Chemical and microbial composition of the manures and lagoon effluents ...................... 104
6 Discussion .................................................................................................................................... 107
6.1 Effect of the matrix .............................................................................................................. 108
6.2 Effect of temperature .......................................................................................................... 109
6.3 Effect of autochthonous flora ............................................................................................. 109
6.4 Formation of VBNC in manure and lagoon effluent ............................................................ 110
7 Conclusion ................................................................................................................................... 111
8 References ................................................................................................................................... 112
9 Bilan ............................................................................................................................................. 120
Chapitre 4 : Analyse transcriptomique d’une souche de L. monocytogenes isolée de lisier, après une
inoculation dans un effluent de lagune et un sol reconstitués ............................................................ 121
1 Avant-propos ............................................................................................................................... 122
2 Introduction ................................................................................................................................. 123
3 Matériel et méthodes ................................................................................................................... 125
3.1 Echantillonnage et préparation des extraits de sol et d’effluents de lagune ........................ 125
3.2 Condition de culture de L. monocytogenes .......................................................................... 126
3.3 Extraction et purification de l’ARN .................................................................................... 126
3.4 Analyse du transcriptome par RNA total sequencing (RNAseq) et analyse des données ... 127
3.5 Démarche analytique ........................................................................................................... 128
4 Résultats ...................................................................................................................................... 128
4.1 Evolution du transcriptome de L. monocytogenes CIP 110868 dans les deux matrices ...... 128
4
4.2 Gènes dont les taux de transcrits sont significativement différents dans les catégories
fonctionnelles .................................................................................................................................. 130
4.3 Analyse des gènes par sous-catégorie fonctionnelle .......................................................... 132
4.3.1 Sous-catégories fonctionnelles ayant des gènes dont les taux de transcrits ont
augmenté ou diminué ................................................................................................................. 132
4.4 Sous-catégories fonctionnelles ayant des gènes dont les transcrits ont augmenté .............. 134
4.4.1 Sous-catégorie " paroi cellulaire" ................................................................................ 134
4.4.2 Sous-catégorie "protéines de surface " ....................................................................... 135
4.4.3 Sous-catégorie "métabolisme des acides aminés " ..................................................... 135
4.4.4 Analyse des catégories fonctionnelles ayant des gènes dont les taux de transcrits sont
diminués 135
4.4.5 Sous-catégorie "transfert d’électrons" ........................................................................ 135
4.4.6 Sous-catégorie " régulation de la synthèse de protéines" .......................................... 136
4.5 Principaux déterminants de la virulence et gènes des régulons SigmaB, PrfA et CodY ...... 136
4.5.1 Déterminants de la virulence ...................................................................................... 136
4.5.2 Régulon SigmaB ........................................................................................................... 137
4.5.3 Régulon PrfA ................................................................................................................ 137
4.5.4 Régulon CodY ............................................................................................................... 138
3.1 Discussion ........................................................................................................................... 138
5 Tableaux supplémentaires ........................................................................................................... 149
Conclusion et perspectives................................................................................................................... 150
Références bibliographiques ............................................................................................................... 158
Annexe 1 - Comparison of DNA extraction kits and modification of DNA elution procedure for the quantification of subdominant bacteria from piggery effluents with real-time PCR .......................... 179
Annexe 2 - Tableau S1 : Classement des gènes dont le taux de transcrit est augmenté (après enrichissement fonctionnel) ................................................................................................................ 188
Annexe 3 - Tableau S2 : Classement des gènes dont le taux de transcrit est diminué (après enrichissement fonctionnel) ................................................................................................................ 206
5
Liste des abréviations et acronymes σA/B/C/F/H/L : Sigma A/B/C/F/H/L ABC (transporteur): ATP binding cassette ACE abundance-based coverage estimator ADN: acide désoxyribonucléique Agr: accessory gene regulator AI-2 : autoinducer-2 ALOA : agar Listeria selon Ottaviani et Agosti AMPc : adénosine monophosphate cyclique ANOVA : analysis of variance ARN : acide ribonucléique ARNm : ARN messager ARNnc : ARN non codant ARNr : ARN ribosomique BHI: brain heart infusion EFSA: European food safety authority HK: histidine kinase Hpt: histidine phosphotransfer InlA : internaline A InlB : internaline B InVS : institut national de veille sanitaire LLO: listériolysine O ORF: open reading frame OUT: operational taxonomical unit PALCAM: polymyxin-acriflavin-lithium-chloride-ceftazidime-aesculin-mannitol Pc-PLC : phosphatidyl-choline phospholipase C PCOa : principal coordinate analysis Pi-PLC : phosphatidyl-inositol phospholipase C PTS (système) : système de phosphotransférase dépendant du phosphoenolpyruvate Qiime: quantitative insights into microbial ecology QS: quorum sensing RDP : ribosomal database project RR : régulateur de réponse SAH S-adénosyl homocystéine TSB: trypton soy broth UniFrac: unique fraction of branches shared VNC : viable non cultivable
6
Liste des figures
Chapitre I
Figure 1 : Effectifs porcins en 2009
Figure 2: Les différents types de pollutions liés à l’élevage porcin (d’après Martinez et Le Bozec, 2000)
Figure 3 : Exemples de filières de traitement biologique du lisier. Les boues activées de la
filière de type I peuvent être stockées dans une fosse sans séparation de phase ou décantées, le
liquide surnageant est alors envoyé dans un bassin de rétention (lagune). Le lisier des filières
II et III subit une centrifugation. Les boues sont décantées (II) ou pressées sur un filtre (III).
Figure4 : Voies de dissémination des micro-organismes pathogènes présents dans les
effluents d’élevages porcins (adapté de McAllister et Topp, 2014).
Figure 5. Arbre phylogénétique fondé sur les séquences de l’ADNr des espèces appartenant
au genre Listeria et d’espèces appartenant au phylum des Firmicutes. L’analyse mesurant la
robustesse des branches est basée sur 500 réplicats de « bootstrap ». Les dernières espèces
décrites apparaissent en gras. D’après Weller et al. (2015).
Figure 6 : incidence de la listériose par million d’habitant en France métropolitaine (1999-2013) (source : INVS http://www.invs.sante.fr)
Figure 7 : Etapes successives de l’infection par L. monocytogenes (d’après Cossart et Toledo-
Arana (2008)
Figure 8 : Etapes successives de l’infection des cellules par L. monocytogenes. Les deux
voies d’internalisation de L. monocytogenes dans les entérocytes sont schématisées (à partir
de l’interaction InlA-E-cadhérine ou de l’interaction entre l’internaline InlB et le récepteur
Met). D’après Cossart et Toledo-Arana (2008), Hamon, et al. (2006) et Disson et Lecuit
(2013). Les protéines intervenant dans les différentes étapes sont indiquées en rouge.
Figure 9 : Schéma d’utilisation du PMA (A), Mécanisme d’action du PMA pour se lier aux
molécules d’ADN ; (B) schéma du mécanisme d’action du PMA pour la quantification des
cellules viables. D’après Nocker et al. (2006) et van Frankenhuyzen, et al. (2011).
7
Chapitre II
Fig. 1 Pareto chart of the individual, quadratic and interactive effect of PMA concentration (PMA), incubation time (Inc) and photoactivation time
(Phot) on the Δviable (a and b) and Δdead (c and d) values in samples of manure and lagoon
effluents
Chapitre III
Figure 1: Average concentrations of strains L111r (solid line) and L120r (dotted line) in
Manure-1 and Manure-2 incubated at 8 °C and 20 ° C by qPCR (), qPCRPMA () and culture
(). The bars represent minimum and maximum values of triplicates.
Figure 2: Average concentrations of strains L111r (solid line) and L120r (dotted line) in
Lagoon-1 and Lagoon-2 incubated at 8 °C and 20 ° by qPCR, qPCRPMA and culture. The bars
represent minimum and maximum values of triplicates.
Figure 3: Relative abundances of major phyla in manures (a) and lagoon effluents (b) microcosms at days T0 and T63. Only relative abundances of phylum higher than 1% are shown, all other sequences are included in “others”.
Figure 4: diversity analysis of the composition of the manures and lagoon effluents inoculated with strain L111r. The phylogenetic dataset was analyzed using Jackknifed PCoA of the weighted pairwise UniFrac distance. Manure-1 (M1) and Manure-2 (M2) at 8 °C (orange), M1 and M2 at 20 °C (red), lagoon-1 (L1) and lagoon-2 (L2) at 8 °C (pale blue), L1 and L2 at 20 °C (dark blue); triangles represent T0 ; squares represent T63.
Figure 5: Relationship between Log10 reduction of viable cells of strain L111r estimated by qPCRPMA incubated at 20 °C and the Shannon index and the numbers of observed OTUs at T63.
Chapitre IV
Figure 1 : Analyse en composantes principales réalisée sur le transcriptome de la souche de L. monocytogenes CIP 110868 inoculée en triplicats dans l’extrait de sol et l’effluent de lagune ; T0 : condition initiale, T1 : après 20 minutes, T2 après 24 heures.
Figure 2 : Diagramme de Venn représentant le nombre de gènes de L. monocytogenes CIP 110868 ayant un taux de transcription supérieur (A) ou inférieur (B) à ceux de la condition
8
initiale, après 20 minutes (T1) et 24 heures (T2) d’incubation dans l’extrait de sol (sol) et l’effluent de lagune (lagune).
Figure 3 : Diagramme de Venn représentant le nombre de gènes de L. monocytogenes CIP
110868, après enrichissement fonctionnel, ayant un taux de transcription supérieur (A) ou
inférieur (B) à ceux de la condition initiale, après 20 minutes (T1) et 24 heures (T2)
d’incubation dans l’extrait de sol (sol) et l’effluent filtré (lagune).
Figure 4 : Répartition par catégorie fonctionnelle des gènes de L. monocytogenes dont le taux
de transcrit a augmenté (A) ou diminué (B) après 20 minutes (T1) et 24 heures (T2)
d’incubation dans les microcosmes.
Figure 5 : Nombre de gènes de sous-catégories fonctionnelles
Figure 6 : nombre de gènes impliqués dans la virulence et nombre de gènes des régulons
SigmaB, PrfA et CodY dont le taux de transcrits est augmenté (A) et diminué (B) par rapport
à la condition initiale.
9
Liste des tableaux
Chapitre I
Tableau 1. Composition chimique moyenne et caractéristiques physico-chimiques des trois
fractions de lisiers issus de porcs en post-sevrage, à l’engraissement et de truies gestantes
d'après (Christensen et al., 2009).
Tableau 2 : Répartition des différents phyla retrouvé dans les effluents d’élevages porcinspar
des techniques moléculaires.
Tableau 3 : Prévalence des micro-organismes pathogènes dans les lisiers et fèces de porcs
Tableau 4 : Caractères biochimiques d'identification de L. monocytogenes d’après Don
Warbuton et al. (2012)
Tableau 5 : Structure antigénique des sérotypes de L. monocytogenes d’après Farber et
Peterkin (1991)
Tableau 6 : Principaux cas de listériose depuis 1981
Tableau 7 : Comparaison du nombre de cas et de leur gravité en Europe associés à 3 maladies
d’origine alimentaire (EFSA, 2015).
Tableau 8: Fréquences d’isolement de L. monocytogenes dans les eaux douces
Tableau 9 : Impact des traitements des effluents d’élevages sur la persistance de L.
monocytogenes
Tableau 10 : persistance de listeria sp et de L. monocytogenes dans les sols après épandage
d’effluents d’élevages.
Tableau 11 : Exemples de facteurs physico-chimiques et environnementaux induisant l’état VNC chez les bactéries).
Tableau 12 : détection des formes viables des bactéries par microscopie optique
Tableau 13 : détection des formes viables des bactéries basée sur l’activité métabolique, les
activités enzymatiques ou l’infection par des phages
10
Tableau 14 : détection des formes viables des bactéries par quantification de l’ARN et de
l’ADN
Chapitre II Table 1: Design matrix of the Doehlert uniform shell design for 3 factors and corresponding
responses
Table 2: Predicted values of the desirability function at each point conditions set for manure
and lagoon
Table 3: Physico-chemical parameters and Δviable and Δdead responses (expressed in log10
cfu-eq) after PMA pretreatment of 5 manures and 4 lagoon effluents
Table 4: Primers and probe used for L. monocytogenes quantification
Table 5: Criteria for multivariate optimization of individualresponses
Chapitre III Table 1: Sequences of primers and probes used in the study Table 2: T90 values (days) and Log10 reduction after 63 days for the two strains of L. monocytogenes (mean of 6 values) in manure and lagoon effluent microcosms maintained at 8 °C and 20 °C
Table 3: Percentage of VBNC cells among viable cells in the two strains of L. monocytogenes (mean of 6 values) at 8 °C and at 20 °C in manure and lagoon effluent microcosms at T0 and T63 days
Table 4: OTU (Operational taxonomic units), Chao 1 (species richness estimator), ACE
(abundance-based coverage estimator), and Shannon (diversity index) of samples calculated at
T0 and after 63 days of incubation for each microcosm inoculated with strain L111r
Table S1: T90 (expressed in days) and Log10 reduction after 63 days of two strains of L. monocytogenes in manure and lagoon effluent microcosms at 8 °C and at 20 °C
Table S2: Chemical composition of the two manures and lagoon effluents and concentrations
of total bacteria estimated by qPCRPMA at T0 and T63
Table S3: Phylogenetic composition of the bacterial communities in the manure and lagoon effluent microcosms inoculated with strain L111
1
Introduction générale
2
Depuis les années 1960, la production porcine européenne a fortement progressé,
conduisant à une concentration spatiale des exploitations dans certaines régions à l’exemple
de la Bretagne qui représente en tonnage 58% de la production de viande porcine française.
L’intensification des élevages et l’augmentation de leur taille ont certes permis des gains de
productivité et d’économies d’échelle à tous les niveaux de la filière porcine mais ils ont
également engendré des impacts négatifs sur l’environnement et sur la santé humaine et
animale. Les volumes importants de lisiers (12 millions de tonnes de lisiers sont produits
annuellement en Bretagne) sont ainsi à l’origine de nuisances olfactives, d’émissions
d’ammoniac et de gaz à effet de serre, d’un apport excessif de phosphore et d’azote dans les
terres agricoles et de la dissémination dans l’environnement de résidus pharmaceutiques, de
gènes de résistances aux antibiotiques et de micro-organismes pathogènes.
Afin de limiter l’apport en éléments nutritifs, des stations de traitements biologiques du lisier
ont été implantées. Celles-ci produisent (i) un refus de séparation concentré en phosphore qui
est exporté ou incinéré, (ii) des boues biologiques destinées à l’épandage, obtenues après une
étape de nitrification-dénitrification suivie d’une séparation de phase et (iii) un effluent
liquide (surnageant de la séparation de phase) stocké dans une lagune avant d’être utilisé pour
l’arrosage ou l’irrigation de cultures. Cependant, l’impact de ces stations de traitements sur
les micro-organismes pathogènes (virus, parasites et bactéries) présents dans les lisiers a fait
l’objet de très peu de travaux scientifiques.
Parmi les agents zoonotiques susceptibles d’être retrouvés dans le lisier de porcs, Salmonella,
Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica, Giardia et
Cryptospridium sont particulièrement importants en santé publique en raison de leur portage
essentiellement digestif et de leur persistance dans le milieu extérieur. Ils sont pour la plupart
responsables de gastro-entérites mais provoquent parfois des maladies graves chez l'Homme à
l'exemple de la listériose. Avec les crises sanitaires associées à la consommation de végétaux
contaminés par des bactéries pathogènes issues de déjections animales telles Listeria
monocytogenes (retrouvée dans des choux lors d’une épidémie au Canada en 1983) ou E. coli
O157:H7 (identifiée dans des épinards en 2006 aux Etats-Unis), une attention particulière a
été portée sur les risques sanitaires engendrés par la présence de micro-organismes
pathogènes dans les effluents d'élevages. Malgré la prise de conscience des pouvoirs publics
de la nécessité de considérer les risques de toxi-infections alimentaires associées à la
consommation de végétaux contaminés par des déjections animales, les données concernant la
3
présence et la circulation des bactéries pathogènes zoonotiques dans l’environnement agricole
restent encore fragmentaires.
Dans ce contexte, Irstea-Rennes a initié une étude en 2007 (Projet ESALIS financé par
l’AFSSET), qui avait pour objectif d’estimer la prévalence de deux bactéries pathogènes
(Salmonella et L. monocytogenes) dans les lisiers de 44 élevages porcins bretons et d’évaluer
l’impact des traitements biologiques appliqués aux lisiers sur ces deux bactéries pathogènes
ainsi que sur les bactéries indicatrices de traitements (E. coli et entérocoques). Cette étude a
mis en évidence une prévalence élevée des salmonelles et de L. monocytogenes qui ont été
retrouvées dans 50% et 18% respectivement, des lisiers bruts stockés en fosse et a mis en
lumière le comportement particulier de L. monocytogenes. En effet, alors que les teneurs en
entérocoques et en E. coli étaient en moyenne 1000 fois moins élevées dans les lagunes que
dans les lisiers et qu’une tendance similaire était observée pour Salmonella, la prévalence de
L. monocytogenes était plus élevée dans les lagunes que dans les lisiers (24% vs. 18%)
suggérant que celles-ci pouvaient représenter un environnement favorable à la survie de ce
pathogène ubiquiste. Au regard de ces premières données, Irstea-Rennes, en collaboration
avec l’unité HQPAP de l’Anses de Ploufragan, a poursuivi les travaux initiés par le projet
ESALIS afin de mieux comprendre la persistance de L. monocytogenes dans les effluents
d’élevages porcins. Ainsi, le premier volet du projet FEDELILAS, financé par l’ADEME, a
confirmé, par un suivi mensuel de deux élevages pendant une année, que le traitement du
lisier conduisait à un abattement de 3 log10 des concentrations en entérocoques alors qu’il
avait très peu d’impact sur L. monocytogenes. Par ailleurs, le typage moléculaire réalisé par
l’Anses de souches isolées des lisiers, des lagunes et des sols situés à proximité de celles-ci, a
montré que certains génotypes retrouvés dans la lagune et le sol n’étaient pas présents dans
les lisiers, suggérant une origine environnementale des souches.
Le second volet du projet FEDELILAS dans lequel s’inscrit intégralement le sujet de thèse
avait pour objectif de préciser les processus d’adaptation de L. monocytogenes dans le lisier et
l’effluent de lagune en comparant (i) la perte de la viabilité et la capacité à entrer dans un état
viable non cultivable (VNC) de deux souches dans ces deux matrices, et (ii) en étudiant le
transcriptome d’une souche de L. monocytogenes inoculée dans des extraits de sol et
d’effluent de lagune.
La réalisation de ces travaux a nécessité des expériences préliminaires de développement de
protocoles permettant (i) d’optimiser l’extraction de l’ADN à partir du lisier et de l’effluent de
lagune et (ii) d’adapter la méthode de quantification des formes VNC de L. monocytogenes
4
(PCR quantitative couplée au Propidium Monoazide) dans ces matrices environnementales
complexes.
Le travail présenté dans ce mémoire se décompose en quatre chapitres. Le premier chapitre
est constitué d’une synthèse bibliographique. Il permet de situer le contexte de l’étude et de
justifier les axes de recherche de la thèse. Après une caractérisation des effluents d'élevages
porcins et de leur rôle dans la dissémination des micro-organismes pathogènes, il se focalise
sur L. monocytogenes en s’attachant notamment à décrire la capacité de survie et les processus
d’adaptation de cette bactérie aux stress. Il se termine par une partie consacrée aux formes
viables non cultivables et aux techniques permettant de les mettre en évidence.
Le chapitre 2 est consacré à l’adaptation d’un protocole de quantification des formes VNC de
L. monocytogenes dans le lisier et l’effluent de lagune. Il présente les résultats d’un plan
d’expérience réalisé sur une souche de L. monocytogenes en phase exponentielle de
croissance (bactéries viables et cultivables) et ayant subi un traitement thermique létal
(bactéries mortes). L’analyse statistique décrite dans ce chapitre a permis d’optimiser les
paramètres de la PCR quantitative couplée au Propidium Monoazide (qPCR-PMA) qui ont été
testés sur différents lisiers et effluents de lagune.
Le chapitre 3 présente la survie de deux souches de L. monocytogenes, isolées d’effluents
d'élevages porcins, inoculées dans quatre matrices (deux lisiers et deux effluents de lagunes)
incubées à 8°C et 20°C. Il décrit la persistance des formes VNC (estimées par qPCR-PMA) et
des formes cultivables (estimées par un ensemencement d’un milieu de culture) et compare
les caractéristiques chimiques et microbiologiques des matrices, susceptibles d’influencer la
formation des formes VNC de L. monocytogenes.
Le chapitre 4 aborde la persistance de L. monocytogenes par une approche transcriptomique.
L’analyse du transcriptome présentée dans ce chapitre vise à étudier les processus
d’adaptation mis en œuvre par une souche de L. monocytogenes isolée d’un lisier lorsqu’elle
est en contact avec un extrait de sol ou d’effluent de lagune.
Le manuscrit se termine par des conclusions générales et des perspectives du travail de thèse.
5
Chapitre 1 : Etude bibliographique
6
1 L’élevage porcin, source d’effluents valorisables, mais aussi réservoir de
micro-organismes pathogènes Les effluents d’élevages représentent 95 % des produits résiduaires organiques épandus
sur les terres agricoles françaises. Selon un rapport de Biomasse-Normandie de 2002, les flux
annuels des effluents d’élevages s’élevaient à 6 millions de m3 pour les élevages avicoles et à
19 et 18 millions de m3 pour les élevages bovins et porcins, respectivement. Dans cette partie
de l’étude bibliographique, nous nous attacherons à décrire les exploitations porcines dont les
volumes des effluents représentent de l’ordre de 42% des flux émis par l’ensemble des
élevages.
1.1 L’élevage porcin en France
Depuis les années 1960, le développement de l’élevage intensif a entraîné une augmentation
de la production porcine, conduisant à une concentration des exploitations dans certaines
régions. En 2010 la France comptait 22 300 élevages porcins totalisant 14,8 millions de porcs
et détenait 9,7% du cheptel européen (IFIP, FranceAgriMer 2010). Les trois quarts du cheptel
porcin sont localisés dans le Grand-Ouest (Bretagne, Pays de la Loire et Basse-Normandie), la
Bretagne représentant à elle seule plus de la moitié de la production nationale (Figure 1).
Entre 2000 et 2010, la région a perdu près d’un élevage de porcs sur quatre mais l’effectif
moyen par exploitation est passé de 1 130 porcs en 2000 à 1 420 en 2010.
Figure 1 : Effectifs porcins en 2009 (source : FranceAgriMer, 2010)
Trois types d’élevages sont répertoriés en fonction de leur mode de gestion des animaux.
- Elevages sur caillebotis. Ils représentent 95% des exploitations. Les animaux sont élevés
dans des bâtiments dont le sol est constitué d’un plancher ajouré en métal ou en béton,
permettant une évacuation rapide des déjections, des résidus alimentaires et des eaux de
7
lavages dans une pré-fosse située en dessous du bâtiment. Le stockage en pré-fosse, de
quelques semaines, précède un stockage en fosse à l’extérieur du bâtiment.
- Elevages en bâtiment sur litière. Ils représentent environ 5% des élevages. Le sol est
bétonné et recouvert d’une litière généralement constituée de paille mais qui peut être
composée de sciure ou de copeaux de bois. La litière est changée régulièrement afin de
conserver un espace suffisamment propre pour les animaux. Ce système d’élevage produit des
quantités de fumier qui dépendent du volume ou de la fréquence de la litière apportée.
- Elevages en plein air. Ce type d’élevage, anecdotique en France, représente 0,05 % des
exploitations. Les animaux sont élevés à l’extérieur et disposent d’abris paillés à l’intérieur
avec une toiture en tôle qui les protègent des intempéries et du soleil. Ces élevages, limités
par la surface disponible, génèrent un volume peu élevé de déjections qui ne sont
généralement pas traitées.
Par ailleurs, les éleveurs peuvent choisir entre trois spécialisations:
- Naisseur : élevage de truies, de verrats et de porcelets jusqu’à leur sevrage.
- Engraisseur : élevage de porcelets sevrés (fournis par un élevage de naisseurs) et production
de porcs charcutiers.
- Naisseur-engraisseur : il assure toutes les étapes de l’élevage, de la naissance des porcelets à
l’engraissement des porcs charcutiers.
Lors du recensement des exploitations porcines en 2010, 52% des éleveurs de porcs en
Bretagne étaient naisseurs-engraisseurs, 46 % engraisseurs et 2 % naisseurs.
1.2 Le Lisier
1.2.1 Composition chimique du lisier porcin
Le lisier porcin est un mélange constitué d’urine, de fèces, de refus d’alimentation et d’eaux
de lavages. Lorsqu’il est stocké en fosse à ciel ouvert, l’eau de pluie entre également dans sa
composition. Le volume de lisier produit par les élevages fluctue en fonction du type
d’exploitation et du stade physiologique de l’animal, du système d’alimentation et
d’abreuvement. A titre d’exemple, dans les élevages naisseurs-engraisseurs de 100 truies, le
volume de lisier est d’environ 1,8 L/j pour les porcelets en post-sevrage, de 3,7 pour les porcs
en engraissement et atteint 16 L/j pour les truies allaitantes (Levasseur, 1998 ; Levasseur et
al., 1998 ; Rousseau, 2009).
8
Les lisiers porcins peuvent être décomposés en trois fractions (Christensen et al., 2009):
- une fraction particulaire composée de solides en suspension dont la taille, généralement
supérieure à 60 µm, peut atteindre quelques centimètres;
- une fraction colloïdale constituée de flocs organiques de taille comprise entre 10 nm et 1
µm;
- une fraction dissoute qui contient les acides organiques et des ions inorganiques.
La composition de trois types de lisiers issus de porcs en post sevrage et à l’engraissement
ainsi que de truies gestantes est présentée dans le Tableau 1.
Tableau 1. Composition chimique moyenne et caractéristiques physico-chimiques des trois
fractions de lisiers issus de porcs en post-sevrage, à l’engraissement et de truies gestantes
d'après Christensen et al. (2009).
Paramètres Post-sevrage Engraissement Truies gestantes
particulaire colloïdal dissous particulaire colloïdal dissous particulaire colloïdal dissous Matière sèche (g/kg) 42 ±5§ 3 ±1 14 ±<1 50 ±7 2 ±2 12 ±1 20 ±4 1 ±1 7,2 ±<1 Matière volatile (g/kg) 36 ±4 2 ±1 6,6 ±<1 40 ±7 2 ±2 5 ±1 15 ±4 1 ±1 3,2 ±<1 Matière minérale (g/kg) 6 ±1 0 ±1 8 ±<1 11 ±1 0 ±1 6 ±1 5 ±1 0 ±1 3,9 ±<1
Glucides (g/kg) 3 ±1 0,2 ±0,03 0,3 ±0,01 12 ±6 0,2 ±0,1 0,18 ±0,03 5 ±1 0,05 ±0,08 0,1 ±0,03 Acides humiques (g/kg) 10 ±4 1,1 ±0,9 5,1 ±0,4 8 ±3 1 ±1 4,1 ±0,4 3 ±1 0,4 ±0,7 2,2 ±0,3
Protéines (g/kg) 4 ±3 2,3 ±0,6 1,1 ±0,3 3 ±4 1,7 ±0,7 0,8 ±0,2 2 ±1 0,7 ±0,4 0,7 ±0,2
N-Kjeldal (g/kg) 1,1 ±0,2 0,2 ±0,1 3,5 ±0,8 1,7 ±0,4 >0,1 3,5 ±0,8 1,2 ±0,3 >0,1 4,5 ±1
NH4+ (gN/kg) 4,4 ±0,3* 4,4 ±0,2* 3,3 ±0,1*
P total 0,6 ±0,2 0,03 ±0,01 0,2 ±0,1 0,8 ±0,3 0,02 ±0 0,1 ±0 0,4 ±0,1 >0,01 0,04 ±0,01
P-PO43-(gP/kg) 0,2 ±0,04* 0,1 ±0,01* 0,05 ±0,01*
Ca (mg/kg) 1100 ±200 10 ±30 270 ±10 3000 ±300 40 ±70 260 ±30 1400 ±300 10 ±50 170 ±20
Mg (mg/kg) 510 ±50 10 ±20 150 ±10 480 ±30 10 ±30 60 ±20 290 ±50 2 ±9 26 ±5 Acides gras volatiles (g/kg) 17,8 ±0,2* 9,6 ±0,4* 2,55 ±0,05*
pH 6,7 ±0,2* 7,2 ±0,2* 7,7 ±0,2* *Valeur dans le lisier brut non séparé, § écart type
Les lisiers de porcs possèdent des caractéristiques chimiques et physico-chimiques très
variables qui dépendent des stades physiologiques des animaux ainsi que du type
d’alimentation. Leur composition évolue aussi avec la durée de stockage (Peu et al., 2007) et
les modes de conduite de l’élevage. Quel que soit le type d’exploitation, le lisier contient des
9
teneurs en éléments minéraux et en matière organique suffisamment élevées qui lui confèrent
une valeur fertilisante et une valeur amendante organique.
1.2.2 Contamination chimique
Les effluents d’élevages porcins sont à l’origine de plusieurs types de pollutions comprenant
les émissions gazeuses et les transferts de composés chimiques et biologiques dans les sols et
les eaux (Figure 2).
Figure 2: Les différents types de pollutions liés à l’élevage porcin (d’après Martinez et Le Bozec, 2000)
La matière organique se transforme lors du stockage du lisier en sous-produits qui participent
à l’émission de mauvaises odeurs à l’exemple de l’hydrogène sulfuré (H2S), de l’ammoniac
(NH3), des acides organiques et des aldéhydes. Certains composés gazeux tels que le H2S, le
NH3, le protoxyde d’azote (N2O) et le méthane (CH4), émis au cours de la production ou de
l’utilisation du lisier, sont particulièrement préoccupants. Le NH3, issu de la dégradation de
l’urée, des acides uriques et des protéines est impliqué dans la production de pluies acides. Le
N2O, formé lors des processus de nitrification-dénitrification et le CH4, produit terminal de la
décomposition anaérobie de la matière organique, sont des gaz à effet de serre.
Le lisier peut être l'origine de la contamination chimique des sols et des eaux via les pratiques
d'épandage. Les composés susceptibles de contaminer l’environnement comprennent des
éléments traces métalliques et organiques ainsi que des éléments nutritifs (phosphore, azote).
Parmi les éléments traces métalliques, le Cu et le Zn, additifs de l’alimentation porcine, sont
N2O, CH4
Pathogènes
Odeurs
NH3
Eutrophisation
DBO, PO42-
Accumulation du cuivre et du zinc
CO(NH2)2 + H2O NH3
uréase
Urée
Bactéries nitrifiantes
NO3-
Epandage
Réchauffement globalPluies acides
Tonne à lisier
Odeurs
NH3
fosse
H2S, NH3
N2O
10
présents à de fortes teneurs dans le lisier de porc. Les pertes par lixiviation, érosion ou
transfert aux plantes sont plus faibles que l’apport de ces deux éléments par les épandages,
conduisant à une augmentation graduelle de leurs concentrations dans les sols amendés par du
lisier (ESCO MAFOR, 2014). Le lisier peut également contenir des composés traces
organiques (détergents, produits pharmaceutiques, hormones…) dont l’accumulation dans le
sol dépend de leurs caractéristiques intrinsèques de persistance. Les contaminants persistants
sont peu ou pas dégradés et peuvent s’accumuler dans le sol. A l’opposé, les contaminants
non persistants disparaissent rapidement en raison d’une dégradation de la molécule, ou d’un
transfert en profondeur ou par ruissellement.
Lorsque les quantités de phosphore apportées par l’épandage dépassent les besoins des
cultures, celui-ci s’accumule dans les sols. Son transfert dans les eaux de surface lors
d’épisodes pluvieux est à l’origine des phénomènes d’eutrophisation particulièrement
importants dans de nombreux plans d’eau, rivières et zones côtières de Bretagne. Peu
représentés dans les lisiers, les nitrates se forment dans le sol après l’épandage sous l’action
de bactéries nitrifiantes qui transforment l’azote ammoniacal en nitrites et en nitrates. Ces
derniers, plus solubles que l’ion ammonium, sont entraînés par lessivage et ruissellement dans
les eaux.
Les nitrates ont fait l’objet d’une réglementation européenne parue en 1991. La directive
européenne 91/676/CEE dite "directive nitrate", transcrite en droit Français par le Décret n°
93-1038, a pour objectif de réduire la pollution des eaux par les nitrates d’origine agricole. Le
décret définit les zones d’excédent structurel d’azote "lorsque la quantité totale d’effluents
d’élevages produite annuellement conduit, si elle est épandue en totalité sur les surfaces
épandables du canton, à un apport annuel d’azote supérieur à 170 kg par hectare de cette
surface épandable". En 2009, sur les 201 cantons bretons, 90 étaient classés en zones
d’excédents structurels. Outre les les seuils d’azote à respecter, le décret fixe les modalités de
traitement du lisier ainsi que des modalités de transfert du lisier en cas d’excédents.
1.2.3 Filière de traitement des lisiers porcins
Pour respecter la réglementation, les exploitants ont accru leurs capacités de stockage du
lisier. Dans 95 % des sites de production, la durée d'autonomie de stockage est supérieure à 4
mois. De plus, des filières de traitements du lisier de porcs ont été mises en place afin de
11
respecter les valeurs limites en azote fixées par la réglementation européenne, de limiter
l’apport de phosphore dans l’environnement, de stabiliser les effluents ou de produire de
l’énergie. La Bretagne, en raison de ses nombreuses zones en excédent structurel concentre à
elle seule 85% des unités de traitement (Levasseur et Lemaire, 2003). Celles-ci se répartissent
en trois types : le procédé par boues activées, le compostage et la méthanisation.
1.2.3.1 Traitement biologique par boues activées
Ce procédé qui est le plus courant (80% des unités de traitement), vise à réduire la charge
organique et la charge azotée. La matière organique est dégradée par des bactéries
hétérotrophes et l’azote est transformé par des bactéries nitrifiantes et dénitrifiantes. Les
boues activées, procédés de culture libre en suspension, maximisent le contact entre les
bactéries et la matière organique, permettant une optimisation de la dégradation du lisier. Le
procédé de boues activées s’intègre dans une chaîne de traitement comprenant le plus souvent
une étape d’élimination du phosphore. Associé à un pré-traitement du phosphore, la filière par
boues activées permet d’abattre de l’ordre de 60 % à 70% de l’azote du lisier brut et
d’exporter jusqu’à 85 % du phosphore (Pigeon, 2010). Le traitement du lisier comprend
plusieurs étapes dont certaines sont facultatives (figure 3).
Figure 3 : Exemples de filières de traitement biologique du lisier. Les boues activées de la filière de type I peuvent être stockées dans une fosse sans séparation de phase ou décantées, le liquide surnageant est alors envoyé dans un bassin de rétention (lagune). Le lisier des filières II et III subit une centrifugation. Les boues sont décantées (II) ou pressées sur un filtre (III).
lagune
lagune
lagune
pressage
épandage
boues pressées
traitement biologique(boues activées)
épandage
décantation
décantation
fosse tamponstockage
épandage
refus solides
centrifugationséparation du P
N2
Bâtiment
filière I
Bâtiment traitement biologique(boues activées)
(filière II)
fosse tampon
filières II et III
(filière III)
N2
exportation
12
Le lisier est homogénéisé dans une fosse. Un pré-traitement mécanique permet d’éliminer une
partie du phosphore. La séparation de phase (réalisée en général par centrifugation) produit
une fraction liquide ainsi qu’un refus solide riche en phosphore destiné à l’exportation. Le
lisier brut ou la fraction liquide du lisier est envoyée dans un bassin alternant des phases
aérobies et anoxiques afin d’éliminer l’azote sous forme N2. Le produit ainsi traité est séparé
en deux fractions par décantation ou filtration. Les boues issues de la séparation sont stockées
en fosse avant d’être épandues. La fraction liquide est stockée dans une lagune avant de servir
pour l’irrigation des cultures.
1.2.3.2 Le compostage
Moins utilisé pour le traitement du lisier que le procédé à boues activées, le compostage
permet de stabiliser la matière organique, de réduire les odeurs et de diminuer les teneurs en
micro-organismes pathogènes. Il conduit à la formation d’un produit solide stabilisé, riche en
composés humiques et hygiénisé par la montée en température. Il requiert toutefois l’apport
de co-substrats utilisés comme structurants à l’exemple de la paille. De plus, s’il permet une
élimination de l’azote organique en N2, il produit également du NH3 et des oxydes d’azote
(N2O, NO) (Bonneau et al., 2008 ; Chen et al., 2015 ; Zhu-Barker et al., 2015).
1.2.3.3 La digestion anaérobie
C’est un procédé de traitement en plein essor, notamment en Bretagne qui comptait en janvier
2014, tout type d’effluent confondu, 41 unités de production. Les unités de méthanisation
traitant le lisier de porcs fonctionnent en mésophilie (35-38°C). Elles visent à produire de
l'énergie sous forme de biogaz et un digestat recyclable utilisé comme fertilisant.
Il convient de souligner qu’à l’exception du compostage, le procédé par boues activées et la
digestion anaérobie mésophile ont de faibles rendements épuratoires vis-à-vis des micro-
organismes pathogènes (Pourcher et al., 2012 ; Viancelli et al., 2013).
1.3 Microbiologie du lisier
Les études consacrées à la microbiologie des lisiers de porcs concernent, d’une part, les
communautés majoritaires et, d’autre part, les micro-organismes pathogènes.
1.3.1 Flore bactérienne dominante
Le lisier de porcs contient de l’ordre de 109-1011 bactéries / mL (Leung and Topp, 2001; Cotta
et al., 2003), réparties dans trois principaux phyla (Firmicutes, Proteobacteria et
Bacteroidetes) (Leung et Topp, 2001 ; Snell-Castro et al., 2005 ; Peu et al., 2006). Bien que
13
ces trois phyla soient systématiquement retrouvés (tableau 2), leurs proportions varient d’une
étude à l’autre. Ces fluctuations peuvent s’expliquer par les traitement appliqués aux lisiers
(Duan et al., 2014), l’état physiologique des animaux (Brooks et al., 2014) et leur mode
d’alimentation (Lu et al., 2014) ou par la saison (Cook et al., 2010).
Tableau 2 : Répartition des différents phyla retrouvés dans les effluents d’élevages porcins.
Lu et al. (2014)
Duan et al. ( 2014) Cook et
al.
(2010)
Brooks et al. (2014) c
Type de lisier Lisier de porcs adultes (NA)a
Lisier de porcelets (NA)b
Lisier de porcs adultes (A)
Lisier de porcelets (A)
croûtes superficielles de lisier de porcs, avec paille
croûtes superficielles de lisier sans ajout de paille
Lisier de porcs stocké en lagune
Lisier de porcs stocké en lagune
Lisier de porcelets stocké en lagune
Lisier de truies, stocké en lagune
phyla
Bacteroidetes 45,2% 65,2% 52,7% 75,2% 23,8% 20,6% 45% 15%* 35% 25%
Firmicutes 43,2% 30,3% 44,3% 22,9% 11,7% 2,7% 65% 40% 20% 30%
Spirochaetes 6,2% 2,3% 0,2% 0 0,2% <0,1% - - - -
Proteobacteria 1,3% <0,1% 0,62% 0,32% 60,0% 72,8% - 20% 40% 40%
Tenericutes 0,2% 0,7% 0,5% 0,2% <0,1% <0,1% - - - -
Actinobacteria 0,1% 0,3% 0,3% 0 0,4% <0,1% - 5% 2% -
a nourris sans additif ; b nourris avec additifs ; cles données ont été estimées d’après les histogrammes présentés dans la publication
1.3.2 Flore pathogène des lisiers
Les micro-organismes pathogènes susceptibles d’être retrouvés dans le lisier de porcs se
répartissent parmi les bactéries, les virus, les protozoaires et les helminthes. Les travaux
scientifiques portent essentiellement sur les agents pathogènes connus pour être responsables
de zoonoses : Salmonella, Listeria monocytogenes, Campylobacter jejuni, Campylobacter
coli, Yersinia enterocolitica, Cryptosporidium, Giardia, helminthes, virus de l’hépatite E
(tableau 3). Leurs fréquences de détection, très variables, peuvent atteindre plus de 80% des
élevages comme cela a été observé pour Salmonella (McLaughlin et al., 2009), Yersinia
enterocolitica (Letourneau et al., 2010), Campylobacter jejuni (Chinivasagam et al., 2004),
Cryptosporidium, Giardia (Maddox-Hyttel et al., 2006), les helminthes (Bornay-Llinares et
al., 2006), et le virus de l’hépatite E (Garcia et al., 2014).
14
Tableau 3 : Prévalence des micro-organismes pathogènes dans les lisiers et fèces de porcs
Micro-organisme Pays (province ou région)
Nb élevages
Prévalence (%)
Références
Salmonella Allemagne 380 1,6 Holzel et Bauer (2008) Australie 13 31 Chinivasagam et al. (2004) Canada (Québec) 32 37 Cote et al. (2006) France (Bretagne) 44 50 Pourcher et al. (2012a) Canada (Eastern) 11 54.5 Letourneau et al. (2010) Etats Unis 18 57,3 Rodriguez et al. (2006) Irlande 14 71,4 Watabe et al. (2003) Canada (Ontario) 31 77b Farzan et al. (2010) Etats Unis 37 89 McLaughlin et al. (2009) Irlande 30 50 Mc Carthy et al. (2014) Listeria monocytogenes France (Bretagne) 44 18 Pourcher et al. (2012a) Canada (Ontario) 11 27b Farzan et al. (2010) Yersinia enterocolitica Irlande 14 0 Watabe et al. (2003) Canada (Québec) 32 9 Cote et al. (2006) Canada (Ontario) 31 48b Farzan et al. (2010) Canada (Eastern) 11 91 Letourneau et al. (2010) Campylobacter coli Canada (Ontario) 31 18b Farzan et al. (2010) Campylobacter jejuni Angleterre 126 11,9 Hutchison et al. (2004a) Australie 13 84,6 Chinivasagam et al. (2004)
Cryptosporidium Canada (Québec) 32 3 Chinivasagam et al. (2004) Espagne 13 53 Reinoso et Becares (2008) Canada (Ontario) 122 44,3 à 55,7c Farzan et al. (2011) Canada (Eastern) 11 36,4 Letourneau et al. (2010) Irlande 33 43,7 Xiao et al. (2006) Giardia Canada (Ontario) 49 84a Maddox-Hyttel et al. (2006) Espagne 13 7 Reinoso et Becares (2008) Canada (Ontario) 122 50,8 à 66,4c Farzan et al. (2011) Canada (Eastern) 11 63,6 Letourneau et al. (2010)
helminthes Espagne 5 100 Bornay-Llinares et al. (2006) Espagne 13 38 Reinoso et Becares (2008) hépatite E (VHE) France 7 71b Pavio et al. (2008) Etats-Unis 22 68 Kasorndorkbua et al. (2005) Canada (Québec) 70 34 Ward et al. (2008) Angleterre 9 22 McCreary et al. (2008) Etats-Unis 5 3 Kase et al. (2009) Espagne 5 80 Garcia et al.,(2014) b prélèvements de lisiers ou de fèces ; c selon deux méthodes (microscopie et PCR)
La forte disparité des fréquences de détection des micro-organismes pathogènes peut être
attribuée à des facteurs liés à l'élevage (âge et état de santé des animaux, respect des règles
d'hygiène, localisation géographique, mode de gestion des effluents) mais aussi à la
méthodologie employée par les scientifiques pour acquérir les données (nombre d'élevages
analysés, stratégie d'échantillonnage, techniques de détection des micro-organismes). Ainsi, la
différence de prévalence de Salmonella (1,6% et 89%) entre les études menées par Holzel et
15
Bauer, (2008) et McLaughlin et al. (2009) peut être expliquée par le nombre d’élevages
étudiés (380 vs 37), la localisation géographique (Etats Unis vs Allemagne) ainsi que par le
type de lisier analysé (lisier stocké 6 à 12 mois vs lisier frais). Il existe peu de données
bibliographiques disponibles sur les concentrations en agents pathogènes dans les lisiers de
porcs en raison des techniques de recherche de ces micro-organismes qui sont majoritairement
qualitatives (présence / absence). Les données publiées concernent surtout Salmonella dont
les concentrations, en général faibles (de 0,03 à 160 bactéries / g ou mL de lisier) (Hill et
Sobsey, 2003 ; Fablet et al., 2007 ; McLaughlin et al., 2009; Pourcher et al., 2012), peuvent
atteindre 104 bactéries/ g de lisier (Hutchison et al., 2004a; Vanotti et al., 2005).
1.3.3 Voies de dissémination des micro-organismes pathogènes issus des effluents
d'élevages porcins dans l’environnement
Bien que les micro-organismes pathogènes soient en faible concentration dans les lisiers, ils
représentent un risque pour la santé humaine et animale via leur dissémination dans les sols
agricoles. En effet, la contamination des végétaux et des eaux peut avoir pour origine
l’épandage de lisier (figure 4). Les micro-organismes se retrouvent sur les végétaux lors de
l’aspersion des effluents. Ils peuvent également être transférés par des phénomènes de
ruissellement et de lixiviation dans les eaux souterraines et dans les eaux de surface lors
d’épisodes pluvieux, notamment lorsque ceux-ci surviennent juste après l’épandage. Les
animaux d’élevages ainsi que la faune sauvage (oiseaux, rongeurs, insectes,…) qui se
contaminent par un contact direct avec le lisier épandu sur les sols et les prairies, ou
indirectement lors de l’abreuvement dans des eaux contaminées, peuvent à leur tour
disséminer les agents pathogènes dans l’environnement. Il est à noter que l’épandage des
effluents d'élevages ne représente pas la seule source de contamination microbiologique des
eaux, les rejets des effluents des stations d'épuration urbaines contribuant également à la
dissémination des agents pathogènes dans les eaux de surface.
16
Figure 4 : Voies de dissémination des micro-organismes pathogènes présents dans les
effluents d’élevages porcins (adapté de McAllister et Topp, 2014).
La persistance des micro-organismes dépend de facteurs intrinsèques au micro-organisme et
de facteurs environnementaux (température, taux d’humidité, pH, taux de matière organique,
compétition et prédation, …) ce qui explique la variabilité des durées de survie des bactéries
pathogènes rapportées dans la littérature. Ainsi dans le sol, Salmonella persiste de 16 à 84
jours, Campylobacter de 4 à 56 jours et L. monocytogenes de 8 à 128 jours (Nichloson et al.,
2005 ; Mc Allister et Topp, 2014). Il ressort néanmoins des études que L. monocytogenes
persiste plus longtemps que Salmonella, E. coli et Campylobacter jejuni dans les effluents
d'élevages et dans le sol (Hutchison et al., 2005 ; Nicholson et al., 2005 ; Grewal et al., 2007 ;
Klein et al., 2011). La gravité de la maladie engendrée par L. monocytogenes, sa capacité
d’adaptation à différents environnement, sa présence dans les aliments crus d'origine animale
et végétale expliquent l’attention particulière qui a été portée sur la présence et l’état
physiologique de ce pathogène dans l’environnement agricole.
Station de potabilisation
Ruissellement
Contamination des eaux de surface
Contamination des eaux souterraines
Station d’épuration
Epandage
Élevage intensif
Contamination des animaux d’élevage et de la faune sauvage
Végétaux
Lixiviation
Eaux récréatives
Eaux usées
Humains
Stockage / et ou traitement du lisier
Prairies
Eau de boisson
17
2 Listeria monocytogenes, bactérie pathogène ubiquiste
2.1 Description de Listeria monocytogenes
2.1.1 Découverte de L. monocytogenes
La première observation de listériose humaine documentée remonte à 1918 lorsque
Dumont et Cotoni ont isolé en France une bactérie du liquide céphalo-rachidien d'un soldat
atteint d'une méningite (Cotoni, 1941 ; Dumont et Cotoni, 1921). En 1929, au Danemark, une
bactérie similaire a été isolée par Nyfeldt de trois malades atteints de mononucléose (Gray et
Killinger, 1966). A partir de 1926, des cas de listériose animale sont également décrits.
Murray et al. (1926) ont ainsi isolé un bacille à partir de lapins morts dans un laboratoire
britannique. Un an plus tard, Pirie (1927) a isolé en Afrique du Sud à partir de gerbilles
mortes une bactérie similaire à celle décrite par l’équipe de Murray. D'autres cas humains de
listériose ont été signalés de façon sporadique au cours des 20 années qui suivirent ces
descriptions (Seeliger, 1961), mais jusqu'en 1950, seulement 70 cas de listériose humaine ont
été rapportés (Seeliger, 1972). Les cas sporadiques de listériose humaine sont associés le plus
souvent à des personnes travaillant au contact d'animaux morts (Cain et McCann, 1986).
Listeria, décrite sous le nom de Bacterium monocytogenes par Murray et al. (1926), est
devenue Listerella jusqu'en 1939 (Pirie., 1929). Ce n'est qu'en 1940 que le nom actuel de
Listeria monocytogenes a été retenu par les "approved lists of bacterial names" (Gray et
Killinger, 1966). Pendant longtemps, ce genre n'était représenté que par une seule espèce :
Listeria monocytogenes. Dans les années 80, des épidémies alimentaires résultant de la
contamination d'aliments par Listeria monocytogenes ont étaient répertoriées (Schlech et al.,
1983; Cossart et Mengaud, 1989). L’étude de L. monocytogenes et la lutte contre la listériose
est donc devenue une priorité pour les pouvoirs publiques ainsi que pour les acteurs des
industries agro-alimentaires.
2.1.2 Classification du genre Listeria
Le genre Listeria comprend actuellement 17 espèces (figure 5). Il est constitué de bactéries à
Gram positif appartenant au phylum des Firmicutes, à la classe des Bacilli, à l’ordre des
Bacillales et à la famille des Listeriaceae.
Historiquement, la caractérisation génomique et moléculaire du genre Listeria a
principalement porté sur le pathogène humain L. monocytogenes ainsi que sur un nombre
restreint d’espèces génétiquement proches de L. monocytogenes : L. ivanovii (pathogène des
18
animaux), L. innocua, L. welshimeri, L. seeligeri. Ces cinq espèces ainsi qu’une espèce plus
récemment décrite, L. marthii (isolée de sols et d’eaux) (Graves et al., 2010) sont capables de
se développer dans des vertébrés supérieurs. Toutes sont connues comme étant des Listeria
stricto-sensu (Chiara et al., 2015).
Figure 5 : Arbre phylogénétique (obtenu par la méthode du maximum de vraisemblance) basé sur les séquences d'acides aminés de 325 séquences du core génome des membres du genre Listeria. L’analyse mesurant la robustesse des branches est fondée sur 250 répliquats de bootstrap; 70% ne sont pas affichées. Les nouvelles espèces sont indiquées en caractères gras. Barre : 0,1 substitutions d'acides aminés par site. D’après Weller et al. (2015).
Onze autres espèces, non pathogènes, sont plus éloignées de L. monocytogenes. Celles-ci
comprennent notamment une espèce isolée en 1971 de la végétation, L. grayi (Welshimer et
Meredith, 1972), dont l'appartenance au genre Listeria a été remise en question sur la base des
caractères phénotypiques (variation dans la structure antigénique) et génotypiques (CG% plus
élevé et faible homologie de l'ADN). Les 10 autres espèces ont été recemment découvertes ou
appartenaient au genre Brochothrix (Weller et al., 2015). L. fleischmannii, subdivisée en deux
sous-espèces L. fleischmannii subsp. fleischmannii et L. fleischmannii subsp. coloradenisis
(isolées de fromage et d'environnements agricoles), L. floridensis et L. aquatica (isolées d’eau
de surface) (den Bakker et al., 2014), sont génétiquement proches de L. grayi (Weller et al.,
2015). L. rocourtiae (isolée de végétaux) (Leclercq et al., 2010), L. cornellensis, L. riparia et
L. grandensis (isolées du milieu agricole et de l'eau) (den Bakker et al., 2014), L.
weihenstephanensis (isolée de végétation aquatique) (Halter et al., 2013; den Bakker et al.,
2014), L. booriae (isolée de fruits de mer) (Weller et al., 2015) et L. newyorkensis (isolée
19
d’une usine de transformation du lait) (Weller et al., 2015) constituent le clade basal du genre
(Chiara et al., 2015).
2.1.3 Caractères d'identification bactériologique
L. monocytogenes est un petit bacille Gram positif, à bouts arrondis de 0,5 à 2 µm de longueur
pour environ 0,5µm de diamètre, parfois de forme coccobacillaire, pouvant s'associer en
palissades ou courtes chaînettes. Dans les cultures en phase stationnaire ou âgées la bactérie
peut former des filaments. Elle est non sporulée et non capsulée. Mobile entre 20°C et 25°C
grâce à un système de 5 à 6 flagelles péritriches, elle perd sa mobilité à 37°C. L.
monocytogenes est une bactérie aéro-anaérobie facultative, catalase positive et oxydase
négative (Low et Donachie, 1997)
Lorsqu’elle est cultivée sur une gélose nutritive, L. monocytogenes forme des colonies de 1 à
2 mm de diamètre, translucides aux bords réguliers, apparaissant bleu/vert lors d'un éclairage
oblique. Elle se développe dans une gamme de pH allant de 4 à 9. Cette bactérie mésophile
dont la croissance optimale se situe entre 30 et 37°C, peut se développer à des températures
proches de 0°C. L. monocytogenes tolère une concentration en NaCl de 10% (Low et
Donachie, 1997). Les caractères d'identification de L. monocytogenes sont regroupés dans le
tableau 4.
Tableau 4 : Caractères biochimiques d'identification de L. monocytogenes d’après Don
Warbuton et al. (2012) Test Résultats Test Résultats
hémolyse β +a Production d’acide à partir de CAMP test mannitol - Staphylococcus aureus + D-ribose - Rhodococcus equi V glucose 1 phosphate - esculine
+ D-tagatose -
H2S - D- xylose - indole - L- rhamnose + nitrate réductase - α-methyl-D-mannoside + uréase - gélatinase -
a ≥ + 90% des souches sont positives ; - 90% des souches sont négatives ; V variable
Les méthodes d'isolement à partir de matrices environnementales telles que les boues de
station d'épuration, les lisiers ou le sol comprennent obligatoirement une étape
d’enrichissement réalisée généralement en bouillon de Fraser ou dans un milieu de
20
composition proche de celui-ci, incubé à une température de 30°C ou 37°C pendant 24 à 48h.
L’identification des bactéries est ensuite réalisée par un isolement à partir des bouillons
d’enrichissement sur des géloses sélectives du genre Listeria (gélose PALCAM ou Oxford)
ou de l’espèce L. monocytogenes (gélose ALOA -Agar Listeria selon Ottaviani et Agosti- ou
Rapid L'mono) incubées à 37°C pendant 24 à 48h.
Les milieux PALCAM et Oxford permettent, grâce à une association du chlorure de lithium et
d’antibiotiques d’inhiber la microflore de contamination, et de reconnaître les colonies de
Listeria par l'hydrolyse de l'esculine en glucose et en esculétine. Ce dernier composé forme un
complexe noir en présence des ions ferriques apportés par le citrate de fer. Les géloses ALOA
et Rapid L'mono contiennent des substrats chromogéniques permettant de différencier L.
monocytogenes des autres espèces de Listeria. Sur le milieu ALOA, les Listeria forment des
colonies de couleur bleue (détection de la -glucosidase). Les colonies de Listeria
monocytogenes présentent en plus un halo opaque lié à l'activité d'une phospholipase
impliquée dans le processus infectieux de cette bactérie. La sélectivité est obtenue par l'action
combinée du chlorure de lithium et des antibiotiques et antifongiques contenus dans le milieu.
Le milieu Rapid’L mono contient également des agents sélectifs permettant de limiter le
développement de la flore contaminante. Les colonies de L. monocytogenes apparaissent
bleues par l’activité de la phospholipase C. Leur incapacité à fermenter le xylose permet de
les différencier de L. ivanovii qui forme des colonies bleues avec un halo jaune.
2.1.4 Caractères sérologiques de L. monocytogenes.
L’espèce L. monocytogenes est divisée 13 sérotypes dont l’identification est fondée sur la
recherche d’antigènes somatiques (O) et flagellaires (H) (tableau 5). Douze antigènes O,
thermostables, très variables entre les sérotypes, ont été décrits. Les variations observées
parmi les antigènes O sont associées à la biochimie des acides téichoïques du peptidoglycane
(den Bakker et al., 2014). Quatre antigènes H, thermolabiles, sont considérés comme
conservés dans la majorité des sérotypes de L. monocytogenes (den Bakker et al., 2014).
Depuis 2005, le Centre National de Référence (CNR) des Listeria utilise une méthode PCR
par réaction multiplex sur 5 gènes qui permet de classer les souches en 5 sérogroupes : IIa
(sérotypes1/2a et 3a), IIb (sérotypes 1/2b et 3b), IIc (sérotypes 1/2c et 3c), IVb (sérotypes 4b,
4d et 4e) et L (autres sérotypes) (Doumith et al., 2004a).
21
Tableau 5 : Structure antigénique des sérotypes de L. monocytogenes d’après (Farber et
Peterkin, 1991)
sérotypes antigène O antigène H 1/2a I II (III) A B 1/2b I II (III) A B C
1/2c I II (III) B D
3a II (III) IV A B 3b II (III) IV A B C
3c II (III) IV (XII) (XIII) B D
4a (III) (V) VII IX (XII) (XIII) A B C
4ab (III) V VI VII IX X A B C
4b (III) V VI A B C
4c (III) V VII A B C
4d (III) (V) VI VIII A B C
4e (III) V VI (VIII) (IX) A B C
7 (III) XII XIII A B C
Les parenthèses indiquent que l’antigène n’est pas systématiquement exprimé
En raison du faible pouvoir discriminant de la sérotypie, d’autres méthodes de typage ont été
favorisées. Les souches de L. monocytogenes ont dans un premier temps été différenciées par
lysotypie (Audurier et Martin, 1989). Depuis les années 1990, des méthodes d'empreintes
moléculaires telles que le ribotypage, la RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) et la
PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis) se sont développées (Wiedmann et al., 1997 ; Zhang
et al., 2004 ; Boscher et al., 2012).
2.1.5 Caractéristiques génomiques de L. monocytogenes
Le premier séquençage du génome entier de L. monocytogenes et son analyse ont été réalisés
en 2001 par un consortium de 10 laboratoires européens (Glaser et al., 2001) sur la souche
EGD-e (sérotype 1/2a) initialement isolée de lapins atteints de listériose par Murray et al.
(1926). Il existe actuellement 63 souches de L. monocytogenes dont le génome a fait l’objet
d’un séquençage complet (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/genomes/159?). La
comparaison de 34 génomes étudiés par deux équipes américaines (Deng et al., 2010; den
Bakker et al., 2013) montre que le génome de L. monocytogenes comprend 1,81 à 3,14
mégabases (Mb) et possède 2710 à 3253 gènes.
Le génome de la souche EGD-e, utilisé comme génome de référence, comporte 2, 94 Mb avec
un GC% moyen de 39%. Il possède 2 853 gènes codant des protéines dont 35% d’entre-elles
ont des fonctionnalités inconnues. Il comprend de nombreux gènes permettant une
22
colonisation d’habitats diversifiés, tels que des gènes codant des protéines de surface, des
transporteurs, des protéines sécrétées et des régulateurs transcriptionnels. Glaser et al. (2001)
ont mis en évidence des gènes codants 86 protéines secrétées et 68 lipoprotéines. Certaines de
ces protéines sont impliquées dans la virulence de L. monocytogenes à l’exemple de la
listériolysine O (LLO), des phospholipases PlcA, PlcB et de l’internaline InlC. D’autres
protéines jouent un rôle dans la dégradation de la matière organique telle que des lipases et les
chitinases. Parmi les 331 gènes codant des transporteurs, 26% sont impliqués dans le transport
de glucides par un système phosphotransférase dépendant du phosphoenolpyruvate (PTS). Ce
nombre élevé de gènes souligne l’aptitude de la souche EGD-e à utiliser des sources de
carbone variées, ce qui expliquerait en partie sa capacité d'adaptation à des environnements
très divers, comme l'ont suggéré plusieurs auteurs (Chico-Calero et al., 2002; Leisner et al.,
2008; Piveteau et al., 2011). Le génome de la souche EGD-e comprend 209 régulateurs de
transcription qui représentent 7,9% du génome total. Cette forte proportion, proche de celle de
Pseudomonas aeruginosa (8,4%), bactérie également ubiquiste, n’est pas surprenante dans la
mesure où l’adaptation de L. monocytogenes à différents environnements nécessite des
systèmes de régulation. Ces régulateurs comprennent notamment 5 facteurs Sigma qui
interviennent lors de l’initiation de la transcription de gènes en fonction des stimuli
environnementaux. La souche EGD-e ne contient pas d'ADN extra-chromosomique.
Toutefois, les études de Lebrun et al. (1994) et Kuenne et al. (2010) ont montré qu’un tiers
des souches de L. monocytogenes (principalement isolées de produits alimentaires) portait des
plasmides porteurs de gènes de résistance aux antibiotiques, aux métaux lourds et aux stress
oxydatifs. De plus, den Bakker et al. (2012) ont montré qu’une souche de L. monocytogenes
isolée d’une chèvre atteinte de listériose, était porteuse d’un plasmide portant des gènes
appartenant à la famille des internalines, protéines associées à la virulence.
Il a été identifié chez L. monocytogenes des petits ARNs non codants (ARNnc) qui sont
exprimés à partir des régions intergéniques du génome, souvent en réponse à un stress ou à
des modifications du milieu environnant. Ils peuvent réguler sélectivement l'expression d'un
ou plusieurs gènes en modulant la traduction et/ou la stabilité des ARNm correspondants. Des
analyses transtriptomiques de L. monocytogenes ont ainsi permis de mettre en évidence 210
ARNnc régulateurs qui seraient impliqués dans l’adaptation au stress oxydatif, au manque de
fer, aux basses températures ainsi qu'à la vie intracellulaire (Nielsen et al., 2008; den Bakker
et al., 2010; Kuenne et al., 2013).
23
2.1.6 Pan-génome et détermination génétique des lignées de L. monocytogenes
Le concept du pan génome a récemment été introduit pour étudier la diversité d’espèces
bactériennes et rechercher divers degrés de conservation reflétant des différences d'habitats,
de pression évolutive et de pools des gènes (Kuenne et al., 2013). Le pan-génome regroupe
l'ensemble des gènes du "core génome" et de "génome accessoire". Le core génome
correspond à l'ensemble des gènes communs à toutes les bactéries d'une même unité
taxonomique (le plus souvent l’espèce, parfois le genre) alors que le génome accessoire
regroupe des gènes spécifiques présents uniquement dans certaines souches de l'unité
taxonomique. Le core génome peut être utilisé pour identifier les caractéristiques génomiques
spécifiques d'une unité taxonomique donnée. Le génome accessoire contribue à la diversité
des espèces et fournit probablement des fonctions qui ne sont pas essentielles à la survie de
l’espèce mais confèrent des avantages sélectifs permettant l'adaptation à des niches
spécifiques, la résistance aux antibiotiques et la capacité à coloniser de nouveaux hôtes.
(Tettelin et al., 2008). L’étude de Kuenne et al. (2013) sur l’analyse du génome de 16 souches
de L. monocytogenes a révélé que les gènes du génome accessoire sont localisés dans des
régions définies du chromosome bactérien (9 régions hyper variables, 9 prophages, 3
transposons et 2 îlots génomiques mobilisables).
Deng et al. (2010) ont montré que le pan-génome de L. monocytogenes, estimé sur 17
souches, totalisait au moins 4052 gènes. Parmi ceux-ci, 2330 à 2456 appartenaient au core
génome qui représentait, pour une souche donnée, 80% du génome. Quant au génome
accessoire, il représentait entre 13 et 23 % du pan génome, selon les souches (Severino et al.,
2007; Deng et al., 2010). Des résultats similaires ont été rapportés par Kuenne et al. (2013)
qui ont montré que pour chacune des 16 souches incluses dans leur étude génomique, environ
78% des séquences codantes appartenaient à des gènes du core génome suggérant une stabilité
de celui-ci. Les gènes impliqués dans l'adaptation tels que les gènes codant des composants de
la paroi, les systèmes de transport de glucides et les régulateurs transcriptionels se répartissent
dans le core génome et le génome accessoire (den Bakker et al., 2013). Les analyses du pan-
génome de Listeria ont montré que la perte de gènes au cours de l’évolution a joué un rôle
majeur dans le développement des espèces actuelles de Listeria qui proviennent probablement
d’un ancêtre pathogène (den Bakker et al., 2013).
Les différences génomiques expliquent la séparation des L. monocytogenes en quatre lignées
phylogénétiques, désignées I, II, III et IV, qui diffèrent par leur écologie, leur taux de
recombinaison et leur contenu génomique (Orsi et al., 2011). Les souches de la lignée I
24
prédominent dans les souches isolées de cas cliniques humains, alors que les souches de la
lignée II sont communes dans les aliments et semblent être très répandues dans les milieux
naturels et les environnements agricoles (Orsi et al., 2011). Les souches des lignées III et IV,
rarement retrouvées chez les humains et les aliments ont été associées à des animaux malades
(Roberts et al., 2006).
Les lignées I et II possèdent en commun 86 gènes absents de la lignée III. Ces gènes codent
des protéines dont les principales fonctions sont liées (i) à la régulation du métabolisme et du
transport des sucres, (ii) à l’adaptation dans le tractus gastro intestinal de l’hôte et (iii) à des
phénomènes de régulation et de synthèse de protéines de surface (Doumith et al., 2004b;
Deng et al., 2010). La distribution de ces gènes expliquerait en partie la répartition des L.
monocytogenes aux seins des 3 lignées. Orsi et al. (2011), soulignent que chaque lignée
comporte un ensemble de gènes spécifiques et que la répartition des différentes lignées
pourrait s’expliquer par la diversité des environnements colonisés par L. monocytogenes.
La lignée I est essentiellement constituée de sérotypes 4b et 1/2b alors que les sérotypes 1/2a
et 3a sont plus couramment retrouvés dans la lignée II (Ragon et al., 2008; Orsi et al., 2011).
Les lignées III et IV regroupent les sérotypes 4a, 4b et 4c (Roberts et al., 2006). En
s’appuyant sur les études génétiques des populations de L. monocytogenes, il a été émis
l’hypothèse que l’ancêtre commun le plus récent de L. monocytogenes était de sérotype 1/2b
et que le sérotype 4b n’est apparu que récemment à partir d'un ancêtre possédant le sérotype
1/2b (Ragon et al., 2008). Il convient de souligner que le nombre de sérotypes reconnus de L.
monocytogenes est très faible par rapport à celui d’autres bactéries pathogènes telles que
Salmonella enterica, qui possède 2579 sérotypes distincts (Grimond et Weill., 2007). Den
Bakker et al. (2014) ont suggéré que les protéines de surface responsables des variations de
l'antigène O de L. monocytogenes subiraient une sélection de diversification moindre que
d’autres bactéries pathogènes.
2.2 Pathogénicité de L. monocytogenes
2.2.1 Epidémiologie
L. monocytogenes est une souche pathogène de l’homme et de l’animal. Des cas d’infection
humaine associés à L. ivanovii et L. seeligeri ont été rapportés mais restent anecdotiques
(Lessing et al., 1987 ; Cummins et al., 1994).
La transmission classique de L. monocytogenes se fait via la consommation d’aliments
25
contaminés par ce germe. Les aliments les plus à risques sont ceux à base de lait cru, la
charcuterie, les légumes crus, ainsi que les plats préparés sans recuisson (Porto-Fett et al.,
2013). Il existe d’autres modes de transmission mais ils sont plus rares. Il a ainsi été rapporté
des transmissions par contact direct avec un animal infecté (Cain et McCann, 1986;
McLauchlin et Low, 1994), de la mère au fœtus par le passage de la bactérie du sang de la
mère au placenta, de la mère au nouveau-né via le sang lors de l’accouchement (Smith et al.,
2009; Tahery et al., 2009; Mokta et al., 2010).
La listériose humaine se présente généralement sous forme de cas sporadiques, plus rarement
de cas groupés et peut être parfois responsable d’épidémies. Les listérioses sporadiques
correspondent aux cas de listériose qui ne peuvent pas être liés entre eux par la consommation
d’un produit contaminé de la même provenance. Le terme de "cas groupés" est employé
lorsque le nombre de cas est faible. Le terme d’épidémie est utilisé lorsqu’il y a une
augmentation importante du nombre de cas de listériose. Les principales épidémies et cas
groupés répertoriés depuis 1981 en Europe, au Canada et aux Etats-Unis sont reportés dans le
tableau 6. Les listérioses sont associées à la consommation d’aliments variés représentés
essentiellement par les produits laitiers et carnés mais également par les végétaux et des
produits de la mer. L’épidémie ayant touché le plus d’individus est apparue en Italie en 1997
avec 1566 cas provoqués par la consommation de salade de maïs et de thon. En France,
l’épidémie la plus importante s’est produite en 1992 (279 cas liés à la consommation de
langues de porc en gelée).
26
Tableau 6 : Principaux cas de listériose depuis 1981
Pays Année Nombre de
cas aliments Mortalité
(%) références Canada 1981 41 choux 34 Schlech et al. (1983) Suisse 1992 57 langue de porc 32 Bula et al. (1995) France 1992 279 Langue de porc 8 CNRL (2014)b France 1993 nd* Rillettes nda CNRL (2014) France 1995 nd* fromage nd CNRL (2014) Italie 1997 1566 salade de maïs et thon nd Valk., (2005)
France 1997 14 Fromage 93 CNRL (2014) USA 1998 108 hot-dog 17 Graves et al. (2005)
Finlande 1999 18 beurre 22 De Valk., (2005) France 1999 4 fromage 25 CNRL (2014)
Finlande 1999-2000 23 poisson sous vide 26 Hatakka et al. (2000) France 2000 23 Rillettes nd CNRL (2014) France 2000 32 langue de porc nd CNRL (2014) France 2002 11 mortadelle nd CNRL (2014) France 2003 4 fromage nd CNRL (2014) Suisse 2005 12 fromage 42 Bille et al. (2006)
Allemagne 2006 189 fromage nd Koch et al. (2010) Norvège 2007 17 fromage 18 Johnsen et al. (2010) Canada 2008 57 charcuterie 39 Taillefer et al. (2010)
Danemark 2009 14 suspicion de viande 14 Smith et al. (2011) Autriche-Allemagne 2010 14 fromage 29 Fretz et al. (2010)
USA 2011 147 melon cantaloupe 22 CDC (2011) c France 2012 11 fromage nd CNRL (2014) USA 2013 6 fromage 17 Choi et al. (2014)
France 2013 3 Fromage 33 CNRL (2014) France 2013 11 quenelle nd CNRL (2014)
Danemark 2014 38 porc 39 CDC (2015) USA 2014 28 pommes 18 CDC (2015)
Macédoine 2014 10 porc fumé 50 CDC (2015) a non déterminé ; b Centre National de Référence des Listeria ; c Centers for Disease control and Prevention
En France, l’incidence de la listériose, stable de 2001 à 2005 avec 3,5 cas par million
habitants (M hab), a augmenté en 2006 et s’est stabilisée jusqu’en 2011 avec 4,3 à 5 cas / M
hab (figure 6). Néanmoins, le nombre de cas a augmenté en 2012 et 2013 pour atteindre une
incidence de 5,7 cas / M hab. Une tendance similaire a été observée en Europe avec une
augmentation de 8,6% des cas de listériose entre 2012 et 2013 (EFSA, 2015).
27
Figure 6 : Incidence de la listériose par million d’habitant en France métropolitaine (1999-2013) (source : INVS http://www.invs.sante.fr)
L’augmentation de l’incidence des listérioses pourrait s’expliquer par le vieillissement de la
population, l’augmentation du nombre de personnes immunodéprimées (cancéreux, malades
greffés…), l’évolution des habitudes alimentaires privilégiant les plats préparés, la
consommation importante d’aliments à risques (fromage au lait cru, charcuterie) et
l’augmentation des dates limites de consommation. En comparaison avec d’autres pathogènes
responsables d’infections d’origine alimentaire, la listériose a une incidence faible, mais
conduit à une fréquence d’hospitalisation et un taux de mortalité élevés (tableau 7).
Tableau 7 : Comparaison du nombre de cas et de leur gravité en Europe associés à 3 maladies
d’origine alimentaire (EFSA, 2015).
maladie nombre de cas
hospitalisation ( %)
taux de mortalité (%)
campylobactériose 214 779 43,6 0,05 salmonellose 82 694 36 0,14
listériose 1 763 99,1 15,6
2.2.2 Listériose et symptomatologie
La listériose est une maladie humaine et animale touchant les animaux sauvages et
domestiques. Le pouvoir pathogène de L. monocytogenes est principalement dû à sa capacité
de parasitisme intracellulaire (Le Monnier et Leclercq., 2009). La bactérie est en effet capable
de pénétrer les cellules non phagocytaires, de survivre dans les macrophages et de franchir les
barrières comme l'épithélium intestinal, la barrière hémato-encéphalique et la barrière de
l'unité-foeto-placentaire (Cossart et Toledo-Arana, 2008).
4,3 4,4
2,93,5
3,33,6
3,3
4,4
5,04,3
5,14,9
4,3
5,35,7
2
3
4
5
6in
cid
en
ce/m
illio
n d
'hab
itan
ts
Années
28
Chez les petits animaux, la maladie est caractérisée par une monocytose avec la présence
d’abcès hépatiques et cardiaques. Chez les ruminants, L. monocytogenes provoque des
septicémies, des encéphalites et des avortements (Low et Donachie, 1997). La listériose
humaine touche préférentiellement les personnes immunodéprimées et les personnes âgées.
Quatre sérovars (1/2a, 1/2b, 1/2c, 4b) sont responsables de plus de 95% des listérioses
(Doumith et al., 2004b). Les infections peuvent être asymptomatiques ou se traduire par un
état pseudo-grippal avec des courbatures, fièvre, maux de tête et troubles digestifs non
spécifiques d’une listériose. Lorsqu’elles sont aiguës, elles sont fréquemment associées à une
atteinte du système nerveux central et des méninges mais elles peuvent également être à
l’origine de septicémies, de conjonctivites, de rhinites, de sinusites et d’atteintes pleuro-
pulmonaires. Chez les femmes enceintes la listériose peut provoquer une infection intra-
utérine accompagnée d'une mortalité élevée du fœtus ou du nouveau-né.
2.2.3 Processus infectieux
L'entrée de la bactérie dans l'organisme de l’hôte s'opère par le franchissement de la barrière
intestinale. Le passage de la muqueuse à l'échelle cellulaire est réalisé par l'envahissement des
entérocytes et/ou des cellules M des plaques de Peyer. Les bactéries se retrouvent ensuite dans
les cellules phagocytaires de la lamina propria où elles survivent et se multiplient. Après avoir
traversé la barrière intestinale, via la circulation sanguine ou lymphatique, L. monocytogenes
rejoint le foie et la rate où elle se multiplie. Par la circulation sanguine, L. monocytogenes
atteint ensuite le cerveau et le placenta (Figure 7) (Lecuit 2007; Cossart et Toledo-Arana,
2008).
Figure 7 : Etapes successives de l’infection par L. monocytogenes (d’après Cossart et Toledo-
Arana, 2008)
29
La première étape de l’infection consiste en une internalisation dans les entérocytes et fait
intervenir plusieurs facteurs de virulence. L. monocytogenes adhère aux cellules par un
contact entre des protéines de surface et des récepteurs. Deux processus d’interaction ont été
décrits dans la littérature (figure 8). Le premier fait intervenir la protéine de surface
internaline A (InlA) qui se lie au récepteur E-cadhérine (glycoprotéine) présent à la surface de
entérocytes (Mengaud et al., 1996; Cossart et Toledo-Arana, 2008). Le second mécanisme fait
appel à une autre protéine de surface, l’internaline B (InlB) qui s’associe au récepteur
cellulaire Met (Shen et al., 2000; Niemann et al., 2007). InlA est le facteur majeur permettant
l’entrée de L. monocytogenes dans les cellules épithéliales. InlB est une protéine
indispensable pour la colonisation de nombreux types cellulaires pour lesquels InlA n’a aucun
rôle, comme les hépatocytes, les cellules endothéliales et les fibroblastes (Mengaud et al.,
1996). Ces interactions "protéine de surface-récepteurs" entraînent un réarrangement du
cytosquelette d’actine par détournement de la machinerie cellulaire de la cellule hôte
conduisant à l’internalisation de L. monocytogenes dans une vacuole (phagosome) (Bonazzi et
al., 2008; Bonazzi et al., 2011; Pizarro-Cerdá et al., 2012). Ce phagosome se retrouve ensuite
dans le cytoplasme de l’entérocyte.
Figure 8 : Etapes successives de l’infection des cellules par L. monocytogenes. Les deux voies
d’internalisation de L. monocytogenes dans les entérocytes sont schématisées (à partir de
l’interaction InlA-E-cadhérine ou de l’interaction entre l’internaline InlB et le récepteur Met).
D’après Cossart et Toledo-Arana (2008), Hamon et al. (2006) et Disson et Lecuit (2013). Les
protéines intervenant dans les différentes étapes sont indiquées en rouge.
Les conditions défavorables à L. monocytogenes (pH acide et présence d’agents
antimicrobiens) retrouvées dans le phagosome activent la listériolysine O (LLO) ainsi qu’une
internalisation
LLOPlcA
InlC
ActA
InlB
E-cadherine
InlA
Met
phagosomeFilaments d’actine
ActA
LLO PlcB
Vacuole à double membrane
cytoplasmique
Lyse de la vacuole
Lyse du phagosome et libération dans le
cytoplasme
30
phospholipase particulière, la phosphatidyl-inositol phopholipase C (Pi-PLC), codée par PlcA.
La libération simultanée de LLO et Pi-PLC permet la destruction du phagosome et la
libération dans le cytoplasme de la bactérie. L. monocytogenes se déplace à l’intérieur de la
cellule à l’aide d’une queue d’actine polymérisée par l’action de la protéine bactérienne ActA.
La formation d’une "queue d’actine " permet la propulsion de L. monocytogenes des
entérocytes vers les cellules voisines (Tilney et Portnoy., 1989; Gouin et al., 2010). InlC,
facteur de virulence, est impliqué dans la formation d’extensions membranaires qui
interagissent avec la protéine Tuba impliquée dans le contrôle de la structure des jonctions
cellulaires apicales (Rajabian et al., 2009). La bactérie se retrouve alors dans une autre cellule
entourée par une vacuole à double membrane. Une autre phospholipase, la phosphatidyl-
choline phospholipase C (Pc-PLC) codée par plcB est utilisée par la bactérie en plus de LLO
pour détruire cette vacuole (figure 8). Les bactéries passent ainsi de cellules en cellules et se
disséminent dans l’ensemble de l’épithélium. Une fois la barrière intestinale traversée, L.
monocytogenes se retrouve dans le sang et le système lymphatique qui transportent les
bactéries jusqu’au foie, la rate et la vésicule biliaire. L. monocytogenes peut ensuite rejoindre
l’encéphale ou le fœtus chez les femmes enceintes via les circulations sanguines et
lymphatiques (Lecuit, 2007).
L. monocytogenes utilise des procédés similaires afin de s’échapper du phagosome des
cellules immunitaires. Néanmoins, le système immunitaire des personnes en bonne santé
permet de contrôler la réplication de L. monocytogenes, l’empêchant ainsi de rejoindre
l’encéphale. Le risque de listériose est donc accru pour les populations immunodéprimées par
une maladie (SIDA, maladie auto-immunes) ou par la prise de traitements médicamenteux
immunosuppresseurs (chimiothérapie anticancéreuse par exemple).
2.2.4 Génomique du processus infectieux
Des études comparatives du génome de L. monocytogenes et L. innocua ont mis en évidence
la présence de 25 internalines dont 8 sont codées uniquement par L. monocytogenes (InlA,
InlB, InlE, InlH, InlI, InlJ, Lmo1290 et Lmo2470). Ces 8 internalines jouent un rôle dans le
processus infectieux. Trois autres protéines interviennent également dans le processus
infectieux : (i) une hydrolase des sels biliaires, Bsh qui permet à la souche de résister dans
l’intestin (Dussurget et al., 2002), (ii), une protéine de surface, Vip (Cabanes et al., 2005) et
(iii), une protéine d’attachement à la fibronectine, FbpA (Dramsi et al., 2004). Une
cinquantaine de gènes majeurs de virulence ont été déterminés.
31
PrfA (Positive Regulatory Factor A) est un important régulateur transcriptionel qui régule 73
gènes impliqués dans le processus infectieux (Renzoni et al., 1997 ; Milohanic et al., 2003 ;
de las Heras et al., 2011). Il contrôle notamment l’expression d'au moins treize gènes de
virulence clés dont les gènes codant les protéines InlA et InlB, LLO et ActA (Scortti et al.,
2007).
D’autres facteurs de régulation interviennent lors du processus d’infection de L.
monocytogenes. Ainsi, le facteur Sigma B régule inlB et d’autres protéines de surface lors de
la circulation de L. monocytogenes dans le tractus intestinal. Le système à deux composants
VirR/VirS régule la transcription de 12 gènes impliqués dans la virulence et la résistance aux
défensines (Mandin et al., 2005 ; Thedieck et al., 2006). La protéine de fixation à l’ARN,
Hfq, joue un rôle non encore élucidé dans la virulence de L. monocytogenes. Il a en effet été
observé que la délétion du gène codant cette protéine rend L. monocytogenes avirulente
(Christiansen et al., 2004 ; Nielsen et al., 2010). Les petits ARN non codants semblent
également être impliqués dans la régulation de gènes de virulence (Toledo-Arana et al., 2007 ;
Izar et al., 2011 ; Mellin et Cossart, 2012). C’est le cas de l’ARNnc rli60, qui lorsqu’il est
déleté chez L. monocytogenes EGD-e, affecte significativement la transcription des gènes de
virulence prfA, plcA, hly, actA, inlA et inlB et diminue aussi la capacité de la bactérie à
envahir le foie et la rate de souris (Peng et al., 2012).
2.3 Réservoirs et capacité de survie de L. monocytogenes dans l’environnement
2.3.1 Portage chez l’Homme et présence dans les effluents de stations d'épuration
La proportion de porteurs sains de L. monocytogenes dans la population globale est estimée
entre 1 et 6% (Rocourt et al., 2000 ; Grif et al., 2001 ; Hofet al., 2001). Elle est de 11,9 à
13,3% chez les personnes ayant des contacts fréquents avec la bactérie (infirmiers,
laborantins, opérateurs en industrie agro-alimentaire) et chez les personnes travaillant au
contact d’animaux (Macgowan et al., 1991 ; Schuchat et al., 1991 ; Kerr et al., 1993). Chez
les porteurs sains, la durée d’excrétion de L. monocytogenes par les fèces semble relativement
courte (de quelques jours à quelques semaines) (Ortel, 1971 ; Kampelmacher et al., 1976 ;
Rousset et al., 1994).
Les souches isolées des porteurs sains sont potentiellement virulentes. En effet, dans une
étude menée sur 14 souches de L. monocytogenes isolées de porteurs asymptomatiques, 10
étaient virulentes sur des embryons de poulets. De plus, le processus d’internalisation de 5 de
ces 10 souches était similaire à celui des souches responsables de listériose sporadique ou
32
épidémique (Olier et al., 2003).
Présente dans les fèces humaines, L. monocytogenes est aussi retrouvée dans les effluents et
les boues de stations d'épuration (Garrec et al., 2003; Watkins et Sleath, 1981 ; Alghazali et
Alazawi, 1988a ; Paillard et al., 2005). La prévalence, essentiellement rapportée pour Listeria
spp., est supérieure à 60% dans les eaux usées brutes (Alghazali et Alazawi, 1988b;
Bernagozzi et al., 1994; MacGowan et al., 1994; Odjadjare et Okoh, 2010). Les
concentrations en L. monocytogenes lorsqu’elles sont précisées par les auteurs, fluctuent de 7
à 1,8 104 bactéries mL-1 dans les eaux brutes et sont inférieures à 30 bactéries mL-1 dans les
eaux traitées (Bernagozzi et al., 1994 ; Odjadjare et Okoh, 2010).
Dans les boues de trois stations d'épuration angevines suivies mensuellement pendant une
année par Garrec et al. (2003), L. monocytogenes a été retrouvée à des teneurs comprises
entre 5 et 6,3 103 NPP g-1 (poids sec) dans les boues activées. Sa concentration dans les boues
ayant subi un traitement (filtration ou décantation), destinées à l’épandage, était comprise
entre 1,1 à 1,9 102 NPP g-1. L. monocytogenes a été retrouvée dans 73% des boues
déshydratées et dans 80% des boues stockées suggérant que l’épandage des boues de stations
d'épuration peut constituer une voie d’entrée de L. monocytogenes dans l’environnement.
Paillard et al. (2005) ont suivi pendant une année les teneurs en Listeria de 6 stations
d'épuration de la région bordelaise traitant les eaux usées par boues activées. Ils ont retrouvé
Listeria dans 84% des effluents de sortie à une teneur comprise entre <0,3 et 2,1 101 NPPg-1
(poids sec) et dans 89% des échantillons de boues activées à une concentration de 7 à 5 104
NPP g-1 (poids sec). L. monocytogenes représentait 59% des 181 souches isolées dans cette
étude. Dans les études de Paillard et al. (2005) et de Garrec et al. (2003), les sérotypes
classiquement impliqués dans les cas de listériose humaines (1/2a, 1/2b, 4b) ont été retrouvés.
2.3.2 Portage de L. monocytogenes par les animaux
Les animaux peuvent être porteurs de L. monocytogenes. Les premiers cas de listériose ont
d’ailleurs été décrits chez des animaux d’animalerie (Muray et al., 1926). L. monocytogenes a
été isolée d’animaux sauvages, de chiens, de chats et d’oiseaux (Iida et al., 1991; Weber et
al., 1993; Casanovas et al., 1995; Weber et al., 1995; Bouttefroy et al., 1997; Yoshida et al.,
2000; Kalorey et al., 2006; Lyautey et al., 2007; Hellstrom et al., 2008). Les animaux
d’élevage (porcins, ovins, bovins, caprins, équins, volailles) sont également porteurs de L.
monocytogenes (Burow et al., 1996; Barbuddhe et al., 2000; Gudmundsdottir et al., 2004;
33
Nightingale et al., 2004; Nightingale et al., 2005; Vilar et al., 2007; Esteban et al., 2008;
Guariglia-Oropeza et al., 2014).
2.3.3 Présence de L. monocytogenes dans les productions alimentaires
L’ensemble des secteurs agro-alimentaires sont concernés par L. monocytogenes. Le portage
de L. monocytogenes chez les animaux peut être responsable d’une contamination des
matières premières d’origine animale ou des produits transformés (Barros et al., 2007;
Mohammed et al., 2010; Morild et al., 2011; Dmowska et al., 2013; Guariglia-Oropeza et al.,
2014; Garcia et al., 1996; Yoshida et al., 1998; Schaffner et al., 2003; Schoder et al., 2003;
Hunt et al., 2012). La capacité de L. monocytogenes à former des biofilms lui permet de
coloniser les équipements agro-alimentaires, ce qui rend difficile son élimination
(Chmielewski et Frank, 2003 ; Carpentier et Cerf, 2011 ; Bridier et al., 2015; Kuda et al.,
2015). La contamination peut avoir différentes origines : les matières premières destinées à
être transformées, les équipements de l’usine, le personnel ou les moyens de transports
(Gudbjornsdottir et al., 2004). Elle peut persister pendant des mois ou des années (jusqu’à 3
ans) sur des surfaces d’installations industrielles (Orgaz et al., 2013). Les matières premières
ou aliments transformés peuvent ainsi être contaminés par contact direct avec les surfaces
contaminées (Orgaz et al., 2013). L’étude de Barros et al. (2007) menée au Brésil sur 443
échantillons prélevés dans 11 établissements de transformation de viande, a montré que
12,6 % des établissements étaient contaminés par L. monocytogenes. Il convient de souligner
que 57,2 % des produits alimentaires de ces usines étaient contaminés par la bactérie
pathogène. Les souches isolées appartenaient aux sérotypes 1/2a et 4b, sérotypes
majoritairement impliqués dans les cas de listérioses. Dans une autre étude menée dans cinq
pays d’Europe du nord, 2522 échantillons ont été prélevés pendant deux années dans 13
usines de transformation de produits animaux. La prévalence de L. monocytogenes dans les 6
usines de transformation de viande étudiées était de 0 à 15,1 %. Elle était de 20 % à 24,1 %
dans les 5 usines de transformation fruits de mer et de 5,9 % à 22,1 % dans les 2 de usines de
transformations de volailles (Gudbjornsdottir et al., 2004).
Les auteurs ont observé que les produits finaux étaient plus contaminés que les matières
premières au début du processus suggérant que la transformation des produits favorise le
développement de L. monocytogenes. Il est important de souligner que les taux de
contamination importants dans les installations de transformation des produits alimentaires
augmentent considérablement le risque de listériose humaine comme cela a été observé en
34
2000 au Danemark où des cas de listériose ont été attribués à la consommation de dindes
issues d’une usine de transformation dans laquelle la prévalence de L. monocytogenes était
comprise entre 25,9 et 41,4% (Ojeniyi et al., 2000).
Récemment, Leong et al. (2014) ont étudié la prévalence et les voies de contamination de L.
monocytogenes dans 48 usines irlandaises de transformation d’aliments dont 43 produisaient
des aliments prêts à la consommation. Les usines traitaient des produits laitiers (18
établissements), de la viande (12 établissements), des fruits de mer (8 établissements), des
légumes frais coupés (6 établissements) et des produits divers (4 établissements). Les
prélèvements (8 par usine) ont été réalisés tous les 2 mois pendant une année sur les produits
finis destinés à la vente ainsi que sur des échantillons environnementaux (conduit
d’évacuation de la salle principale de transformation, sol, étagère de rangement et d’autres
zones sélectionnées par chaque responsable d’usine telles que les murs, écoulements d’eau,
flaques…). Les 2006 échantillons analysés comprenaient 1 574 échantillons
environnementaux et 432 échantillons d'aliments. L. monocytogenes a été détectée dans 62%
des usines mais généralement avec une faible prévalence qui était de 4,4% dans les
échantillons environnementaux et de 4,6% dans les aliments. La prévalence la plus élevée a
été observée dans le secteur de transformation des légumes (9,4 % des échantillons étaient
positifs), suivi par le secteur de la viande (4,2 %), le secteur laitier ( 3,9 %) et le secteur des
fruits de mer (1,6 %). L’analyse des souches isolées par sérotypage et PFGE a révélé une
variété importante de pulsotypes isolés du secteur traitant les légumes, indiquant une
contamination issue de différentes origines et suggérant que la source probable de cette
contamination serait le sol plutôt que les matériaux des fournisseurs, le personnel ou les
équipements communs de l’usine.
2.3.4 Prévalence dans les élevages et les effluents d’élevages
Les études de Boscher et al. (2012) et de Pourcher et al. (2012) menées dans des élevages de
porcs bretons ont mis en évidence une prévalence élevée de L. monocytogenes,
respectivement dans les fèces (46 % des 73 élevages analysés) et dans les lisiers (18 % des 44
élevages analysés). De même, une étude réalisée sur 16 élevages bovins a révélé la présence
de L. monocytogenes dans 19% des 298 échantillons constitués de fèces, d’ensilage, d’eau, de
sol et de lait (Fox et al., 2009). Une étude menée par Nightingale et al. (2004) dans 16
exploitations bovines et 12 élevages de petits ruminants (chèvres et moutons) a indiqué une
prévalence de L. monocytogenes de 24% et 6%, respectivement. Cette étude a également
35
montré que la diversité des populations de L. monocytogenes, analysée par ribotypage, était
supérieure dans les élevages bovins, les élevages de petits ruminants n’étant caractérisés que
par un seul ou quelques ribotypes. La prévalence de L. monocytogenes dépend du type de
ruminants mais également de la saison comme l’ont souligné Nightingale et al. (2005) qui ont
observé une prévalence plus importante en période hivernale. Une influence de la saison sur la
prévalence de L. monocytogenes a également été observée sur les porcs par Boscher et al.
(2014).
La présence de L. monocytogenes dans les eaux a été mise en évidence dès les années 1980 en
Grande-Bretagne (Watkins et Sleath, 1981) et aux Pays-Bas (Dijkstra, 1982). La fréquence
d’isolement de L. monocytogenes varie fortement d’une région géographique à une autre
(tableau 8).
Tableau 8: Fréquences d’isolement de L. monocytogenes dans les eaux douces
Type d’eau pays Fréquence (nombre d’échantillons) d’isolement (%) Références
Rivières (7) Angleterre 100 Watkins et Sleath (1981)
Lacs et canaux (180) Pays-Bas 37 Dijkstra (1982)
Rivières (37) Etats-Unis 62 Colburn et al. (1990)
Rivières (15) Italie 40 Bernagozzi et al. (1994)
Rivières (84) Grèce 3,9 Arvanitidou et al (1997)
Rivières (non précisé) Espagne 44,3 Combarro et al. (1997)
Lacs (44) Grèce 0 Arvanitidou et al. (1997)
Rivières (107) Suisse 17, 8 Schaffter et Pariaux (2002)
Rivières (314) Canada 10 Lyautey et al. (2007)
Rivière, lacs et étangs (1405) Etats Unis 43 Cooley et al. (2014)
Rivières et lacs (329) Canada 17.5 Stea et al. (2015)
Ainsi, alors que L. monocytogenes a été détectée dans moins de 4% des échantillons d’eau de
surface en Grèce (Arvanitidou et al., 1997), elle a été mise en évidence dans plus de 30% des
échantillons aux Pays-Bas (Dijkstra, 1982), en Espagne (Combarro et al., 1997), en Italie
(Bernagozzi et al., 1994) et aux Etats-Unis (Colburn et al., 1990 ; Cooley et al., 2014).
Schaffter et Parriaux (2002) ont souligné que la présence de L. monocytogenes dans les eaux
36
est influencée par la présence de fèces animales et de rejets de stations d'épuration. Si la pluie
semble être un facteur primordial dans la dissémination de L. monocytogenes dans les eaux, la
température et la présence de bétail sont également des facteurs importants comme l’ont
observé Lyautey et al. (2007) ; Wilkes et al. (2009) et Cooley et al. (2014). Ainsi, l’étude
menée au Canada par Lyautey et al. (2007) sur 314 échantillons d'eau de surface a montré que
le nombre d'échantillons positifs en L. monocytogenes était plus élevé dans les zones proches
d'exploitations bovines.
2.3.5 Prévalence de L. monocytogenes dans les sols
Peu de travaux rapportent la prévalence de L. monocytogenes dans le sol. Globalement, la
fréquence de détection fluctue entre 1 et 51% et dépend du type de sol analysé. Les premières
études réalisées par Weis et Seeliger (1975) en Allemagne sur 55 échantillons et par Dowe et
al. (1997) au Canada sur 26 échantillons montrent une prévalence de L. monocytogenes plus
élevée dans les sols en jachère (51,4% et 30,8 %) que dans les sols cultivés (18,7% et 8,3%).
Toutefois, la fréquence de détection du pathogène dans 46 prairies et pâtures (8,7 %) et dans
59 sols forestiers (15,2%) rapportée par Weis et Seeliger (1975) est du même ordre de
grandeur que celle observée dans les sols cultivés. Dans une étude menée aux Etats-Unis sur
deux années Sauders et al. (2012) ont isolé L. monocytogenes dans 7,5% des 889 échantillons
de sols urbains et seulement dans 1,4% des 916 échantillons issus de l’environnement hors
zone urbaine ("sols naturels"), suggérant que l’environnement urbain serait plus propice au
développement de L. monocytogenes. Par ailleurs, les auteurs ont observé un effet "saison"
qui dépendait du type de sols analysés. Ainsi, dans les sols urbains la plus faible prévalence
des Listeria a été observée en été alors que cette saison correspondait à la prévalence la plus
élevée dans les sols naturels. La présence de L. monocytogenes dans l’environnement urbain a
également été mise en évidence par les travaux de Schoder et al. (2015) réalisés à Vienne. Le
pathogène a été isolé dans 12,5% (1/8) et 20,7% (6/29) des échantillons prélevés dans des
toilettes publiques situées sur des marchés et sur des parcs de la ville ainsi que dans 40 %
(2/5) d’échantillons prélevés sur les semelles de chaussures de personnes présentes sur des
marchés, suggérant, selon les auteurs, que le sol urbain représente un réservoir important de L.
monocytogenes.
En France, Locatelli et al. (2013a) ont recherché L. monocytogenes au moyen d’une PCR
ciblant le gène prs spécifique de la bactérie dans 1232 échantillons de sol. Aucune L.
monocytogenes n’a été détectée à partir des ADN extraits des sols, soulignant que la présence
37
de cette bactérie dans les sols français est inférieure au seuil de détection de la qPCR, soit 104
eq.génome/g de sol sec. Locatelli et al. (2013a) ont aussi réalisé 53 prélèvements de sols
localisés sur 23 sites de Bourgogne (3 pâturages, 8 champs cultivés, 11 prairies et une forêt).
Ils ont isolé après enrichissement L. monocytogenes dans 17% des sols analysés, tous issus
des zones de pâturage, suggérant que le pathogène est bien présent dans certains types de sols,
notamment les pâturages, mais à une faible concentration, non détectable par les outils
moléculaires.
Alors que la fréquence de détection de L. monocytogenes paraît augmenter en présence de
pâturage, dans une étude menée en Irlande, Fox et al. (2009) n’ont détecté le pathogène que
dans un seul des 35 échantillons de sols prélevés dans 9 élevages de vaches laitières.
Toutefois, Nightingale et al. (2004) ont isolé L. monocytogenes dans 23% des 504 sols
d’exploitations bovines analysés (prairies, champs et cours de ferme). Dans leur étude, la
prévalence était plus élevée dans les exploitations de bovins et de petits ruminants pour
lesquelles des cas de listériose avaient été déclarés (35,3%) que dans les élevages non atteints
par la maladie (14,6%), confirmant le rôle des animaux malades dans la dissémination de la
bactérie.
2.3.6 Persistance dans les effluents d’élevages et impact des traitements
Bien que L. monocytogenes ait été détectée dans les effluents d’élevage, l’impact des
traitements sur la persistance de cette bactérie est peu documenté. Il existe néanmoins
quelques données sur la survie, estimée par méthode culturale, au cours du stockage des
effluents d’élevages ou de leur compostage dont les résultats sont reportés dans le tableau 9
(Hutchison et al., 2005; Nicholson et al., 2005; Erickson et al., 2014; Millner et al., 2014).
38
Tableau 9 : Impact des traitements des effluents d’élevages sur la persistance de L.
monocytogenes
Matrice et conditions expérimentales
Teneur initiale (UFC /g)
Temps de survie
références
Lisier de bovin - stocké - placé en digesteur anaérobie en batch Température de stockage du lisier : 4 et 17°C Température de la digestion anaérobie : 35°C Mesure du T90a
108
T90 Lisier stocké à 4°C : 84 jours Lisier stocké à 17°C : 29 jours Lisier en digesteur anaérobie (35°C) : 12 jours
Kearney et al. (1993)
Stockage de fumiers et de lisiers à l’extérieur Température : de 5 à 20°C Fumier de bovins (MS : 32 à 34%) Fumier de porcs (MS : 34%) Litière de volailles (MS : 55%) Lisier de vaches laitières (MS : 2 à 7%)
106
Durée de détection : Fumiers bovins et porcins : 4 jours Litière de volailles : 8 jours Lisier de vaches laitières : 185 jours
Nicholson et al. (2005)
Lisier porcin + sciure : composté en réacteurs maintenus à 25°C et à 55°C Humidité : 60% Lisier porcin stocké avec ou sans aération Humidité : 75 à 85% Température 20-25°C
106 -107
Abattement après 3 jours : Compost à 55°C : 4 log10 ; compost à 25°C : <1 log10 Lisier stocké en aérobiose : >3 log10 Lisier stocké sans aération : <1 log10 Réduction de 4-5 log10 après 14 jours quelle que soit la matrice Lisier stocké : détection jusqu’au 28ème jour, non détecté après 42 jours Compost : détection jusqu’au 56ème jour
Grewal et al. (2007)
Compost de fumier de vaches laitières obtenu après 30 jours de compostage. Inoculation du compost autoclavé ou non avec une souche de L. monocytogenes résistante à la rifampicine Suivi pendant 28 jours de stockage Taux d’humidité : 10 à 50% Température : 20-25°C (hiver) 20-30°C (printemps et été)
10 Compost non autoclavé : aucune détection Compost autoclavé : survie dépend de l’humidité et de la saison Taux d’humidité à 10% : survie de 14-21jours au printemps et en été survie de 21-28jours en hiver Taux d’humidité à 20% : survie de >28 jours au printemps et en hiver survie de 21-28jours en hiver Taux d’humidité ≥30% : survie de >28 jours
Kim et jiang (2010)
Fumier de bovins composté ou maintenu en tas Etude en microcosme Températures de 20°C, 37°C, 50°C et 60°C Suivi par méthode culturale et qPCR ciblant hlyA Mesure du T90
106 à 107 b
Fumier en tas, quantification par qPCR : T90 20°C : 36j ; 37°C : 5,6j ; 50°C : 2,3j ; 60°C : <2,3j Fumier en tas, quantification par dénombrement : T90 20°C : 11j ; 37° : 1,9j ; 50°C : 1.6j ; 60°C : 0,52j Compost, quantification par qPCR : T90 20°C : 65j ; 37° : 7,4j ; 50°C : 2,5j ; 60°C : 3,2j Compost, quantification par dénombrement : T90 20°C : 17j ; 37° : 1,6j ; 50°C : 0,6j ; 60°C : 0,5j
Klein et al. (2011)
Compost de fumier de veaux (urine + fèces +sciure) inoculé avec L. monocytogenes puis mélangé ou non à de la paille Température max (T max) atteinte en 2-3 jours Fumier : Taux d’humidité : 69%, T max : 45°C Fumier + paille Taux d’humidité : 67%, T max : 58°C
4 106 c Compost de fumier : Survie > 28 j en surface du tas Survie < 7 j au cœur du tas Compost de fumier +paille Survie <14 j en surface du tas Survie < 7 j au cœur du tas
Millner et al. (2014)
Compostage de fumier de porcs, de fumier de bovins et du fumier de volailles en réacteur pendant 4 jours Température initiale : 40°C Température après 4 jours : 42°C (porcs) ; 57,8°C (bovins) ; 66,7°C (volailles) Humidité initiale : 61 à 62 % Humidité après 4 jours 54 à 58% Souche marquée avec une protéine fluorescente
107
Abattement : Fumier de porcs et volailles : après 3 jours d’incubation : > 6 log10 Fumier de bovins : après 3 jours d’incubation : 3,5 log10
après 4 jours d’incubation : > 6 log10
Erickson et al. (2014)
aT90 : durée pour laquelle une réduction décimale des concentrations est obtenue ; b culture et qPCR, c poids sec
39
La persistance de L. monocytogenes varie de moins de 4 jours à 185 jours. Bien que les
données soient difficilement comparables en raison des conditions expérimentales spécifiques
à chaque étude, il ressort que la survie de L. monocytogenes dépend du traitement appliqué
(compostage, simple stockage en tas), du type de matrice (fumier, litière, lisier) et de la
température. La survie de L. monocytogenes diminue avec l’augmentation de la température.
Elle est également affectée par un faible taux d’humidité, un taux élevé d’ammoniac ou
d’acides gras volatiles, (Klein et al., 2011; Erickson et al., 2014). Les études dont les résultats
sont reportés dans le tableau 9 ne prennent en compte que les formes cultivables à l’exception
de l’étude de Klein et al. (2011) qui ont aussi utilisé la qPCR pour dénombrer L.
monocytogenes dans du fumier de bovins. Or, la cinétique de disparition des bactéries dépend
de la cible considérée (cellules cultivables ou copies de génome) comme l’ont montré les
travaux de Klein et al. (2011) qui ont observé une disparition plus rapide du nombre d’UFC
que du nombre de copies de génome. Les différences de 4 log10 entre le nombre de copies de
génome et le nombre de bactéries cultivables suggèrent que le compost ou le simple stockage
en tas du fumier de bovin favorise la persistance de formes non cultivables. Toutefois, même
si ces auteurs estiment avoir minimisé la quantité d’ADN extra cellulaire par des lavages en
tampon PBS et en utilisant une solution de KCL à 0,85%, il n’est pas possible d’exclure qu’ils
aient également quantifié l’ADN présent dans des cellules mortes.
2.3.7 Persistance de L. monocytogenes dans les sols
L. monocytogenes est capable de survivre plus d’un mois dans les sols amendés ou non avec
des lisiers et des fumiers (Jiang et al., 2004 ; Hutchison et al., 2005 ; Nicholson et al., 2005 ;
Moynihan et al., 2015). Sa persistance dépend de plusieurs paramètres comprenant des
facteurs intrinsèques à la bactérie (état physiologique, concentration) et des facteurs
environnementaux eux-mêmes répartis en facteurs abiotiques (structure physique et
composition chimique du sol, ensoleillement, précipitation, température) et biotiques (activité
de la flore endogène, compétition vis-à-vis du substrat, action des protozoaires,…). Le mode
de gestion des épandages est aussi à prendre en compte comme l’a montré l’étude de
Hutchison et al. (2004) sur la survie de L. monocytogenes dans un sol amendé avec différents
fertilisants (fumiers, lisiers, litières). La persistance était plus élevée lorsque que le fertilisant
était incorporé dans le sol immédiatement après l’épandage alors qu’une application
immédiate en surface ou un stockage de 7 jours des fertilisants avant l’incorporation,
diminuaient significativement le T90 du pathogène, ce que les auteurs ont attribué à l’effet
conjugué des rayons U.V. et du dessèchement. Dans cette étude, réalisée en hiver et en été,
40
Hutchison et al. (2004) n’ont pas observé un effet saison alors que les températures basses
privilégient la survie de L. monocytogenes (Jiang et al., 2004 ; Sidorenko et al., 2006).
Comme l’ont suggéré Hutchison et al. (2004), les différences de températures mesurées entre
les deux saisons dans les 3 semaines qui ont suivi le début de leurs expérimentations était trop
faibles (moins de 5°C) pour mettre en évidence un effet température.
La présence de matière organique et sa disponibilité jouent un rôle important sur la survie de
ce pathogène. L’apport d’éléments nutritifs via l’épandage de compost, de fumier ou lisier
modifie la survie de L. monocytogenes. En effet, l’application de lisier porcin en libérant
rapidement du carbone et de l’azote assimilable favorise l’activité de la flore du sol
conduisant à une diminution de la survie de L. monocytogenes (Jiang et al., 2004). Le type de
sol joue un rôle sur la survie de L. monocytogenes. En inoculant deux souches de L.
monocytogenes dans trois sols (forêt, terre arable et sol cultivé) à une teneur de 102 UFC/g,
Sidorenko et al. (2006) ont observé que la croissance de L. monocytogenes était favorisée
dans les sols possédant une faible teneur en acides humiques et une forte concentration en
calcium et en magnésium. Dans l’étude menée par Nicholson et al. (2005) qui ont comparé à
l’échelle de parcelles expérimentales l’impact de 2 types de sol (sableux et argileux) et 8 types
de fertilisants organiques, L. monocytogenes a survécu plus longtemps dans le sol argileux
que dans le sol sableux indépendamment de la matrice épandue (fumier, lisier, litière) (tableau
10). L'influence du type de fertilisant semble dépendre du type de sol. Ainsi, la persistance de
L. monocytogenes inoculée dans la litière de volaille, de 4 jours dans le sol sableux, était
significativement plus faible que celle observée lorsque la bactérie a été ensemencée dans des
lisiers et les fumiers, alors que cette différence de comportement n'a pas été observée pour le
sol argileux. Dowe et al. (1997) ont également montré que L. monocytogenes était moins
longtemps détectable dans les sols sableux que dans les sols limoneux ou argileux. Ces
différences peuvent en partie être attribuées à la structure du sol plus ou moins propice à la
migration et à la rétention des bactéries.
La survie de L. monocytogenes dépend également de facteurs biotiques. L’effet de la flore
autochtone a été mis en évidence par des études comparant la survie de L. monocytogenes
dans des microcosmes non stériles et stérilisés par autoclavage. Quel que soit le type de
matrice inoculée (sols, composts, boues de station d'épuration ) L. monocytogenes persiste
plus longtemps dans les matrices stérilisées (Jiang et al., 2004; Kim et Jiang., 2010;
McLaughlin et al., 2011; Piveteau et al., 2011). Il convient de souligner que l’autoclavage
41
entraîne une modification de la composition chimique conduisant à une meilleure
disponibilité des substrats organiques, susceptible de favoriser la survie du pathogène.
Tableau 10 : Persistance de L. monocytogenes dans les sols après épandage d’effluents
d’élevages. Matrice
Conditions expérimentales
Teneur initiale UFC / g
Survie (exprimée en T90 ou en durée de détection)
références
Fumier de bovins Lisier de vaches laitières Fumier de porcs Litière de volailles Lisier de porcs
Fertilisant épandu et incorporé directement épandu en surface épandu après un stockage de 7 jours
106 fumier de bovinT90 : 2,9 à 3,5 jours Lisier de vaches laitières T90: 0,9 à 1,4 jours Fumier de porcs T90: 0,9 à 1,3 jours Lisier de volailles T90 : 1 à 1 jours Lisier de porcs T90: 0,8 à 1,1 jours
Hutchison et al. (2004b)
Sol autoclavé + lisier bovin (sol A) Sol non-autoclavé + lisier bovin (Sol NA)
3 températures : 5, 15 et 21°C
105 à 106
Sol A : survie de 43 jours à 5°C et 15°C ; survie de 14 jours à 21°C Sol NA : détectée après 43 jours à 5°C et survie 21 jours à 15°C et à 21°C
Jiang et al. (2004)
Fumier, lisier ou eau de lavage de porcs, de bovins, de volailles et de moutons
épandage sur des sols de pâture
106
T90 moyen : 2,3 jours Détection pendant 63 jours Non détecté après 128 jours
Hutchison et al. (2005)
Fumier de bovins, de vaches laitières, de porcs, de moutons litière de volailles, lisier de bovins, de vaches laitières, de porcs épandus
2 types de sol : Sableux : température 10-20°C, humidité 12% Argileux : température 15-18°C, humidité 31% Lisier incorporé aux sols à une profondeur de 15cm
106 b Nombre de jours de détection : Fumier de bovins : 16 à 32, fumier de vaches : 16 à >32 Fumier de porcs : 8 à >32a , fumier de moutons : >32a Litière de volaille : 4 à >a lisier de bovins : 8 à 32, lisier de vaches : 16 à 32 lisier de porcs : 8 à >32a
Nicholson et al. (2005)
12 types de sol Humidité de 36% à 54% MO : 3 à 13,8% pH : 5,5 à 7,6
Microcosmes maintenus à 10°C
106
Taux de mortalité de L. monocytogenes en jour : de 0,07à 0,4jours-1 selon les sols
Moynihan et al. (2015)
100 sols étudiés et analyse de la survie de L.monocytogenes en micrcosmes pour 9 types de sols non stérilisés et stérilisés (rayons gamma) Humidité : 80% pH : 4,7 à 7,9
Microcosmes maintenus à 20°C
106b (poids sec)
Survie dans 100 sols en jours : 71 sols : > 84 j 21 sols : 7 à 14 j Survie en microcosmes (sols non stérilisés) en jours : 5 sols : > 84 j ; 3 sols : 7 à 14 j ; 1 sol : < 7j Survie en microcosmes (sols stérilisés) : croissance de 1 à 3 log10 après 84 jours dans 3 sols , absence de croissance et diminution de la concenration en L.monocytogenes dans 5 sols
Locatelli et al. (2013b)
a Non détecté après 9 mois ; b teneur dans l’effluent ; c poids sec
Locatelli et al. (2013b) ont souligné l’existence d’une interaction entre la flore endogène et les
caractéristiques abiotiques des sols. Ainsi, les données de leur étude menée sur L.
monocytogenes EGD-e, inoculée en microcosmes sur 9 sols non stérilisés ou stérilisés avec
des rayons gamma, ont suggéré que la flore endogène peut limiter la survie de L.
monocytogenes lorsque le pH du sol est supérieur à 7, alors que dans les sols acides (inferieurs
à 5,6), la survie du pathogène dans des microcosmes stérilisés et non stérilisés ne différaient
pas significativement. Par ailleurs, ces auteurs ont observé que L. monocytogenes se
42
comportait différemment selon les sols. Ainsi, dans les sols stérilisés, une croissance de L.
monocytogenes n’a été observée que dans les trois sols ayant le pH le plus élevé (≥7),
suggérant que les caractéristiques abiotiques des six autres sols étaient défavorables à la
survie de la bactérie.
Moynihan et al. (2015) ont comparé le comportement d’une souche de L. monocytogenes dans
des microcosmes constitués de 12 sols se différenciant par leurs caractéristiques
pédologiques, incubés à 10°C. Les auteurs ont analysé les caractéristiques physico-chimiques
des sols ainsi que les profils phénotypiques des communautés microbiennes obtenus par
l’analyse des profils des acides gras des phospholipides (AGPL). L. monocytogenes a persisté
plus de 70 jours quelle que soit l’origine du sol. Contrairement aux résultats obtenus par
Nicholson et al. (2005), aucune corrélation n’a été mise en évidence entre la survie de L.
monocytogenes et les caractéristiques physicochimiques et pédologiques des sols. Or, le taux
de mortalité de la bactérie s’est avéré plus élevé dans les sols de prairies que dans les terres
arables et les sols de forêt. L’analyse statistique multifactorielle réalisée sur les profils des
AGPL et les taux de survie du pathogène a montré que les communautés des sols de prairie
ont un effet plus antagoniste envers L. monocytogenes que celles associées aux sols des terres
arables ou forestiers. Les auteurs ont attribué cet effet à des interactions entre L.
monocytogenes et la communauté microbienne prise dans son ensemble et non à quelques
membres spécifiques de cette communauté dans la mesure où les profils ne présentaient pas
d’AGPL prédominants. Cependant comme l’ont souligné les auteurs, les profils
phénotypiques des AGPL ne peuvent pas être utilisés pour estimer les indices de diversité et
l’abondance des espèces présentes dans le sol, nécessitant une approche génomique
supplémentaire. Dans une autre étude, Vivant et al. (2013) ont utilisé une technique de
dilution-extinction afin de générer un gradient de diversité des communautés microbiennes.
Ils ont ainsi montré que la survie de L. monocytogenes était inversement proportionnelle à la
diversité de la communauté microbienne du sol. Cette étude a également mis en évidence que
la composition phylogénétique de la flore autochtone influe sur la survie de L.
monocytogenes. Il convient de souligner que les bactéries lactiques appartenant aux genres
Lactobacillus, Pediococcus et Leuconostoc ont une activité antagoniste par la production de
bactériocines ou de métabolites (H2O2, acide lactique, par exemple) dirigée contre
L. monocytogenes (Pucci et al., 1988; Schillinger et al., 1991; Winkowski et al., 1993; Goff et
al., 1996; Trias et al., 2008; Pujato et al., 2014). La présence de ces bactéries dans de le sol et
43
dans les lisiers (Ostling et Lindgren, 1991; Ouwerkerk et Klieve, 2001; Magnusson et al.,
2002; Chen et al., 2005; Yanagida et al., 2006; Marti et al., 2009) peut dont jouer un rôle dans
l’inhibition de L. monocytogenes dans ces environnements.
Les protozoaires peuvent également modifier la survie de L. monocytogenes dans
l’environnement en l’éliminant ou en ayant un effet protecteur (Anderson et al., 2003;
Anderson et al., 2006; Forrester et al., 2007; Zhou et al., 2007; Guha et al., 2013). Ainsi,
l’amibe Acanthamoeba polyphaga digère rapidement L. monocytogenes (Akya et al., 2010)
alors que Tetrahymena pyriformis (cillié holotriche) permet la multiplication de la bactérie
dans ses vacuoles (Ly et Muller, 1990a; b).
Les relations interspécifiques (compétition ou mutualisme) avec d’autres microorganismes, la
prédation ou la protection par des protozoaires rendent difficiles l’estimation de l’influence
des paramètres biotiques sur la survie de ce pathogène.
2.3.8 Transfert de L. monocytogenes du sol aux végétaux
La présence de L. monocytogenes dans les sols pourrait être à l’origine de la contamination de
fruits et de légumes (Laksanalamai et al., 2012; Jamali et al., 2013). En effet, ce pathogène a
été mis en évidence à de faible teneurs dans des produits maraîchers tels que les choux, les
salades, les tomates, les pommes de terre, les pousses de soja et les concombres (Nguyenthe et
Carlin, 1994; Beuchat, 1996; Szabo et al., 2000; Francis et al., 2014). L. monocytogenes
inoculée dans le sol est capable de coloniser la surface de végétaux tels que les carottes, les
radis et les pousses de soja mais son internalisation n’as pas été constatée (Vanrenterghem et
al., 1991; Kutter et al., 2006).
Après un épandage de boues déshydratées d’une station d'épuration contenant 6 L.
monocytogenes / g sur un sol initialement exempt du pathogène, Al-Ghazali et Al-Azawi,
(1990) ont détecté L. monocytogenes dans 10% des échantillons de luzerne cultivée sur le sol
amendé. Ces auteurs ont également étudié le comportement de L. monocytogenes après apport
de boues contaminées dans des microcosmes contenant de la terre stérilisée et des graines de
persil. La bactérie a été mise en évidence dans le persil trois semaines après la germination
des graines. Cependant, la localisation des bactéries (système racinaire ou parties aériennes)
n’a pas été précisée par les auteurs.
Le transfert de L. monocytogenes du sol vers les végétaux n’est pas systématique. Ainsi, Liao
et al. (2003) n’ont pas détecté L. monocytogenes sur des pommes de terre plantées dans un sol
44
fertilisé avec du lisier de vaches. Aucune L. monocytogenes n’a été détectée sur les tiges, les
feuilles et les grains de maïs et de blés, cultivés sur des sols fertilisés avec du fumier de
vaches (Brochier et al., 2012). Dans un sol fertilisé avec du compost de fumier de bovins, L.
innocua, utilisée comme modèle de L. monocytogenes, a diminué de 7 log10 en 3 mois dans le
sol. La bactérie a été détectée sur les feuilles de persil cultivé sur le sol pendant le premier
mois qui a suivi la fertilisation (Girardin et al., 2005). Le transfert de la bactérie sur le persil a
été attribué par les auteurs de l’étude aux éclaboussures dues à la pluie et l'irrigation. Une
autre étude sur le transfert de L. innocua d’un sol amendé avec du compost contaminé vers
des plants de salades a montré la présence de la bactérie sur les feuilles externes et internes
pendant les 9 semaines d’expérience (Oliveira et al., 2011). Les auteurs ont toutefois observé
un niveau de contamination plus faible des feuilles internes que des feuilles externes, ce qui
peut s’expliquer par le contact direct de ces dernières avec le sol. Il convient de souligner que
les auteurs ont observé un transfert des bactéries du sol contaminé aux parties comestibles des
feuilles de salade mais sans démontrer s'il y avait eu internalisation via le système racinaire,
ou par contact direct avec le sol.
Il est important de noter que les déjections animales en contaminant les sols sur lesquels sont
cultivés des végétaux destinés à être consommés crus peuvent être à l’origine de listériose. A
titre illustratif, une épidémie de listériose est survenue au Canada en 1981 après la
consommation de choux cultivés dans un sol fertilisé par du fumier de moutons dont certains
étaient porteurs de L. monocytogenes (Schlech et al., 1983). Le ribotypage de souches isolées
d’ensilage et de fèces de vaches laitières d’une exploitation agricole suivie pendant 3 mois a
montré que des ribotypes présents dans les fèces étaient également retrouvés dans les
ensilages (Ho et al., 2007).
Le portage de L. monocytogenes par les animaux d’élevages peut être à l’origine de la
contamination des matières premières agricoles et notamment de la viande (Barros et al.,
2007; Mohammed et al., 2010; Morild et al., 2011; Dmowska et al., 2013; Guariglia-Oropeza
et al., 2014) ou le lait (Garcia et al., 1996; Yoshida et al., 1998; Schaffner et al., 2003;
Schoder et al., 2003; Hunt et al., 2012). Par ailleurs, avec les animaux sauvages ils
représentent des vecteurs potentiels de L. monocytogenes dans l’environnement (Hellstrom et
al., 2008).
La présence de L. monocytogenes dans les fèces d’animaux d’élevages peut donc conduire (i)
45
à la contamination du sol et des végétaux via le pâturage et l’épandage du lisier ou du fumier,
(ii) à la contamination de l’eau de surface ou souterraine par des phénomènes de ruissellement
ou d’infiltration après des épisodes pluvieux à partir de sols contaminés par les déjections
animales et (iii) à la contamination de la viande par le transfert de de L. monocytogenes dans
l’abattoir ou dans les usines de transformation des aliments carnés (par contact des
équipements avec les viscères). De plus, l'excrétion fécale de L. monocytogenes peut
contaminer l’environnement agricole et les aliments pour animaux (par la fertilisation des sols
utilisés pour cultiver les végétaux destinés à l’ensilage), entretenant ainsi les cycles d'infection
notamment chez ruminants.
Ainsi L. monocytogenes est capable de coloniser et de persister dans de nombreux
environnements. Le caractère ubiquiste de ce pathogène et sa persistance, peuvent être
expliqués par des mécanismes efficaces de réponse au stress.
3 Réponse au stress et formes viables mais non cultivables de L. monocytogenes
3.1 Facteurs de stress et mécanismes d’adaptation chez L. monocytogenes
L. monocytogenes possède une capacité d’adaptation aux stress remarquable qui lui permet
de coloniser de nombreux environnements.
3.1.1 Notions générales sur le stress microbien
Le stress microbien est défini comme étant "tout facteur biologique, physique ou chimique,
qui affecte négativement la croissance ou la survie des micro-organismes" (Csonka, 1989).
Les facteurs de stress biologiques incluent la compétition, la synthèse de métabolites produits
par les bactéries et l'antagonisme microbien (Abee et Wouters, 1999). Ils ont un impact sur la
physiologie, la fonction et l'activité des bactéries. Selon la sévérité de leur impact, ils peuvent
être classés en stress sub-létaux et en stress létaux ou sévères (Donnelly, 2001). Dans le cas
d’un stress sub-létal, la bactérie peut retrouver son état physiologique initial lors du retour à
des conditions favorables, ou grâce à sa capacité d’adaptation qui permet aux cellules lésées
par le stress de se réparer (Lou et Yousef, 1996). Lorsque le stress est létal, la pression subie
par la bactérie est tellement forte que les cellules sont lésées de façon irréversible (Sheridan et
al., 1994; Hoffmans et al., 1997). Selon Hill et al. (2002), l’adaptation aux stress est
également définie comme la capacité que possède une bactérie soumise à un stress sub-léthal
à résister à celui-ci lorsqu’elle est à nouveau soumise à ce stress. Il a été montré que des
mécanismes mis en jeux pour répondre aux stress sub-létaux peuvent provoquer une tolérance
46
à des facteurs de stress habituellement létaux (Foster, 1999). Ce mécanisme de résistance,
appelé "protection croisée" a été mis en évidence chez L. monocytogenes (Begley et al., 2002;
Shen et al., 2014).
3.1.2 Réponse au stress chez L. monocytogenes
L. monocytogenes possède de nombreux régulateurs de la réponse au stress qui ont été mis en
évidence ou étudiés sur un nombre limité de souches et notamment sur la souche EGD-e.
L. monocytogenes EGD-e possède 209 gènes (représentant 7,3% de son génome) codant pour
des régulateurs transcriptionnels (Glaser et al., 2001). Ce-sont des protéines capables de
réprimer (répresseur) ou de stimuler (activateur) l’initiation de la synthèse des ARNm en
empêchant ou en favorisant l’assemblage du complexe de l’initiation. Certains régulateurs
peuvent être à la fois activateur et répresseur (Perez-Rueda et Collado-Vides., 2000). Deux
types de régulateurs transcriptionnels jouent un rôle majeur chez L. monocytogenes : les
facteurs de transcription et les systèmes à deux composants. La réponse à un stress peut faire
intervenir des régulateurs spécifiques à un stress donné ou des régulateurs globaux (protéines
générales de stress) répondant à diverses contraintes environnementales.
3.1.3 Régulateurs globaux en réponse à un stress
Les facteurs de transcription (facteurs sigma), les systèmes à deux composants et les ARN
non codants sont impliqués dans la régulation et le contrôle de la réponse générale aux stress.
3.1.3.1 Les facteurs sigma
Leur fixation sur l’ARN polymérase leur confèrent une spécificité de reconnaissance vis-à-vis
de certains promoteurs (Haldenwang., 1995). Cinq facteurs sigma (A, B, C, H, L) ont
été identifiés chez L. monocytogenes EGD-e (Glaser et al., 2001). Le facteur A, impliqué
dans la transcription de la majorité des gènes, permet de conserver les voies métaboliques et
l’essentiel des gènes opérationnels (Gruber et Gross., 2003). Le facteur B, le plus étudié, a
une action globale sur la physiologie de la bactérie. Mujahid et al. (2013) ont montré que 134
gènes étaient sous le contrôle de ce facteur. Les trois autres facteurs sigma sont impliqués
dans la réponse au stress thermique (C, H, L), au stress nutritif et alcalin (H) et au stress
osmotique (L) (Zhang et al., 2005 ; Rea et al., 2004 ; Raimann et al., 2009).
3.1.3.2 Les systèmes à deux composants
Au nombre de 16 chez L. monocytogenes EGD-e (Glaser et al., 2001), ils comprennent une
protéine Histidine Kinase senseur (HK) et une protéine régulatrice de réponse (RR) qui
permettent à la bactérie de percevoir et de répondre aux changements des conditions physico-
47
chimiques et biotiques de l’environnement. Les protéines HK, intégrées dans la membrane,
s’auto-phosphorylent lorsqu’elles perçoivent un signal de stress. Elles activent les protéines
RR par phosphorylation qui activent à leur tour une réponse cellulaire par induction
transcriptionnelle.
3.1.3.3 Les ARNnc
Ils régulent la transcription au niveau post-transcriptionnel en modifiant la structure
secondaire des ARNm, en s’appariant à l’ARNm ou en modifiant l’activité de certaines
protéines. Chez L. monocytogenes, 438 ARNnc ont été identifiés (Behrens et al., 2014). Ils
sont regroupés en plusieurs classes en fonction de leur mode d’action : les ARN cis-
régulateurs, les ARN antisens cis-régulateurs et les petits ARN trans-régulateurs.
Ces trois types de régulateurs s’insèrent dans des réseaux de régulation plus globaux. Il existe
donc des interconnexions complexes qui permettent aux bactéries de s’adapter rapidement et
de produire des ARNm répondant à leurs besoins physiologiques (Chaturongakul et al., 2008;
Mellin et Cossart, 2012).
3.1.4 Mécanismes mis en jeux en réponses à des stress spécifiques
3.1.4.1 Réponse aux stress thermiques
Plusieurs mécanismes permettent d’expliquer la capacité d’adaptation à des changements de
température. Trois des cinq facteurs sigma identifiés chez L. monocytogenes (σB, σC, σL )
régulent la transcription génique lors de stress thermiques (Becker et al., 2000 ; Wemekamp-
Kamphuis et al., 2004 ; Zhang et al., 2005 ; Mattila et al., 2012 ; Wang et al., 2014).
- Réponse aux basses températures
Les phospholipides de la membrane cellulaire deviennent plus rigides perturbant les fonctions
de la membrane et des protéines associées à celle-ci (Tasara et Stephan, 2006; Schneiter et
Toulmay, 2007). Pour conserver la fluidité membranaire à basse température, L.
monocytogenes modifie la composition en acides gras de la membrane en augmentant le
nombre d’acides gras insaturés ainsi que la proportion des chaînes d’acides gras C15:0 au
détriment des chaînes C17:0 (Annous et al., 1997; Beales, 2004). La diminution de la
longueur des chaînes d’acides gras abaisse leur température de fusion, contribuant ainsi au
maintien de la fluidité de la membrane à basse température (Beales., 2004). Des changements
de l’expression génique induisent la synthèse de 12 protéines de choc froid Csps ("cold shock
48
proteins") et de 4 protéines d’acclimatation au froid Caps ("cold acclimatation proteins")
(Bayles et al., 1996).
Liu et al. (2002) ont observé que lorsque L. monocytogenes 10403S était soumise à une
température de 10°C, l’expression des ARNm codant des protéines chaperonnes telles que
GroEL, ClpP et ClpB était augmentée, reflétant la présence de protéines mal repliées ou
endommagées par le froid. En effet, les protéases Clp sont impliquées dans la dégradation des
polypeptides endommagés et dans la récupération d’acides aminés et GroEL participe à la
gestion des protéines dépliées, endommagés ou agrégées ainsi qu’au repliement des protéines.
Cacace et al. (2010) ont montré par une approche protéomique que l’adaptation au froid de L.
monocytogenes augmentait la production de protéines impliquées dans les voies métaboliques
productrices d’énergie telles que la glycolyse ou la voie Pta-AckA (phosphotransacetylase-
acetate kinase A), suggérant que la résistance au froid augmente les besoins énergétiques de la
bactérie.
Par ailleurs, Wemekamp-Kamphuis et al. (2004) ont montré que pour résister au froid, L.
monocytogenes accumule des composés osmo et cryo-protecteurs (appelés osmolytes) tels que
la bétaïne et la carnitine dont le transport est assuré par les transporteurs membranaires BetL
et Gbu pour la bétaïne et par OpuC pour la carnitine. Une étude menée par Mattila et al.
(2011) sur L. monocytogenes EGD-e a révélé que le niveau d’expression des gènes de
mobilité flhA et motA était significativement plus élevé à 3°C qu’à 37°C, soulignant le rôle
majeur des flagelles dans l’adaptation de la bactérie au froid. Cependant, l’adaptation aux
basses températures dépend des souches comme l’ont souligné Arguedas-Villa et al. (2010)
qui ont comparé la réponse de 20 souches isolées de malades, de produits alimentaires et
d’usines de production de viande, soumises à une température de 4°C. Les souches étudiées se
sont différenciées par leur taux de croissance et leur activation transcriptionnelle de gènes
d'adaptation au froid. Toutefois, les différences observées n’étaient pas corrélées à l’origine
des souches.
- Réponse aux températures élevées
Pour répondre à une élévation de température, L. monocytogenes possède deux mécanismes
de réponse spécifique, appelés "class I heat shock response" et "class III heat shock response"
ainsi qu’un mécanisme de réponse générale appelé "class II stress response". Xie et al. (2014)
ont suggéré que l’ARNnc Rli87 intervient aussi dans la régulation des gènes impliqués dans la
réponse à choc thermique (42°C) chez L. monocytogenes EGD-e.
49
Les gènes de la classe I sont régulés par le répresseur HrcA (Benson et Haldenwang, 1993 ;
Schulz et Schumann, 1996). Ils codent pour les "Heat Shock Proteins" (HSP) dnaK et dnaJ et
pour les protéines chaperonnes groES et groEL. Les HSP protègent les cellules des élévations
de température. Elles sont codées par les gènes hsp70 et hsp90 qui sont sous la régulation du
facteur B (Hu et al., 2007a; Hu et al., 2007b). Les gènes de la classe III, régulés par le
répresseur CtsR, codent pour des protéines chaperonnes (dnaK et dnaJ) et des protéases Clp
ATP dépendantes qui dégradent les protéines mal repliées ou endommagées par le stress
thermique.
Les gènes de la classe II codent des protéines générales de stress qui sont sous le contrôle du
facteur B.
L’analyse génomique par puce à ADN de L. monocytogenes EGD-e soumise à une
température de 48°C a montré que la majorité des gènes des classes I, II et III étaient
surexprimés et que l’exposition à une température élevée, entraînait une élongation de la
cellule et empêchait la division cellulaire (van der Veen et al., 2007).
3.1.4.2 Réponse au stress alcalin
L. monocytogenes a la capacité de pouvoir survivre jusqu’à pH 9,3. Lorsque L.
monocytogenes est soumise à un changement de pH, les cellules prennent une forme allongée
filamenteuse multinucléée (Giotis et al., 2007). La résistance au stress alcalin implique le
système "Alkali-Tolerance Response" (AlTR) dont les mécanismes d’action ont été décrits
par Giotis et al.(2008b). Le système AlTR met en jeu des combinaisons de réseaux de
régulation complexes qui limitent les dépenses d’énergie et mobilisent les sources de carbone.
Ces données sont corroborées par l’étude protéomique de Nilsson et al. (2013) réalisée sur le
génome de L. monocytogenes EGD-e. Les auteurs ont mis en évidence, lorsque la souche est
soumise à un stress alcalin, un shift des voies métaboliques qui lui permet d’utiliser les voies
anaérobies moins coûteuses en énergie que les voies aérobies.
Les facteurs de régulation B et H sont impliqués dans la résistance au stress alcalin (Rea et
al., 2004; Giotis et al., 2008a). Xie et al. (2014) ont montré que l’ARNnc Rli87 régule
l’expression de 5 gènes lorsque L. monocytogenes EGD-e est soumise à un pH 9.
50
3.1.4.3 Réponse au stress acide
Plusieurs études ont mis en évidence le rôle central joué par le facteur B dans la résistance
au stress acide (Wiedmann et al., 1998; Ferreira et al., 2001; Ferreira et al., 2003; Abram et
al., 2008).
L. monocytogenes possède plusieurs systèmes qui régulent son pH intracellulaire quand elle
est exposée à un environnement acide (pH < 5,5). Parmi ceux-ci, le système "Acid Tolerance
Response" (ATR) implique 23 protéines dont 11 sont induites et 12 réprimées (Davis et al.,
1996; Odriscoll et al., 1996). Ce système implique également la synthèse des protéines
chaperonnes GroEL et des ATP synthases (Phan-Thanh et al., 2000).
Le système GAD (Glutamate décarboxylase), composé de 2 glutamate/GABA anti
transporteurs (GadT1 et GadT2) et de 3 glutamate décarboxylases (GadD1, GadD2, et
GadD3) intervient lors de changement du pH. Ce système permettrait l’augmentation du pH
cytoplasmique par la perte de protons induite par le système GAD (Cotter et Hill., 2003).
Toutefois la présence de ces systèmes dépend des souches et paraît associé aux sérotypes et
aux lignées de L. monocytogenes. Ainsi, Chen et al. (2012) ont mis en évidence les gènes
GadD2/T2 et GadD3 chez la totalité des 164 souches de L. monocytogenes incluses dans leur
étude tandis que le système GadT1/GadD1 n’était présent que chez 36,6% des souches. Le
système GadT1/GadD1, systématiquement retrouvé chez les souches de sérotype 4b et de la
lignée IV, n’était présent que chez 68,5% des souches du sérotype 1/2c, 13, 8 % des souches
de la lignée III et 3,4% des souches de sérotype 1/2b.
Deux autres systèmes sont impliqués dans la régulation du stress acide : "l’arginine deiminase
pathway" (ADI) et "l’agmatine deiminase system" (AgDI) qui contribuent à équilibrer le pH
intracellulaire (Ryan et al., 2008 ; Chen et al., 2011 ; Smith et al., 2013). Le système ADI via
le catabolisme de l'arginine, produit de l’ornithine et des ions ammonium qui protègent les
cellules des pH acides (Ryan et al., 2009). Les gènes du système ADI sont sous le contrôle du
régulateur ArgR (Ryan et al., 2009) et du facteur B (Hain et al., 2008). Le système AgDi
implique l’enzyme AgDI, la "catabolic putrescine carbamoyltransferase" (c-PTC) et la
carbamate kinase (Chen et al., 2011). Les gènes aguA1 et aguA2 codent pour les protéines
putatives agmatine deiminases (AgDIs), AguA1 et AguA2. La transcription de aguA1 et de
aguA2 est significativement augmentée à pH 5,0. Contrairement à la délétion de aguA2 qui ne
perturbe pas le comportement de L. monocytogenes 10403S soumise à un pH de 2,5, celle de
aguA1 empêche la survie de la souche. Ceci signifierait que seul AguA1 serait impliqué dans
le système AgDI lors d’une diminution du pH (Cheng et al., 2013).
51
L. monocytogenes possède aussi un système de régulation à deux composants, lisK (qui code
une histidine kinase) et lisR (qui code des régulateurs de réponses), qui intervient dans
l’adaptation au pH acide. Le système permet de détecter des changements de pH dans
l’environnement proche des bactéries via l’histidine kinase associée à la membrane et de
réguler l’expression génique via le régulateur de réponse (Cotter et al., 1999).
3.1.4.4 Réponse au stress osmotique
L. monocytogenes est capable lors d’un stress osmotique d’induire la synthèse de protéines
spécifiques. Elle augmente ainsi l’expression des gènes des opérons betL, opuC et gbu
permettant la synthèse des protéines impliquées dans le transport de solutés (Duche et al.,
2002b; Chan et al., 2007).
L’adaptation de L. monocytogenes au stress salin fait entrer en jeu l’accumulation d’ions et de
solutés organiques qui permet de contebalancer la pression osmotique du milieu environnant.
L’augmentation de la synthèse de "Salt sock proteins" (Ssp) et de "stress acclimation
protéins" (Sap) a été observée par Duche et al. (2002b) qui ont réalisé une analyse
protéomique de L. monocytogenes LO28 soumise à un stress osmotique (3,5 % de NaCl final).
Douze protéines ont été induites lors de ce stress. Elles comprenaient deux proteines
gérénérales de stress (DnaK et Ctc), des transporteurs (GbuA et le système enzymatique IIAB
mannose-specific phosphotransferase) ainsi que des protéines du métabolisme général
(alanine dehydrogenase, CcpA, CysK, EF-Tu, Gap, GuaB, PdhA, et PdhD) (Duche et al.,
2002a).
Les facteurs B et L sont impliqués dans la régulation des réponses liées au stress osmotique
(Utratna et al., 2011; Zhang et al., 2011; Huang et al., 2015 ; Raimann et al., 2009).
Le système à deux composants Kdp mis en évidence chez L. monocytogenes LO28-e en
présence de NaCl à 10%, permet le transport des ions K+ dont l’accumulation dans le
cytoplasme protège les cellules du stress osmotique (Kallipolitis et Ingmer, 2001). De même,
Brondsted et al. (2003) ont souligné l’importance des gènes kdpE et orfX, dans la survie de L.
monocytogenes EGD-e en présence de NaCl à 2 %.
Des solutés tels que la glycine, la bétaïne, l’acetyl carnitine, la proline bétaïne, la carnitine,
l’ϒ-butyrobetaine et le 3-dimethylsulphoniopropionate jouent un rôle osmoprotecteur chez L.
monocytogenes comme l’ont rapporté Bayles et Wilkinson, (2000). Ces auteurs ont comparé
52
le développement de deux souches de L. monocytogenes (ScottA et 104035) cultivées dans un
milieu contenant 0,7M de NaCl sans soluté (milieu contrôle) et en présence des solutés
ajoutés séparément à une concentration de 1 mM. Ils ont observé des taux de croissance de
1,5 à 2,5 plus élevés des deux souches en présence des solutés par rapport à ceux observés
dans le milieu contrôle.
Il convient de souligner qu’il existe de nombreux points communs dans la réponse au stress
osmotique et celle engendrée lors d’un stress thermique. L’étude protéomique de Pittman et
al. (2014) a montré qu’un choc thermique (passage de 4°C à 37°C) de L. monocytogenes
EGD-e améliore sa survie lorsqu’elle est exposée ensuite à un stress osmotique (3% NaCl),
indiquant l’existence d’un mécanisme de "protection croisée" entre les deux types de stress.
L’analyse génomique comparative de Pittman et al. (2014) a permis de mettre en évidence
que les protéines impliquées dans le maintien des parois cellulaires et dans les processus
cellulaires ("penicillin binding proteins", transporteurs d'osmolytes) ainsi que les processus
impliqués dans le métabolisme des acides aminés, sont surexprimés lorsque les bactéries sont
exposées à un choc thermique avant un choc osmotique.
3.1.4.5 Réponse à la limitation en nutriments
Dans les milieux pauvres en nutriments, comme d’autres espèces bactériennes, L.
monocytogenes, met en place la réponse SSR (starvation survival response) qui lui permet de
survivre sans se multiplier (Morita, 1990 ; Watson et al., 1998). La réponse SSR est
caractérisée par une perte rapide de cultivabilité (90 à 99% ) puis d’un maintien d’une faible
partie de population initiale, capable de survivre grâce à la libération de nutriments issus de la
lyse des cellules mortes (Herbert et Foster, 2001). Chez L. monocytogenes EGD-e, elle
conduit à une diminution de la taille des cellules. Elle permet également à la bactérie de
résister aux stress environnementaux (notamment les stress oxydatif et thermique). La réponse
SSR fait intervenir les régulateurs B et PrfA. Herbert et Foster (2001) ont montré que
l’activateur transcriptionnel PrfA régule non seulement l’adaptation au manque de nutriments
mais également la résistance aux stress environnementaux.
Lorsque L. monocytogenes est hors des cellules d’un hôte, les sources de carbone telles que le
glucose et le cellobiose sont transportées par les systèmes PTS (phosphoenol pyruvate (PEP)-
dependent phosphotransferase systems) (Goerke et Stuelke, 2008; Wang et al., 2014). Les
facteurs σB, σH, σL co-régulent l'expression de gènes codant des PTS et contrôlent ainsi le
métabolisme des glucides par la régulation de l'activité PTS (Wang et al., 2014). L.
53
monocytogenes EGD-e possède 7 familles de système PTS: PTS Glc, PTS Man, PTS Lac, PTS Fru,
PTS Gut, PTSGat et PTS Asc , permettant le transport de différents sucres à l’intérieur de la
cellule (Barabote et al., 2005). D’autres régulateurs transcriptionnels peuvent aussi jouer un
rôle dans l’utilisation des carbohydrates à l’exemple de la protéine lmo0501 qui intervient
dans assimilation et le métabolisme du glucose et du fructose (Michell et al., 2001).
L’ensemble de ces systèmes permettent à la bactérie l’accès au substrat et son assimilation.
Le régulateur transcriptionnel CodY qui contrôle l’expression de plusieurs gènes en réponse à
la disponibilité de nutriments est présent chez L. monocytogenes. Son activité est modulée par
le GTP et les acides aminés branchés qui augmentent son affinité pour l’ADN. Lorsque la
concentration en nutriments est réduite, le taux de GTP et d’acides aminés branchés
diminuent, conduisant à une diminution de l’activité de CodY. Chez L. monocytogenes EGD-
e, les gènes du régulateur CodY permettent le transport de sucres grâce aux transporteurs
ABC (3 constituants de l’enzyme II, protéine de transport membranaire spécifique de sucres)
et à 8 gènes du système PTS (Bennett et al., 2007). Le régulon CodY contient également des
gènes impliqués dans la synthèse et le métabolisme des acides aminés, l’assimilation de
l’azote et l’absorption de sucres.
3.1.4.6 Réponse à la présence de composés toxiques
La réponse au stress engendrée par la présence de composés toxiques tels que les
antibiotiques et de bactériocines est régulée par les facteurs σL et σB (Palmer et al., 2009,
Mattila et al., 2012). Il a en effet été montré que la délétion de σL réduisait la résistance de L.
monocytogenes EGD-e aux composés qui ciblent des structures cellulaires et des fonctions
métaboliques à l’exemple des inhibiteurs de synthèse des protéines (aminoglycosides,
tétracyclines et macrolides) et des antibiotiques ciblant la synthèse de la paroi bactérienne
(béta-lactames, céphalosporines). Mattila et al. (2012) ont observé que la souche EGD-e
mutante sigL était plus sensible que la souche parente aux composés agissant sur le
métabolisme de l’ADN ainsi qu’aux inhibiteurs de respiration, aux ions toxiques et aux
détergents. Chez L. monocytogenes 10403S, les facteurs de régulation σB et σL sont
également impliqués dans la réponse au peptide antimicrobien SdpC et à la nisine (Palmer et
al., 2009).
L. monocytogenes est sensible à la plupart des antibiotiques. Ainsi, Walsh et al. (2001) ont
observé que sur 351 souches de L. monocytogenes isolées d’aliments, seules deux étaient
résistantes à la tétracycline, l’un des 8 antibiotiques testés dans l’étude. Camargo et al. (2015)
54
ont observé que les 137 souches de L. monocytogenes isolées de cas cliniques, d’usines de
fabrication d’aliments ou de transformation de viande bovine n’étaient résistantes qu’à deux
des 12 antibiotiques testés, la clindamycine et l’oxacilline.
3.1.4.7 Formation de cellules viables mais non cultivables (VNC)
L. monocytogenes a la capacité d’entrer dans un état morphologique et physiologique
particulier, appelé "Long-term survival phase" qui se caractérise par le passage d’une
morphologie de bacilles à coccoïdes ainsi que par une résistance à de nombreux stress (stress
acides, oxydatifs, thermiques) et par une résistance à des antibiotiques agissant sur la paroi
bactérienne (Herbert et Foster, 2001 ; Wen et al., 2009 ; Wen et al., 2013). Par ailleurs, lors
de changement des conditions environnementales, elle est aussi capable d’entrer dans un état
physiologique particulier appelé viable mais non cultivable (VNC) décrit en détail dans le
paragraphe suivant.
3.2 L’état Viable mais non Cultivable comme forme de résistance au stress
Selon la définition de Oliver, (2005), les bactéries en état viable mais non cultivable (VNC)
n’ont pas la capacité de croître sur les milieux de culture standards et sont dans un état de très
faible activité métabolique sans division possible. Pour être qualifiée de formes VNC, les
bactéries doivent être capables de "ressuscitation" ou "réveil" c’est-à-dire de recouvrer leur
cultivabilité lorsque les conditions environnementales redeviennent favorables (Oliver et
Bockian, 1995). L’état VNC est une stratégie adoptée par de nombreuses bactéries dont L.
monocytogenes en réponse à des conditions environnementales défavorables (Ramamurphy et
al., 2014).
Les premières recherches consacrées à la viabilité des bactéries ont été rapportées en 1979
par une équipe Japonaise (Kogure et al., 1979). La mise en évidence de la viabilité a été
réalisée en ajoutant à des échantillons d’eau de mer de l'extrait de levure et de l'acide
nalidixique, inhibiteur de la synthèse de l’ADN. Après 6 heures d’incubation à 20°C à
l’obscurité, les cellules bactériennes ne se sont pas divisées mais ont continué à croître, leur
conférant une forme allongée reconnaissable au microscope et permettant de les différencier
des formes non viables (incapables de s’allonger). Les auteurs ont ainsi défini que le nombre
de cellules allongées correspondait au nombre direct des cellules bactériennes viables (DVC
pour "Direct Viable Count").
Trois années plus tard, l’équipe américaine de R. Colwel a mis en lumière l’existence de l’état
viable mais non cultivable chez E. coli et Vibrio cholerae. Dans cette étude, des souches de E.
55
coli et de V. cholerae ont été inoculées dans des microcosmes constitués d’eau de mer
synthétique (additionnée de tryptone) ou d’eau prélevée dans la baie de Chesapeake et
stérilisée par filtration. Les bactéries ont été dénombrées par des techniques comptabilisant (i)
les cellules totales (mortes et vivantes) (par immunofluorescence et coloration à l’acridine
orange), (ii) les formes viables (par la technique DVC) et (iii) les formes cultivables (par la
méthode du Nombre le Plus Probable (NPP) et étalement sur milieu gélosé). La comparaison
de ces méthodes a montré que les souches perdaient leur cultivabilité au cours du temps alors
qu’elles conservaient leur viabilité, suggérant que les cellules entraient dans un état viable
mais non cultivable lorsqu’elles étaient incubées dans de l’eau de mer qu’elle soit synthétique
ou naturelle (Xu et al., 1982). L’état VNC a été observé chez 85 espèces bactériennes dont 51
espèces pathogènes ou pathogènes opportunistes pour l’Homme (Li et al., 2014). L’état VNC,
principalement étudié sur de souches de Vibrio cholerae, Vibrio vulnificus, Legionella
pneumophila et E. coli, est peu documenté chez L. monocytogenes.
3.2.1 Caractéristiques de l’état VNC
Les bactéries entrées dans l’état VNC ont perdu la capacité de croître sur des milieux de
culture sur lesquels elles se développent habituellement (Oliver, 2005 ; Oliver, 2010). Les
formes VNC possèdent une membrane intacte contrairement aux cellules mortes dont la
membrane endommagée est incapable de retenir l’ADN chromosomique et plasmidique dans
leur cytoplasme (Cook et Bolster, 2007 ; Heidelberg et al., 1997 ; Oliver, 2010). De plus, les
formes VNC sont métaboliquement actives et conservent leur activité respiratoire (Klumpp et
Loessner, 2013 ; Weinrick et al., 2004). Elles absorbent des nutriments et des acides aminés
(Lleo et al., 1998). Elles poursuivent la transcription et continuent par conséquent la
production d’ARNm (Lleo et al., 2000). Par ailleurs, des études ont montré en utilisant la RT-
PCR que les formes VNC continuaient à produire de l’ARN (Coutard et al., 2005 ; Lleo et al.,
2000). Cependant, dans l'état VNC, la synthèse des macromolécules, le transport des
nutriments et la respiration sont généralement réduits. Plusieurs auteurs suggèrent que l’état
VNC correspond à une stratégie développée par les bactéries non sporulantes pour résister aux
conditions environnementales difficiles (Amel et al., 2008 ; Du et al., 2007 ; Oliver, 2010 ;
Wong et Wang, 2004).
3.2.2 Modifications morphologiques et physiologiques
Des modifications morphologiques et physiologiques sont fréquemment observées lorsque les
bactéries entrent dans un état VNC. Ainsi, leur taille diminue, probablement pour permettre
56
de réduire les besoins énergétiques (Du et al., 2007 ; Oliver, 1995 ; Oliver et al., 1991 ;
Rahman et al., 1994). Bien que les changements de morphologie ne soient pas spécifiques des
formes VNC, certaines espèces telles que V. cholerae, V. vulnificus, Helicobacter pylori,
Campylobacter sp, prennent des formes coccoïdes lorsqu’elles elles perdent leur cultivabilité
(Citterio et al., 2004 ; Nilsson et al., 1991 ; Rao et al., 2014 ; Senoh et al., 2010).
Comme cela a été remarqué lors de l’adaptation à un stress environnemental, des
modifications de la composition du peptidoglycane, des acides gras et des protéines
membranaires apparaissent lorsque les bactéries entrent en état VNC (Day et Oliver, 2004).
Ainsi, la composition du peptidoglycane des formes VNC de E. coli et de Enterococcus
faecalis diffèrent de celles des formes cultivables (Signoretto et al., 2002). Des modifications
du taux de transcrits de la Penicillin binding protein (PBP), enzyme impliquée dans l’étape
terminale d’assemblage du peptidoglycane ont également été rapportées par Signoretto et al.
(2000) chez Enterococcus faecalis.
3.2.3 Modification du protéome
L’état VNC induit des modifications du protéome. Heim et al. (2002) ont ainsi observé
différents profils protéiques de Enterococcus faecalis V583 selon l’état physiologique de la
souche (phase exponentielle, phase stationnaire et état VNC). L’analyse protéomique de
Muela et al. (2008) réalisée sur E.coli STCC 416 soumise à différents stress (transfert dans
l’eau de mer, manque de nutriments, exposition à la lumière visible et température sub-
optimale) a mis en évidence que le maintien de la cultivabilité de la souche dans des
conditions défavorables était accompagné par des changements importants du sous-protéome
de la membrane externe. Dix nouvelles protéines apparues lorsque la bactérie était exposée à
des conditions défavorables ont perduré dans l’état VNC. Toutefois, aucune protéine
spécifique à l'état VNC n’a été détectée dans cette étude. Lai et al. (2009) ont mis en évidence
la surexpression de 13 protéines lors de l’induction de l’état VNC de V. parahaemolyticus
ST550 exposée à un stress thermique (passage de 25°C à 4°C) et nutritif (incubation dans un
milieu limité en nutriments). Quatre d’entre-elles sont devenues sous-exprimées lorsque les
bactéries ont été maintenues dans l’état VNC. De même, Jia et al. (2013) ont mis en évidence
que 16 protéines étaient fortement sous-exprimées dans les formes VNC de Vibrio harveyi
SF1 par rapport à la phase exponentielle. Celles-ci étaient essentiellement des protéines de
réponse au stress et intervenant dans le métabolisme des glucides, des transports et de
traduction.
57
Les cellules en état VNC ralentissent leur métabolisme et ont des profils d’expression génique
qui différèrent de ceux des cellules en phase exponentielle de croissance (Shleeva et al.,
2004). Lleo et al. (2000) et Lleo et al. (2001) en utilisant la RT-PCR, ont mis en évidence que
des gènes continuaient à être exprimés chez des souches d’entérocoques entrées en état VNC,
confirmant que les cellules VNC étaient encore actives.
Plusieurs travaux portant sur le génome de souches de Vibrio, E. coli, Staphylococcus,
Salmonella et Helicobacter ont mis en évidence une évolution de l’expression des gènes lors
du passage à l’état VNC. Alors que chez Vibrio fluvialis et Helicobacter pylori, peu de
différences ont été notées lors de la comparaison des profils génétiques de souches en état
VNC et en phase de croissance exponentielle (Amel et al., 2008 ; Hua et Ho., 1996), la
plupart des études montre une évolution marquée de l’expression génique lors du passage à
l’état VNC.
L’analyse génomique de V. cholerae 3083 en phase exponentielle et en état VNC a montré
une réduction du taux de transcrits de 3 gènes (tuf, rpoSet, relA) impliqués dans la synthèse de
protéines de réponse aux stress, lorsque la souche était en état VNC (Gonzalez-Escalona et
al., 2006). Une autre étude réalisée sur V. cholerae O1 El Tor P6973 a montré que le taux de
transcrits de 58 gènes liés à des fonctions de régulation du métabolisme, de la mobilité et de
l’adhésion, était augmenté d’un facteur 5 entre la phase exponentielle et l’état VNC (Asakura
et al., 2007a).
Chez E. coli, le passage à l’état VNC implique l’expression du gène ompW qui permet la
synthèse de protéines de surface en réponse à un stress (Asakura et al., 2008). L’état VNC de
S. aureus induit l’inhibition des gènes KatA et SodA permettant respectivement l’activité
catalase et superoxide dismutase (Masmoudi et al., 2010).
L’inhibition du gène RpoS chez Salmonella Oranienburg Sa99004 et S. Typhimurium LT2
VBNC a entraîné le passage à l’état VNC des souches (Kusumoto et al., 2012). Chez S.
Typhimurium LT2, le gène codant CplX, une ATPase qui se lie et dénature le facteur S par
interaction avec le gène RpoS, semble contrôler le passage à l’état VNC. En effet, une
délétion de la portion C-terminale de ce gène ne permet plus l’entrée de la souche en état
VNC. Ainsi, le facteur S et le gène CplX jouent un rôle primordial dans l’entrée en état VNC
de S. Typhimurium (Kusumoto et al., 2013).
58
3.2.4 Pouvoir pathogène et adhérence
eLa capacité d’adhésion et la virulence des formes VNC peut différer de celles des formes
cultivables. Ainsi, en état VNC, C. jejuni conserve sa capacité à former un biofilm (Duffy et
Dykes, 2009), L. pneumophila synthétise des protéines liées à la virulence (Alleron et al.,
2013), Vibrio sp. exprime des gènes de virulence (Vora et al., 2005) et E. coli O157: H7 est
capable de produire des "Shiga-like" toxines. En revanche, V. cholerae et E. faecalis perdent
leur capacité à adhérer aux cellules intestinales et à établir des biofilms (Lleo et al., 2007 ;
Pruzzo et al., 2003). De même, Oliver et Bockian, (1995) ont montré que la virulence des
formes VNC de V. vulnificus diminue au cours du temps. Il convient de souligner qu’aucune
étude n’a démontré ni le caractère virulent ni la perte de virulence de L. monocytogenes en
état VNC.
3.3 Induction de l’état VNC
3.3.1 Condition environnementales
L’état VNC chez les bactéries, étudié essentiellement sur Enterococcus, E. coli, L.
monocytogenes, Vibrio, Campylobacter jejuni et Pseudomonas, peut être induit par des
modifications des conditions physico-chimiques ou environnementales. L’état VNC peut être
induit lorsque les bactéries sont soumises à des conditions environnementales stressantes
telles qu’un passage dans l’eau de mer, un manque d’éléments nutritifs, des températures
basses (4°C), les rayons lumineux. D’autres stress tels que les stress acides, alcalins,
oxydatifs, osmotiques ainsi que la présence de cuivre peuvent également provoquer ou
accentuer la formation de VNC (tableau 11).
59
Tableau 11 : Exemples de facteurs physico-chimiques et environnementaux induisant l’état VNC chez les bactéries).
Paramètre Espèces ou genre Références
Privation en nutriments
Campylobacter jejuni, E. coli,
Pseudomonas fluorescens,
E. coli O154 H4, Citrobacter spp.
Cook et Bolster (2007)
Klancnik et al. (2009)
Shleeva et al. (2004)
Jorgensen et al. (1994)
Aurass et al. (2011)
Magajna et Schraft (2015)
Darcan et al. (2009)
Dhiaf et al. (2008)
Lleo et al. (2001)
Basse température
(4°C)
C. jejuni, E. coli, Vibrio vulnificus
S. aureus, V. cholerae
L. monocytogenes
Cook et Bolster (2007)
Patrone et al. (2013)
Wolf et Oliver (1992)
Masmoudi et al. (2010)
Asakura et al.(2007a)
Sung et al. (2006)
Gonzalez-Escalona et al. (2006)
Cappelier et Federighi (1998)
Besnard et al. (2002)
Weichart et Kjelleberg (1996)
Choc thermique (50°C à 70 °C
pendant 5 à 60 min)
Legionella pneumophila
Epalle et al. (2015)
Stress osmotique C. jejuni, E. faecalis, Salmonella
E. coli, V. vulnificus
Magajna et Schraft (2015)
Gin et Goh (2013)
Kusumoto et al. (2012)
Darcan et al. (2009)
Wong et Liu (2008)
Stress oxydatif E. coli O157 : H7, V. vulnificus Asakura et al. (2007b)
Taux d’oxygène
Sinorhizobium meliloti
L. monocytogenes, P. fluorescens
Mycobacterium tuberculosis
Basaglia et al.( 2007)
Li et al. (2003)
Kana et al. (2008)
Mascher et al. (2000)
Stress acide/alcalin E. coli, L. monocytogenes Darcan et al. (2009)
Cunningham et al. (2009)
Cuivre
E. coli O154 : H4
Xanthomonas campestris
X. axonopodis
Aurass et al. (2011)
Ghezzi et Steck (1999)
del Campo et al. (2009)
Présence de de chlore E. coli O157 :H7 Liu et al. (2009)
Zhao et Matthews. (2000)
Kolling et Matthews (2001)
Lumière, UV E. coli , L. innocua, E. faecalis
P. aeruginosa
Gourmelon et al. (1994)
Kramer et Muranyi (2014)
Idil et al. (2010)
Gin et Goh (2013)
Zhang et al. (2015)
60
3.3.2 Régulateurs impliqués dans la formation des VNC
Les régulateurs RpoS et OxyR interviennent dans l’induction des formes VNC des bactéries.
La délétion de RpoS ou un faible taux de ce régulateur dans les cellules diminue le délai de
l’entrée en état VNC de souches de E. coli (Boaretti et al., 2003) et de Salmonella (Kusumoto
et al., 2012). De plus, la durée de l’état VNC est réduite en absence de RpoS (Boaretti et al.,
2003).
Les espèces réactives de l’oxygène (ERO), notamment l’H2O2, jouent probablement un rôle
dans la formation de VNC chez E.coli et V. vulnificus (Arana et al., 1992 ; Desnues et al.,
2003, Kong et al., 2004). Chez V. vulnificus les basses températures inhibent l’activité de la
catalase régulée par OxyR, conduisant à une perte de cultivabilité (Abe et al., 2007).
Par ailleurs, la comparaison par hybridation soustractive des génomes d’une souche sauvage
de V. vulnificus et de mutants de cette souche, a mis en évidence que le taux d’expression de
la glutathion S-transférase (GST), enzyme liée au système de détoxification des ERO, était
surexprimé à basse température chez la souche mutante qui était également plus résistante que
la souche sauvage au peroxyde d'hydrogène (Abe et al., 2006). Oliver (2010) a rapporté que
chez V. vulnificus, le gène katG, impliqué dans la régulation de la catalase, était inhibé dans
les formes VNC alors que lorsque les conditions environnementales redevenaient favorables,
il était exprimé dans les cellules cultivables. De plus, la délétion des gènes ahpC1 et ahpC2,
impliqués dans la détoxification des formes réactives de l’oxygène, retarde l’entrée en état
VNC de V. parahaemolyticus KX-V231 (Wang et al., 2013). Ces études mettent en évidence
l’existence d’un lien entre le système de réponse/détoxification aux stress oxydatifs et l’entrée
des bactéries en état VNC.
L’état VNC fait intervenir plusieurs mécanismes mais aucune étude n’a pu démontrer
l’existence de protéines, de gènes ou d’ensemble de gènes spécifiquement associés à l’entrée
des bactéries dans un état viable mais non cultivable.
3.3.3 Ressuscitation des bactéries en état VNC
La capacité des cellules à recouvrer leur cultivabilité est l’un des critères caractérisant l’état
VNC. Le retour à l’état métabolique et physiologique dit "normal" c’est-à-dire la capacité de
former des colonies sur milieu gélosé est appelé "ressuscitation" (Baffone et al., 2006). La
sortie de l’état VNC peut être observée lors du retour à des conditions environnementales non
61
stressantes à l’exemple de V. vulnificus qui entre en VNC à basse température et peut en sortir
par une augmentation de la température du milieu dans lequel il est incubé (Oliver et Bockian,
1995). La sortie de l’état VNC peut nécéssiter un passage dans un hôte (animal, amibe, œufs
embryonnés) ou dans des cultures de cellules in vitro (Oliver et Bockian, 1995). Ainsi
Legionella pneumophila, Campylobacter jejuni et V.cholerae O1 retrouvent un état cultivable
après avoir été injectées respectivement dans des amibes (Acanthamoeba polyphaga) (Teresa
Garcia et al., 2007), des souris (Baffone et al., 2006) et dans des intestins humains (Colwell et
al., 1996).
3.3.3.1 Protéines impliquées dans la ressuscitation des VNC
La capacité des cellules à recouvrer leur cultivabilité a été attribuée à la présence d’une
enzyme, la protéine extracellulaire Rpf (resuscitation-promoting factor), capable d’hydrolyser
le peptidoglycane et de provoquer la division cellulaire. Celle-ci a été mise en évidence pour
la première fois chez Mycobacterium tuberculosis (Mukamolova et al., 2002) puis chez
Micrococcus luteus (Mukamolova et al., 2006 ; Telkov et al., 2006). Des protéines Rpf ou
des protéines homologues à celles-ci ont aussi été identifiées chez Mycobacterium spp.,
Corynebacterium spp., Streptomyces spp., L. monocytogenes et S. Typhimurium. (Gupta et
Srivastava, 2012 ; Panutdaporn et al., 2006 ; Pinto et al., 2015 ; Pinto et al., 2013). Le
mécanisme impliquant Rpf dans la ressuscitation des cellules VNC n’est pas encore
totalement élucidé, mais ces protéines permettraient de cliver les composants de la paroi
cellulaire, libérant des peptidoglycanes qui pourraient fonctionner comme des molécules de
signalisation dans l’initiation de la croissance (Kana et Mizrahi, 2010). Ceci suggère que la
ressuscitation des VNC nécessite soit une hydrolyse du peptidoglycane permettant d’altérer
les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire afin de permettre la division cellulaire, soit la
libération de produits de lyse qui fonctionneraient comme des signaux de ressuscitation (Keep
et al., 2006). La protéine Sps (Stationary phase survival) décrite chez Micrococcus luteus
paraît également impliquée dans la sortie de l’état VNC (Ravagnani et al., 2005). A l’instar
des protéines Rfp, elle permet la lyse du peptidoglycane de la paroi bactérienne.
3.3.3.2 Stratégies de ressuscitation des bactéries
Il convient de souligner que les travaux réalisés sur la ressuscitation des cellules en état VNC
font l’objet de controverses, aucune méthode ne permettant de prouver avec certitude que la
ressuscitation des bactéries a lieu après l’action d’un stimulus.
62
Selon Bogosian et al. (1998), les populations bactériennes soumises à un stress contiennent
toujours des bactéries cultivables mais leur quantité est trop faible pour qu’elles soient
détectées par les méthodes culturales. La reprise de croissance observée lorsque les conditions
redeviennent favorables ou après l’application de stimuli serait due à la multiplication de cette
sous-population. Bogosian et Bourneuf (2001) ont aussi suggéré que la reprise de croissance
des formes VNC serait due à la capacité de bactéries lésées à se réparer et à retrouver un
métabolisme normal lorsque le facteur de stress disparaît.
Dans leur revue bibliographique sur la viabilité des bactéries, Barcina et Arana (2009) ont
émis l’hypothèse que l’état VNC serait une stratégie de survie mise en place par les
populations bactériennes. Selon ces auteurs, les populations bactériennes seraient constituées
de bactéries "survivantes" et "altruistes". Ces dernières libéreraient des constituants cellulaires
dans le milieu et perdraient leur cultivabilité pour devenir VNC quand les conditions
environnementales deviennent défavorables. Les constituants cellulaires libérés seraient alors
utilisés par les "survivantes" qui pourraient se maintenir ou déclineraient petit à petit, les
nutriments n’étant plus disponibles ou le stress subi trop important. Une sous-population de
cellules cultivables peut alors se maintenir et assurer la survie de l’espèce malgré les
conditions environnementales difficiles. Toutefois, cette hypothèse ne s’applique qu’en
réponse à une carrence en nutriments.
Il a été observé chez des souches de V. cholerae O139, de E. faecalis et de E. hirae que la
capacité à ressusciter des cellules VNC diminuait au cours du temps (Senoh et al., 2010 ; Lleo
et al., 2001). Pinto et al. (2015) ont ainsi défini le terme "fenêtre de ressuscitation" et ont émis
l’hypothèse de l’existence d’un laps de temps au cours duquel une cellule en état VNC
pourrait être ressuscitée par un stimulus ou par la disparition du stress ayant provoqué sa perte
de cultivabilité. Cela suggérerait selon ces auteurs que l’état VNC correspondrait à un état
génétiquement programmé.
3.3.4 Etat VNC chez L. monocytogenes
L’existence de l'état VNC chez L. monocytogenes a été mentionnée pour la première fois par
Colburn et al. (1992). Ce n’est qu’en 2000 que Besnard et al. (2000) ont mis en évidence par
un double marquage (DVC et CTC-DAPI) la capacité de deux souches de L. monocytogenes
(CNL 895807 et Scott A) à former des cellules VNC après une incubation de 4 et 8 semaines
dans des microcosmes d’eau distillée stérile supplémentée ou non avec 7% de NaCl. Depuis,
plusieurs études ont mis en évidence la capacité de L. monocytogenes à entrer dans cet état
63
VNC (Cappelier et al., 2007 ; Klumpp et Loessner, 2013 ; Olszewska et al., 2015). Des
auteurs ont également suggéré la présence de L. monocytogenes en état VNC dans des eaux
usées (Giao et Keevil, 2014), des boues de stations d'épuration (Wery et al., 2006) et des
fumiers de bovins (Klein et al., 2010).
Différents facteurs permettent d’induire la formation de VNC chez L. monocytogenes : une
carence en éléments nutritifs (Cappelier et al., 2007 ; Weinrick et al., 2004), un stress acide
(Besnard et al., 2000 ; Cunningham et al., 2009), une température de 4°C (Li et al., 2003), un
stress osmotique (Besnard et al., 2000 ; Reichert-Schwillinsky et al., 2009), un taux
d’humidité inférieur à 69% (Dreux et al., 2007), la lumière naturelle (Besnard et al., 2002),
l’action d’un champ électrique pulsé de haute intensité (Yaqub et al., 2004) ainsi que les
bactériocines produites par des bactéries lactiques (Rodriguez Amado et al., 2012).
L’activité métabolique des formes VNC de L. monocytogenes a été mise en évidence par
Cappelier et al. (2005) par la mesure de la production d’ATP de quatre souches en état VNC
mainetnues à 4°C dans de l’eau sétrile. Récemment, Giao et Keevil (2014) ont montré la
capacité de cellules VNC à former des biofilms sur des coupons d’aciers incubés à des
températures comprises entre 4°C et 37°C, confirmant l’activité métabolique de L.
monocytogenes en état VNC.
L’entrée en état VNC et la durée de cet état semblent dépendre des souches comme l’ont
montré Besnard et al. (2002) qui ont observé que le comportement de quatre souches de L.
monocytogenes soumises à une basse température et à l’action de la lumière différait.
Il a été montré que l’élimination du stress ayant provoqué l’état VNC de L. monocytogenes ne
permettait pas la sortie de cet état (Cappelier et al., 2005 ; Dreux et al., 2007 ; Weinrick et al.,
2004). Toutefois, Cappelier et al. (2007) ont observé une ressuscitation des formes VNC de L.
monocytogenes après une inoculation dans des œufs de poulets embryonnés. Bien que la
ressuscitation de L. monocytogenes n’ait pas été clairement établie, Ravagnani et al. (2005)
ont décrit chez L. monocytogenes EGDe deux protéines (Lmo0186 et Lmo2522) dont la
structure et la séquence sont similaires à celles des protéines Rpf décrites chez d’autres
espèces capables de former des VNC. En utilisant les mutants L. monocytogenes EGD-e
Δlmo0186 et Δlmo2522, Pinto et al. (2013) ont montré que ces protéines qui ont une action
similaire aux protéines Rpf (lyse du peptidoglycane), peuvent permettre la sortie de l’état
VNC.
64
Il existe très peu de données sur la conservation de la virulence des cellules VNC. Lindback
et al. (2010) n’ont constaté aucune virulence de quatre souches de L. monocytogenes entrées
en état VNC après une inoculation in vitro dans des cellules d'adénocarcinome de côlon
humain ou après une inoculation par injection dans des souris immunodéprimées. Cependant,
les travaux de Cappelier et al. (2007) réalisés sur des cellules VNC inoculées dans des œufs
de poulets embryonnés ont montré que L. monocytogenes, une fois sortie de l’état VNC, était
capable de coloniser la rate de souris.
L’état VNC chez L. monocytogenes est encore mal caractérisé, mais il semble possible que
cette souche conserve sont caractère virulent une fois ressuscitée, confirmant le risque
sanitaire que représente ce pathogène pour l’Homme.
3.4 Détection des microorganismes en état VNC
3.4.1 Les techniques disponibles
Les méthodes développées pour détecter ou quantifier les formes viables et les formes VNC
des bactéries se distinguent par leurs cibles et les outils de détection (tableaux 12, 13 et 14).
3.4.1.1 Méthodes utilisant la microscopie optique
Les méthodes utilisant la microscopie (tableau 12) ont été les premières à avoir été décrites.
Elles sont par conséquent largement utilisées pour mettre en évidence la viabilité des
bactéries. Elles s’appuient sur l’utilisation d’agents fluorescents (2-(p-iodophenyl)-3-(p-
nitrophenyl)-5-phenyl tetrazolium (INT) ou le 5-cyano-2,3ditoyl tetrazolium chloride (CTC).
Les cellules ayant une chaîne respiratoire active réduisent ces colorants qui forment un
précipité rouge de formazan. L’émission de fluorescence rouge à 630 nm permet de visualiser
les cellules viables (Rahman, et al., 1994). Inversement, il est possible d’utiliser un colorant,
tel l’iodure de propidium, qui n’entre que dans les cellules dont la paroi est lésée et permet
donc de visualiser les cellules mortes (Suzuki et al., 1997). En général, ces techniques
utilisent en parallèle un contre colorant fluorescent (tel le DAPI) qui pénètre dans toutes les
cellules et permet de différencier les cellules vivantes des cellules mortes. La technique Direct
viable Count (DVC) développée par Kogure et al. (1979), basée sur l’élongation de cellules
incubées en présence d’extrait de levure et d’un antibiotique inhibiteur de la synthèse de
l’ADN, a fait l’objet d’études visant à améliorer sa spécificité. Moreno et al. (2007) et Griffit
et al. (2011) ont ainsi couplé la technique DVC à la méthode FISH (sonde ciblant l’ADN 16S)
et RING FISH (sonde ciblant un gène spécifique) pour mettre en évidence la viabilité de
Helicobacter pylori et de Vibrio parahaemolyticus.
65
Ces techniques ont été testées avec succès dans de l’eau ou des bouillons de culture (Federighi
et al., 1998, Boulos et al., 1999, Baffone et al., 2006, Winkelströter et Martinis., 2015) mais
sont plus difficilement applicables dans des matrices environnementales complexes, riches en
matière organique et avec une concentration importante en micro-organismes. En effet, les
agents fluorescents peuvent réagir avec la matière organique du milieu et perturber l’émission
de fluorescence. Par ailleurs, lorsque l’étude cible une espèce particulière, celle-ci peut être
difficilement visible dans la matrice. Pour cette raison, la détection de formes VNC dans les
matrices complexes telles que les boues de stations d'épuration ou le sol nécessite un
prétraitement des matrices (centrifugation, autoclavage, filtration…), dénaturant la structure et
la composition des matrices (Garrec et al., 2005). Il convient de souligner que la
quantification par méthode microscopique est peu précise et qu’elle est limitée par un seuil de
quantification élevé de l’ordre de 106-107 bactéries mL-1 (Cho et Kim, 1999 ; Garcia-Armisen
et Servais, 2004).
3.4.1.2 Méthodes basées sur l’activité métabolique, les activités enzymatiques ou l’infection par des
phages
L’impédancemétrie et la cytométrie de flux permettent d’estimer la viabilité des cellules par
des mesures de l’activité métabolique ou enzymatique lorsque ces techniques sont couplées à
des sondes fluorescentes distinguant les cellules viables des cellules mortes. Ainsi,
l’accumulation de la rhodamine123, colorant cationique fluorescent, est proportionnelle à
l’activité métabolique des cellules viables (Forsman et al., 2000, Kaprelyants et Kell., 1992,
Pacheco et al., 2003). Lorsqu’elle est couplée à des biosenseurs permettant de mesurer
l’activité d’enzymes spécifiques, l’impédencemétrie peut être utilisée pour cibler l’activité
d’espèces bactériennes (tableau 13). Cette technique a été utilisée par Togo et al. (2011) pour
quantifier dans des eaux de surface les formes viables de E. coli par la mesure de l’activité β-
D-glucuronidasique. Labib, et al. (2012) ont utilisé la technique SELEX (systematic evolution
of ligands by exponentiel enrichment) pour sélectionner un aptamère d’ADN ciblant les
formes viables de Salmonella Typhimurium. La séquence spécifique qui se lie aux cellules
dont la paroi est intacte a été intégrée dans un capteur impédimétrique permettant de
quantifier au moins 600 bactéries mL-1. Récemment, Fernandes et al. (2014) ont utilisé des
bactériophages PVP-SE1 capables de reconnaître des cellules VNC de Salmonella sans
entraîner leur lyse alors qu’ils lysent les cellules mortes. Une sonde recouverte d’or a été
greffée à la surface des phages, permettant, grâce à des biosenseurs, de quantifier les bactéries
en état VNC avec une sensibilité élevée permettant la détection de 4 bactéries/biosenseur.
66
Ces techniques qui nécessitent un matériel spécifique ont été testées avec succès sur des
solutions tampon ou des eaux. Toutefois, elles paraissent difficilement applicables aux
matrices environnementales complexes.
3.4.1.3 Méthodes basées sur la quantification de l’ARN et l’ADN
Les méthodes génomiques ciblent l’ARN ou l’ADN bactérien (tableau 14). La quantification
de l’ARN par RT-qPCR qui présente l’avantage de mesurer l’activité bactérienne, a été
utilisée pour estimer la viabilité de souches de Salmonella (Garcia et al., 2010, Jiang et al
2013), de Shigella flexneri (Jiang, et al., 2013 ; Kong, et al., 2014 ; Zhang, et al., 2015),
Ralstonia solanacearum dans des microcosmes de sols (Kong et al., 2014) et E. coli et de P.
aeruginosa dans de l’eau (Zhang et al., 2015). L’ARN est considéré comme une molécule très
labile dans le milieu extra cellulaire. Il est rapidement dégradé par des RNAses et sa
production cesse à la mort des cellules. Ainsi, la quantification de l’ARN permet de mesurer
les bactéries actives métaboliquement. Néanmoins, Tasara et Stephan, (2007) ont rapporté
qu’en dehors de la cellule, la demi-vie de l’ARNr 16S est similaire à celle de l’ADN. De plus,
le taux d’expression de l’ARN évolue en fonction de l’état physiologique des cellules, rendant
difficile la quantification des bactéries actives (Bui et al., 2012 ; Zhang et al., 2015). Par
ailleurs, l’extraction de l’ARN à partir de matrices environnementales complexes, plus
délicate que celle de l’ADN, conduit à un ARN de mauvaise qualité qui se conserve mal et se
dégrade vite.
Depuis 2006, l’équipe de A. Nocker aux Etats-Unis développe des techniques permettant de
différencier les bactéries viables des bactéries mortes en ciblant la quantification de l’ADN
par PCR en temps réel. Ces techniques nécessitent une étape de prétraitement des échantillons
avec des agents intercalants, l’éthidium monoazide (EMA) ou le propidium monoazide
(PMA), dont le mécanisme d’action sera défini dans le paragraphe suivant. L’utilisation de
ces intercalants a fait l’objet de nombreuses études (201 publications internationales depuis
2006 dont 171 entre 2010 et 2015 référencées dans la base web of knowledge) en raison (i) de
la simplicité de la méthode de quantification (mise en contact de l’intercalant avec
l’échantillon suivie d’une extraction de l’ADN et d’une simple PCR quantitative), (ii) de la
possibilité de cibler de nombreux micro-organismes incluant des agents pathogènes, et (iii) de
l’applicabilité de la méthode aux matrices complexes alimentaires et environnementales. Dans
cette technique, les bactéries possédant des membranes intègres sont considérées comme des
bactéries viables.
67
Tableau 12 : détection des formes viables des bactéries par microscopie optique Méthode Cible Description de la méthode Avantages inconvénients Références
CTC/ Dapi ou INT / Dapi
Chaîne respiratoire
Le CTC (5-cyano-2,3-ditolyl tetrazolium chloride) ou l’INT (p-Iodonitrotetrazolium violet) sont des colorants redox. Ils sont réduits par les électrons de la chaîne respiratoire en formazan, précipité rouge fluorescent insoluble qui s’accumule dans les cellules. Le Dapi, contre colorant, se lie à l'ADN des cellules mortes et vivantes et émet une fluorescence bleue.
- Utilisation facile - Peu coûteux -Pas de matériel spécifique
- Bruit de fond avec les matrices environnementales - Dénombrement peu précis - Non spécifique d’une espèce
Cappelier et al. (2005)
Rahman et al. (1994)
Live/dead ® BacLight
Membrane cellulaire lésée
Le SYTO9®, de faible masse moléculaire, diffuse dans toutes les cellules et émet une fluorescence verte.
L’iodure de propidium (IP),agent intercalant de l'ADN, ne pénètre que dans les cellules dont les membranes sont altérées. Il émet une fluorescence rouge qui masque la fluorescence du Syto9.
- Utilisation facile - Peu coûteux -Pas de matériel spécifique
- Bruit de fond avec les matrices environnementales - Dénombrement peu précis -Non spécifique d’une espèce - L’iodure de propidium peut rentrer dans les cellules viables
Jacobsen et
Holben (2007)
Direct Viable count (DVC)
Synthèse de l’ADN
Les cellules sont incubées dans un milieu contenant de l'extrait de levure et de l’acide nalidixique ou un autre antibiotique tel que la ciprofloxacine ou la novobiocine qui inhibe la synthèse de l’'ADN. Les bactéries viables ne se divisent plus mais utilisent l'extrait de levure et prennent une forme allongée qui permet de les différencier des cellules mortes.
- Utilisation facile - Peu coûteux -Pas de matériel spécifique
- Bruit de fond avec les matrices environnementales - Existence de souches naturellement résistantes aux antibiotiques. - quantification difficile
Kogure et al. (1979) Barcina et al. (1995)
DVC – Fluorescence in situ hybridation (DVC-FISH)
Synthèse de l’ADN
Couplage de la méthode DVC à la méthode FISH, utilisant une sonde spécifique d’une espèce bactérienne.
- Utilisation facile - Peu coûteux -Marquage spécifique d’une espèce
- Bruit de fond avec les matrices environnementales -Dénombrement difficile Le FISH peut être problématique pour différencier certaines espèces lorsque les séquences d'ADNr 16S sont similaires
Moreno et al. (2007)
DVC- Recognition of Individual Gene Fluorescence In Situ Hybridization (RING-FISH)
Synthèse de l’ADN
Principe similaire au (DVC-FISH) mais la sonde cible un gène spécifique
- Plus grande spécificité que le DVC FISH
-Dénombrement difficile -Manipulation complexe (développement de la sonde, vérification de la taille, clonage…)
-Non adapté aux matrices environnementales
Griffitt et al. (2011)
68
Tableau 13 : détection des formes viables des bactéries basée sur l’activité métabolique, les activités enzymatiques ou l’infection par des phages
Méthode (outil) Cible Description de la méthode Avantages Inconvénients Références
rhodamine 123 (cytométrie de flux ou microscopie)
activité métabolique
La rhodamine 123, colorant cationique fluorescent, est concentrée par les cellules viables. L’accumulation dépend de l’activité de la cellule.
- Utilisation facile - Peu coûteux
Non adapté aux bactéries Gram négatif dont la membrane externe est moins perméable à ce colorant
Forsman et al. (2000) Kaprelyants et Kell (1992) Pacheco et al. (2003)
Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) (Impédancemétrie)
Enzyme spécifique
Détection de l’activité spécifique d’une enzyme comme la glucuronidase par impédancemétrie
- Très spécifique - Toute matrice
- conception du bio senseur difficile - matériel spécifique
Guan et al. (2004, Wang et al. (2012)
SELEX technique (Impédancemétrie)
Aptamère d’ADN spécifique d’une espèce
Même principe que l’EIS mais les bactéries viables se distinguent des cellules mortes par un aptamère d’ADN spécifique. Un apatamère ligand spécifique des cellules viables, est obtenu par enrichissement exponentiel. L’apatamère ligand « capture » les cellules viables qui sont quantifiées par impédancemétrie.
- Très spécifique - Toute matrice -Méthode quantitative
Idem EIS Labib et al. (2012)
Solid phase cytometry fluorescent viability staining (SPC-FVS) (cytométrie de flux)
activité des estérases
L’échantillon est filtré puis les cellules retenues sont colorées en utilisant un ester de carboxyfluorescéine, substrat pour les estérases intracellulaires. Les bactéries fluorescentes sont dénombrées par cytométrie de flux
- Méthode quantitative Limite de détection basse (1 bactérie/ml)
- applicable sur les matrices liquides filtrables - matériel spécifique
Cools et al. (2005)
Bactériophages couplé à une molécule d’or
Infection des cellules viables par un phage
Certains bactériophages (PVP-SE1) ont la capacité de reconnaître des cellules viables sans induire la lyse. Une sonde permet de détecter les phages fixés aux bactéries viables. La quantité de phages est proportionnelle à la quantité de formes viables. Le nombre de VNC peut être obtenu en soustrayant les formes viables des formes cultivables.
- quantitatif - limite de détection basse (≈ 4 bactéries/biosenseur)
- Non spécifique d’une souche - Peu de références et d’application dans la littérature mais technique récente (2014)
Fernandes et al. (2014)
69
Tableau 14 : détection des formes viables des bactéries par quantification de l’ARN et de l’ADN Méthode Cible Description de la méthode Avantages Inconvénients Références
RT-qPCR
ARN ARN exprimé uniquement par des cellules viables -Applicable à toutes matrices
-Méthode quantitative
- Extraction difficile
- ARN fragile
- méthode longue
- ARNr 16S peut persister comme l’ADN
-Limite de quantification élevée
Sheridan et al. (1998)
Garcia et al. (2010)
Ethidium monoazide ou Propidium monoazide couplé à la PCR quantitative (qPCR-EMA ou qPCR-PMA)
ADN des cellules dont la paroi est lésée
L’éthidium monoazide (EMA) ou le propidium monoazide (PMA) se fixe sur l’ADN des cellules dont la membrane est endommagée. Une fois activé par la lumière, l’EMA ou le PMA se lie à l’ADN et empêche la progression de l’ADN polymérase. Seul l’ADN des cellules dont la paroi n’est pas endommagée est quantifié.
La qPCR réalisée après le traitement avec l’une des deux molécules et l’extraction d’ADN permet de cibler un gène spécifique d’une espèce.
- Utilisation facile
- rapide
- Peu coûteux
- cible une espèce
-Méthode quantitative adaptable aux matrices environnementales
- existence de faux négatifs : l’EMA et dans une moindre mesure le PMA peuvent diffuser à travers les membranes intactes.
-Limite de quantification élevée
Nocker et al. (2006) Nocker et al. (2007)
70
3.4.2 Le Propidium Monoazide (PMA)
3.4.2.1 Principe
L’utilisation du PMA a été développée pour améliorer l’efficacité de l’EMA. En effet le
PMA possède une charge positive supplémentaire qui limite la pénétration passive des
membranes intactes, réduisant le nombre de faux négatifs observé avec l’EMA (Lee et Levin,
2009). Le mode d’action de l’EMA étant similaire à celui du PMA, seul ce dernier sera
détaillé dans ce paragraphe.
Au cours d’une première incubation réalisée à l’obscurité, le PMA traverse la membrane des
cellules lorsque celle-ci est endommagée ou partiellement dégradée. Une fois fixé à l’ADN,
sous l’action de la lumière, le groupement azide du PMA est converti en radical nitrène qui se
lie au double brin d’ADN. Ce lien covalent empêche l’extension des primers au cours de la
PCR (figure 9). La PCR réalisée après le traitement avec le PMA (qPCR-PMA) permet de
quantifier le génome des cellules dont la membrane est intacte (cellules viables). En
soustrayant le nombre de cellules viables (obtenu par qPCR-PMA) au nombre de cellules
cultivables (obtenu par ensemencement d’un milieu de culture), il est possible de définir le
nombre de formes VNC dans un échantillon. L’intérêt de la qPCR-PMA réside notamment
dans la possibilité de cibler un gène spécifique d’une espèce donnée. La technique a ainsi été
utilisée en recherchant les gènes spécifiques de bactéries pathogènes telles Salmonella (Wang
et al., 2015; Xiao et al., 2015) , Campylobacter jejuni (Duarte et al., 2015), E. coli O157:H7
(Elizaquivel et al., 2012; Liu et Mustapha, 2014; Wang et al., 2014) et L. monocytogenes
(Elizaquivel et al., 2012; Zhu et al., 2012; Yang et al., 2013).
De plus, le PMA n’étant pas spécifique d’une espèce, il est possible d’estimer simultanément
la viabilité de plusieurs espèces dans un même échantillon en utilisant une qPCR multiplex
(Forghani et al., 2015).
71
Figure 9 : Schéma d’utilisation du PMA (A), Mécanisme d’action du PMA pour se lier aux
molécules d’ADN ; (B) schéma du mécanisme d’action du PMA pour la quantification des
cellules viables. D’après Nocker et al. (2006) et van Frankenhuyzen et al. (2011).
3.4.2.2 Difficulté d’utilisation
Difficultés liées aux conditions d’incubation du PMA
Même si le PMA a été utilisé sur un large éventail d’organismes vivants (bactéries, spores,
champignons, virus, protozoaires.) (Soejima et al., 2007; Vesper et al., 2008; Bae et Wuertz.,
2009; Delgado-Viscogliosi et al., 2009; Rawsthorne et al., 2009; Fittipaldi et al., 2011) et
qu’il semble fonctionner correctement lorsqu’il est utilisé avec des milieux liquides simples
(bouillon de culture, eau…) (Vesper et al., 2008 ; Bae et Wuertz, 2009 ; Delgado-Viscogliosi
et al., 2009 ; Nocker et Camper, 2009 ; Rawsthorne et al., 2009 ; Agusti et al., 2010 ; Etorra
A
B
72
et al., 2010 ; Fittipaldi et al., 2011b; Lovdal et al., 2011), il semble plus difficilement
applicable aux matrices environnementales complexes (Pisz et al., 2007 ; Wagner et al., 2008
; Kramer et al., 2009 ; Varma et al., 2009). Bien qu’il soit plus performant que l’EMA, l’un
des inconvénients du PMA est lié à sa possible pénétration dans les cellules ayant des
membranes intactes, conduisant à une sous-estimation du nombre de cellules viables. De
plus, le PMA peut réagir avec la matrice et ainsi diminuer la quantité de PMA réellement
disponible pour entrer dans les cellules mortes. Il est donc nécessaire de maîtriser plusieurs
paramètres susceptibles d’impacter la quantification des cellules viables.
- La concentration en PMA : les concentrations utilisées, très variables selon les études, se
situent entre 10µM et 300µM. Les résultats obtenus sur des matrices complexes indiquent
que les faibles teneurs en PMA sous-estiment le nombre de bactéries mortes alors que les
teneurs élevées sous-estiment le nombre de bactéries vivantes (Wagner et al., 2008; Bae et
Wuertz, 2009; Varma et al., 2009). Bien que Banihashemi et al. (2012) aient constaté que des
concentrations en PMA supérieures à 20 µM étaient toxiques sur des souches de Salmonella
et de Campylobacter jejuni, l’effet toxique du PMA n’est en général pas démontré. Ainsi,
Elizaquivel et al. (2012) et Takahashi et al. (2011) n’ont observé aucune toxicité du PMA à
une concentration de 2,4 mM sur E. faecalis et de 100 µM sur E. coli O157:H7, Salmonella et
L. monocytogenes.
- Le temps d’incubation : il doit être suffisamment long pour permettre à l’intecalant d’entrer
dans les cellules et de pouvoir se lier aux molécules d’ADN. Néanmoins, il ne doit pas être
trop long pour éviter que le PMA ne pénètre dans les cellules à membrane intacte (Nocker et
al., 2007). Le temps d’incubation fluctue de quelques secondes à 60 minutes selon les études
mais la durée la plus fréquemment appliquée par les auteurs est de 5 minutes (Rawsthorne et
al., 2009; Fittipaldi et al., 2012).
- La source de lumière : la distance entre la source lumineuse et l’échantillon est
généralement de 20 à 30 cm. Afin d’éviter une montée en température de l’échantillon, celui-
ci est placé horizontalement dans la glace. Le maximum d’absorption du PMA se situe à
464nm. La source de lumière doit donc balayer les longueurs d’ondes permettant l’activation
du PMA, ce qui est réalisable avec des lampes de type halogène. Celles-ci ont une puissance
comprise en 500 W et 750 W. Néanmoins il a été souligné que les longueurs d’ondes de ces
lampes dépendent du modèle, conduisant à des résultats non reproductibles. Pour cette raison,
73
Vesper et al. (2008) ont utilisé des lampes à LEDs dont la longueur d’onde était proche de
465 nm, ce qui améliorerait l’activation du PMA.
- La durée de photoactivation : la liaison covalente carbone-azote entre le PMA et l’ADN se
forme rapidement. La durée de photoactivation est donc souvent courte (de une à 20 minutes)
(Fittipaldi et al., 2012).
- La taille de l’amplicon : Plusieurs études révèlent que l’utilisation de longues séquences
permet de diminuer une éventuelle amplification de l’ADN des cellules mortes. (Rudi et al.,
2005a; Rudi et al., 2005b; Soejima et al., 2008 ; Chang et al., 2010 ; Contreras et al., 2011 ;
Lovdal et al., 2011 ; Soejima et al., 2011 ; Banihashemi et al., 2012). Selon Benihashemi et
al. (2012), l’allongement de la séquence augmente la probabilité de dommages de l’ADN
induits par sa liaison avec le PMA et augmente donc les risques d’interférences lors de
l’étape d’amplification de la PCR. Cependant, Martin, et al. (2013) n’ont pas observé de
différences significatives entre les quantifications de formes VNC de salmonelles obtenues
avec 3 longueurs d’amplicons (95pb, 285pb et 417pb). Il convient de souligner que
l’amplification de longs fragments (supérieurs à 400pb) diminue l’efficacité de la qPCR par
la formation de structures secondaires dans l’amplicon et que l’utilisation de longs amplicons
est déconseillée lorsque les PCR sont réalisées avec des sondes. Le rôle de ce paramètre dans
l’efficacité de la qPCR-PMA n’est donc pas clairement établi.
- Le type de microorganisme : la différence de composition de la paroi entre les bactéries à
Gram positif et à Gram négatif, la complexité de l’enveloppe de certaines bactéries ainsi que
les différents pourcentages de GC dans le génome peuvent modifier l’action du PMA (Chang
et al., 2010; Contreras et al., 2011; Fittipaldi et al., 2012).
Il ressort des données de la littérature que de nombreux paramètres sont susceptibles
d’intervenir sur l’efficacité du PMA et qu’ils fluctuent d’une étude à l’autre. IL est donc
important de les optimiser pour maximiser les chances de pénétration du PMA dans les
cellules mortes tout en minimisant l’entrée de l’intercalant dans les cellules viables.
Influence de la composition des matrices sur l’efficacité de la technique de la qPCR-PMA
Le PMA a dans un premier temps été appliqué sur des matrices simples telles que l’eau et les
bouillons (Nocker et Camper, 2006; Nocker et al., 2007 ; Pan et Breidt, 2007 ; Vesper et al.,
2008). Dans ce type de milieu, le protocole la qPCR-PMA est facile à optimiser. En
74
revanche, dans des matrices environnementales turbides et riches en matière organique, la
mise en œuvre du traitement au PMA apparaît plus compliquée. Des études ont d’ailleurs
souligné la difficulté à utiliser le PMA dans les boues de stations d'épuration (Wagner et al.,
2008; Fittipaldi et al., 2012). Plusieurs caractéristiques des matrices sont susceptibles
d’interférer sur l’action du PMA :
- La matière organique et la turbidité : le PMA peut se fixer sur la matière organique (qui agit
comme un site échangeur de cations), ce qui diminue sa disponibilité (Pisz et al., 2007). De
plus, Bae et Wuertz, (2009) ont observé que des teneurs en matières en suspension
supérieures à 1g L-1 conduisent à une sous-estimation du nombre de bactérie mortes. Par
ailleurs, l’intensité lumineuse nécessaire à l’activation du PMA est réduite par la turbidité.
Gedalanga et Olson (2009) et Luo et al. (2010) ont observé que l’application du PMA est
possible pour des turbidités inférieures à 10 NTU et qu’au-delà de cette valeur, le nombre de
formes viables est surestimé. Il est possible de diluer les matrices pour diminuer la turbidité et
la teneur en matière organique comme l’ont proposé Luo et al. (2010) mais cela entraîne une
augmentation du seuil de quantification de la méthode.
- Le pH : il existe très peu de données sur ce paramètre. Alors que Shi et al. (2011) ont
rapporté qu’un pH inférieur à 5 réduisait l’efficacité de l’EMA, Barth et al. (2012), n’ont
observé aucun impact du pH (pour des valeurs comprises entre 4 et 10) sur l’efficacité du
PMA.
- La concentration en sels : les études menées sur l’EMA soulignent que les fortes teneurs en
sels réduisent sa capacité à se lier à l’ADN (Shi et al., 2011). De même, Barth et al. (2012)
ont rapporté qu’au-delà d’une teneur en NaCl de 5%, la technique de la qPCR-PMA sous-
estimait le nombre de cellules mortes. Il convient de souligner que ce facteur a probablement
un rôle limité lorsque la qPCR-PMA est appliquée sur des boues, des effluents urbains ou des
effluents d’élevages dont les concentrations en sels sont généralement inférieures à 5%.
- La proportion de cellules mortes : Fittipaldi et al. (2012) ont rapporté qu’au-delà d’une
concentration de 105 cellules mortes par mL, il existe un risque de sous-estimer leur nombre,
le PMA ne pénétrant pas dans l’ensemble des cellules dont la paroi est endommagée. Des
études ont également montré que le ratio entre le nombre de cellules mortes et le nombre de
cellules viables (Cm/Cv) influençait les performances de la qPCR-PMA. Ainsi, Noker et al.
(2006) ont rapporté qu’un ratio inférieur à 103 n’influençait pas l’efficacité du PMA, mais
75
Pan et Breidt (2007) et Lovdal et al. (2011) qui ont étudié respectivement la viabilité de
souches de L. monocytogenes et de L. innocua inoculées dans un bouillon, ont montré que
lorsque le ratio Cm/Cv dépassait 104, la qPCR-PMA sous-estimait le nombre de cellules
mortes. Il est à noter que les auteurs n’expliquent pas comment le ratio Cm/Cv influence la
qPCR-PMA.
Par ailleurs, une des limitations de la qPCR-PMA réside dans le seuil de quantification de la
méthode, nettement plus élevé que celui des méthodes culturales. Lorsque les bactéries sont
ensemencées en culture pure avec une concentration initiale de l’ordre de 108 cellules mL-1, il
est possible de mesurer un abattement de 4 à 5 Log10 des bactéries viables (Chang et al., 2009
; Nocker et al., 2009 ; Rudi et al., 2002 ; Rudi et al., 2005b; Varma et al., 2009). En
revanche, pour les matrices complexes, inoculées avec une concentration initiale identique, la
réduction n’est que 2 à 3 Log10 (Wagner et al., 2008 ; Varma et al., 2009 ; Li et al., 2014).
Cette différence peut s’expliquer par la présence de matière organique et de molécules
chargées négativement sur lesquelles l’intercalant se fixe, conduisant à une diminution de la
teneur en PMA réellement didponible pour pénétrer dans les cellules mortes.
Malgré ces contraintes, la technique de la qPCR-PMA a été appliquée sur des eaux usées, des
boues de stations d'épuration et des sédiments marins (Bae et Wuertz., 2009; Nocker et al.,
2009; Varma et al., 2009 ; Bae et Wuertz, 2012; Alonso et al., 2014; Kim et al., 2014; Li et
al., 2014). Il convient de souligner que pour fixer les valeurs des paramètres de la méthode
(type de lampe, durée d’incubation, durée de photoactivation, teneur en PMA), la plupart de
ces études se sont appuyées sur les travaux de Nocker et al. (2006, 2007) qui ont été réalisés
avec des cultures pures en bouillon et non sur des matrices complexes, conduisant
probablement à des estimations de la viabilité erronées.
4 Objectif du doctorat L’épandage des effluents d'élevages porcins représente l’une des voies de dissémination de L.
monocytogenes dans l’environnement. Cette bactérie pathogène, retrouvée dans les fèces
porcines et dans les lisiers, possède une capacité de survie remarquable dans le sol. Toutefois,
son potentiel de survie dans les effluents d'élevages porcins, au cours de leur stockage ou de
leur traitement biologique, est peu renseigné et lorsque les données existent, celles-ci sont
restreintes à la fraction cultivable de L. monocytogenes. Seuls les travaux de Klein et al.
(2010) réalisés avec une approche culturale et moléculaire, suggèrent que L. monocytogenes
76
entre en état VNC lors du stockage ou du compostage de fumier de bovins, conduisant ainsi à
une sous-estimation du risque sanitaire lié à la présence de ce pathogène dans les effluents
d'élevages. La présence dans les lisiers de formes VNC, capables de recouvrer leur
cultivabilité dans les lagunes après avoir subi un traitement biologique, pourrait expliquer la
similitude des concentrations en L. monocytogenes observée par Pourcher et al. (2015) dans
ces deux types d’effluents. Il est aussi possible que l’origine des souches isolées des lagunes
soit environnementale et non porcine comme le suggère la présence de génotypes de L.
monocytogenes non identifiés dans les lisiers, mais communs aux effluents de lagune et aux
sols situés à proximité des lagunes (Boscher et al., 2014).
L’objectif du travail de thèse était donc de préciser le comportement de L. monocytogenes
dans l’environnement d’élevages porcins (lisiers, effluents de lagune et sol) par deux
approches.
- La première approche a consisté à comparer la perte de cultivabilité des cellules viables de
L. monocytogenes dans les lisiers et des effluents de lagune.
Parmi les méthodes disponibles permettant de quantifier les cellules VNC, nous avons
sélectionné la qPCR couplée au propidium monoazide (PMA) utilisée avec succès sur les
matrices limpides, peu chargées en matière organique. L’application de la qPCR-PMA à des
matrices complexes et turbides a nécessité une étape d’optimisation de trois paramètres
intervenant sur la sensibilité de la méthode (chapitre 2). Une fois les paramètres déterminés,
la qPCR-PMA a été utilisée afin (i) de suivre la viabilité et la cultivabilité de deux souches de
L. monocytogenes inoculées dans deux lisiers et deux effluents de lagune et (ii) de déterminer
l’impact de facteurs abiotiques et biotiques susceptibles d'influencer la survie de cette
bactérie pathogène dans ces matrices (chapitre 3).
- La seconde approche, au travers d’une étude transcriptomique, visait à mieux comprendre
l’adaptation de L. monocytogenes lors de son passage du lisier vers l’effluent de lagune et le
sol. Cette partie de l’étude a consisté à rechercher les gènes différentiellement exprimés d’une
souche de L. monocytogenes isolée de lisier, après une inoculation dans un effluent de lagune
et un sol reconstitués (chapitre 4).
77
Chapitre 2 : Optimisation des paramètres de
la qPCR couplée au propidium monoazide
(qPCR-PMA) permettant de quantifier les
formes VNC de L. monocytogenes dans les
lisiers et les effluents de lagune
78
1 Avant-propos Comme l’a montré la synthèse bibliographique, L. monocytogenes est capable d’entrer en état
VNC mais aucune étude n’a permis de mettre en évidence l’existence de formes VNC de ce
pathogène dans les effluents d’élevages. Seuls les travaux de Klein et al. (2010) réalisés sur
des fumiers de bovins stockés en tas ont décrit la présence probable de formes VNC de L.
monocytogenes. Toutefois ces auteurs se sont appuyés sur les différences de dénombrements
obtenus à partir d’un ensemencement sur milieu de culture et d’une quantification par qPCR.
Dans la mesure où cette dernière comptabilise à la fois les bactéries vivantes et mortes, il
n’était donc pas possible de déduire avec certitude que les différences observées étaient dues
uniquement à la perte de cultivabilité de L. monocytogenes.
Au regard des données de la littérature, parmi les différentes méthodes de quantification des
formes VNC, nous avons retenu la qCR couplée au PMA (qPCR-PMA), déjà testée avec
succès sur L. monocytogenes en bouillon de culture, qui nous paraissait adaptable aux
matrices complexes malgré la surestimation de la viabilité de L. monocytogenes dans des
boues de méthaniseur évoquée par Wagner et al. (2008). La forte teneur en matière organique
et la turbidité des matrices perturbent en effet l’efficacité de cette méthode en réagissant avec
le PMA ou en limitant la pénétration de la lumière nécessaire à la phase de photoactivation.
Par ailleurs, l’un des problèmes majeurs des techniques fondées sur la détection du génome
réside dans leur seuil de quantification élevé. Afin d’améliorer la limite de détection de la
qPCR-PMA, nous avons dans un premier temps optimisé la technique d’extraction de l’ADN
en comparant l’efficacité de quatre kits commerciaux et en proposant des modifications des
protocoles d’extraction. Ce travail a fait l’objet d’un article publié dans la revue
MicrobiolyOPen, présenté en annexe 1. A l’issue de ces travaux préliminaires, nous avons
sélectionné le kit NucleoSpin® pour extraire l’ADN des effluents d'élevages porcins.
Une première série d’expérimentations a consisté à tester la qPCR-PMA sur une souche de L.
monocytogenes en phase exponentielle (cellules vivantes) ou soumise à une température de
90°C pendant 15 minutes (cellules mortes). Les trois paramètres expérimentaux de la qPCR-
PMA, classiquement utilisés dans la littérature scientifique, correspondaient à ceux définis
par Nocker et al. (2007) : 100µM de PMA, 5 minutes d’incubation à l’obscurité et 10 minutes
de photoactivation. Ces premiers essais réalisés sur un lisier et un effluent de lagune ont
conduit systématiquement à une sous-estimation du nombre de cellules mortes, ce qui était en
accord avec les données rapportées par Wagner et al. (2008).
79
La difficulté à laquelle nous nous sommes trouvés confrontés était de maximiser la
quantification des cellules mortes (donc, d’améliorer la pénétration du PMA dans les cellules
possédant une paroi endommagée) tout en minimisant l’entrée du PMA dans les cellules
viables. Nous avons dilué le lisier afin de réduire la turbidité et nous avons testé plusieurs
teneurs en PMA et plusieurs temps d’incubation et de photoactivation sans améliorer
l’efficacité de la méthode. C’est la raison pour laquelle, en collaboration avec l’unité HQPAP
de Ploufragan, nous avons réalisé un plan d’expérience qui permettait de tester
simultanément les trois paramètres intervenant dans l’efficacité de la qPCR-PMA
(concentration en PMA, durée d’incubation et durée de photoactivation). Les valeurs limites
des trois paramètres entrant dans le plan d’expérience (PMA : 90 et 230 µM ; incubation : 5
et 30 min. ; photoactivation : 2 et 47 min.) ont été sélectionnées en s’appuyant sur les
données de la littérature. Pour chaque matrice (lisier et effluent de lagune), un plan
d’expérience de Doehlert a été réalisé pour quantifier les cellules vivantes et les cellules
mortes, inoculées séparément, conduisant à deux séries indépendantes de résultats par
matrice. Les valeurs optimales des trois paramètres prenant en compte à la fois les
quantifications des cellules mortes et des cellules vivantes ont été calculées en appliquant une
fonction de désirabilité. Une fois les conditions optimales déterminées pour chaque matrice,
celles-ci ont été testées sur une série de lisiers et de lagunes prélevés dans des élevages
porcins afin d’évaluer la reproductibilité de la méthode.
2 Article
80
81
82
83
84
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86
87
88
3 Bilan Les valeurs optimales des trois paramètres ayant une influence sur la qPCR-PMA
(concentration en PMA, durée d’incubation et de photoactivation) ont été obtenues grâce à un
plan d’expérience de Doehlert associé à une fonction de désirabilité. Il ressort de ces travaux
que la méthode de la qPCR-PMA est applicable dans des matrices turbides riches en matière
organique.
Alors que la plupart des auteurs qui étudient la viabilité des bactéries dans les
environnements complexes ne justifient pas le choix des valeurs de ces paramètres, notre
étude indique clairement que les conditions optimales dépendent du type de matrice. Ainsi,
elles étaient de 55 µM de PMA, 5 min. d’incubation et 56 min. de photoactivation pour le
lisier et de 20µM de PMA, 20 min. d’incubation et 30 min. de photoactivation pour l’effluent
de lagune. Les expérimentations complémentaires menées sur cinq lisiers et quatre effluents
de lagune ont permis de valider les valeurs de ces paramètres signifiant qu’une fois que les
conditions optimales ont été obtenues à l’aide d’un plan d’expérience, celles-ci sont
applicables à un type de matrice donné.
En tenant compte du seuil de quantification de la qPCR (104 ufc-eq mL-1), lorsque L.
monocytogenes est inoculée à une teneur initiale de 107 ufc. mL-1, la différence maximale de
concentration mesurable entre le nombre de cellules totales (mortes et vivantes) mesuré par
qPCR et le nombre de cellules vivantes mesuré par qPCR-PMA est de l’ordre de 3 Log10. Il
est donc possible de suivre une cinétique de disparition de la viabilité de souches de L.
monocytogenes inoculées en fortes concentrations dans un lisier ou un effluent de lagune tant
que le seuil de quantification de la qPCR n’est pas atteint.
89
Chapitre 3 : Etude du comportement des
formes viables non cultivables de L.
monocytogenes dans les lisiers et l’effluents
de lagune de deux élevages porcins
90
1 Avant-propos Il n’existe aucune donnée sur le comportement des formes VNC de L. monocytogenes dans
les effluents d’élevages porcins. Une campagne de mesures réalisée dans le cadre du projet
ESALIS par Irstea-Rennes sur les effluents de 44 élevages bretons a mis en évidence une
prévalence plus élevée de pathogène dans les effluents de lagunes (24%) que dans les lisiers
bruts (18,2%). Par ailleurs, le suivi mensuel sur une année de deux élevages bretons a montré
que les concentrations en L. monocytogenes étaient du même ordre de grandeur dans les
lisiers et les effluents de lagune (projet FEDELILAS). Les résultats de ces deux études
suggèrent que les conditions environnementales des lagunes peuvent favoriser la persistance
de cette bactérie.
Il est possible que les souches présentes dans les lagunes aient une origine environnementale
comme l’ont suggéré les résultats du typage moléculaire réalisé par l’unité HQPAP de
l’Anses de Ploufragan sur des souches isolées dans les deux élevages. En effet, certains
génotypes communs aux lagunes et aux sols situés à proximité de celles-ci n’ont pas été
retrouvés dans les lisiers. Toutefois, dans les projets ESALIS et FEDELILAS, L.
monocytogenes a été recherchée par une méthode culturale. Il se peut donc que le lisier
favorise l’entrée des bactéries en état VNC et que celles-ci recouvrent leur cultivabilité dans
les lagunes. Cette hypothèse est le point de part d’une étude qui avait pour objectif de
comparer le comportement de L. monocytogenes dans le lisier et l’effluent de lagune. Trois
facteurs ont été étudiés :
- matrice : deux lisiers et deux effluents de lagune prélevés dans deux élevages ont été
transférés dans des flacons et incubés pendant 60 jours après inoculation de souches de L.
monocytogenes. Les effluents ont été caractérisés par l’analyse de leur composition chimique
et microbiologique.
- température : les microcosmes ont été incubés à 8°C et 20°C, températures moyennes des
effluents de lagune observées en période hivernale et estivale sur les deux élevages ;
- souche : deux souches (L111, sérogroupe IVb, isolée d’un lisier et L120, sérogroupe IIb,
isolée d’un effluent de lagune) rendues résistantes à la rifampicine ont été inoculées à une
teneur initiale de 108 ufc. mL-1.
L’originalité de cette étude réside dans son approche qui prend en compte non seulement les
formes cultivables (ensemencement sur milieu de culture) mais également les formes viables
91
(qPCR-PMA), permettant ainsi d’estimer l’impact de différents facteurs environnementaux et
intrinsèques (facteur " souche ") sur la viabilité de L. monocytogenes. Par ailleurs, la
différence entre le nombre de bactéries totales estimé par qPCR et le nombre de bactéries
viables estimé par qPCR-PMA a permis de suivre la cinétique de mortalité de L.
monocytogenes.
Etant donné la diversité des termes employés pour définir les différents états physiologiques
des bactéries, nous avons sélectionné certains d’entre-eux dans l’article :
- bactéries cultivables : bactéries capables de se développer sur un milieu de culture ;
- bactéries viables mais non cultivables (VNC) : bactéries incapables se développer sur un
milieu de culture mais possédant une paroi intègre ;
- bactéries viables : somme des bactéries cultivables et des bactéries VNC ;
- bactéries mortes : bactéries dont la paroi endommagée irrémédiablement permet le passage
de petites molécules.
- bactéries totales : somme des bactéries viables et des mortes.
92
Fate of viable but non-culturable Listeria monocytogenes in pig manure microcosms
Desneux Jérémy 1,2, Biscuit Audrey 1,2, Picard Sylvie 1,2, Pourcher Anne-Marie 1,2
1 Irstea-Rennes, Rennes, France
2 Université Européenne de Bretagne, Rennes, France
2 Abstract The fate of two strains of L. monocytogenes et their ability to become viable but non-
culturable (VBNC) was investigated in microcosms containing piggery effluents (two raw
manures and two biologically treated manures) stored for two months at 8°C and 20°C.
Levels of L. monocytogenes were estimated using the culture method, qPCR, and propidium
monoazide treatment combined with qPCR. The chemical composition and the microbial
community structure of the manures were also analysed. The strains showed similar decline
rates and persisted up to 63 days. At day zero, the percentage of VBNC cells among viable
cells was higher in raw manures (81.5-94.8%) than in treated manures (67.8-79.2%). The
changes in their proportion over time depended on the temperature and on the type of
effluent: the biggest increase was observed in treated manures at 20°C and the smallest
increase in raw manures at 8°C. The chemical parameters had no influence on the behaviour
of the strains, but decrease of the persistence of viable cells was associated with an increase
in the microbial richness of the manures. This study demonstrated that storing manure altered
the culturability of L. monocytogenes, which rapidly entered the VBNC state, and underlines
the importance of including VBNC cells when estimating the persistence of the pathogens in
farm effluents.
Keywords: L. monocytogenes, VBNC state, manure, microcosm, PMA, pyrosequencing
93
3 Introduction The presence of Listeria monocytogenes, a food-borne pathogen, has been demonstrated in
animal faeces, manure and farm wastewaters (Boscher et al., 2012; Dungan et al., 2012;
Farzan et al., 2010; Hellstrom et al., 2010; Pourcher et al., 2012). Humans can be exposed to
L. monocytogenes strains by direct contact through farming operations or indirectly through
consumption of food contaminated by manure from infected or shedding animals
(Mohammed et al., 2010; Nightingale et al., 2004; Schlech et al., 1983). It has been reported
that cattle farm ecosystems maintain a high prevalence of L. monocytogenes, including
subtypes linked to human listeriosis (Nightingale et al., 2004). In a study conducted in
piggeries in Brittany (France), Pourcher et al. (2012) observed high occurrence of L.
monocytogenes in pig manures stored in pits and in lagoons after biological treatment
(respectively 18% and 24% of the samples were positive). Lyautey et al. (2007) showed a
link between the occurrence of L. monocytogenes in surface waters in agricultural catchments
in Ontario (Canada), the extent of cropped land and proximity to an upstream dairy operation.
More recently, Stea et al. (2015), reported that surface waters may be a reservoir of L.
monocytogenes, especially in rural agricultural watersheds. Farm environments may thus act
as a vehicle for the dissemination of L. monocytogenes.
Several factors including temperature, moisture, pH and competition for nutrients may
influence the survival of pathogenic bacteria. However, L. monocytogenes can acquire
tolerance to numerous physical and physiochemical stresses and can thus survive in a wide
range of environmental conditions (Gandhi and Chikindas 2007; Roberts and Wiedmann
2003), which may explain their high prevalence in stored and treated manures. Moreover, in
response to environmental stress such as starvation, light, temperature, and NaCl
concentrations, L. monocytogenes may become viable but non-culturable (VBNC) (Besnard
et al., 2002; Lindback et al., 2010). Although resuscitation from the VBNC state of L.
monocytogenes is difficult to prove (Cappelier et al., 2007; Lindback et al., 2010), the
presence of VBNC bacteria in the environment is a health risk for humans since the cells may
retain their infectivity (Besnard et al., 2002).
In most studies on the survival of L. monocytogenes during manure storage, manure treatment
(e.g. composting) or after manure is spread on soil, the viability of the pathogen was assessed
only on the basis of its recovery by cultural methods (Erickson et al., 2014; Goberna et al.,
2011; Grewal et al., 2007; Hutchison et al., 2005b; Millner et al., 2014; Nicholson et al.,
2005). Given the ability of L. monocytogenes to enter the VBNC state, the decrease in
94
concentration reported by these authors may in fact underestimate the number of infectious
pathogens. Very few studies have used molecular methods to quantify L. monocytogenes in
urban or animal effluents. Klein et al., 2011; Wery et al., 2006 investigated the persistence of
L. monocytogenes inoculated in microcosms in sewage sludge and in cattle manure
(stockpiled or composted), respectively, using cultural methods and qPCR targeting hlyA
gene. The results of these studies in which qPCR was used, showed a slower decline of L.
monocytogenes cells than when a cultural method was used, suggesting the presence of non-
culturable cells. However, DNA-based quantification methods detect DNA in both non-
culturable and dead bacteria, leading to false positive results. To prevent the amplification of
DNA from dead cells, propidium monoazide (PMA), a DNA-intercalating agent which can
enter membrane-damaged cells, has been used in combination with qPCR (qPCRPMA) to
enable only viable bacteria to be quantified (Adela Yanez et al., 2011; Contreras et al., 2011;
Dong et al., 2014; Forghani et al., 2015; Li et al., 2014; Nocker et al., 2006). However, it is
worth noting that qPCRPMA remains difficult to apply in turbid matrices such as wastewater or
manure containing high rates of suspended matter (Varma et al., 2009; Wagner et al., 2008).
To overcome this drawback, our team has recently compared different experimental
conditions to achieve optimal qPCRPMA quantification of L. monocytogenes in pig manures
(Desneux et al., 2015).
The aim of the present study was to evaluate the persistence of L. monocytogenes strains and
their ability to enter the VBNC state during the storage of raw pig manure and biologically
treated manure stored in a lagoon (lagoon effluent) at the laboratory scale at two temperatures
(8 °C and 20 °C) selected to mimic the average winter and summer temperatures in piggery
lagoons in Brittany. Manure and lagoon effluent microcosms were inoculated with two
rifampicin-resistant strains of L. monocytogenes originating from two piggeries, and
quantified over a 63 day period by plate counts (cultivable cells), qPCR targeting hlyA gene
(total cells) and qPCR after contact with PMA (viable cells). To better understand the
relationship between the properties of the matrix and the behaviour of L. monocytogenes, the
chemical and microbial composition of the manures and the lagoon effluents were analysed at
T0 and after two months of incubation.
95
4 Materiel and method
4.1 Bacterial strains
The experiments were carried out with two strains of L. monocytogenes: strain L111 (CIP
110869) and strain L120 (CIP 110870) isolated from pig manure and a lagoon effluent,
respectively. The two strains were serotyped by the research unit Hygiene and Quality of
Poultry and Pork Products (Anses Ploufragan, France). They belonged to serogroups IVb
(L111) and IIb (L120). Two rifampicin-resistant (Rifr) mutants (L111r and L120r) were
generated from the two selected strains as described in Lung et al. (2001) to facilitate L.
monocytogenes enumeration on plate agar. The Rifr strains were cultivated at 37 °C in
nutritive broth (OXOID, France) supplemented with 3 g L-1 of glucose and 0.1 g L-1 of
rifampicin (Sigma Aldrich, France) (NBG-RIF broth). Both strains had similar growth rates
in the nutritive broth.
4.2 Characteristics of the treatment processes
Raw manures (Manure-1 and Manure-2) and lagoon effluents (Lagoon-1 and Lagoon-2) were
collected in sterile flasks from pig manure treatment processing units at two farms (farm 1
and farm 2) located in Brittany (France). The manure treatments consist of pre-storage of raw
manure in a tank followed by centrifugation to concentrate the phosphorus into a solid phase.
The liquid phase is biologically treated in aerobic and anoxic stages in a reactor to reduce the
level of nitrogen. The treated manure is dehydrated using a filter band press (farm 1) or
settled in a settling tank (farm 2). The liquid fraction is then sent to an open-air lagoon where
it is stored for 9-12 months before being used to water crops.
4.3 Chemical characterisation of manure and lagoon effluent
Total solids (TS), volatile solids (VS), total Kjeldahl nitrogen (TKN) and total ammonia
nitrogen (TAN) were determined using standard methods (APHA. 1998). Volatile fatty acids
(VFA) were analysed using high-pressure liquid chromatography (HPLC) (Peu et al., 2004).
The pH was measured using a hand-held pH meter (Hanna, Tanneries, France).
4.4 Preparation of the microcosms
Microcosm experiments were conducted in 200-mL glass bottles containing 100 mL of raw
manure or lagoon effluent. The bottles were closed with a screw plug to maintain anoxic
96
conditions (raw manure microcosms) or with carded cotton plugs to allow air to penetrate
(lagoon effluent microcosms). The bottles were stored for a week in the d ark at 8 °C or 20 °C
to enable acclimation of endogenous microbial flora before inoculation with L.
monocytogenes strains.
A volume of 150 µL of pure culture of the L111r or the L120r strain in the exponential phase
growth in nutritive broth (Oxoid, France) was transferred into 100 mL NBG-RIF broth and
incubated for 17 h at 37 °C to obtain stationary-phase cells. Aliquots (40 mL) of the
incubated NBG-RIF broth were centrifuged for 5 min at 5000 g. The pelleted cells were
suspended in 5 mL of 0.8% NaCl and centrifuged for 5 min at 5000 g. The pellet was
resuspended in 5 mL of 0.8% NaCl. Next, each microcosm was inoculated with 1 mL of the
bacterial suspension to reach an initial concentration of approx.108 L. monocytogenes mL-1.
Three microcosms were used for each strain. A total of 24 microcosms (two strains, two raw
manures, two lagoon effluents, three replicates) were stored in the dark at 20 °C or 8 °C for
63 days.
4.5 Quantification of autochthonous L. monocytogenes in raw manures and lagoon
effluents
L. monocytogenes was enumerated by a three-tube MPN method. Before inoculation with the
Rifr strains, 10 mL, 1 mL and 0.1 mL of raw manure or lagoon effluent were transferred in
90 mL or 9 mL of ONE Broth-Listeria (Oxoid, France). After incubation for 48 h at 30 °C,
0.1 ml of each enrichment broth was plated onto Rapid L’mono agar (Bio-Rad, France) and
incubated for 48 h at 37 °C. Characteristic colonies of L. monocytogenes were identified
based on their phosphatidylinositol phospholipase C (PIPLC) activity.
4.6 Quantification of Rifr strains in the microcosms
Samples for cultural, qPCR and qPCRPMA quantification were collected in each microcosm
immediately after inoculation of the Rifr strains (T0), and after 7, 21, 42 and 63 days of
incubation.
4.7 Cultural method
Serial 10-fold dilutions were prepared in peptone water (Oxoid, France). A volume of 0.25
mL of undiluted matrices or 0.1 mL of dilutions was surface plated on PALCAM agar
without supplement (Oxoid, France) containing 100 mg L-1 of rifampicin and 50 mg L-1 of
97
cycloheximide (Sigma-Aldrich, France). Colonies were counted after 48-72 h of incubation at
37 °C. Results are expressed as cfu mL-1.
4.8 Propidium monoazide (PMA) treatment
PMA (Biotium, Inc., Hayward, CA) was dissolved in water to prepare a stock solution (1 mg
mL-1) stored in the dark at -20 °C. PMA was used as described in Desneux et al. (2015).
Briefly, 400 µL of manure or 600 µL of lagoon effluent were transferred in transparent
polypropylene reaction tubes (Greiner Bio-One, France). PMA was added to the tubes
containing manure or lagoon effluent at a final concentration of 55 or 20 µM, respectively.
After incubation in the dark at room temperature for 5 min (manure) or 20 min (lagoon
effluent), the samples were placed horizontally on ice at a distance of 30 cm from a 650-W
halogen light source. They were exposed to the light source for 55 min (manure) or 30 min
(lagoon effluent). Then, 250 µL of PMA treated manure and 500 µL of PMA treated lagoon
effluent were transferred in 2 mL tubes and centrifuged for 5 min at 5000 g. The pellets were
stored at -20 °C before DNA extraction.
4.9 DNA extraction and quantification of L. monocytogenes and total bacteria
DNA was extracted from PMA treated and untreated samples with Nucleospin kit for soil
(Macherey Nagel) according to the manufacturer’s instructions with one modification of the
elution procedure as described in Desneux and Pourcher (2014).
L. monocytogenes were quantified using the protocol of Nogva et al. (2000). Briefly, PCR
reactions were performed in a volume of 25 µL containing 2 µL of diluted DNA, 1X TaqMan
Buffer, 5 mM MgCl2, 200 µM dNTPs, 0.1 µM L. monocytogenes-specific probe, 0.3 µM
L. monocytogenes specific primers (LiMo) (each), 12.5 µL of iQ Supermix (Bio-Rad, France)
and water to complete the volume to 25 µL. Cycling parameters were 95 °C for 10 min,
followed by 40 cycles at 95 °C for 20 s and 60 °C for 60 s.
For total bacteria, PCR reactions were performed in a volume of 25 µL containing 12.5 µL of
iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, France), 200 nmol L-1 of each primer (W18 and W02),
2 µL of diluted DNA, and 9.5 µL of water. The cycling parameters were 95 °C for 10 min,
followed by 45 cycles at 95 °C for 30 s, 60 °C for 50 s, and 72 °C for 30 s.
The primers and probes used are listed in Table 1. The PCR reaction was prepared using the
Automated Pipetting System epMotion® (Eppendorf, France). PCR amplification was
98
performed using a Bio-Rad CFX96 real-time PCR machine with Bio-Rad CFX Manager
software, version 1.1 (Bio-Rad, France). Data were processed with Opticon Monitor version
3. 1. 32 and CFX manager version 1. 1 (Biorad, Hercule, CA).
Table 1: Sequences of primers and probes used in the study
Probe and primers Sequences (5'-3') Tm (°C) References
LiMo F TGC-AAG-TCC-TAA-GAC-GCC-A 60.3 (Nogva et al., 2000)
LiMo R CAC-TGC-ATC-TCC-GTG-GTA-TAC-TAA 60.3 “ ”
Probe hlyA CGA-TTT-CAT-CCG-CGT-GTT-TCT-TTT-CG 70.2 “ ”
W18 GAGTTTGATCMTGGCTCAG 50 (Godon et al., 1997)
W02 GNTACCTTGTTACGACTT 50 (Weisburg et al., 1991)
The results are expressed as cfu equivalent (cfu-eq mL-1). The detection threshold was 5.103
cfu-eq mL-1 for manure and 2.5.103 cfu-eq mL-1 for lagoon effluent.
The cultural method and the qPCR performed on PMA treated samples and on untreated
samples estimated:
- the culturable cells: plate counts
- the total number of cells: qPCR without PMA
- the number of viable cells: qPCRPMA
- the number of VBNC: [qPCRPMA] - [plate counts]
4.10 T90 calculations and statistical analysis
Decay rates were estimated as T90 values using Chick’s model (monophasic model, C (t) =
C0 e-kt) or Cerf’s model (biphasic model, C (t) = C0 (fe-k1t + (1-f) e-k2t) described in Xiong
et al. (1999). C(t) is the concentration at time t, C0 is the initial concentration, k is the first
order decay rate constant, f is the initial proportion of the first fraction, k1and k2 are the
decay constants of the first and second phase, respectively. Decay rate models and their
parameters were obtained using XLSTAT 2010 software. T90 (expressed in days) was
calculated as follows: T90 =-ln (0.1) / k (Chick’s model) or T90 =-ln (0.1) / k1 (Cerf’s
model).T90 were subjected to analysis of variance, and a Newman-Keuls test for multiple
comparisons was applied to determine significantly different T90.
99
4.11 Pyrosequencing of 16S rDNA gene sequences
The microbial diversity of the manure and the lagoon effluent microcosms stored at 8 °C and
20 °C was analysed using a metagenomic approach applying 454-pyrosequencing
technology. At T0 and T63, DNA extracted from the three replicate microcosms inoculated
with strain L111r were pooled to obtain a total volume of 100 µL. DNA was precipitated with
ethanol to reach a final volume of 20 µL. The 16S rDNA V3-V4 region of DNA was
amplified with the primers F343 (5’-
CTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTACGGRAGGCAGCAG-3’) and R784 (5’-
GGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTACCAGGGTATCTAATCCT-3’) using 30
amplification cycles with an annealing temperature of 65 °C. The average amplicon length
was 510 bp. The 16S rDNA V3-V4 region of the DNA extracts was sequenced on the GeT-
PlaGe platform in Toulouse (Genotoul, Toulouse, France) using Illumina Miseq technology.
Because MiSeq enables paired 250-bp reads, the ends of each read overlap and can be
stitched together to generate extremely high quality, full-length reads of the entire V3 and V4
region in a single run. Single multiplexing was performed using a homemade 6 bp index,
which was added to the R784 during a second PCR with 12 cycles using forward primer
(AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC) and reverse primer
(CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-index-GTGACTGGAGTTCAGACGTGT). The
resulting PCR products were purified and loaded onto the Illumina MiSeq cartridge according
to the manufacturer’s instructions. The quality of the run was checked internally using PhiX,
and then each paired-end sequence was assigned to its sample with the help of the previously
integrated index.
4.12 Analysis of pyrosequencing data using the QIIME pipeline
The data were studied using the quantitative insights into microbial ecology (QIIME) pipeline
(Caporaso et al., 2010b). Operational taxonomic units (OTUs) were formed at 97% similarity
using UCLUST (Edgar 2010). The representative sequences of each OTU were aligned to
16S reference sequences using PyNAST with a minimum length of 150 bp and 75%
minimum percent identity (Caporaso et al., 2010a). The alpha diversity within the microcosm
samples was estimated by the Chao1 richness estimator, the abundance-based coverage
(ACE) estimator and the Shannon index. Shifts in bacterial community structure over time
were assessed by principal coordinate analysis (PCoA) of the pairwise weighted Unique
100
Fraction (UniFrac) distances (Lozupone et al., 2006; Lozupone and Knight 2005; Lozupone
et al., 2011). Uncertainty in PCoA plots was estimated using jackknife analysis, in which the
jackknife replicate was 10.
5 Results Autochthonous L. monocytogenes were not detected (<4 MPN 100 mL-1) in the four matrices
collected for the microcosm assays.
5.1 Persistence of inoculated strains in manures and lagoons
Figure 1 shows the levels of strains L111r and L120r for each culture and molecular method
in the two manures stored at 8 °C and 20 °C. A decrease in the concentration of L.
monocytogenes was observed in all microcosms but both strains were still recovered 63 days
after the inoculation. The two strains displayed similar behaviour depending on the
temperature and on the origin of the manure (Figure 1, Supplementary Table S1).
Figure 1: Average concentrations of strains L111r (solid line) and L120r (dotted line) in Manure-1 and Manure-2 incubated at 8 °C and 20 °C by qPCR, qPCRPMA and culture. The bars represent minimum and maximum values of triplicates.
0 20 40 60
Manure-1 8°C
0 20 40 60
Manure-2 8°C
0 20 40 60
Manure -1 20°C
0 20 40 60
Manure-2 20°C
9
8
7
6
5
4
3
2
1
9
8
7
6
5
4
3
2
1
9
8
7
6
5
4
3
2
1
9
8
7
6
5
4
3
2
1
Log 1
0ce
llso
r cf
u-e
qm
L-1
days days
days days
Log 1
0ce
llso
r cf
u-e
qm
L-1
Log 1
0ce
llso
r cf
u-e
qm
L-1Lo
g 10
cells
or
cfu
-eq
mL-1
PCR qPCRPMA culture
101
Generally, the lowest temperature increased the persistence of both strains, regardless of the
quantification method used. The Log10 reduction observed between 8 °C and 20 °C was more
marked using plate counts. The biggest difference was observed in Manure-2 microcosms in
which the average reduction in culturable bacteria did not exceed 1.2 Log10 at 8 °C whereas it
reached 6.2 Log10 after two months of incubation at 20 °C (Table 2). T90 values observed
with both cultural and molecular methods were approximately 2.5-fold lower in Manure-1
than in Manure-2. Except for cultivable cells at 20°C, the Log10 reduction after 63 days was
also higher in Manure-1 (3.4-3.8 at 8°C; ≥4.4 at 20°C) than in Manure-2 (0.9-1.2 at 8°C; 4.0
at 20°C). Moreover, the decrease in the concentration of both strains at 20 °C showed a
marked biphasic pattern in Manure-1, which was not observed in Manure-2, with a break in
the kinetics after 21 days of incubation.
Table 2: T90 values (days) and Log10 reduction after 63 days for the two strains of L. monocytogenes (mean of 6 values) in manure and lagoon effluent microcosms maintained at 8 °C and 20 °C
Matrix Method T90 (days) Log10 reduction
8 °C 20 °C 8 °C 20 °C
Manure-1 culture
21.2e
3.6b
3.5abc
5.5b
qPCR 19.3ef 2.5b 3.4abc 4.4c
qPCRPMA
18.9ef
2.5b
3.8a
≥4.6†
Manure-2 culture 53.5a 9.9a 1.2fg 6.2a
qPCR 56.7a* 12.1a 0.9g 4.0c
qPCRPMA 51.7a* 11.2a 1.1fg 4.0c
Lagoon-1 culture 18.4ef 10.3a 3.6ab 4.0c
qPCR 17.1ef 10.7a 2.9c 2.5d
qPCRPMA
15.2f
10.0a
3.2bc
2.8d
Lagoon-2 culture 25.7d 10.6a 2.4d 5.9a
qPCR 37.1b 12.2a 1.6ef 4.3c
qPCRPMA 32.4c 10.1a 2.0de 4.4c Values in the same column followed by different letters differ significantly (Newman-Keuls. p <0.05); * mean of 3 values (strain L120r); † detected but not quantified
The two strains also exhibited similar behaviour in the lagoon microcosms regardless of the
method of quantification (Figure 2, Supplementary Table S1).
102
Figure 2: Average concentrations of strains L111r (solid line) and L120r (dotted line) in Lagoon-1 and Lagoon-2 incubated at 8 °C and 20 °C by qPCR, qPCRPMA and culture. The bars represent minimum and maximum values of triplicates.
The T90 values and the Log10 reduction were affected by the origin and the temperature of
the lagoon, but to a lesser extent than that observed in manure microcosm assays. At 8 °C,
both strains persisted better in Lagoon-1 than in Lagoon-2 whereas the opposite was observed
at 20 °C. Both strains persisted longer at 8 °C in Lagoon-2 with a T90 of between 25.7 and
37.1 days at 8 °C, and between 10.1 and 12.2 days at 20 °C. The Log10 reduction was also
lower at 8 °C (1.6-2.4) than at 20 °C (4.3-5.9) after two months of incubation. In contrast, the
persistence of the strains in Lagoon-1 was hardly influenced by the temperature, leading to a
similar Log10 reduction (approx. 3.1) at the end of the incubation period.
5.2 Comparison of the level of the cultivable, viable, and total bacteria
Considering the strains together, there was no significant difference between the T90 values
obtained with the cultural and molecular methods at 20 °C, regardless of the matrix, whereas
the Log10 reduction was systematically significantly higher after 63 days when estimated
0 20 40 60
Lagoon-2 20°C
0 20 40 60
Lagoon-2 8°C
0 20 40 60
0 20 40 60
Lagoon-1 8°C
Lagoon-1 20°C
9
8
7
6
5
4
3
2
1
days
9
8
7
6
5
4
3
2
1
days
9
8
7
6
5
4
3
2
1
days
9
8
7
6
5
4
3
2
1
days
Log 1
0ce
llso
r cf
u-e
qm
L-1Lo
g 10
cells
or
cfu
-eq
mL-1
Log 1
0ce
llso
r cf
u-e
qm
L-1Lo
g 10
cells
or
cfu
-eq
mL-1
PCR qPCRPMA culture
103
using cultural method (Table 2). At 8 °C, the same trend was observed, but the differences
between the Log10 reductions were less marked than at 20 °C.
At T0, the difference in L. monocytogenes concentrations measured with the cultural method
and with qPCRPMA ranged from 0.5 to 0.7 Log10 in the lagoon effluent microcosms and from
0.7 to 1.3 Log10 in the manure microcosms, suggesting that both strains entered the VBNC
state in the early hours of contact with the manures and the lagoon effluents. Interestingly, the
biggest differences in concentration obtained between culture and qPCRPMA were observed in
Manure-1. Except for Manure-1 at 8 °C, where significant growth of cultivable bacteria was
observed during the first week of incubation, cultivable, total and viable cells exhibited
similar behavior during the 21 first days. After three weeks, in all microcosms at 20 °C and in
two microcosms at 8 °C, the levels of cultivable cells declined faster than viable bacteria,
pointing to an increase in VBNC forms over time.
Considering the viable cells, the proportion of VBNC cells at T0 was significantly higher (p
< 0.05) in manures (81.5 to 94.8%) than in lagoon effluents (67.8 to 79.2%) (Table 3). Their
proportion changed over time.
Table 3: Percentage of VBNC cells among viable cells in the two strains of L. monocytogenes (mean of 6 values) at 8 °C and at 20 °C in manure and lagoon effluent microcosms at T0 and T63 days.
Temperature Matrix T0 T63 (°C)
mean mean
8 Manure-1 94.5a 95.0 a 8 Manure-2 81.5b 85.0 b 20 Manure-1 94.8 a 98.8 a 20 Manure-2 84.8ab 99.8 a
8 Lagoon-1 67.8 c 83.1 b 8 Lagoon-2 76.1 bc 88.7 b 20 Lagoon-1 79.2 bc 97.3 a 20 Lagoon-2 78.1 bc 99.2 a
Values in the same column followed by different letters differ significantly (Newman-Keuls. p <0.05)
The biggest difference in the proportion of VBNC between T0 and T63 was observed in
lagoon effluents at 20 °C (18-21%) and the smallest in raw manures at 8 °C (0.5-3.5%),
suggesting that L. monocytogenes kinetics of entry into the VBNC state depended on the
matrix and on the temperature.
104
In all the microcosms, quantification by qPCR gave similar results as by qPCRPMA, indicating
that the bacteria remained viable in both manure and lagoon effluent microcosms. The
concomitant decline in total and viable bacteria suggests that the DNA of dead bacteria was
rapidly degraded or bound to the matrix, thereby preventing its amplification. To test this
hypothesis, a complementary experiment was performed. A culture of L. monocytogenes
washed with sodium chloride and exposed to ultrasound (8 min, 360 W) was placed in a
water bath for 10 minutes at 85 °C to damage the bacterial membrane. Manure and lagoon
effluent were inoculated in triplicate with dead bacteria at an initial concentration of 7 107 cfu
mL-1. The manure and lagoon effluent were then incubated at 20 °C. The cell numbers
measured by qPCR dropped by more than 3.2 Log10 within 5 days, confirming the rapid
degradation of the DNA of dead bacteria in both the manure and lagoon effluent.
The conditions of each microcosm led to a particular behaviour of the culturable and VBNC
cells, suggesting that the persistence of L. monocytogenes was affected by the combined
influence of the temperature and of the composition of the matrix.
5.3 Chemical and microbial composition of the manures and lagoon effluents
The chemical composition of the four matrices differed but remained stable over the course
of the experiment (Supplementary Table S2) and was not affected by the incubation
temperature. The pH ranged between 7.3 and 7.8 in the manures and between 8.0 and 9.0 in
the lagoon effluent. Organic matter and nitrogen contents measured in manures ranged
between 5.4 and 18.6 g kg-1and between 1.8 and 4 gN kg-1, respectively, and were 10-fold
higher than in lagoon effluents. The level of total bacteria estimated by qPCRPMA was also
10-fold higher in the manures than in lagoon effluents. At T0, they ranged from 2 109 to 6.7
109 eq-cfu mL-1 in the manures and from 2.5 108 to 4.9 108 eq-cfu mL-1 in the lagoon
effluents and did not change throughout the incubation period.
Since the behaviour of the two strains was similar, the bacterial community profiles at T0 and
T63 were assessed by 16S rRNA pyrosequencing of the microcosms inoculated with strain
L111r. The observed OTU numbers and richness estimators (Chao 1 and ACE), showed that
the richness values varied 4 and 7-fold among the microcosms, respectively (Table 4). The
richness of the manure (4428 to 5470 observed OTUs) and the species diversity estimated by
the Shannon index (8.2 to 9.3) decreased slightly during incubation. The richness of the
lagoon effluent microcosms was more variable, ranging from 1388 to 4540 OTUs. The
lowest diversity was observed in Lagoon-1 at 8 °C, which also displayed the lowest richness.
105
In contrast to the manure, the diversity of Lagoon-2 increased at 8 °C in the three
microcosms, or remained stable throughout incubation.
Table 4: OTU (Operational taxonomic units), Chao 1 (species richness estimator), ACE
(abundance-based coverage estimator), and Shannon (diversity index) of samples calculated
at T0 and after 63 days of incubation for each microcosm inoculated with strain L111r
Matrix Temperature (°C)
Time (days)
Observed OTUs Chao1 ACE Shannon
Manure-1 8 0 5470 19965 23270 9.5 8 63 5171 18536 21308 8.2 20 0 5280 12371 15136 8.3 20 63 4750 13233 15987 9.0
Manure-2 8 0 4872 15451 17821 8.9 8 63 4428 14046 16234 8.5 20 0 4962 15625 17912 9.0 20 63 4434 14431 16490 8.6
Lagoon-1 8 0 1388 3090 3329 4.3 8 63 2007 5231 5272 8.0 20 0 2659 6945 7842 6.5 20 63 2975 7780 8810 7.4
Lagoon-2 8 0 4540 14744 16621 8.5 8 63 4157 13731 15194 8.5 20 0 1989 5198 5505 6.6 20 63 3676 10293 11608 8.3
The relative taxonomic abundance of the bacterial community at the phylum level is
presented in Figure 3 and Supplementary Table S3. Samples were dominated by four major
phyla found in both manure and lagoon microcosms: Proteobacteria (7-26% in manures;
10.5-83% in lagoons), Firmicutes (39-66% in manures; 10-72.5% in lagoons), Bacteroidetes
(16-23% in manures; 1.8-22% in lagoons) and Actinobacteria (1.4-6.4% in manures; 0.4-16%
in lagoons).
106
Figure 3: Relative abundances of major phyla in manures (a) and lagoon effluents (b) microcosms at days T0 and T63. Only relative abundances of phylum higher than 1% are shown, all other sequences are included in “others”.
The relative abundance of the dominant phyla was more stable in manures than in lagoon
effluents which varied between the two incubation temperatures. Principal coordinate
analysis (PCoA) of the unweighted Unifrac distance (Figure 4) revealed significant
differences between the diversity of the manure and lagoon microcosms.
Figure 4: diversity analysis of the composition of the manures and lagoon effluents inoculated with strain L111r. The phylogenetic dataset was analyzed using Jackknifed PCoA of the weighted pairwise UniFrac distance. Manure-1 (M1) and Manure-2 (M2) at 8 °C (orange), M1 and M2 at 20 °C (red), lagoon-1 (L1) and lagoon-2 (L2) at 8 °C (pale blue), L1 and L2 at 20 °C (dark blue); triangles represent T0 ; squares represent T63.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Bacteroidetes Firmicutes Proteobacteria
Actinobacteria Tenericutes WWE1
Cyanobacteria Spirochaetes others
M1T0 M2T0 M1T63 M2T63 M1T0 M2T0 M1T63 M2T63
8°C 20°C
a b
L1T0 L2T0 L1T63 L2T63 L1T0 L2T0 L1T63 L2T63
8°C 20°C
0.2
0.1
0.0
-0.1
-0.2
-0.3-0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0.0 0.1 0.2 0.3
PC
2-
18
.7%
PC1- 42.1%
L1M1
L2
L2
L1
L2
L2
L1
L1
M2 M2 M2
M2 M1
M1 M1
107
The manures clustered close together, showing that their bacterial communities remained
stable over time regardless of temperature, whereas the lagoon effluents were more separated.
At 8 °C, the overall composition of the microbiota in both lagoons was relatively stable,
whereas changes in the communities occurred at 20 °C. Given the stability of the bacterial
communities in the manures, it appears difficult to establish a link between the behavior of
the strains and the relative taxonomic abundances of the bacterial community of the matrices.
However, the Log10 reduction in the number of viable cells of L. monocytogenes strain L111r
estimated by qPCRPMA increased with an increase in species diversity and in the number of
observed OTUs (Figure 5).
Figure 5: Relationship between Log10 reduction of viable cells of strain L111r estimated by qPCRPMA incubated at 20 °C and the Shannon index and the numbers of observed OTUs at T63.
6 Discussion Culturable L. monocytogenes have already been detected in pig manure (Farzan et al., 2010;
Pourcher et al., 2012) and shown to persist longer than other zoonotic pathogens such as
thermotolerant campylobacter spp., Salmonella or E. coli O157 in the soil after application of
manure (Brennan et al., 2014; Nicholson et al., 2005). However, little information was
available on their survival and their ability to enter in the VBNC state during storage of the
manure. In this study, the persistence of two strains of L. monocytogenes originating from
piggery effluents was studied in raw manure and in lagoon effluent (liquid fraction of
biologically treated manure) to see if storing the effluents favours the formation of VBNC
cells, which may lead to underestimation of the dissemination of the pathogen in the
agricultural environment. As the level of autochthonous L. monocytogenes was too low to
2
3
4
5
R2 =0.8
Log
10re
duct
ion
of v
iabl
e ce
lls
7 7.5 8 8.5 9 9.5
Shannon index
2
3
4
5
2500 3500 4500 5500
R2 =0.6
Number of observed OTUs
Log
10re
duct
ion
of v
iabl
e ce
lls
y= 1.094x-5.18 y = 0.0008x + 0.74
108
estimate a decrease in concentrations, the strains were rendered resistant to rifampicin. They
were inoculated in the same physiological state (early stationary phase) in all microcosms.
Both strains were still detected after 63 days of incubation regardless of the conditions of the
microcosm, indicating a high potential for the persistence of L. monocytogenes in manures
and their liquid fraction after biological treatment. The inactivation rates did not depend on
the origin of the strain (manure or lagoon effluent) or of their serogroup (IIb, IVb). A similar
trend has been observed in digested sludge inoculated at 35 °C with other pathogens. Three
strains of Salmonella and three strains of E. coli underwent similar decay over an incubation
period lasting 20 days, irrespective of the origin of the strain (Smith et al., 2005). Similarly,
Garrec et al. (2005) found no difference in survival between two strains of L. monocytogenes
inoculated in sewage sludge stored at 20 °C for 70 days. However, McLaughlin et al. (2011)
observed different behaviours of three strains of L. monocytogenes belonging to three
serogroups inoculated in a soil stored at 25 °C or at 30 °C for six days, suggesting that,
depending on the type of matrix inoculated, the intrinsic characteristics of the strains may
have an effect. It is known that the persistence of pathogenic bacteria in the environment
depends on biotic and abiotic parameters and on their interaction. In our study, the properties
of the matrices appeared to mainly impact the survival of the two strains.
6.1 Effect of the matrix
Although the lagoon effluent microcosms allowed air to penetrate and the concentrations of
VS and nitrogen in these matrices were 10 times lower than in the raw manures, no clear
difference in the survival rate was observed between these two types of effluents. At 8 °C, the
survival of culturable and viable L. monocytogenes differed with the origin of the effluent
(farm 1 or farm 2) rather than between raw and treated manures. The T90 values were lower
in the effluents collected from farm 1 than in the effluents from the farm 2. Similarly, the
highest Log10 reduction was observed in effluents from farm 1, suggesting that at low
temperatures, the manure and the lagoon effluent from farm 2 were more favourable for the
survival of L. monocytogenes than the effluents from farm 1. At 20 °C, except for the T90
value observed in Manure-1, which was significantly lower than that observed in the three
other matrices, the differences in the behaviour of the strains between the effluents from the
two farms were less marked. Since the chemical and microbial parameters of the manures
were similar, there is no apparent explanation for the particular biphasic decay of cultivable
L. monocytogenes observed in Manure-1 at 20 °C.
109
The effect of the matrix on the survival of L. monocytogenes has also been investigated in
different types of matrices. Lemunier et al. (2005) and Paniel et al. (2010) observed that the
persistence of L. monocytogenes in composts depended on the degree of maturation of the
inoculated matrices. Likewise, Klein et al. (2011) reported T90 values for L. monocytogenes
(determined using the cultural method) of 11 days in stockpiled manure and 17 days in
composted manure maintained at 20 °C. Our results highlight the combined effect of the
matrix and the temperature on the survival of L. monocytogenes, which has also been
observed in soil and in manured soil inoculated with a strain of Salmonella Typhimurium
(Garcia et al., 2010). In that case, the presence of manure in the soil significantly reduced the
survival of the strain of Salmonella at 5 °C and 15 °C but not at 25 °C.
6.2 Effect of temperature
As expected, the lowest temperature increased the survival of L. monocytogenes. In addition,
storing the effluents at 8 °C increased the growth of both strains during the first week of
incubation in Manure-1 and to a lesser extent in Lagoon-2 microcosms. Previous studies have
shown that L. monocytogenes can grow at low temperatures (Bigwood et al., 2012; Zhang et
al., 2015). The effect of temperature on the persistence of pathogenic or enteric bacteria is
well known and has been reported for Salmonella, Campylobacter coli, L. monocytogenes
and E.coli in livestock waste, in manure, and in manured soil (Arrus et al., 2006; Garcia et
al., 2010; Himathongkham et al., 1999; Klein et al., 2011; Mawdsley et al., 1995; Semenov
et al., 2007; Xuan Thanh et al., 2011). In sterilised distilled water, L. monocytogenes
survived for 5 weeks at 4 °C and for 3 weeks at 20 °C (Besnard et al., 2002). Similarly, in
bovine manure-amended soil, Jiang et al. (2004) detected L. monocytogenes up to 43 days at
5°C, and up to 21 days 21°C. However, in our study, the impact of the temperature varied
with the matrix. Indeed, the difference in Log10 reduction for a given matrix after 63 days of
incubation at between 8°C and 20°C ranged from 0.4 Log10 (Lagoon-1) to 5 Log10 (Manure-
2). This is consistent with the results reported by Klein et al. (2011), who compared the
behaviour of an inoculated strain of L. monocytogenes in microcosms containing stockpiled
or composted manure. After 10 days of incubation, the Log10 reduction in composted manure
decreased by 4 at 37 °C and by 1.5 at 20 °C, and in stockpiled manure, it decreased by 3.5 at
37 °C and by 2 at 20 °C.
6.3 Effect of autochthonous flora
After the manures and lagoon effluents were acclimatised at the two temperatures for eight
days, the composition of the autochthonous flora in the manures was similar at 8 °C and 20
110
°C, but differed in the lagoon effluents. The three major OTUs (Firmicutes, Bacteroidetes
and Proteobacteria) found in the two farm effluents were also dominant in the surface crust
of swine slurry (Duan et al., 2014). Lu et al. (2014) also reported a high proportion of
Firmicutes and Bacteroidetes in pig and piglet manures, whereas in their study
Proteobacteria accounted for less than 1.5% of identified taxa. At T0, Firmicutes dominated
in manures at both temperatures and in lagoon effluents at 8 °C. This phylum was less
abundant in lagoon effluents at 20 °C in which Proteobacteria dominated. After two months
of incubation, the relative abundance of the dominant phyla in the manures and the lagoon
effluents remained relatively stable. The manures showed higher diversity than the lagoon
effluents, indicating that the biological treatment and the subsequent storage of the liquid
effluent reduced both richness and diversity. However, at T0, except for Lagoon-1 effluent
stored at 8 °C, the number of OTUs in the lagoon effluents (1,989-4,540) were still higher
than those reported by Lu et al. (2014) in pig and piglet manures (ca. 1,200-1,700 OTUs).
The behaviour of L. monocytogenes (especially the low T90 value observed in Manure-1 at
20 °C) does not appear to be influenced by the taxonomic composition of the manures and
lagoon effluent communities. Nevertheless, interestingly, the decline in the number of viable
cells of strain L111r increased with an increase in species diversity and in the number of
OTUs. This finding is in agreement with the results of a study by Vivant et al. (2013), who
reported that the survival of L. monocytogenes in soil microcosms decreased with the
diversity and abundance of bacterial communities.
6.4 Formation of VBNC in manure and lagoon effluent
The persistence of Listeria in environmental matrices (soil, whether manured or not,
compost, manure) is mainly estimated by culture methods (Hutchison et al., 2005a; Lemunier
et al., 2005; Locatelli et al., 2013; Nicholson et al., 2005; Paniel et al., 2010; Piveteau et al.,
2011; Vivant et al., 2013). Yet several studies on food products, biofilms, and water, showed
that L. monocytogenes can enter the VBNC state (Besnard et al., 2000; Besnard et al., 2002;
Gedalanga and Olson 2009 ; Gião et Keevil 2014 ; Lindback et al., 2009 ; Moreno et al.,
2012). Moreover, the presence of a VBNC indicator or of pathogenic bacteria in sludge has
been suggested by comparing the results of culture and qPCR methods (Erkan and Sanin
2013; Higgins et al., 2007; Viau and Peccia 2009; Wery et al., 2006 ; Wery et al., 2008). But
only a few studies have demonstrated the presence of indicator or pathogenic bacteria in the
VBNC state in sludge or in manured soil using PMA or RNA based techniques (Bae and
111
Wuertz, 2009 ; Fu et al., 2014; Garcia et al., 2010 ; Jiang et al., 2013). Although the use of
qPCRPMA to detect viable bacteria in sludge is limited by problems with turbid matrices
(Wagner et al., 2008), we previously demonstrated that qPCRPMA can be applied to manures
after optimisation of the conditions of exposure (Desneux et al., 2015). In the present study,
analysis of cell viability in the microcosms, conducted using PMA, showed that L.
monocytogenes entered the VBNC state in piggery effluents. VBNC cells represented 68% to
95% of viable cells after inoculation, suggesting that strains of L. monocytogenes lost their
culturability within the first hour of contact with the manures and the lagoon effluents. The
rapid appearance of VBNC cells we observed in the microcosms is in agreement with the
work of Piveteau et al. (2011), who used whole-genome microarrays to analyse transcriptome
modifications in a soil extract inoculated with a strain of L. monocytogenes. Their analysis
revealed massive transcriptional modifications within 30 minutes of incubation. In our study,
although viable bacteria decreased over time in all the microcosms, the proportion of VBNC
increased. The kinetic of appearance of VBNC cells depended on the matrices. Manures
appeared to be more favourable to a switch in L. monocytogenes cells to VBNC than lagoon
effluents within the first hours of contact whereas after 63 days of incubation, the proportion
of VBNC was similar in the two types of matrix. Furthermore, the proportion of VBNC was
higher at 20 °C than at 8 °C. This may reflect the greater ability of this psychrophilic
bacterium to survive and to maintain culturability at low temperatures. It is noteworthy that
culturability also depends on the physiological state of the inoculated bacteria. Thus, we
observed that when L. monocytogenes cells in the exponential phase were used as the
inoculum for the microcosms instead of stationary cells, the proportion of VBNC at T0
decreased by 14% (data not shown).
The comparison of quantification of viable and total L. monocytogenes cells by qPCRPMA and
qPCR clearly showed that extracellular DNA was rapidly degraded in these environments,
providing an additional source of nutrients. The rapid disappearance of DNA we observed at
20 °C is supported by data in the literature, which also showed a high recycling rate of
extracellular DNA in manure (Klein et al., 2011; Lebuhn et al., 2004).
7 Conclusion This study showed that the survival of L. monocytogenes, which was shorter at 20 °C than at
8 °C, did not depend on the serotype or on the origin of the strain. Although lagoon effluents
112
were less concentrated than manures, this did not impair the survival of L. monocytogenes.
Here, for the first time, we demonstrate the ability of L. monocytogenes to become VBNC in
manures and to persist in this state for at least two months. The high proportion of VBNC,
which increased over time and reached 99.8% of viable bacteria, confirmed that the culture
method currently used to detect pathogens in manured material results in underestimation of
the survival rate of pathogens during storage of manure. As VBNC cells can become
cultivable and regain their virulent character when conditions again become favourable
(Cappelier et al., 2007; Oliver 2010), the PMA based method appears as a promising
approach to assess the potential health risk associated with manure handling.
Funding
This work was supported by the French Agency for Food, Environmental and Occupational
Health and Safety (ANSES) and by the French Environment and Energy Management
Agency (ADEME). J. Desneux is recipient of an Irstea-Région Bretagne fellowship.
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(Godon et al., 1997; Nogva et al., 2000)
117
Table S1: T90 (expressed in days) and Log10 reduction after 63 days of two strains of L. monocytogenes in manure and lagoon effluent microcosms at 8 °C and at 20 °C
Manure-1 Manure-2 Lagoon-1 Lagoon-2 Temperature
T90
abatement‡ T90 abatement T90
abatement T90 abatement
Method strain Mean* (sd)† mean (sd) mean (sd) mean (sd) mean (sd) mean (sd) mean (sd) mean (sd)
8 °C Culture method L111r 22.2 (1.6) 3.0 (0.5) 50.3 (4.9) 1.3 (0.2) 15.4 (2.3) 3.9 (0.7) 25.8 (0.5) 2.7 (0.1)
L120r 20.1 (1.0) 4.0 (0.4) 56.7 (2.1) 1.1 (0.2) 21.4 (0.6) 3.3 (0.1) 25.5 (0.6) 2.2 (0.3)
qPCR L111r 22.1 (1.7) 3.0 (0.2) >56
0.7 (0.1) 19.1 (0.4) 2.9 (0.3) 37.2 (3.8) 1.6 (0.2)
L120r 16.4 (2.3) 3.8 (0.2) 56.7 (2.1) 1.0 (0.1) 15.1 (1.9) 2.9 (0.2) 37.0 (2.3) 1.6 (0.2)
qPCR PMA L111r 24.2 (1.7) 3.3 (0.3) >63
0.9 (0.2) 18.0 (1.5) 3.2 (0.3) 32.0 (1.5) 1.9 (0.1)
L120r 13.6 (0.4) 4.4 (0.5) 51.7 (5.7) 1.2 (0.1) 12.4 (1.4) 3.2 (0.2) 32.8 (1.4) 2.1 (0.2)
20 °C Culture
method L111r 3.7 (0.9) 5.4 (0.2) 9.2 (2.1) 6.5 (0.3) 12.0 (2.4) 4.5 (0.8) 10.3 (0.5) 5.9 (0.2)
L120r 3.4 (0.4) 5.6 (0.3) 10.5 (0.5) 5.9 (0.5) 8.5 (2.2) 3.5 (0.2) 10.8 (1.5) 6.0 (0.6)
qPCR L111r 2.5 (0.1) 4.0 (0.5) 11.9 (1.2) 3.9 (0.2) 12.9 (2.0) 2.5 (0.1) 12.9 (2.0) 4.3 (0.2)
L120r 2.4 (0.2) 4.7 (0.1) 12.3 (1.2) 4.1 (0.2) 8.5 (1.7) 2.6 (0.3) 11.5 (1.5) 4.3 (0.1)
qPCR PMA L111r 2.6 (0.2) >4.6 § 11.6 (0.6) 3.8 (0.1) 12.9 (1.3) 2.8 (0.3) 9.2 (1.2) 4.4 (0.4)
L120r 2.4 (0.2) >4.7 § 10.8 (1.5) 4.1 (0.1) 7.1 (0.7) 2.8 (0.3) 11.0 (1.3) 4.3 (0.2) * Mean of three replicates; † standard deviation; ‡ Log10 reduction of cfu or eq.cfu after 63 days of incubation; § not detected at day 63 (below the limit of detection: 5 103 eq.ufc mL-1
118
Table S2: Chemical composition of the two manures and lagoon effluents and concentrations
of total bacteria estimated by qPCRPMA at T0 and T63
Matrix Temperature
(°C)
time pH TS g/Kg
VS g/Kg
NTK gN/Kg
TAN g/L
VFA g/L
Total bacteria qPCRPMA
(Eq-genome. mL-1) Manure-1 8 T0 7.5 15.8 8.7 1.8 1.1 0.8 6.7 109
T63 7.2 11.3 5.4 2.2 0.5 0.1 2.0 109
20 T0 7.6 12.8 6.5 2.3 1.1 0.3 5.0 109
T63 7.4 19.0 9.8 2.2 1.2 0.0 4.5 109 Manure-2 8 T0 7.8 26.7 14.4 3.3 2.5 0.4 5.1 109
T63 7.7 22.1 12.0 3.2 2.1 0.0 4.4 109
20 T0 7.6 31.2 18.6 3.8 2.0 0.4 4.1 109
T63
7.3
26.7
15.0
4.0
2.0
0.1
4.5 109
Lagoon-1 8 T0 8.2 4.7 0.9 0.04 0.01 0.4 -*
T63 8.1 4.9 0.9 0.1 0.00 0.0 -
20 T0 8.0 5.4 1.1 0.0 0.00 0.0 3.3 108
T63 8.7 5.6 1.1 0.1 0.00 0.0 2.5 108 Lagoon-2 8 T0 8.4 7.3 2.0 0.2 0.05 0.0 3.9 108
T63 9.0 6.8 1.6 0.1 0.05 0.0 3.9 108
20 T0 8.4 6.7 1.6 0.1 0.08 0.0 4.9 108
T63 9.0 6.8 1.6 0.1 0.00 0.0 4.5 108 * no data
119
Table S3. Phylogenetic composition of the bacterial communities in the manure and lagoon effluent microcosms inoculated with strain L111r
Manure-1 Manure-2 Lagoon-1 Lagoon-2
Phyla 8 °C 20 °C 8 °C 20 °C 8 °C 20 °C 8 °C 20 °C
T0 T63 T0 T63 T0 T63 T0 T63 T0 T63 T0 T63 T0 T63 T0 T63
Acidobacteria 0.02 0.04 0.07 0.04 0.01 0.00 0.00 0.00 0.02 0.18 0.00 0.00 0.05 0.07 0.01 0.01 Actinobacteria 5.52 6.44 4.43 4.89 1.39 2.07 1.50 1.14 5.19 16.33 0.52 0.65 2.69 2.77 0.40 0.61 Bacteroidetes 15.99 17.34 20.24 17.23 22.59 19.26 21.78 22.96 7.05 20.29 6.19 9.47 13.90 18.57 1.78 22.04 Chlorobi 0.15 0.26 0.18 0.19 0.07 0.05 0.05 0.10 0.13 0.05 0.01 0.03 0.12 0.07 0.02 0.05 Chloroflexi 0.05 0.06 0.09 0.14 0.15 0.05 0.13 0.11 0.01 0.01 0.00 0.00 0.13 0.08 0.00 0.00 Cyanobacteria 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 2.94 0.01 0.03 0.00 0.01 0.01 0.01 0.00 Fibrobacteres 0.31 0.75 0.48 0.34 0.32 0.18 0.52 0.67 0.01 0.35 0.00 0.00 0.35 0.26 0.04 0.01 Firmicutes 39.57 48.90 43.41 49.95 56.84 66.07 57.29 54.81 72.50 23.35 10.68 24.96 45.48 32.23 10.04 14.09 Fusobacteria 0.04 0.03 0.23 0.02 0.02 0.04 0.04 0.05 0.03 0.01 0.02 0.02 0.10 0.13 0.01 0.01 GN02 0.01 0.01 0.01 0.02 0.02 0.02 0.01 0.01 0.10 0.05 0.00 0.00 0.10 0.06 0.01 0.00 GN04 0.08 0.15 0.08 0.13 0.00 0.00 0.00 0.00 0.09 0.09 0.01 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 Gemmatimonadetes 0.11 0.15 0.14 0.21 0.01 0.01 0.00 0.01 0.12 0.95 0.02 0.02 0.19 0.36 0.03 0.07 Lentisphaerae 0.14 0.12 0.24 0.29 0.07 0.13 0.10 0.07 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 Nitrospirae 0.08 0.12 0.13 0.16 0.00 0.00 0.00 0.00 0.01 0.01 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 Proteobacteria 25.94 12.34 13.86 11.98 6.40 5.05 6.33 6.89 10.51 35.81 79.69 60.07 31.18 40.01 83.00 54.09 SAR406 0.09 0.20 0.15 0.05 0.11 0.02 0.07 0.09 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 SR1 0.03 0.02 0.05 0.01 0.05 0.03 0.05 0.05 0.00 0.00 0.00 0.00 0.01 0.01 0.00 0.00 Spirochaetes 0.83 1.50 1.43 0.61 0.64 0.34 0.70 1.08 0.02 0.07 0.01 0.04 0.21 0.17 0.01 0.24 TM6 0.00 0.00 0.01 0.01 0.01 0.01 0.00 0.00 0.15 0.23 0.01 0.00 0.06 0.06 0.00 0.00 TM7 0.02 0.02 0.02 0.04 0.00 0.00 0.00 0.00 0.35 0.84 0.01 0.00 0.04 0.02 0.01 0.00 Tenericutes 2.34 2.17 4.22 1.76 2.87 0.33 2.47 2.68 0.23 0.59 1.02 2.01 1.25 1.54 2.99 3.30 WWE1 2.25 3.78 3.92 4.63 3.35 2.89 3.84 4.42 0.02 0.02 0.01 0.05 0.25 0.10 0.03 0.55 Others 6.41 5.60 6.63 7.32 5.03 3.47 5.10 4.85 0.53 0.76 1.77 2.66 3.88 3.47 1.61 4.93
120
9 Bilan Dans les conditions de l’expérience (souches inoculées dans des microcosmes constitués
de lisiers et d’effluents de lagune et maintenus à 20°C et 8°C), il ressort que le
sérogroupe et l’origine des souches n’influencent pas leur comportement. En effet, les
deux souches ont présenté des cinétiques de disparition similaires dans l’ensemble des
conditions testées, quelle que soit la méthode de dénombrement. En revanche, il existe
un effet température très marqué, démontré par l’augmentation de la persistance des
deux souches à 8°C.
Une différence de comportement a également été observée au sein d’un même type de
matrice mais celle-ci n’a pas pu être expliquée par les facteurs physico-chimiques
analysés (pH, matières en suspension, matières volatiles, azote total,NH4+, AGV),
suggérant que des facteurs biotiques tels que la diversité microbienne peuvent jouer un
rôle dans la persistance de L. monocytogenes. En effet, la viabilité de L. monocytogenes
était plus faible dans les microcosmes présentant une plus grande diversité bactérienne.
Enfin, cette étude a mis en évidence que L. monocytogenes était capable d’entrer dans
l’état VNC dans les lisiers et les effluents de lagune aussi bien à 8°C qu’à 20°C. Les
formes VBNC qui représentent 83 à 99,8% des bactéries viables après 60 jours
d’incubation, se forment dès les premières heures de contact avec l’effluent. Leur
proportion, plus élevée en début d’expérience dans les lisiers que dans les effluents de
lagune, est toutefois du même ordre de grandeur dans les deux types de matrices après
60 jours.
Au regard de ces résultats, il ne semble pas que les effluents de lagune favorisent plus la
persistance de L. monocytogenes que les lisiers. En revanche, la cinétique de formation
des VNC est plus lente dans les lagunes.
Cette étude a confirmé la capacité de survie importante de L. monocytogenes dans les
effluents d’élevages porcins, notamment aux basses températures rencontrées en hiver.
De plus, la formation de VNC observée indépendamment de la matrice et de la
température souligne la difficulté à évaluer le risque réel de dissemination de ce
pathogène dans l’environnement agricole par les méthodes culturales.
121
Chapitre 4 : Analyse transcriptomique d’une
souche de L. monocytogenes isolée de lisier,
après une inoculation dans un effluent de
lagune et un sol reconstitués
122
1 Avant-propos Les données obtenues sur le terrain (Pourcher et al., 2015 ; Boscher et al., 2014) et en
microcosme (chapitre 3) ont révélé l’aptitude de L. monocytogenes à survivre dans
l’environnement des élevages porcins (effluents, sol) et sa capacité à entrer rapidement
en état VNC dans le lisier et l’effluent de lagune. Il nous paraissait donc important
d’approfondir nos connaissances sur l’adaptation de L. monocytogenes en étudiant les
modifications de son fonctionnement induites lors de son transfert dans l’effluent de
lagune et dans sol, ce qui a été réalisé en utilisant une approche transcriptomique.
Le transcriptome représente l’ensemble des ARN (ARN messagers codant des protéines
et ARN non codants) issus de l'expression du génome de la bactérie à un temps donné et
dans une condition environnementale précise (dans notre étude, un extrait de sol et un
extrait d’effluent de lagune maintenus à 21°C). L'un des principaux mécanismes initiant
les processus adaptatifs dans une cellule bactrienne est la modification des niveaux de
transcription des gènes qui conduit à des changements dans la machinerie cellulaire. La
transcriptomique qui permet de percevoir le fonctionnement interne du génome dans
une condition physiologique donnée peut s’étudier par des approches basées sur le
séquençage d’ARN. Nous avons ainsi réalisé une analyse du génome par séquençage de
l’ARN (RNAseq) de la souche L. monocytogenes CIP 110868 isolée d’un lisier afin
d’étudier les modifications transcriptomiques mises en place lorsqu’elle est incubée
pendant 20 minutes et 24 heures dans des microcosmes constitués d’extraits stériles de
sol et d’effluent de lagune.
L’objectif de l’analyse transcriptomique était de comparer la réponse globale de L.
monocytogenes CIP110868 lors de son inoculation dans un extrait de sol et d’effluent de
lagune sans entrer dans une analyse fine de la transcription. Ce chapitre présente
uniquement les données des ARN messagers.
Nous avons sélectionné L. monocytogenes CIP110868 plutôt que la souche EGD-e
(isolée de lapins) dont le génome est séquencé et qui a fait l’objet de nombreuses études
génomiques, en raison de son origine environnementale (lisier de porcs). Il nous
paraissait en effet pertinent d’étudier une souche isolée de la station de traitement dans
laquelle ont été prélevés le sol et l’effluent de lagune utilisés pour constituer les
microcosmes.
123
2 Introduction
Listeria monocytogenes est l’agent responsable de la listériose, maladie transmise à
l'Homme par voie alimentaire. En raison du taux de mortalité élevé de la listériose, de
l’ordre de 20 à 30% (Vazquez-Boland et al., 2001), et du caractère ubiquiste de L.
monocytogenes qui lui permet de survivre dans l’environnement agricole et de persister
tout au long des étapes de la chaîne de transformation des aliments, il est nécessaire de
disposer de méthodes permettant de minimiser le risque de contamination non
seulement au sein des industries alimentaires mais aussi en amont des établissements de
transformation. La réduction du risque demande une meilleure compréhension des
mécanismes de survie mis en jeu par L. monocytogenes.
L’épandage des effluents d’élevages représente l’une des voies possibles du transfert de
L. monocytogenes vers le sol et les végétaux (Nicholson et al., 2005 ; Pourcher et al.,
2012). L. monocytogenes est en effet capable de persister plusieurs semaines aussi bien
au cours du stockage des effluents d'élevages (Hutchison et al., 2005 ; Klein et al.,
2010) que dans le sol après épandage (Jiang et al., 2004 ; Nicholson et al., 2005). Cette
persistance s’explique par les différents mécanismes d’adaptation mis en jeux par L.
monocytogenes en réponse aux stress environnementaux tels que le stress thermique
(Chang et al., 2007 ; Liu et al., 2002 ; Schhneier et Toulmay., 2007 ; Cacace et al.,
2010 ; Mattilla et al., 2011 ; Van der Veen et al., 2007 ; Xie et al., 2014), les stress
acide et alcalin (Rea et al., 2004 ; Giotis et al., 2008a, Xie et al., 2014 ; Chen et al.,
2011, Abram et al., 2008) , le stress osmotique (Bergholz et al., 2012 ; Duche et al.,
2002b ; Chan et al., 2007) ou la carence en nutriments (Herbert et Foster, 2001). La
survie de L. monocytogenes dans l’environnement implique de nombreux gènes tels des
gènes codants des protéines de surface, des protéines sécrétées, des transporteurs, des
gènes de mobilité ainsi que plusieurs régulateurs de transcription dont SigmaB, prfA et
CodY, susceptibles de jouer un rôle dans les mécanismes d’adaptation aux stress
(Bennett et al., 2007; Giotis et al., 2008; Kazmierczak et al., 2003; Milohanic et al.,
2003; Wang et al., 2014; Casey et al., 2014; Gahan et Hill., 2014; Gandhi et Chikindas.,
2007; Piveteau et al., 2011).
Les études basées sur des approches de transcriptomique différentielle sont peu
nombreuses et concernent essentiellement l’adaptation de L. monocytogenes à (i) des
matrices alimentaires à l’exemple du chou découpé (Palumbo et al., 2005), du lait UHT
124
(Liu et Ream 2008), de la viande de dinde fumée (Bae et al., 2011) et (ii) à des agents
désinfectants utilisés dans l’industrie agroalimentaire tel le chlorure de benzethonium
(BZT) (Fox et al, 2011 ; Casey et al., 2014). Seuls les travaux de Piveteau et al. (2011)
portent sur les modifications transcriptionnelles de L. monocytogenes dans une matrice
d’origine environnementale (extrait de sol).
Les données obtenues par ces études sur différentes souches (EGD-e, 6179, F6854,
F2365 ou 10403) en utilisant des biopuces à ADN (Liu et Ream, 2008 ; Fox et al.,
2011 ; Piveteau et al., 2011), la RT-PCR, ou le séquençage d'ARN à haut débit (RNA-
seq) (Casey et al., 2014) ont toutes montré que des gènes impliqués dans le transport de
différents composés étaient surexprimés. De plus, les gènes codant les protéines
générales du système phosphotransférase (PTS) sont surexprimés chez les souches 6179
en présence de BZT (Casey et al, 2014), EGD-e dans l’extrait de sol (Piveteau et al.,
2011) et F2365 sur la viande de dinde fumée (Bae et al., 2011). Une sur-régulation de
l’expression de gènes impliqués dans le métabolisme des acides aminés (Piveteau et al.,
2011 ; Liu et Ream, 2008) et de gènes liés au chimiotactisme et à la mobilité (Palumbo
et al., 2005 ; Casey et al., 2014) a également été mis en évidence.
Les résultats émanant de ces études ont montré que l’expression les gènes de virulence
n’était pas augmentée dans les conditions des expériences. Ainsi, Piveteau et al. (2011)
ont observé une stabilité ou une sous-régulation de l’expression des gènes de virulence
de la souche EGD-e incubée dans l’extrait de sol. De même Riu et al. (2008) et Casey et
al., (2014) ont noté une stabilité de l’expression des gènes de virulence des souches
F2365 et 6179 après une incubation dans du lait UHT ou après un contact avec le BZT,
respectivement. Alessandria et al. (2013) qui ont quantifié par RT-qPCR trois gènes de
virulence (iap, pclA et hly) chez sept souches de L. monocytogenes ont également
rapporté que l’expression des trois gènes chez les souches incubées dans du fromage à
basse température (4 et 12°C) était pour 5 d’entre elles plus faible que lorsqu’elles
étaient incubées en bouillon BHI à 37°C. Ces auteurs soulignent néanmoins des
différences d’expression des gènes de virulence en fonction des souches et des
conditions environnementales.
La majorité des études sur l’adaptation de L. monocytogenes et sur sa réponse au stress
ont été réalisées sur des matrices alimentaires et il n’existe pas, à notre connaissance, de
données sur les modifications du transcriptome de ce pathogène dans les effluents
125
d’élevage. Or, nos travaux ont mis en évidence la présence de L. monocytogenes non
seulement dans le lisier brut mais également dans les effluents de lagune (issus du
traitement biologique du lisier) ainsi que dans les sols situés à proximités de ces lagunes
(Pourcher et al., 2012, 2015). Par ailleurs, il ressort de notre étude sur le comportement
des formes viables de L. monocytogenes, que le pathogène entre en état VNC dès les
premières heures de contact avec l’effluent de lagune, suggérant une réponse rapide au
stress induit par cette matrice.
L’objectif de cette étude était d’acquérir via l’analyse du transcriptome par RNAseq,
des connaissances sur la réponse d’une souche de L. monocytogenes, isolée d’un lisier
de porcs (CIP 110868), après 20 minutes et 24 heures de contact avec un effluent de
lagune et un sol reconstitués.
3 Matériel et méthodes
3.1 Echantillonnage et préparation des extraits de sol et d’effluents de lagune
Le sol et l’effluent de lagune ont été prélevés dans la station 2. Le sol de type limoneux,
a été prélevé à proximité de la lagune et en surface (20 premiers centimètres). Les deux
matrices ont ensuite été stockées à 4°C avant leur préparation. Les microcosmes sont
constitués d’extraits liquides de sol et d’effluent de lagune. L’extrait de sol a été préparé
selon le protocole modifié par Piveteau et al. (2011). Brièvement, 500 g de sol ont été
transférés dans 750 mL d'eau et ont été autoclavés 1 heure à 130°C. La suspension de
sol a été centrifugée (10 000 g, 20 minutes) et le surnageant a été filtré sur du papier
Whatman3 MM. Des volumes de 30 mL de filtrat ont ensuite été répartis dans des
flacons de 100 mL et autoclavés 20 minutes à 120°C.
L’extrait d’effluent de lagune a été préparé en centrifugeant l’effluent de lagune 10
minutes à 10 000g. Le surnageant a été filtré sur du papier Whatman 3MM et sur du
papier Whatman de grade 2 (8 µm). Le filtrat a ensuite été filtré successivement sur des
membranes d’ester de cellulose de 3 µm, 1,2 µm, 0,8 µm et 0,45 µm. La filtration finale
a été obtenue à l’aide d’une unité de filtration à usage unique constituée d’une
membrane d’ester de cellulose de porosité de 0,22 µm. Des volumes de 30 mL du filtrat
ont été transférés dans des flacons de 100 mL stériles.
126
Pour chaque microsome, l’absence de germes cultivables a été vérifiée en étalant 0,25
mL sur 3 boîtes de milieu gélosé Plate count agar (PCA) incubées pendant 48 heures à
30 et 37°C.
Dans la suite du texte, nous avons nommé les extraits de sol reconstitué "extrait de sol "
et les extraits d’effluents de lagune "effluent filtré".
3.2 Condition de culture de L. monocytogenes
L. monocytogenes CIP 110868 (serogroup IVb) utilisée dans cette étude a été isolée
dans un lisier porcin. Les pré-cultures ont été réalisées dans des bouillons nutritifs
complémentés avec 0,3 % de glucose (milieu BNG), puis incubés sans agitation à 30°C
pour obtenir des cellules en phase stationnaire de croissance. Puis 150 µL de cette pré-
culture ont été inoculés dans 100 mL de milieu BNG qui a été incubé 17 heures à 37°C
(DO 0,4), afin d’obtenir des cellules en phase exponentielle de croissance.
Un volume de 40 mL a ensuite été centrifugé 5 minutes à 5 000 g. Le culot a été re-
suspendu dans 10 mL de NaCl 0,8 % puis de nouveau centrifugé 5 min à 5 000 g. Une
fois le culot remis en suspension dans 5 mL de NaCl 0,8 %, 2,5 mL de cette solution ont
été inoculés dans chaque microcosme, afin d’atteindre une concentration initiale en L.
monocytogenes d’environ 5.108 ufc/mL. Pour chaque condition, trois microcosmes
indépendants ont été inoculés. Immédiatement après l’inoculation, les microcosmes ont
été incubés sans agitation à 21°C.
3.3 Extraction et purification de l’ARN
Les extraits de sol et d’effluent de lagune ont été incubés à 21°C pendant 20 minutes
(T1) et pendant 24 heures (T2). Afin de stabiliser les ARN avant l’extraction, les
cultures bactériennes ont été traitées avec du RNAprotect (QIAGEN, Courtaboeuf,
France). Trois répliquats biologiques indépendants ont été préparés et traités
séparément. Pour chaque répliquat, 4 extractions ont été réalisées en prélevant 2mL qui
ont été centrifugés à 5 500 g pendant 5 minutes. Le culot a été ensuite été remis en
suspension dans 700 mL de tampon RLT (Qiagen RNeasy kit) supplémenté avec 1 % de
β-mercaptoéthanol puis placé dans un tube de 2 mL contenant 0,2 g de billes de verre
RNAse Free (100 µm). Les cellules ont été lysées mécaniquement à l’aide d’un broyeur
cellulaire FastPrep (MP Bio, France) avec 4 cycles de 6 m/s pendant 30 s. L'ARN total a
été isolé en utilisant le kit Qiagen RNeasy. Après un traitement DNAse I (DNAse on
127
column, U 10, Quiagen) l’élution finale a été réalisée avec 40 µL d’eau RNase free. Les
4 extractions d’un même répliquat ont ensuite été rassemblées dans un tube Eppendorf
de 1,5 mL. La totalité de l’ARN extrait a été traitée avec la RQ1 RNAse free Dnase
(Promega, Charbonniere, France) en présence de RNasin (40 U, Promega). L’ARN a été
purifié à l’aide du kit RNeasy MiniElute cleanup (Qiagen, France). La qualité et la
pureté de l’ARN ont été évaluées par une lecture au spectrophotomètre à 260 nm et par
une électrophorèse capillaire sur puce par Bioanalyzer 2100 (Agilent, France).
L’ensemble des étapes a été réalisé en suivant les instructions et les recommandations
des fabricants.
Pour la condition de référence (T0), un protocole identique a été appliqué sur une
culture pure de la souche de L. monocytogenes CIP 110868 en phase exponentielle de
croissance en milieu BNG. Les extraits d’ARN ont ensuite été conservés à -80°C.
3.4 Analyse du transcriptome par RNA total sequencing (RNAseq) et analyse des
données
La stabilisation des ARN, la déplétion des ARN 16S, 23S et 5S, la génération des
bibliothèques d’ARNm par la méthode « strand specific », la génération de cluster dans
cBot ainsi que le séquençage par l’illumina HiSeq2000 ont été réalisés par la société
Sistemas Genómicos (Valence, Espagne) selon leur protocole standard. L’obtention des
données brutes de prétraitement et leur normalisation ont également été effectuées par
Sistemas Genómicos. Trois niveaux d’analyse ont été réalisés :
- primaire : vérification et contrôle de la qualité des lectures séquencées. Le contrôle de
qualité a été effectué manuellement en utilisant le programme fastqc ;
- secondaire: lecture de la cartographie et quantification des gènes. Les reads de
séquençage ont été cartographiés contre la dernière version du génome de Listeria
monocytogenes EGD-e fourni par la base de données du NCBI
[http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_003210.1]. Les reads de mauvaises qualités
ont été enlevés en utilisant le logiciel de nettoyage Picard Tools
[http://picard.sourceforge.net]. L’identification des gènes a été réalisé en utilisant des
méthodes d'inférence bayésienne avec le logiciel Cufflinks v2.2.0, et leur niveau
d’expression a été déterminé avec le logiciel bedtools (Quinlan et Hall 2010) ;
128
- tertiaire : étude comparative entre les échantillons. La comparaison entre les
échantillons ainsi que l’étude des enrichissements fonctionnels a été réalisée selon les
protocoles standards de Sistemas Genómicos.
Pour cette étude, un gène a été considéré comme exprimé de manière différentielle si sa
valeur de « Fold change » était supérieure à 2 ou inférieure à -2 avec une p-value de
0,05. L’ensemble des gènes différentiellement exprimés a ensuite été regroupé par
catégorie fonctionnelle (Glaser et al., 2001).
3.5 Démarche analytique
L’enrichissement fonctionnel, réalisé par la société Sistemas Genomicos a permis de
classer les gènes dans six catégories fonctionnelles dont deux correspondaient à des
fonctions inconnues. Les gènes classés dans ces dernières catégories ont été retirés de
notre analyse.
Les quatre catégories fonctionnelles retenues étaient elles-mêmes subdivisées en 36
sous-catégories fonctionnelles. Pour chaque catégorie, nous avons retenu dans notre
analyse comparative, uniquement les sous-catégories représentatives dont le nombre de
gènes était suffisamment élevé. Ainsi seules les sous-catégories dont le nombre de
gènes représentait au moins 20% du nombre total de gènes de leur catégorie ont été
analysées. Nous avons vérifié que les gènes exclus de l’analyse ne correspondaient pas à
des gènes jouant un rôle majeur chez L. monocytogenes. Lorsque c’était le cas, ces
gènes ont été réintroduits dans l’analyse comparative. Par ailleurs, nous avons traité
spécifiquement les 50 gènes majeurs intervenant dans la virulence de L. monocytogenes
et les gènes des régulons sigmaB, PrfA et CodY sans s’attacher à leur représentativité
sur le plan numérique.
4 Résultats
4.1 Evolution du transcriptome de L. monocytogenes CIP 110868 dans les
deux matrices L’inoculation de la souche de L. monocytogenes en phase exponentielle de croissance
dans l’extrait de sol et dans l’effluent filtré a entraîné des modifications considérables
du transcriptome (figure 1). Chaque condition (effluent filtré, extrait de sol après 20
129
minutes et 24 heures d’incubation) a conduit à un transcriptome spécifique,
reproductible dans les 3 réplicats.
Figure 1 : Analyse en composantes principales réalisée sur le transcriptome de la souche de L. monocytogenes CIP 110868 inoculée en triplicats dans l’extrait de sol et l’effluent filtré ; T0 : condition initiale, T1 : après 20 minutes, T2 après 24 heures.
Dans l’extrait de sol, le nombre de gènes dont le taux de transcrits a évolué par rapport à
la condition initiale (Fold change > 2, P <0,05), de 1755 après 20 minutes, diminue à
1677 après 24 heures (figure 2). Il est plus faible dans l’effluent filtré pour lequel une
diminution est également observée entre les deux temps (1560 gènes après 20 minutes
et 1282 après 24 heures).
Figure 2 : Diagramme de Venn représentant le nombre de gènes de L. monocytogenes CIP 110868 ayant un taux de transcription supérieur (A) ou inférieur (B) à ceux de la condition initiale, après 20 minutes (T1) et 24 heures (T2) d’incubation dans l’extrait de sol (sol) et l’effluent filtré (lagune).
Le nombre de gènes communs aux deux matrices, compris entre 324 et 447 diminue au
cours du temps. L’incubation de la souche CIP 110868 dans l’extrait de sol conduit à un
T2 extrait de sol
T2 effluent filtré
T1 effluent filtré
T1 extrait de sol
T0 conditioninitiale
T2 lagune713
T1 lagune763
250
T1 sol978
393
T2 sol956
356
725
A
T1 lagune797
T2 lagune569
285
T1 sol777
T2 sol721
535
447 324
B
130
nombre plus élevé de gènes dont le taux de transcrits est supérieur à la condition initiale
(978 à 956 gènes) que son incubation dans l’effluent filtré (763 à 713 gènes). La
différence entre les deux matrices est moins marquée pour les gènes dont le taux de
transcrits est réduit (777 dans l’extrait de sol et 797 dans l’effluent filtré) après 20
minutes d’incubation. Toutefois, alors que le nombre de gènes dont le taux de transcrits
est réduit reste relativement stable dans l’extrait de sol, il diminue nettement dans
l’effluent filtré.
4.2 Gènes dont les taux de transcrits sont significativement différents dans les
catégories fonctionnelles
Les gènes dont le taux de transcrits est augmenté ou diminué au moins deux fois par
rapport à la condition initiale ont été analysés par enrichissement fonctionnel.
Après cette analyse, le nombre de gènes différentiellement exprimés par rapport à la
condition initiale entrant dans une catégorie fonctionnelle varie selon les conditions de
47 à 674 (figure 3). Ainsi, après 20 minutes d’incubation, très peu de gènes sont
différentiellement exprimés dans l’extrait de sol alors que leur nombre augmente
significativement après 24 heures. Dans l’effluent filtré, le nombre de gènes sur ou
sous-exprimés diminue légèrement entre les deux temps.
Figure 3 : Diagramme de Venn représentant le nombre de gènes de L. monocytogenes CIP 110868, après enrichissement fonctionnel, ayant un taux de transcription supérieur (A) ou inférieur (B) à ceux de la condition initiale, après 20 minutes (T1) et 24 heures (T2) d’incubation dans l’extrait de sol (sol) et l’effluent filtré (lagune).
T1 lagune445 T2 lagune
277
T2 sol375
T1 sol57
15 138
22
131
B
T1 lagune280
T2 lagune26385
T1 sol24
T2 sol614
15
8 18
A
131
L’enrichissement fonctionnel a permis de classer par ontologie les gènes dans 6 catégories fonctionnelles dont quatre correspondent à une gamme de fonctions connues (figure 4). La liste des gènes présents pour chaque condition et chaque catégorie est détaillée dans
les tableaux supplémentaires S1 et S2 présentés en annexe 2.
Dans l’extrait de sol, le nombre de gènes dont le taux de transcrits augmente ou diminue
est systématiquement plus élevé, et de façon très marquée, après 24 heures. Dans
l’effluent filtré, le nombre de gènes dont le taux de transcrits est inférieur diminue entre
les deux temps et le nombre de gènes dont le taux de transcrits est supérieur augmente
pour 3 catégories fonctionnelles. Il est à noter que dans cette matrice, les différences
observées entre les deux temps sont peu marquées.
Figure 4 : Répartition par catégorie fonctionnelle des gènes de L. monocytogenes dont le taux de transcrit a augmenté (A) ou diminué (B) après 20 minutes (T1) et 24 heures (T2) d’incubation dans les microcosmes.
Il est important de souligner qu’une fraction non négligeable (10 à 61 % selon les
conditions) des gènes dont le taux de transcrits a diminué ou augmenté appartiennent à
la catégorie "similaire à des protéines inconnues " ou "sans similarité ".
A pas de similarité
similaire à des protéines de fonctions inconnues
autres fonctions
voies métaboliques
Métabolisme
processus cellulaires et composition de l’enveloppe
T1 lagune T2 lagune T1sol T2 sol
B pas de similarité
similaire à des protéines de fonctions inconnues
autres fonctions
voies métaboliques
Métabolisme
processus cellulaires et composition de l’enveloppe
0 50 100 150 200 0 50 100 150 200nb gènes nb gènes
132
4.3 Analyse des gènes par sous-catégorie fonctionnelle
Huit sous-catégories fonctionnelles ont été retenues pour l’analyse comparative du
transcriptome de L. monocytogenes CIP110868 (figure 5). Cinq d’entre-elles regroupent
des gènes dont le taux de transcrits est à la fois diminué et augmenté : " transport et
fixation de protéines", "voies métaboliques spécifiques", "régulation de la synthèse
d’ARN", "phages et fonctions associées" et "adaptation aux conditions atypiques". Deux
et trois sous-catégories regroupent respectivement des gènes dont le taux de transcrits
est augmenté ("paroi cellulaire", "protéine de surface" et "métabolisme des acides
aminés") ou est diminué ("transfert d’électrons" et "régulation de la synthèse de
protéines").
Figure 5 : Nombre de gènes de sous-catégories fonctionnelles dont le taux de transcrits est augmenté (A) et diminué (B) par rapport à la condition initiale.
4.3.1 Sous-catégories fonctionnelles ayant des gènes dont les taux de transcrits ont
augmenté ou diminué
4.3.1.1 Sous-catégorie "protéines de transport et de liaison"
Les gènes de cette sous-catégorie sont représentés dans les quatre conditions
expérimentales (les deux matrices aux deux temps). Après 20 minutes d’incubation, 8 et
3 gènes dans l’extrait de sol, et 20 et 26 gènes dans l’effluent filtré, ont des taux de
transcrits augmentés et diminués, respectivement. Après 24 heures d’incubation, 39 et
37 gènes dans l’extrait de sol, et 34 et 13 gènes dans l’effluent filtré ont des taux de
transcrits augmentés et diminués, respectivement.
Les gènes dont le taux de transcrits est augmenté codent principalement des
transporteurs de sucres, des "phosphotransferase system" (PTS) pour le transport du
0 10 20 30 40 50
paroi cellulaire
transport/fixation des protéines
protéines de surface
voies métaboliques spécifiques
métabolisme des acides aminés
régulation de la synthèse d’ARN
phages et fonctions associées
adaptation aux conditions atypiques
0 10 20 30 40 50
transport/fixation des protéines
transfert d’électrons
voies métaboliques spécifiques
régulation de la synthèse d’ARN
régulation de la synthèse des protéines
phages et fonctions associées
adaptation aux conditions atypiques
T1 effluent T2 effluent T1 sol T2 solnb gènes nb gènes
A B
133
cellobiose, du mannose, du fructose et du galacticol. Ils codent des transporteurs de type
ABC dont certains sont associés au transport du maltose et de la maltodextrine, du
molybdate, du zinc et de la glycine/betaine/canitine/ choline. De plus, deux gènes sont
impliqués dans la résistance aux antibiotiques dont la tétracycline.
Les gènes dont le taux de transcrits est diminué, comprennent des transporteurs de
sucres, des PTS pour le transport du glucitol et du galacticol, des transporteurs ABC
pour les acides aminés. Ils comprennent aussi des gènes impliqués dans la résistance
aux antibiotiques (dont la daunorubicine, antibiotique de la famille des anthracyclines).
4.3.1.2 Sous-catégorie " voies métaboliques spécifiques"
Les gènes de cette sous-catégorie sont représentés dans les 4 conditions. Dans l’effluent
filtré, les taux de transcrits de 31 et 46 gènes sont augmentés et ceux de 46 et 20 gènes
sont diminués après 20 minutes et 24 heures, respectivement. Dans l’extrait de sol, les
gènes exprimés différentiellement sont très peu représentés (≤ 3 gènes) après 20 minutes
mais leur nombre augmente considérablement au cours de l’incubation pour atteindre 51
(taux de transcrits augmentés) et 43 (taux de transcrits diminués). Les gènes dont les
taux de transcrits est augmenté comprennent des gènes codant des oxydoréductases, des
chitinases, des protéines similaires à des α ou β-glucosidases et des enzymes impliquées
dans le catabolisme de sucres à l’exemple de la maltose ou de la cellobiose
phosphorylase. Les gènes dont les taux de transcrits sont diminués codent des
glucanases, des peptidases. Ils comprennent également des gènes impliqués dans la
dégradation du glucose et du mannose.
4.3.1.3 Sous-catégorie "régulation de la synthèse d’ARN"
Les gènes de cette sous-catégorie sont différentiellement exprimés dans trois conditions.
En effet, ils ne sont retrouvés dans l’extrait de sol qu’après 24 heures (33 et 15 gènes
ont alors des taux de transcrits augmenté et diminué, respectivement). Dans l’effluent
filtré, 15 et 16 gènes ont des taux de transcrits augmenté après 20 minutes et 24 heures
et 11 et 7 ont des taux de transcrits diminués après 20 minutes et 24 heures,
respectivement.
Parmi les régulateurs transcriptionnels dont le taux de transcrits est augmenté, LytR,
répresseur pour le xylose, AbrB, régulateur impliqué dans les réseaux de régulation
134
régissant l’expression de la phase stationnaire de B. subtilis, et CtsR qui régule les gènes
impliqués dans le stress des températures élevées sont retrouvés dans les deux matrices.
Le taux de transcrits du gène lmo2460, similaire au régulateur transcriptionnel CggR de
Bacillus subtilis, intervenant dans la régulation catabolique de gènes et d’opérons
spécifiques du métabolisme central du carbone, est diminué dans les trois conditions.
Les gènes lmo0659, similaire au gène Rgg codant des régulateurs transcriptionnels
impliqués dans la réponse au stress, et lmo0459, similaire à VirR de S. pyogenes, ont
des taux de transcrits diminués dans l’effluent filtré après 20 minutes.
4.3.1.4 Sous-catégorie " fonction liée à un phage"
L’augmentation du taux de transcrit des gènes de cette sous-catégorie n’apparaît
qu’après 24 heures (14 gènes dans l’effluent filtré et 33 dans l’extrait de sol). Douze
gènes ont des taux de transcrits diminués après 20 minutes dans l’effluent filtré. Après
24 heures, le nombre de gènes dont le taux de transcrit est diminué est de 3 dans
l’effluent filtré et de 6 dans l’extrait de sol. Ils sont similaires aux protéines du
bactériophage A118.
4.3.1.5 Sous-catégorie "adaptation aux conditions atypiques"
Ces gènes sont différentiellement exprimés uniquement après 20 minutes dans les deux
matrices. Un gène dans l’extrait de sol et 6 gènes dans l’effluent filtré ont des taux de
transcrits augmenté. Quatre gènes dans l’extrait de sol et 7 gènes dans l’effluent filtré
ont des taux de transcrits diminués. Ils permettent une adaptation et une réponse à
différents stress, notamment des stress thermiques, ainsi que la régulation positive ou
négative du facteur sigmaB.
4.4 Sous-catégories fonctionnelles ayant des gènes dont les transcrits ont augmenté
Trois sous-catégories fonctionnelles regroupent des gènes dont les taux de transcrits
sont augmentés par rapport à la condition initiale : "paroi cellulaire ", "protéines de
surface" et "métabolisme des acides aminés ".
4.4.1 Sous-catégorie " paroi cellulaire"
Alors que le nombre de gènes de cette sous-catégorie reste stable dans l’effluent filtré
(21 à 22 gènes), il augmente dans l’extrait de sol, passant de 2 gènes après 20 minutes à
135
22 gènes après 24 heures. Ces gènes comprennent notamment 7 gènes de l’opéron
comG, retrouvés dans l’effluent filtré aux deux temps, des gènes codant les protéines
fixatrices de pénicilline ainsi que les gènes permettant la biosynthèse du peptidoglycane
(murZ, lmo2812, lom1084, tagB).
4.4.2 Sous-catégorie "protéines de surface "
L’augmentation des taux de transcrits des gènes de cette sous-catégorie n’apparaît
qu’après 24 heures dans les deux matrices (16 dans l’effluent filtré et 43 dans l’extrait
de sol). La plupart de ces gènes permettent la sécrétion de "peptidoglycan bound
protein" à motif LPXTG (lmo0435, lmo0159, lmo1799), des adhésines (lmo0627,
lmo2714) ou des internalines (lmo1666, inlA, inlB, inlH, inlG, inlE, lmo0514).
4.4.3 Sous-catégorie "métabolisme des acides aminés "
Le nombre de gènes de cette sous-catégorie augmente au cours du temps. Il est de 18 et
27 dans l’effluent filtré, et de 8 et 16 dans l’extrait de sol après 20 minutes et 24 heures,
respectivement. Ces gènes sont impliqués notamment dans la synthèse de l’arginine
(argG,) la méthionine (metK), l’alanine (dal), la proline (proB), la glycine (glyA, gcvT),
le tryptophane (trpB), la thréonine (thrC, ilvA), l’histidine (HisJ, HisH, HisE, HisL), et
le glutamate (SerC).
4.4.4 Analyse des catégories fonctionnelles ayant des gènes dont les taux de transcrits
sont diminués
Deux sous-catégories fonctionnelles regroupent des gènes dont les taux de transcrits
sont diminués par rapport à la condition initiale : "transfert d’électrons" et "régulation
de la synthèse de protéines".
4.4.5 Sous-catégorie "transfert d’électrons"
Cette sous-catégorie est représentée par 16 gènes retrouvés uniquement dans l’effluent
filtré dont 5 sont communs aux deux temps. Leur nombre diminue de moitié après 24
heures. Ils correspondent essentiellement à des gènes codant des cytochromes D-
ubiquinol oxydases, des déshydrogénases, des ferrédoxines, des nitroflavines rédutases
et des thiorédoxines.
136
4.4.6 Sous-catégorie " régulation de la synthèse de protéines"
Les taux de transcrits des 16 gènes dans l’effluent filtré et de 15 gènes dans l’extrait de
sol sont diminués uniquement après 20 minutes. Les gènes rplL, rpsU et rpmF,
communs aux deux matrices, sont impliqués dans la synthèse de protéines ribosomales.
Les autres gènes de cette sous-catégorie sont aussi impliqués dans la synthèse de
protéines ribosomales ainsi que dans la formation de l’aminoacyl ARNt synthase.
4.5 Principaux déterminants de la virulence et gènes des régulons SigmaB, PrfA
et CodY
Une attention particulière est portée sur la régulation des gènes de virulence ainsi que
sur les régulateurs SigmaB, PrfA et CodY qui sont impliqués dans la régulation de la
transcription de gènes en réponse à des changements environnementaux. L’évolution de
leur taux de transcrit est présentée sur la figure 6.
Figure 6 : nombre de gènes impliqués dans la virulence et nombre de gènes des régulons SigmaB, PrfA et CodY dont le taux de transcrits est augmenté (A) et diminué (B) par rapport à la condition initiale.
4.5.1 Déterminants de la virulence
Parmi les 50 gènes reconnus pour être impliqués dans la virulence de L. monocytogenes,
10 ont des taux de transcrits augmentés dans l’effluent filtré et 21 dans l’extrait de sol
après 20 minutes. Après 24 heures d’incubation, leur nombre double dans l’effluent
filtré et reste stable dans l’extrait de sol. Onze gènes dans l’effluent filtré et 14 gènes
dans l’extrait de sol ont des taux de transcrits diminués après 20 minutes. Leur nombre
0 20 40 60 80
CodY
prfA
SigmaB
dét. de la virulence
T1 effluent T2 effluent T1 sol T2 sol
0 20 40 60 80 100
CodY
prfA
SigmaB
dét. de lavirulence
nb gènes nb gènes
A B
137
diminue au cours de l’incubation pour atteindre 5 dans l’effluent filtré et 10 dans
l’extrait de sol après 24 heures.
Il convient de souligner que parmi les gènes dont le taux de transcrits est augmenté,
seuls ceux retrouvés dans l’extrait de sol présentent un taux de transcription
particulièrement élevé. Ainsi, les fold changes des gènes lmo2027, lmo0171, lmo0801,
lmo2177 et inlG sont compris entre 115 et 799. De plus, le taux de transcrit du gène
prfA, activateur de la transcription de la majorité des gènes de virulence de L.
monocytogenes, qui est diminué dans l’effluent filtré après 24 heures, est en revanche
augmenté dans l’extrait de sol, suggérant un effet matrice sur la régulation des gènes de
virulence.
Les régulateurs SigmaB, PrfA et CodY sont impliqués dans la régulation de la
transcription de gènes en réponse à des changements environnementaux. Il est donc
important de connaître l’impact des deux matrices sur leur expression.
4.5.2 Régulon SigmaB
Les gènes dont le taux de transcrits est diminué ou augmenté sont principalement
impliqués dans la constitution de la paroi, le transport de protéines ainsi que dans des
voies métaboliques spécifiques. L’incubation de la souche dans les deux matrices
conduit dès les 20 premières minutes à une augmentation des taux de transcrits d’un
nombre de gènes deux fois plus important dans l’effluent filtré (97) que dans l’extrait de
sol (52). Après 24 heures, ce nombre diminue à 82 dans l’effluent filtré mais reste
supérieur à celui observé dans l’extrait de sol (68 gènes). Inversement, le nombre de
gènes dont le taux de transcrits est diminué est plus faible dans l’effluent filtré (55 après
20 minutes et 38 à 24 heures) que dans l’extrait de sol (76 après 20 minutes et 75 après
24 heures).
4.5.3 Régulon PrfA
La majorité des gènes dont le taux de transcrits est diminué ou augmenté sont similaires
à des protéines inconnues ou "sans similarité". Le nombre de gènes dont le taux de
transcrits est augmenté est du même ordre de grandeur dans les deux matrices (19 dans
l’effluent filtré, 15 dans l’extrait de sol) après 20 minutes. Il double au cours des 24
heures d’incubation. Le nombre de gènes dont le taux de transcrits est diminué est plus
138
faible dans l’effluent filtré (24) que dans l’extrait de sol (39). Il diminue à 16 et 26
gènes, respectivement après 24 heures.
4.5.4 Régulon CodY
Ces gènes interviennent dans le métabolisme intermédiaire de L. monocytogenes. Le
nombre de gènes dont le taux de transcrits est augmenté reste stable dans l’effluent filtré
(35) alors qu’il augmente au cours du temps dans l’extrait de sol (20 après 20 minutes et
34 après 24 heures). Le nombre de gènes dont le taux de transcrits est diminué est du
même ordre de grandeur dans les deux matrices après 20 minutes (26 dans l’effluent
filtré et 24 dans l’extrait de sol). Toutefois, après 24 heures, il diminue dans l’effluent
filtré (16 gènes) et augmente considérablement dans l’extrait de sol (64 gènes).
3.1 Discussion
L’épandage des effluents d’élevages porcins sur les sols participent à la dissémination
de L. monocytogenes dans l’environnement conduisant à une possible contamination des
végétaux. Alors que plusieurs auteurs ont étudié le génome de L. monocytogenes dans
des matrices alimentaires, les données sur l’adaptation de L. monocytogenes dans les
sols et les effluents d’élevages sont rares. Notre étude avait pour objectif de mieux
comprendre l’adaptation d’une souche isolée d’un lisier lors de son transfert dans un
d’effluent de lagune et dans un sol. Nous avons ainsi comparé le transcriptome de cette
souche dans chacune des deux matrices.
L’analyse en composantes principales a montré que la réponse de la souche diffère
selon la matrice, et qu’elle évolue au cours du temps. Les modifications génomiques de
L. monocytogenes apparaissent rapidement avec 1700 à 2867 gènes différentiellement
exprimés quelle que soit la matrice dès les 20 premières minutes, ce nombre restant
stable après 24 heures. Cette adaptation rapide a également été mise en évidence par
Piveteau et al. (2011) sur la souche EGD-e inoculée dans un extrait de sol dans lequel le
nombre de gènes différentiellement exprimés était de 1237 et 1883 après 15 et 30
minutes d’incubation, respectivement.
Le nombre de gènes différentiellement exprimés communs aux deux temps était plus
faible pour l’effluent filtré (18 à 24%) que pour l’extrait de sol (30 à 33%), suggérant
que l’adaptation de la souche dans l’effluent de lagune requiert une régulation plus
complexe.
139
Lorsqu’elle est inoculée dans l’extrait de sol et l’effluent filtré, la souche CIP 110868
est capable d’induire des gènes impliqués dans les systèmes de transport et de fixation
des protéines/molécules. En effet, pour toutes les conditions, l’accès aux sucres est
possible grâce à l’augmentation du taux de transcrits de gènes codant les systèmes PTS.
Les gènes de 6 familles du système PTS (PTS Glc, PTS Man, PTS Lac, PTS Fru, PTS
Gut et PTS Asc) ont des taux de transcrits augmentés. Des transporteurs de type ABC
sont aussi des taux de transcrits augmentés et sont notamment impliqués dans
l’absorption de certains sucres (maltose, maltodextrine, cellobiose), des peptides
(spermidine, putrecine, oligopeptide) et du phosphate. De plus, les taux de transcrits des
gènes codant des β-glucosidases et des chitinases sont augmentés. La souche semble
privilégier l’utilisation du mannose et du cellobiose, carbohydrates susceptibles d’être
retrouvés dans les sols (Nacro et al., 2004 Schellenberger et al., 2011), comme l’indique
l’augmentation du taux de transcrit des gènes codant les enzymes impliquées dans le
transport de ces substrats.
Il est intéressant de noter qu’après 24 heures d’incubation, il est observé une sous-
régulation des gènes codant les enzymes impliquées dans le transport et l’absorption
d’acides aminés alors que dans le même temps, les gènes codant les enzymes
impliquées dans les chaînes de biosynthèse de 9 acides aminés sont surexprimés. Cela
pourrait signifier un épuisement du milieu en acides aminés disponibles qui conduirait à
une synthèse des acides aminés par la bactérie. En accord avec les données observées
avec la souche EGD-e par Piveteau et al. (2011), L. monocytogenes CIP 110868, en
présence de faibles teneurs en éléments nutritifs, met en place des systèmes pour
accéder à différent substrats. Comme dans l’étude de Piveteau et al. (2011), la
surexpression des gènes du régulon codY qui permet d’intégrer l’énergie et modifie
l’état physiologique de la cellule en réponse à un changement environnemental, indique
que L. monocytogenes CIP 110868 est soumise à un stress nutritionnel qui entraîne une
perte d’énergie (Bennett et al., 2007). Ceci pourrait expliquer que l’absence de
croissance que nous avons observée après l’inoculation des deux souches de L.
monocytogenes dans les effluents de lagune maintenus à 20°C.
Dans toutes les conditions, le taux de transcrits du gène lmo0168 est augmenté. Ce gène
code une protéine, similaire à AbrB, qui est impliquée lors de l'état de transition entre la
croissance végétative et le début de la phase stationnaire et la sporulation chez Bacillus
subtilis (Zuber et Losick, 1987).
140
Le régulon sigmaB contrôle et régule 216 gènes impliqués dans les processus infectieux
et l’adaptation à de nouveaux environnements (Guariglia-Oropeza et al., 2014 ; O'Byrne
et Karatzas, 2008). Hain et al. (2008) ont observé que 111 gènes du régulon SigmaB
étaient sous-exprimés lors du passage en phase stationnaire. Dans notre étude, le
nombre de gènes communs à ceux décrits par Hain et al. (2008) dont le taux de transcrit
était inférieur à la condition initiale, a augmenté de 4 (après 20 minutes) à 22 (après 24
heures), indiquant une entrée en phase stationnaire de la souche.
Dans toutes les conditions, plus de la moitié des gènes de SigmaB ont des taux de
transcrits qui ont diminué ou augmenté. Or, la régulation des gènes de ce régulon est
primordiale lors de changement de conditions environnementales et pour l’adaptation à
des nombreux stress (acide, choc thermique, osmotique, oxydatif, alcoolique…) (Becker
et al., 2000 ; Chaturongakul et al., 2008 ; Ferreira et al., 2001 ; van der Veen et al.,
2010 ; Wiedmann et al., 1998). Les changements importants des taux de transcription
des gènes sous le contrôle de SigmaB, observés dans l’extrait de sol et l’effluent filtré,
confirment le rôle central de ce régulateur mis en évidence par différentes études
(Chaturongakul, et al., 2008 ; Hu et al., 2007 ; Lee et al., 2014 ; Oliver et al., 2009) et
son importance dans l’adaptation de L. monocytogenes lorsqu’elle est en contact avec
l’effluent de lagune et le sol.
Les taux de transcrits de certains régulateurs sont spécifiquement augmentés dans
l’effluent filtré ou dans l’extrait de sol. Ainsi dans l’effluent filtré, il a été observé une
augmentation des taux de transcrits du gène lmo0443 qui code une protéine LytR
régulant l’autolyse des cellules et des gènes lmo0178 et lmo0032 qui répriment
l’utilisation de xylose. Plusieurs gènes ont des taux de transcrits augmentés uniquement
dans l’extrait de sol à l’exemple du gène lmo0816 qui code une protéine régulatrice
impliquée dans production d'enzymes de dégradation (Forouhar et al., 2005), du gène
lmo0659, régulateur transcriptionnel de type Rgg qui intervient dans la régulation de la
glycolsyltransferase et du gène lmo2731, régulateur transcriptionnel de type RpiR, qui
intervient dans le catabolisme des riboses (Sorensen et HoveJensen, 1996 ; Sulavik, et
al., 1992).
Dans les deux matrices, il a été observé une diminution du taux de transcrit du gène
lmo0192 similaire au gène PurR qui code un répresseur transcriptionnel du type HTH
intervenant dans la synthèse d’enzymes impliquées dans la biosynthèse des purines
(Meng et al., 1990). Après 24 heures dans l’extrait de sol, le taux de transcrit du gène
141
PyrR qui permet de contrôle la répression de la synthèse de pyrimidine (Hobl et Mack.,
2007), est également diminué.
L. monocytogenes peut ainsi réguler la production de bases purines et pyrimidines dans
les deux matrices. Les gènes de la catégorie fonctionnelle "régulation et synthèse de
protéines ", impliqués dans la synthèse des ribosomes (famille Rpl) ont aussi des taux de
transcrits plus faibles. D’autres gènes impliqués dans l’initiation, l’élongation et la
terminaison de la traduction ont des taux de transcrits diminués uniquement dans
l’effluent filtré. L’ensemble de ces modifications conduit à une diminution de la
synthèse de protéines de L. monocytogenes dans l’effluent filtré et dans l’extrait de sol.
Dès les premières minutes de contact avec les deux matrices, il a été observé une
augmentation du taux de transcrits des gènes CspB, CsPL et lmo0609 impliqués dans la
production de « cold shock proteins ». Cette modification peut s’expliquer par la
différence de température entre le bouillon dans laquelle la bactérie a été cultivée
(30°C) et la température des microcosmes (21°C). L’augmentation du taux de transcrits
des gènes ctc, codant une protéine exprimée en réponse à un stress osmotique, et des
taux de transcrits des transporteurs de type ABC pour la carnitine, la glycine et la
bétaïne (lmo1422 et GubA) n’ont été observés que dans l’extrait de sol. Or ces solutés
jouent un rôle important dans l’osmoprotection de L. monocytogenes (Duche et al.,
2002 ; Gardan et al., 2003). De plus, trois systèmes PTS (lmo 0442, lmo0443, lmo0444),
impliqués dans le transport de sucres avaient des taux de transcrits augmentés
uniquement dans l’extrait de sol. Liu et al. (2013) ont démontré que ces gènes étaient
spécifiquement surexprimés en réponse à un stress osmotique. Ces données suggèrent
que L. monocytogenes subit un stress osmotique plus important dans l’extrait de sol que
dans l’effluent filtré.
Les gènes lmo2845, lmo2818, lmo0872 codant des transporteurs « multidrug resistance
» (MDR transporter) (Kaplan Zeevi et al., 2013), qui confèrent à L. monocytogenes une
protection contre les xénobiotiques ont des taux de transcrits supérieurs à ceux de la
condition initiale dans les deux matrices. Les taux de transcrits des gènes intervenant
dans la détoxification de la cellule vis-à-vis de certains composés toxiques ne sont
augmentés que lorsque la souche est incubée dans l’effluent filtré à l’exemple du gène
lmo0839, permettant une résistance à la tétracycline et des gènes lmo1852 et CadA
permettant une résistance au cuivre/mercure et au cadmium, respectivement (Corbett et
al., 2011 ; Lebrun et al ; 1994 ; Steele et Opella, 1997). L’augmentation spécifique à
142
l’effluent filtré du taux de transcrits du gène lmo1852 pourrait s’expliquer par la
présence de cuivre dans l’effluent de lagune. En effet, les analyses chimiques réalisées
pendant une année sur l’effluent de lagune de la station 2 indiquent une teneur moyenne
en cuivre de 1,2 mg/L.
Les 7 gènes du locus ComG, aussi appelé système FPE (ComGA-ComGG), ont des taux
de transcrits augmentés uniquement dans l’effluent filtré. Dans la mesure où le système
FPE permet de rendre la bactérie compétente et assure le transport transmembranaire de
l’ADN (Desvaux et Hebraud, 2006 ; Dubnau, 1997), L. monocytogenes pourrait
acquérir de l’ADN exogène plus facilement dans l’effluent de lagune que lorsqu’elle est
en contact avec le sol. L’effluent de lagune peut donc représenter un environnement
favorable aux recombinaisons génétiques de L. monocytogenes (Buchrieser et al., 2003).
L’induction et la répression des gènes de phage ou de prophage observée chez la souche
CIP 110868 a déjà été rapportée chez L. monocytogenes et chez d’autres espèces
bactériennes lors de changements environnementaux (Casey et al., 2014 ; Weinrick et
al., 2004). Toutefois, le rôle de ces modifications reste inconnu (Casey et al., 2014).
Dans notre étude, la majorité des gènes de la sous-catégorie « fonction liée à un phage »
dont les taux de transcrits sont diminués ou augmentés, correspondent aux gènes du
phage A118. Les caractéristiques du génome de ce phage (circulaire, permuté),
permettraient d'effectuer la transduction d’ADN grâce à différentes enzymes par un
mécanisme "headful". En conséquence, des gènes codant des facteurs de virulence et les
gènes impliqués dans la résistance aux des toxines et la résistance aux antibiotiques
pourraient être transférées à d’autres bactéries (Klumpp et Loessner, 2013).
Contrairement aux observations de Piveteau et al. (2011) sur la souche EGD-e incubée
dans de l’extrait de sol, dans notre étude, après 24 heures d’incubation, les gènes
associés à la virulence et les gènes codant des internalines et des protéines de surface
impliquées dans les processus de virulence de L. monocytogenes ont des taux de
transcrits supérieurs à ceux de la condition initiale. Leur nombre a augmenté au cours
du temps tandis que le nombre de gènes dont les taux de transcrits étaient inférieurs a
diminué.
De plus, les taux de transcrits de la majorité des gènes sous le contrôle du régulateur
transcriptionnel prfA, qui régule 73 gènes impliqués dans les processus infectieux (de
las Heras et al., 2011 ; Milohanic et al., 2003 ; Renzoni et al., 1997), qui ont diminué
dans les deux matrices après 20 minutes, ont augmenté après 24 heures. Plusieurs
143
auteurs ont montré que la régulation des gènes associés à prfA était provoquée par des
stimuli environnementaux (changement de température, présence de cellobiose)
(Leimeisterwachter et al., 1992 ; Mengaud et al., 1991 ; Park et Kroll., 1993).
Récemment, Vasanthakrishnan et al. (2015) ont observé en utilisant des mutants « prfA
ON » que la survie des souches inoculées dans un sol stérile diminuait lorsque celles-ci
exprimaient de façon constitutive la virulence. Becavin et al. (2014) ont également
montré que l’expression constitutive de gènes de virulence régulés par prfA ne paraît
pas donner un avantage significatif à la souche EGD-e au cours de l'infection in vivo.
L’expression des gènes de virulence aurait donc un coût pour la cellule et la régulation
de prfA permettrait de limiter ce coût (Vasanthakrishnan et al., 2015). Il a été suggéré
que si l’expression de la virulence par la bactérie est excessive, la mort de l’hôte
interviendrait trop rapidement et la dissémination du germe serait moins efficace
(Anderson et May, 1981 ; Bull et Lauring, 2014 ; Vasanthakrishnan et al., 2015). La
bactérie pathogène doit donc trouver un compromis entre la virulence et sa
dissémination (Vasanthakrishnan et al., 2015). Plusieurs auteurs ont mis en évidence
que les gènes sous le contrôle de prfA sont faiblement exprimés en dehors de l’hôte
(Chatterjee et al., 2006 ; Joseph et al., 2006 ; Toledo-Arana, et al., 2009). Or, dans notre
étude, après 24 heures, près de 50 % des gènes impliqués dans la virulence et sous le
contrôle de prfA ont des taux de transcrits augmentés.
Il convient de souligner que Piveteau et al. (2011) ont étudié la souche EGD-e, de
sérotype 1/2a, alors que la souche CIP 110868 que nous avons inoculée est de
sérogroupe IVb, ce qui pourrait expliquer les différences observées dans l’expression de
la virulence. Ainsi, Sokolovic, et al. (1996) ont montré, in vivo des différences dans la
régulation des gènes contrôlés par prfA entre L. monocytogenes EGD-e et d’autres
souches de L. monocytogenes de sérotype 4b. Severino et al. (2007) ont aussi observé
que l’expression des gènes liés à la virulence différait selon le séroytype de souches
(1/2a et 4b). De même, Becavin et al. (2014) ont observé in vitro la différence
d’expression des gènes impliqués dans la virulence de souches appartenant à des
sérotypes différents. Alessandria et al. (2013) ont comparé l’expression de quatre gènes
de virulence (sigB, iap, plcA et hly) chez 7 souches de L. monocytogenes cultivées en
bouillon BHI à 37°C et dans du fromage à 12°C. Ils ont montré que l’expression des
gènes de virulence était influencée par les conditions environnementales (température,
144
type de matrice) et différaient selon les souches, suggérant que les interactions avec
l'environnement dépendent des souches.
En conclusion, bien que les profils d’expression des gènes diffèrent entre l’extrait de sol
et l’effluent filtré, les mécanismes d’adaptation sont en revanche très proches.
L’adaptation de la souche CIP 110868 se traduit par l’activation (i) de gènes impliqués
dans le transport de protéines et de molécules variées et (ii) de gènes codant des
enzymes impliquées dans l’assimilation des sucres et la production d’énergie. Le taux
de transcrits des gènes de virulence et des gènes impliqués dans leur régulation a
augmenté au cours de l’incubation, signifiant que dans l’effluent de lagune et le sol, L.
monocytogenes augmente sa virulence, ce qui aurait pour conséquence de limiter sa
survie. La régulation des gènes contrôlés par SigmaB lui permet de s’adapter à la
température de 20°C et la régulation des systèmes de détoxification la protège des
composés xénobiotiques, et notamment d’antibiotiques, susceptibles d’être présents
dans les effluents d’élevages porcins. Le transfert d’ADN semble possible lorsque L.
monocytogenes se retrouve dans l’effluent de lagune par l’augmentation du taux de
transcrits des gènes du locus comG.
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5 Tableaux supplémentaires Les tableaux supplémentaires de ce chapitre sont fournis par voie électronique aux membres du jury.
150
Conclusion et perspectives
151
Listeria monocytogenes a été impliquée dans plusieurs épidémies d'origine alimentaire
associées à la consommation de viandes, de produits laitiers et de végétaux (Porto-Fett
et al., 2013). En raison du caractère grave de la listériose, les travaux de recherche se
sont surtout focalisés sur l’aspect médical (épidémiologie et étude de la virulence) ainsi
que sur les mesures de contrôle et les méthodes permettant de limiter la présence de ce
pathogène dans l’industrie agro-alimentaire. Les données concernant la persistance de L.
monocytogenes dans l’environnement agricole et notamment sur son comportement
dans les effluents d'élevages sont plus fragmentaires. Or, il est reconnu que
l’environnement agricole représente l’une des voies de propagation de cette bactérie
pathogène. Ainsi, les ensilages dont l’acidification est insuffisante peuvent contenir des
teneurs élevées en L. monocytogenes et sont à l’origine de la contamination du cheptel
bovin. Les déjections des animaux d’élevages qui hébergent cette bactérie dans leur
tube digestif peuvent également contaminer le sol et les végétaux.
L’estimation du rôle joué par les épandages des effluents d'élevages dans la
dissémination de L. monocytogenes nécessite déjà de connaître les niveaux de
concentrations de la bactérie ainsi que son comportement au cours du stockage des
effluents et lors de son transfert dans le sol. Les teneurs en L. monocytogenes sont en
général faibles dans l’environnement, ce qui explique l’échec des méthodes
moléculaires à la quantifier dans les sols (Locatelli et al., 2013a). Les méthodes
culturales dont le seuil de quantification peut être jusqu’à 100 000 fois plus bas que
celui de la PCR quantitative ont donc été privilégiées pour rechercher L. monocytogenes
dans l’environnement (Nightingale et al., 2004 ; Fox et al., 2009 ; Pourcher et al.,
2012 ; Cooley et al., 2014 ; Stea et al. , 2015). Or, comme d’autres pathogènes d’origine
entérique telles que les salmonelles et les campylobacters thermotolérants, L.
monocytogenes est capable d’entrer dans un état viable non cultivable qui la rend
indétectable par les méthodes culturales.
En raison du risque sanitaire que représente cet état physiologique particulier, il nous
paraissait important d’étudier la capacité de L. monocytogenes à former des cellules
VNC dans des effluents d’élevages. Une étude menée à l’Irstea de Rennes ayant montré
une prévalence élevée de L. monocytogenes dans les effluents d'élevages porcins
bretons, nous avons axé nos recherches sur la persistance de cette bactérie pathogène
152
dans les lisiers de porcs et dans les effluents de lagune, sous-produits issus de leur
traitement biologique.
La plupart des méthodes utilisées pour mettre en évidence les formes VNC décrites dans
la littérature scientifique sont fondées sur des marquages des cellules actives avec des
molécules fluorescentes, repérées en microscopie (Moreno, 2007 ; Griffitt et al., 2011).
Cependant, la turbidité et la forte teneur en matière organique et en bactéries des
effluents d’élevages, rendaient impossible l’utilisation de telles techniques. Deux
méthodes ont retenu notre attention, la RT-qPCR, ciblant les cellules actives (Garcia et
al., 2010) et l’utilisation d’agents intercalants ciblant les cellules à paroi endommagée
(Nocker et al. , 2006, 2007). Nous avons exclu la RT-qPCR non seulement en raison de
la difficulté à extraire l’ARN de bonne qualité à partir des matrices complexes, mais
aussi parce que le taux d’expression de l’ARN dépend de l’état physiologique des
cellules. Il est donc difficile d’établir une relation entre le nombre de cellules actives et
la quantité d’ARN mesuré. La seconde technique qui nous paraissait pertinente, utilise
le Propidium monoazide couplé à la qPCR (qPCR-PMA). Cette technique a été
appliquée avec succès pour quantifier des formes viables de bactéries dans des matrices
simples comme l’eau ou les bouillons nutritifs (Nocker et Camer, 2009 ; Agusti et al.,
2010 ; Fittipaldi et al., 2011b ; Lovdal et al., 2011). Toutefois, les données obtenues sur
les matrices turbides et riches en matières organiques étaient moins encourageantes
(Wagner et al., 2008). En effet le PMA réagit avec la matière organique. De plus, la
méthode nécessite une étape de photoactivation de l’intercalant qui est d’autant plus
efficace que la matrice est claire et peu chargée en composés organiques. Il est
important de souligner que les paramètres expérimentaux (teneur en PMA, durée
d’incubation permettant au PMA de pénétrer dans les cellules et durée de
photoactivation), décrits dans la majorité des travaux publiés, ont été repris de l’étude
réalisée en 2006 par l’équipe de Nocker (Nocker et al., 2006) sans aucune adaptation
aux matrices testées. De plus, les limites de détection et de quantification de cette
méthode n’ont jamais été clairement définies. Il faut également noter que le PMA ne
possède pas une efficacité parfaite dans la mesure où il peut ne pas entrer dans toutes les
cellules à paroi endommagée, par exemple lorsqu’il réagit en partie avec la matière
organique de la matrice. Inversement, il peut pénétrer, notamment lorsqu’il est en trop
forte concentration, dans les cellules viables.
153
Au regard des données de la littérature, il était donc nécessaire d’adapter les paramètres
méthodologiques du PMA aux effluents de lagune et aux lisiers, deux matrices foncées
et chargées en matières en suspension (MES) qui se différenciaient cependant par leur
turbidité (de l’ordre de 100 à 700 et 2600 à 4600 NTU, respectivement) et de leur teneur
en MES (0,5 à 1 et 4 à 10 g/L, respectivement). L’optimisation des trois paramètres
méthodologiques ayant un rôle majeur dans la méthode du PMA (concentration en
PMA, durée d’incubation, durée de photoactivation), a été réalisée à l’aide d’un plan
d’expérience de Doehlert associé à une fonction de désirabilité. Cette fonction a été
utilisée dans la mesure où il était nécessaire de maximiser l’entrée du PMA dans les
cellules à paroi endommagée tout en minimisant son entrée dans les cellules à paroi
intacte. Etant donné les caractéristiques différentes des deux matrices, il n’est pas
surprenant que les valeurs des paramètres obtenues par le plan d’expérience soient
spécifiques à chaque matrice, ce qui peut d’ailleurs remettre en question les résultats des
études menées sur des matrices complexes qui se sont appuyées sur les valeurs de
Nocker et al. (2006). Nous avons dans un second temps testé les valeurs définies avec le
plan d’expérience sur quatre effluents de lagune et cinq lisiers de porcs en inoculant des
cellules de L. monocytogenes en phase exponentielle et tuées par la chaleur. Malgré une
légère sous-estimation des cellules vivantes (en moyenne de 0,4 Log10), les résultats
obtenus ont montré qu’une fois les valeurs des paramètres définies sur un échantillon de
matrice donnée, la qPCR-PMA était applicable à ce type de matrice (dans notre cas,
lisiers et effluents de lagunes).
Cette étude a permis de développer un protocole optimisé pour rechercher les formes
VNC de L. monocytogenes dans les lisiers porcins et les effluents de lagune.
Pour tout autre type de matrice liquide complexe (boues de stations d'épuration, lisiers
de bovins, lisiers de canards,…) il est possible d’appliquer la technique de la qPCR-
PMA à condition de définir à l’aide d’un plan d’expérience les valeurs optimales des
paramètres méthodologiques en utilisant des cellules vivantes en phase exponentielle et
des cellules mortes.
La mise en évidence de formes VNC chez d’autres bactéries pathogènes dans les
effluents d’élevage porcins est envisageable mais elle requiert également une mise au
point préliminaire, notamment si les bactéries sont des Gram négatif, la cinétique de
154
pénétration du PMA dans les cellules dépendant de la structure de la paroi (Contreras et
al., 2011 ; Soejima et al., 2011).
Il faut noter que des essais réalisés sur un sol au cours de la thèse se sont avérés
infructueux, ce que nous avons attribué à la présence de cations susceptibles d’interférer
sur les performances du PMA (Pisz et al., 2007). Il reste donc des améliorations à
apporter à la technique pour qu’elle puisse être utilisée pour estimer la capacité des
bactéries pathogènes à entrer en état VNC dans le sol.
Il est aussi important de rappeler que la technique du PMA est dépendante du seuil de
quantification de la qPCR qui reste trop élevé (103 à 104 équivalent génome/mL) pour la
détection directe des pathogènes dans l’environnement. L’une des principales difficultés
consiste à diminuer le seuil de quantification des méthodes moléculaires associées au
PMA. Une piste possible est la PCR digitale qui est une PCR en émulsion dont la limite
de détection atteint une molécule d’ADN par mL de matrice (Rothrock et al., 2013).
Cette technique, encore peu utilisée, n’a jamais été couplée au PMA. Récemment
Fernandes et al. (2014) ont développé une technique qui mesure à l’aide d’un
biosenseur la concentration de bactériophages fixés à des cellules viables de Salmonella
Enteritidis. Le seuil de quantification des formes VNC était de 4 cellules par biosenseur.
Cependant, l’expérimentation a été réalisée dans de l’eau sur une souche pure de
Salmonella et n’a pas encore été adaptée à des matrices complexes.
Si elle ne peut pas encore être utilisée pour détecter les formes VNC des bactéries
pathogènes dans l’environnement, la qPCR-PMA peut en revanche permettre d’étudier
la viabilité de souches ensemencées dans des microsomes à des teneurs suffisamment
élevées (de l’ordre de 107 à 108 bactéries/mL) pour être quantifiées par qPCR.
Nous avons ainsi pu appliquer la technique de la qPCR-PMA pour étudier l’influence
des facteurs environnementaux sur la persistance de deux souches de L. monocytogenes,
et plus particulièrement sur leur capacité à entrer en état VNC, dans des microcosmes
constitués de deux lisiers et deux d’effluents de lagune maintenus à 8°C et 20°C,
températures représentant les températures moyennes des effluents de lagunes pendant
la période hivernale et estivale.
155
De façon intéressante, le comportement des deux souches s’est avéré indépendant de
leur sérogroupe (IIb et IVb) et de leur origine (effluent de lagune et lisier) quelle que
soit la méthode de quantification utilisée (culturale, qPCR-PMA et qPCR) et quelle que
soit la matrice. Comme attendu, la température la plus basse a conduit à une
augmentation significative de la persistance confirmant un effet de la saison sur la
survie des bactéries pathogènes dans les effluents et les sols, rapporté dans la littérature
(Jiang et al., 2014 ; Sidorenko et al., 2006). Une différence de comportement a
également été observée au sein d’un même type de matrice, sans que celle-ci puisse être
attribuée aux facteurs physico-chimiques analysés (pH, matières en suspension,
matières volatiles, azote total, NH4+, AGV). D’autres facteurs chimiques non pris en
compte dans notre étude, notamment les éléments minéraux ou les composés organiques
tels que les antibiotiques susceptibles d’être présents dans les effluents, ont pu
influencer le comportement des deux souches. Il est également possible que les
différences de persistance observées notamment entre les deux lisiers à 20°C soient
dues à des facteurs biotiques. L’analyse de la diversité bactérienne des quatre effluents
dont les phyla dominants appartenaient aux Proteobacteria, Firmicutes, Bacteroidetes
et Actinobacteria n’a pas permis d’expliquer les différences de comportement observées
entre les matrices. Toutefois, la viabilité de L. monocytogenes était plus faible dans les
microcosmes présentant une plus grande diversité bactérienne, ce qui est en accord avec
l’étude de Vivant et al. (2013) qui ont montré que la survie de L. monocytogenes dépend
de la diversité et de l’abondance des communautés bactériennes. L’analyse par
pyroséquençage des lisiers et des effluents de lagune n’a pas permis de mettre en
évidence l’existence de bactéries ayant une action antagoniste vis-à-vis de L.
monocytogenes. Il serait intéressant de rechercher des bactéries antagonistes décrites
dans la littérature par technique culturale et par qPCR dans les effluents.
L’un des résultats majeurs de cette étude est la mise en évidence de l’entrée en état
VNC de L. monocytogenes dans les lisiers et les effluents de lagune aussi bien à 8°C
qu’à 20°C, ce qui avait été suggéré mais non prouvé par Klein et al. (2010) qui ont suivi
avec la méthode culturale et la qPCR, la persistance d’une souche de L. monocytogenes
inoculée dans du fumier de bovin. Il est important de souligner que les formes VNC qui
représentent 83 à 99,8% des bactéries viables après 2 mois d’incubation, se sont
formées dès les premières heures de contact avec l’effluent, suggérant une réponse
156
rapide au stress provoqué par le transfert des bactéries dans les effluents. Leur
proportion était plus élevée en début d’expérience dans les lisiers que dans les effluents
de lagune mais elle était du même ordre de grandeur dans les deux types de matrices
après 60 jours, suggérant que la cinétique d’apparition des formes VNC dépend de la
matrice, celle-ci étant plus lente dans les lagunes.
La cinétique d’apparition des formes VNC dans les effluents d'élevages traduit une
réponse rapide de L. monocytogenes. Il nous paraissait important pour compléter cette
étude, d’acquérir des connaissances sur les mécanismes d’adaptation mis en jeu par L.
monocytogenes lors de son transfert dans l’effluent de lagune et dans le sol qui
représentent les deux compartiments finaux de la circulation de la bactérie pathogène
dans les stations de traitement du lisier. L’analyse du génome a été réalisée par
séquençage de l’ARN (RNAseq) d’une souche isolée d’un lisier, inoculée dans des
extraits stériles de sol et d’effluent de lagune, incubés à 21°C sur un temps court (20
minutes et 24 heures). Les modifications génomiques, différentes dans les deux
matrices, apparaissent dès les 20 premières minutes, ce qui est en accord avec l’entrée
rapide en état VNC observée lors de l’inoculation des deux souches dans les effluents
d'élevages.
Le stress induit par le contact avec les extraits de sol et d’effluent de lagune a conduit à
une augmentation du taux de transcrits de gènes codant des enzymes impliquées dans le
transport et l’assimilation de sucres et de protéines. De plus, la souche a activé des
systèmes lui permettant (i) de lutter contre des xénobiotiques et (ii) de répondre à des
stress spécifiques tels que des stress osmotiques ou de température via la régulation des
gènes contrôlés par sigmaB. La surexpression des gènes du locus comG observée dans
l’extrait d’effluent de lagune suggère que L. monocytogenes pourrait acquérir de l’ADN
exogène, ce qui faciliterait le transfert des gènes impliqués dans la résistance aux
antibiotiques et à des toxines. Enfin, l’expression des gènes de virulence et des gènes
impliqués dans leur régulation a augmenté au cours du temps dans les deux matrices,
signifiant le maintien de la virulence de la souche. Il convient de souligner que
l’augmentation du taux de transcrit des gènes impliqués dans la virulence peut conduire
à une diminution de la survie de L. monocytogenes, comme cela a été rapporté par
Vasanthakrisham et al. (2015).
157
La technique d’analyse RNA-Seq nous a permis d’analyser qualitativement et
quantitativement les transcrits d’une souche dans deux matrices stériles. Les limites de
cette étude concernent l’utilisation de milieux stériles et filtrés. Il est probable que les
mécanismes d’adaptation de L. monocytogenes diffèrent dans les matrices naturelles
mais les techniques actuellement disponibles ne permettent pas d’analyser le
transcriptome d’une souche en présence de flore autochtone et de fortes teneurs en
matière organique. Dans cette étude, nous n’avons étudié qu’une seule souche de L.
monocytogenes. Or, la réponse aux stress peut dépendre des souches (Alessandria et al.,
2014). Nous avions d’ailleurs prévu de comparer le transcriptome de deux souches,
l’une isolée d’un lisier, l’autre d’un sol, mais des contraintes techniques (difficulté à
obtenir un ARN d’excellente qualité) ont réduit notre étude au séquençage d’une seule
souche. Enfin, il est important de compléter l’étude du transcriptome par l’analyse du
taux de transcrit des ARN non codants qui jouent un rôle important dans l’expression
des gènes en affectant la stabilité des ARN messagers ou en modifiant l’activité de
certaines protéines.
En conclusion, nos travaux ont permis d’améliorer les connaissances sur le
comportement de L. monocytogenes dans les effluents d’élevages porcins. Il apparaît
que les principaux facteurs influençant la persistance de ce pathogène sont la
température et l’origine géographique des effluents. Le type de matrice (lisier vs
effluent de lagune), malgré les différences de composition chimique et microbiologique,
a un impact moindre sur la survie de L. monocytogenes. Nos travaux, pour la première
fois, ont montré la forte proportion de formes VNC d’une bactérie pathogène dans les
effluents d'élevages, soulignant la difficulté à évaluer le risque réel de dissémination des
micro-organismes pathogènes dans l’environnement agricole.
158
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Annexes
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Annexe 1 - Comparison of DNA extraction kits and modification of DNA elution procedure for the quantification of subdominant bacteria from piggery effluents with real-time PCR
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Annexe 2 - Tableau S1 : Classement des gènes dont le taux de transcrit est augmenté (après enrichissement fonctionnel)
matrice gène fold change description
cat. fonct
T2 lag dltD 2,3 DltD protein for D-alanine esterification of lipoteichoic acid and wall teichoic acid 1.1 T2 sol tagD 56,1 highly similar to glycerol-3-phosphate cytidylyltransferase (gct), CDP-glycerol pyrophosphorylase 1.1 T2 sol lmo1074 300,2 highly similar to teichoic acid translocation permease protein TagG 1.1 T1 lag murZ 4,9 highly similar to UDP-N-acetylglucosamine 1-carboxyvinyltransferase 1.1 T1 sol murZ 101,1 highly similar to UDP-N-acetylglucosamine 1-carboxyvinyltransferase 1.1 T2 lag murZ 18,4 highly similar to UDP-N-acetylglucosamine 1-carboxyvinyltransferase 1.1 T2 lag iap 5,0 P60 extracellular protein, invasion associated protein Iap 1.1 T1 lag spl 3,7 peptidoglycan lytic protein P45 1.1 T2 lag spl 3,5 peptidoglycan lytic protein P45 1.1 T2 sol spl 4,2 peptidoglycan lytic protein P45 1.1 T1 lag lmo0849 3,1 similar to amidases 1.1 T2 sol lmo0849 5,2 similar to amidases 1.1 T2 sol lmo2691 5,0 similar to autolysin, N-acetylmuramidase 1.1 T2 lag lmo0129 3,9 similar to autolysin: N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase 1.1 T2 sol lmo1080 535,2 similar to B. subtilis minor teichoic acids biosynthesis protein GgaB 1.1 T2 lag lmo2521 2,4 similar to B. subtilis TagA protein involved in polyglycerol phosphate biosynthesis 1.1 T2 lag lmo0017 3,2 similar to Bacillus anthracis CapA protein (polyglutamate capsule biosynthesis) 1.1 T2 sol lmo0017 4,5 similar to Bacillus anthracis CapA protein (polyglutamate capsule biosynthesis) 1.1 T2 lag lmo0516 2,9 similar to Bacillus anthracis encapsulation protein CapA 1.1 T2 sol lmo0516 5,0 similar to Bacillus anthracis encapsulation protein CapA 1.1 T1 lag mreB 4,0 similar to cell-shape determining protein MreB 1.1 T1 lag mreD 6,3 similar to cell-shape determining protein MreD 1.1 T1 lag lmo2812 5,6 similar to D-alanyl-D-alanine carboxypeptidase 1.1 T2 lag lmo2812 3,4 similar to D-alanyl-D-alanine carboxypeptidase 1.1 T2 sol lmo2812 4,0 similar to D-alanyl-D-alanine carboxypeptidase 1.1 T1 lag lmo2754 8,2 similar to D-alanyl-D-alanine carboxypeptidase (penicillin-binding protein 5) 1.1 T2 sol lmo2754 2,2 similar to D-alanyl-D-alanine carboxypeptidase (penicillin-binding protein 5) 1.1 T2 sol lmo1083 328,8 similar to dTDP-D-glucose 4,6-dehydratase 1.1 T2 lag lmo1084 12,6 similar to DTDP-L-rhamnose synthetase 1.1 T2 sol lmo1084 330,5 similar to DTDP-L-rhamnose synthetase 1.1 T2 sol lmo1084 330,5 similar to DTDP-L-rhamnose synthetase 1.1 T2 sol lmo1082 205,7 similar to dTDP-sugar epimerase 1.1 T1 lag lmo2554 2,3 similar to galactosyltransferase 1.1 T2 sol lmo1090 129,9 similar to glycosyltransferases 1.1 T2 sol lmo1091 129,7 similar to glysosyltransferases 1.1 T2 lag lmo2522 10,5 similar to hypothetical cell wall binding protein from B. subtilis 1.1 T2 lag lmo0394 2,3 similar to L. monocytogenes extracellular P60 protein 1.1 T1 lag lmo1215 3,6 similar to N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase (autolysin) 1.1 T2 lag lmo1216 2,9 similar to N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase (autolysin) 1.1 T1 lag lmo1438 3,6 similar to penicillin-binding protein 1.1 T1 lag lmo2229 4,9 similar to penicillin-binding protein 1.1 T2 lag lmo0441 3,1 similar to penicillin-binding protein (D-alanyl-D-alanine carboxypeptidase) 1.1 T1 sol pbpA 4,6 similar to penicillin-binding protein 2A 1.1 T1 lag pbpB 2,8 similar to penicillin-binding protein 2B 1.1 T2 lag pbpB 3,1 similar to penicillin-binding protein 2B 1.1 T2 lag lmo1078 22,9 similar to putative UDP-glucose pyrophosphorylases 1.1 T2 sol lmo1078 445,6 similar to putative UDP-glucose pyrophosphorylases 1.1 T2 lag lmo0497 41,9 similar to sugar transferase 1.1 T2 sol lmo0497 615,9 similar to sugar transferase 1.1 T2 sol lmo0933 623,5 similar to sugar transferase 1.1 T2 sol lmo1077 764,4 similar to teichoic acid biosynthesis protein B 1.1 T2 sol lmo1085 498,6 similar to teichoic acid biosynthesis protein B 1.1 T2 sol tagB 165,3 similar to teichoic acid biosynthesis protein B precursor 1.1 T1 lag murB 5,9 UDP-N-acetylenolpyruvoylglucosamine reductase 1.1 T1 lag lmo2555 2,5 weakly similar to human N-acetylglucosaminyl-phosphatidylinositol biosynthetic protein 1.1 T1 lag lmo0275 4,3 C-terminal part similar to B. subtilis ComEC protein 1.10 T2 lag lmo0275 3,4 C-terminal part similar to B. subtilis ComEC protein 1.10
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T2 sol lmo2189 3,5 similar to a putative competence protein from streptococcus pneumoniae 1.10 T1 lag comGA 2,0 similar to B. subtilis comG operon protein 1 1.10 T1 lag comGB 3,2 similar to B. subtilis comG operon protein 2 1.10 T2 lag comGB 2,7 similar to B. subtilis comG operon protein 2 1.10 T1 lag lmo1344 2,7 similar to comG operon protein 4 (comGD) 1.10 T2 lag lmo1344 6,9 similar to comG operon protein 4 (comGD) 1.10 T1 lag lmo1343 3,0 similar to comG operon protein 5 (comGE) 1.10 T2 lag lmo1343 4,9 similar to comG operon protein 5 (comGE) 1.10 T1 lag lmo0945 6,0 similar to C-terminal part of B. subtilis ComEC protein and to ComEA 1.10 T1 lag
comEC 6,6
similar to putative integral membrane protein ComEC specifically required for DNA uptake but not for binding
1.10
T2 lag comEC
3,2 similar to putative integral membrane protein ComEC specifically required for DNA uptake but not for binding
1.10
T2 lag cadA 81,9 cadmium resistance protein 1.2 T2 sol lmo0366 50,8 conserved hypothetical protein, putative lipoprotein 1.2 T2 sol lmo0650 2,6 conserved membrane protein 1.2 T2 lag uhpT 2,3 highly similar to hexose phosphate transport protein 1.2 T1 sol kdpA 9,0 highly similar to potassium-transporting atpase a chain 1.2 T2 sol kdpA 6,9 highly similar to potassium-transporting atpase a chain 1.2 T2 lag lmo2775 4,7 hypothetical membrane protein 1.2 T2 sol lmo2775 2,4 hypothetical membrane protein 1.2 T1 lag lmo0947 3,1 hypothetical transport protein 1.2 T2 lag lmo0947 2,8 hypothetical transport protein 1.2 T1 sol zurM 4,0 metal (zinc) transport protein (ABC transporter, permease protein) 1.2 T1 sol kdpC 3,5 potassium-transporting atpase c chain 1.2 T2 sol kdpC 4,2 potassium-transporting atpase c chain 1.2 T1 lag lmo1431 8,3 similar to ABC transporter (ATP-binding protein) 1.2 T1 lag lmo1747 2,4 similar to ABC transporter (ATP-binding protein) 1.2 T1 lag lmo2114 2,7 similar to ABC transporter (ATP-binding protein) 1.2 T1 lag lmo2215 2,3 similar to ABC transporter (ATP-binding protein) 1.2 T1 lag lmo2240 2,1 similar to ABC transporter (ATP-binding protein) 1.2 T2 lag lmo1431 2,7 similar to ABC transporter (ATP-binding protein) 1.2 T2 lag lmo2114 2,4 similar to ABC transporter (ATP-binding protein) 1.2 T2 sol lmo2114 3,7 similar to ABC transporter (ATP-binding protein) 1.2 T2 sol lmo2215 3,4 similar to ABC transporter (ATP-binding protein) 1.2 T2 lag lmo2140 2,0 similar to ABC transporter (membrane protein) 1.2 T2 sol lmo2214 3,4 similar to ABC transporter (membrane protein) 1.2 T1 lag lmo2115 3,0 similar to ABC transporter (permease) 1.2 T2 lag lmo2115 3,4 similar to ABC transporter (permease) 1.2 T2 sol lmo2115 4,1 similar to ABC transporter (permease) 1.2 T2 sol lmo0283 3,2 similar to ABC transporter permease protein 1.2 T1 lag lmo2769 3,7 similar to ABC transporter, ATP-binding protein 1.2 T2 lag lmo2769 3,6 similar to ABC transporter, ATP-binding protein 1.2 T2 lag lmo2751 2,7 similar to ABC transporter, ATP-binding protein 1.2 T2 sol lmo2751 3,9 similar to ABC transporter, ATP-binding protein 1.2 T2 sol lmo2769 3,5 similar to ABC transporter, ATP-binding protein 1.2 T2 sol lmo0767 11,8 similar to ABC transporter, permease protein 1.2 T2 lag lmo0872 3,4 similar to antibiotic resistance protein 1.2 T2 sol lmo0872 3,6 similar to antibiotic resistance protein 1.2 T1 lag lmo2575 3,0 similar to cation transport protein (efflux) 1.2 T2 lag lmo2685 32,5 similar to cellobiose phosphotransferase enzyme IIA component 1.2 T2 sol lmo2685 5,9 similar to cellobiose phosphotransferase enzyme IIA component 1.2 T2 sol lmo2062 2,3 similar to copper export proteins 1.2 T1 sol lmo2777 2,5 similar to efflux protein 1.2 T2 sol lmo2777 2,7 similar to efflux protein 1.2 T1 sol lmo1539 5,2 similar to glycerol uptake facilitator 1.2 T2 sol lmo1422 2,1 similar to glycine betaine/carnitine/choline ABC transporter (membrane protein) 1.2 T1 sol lmo0155 5,6 similar to high-affinity zinc ABC transporter (membrane protein) 1.2 T2 lag lmo2249 3,3 similar to low-affinity inorganic phosphate transporter 1.2 T2 sol lmo2124 5,7 similar to maltodextrin ABC-transport system (permease) 1.2 T2 sol lmo2123 8,1 similar to maltodextrin ABC-transport system (permease) 1.2 T1 lag lmo2125 15,9 similar to maltose/maltodextrin ABC-transporter (binding protein) 1.2 T2 lag lmo2125 7,9 similar to maltose/maltodextrin ABC-transporter (binding protein) 1.2 T2 sol lmo2125 13,4 similar to maltose/maltodextrin ABC-transporter (binding protein) 1.2 T2 sol lmo0783 2,5 similar to mannose-specific phosphotransferase system (PTS) component IIB 1.2 T1 lag lmo1064 3,3 similar to membrane and transport proteins 1.2 T1 lag lmo1041 3,5 similar to molybdate ABC transporter binding protein 1.2
190
T2 lag lmo1041 3,3 similar to molybdate ABC transporter binding protein 1.2 T1 lag lmo0993 5,9 similar to Na+-transporting ATP synthase subunit J 1.2 T2 sol lmo0135 4,0 similar to oligopeptide ABC transport system substrate-binding proteins 1.2 T2 sol lmo0136 2,5 similar to oligopeptide ABC transporter, permease protein 1.2 T2 lag lmo0152 5,2 similar to oligopeptide ABC transporter-binding protein 1.2 T2 sol lmo0152 2,9 similar to oligopeptide ABC transporter-binding protein 1.2 T1 lag lmo2196 3,9 similar to pheromone ABC transporter (binding protein) 1.2 T1 lag lmo2499 221,1 similar to phosphate ABC transporter (binding protein) 1.2 T2 lag lmo2499 10,6 similar to phosphate ABC transporter (binding protein) 1.2 T2 sol lmo0405 5,4 similar to phosphate transport protein 1.2 T1 lag lmo1017 2,9 similar to phosphotransferase system glucose-specific enzyme IIA 1.2 T2 sol lmo2797 11,1 similar to phosphotransferase system mannitol-specific enzyme IIA 1.2 T2 lag lmo2765 6,0 similar to PTS cellobiose-specific enzyme IIA 1.2 T2 sol lmo2765 3,9 similar to PTS cellobiose-specific enzyme IIA 1.2 T2 lag lmo1997 19,6 similar to PTS mannose-specific enzyme IIA component 1.2 T2 lag lmo2002 3,8 similar to PTS mannose-specific enzyme IIB component 1.2 T2 lag lmo2001 3,8 similar to PTS mannose-specific enzyme IIC component 1.2 T2 lag lmo2000 4,8 similar to PTS mannose-specific enzyme IID component 1.2 T2 sol lmo1973 38,2 similar to PTS system enzyme II A component 1.2 T2 lag lmo0874 6,6 similar to PTS system enzyme IIA component 1.2 T2 sol lmo2667 4,4 similar to PTS system galactitol-specific enzyme IIA component 1.2 T2 sol lmo2665 3,3 similar to PTS system galactitol-specific enzyme IIC component 1.2 T2 sol lmo0021 6,3 similar to PTS system, fructose-specific IIA component 1.2 T2 lag lmo0023 7,0 similar to PTS system, fructose-specific IIC component 1.2 T2 lag lmo0508 3,5 similar to PTS system, Galactitol-specific IIC component 1.2 T2 lag lmo0024 4,0 similar to PTS system, mannose-specific IID component 1.2 T2 lag lmo1852 2,2 similar to putative mercuric ion binding proteins 1.2 T2 sol lmo0766 11,9 similar to putative sugar ABC transporter, permease protein 1.2 T2 lag lmo0524 3,0 similar to putative sulfate transporter 1.2 T2 sol lmo0524 4,1 similar to putative sulfate transporter 1.2 T2 sol lmo2009 4,3 similar to putative transport system integral membrane protein 1.2 T1 lag lmo1625 2,0 similar to putative transporters 1.2 T1 sol lmo0808 2,7 similar to spermidine/putrescine ABC transporter, permease protein 1.2 T1 lag lmo1730 5,0 similar to sugar ABC transporter binding protein 1.2 T2 sol lmo2837 3,5 similar to sugar ABC transporter permease protein 1.2 T2 sol lmo0768 16,8 similar to sugar ABC transporter, periplasmic sugar-binding protein 1.2 T2 lag lmo0181 3,0 similar to sugar ABC transporter, sugar-binding protein 1.2 T2 lag lmo2839 14,1 similar to sugar binding protein (ABC transporter) 1.2 T1 lag lmo2850 3,0 similar to sugar transport proteins 1.2 T2 sol lmo2850 3,5 similar to sugar transport proteins 1.2 T2 lag lmo0839 2,7 similar to Tetracycline resistance protein 1.2 T2 lag lmo2818 2,4 similar to transmembrane efflux protein 1.2 T2 sol lmo2818 2,5 similar to transmembrane efflux protein 1.2 T1 sol lmo2845 9,5 similar to transmembrane efflux proteins 1.2 T1 lag lmo0826 2,7 similar to transport protein 1.2 T2 lag lmo2816 2,3 similar to transport protein 1.2 T2 lag lmo0593 2,3 similar to transport proteins (formate?) 1.2 T1 sol lmo2679 16,3 similar to the two components sensor protein kdpD 1.3 T1 lag atpI 3,7 highly similar to ATP synthase subunit i 1.4 T2 sol atpI 4,1 highly similar to ATP synthase subunit i 1.4 T2 sol atpB 3,7 highly similar to H+-transporting ATP synthase chain a 1.4 T2 sol atpA 2,1 highly similar to H+-transporting ATP synthase chain alpha 1.4 T2 sol atpF 2,7 highly similar to H+-transporting ATP synthase chain b 1.4 T2 sol atpD 2,7 highly similar to H+-transporting ATP synthase chain beta 1.4 T2 sol atpH 2,6 highly similar to H+-transporting ATP synthase chain delta 1.4 T2 sol atpC 2,2 highly similar to H+-transporting ATP synthase chain epsilon 1.4 T2 sol atpG 2,7 highly similar to H+-transporting ATP synthase chain gamma 1.4 T2 sol lmo0093 2,6 similar to ATP synthase epsilon chain 1.4 T2 lag lmo0091 3,5 similar to ATP synthase gamma chain 1.4 T2 sol lmo0091 4,5 similar to ATP synthase gamma chain 1.4 T2 sol lmo0103 2,2 similar to NADH oxidase 1.4 T1 lag lmo1710 3,6 similar to putative flavodoxin 1.4 T2 lag trxA 4,5 thioredoxin 1.4 T2 sol lmo0089 3,2 weakly similar to ATP synthase delta chain 1.4 T2 sol lmo1789 3,1 weakly similar to Nad(P)h Oxidoreductase chain B 1.4 T2 lag lmo0681 8,1 similar to flagellar biosynthesis protein FlhF 1.5 T2 sol fliD 2,2 similar to flagellar hook-associated protein 2 FliD 1.5
191
T1 lag lmo0700 2,6 similar to flagellar motor switch protein fliY 1.5 T2 lag lmo0723 2,6 similar to metyl-accepting chemotaxis protein 1.5 T2 sol fliP 6,9
1.5
T2 sol fliQ 5,8
1.5 T1 lag lmo1270 6,6 similar to signal peptidase I 1.6 T1 lag gidB 3,3 GidB protein 1.7 T1 lag lmo0217 11,1 similar to B. subtilis DivIC protein 1.7 T2 sol lmo0217 2,4 similar to B. subtilis DivIC protein 1.7 T1 sol lmo2427 5,8 similar to cell division proteins RodA, FtsW 1.7 T1 sol lmo2428 4,1 similar to cell division proteins RodA, FtsW 1.7 T1 sol lmo1071 4,0 similar to cell-division protein RodA and FtsW 1.7 T2 sol lmo0700 3,7 similar to flagellar motor switch protein fliY 1.7 T2 lag lmo0421 105,7 similar to rod shape-determining protein RodA 1.7 T2 sol lmo0421 3977,5 similar to rod shape-determining protein RodA 1.7 T1 lag actA 28,4 actin-assembly inducing protein precursor 1.8 T2 lag actA 6,4 actin-assembly inducing protein precursor 1.8 T2 sol actA 2,1 actin-assembly inducing protein precursor 1.8 T2 sol ami 10,6 autolysin, amidase 1.8 T2 sol gidB 3,5 GidB protein 1.8 T2 sol lmo0576 10,3 hypothetical cell wall associated protein 1.8 T2 sol lmo0701 7,8 hypothetical protein lmo0701 1.8 T1 lag lmo0821 10,5 hypothetical protein lmo0821 1.8 T2 lag lmo0821 2,3 hypothetical protein lmo0821 1.8 T2 lag inlA 3,4 Internalin A 1.8 T2 lag inlB 3,3 Internalin B 1.8 T2 sol inlB 8,8 Internalin B 1.8 T2 sol inlE 22,5 internalin E 1.8 T2 sol inlG 105,7 internalin G 1.8 T2 lag inlH 2,7 internalin H 1.8 T2 sol inlH 38,6 internalin H 1.8 T2 sol lmo2714 2,8 peptidoglycan anchored protein (LPXTG motif) 1.8 T2 sol lmo2576 212,1 peptidoglycan anchored protein (LPXTG motif) 1.8 T2 lag lmo0627 2,3 peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) similar to adhesin 1.8 T2 sol lmo0627 3,5 peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) similar to adhesin 1.8 T2 lag lmo1666 3,5 peptidoglycan linked protein (LPxTG) 1.8 T2 lag lmo0460 2,5 putative membrane associated lipoprotein 1.8 T2 lag lmo0435 36,2 putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 lag lmo0159 2,8 putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 lag lmo1799 2,7 putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 lag lmo0842 2,5 putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 sol lmo0160 6,1 putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 sol lmo0732 2,6 putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 sol lmo2026 209,1 putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 sol lmo0159 7,0 putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 sol lmo1799 4,2 putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 sol lmo0175 7,3 putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 sol lmo0842 9,6 putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 sol lmo2085 2,2 putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 sol lmo0435 966,9 putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 sol lmo2178 4,2 putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T1 lag lmo2713 2,0 secreted protein with 1 GW repeat 1.8 T2 sol lmo2713 2,8 secreted protein with 1 GW repeat 1.8 T1 lag lmo0130 43,5 similar to 5'-nucleotidase, putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 lag lmo0130 19,6 similar to 5'-nucleotidase, putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 sol lmo0130 4,4 similar to 5'-nucleotidase, putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T1 lag lmo0601 11,6 similar to cell surface protein 1.8 T2 lag lmo0601 6,9 similar to cell surface protein 1.8 T2 sol lmo0601 17,2 similar to cell surface protein 1.8 T2 sol lmo0327 2,9 similar to cell surface proteins (LPXTG motif) 1.8 T1 lag lmo2504 7,2 similar to cell wall binding proteins 1.8 T2 sol lmo2504 5,4 similar to cell wall binding proteins 1.8 T2 sol lmo1115 76,1 similar to fibrinogen-binding protein (LPXTG motif) 1.8 T1 lag lmo1829 6,3 similar to fibronectin binding proteins 1.8 T2 lag lmo1829 2,5 similar to fibronectin binding proteins 1.8 T2 sol lmo1829 2,9 similar to fibronectin binding proteins 1.8 T2 sol lmo2445 3,5 similar to internalin 1.8 T2 sol lmo0514 2,1 similar to internalin protein, putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8
192
T1 lag lmo2396 3,4 similar to internalin proteins, putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 lag lmo0610 2,8 similar to internalin proteins, putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 sol lmo2396 4,7 similar to internalin proteins, putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 sol lmo1290 2,3 similar to internalin proteins, putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 sol lmo1289 75,1 similar to internalin proteins, putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 sol lmo0610 6,8 similar to internalin proteins, putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 sol lmo0171 919,2 similar to internalin proteins, putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 sol lmo0409 26,3 similar to internalin, peptidoglycan bound protein (LPxTG motif) 1.8 T2 sol lmo0801 198,2 similar to internalin, putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 sol lmo0331 10,2 similar to internalin, putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8 T2 sol lmo0929 2,7 similar to sortase 1.8 T2 sol lmo0320 10,7 similar to surface protein (peptidoglycan bound, LPXTG motif) 1.8 T2 sol lmo2061 3,1 similar to unknown protein 1.8 T2 sol lmo0880 2,5 similar to wall associated protein precursor (LPXTG motif) 1.8 T2 sol inlA 10,4 Internalin A 1.9 T2 lag lmo2027 10,4 putative cell surface protein, similar to internalin proteins 1.9 T2 sol lmo2027 189,3 putative cell surface protein, similar to internalin proteins 1.9 T2 sol lmo0616 3,0 C-terminal domain similar to glycerophosphoryl diester phosphodiesterase 2.1.1 T1 lag lmo0105 12,2 highly similar to chitinase B 2.1.1 T2 lag lmo0105 10,6 highly similar to chitinase B 2.1.1 T2 sol lmo0105 10,2 highly similar to chitinase B 2.1.1 T1 lag lmo0401 19,5 highly similar to E. col YbgG protein, a putative sugar hydrolase 2.1.1 T2 lag lmo0401 14,1 highly similar to E. col YbgG protein, a putative sugar hydrolase 2.1.1 T2 sol lmo0401 9,4 highly similar to E. col YbgG protein, a putative sugar hydrolase 2.1.1 T2 lag lmo2712 2,4 highly similar to gluconate kinase 2.1.1 T2 sol lmo1969 24,5 similar to 2-keto-3-deoxygluconate-6-phosphate aldolase 2.1.1 T2 sol lmo0739 7,0 similar to 6-phospho-beta-glucosidase 2.1.1 T1 lag lmo2833 2,1 similar to a maltose phosphorylase 2.1.1 T2 sol lmo2833 3,4 similar to a maltose phosphorylase 2.1.1 T2 lag lmo2720 2,4 similar to acetate-CoA ligase 2.1.1 T2 sol lmo2720 11,9 similar to acetate-CoA ligase 2.1.1 T2 lag lmo0664 26,6 similar to acetyl transferase 2.1.1 T2 lag lmo2480 2,0 similar to acetyltransferase 2.1.1 T2 sol lmo0431 3,8 similar to acetyltransferase 2.1.1 T2 lag lmo2836 5,5 similar to alcohol dehydrogenase 2.1.1 T2 sol lmo2836 2,8 similar to alcohol dehydrogenase 2.1.1 T2 sol lmo2700 3,9 similar to aldo/keto reductase 2.1.1 T2 sol lmo0769 29,5 similar to alpha-1,6-mannanase 2.1.1 T2 sol lmo0183 3,1 similar to alpha-glucosidase 2.1.1 T2 lag lmo0182 3,4 similar to alpha-xylosidase and alpha-glucosidase 2.1.1 T2 sol lmo0182 2,2 similar to alpha-xylosidase and alpha-glucosidase 2.1.1 T2 lag lmo0877 4,5 similar to B. subtilis NagB protein (glucosamine-6-phosphate isomerase) 2.1.1 T1 lag lmo0917 2,6 similar to beta-glucosidase 2.1.1 T1 lag lmo2761 3,1 similar to beta-glucosidase 2.1.1 T1 lag lmo2771 5,8 similar to beta-glucosidase 2.1.1 T2 lag lmo0917 4,5 similar to beta-glucosidase 2.1.1 T2 lag lmo2771 3,4 similar to beta-glucosidase 2.1.1 T2 sol lmo2771 2,2 similar to beta-glucosidase 2.1.1 T2 sol lmo0917 4,5 similar to beta-glucosidase 2.1.1 T2 sol lmo2761 7,5 similar to beta-glucosidase 2.1.1 T1 lag lmo1729 9,5 similar to beta-glucosidases 2.1.1 T2 lag lmo1729 3,0 similar to beta-glucosidases 2.1.1 T1 lag lmo1184 6,1 similar to carbon dioxide concentrating mechanism protein 2.1.1 T2 lag lmo1184 3,4 similar to carbon dioxide concentrating mechanism protein 2.1.1 T1 lag lmo0811 2,6 similar to carbonic anhydrase 2.1.1 T2 lag lmo0075 4,3 similar to carboxyphosphonoenolpyruvate phosphonomutase 2.1.1 T2 sol lmo0075 2,6 similar to carboxyphosphonoenolpyruvate phosphonomutase 2.1.1 T2 sol lmo2467 2,1 similar to chitinase and chitin binding protein 2.1.1 T2 lag lmo1883 2,1 similar to chitinases 2.1.1 T2 sol lmo1883 5,4 similar to chitinases 2.1.1 T2 lag lmo2824 2,4 similar to D-3-phosphoglycerate dehydrogenase 2.1.1 T2 sol lmo2824 4,1 similar to D-3-phosphoglycerate dehydrogenase 2.1.1 T2 lag lmo2800 3,0 similar to dehydrogenase 2.1.1 T2 lag lmo0347 4,0 similar to dihydroxyacetone kinase 2.1.1 T2 lag lmo2695 2,1 similar to dihydroxyacetone kinase 2.1.1 T2 sol lmo0415 2,9 similar to endo-1,4-beta-xylanase 2.1.1 T2 lag lmo0033 4,8 similar to endoglucanase 2.1.1
193
T1 lag eutB 2,1 similar to ethanolamine ammonia-lyase, heavy chain 2.1.1 T2 lag eutA 4,5 similar to ethanolamine utilization protein EutA (putative chaperonin) 2.1.1 T1 lag lmo1186 4,6 similar to ethanolamine utilization protein EutH - Escherichia coli 2.1.1 T1 lag lmo1187 3,6 similar to ethanolamine utilization protein EutQ 2.1.1 T2 lag lmo1066 2,6 similar to extragenic suppressor protein SuhB and to myo-inositol-1(or 4)-monophosphatase 2.1.1 T2 lag lmo2586 18,2 similar to formate dehydrogenase alpha chain 2.1.1 T2 lag lmo0813 2,2 similar to fructokinases 2.1.1 T2 sol lmo2721 7,9 similar to glucosamine-6-phosphate isomerase 2.1.1 T2 lag lmo0035 4,6 similar to Glucosamine--fructose-6-phosphate aminotransferase (C-terminal domain) 2.1.1 T2 lag lmo1339 2,1 similar to glucose kinase 2.1.1 T2 lag lmo1034 12,2 similar to glycerol kinase 2.1.1 T2 lag lmo2446 3,0 similar to glycosidase 2.1.1 T2 lag lmo2109 5,0 similar to hydrolase 2.1.1 T2 sol lmo2109 119,5 similar to hydrolase 2.1.1 T2 lag lmo2696 2,4 similar to hypothetical dihydroxyacetone kinase 2.1.1 T2 sol lmo2696 3,5 similar to hypothetical dihydroxyacetone kinase 2.1.1 T1 lag lmo2122 2,5 similar to maltodextrose utilization protein MalA 2.1.1 T2 lag lmo2122 3,0 similar to maltodextrose utilization protein MalA 2.1.1 T2 sol lmo2122 6,2 similar to maltodextrose utilization protein MalA 2.1.1 T2 sol lmo2126 3,5 similar to maltogenic amylase 2.1.1 T1 lag lmo2121 2,6 similar to maltosephosphorylase 2.1.1 T2 lag lmo2121 3,0 similar to maltosephosphorylase 2.1.1 T2 sol lmo2121 15,4 similar to maltosephosphorylase 2.1.1 T1 lag lmo0010 4,9 similar to mevalonate kinase 2.1.1 T2 sol lmo0554 2,8 similar to NADH-dependent butanol dehydrogenase 2.1.1 T2 lag lmo0862 4,5 similar to oligo-1,6-glucosidase 2.1.1 T2 sol lmo0184 2,6 similar to oligo-1,6-glucosidase 2.1.1 T1 lag lmo0277 2,9 similar to oxidoreductase 2.1.1 T1 lag lmo0613 2,9 similar to oxidoreductase 2.1.1 T1 lag lmo0640 4,2 similar to oxidoreductase 2.1.1 T1 lag lmo2247 5,4 similar to oxidoreductase 2.1.1 T2 lag lmo0613 2,9 similar to oxidoreductase 2.1.1 T2 lag lmo0669 2,0 similar to oxidoreductase 2.1.1 T2 sol lmo2247 2,3 similar to oxidoreductase 2.1.1 T2 sol lmo0356 7,2 similar to oxidoreductase 2.1.1 T2 sol lmo0613 2,2 similar to oxidoreductase 2.1.1 T2 sol lmo0277 2,3 similar to oxidoreductase 2.1.1 T2 lag lmo2834 14,2 similar to oxidoreductases 2.1.1 T2 sol lmo0084 3,3 similar to oxidoreductases 2.1.1 T2 sol lmo0823 3,3 similar to oxydoreductases 2.1.1 T1 lag lmo2798 3,2 similar to phosphatase 2.1.1 T2 sol lmo2730 2,4 similar to phosphatase 2.1.1 T2 sol lmo2798 5,9 similar to phosphatase 2.1.1 T2 lag lmo0319 3,6 similar to phospho-beta-glucosidase 2.1.1 T1 lag lmo2253 3,0 similar to phosphoglucomutase 2.1.1 T2 lag lmo2253 2,7 similar to phosphoglucomutase 2.1.1 T1 lag lmo1000 5,9 similar to phytoene dehydrogenase 2.1.1 T2 sol lmo2663 3,3 similar to polyol dehydrogenase 2.1.1 T1 lag lmo0502 16,2 similar to putative sugar-phosphate isomerase 2.1.1 T2 lag lmo0722 3,1 similar to pyruvate oxidase 2.1.1 T1 lag lmo1867 9,3 similar to pyruvate phosphate dikinase 2.1.1 T2 lag lmo1867 9,3 similar to pyruvate phosphate dikinase 2.1.1 T2 sol lmo1867 6,0 similar to pyruvate phosphate dikinase 2.1.1 T2 sol lmo2662 6,2 similar to ribose 5-phosphate epimerase 2.1.1 T2 sol lmo2674 3,5 similar to ribose 5-phosphate epimerase 2.1.1 T1 lag lmo0498 4,9 similar to ribose 5-phosphate isomerase 2.1.1 T2 sol lmo0736 72,4 similar to ribose 5-phosphate isomerase 2.1.1 T1 lag lmo0499 5,8 similar to ribulose-5-phosphate 3 epimerase 2.1.1 T2 sol lmo2661 4,2 similar to ribulose-5-phosphate 3-epimerase 2.1.1 T2 sol lmo0735 105,4 similar to Ribulose-5-Phosphate 3-Epimerase 2.1.1 T1 lag lmo1185 7,3 similar to Salmonella enterica PduT protein 2.1.1 T2 sol lmo2664 3,8 similar to sorbitol dehydrogenase 2.1.1 T2 lag lmo0913 2,1 similar to succinate semialdehyde dehydrogenase 2.1.1 T2 sol lmo0913 5,2 similar to succinate semialdehyde dehydrogenase 2.1.1 T2 sol lmo2735 3,7 similar to Sucrose phosphorylase 2.1.1 T1 lag lmo0429 2,1 similar to sugar hydrolase 2.1.1 T2 sol lmo0429 4,5 similar to sugar hydrolase 2.1.1
194
T1 lag lmo0500 7,6 similar to transaldolase 2.1.1 T2 lag lmo1032 7,4 similar to transketolase 2.1.1 T2 lag lmo1033 6,9 similar to transketolase 2.1.1 T2 sol lmo2573 4,6 similar to zinc-binding dehydrogenase 2.1.1 T1 lag lmo1728 6,5 some similarities to cellobiose-phosphorylase 2.1.1 T2 lag lmo1728 2,8 some similarities to cellobiose-phosphorylase 2.1.1 T1 lag lmo1999 11,7 weakly similar to glucosamine-fructose-6-phosphate aminotransferase 2.1.1 T2 lag lmo1999 5,5 weakly similar to glucosamine-fructose-6-phosphate aminotransferase 2.1.1 T2 sol lmo2841 7,2 weakly similar to sucrose phosphorylase 2.1.1 T2 lag lmo2734 2,8 weakly similar to sugar hydrolase 2.1.1 T2 sol lmo2734 3,5 weakly similar to sugar hydrolase 2.1.1 T1 sol pgi 4,5 glucose-6-phosphate isomerase 2.1.2 T2 sol lmo0386 2,7 similar to B. subtilis IolD protein, to acetolactate synthase 2.1.2 T1 lag lmo0411 3,8 similar to phosphoenolpyruvate synthase (N-terminal part) 2.1.2 T2 lag lmo0411 2,5 similar to phosphoenolpyruvate synthase (N-terminal part) 2.1.2 T2 sol lmo0411 2,1 similar to phosphoenolpyruvate synthase (N-terminal part) 2.1.2 T1 lag lmo0517 19,4 similar to phosphoglycerate mutase 2.1.2 T2 lag lmo0517 18,8 similar to phosphoglycerate mutase 2.1.2 T2 sol lmo0517 4,3 similar to phosphoglycerate mutase 2.1.2 T2 sol lmo0907 2,6 similar to phosphoglycerate mutase 2.1.2 T1 lag citZ 3,0 highly similar to citrate synthase subunit II 2.1.3 T1 sol argG 2,6 Argininosuccinate synthase 2.2 T2 sol argG 6,1 Argininosuccinate synthase 2.2 T1 lag hisE 2,4 Phosphoribosyl-ATP pyrophosphatase 2.2 T1 lag aroB 6,5 3-dehydroquinate synthase 2.2 T2 lag aroB 5,3 3-dehydroquinate synthase 2.2 T2 lag aroD 5,4 3-dehydroquinate dehydratase 2.2 T1 lag aroA 4,8 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase 2.2 T2 lag aroA 2,1 3-deoxy-D-arabino-heptulosonate 7-phosphate synthase 2.2 T1 lag gcvT 11,9 aminomethyltransferase 2.2 T1 lag dapF 2,6 diaminopimelate epimerase 2.2 T1 sol dapF 18,4 diaminopimelate epimerase 2.2 T2 sol dapF 7,4 diaminopimelate epimerase 2.2 T1 lag dapA 5,3 dihydrodipicolinate synthase 2.2 T1 sol proB 132,9 gamma-glutamyl kinase 2.2 T2 sol pgi 3,5 glucose-6-phosphate isomerase 2.2 T2 lag lmo1711 2,6 highly similar to aminopeptidases 2.2 T1 lag glyA 4,1 highly similar to glycine hydroxymethyltransferase 2.2 T2 lag hom 3,8 highly similar to homoserine dehydrogenase 2.2 T1 lag hisA 2,6 highly similar to phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase 2.2 T1 sol hisA 4,1 highly similar to phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase 2.2 T2 sol hisA 3,6 highly similar to phosphoribosylformimino-5-aminoimidazole carboxamide ribotide isomerase 2.2 T1 lag serC 14,0 highly similar to phosphoserine aminotransferase 2.2 T2 lag thrC 7,1 highly similar to threonine synthase 2.2 T2 lag trpB 2,5 highly similar to tryptophan synthase (beta subunit) 2.2 T1 lag hisB 4,6 imidazoleglycerol-phosphate dehydratase 2.2 T1 lag hisI 2,4 Phosphoribosyl-AMP cyclohydrolase 2.2 T2 lag hisJ 5,4 similar histidinol phosphate phosphatase 2.2 T2 sol hisJ 17,8 similar histidinol phosphate phosphatase 2.2 T2 lag leuA 5,6 similar to 2-isopropylmalate synthase 2.2 T2 lag leuC 8,1 similar to 3-isopropylmalate dehydratase (large subunit) 2.2 T2 lag leuD 3,7 similar to 3-isopropylmalate dehydratase (small subunit) 2.2 T2 lag leuB 9,7 similar to 3-isopropylmalate dehydrogenase 2.2 T2 lag aroE 4,4 similar to 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase 2.2 T2 lag ilvB 4,6 similar to acetolactate synthase (acetohydroxy-acid synthase) (large subunit) 2.2 T1 lag dal 3,8 similar to alanine racemase 2.2 T1 sol hisH 13,5 similar to amidotransferases 2.2 T2 sol hisH 8,0 similar to amidotransferases 2.2 T2 sol lmo1611 2,1 similar to aminopeptidase 2.2 T2 lag lmo0286 7,2 similar to aminotransferase 2.2 T2 sol lmo0286 8,9 similar to aminotransferase 2.2 T2 lag lmo1006 8,0 similar to aminotransferases (to B. subtilis PatA protein) 2.2 T2 sol lmo1375 2,5 similar to aminotripeptidase 2.2 T1 lag hisG 4,8 similar to ATP phosphoribosyltransferase 2.2 T1 sol hisG 10,3 similar to ATP phosphoribosyltransferase 2.2 T2 lag lmo0039 3,2 similar to carbamate kinase 2.2 T2 lag aroF 6,4 similar to chorismate synthase 2.2
195
T2 sol lmo2647 5,6 similar to creatinine amidohydrolase 2.2 T2 sol lmo1968 44,4 similar to creatinine amidohydrolases 2.2 T2 lag lmo1679 4,1 similar to cystathionine beta-lyase 2.2 T2 lag lmo1680 4,9 similar to cystathionine gamma-synthase 2.2 T1 sol ilvD 5,7 similar to dihydroxy-acid dehydratase 2.2 T2 lag ilvD 4,2 similar to dihydroxy-acid dehydratase 2.2 T2 sol lmo2749 4,1 similar to glutamine amidotransferase 2.2 T2 lag lmo0458 4,9 similar to hydantoinase 2.2 T2 lag ilvC 3,1 similar to ketol-acid reductoisomerase (acetohydroxy-acid isomeroreductase) 2.2 T2 lag lmo0538 3,3 similar to N-acyl-L-amino acid amidohydrolase 2.2 T2 sol lmo0537 5,3 similar to N-carbamyl-L-amino acid amidohydrolase 2.2 T1 lag lmo2397 4,2 similar to NifU protein 2.2 T2 lag lmo0595 3,1 similar to O-acetylhomoserine sulfhydrylase 2.2 T2 sol lmo2188 4,7 similar to oligoendopeptidase 2.2 T1 lag lmo1585 2,7 similar to proteases 2.2 T2 lag lmo0961 3,3 similar to proteases 2.2 T1 sol metK 2,9 similar to S-methionine adenosyltransferase 2.2 T2 sol metK 3,8 similar to S-methionine adenosyltransferase 2.2 T1 lag lmo2658 2,3 similar to spermidine/spermine N1-acetyl transferase 2.2 T2 sol lmo2658 4,9 similar to spermidine/spermine N1-acetyl transferase 2.2 T2 lag ilvA 5,1 similar to threonine dehydratase 2.2 T1 lag lmo0820 12,4 some similarity to acatyltransferases 2.2 T1 lag gmk 3,3 guanylate kinase 2.3 T2 lag lmo0280 2,3 highly similar to anaerobic ribonucleotide reductase activator protein 2.3 T1 sol pyrAa 26,1 highly similar to carbamoyl-phosphate synthetase (glutaminase subunit) 2.3 T1 sol pyrD 2,9 highly similar to dihydroorotase dehydrogenase 2.3 T2 sol pyrD 2,9 highly similar to dihydroorotase dehydrogenase 2.3 T1 sol purN 2,8 highly similar to phosphoribosylglycinamide formyltransferases 2.3 T2 sol purN 7,5 highly similar to phosphoribosylglycinamide formyltransferases 2.3 T1 sol deoD 3,2 purine nucleoside phosphorylase 2.3 T2 sol aroE 2,3 similar to 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase 2.3 T1 lag lmo1705 6,1 similar to deoxyguanosine kinase/deoxyadenosine kinase(I) subunit 2.3 T2 sol lmo1705 2,2 similar to deoxyguanosine kinase/deoxyadenosine kinase(I) subunit 2.3 T1 lag dra 2,9 similar to deoxyribose-phosphate aldolase 2.3 T1 lag drm 2,1 similar to phosphopentomutase 2.3 T1 lag udk 2,1 similar to Uridine kinase 2.3 T1 lag lmo1357 5,1 acetyl-CoA carboxylase subunit (biotin carboxylase subunit) 2.4 T1 lag acpP 2,1 acyl carrier protein 2.4 T2 lag plcA 10,9 phosphatidylinositol-specific phospholipase c 2.4 T2 sol deoD 2,6 purine nucleoside phosphorylase 2.4 T1 lag lmo1647 4,7 similar to 1-acylglycerol-3-phosphate O-acyltransferases 2.4 T1 lag lmo1005 6,4 similar to 3-hydroxyisobutyrate dehydrogenase (B. subtilis YkwC protein) 2.4 T1 lag lmo1356 5,8 similar to acetyl-CoA carboxylase subunit (biotin carboxyl carrier subunit) 2.4 T1 lag lmo1464 2,0 similar to diacylglycerol kinase 2.4 T2 lag lmo0354 5,4 similar to fatty-acid--CoA ligase 2.4 T2 sol lmo0354 5,4 similar to fatty-acid--CoA ligase 2.4 T1 lag lmo1292 2,3 similar to glycerophosphodiester phosphodiesterase 2.4 T1 lag acpS 4,0 similar to holo-acyl-carrier protein synthase 2.4 T2 sol lmo2677 10,5 similar to hydrolase (esterase) 2.4 T1 lag lmo0110 14,5 similar to lipase 2.4 T2 lag lmo0110 4,1 similar to lipase 2.4 T2 sol lmo0110 5,1 similar to lipase 2.4 T1 lag lmo0011 3,5 similar to mevalonate diphosphate decarboxylase 2.4 T2 sol lmo0011 3,4 similar to mevalonate diphosphate decarboxylase 2.4 T1 lag lmo0012 2,4 similar to mevalonate kinases 2.4 T1 lag lmo2648 2,1 similar to Phosphotriesterase 2.4 T2 sol lmo2648 3,7 similar to Phosphotriesterase 2.4 T2 sol lmo1970 23,3 similar to putative phosphotriesterase related proteins 2.4 T2 sol lmo2829 6,7 similar to yeast protein Frm2p involved in fatty acid signaling 2.4 T2 lag lmo0494 5,2 weakly similar to esterase 2.4 T1 sol ubiE 2,8 Menaquinone biosynthesis methyltransferase ubiE 2.5 T2 sol gsaB 2,7 glutamate-1-semialdehyde aminotransferase 2.5 T2 sol fabG 6,2 similar to 3-ketoacyl-acyl carrier protein reductase 2.5 T2 sol lmo2022 70,9 similar to a NifS-like protein required for NAD biosynthesis 2.5 T2 sol lmo2572 5,8 similar to Chain A, Dihydrofolate Reductase 2.5 T2 lag lmo1181 3,5 similar to cobalamin adenosyl transferase 2.5 T2 sol lmo1932 4,5 similar to heptaprenyl diphosphate synthase component I 2.5
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T1 lag lmo1042 32,5 similar to molybdopterin biosynthesis protein moeA 2.5 T2 lag lmo1042 2,8 similar to molybdopterin biosynthesis protein moeA 2.5 T2 sol lmo1042 2,6 similar to molybdopterin biosynthesis protein moeA 2.5 T1 lag lmo1045 11,1 similar to molybdopterin converting factor (subunit 1). 2.5 T1 lag lmo1044 16,2 similar to molybdopterin converting factor, subunit 2 2.5 T2 sol lmo1044 4,4 similar to molybdopterin converting factor, subunit 2 2.5 T1 lag lmo1043 18,6 similar to molybdopterin-guanine dinucleotide biosynthesis MobB 2.5 T2 sol lmo1043 3,2 similar to molybdopterin-guanine dinucleotide biosynthesis MobB 2.5 T2 sol lmo2571 3,3 similar to nicotinamidase 2.5 T1 lag lmo1825 3,0 similar to pantothenate metabolism flavoprotein homolog 2.5 T2 sol lmo1825 2,5 similar to pantothenate metabolism flavoprotein homolog 2.5 T2 lag cbiH 4,8 similar to precorrin methylase 2.5 T1 lag lmo0884 5,1 similar to protoporphyrinogen IX and coproporphyrinogen III oxidase (HemY) 2.5 T2 lag nadA 2,2 similar to quinolinate synthetase 2.5 T1 lag lmo1870 17,1 similar to alkaline phosphatase 2.6 T2 sol lmo2540 4,2 similar to phosphatases 2.6 T1 lag lmo1467 4,1 similar to phosphate starvation induced protein PhoH 2.6 T2 lag lmo0339 10,4 weakly similar to inorganic pyrophosphatase 2.6 T2 sol lmo0339 137,5 weakly similar to inorganic pyrophosphatase 2.6 T1 lag lmo1418 4,6 weakly similar to pyrophosphatase 2.6 T1 lag pcrA 3,8 ATP-dependent DNA helicase 3.1 T1 lag dnaA 2,8 Chromosomal replication initiation protein DnaA 3.1 T1 lag dnaB 6,8 chromosome replication initiation / membrane attachment protein DnaB 3.1 T1 lag dnaN 2,7 DNA polymerase III, beta chain 3.1 T1 lag lmo0162 11,7 similar to B. subtilis DNA polymerase III (delta' subunit) 3.1 T1 lag rnhC 2,1 similar to B. subtilis ribonuclease HIII 3.1 T1 lag rnhB 3,8 similar to ribonuclease H rnh 3.1 T1 lag lmo1880 2,5 similar to similar to RNase HI 3.1 T2 lag lmo1880 7,7 similar to similar to RNase HI 3.1 T2 sol lmo1880 24,6 similar to similar to RNase HI 3.1 T2 sol ubiE 2,4 Menaquinone biosynthesis methyltransferase ubiE 3.2 T1 lag uvrB 2,4 excinuclease ABC (subunit B) 3.2 T1 sol uvrB 4,4 excinuclease ABC (subunit B) 3.2 T2 sol uvrB 4,2 excinuclease ABC (subunit B) 3.2 T1 lag uvrC 3,3 highly similar to excinuclease ABC subunit C 3.2 T1 lag lmo1689 3,0 similar to A/G-specific adenine glycosylase 3.2 T2 sol lmo0157 2,1 similar to ATP dependent helicase 3.2 T1 lag lmo1231 2,2 similar to DNA polymerase beta, to B. subtilis YshC protein 3.2 T2 lag lmo1119 36,9 similar to methylases 3.2 T1 lag mfd 2,8 transcription-repair coupling factor 3.2 T2 sol lmo0470 839,3 weakly similar to site-specific DNA-methyltransferase 3.2 T2 lag addB 2,4 similar to ATP-dependent deoxyribonuclease (subunit B) 3.3 T1 lag recU 4,9 similar to DNA repair and homologous recombination protein 3.3 T1 sol recU 3,3 similar to DNA repair and homologous recombination protein 3.3 T2 sol lmo1119 293,2 similar to methylases 3.3 T1 lag gyrA 2,0 DNA gyrase subunit A 3.4 T2 sol sigL 5,0 RNA polymerase sigma-54 factor (sigma-L) 3.5.1 T2 sol lmo2820 5,0 amino-terminal domain similar to transcription regulators 3.5.2 T2 sol lmo0041 4,6 conserved hypothetical protein, hypothetical regulator 3.5.2 T1 lag lmo0229 16,2 highly similar to transcription repressor of class III stress genes (CtsR) 3.5.2 T2 sol lmo0229 4,3 highly similar to transcription repressor of class III stress genes (CtsR) 3.5.2 T2 sol prfA 2,5 listeriolysin positive regulatory protein 3.5.2 T2 lag lmo2329 23,4 similar to a putative repressor protein [Bacteriophage A118] 3.5.2 T2 sol lmo2329 470,3 similar to a putative repressor protein [Bacteriophage A118] 3.5.2 T1 lag lmo0639 2,1 similar to a transcription regulator (surface protein PAg negative regulator par) 3.5.2 T2 sol lmo2324 9,3 similar to anti-repressor [Bacteriophage A118] 3.5.2 T1 lag lmo2518 2,2 similar to B. subtilis putative transcriptional regulator LytR 3.5.2 T2 lag lmo2518 2,3 similar to B. subtilis putative transcriptional regulator LytR 3.5.2 T2 sol lmo2518 4,1 similar to B. subtilis putative transcriptional regulator LytR 3.5.2 T2 sol lmo0816 121,5 similar to B. subtilis regulatory protein PaiA 3.5.2 T1 lag lmo0443 3,3 similar to B. subtilis transcription regulator LytR 3.5.2 T2 lag lmo0443 2,8 similar to B. subtilis transcription regulator LytR 3.5.2 T2 sol lmo0443 9,8 similar to B. subtilis transcription regulator LytR 3.5.2 T1 lag lmo0168 5,0 similar to B. subtilis transcription regulatory protein AbrB 3.5.2 T2 sol lmo0168 6,2 similar to B. subtilis transcription regulatory protein AbrB 3.5.2 T2 sol lysA 44,0 similar to diaminopimelate decarboxylase 3.5.2 T2 lag lmo2795 2,0 similar to E. coli RpiR transcription regulator 3.5.2
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T2 sol lmo2795 4,6 similar to E. coli RpiR transcription regulator 3.5.2 T1 lag lmo2766 4,5 similar to hypothetical transcriptional regulator 3.5.2 T2 sol lmo2766 2,8 similar to hypothetical transcriptional regulator 3.5.2 T1 lag lmo2494 21,0 similar to negative regulator of phosphate regulon 3.5.2 T2 sol lmo0114 2,6 similar to putative repressor C1 from lactococcal bacteriophage Tuc2009 3.5.2 T1 lag lmo0416 3,2 similar to putative transcription regulator 3.5.2 T1 lag lmo2698 4,5 similar to putative transcription regulator 3.5.2 T2 lag lmo2698 3,4 similar to putative transcription regulator 3.5.2 T2 sol lmo0376 3,5 similar to putative transcription regulator 3.5.2 T2 sol lmo2698 6,2 similar to putative transcription regulator 3.5.2 T2 lag lmo0252 10,4 similar to repressor (penicilinase repressor) 3.5.2 T2 sol lmo0252 156,7 similar to repressor (penicilinase repressor) 3.5.2 T2 lag lmo2408 22,2 similar to repressor protein 3.5.2 T2 sol lmo2408 230,9 similar to repressor protein 3.5.2 T2 sol lmo2365 11,0 similar to S. pyogenes RofA regulatory protein 3.5.2 T1 lag lmo2773 2,7 similar to transcription antiterminator 3.5.2 T2 sol lmo2436 2,2 similar to transcription antiterminator 3.5.2 T1 lag lmo0364 2,8 similar to transcription regulator 3.5.2 T1 lag lmo0806 9,5 similar to transcription regulator 3.5.2 T1 lag lmo2796 2,6 similar to transcription regulator 3.5.2 T2 lag lmo0445 25,4 similar to transcription regulator 3.5.2 T2 lag lmo0106 3,5 similar to transcription regulator 3.5.2 T2 lag lmo0520 3,0 similar to transcription regulator 3.5.2 T2 sol lmo0106 5,0 similar to transcription regulator 3.5.2 T2 sol lmo0364 3,1 similar to transcription regulator 3.5.2 T2 sol lmo0445 884,0 similar to transcription regulator 3.5.2 T2 sol lmo0520 6,8 similar to transcription regulator 3.5.2 T2 sol lmo2328 46,1 similar to transcription regulator 3.5.2 T2 sol lmo2796 4,2 similar to transcription regulator 3.5.2 T2 sol lmo0790 2,2 similar to transcription regulator (EbsC from Enterococcus faecalis) 3.5.2 T2 lag lmo0776 2,4 similar to transcription regulator (repressor) 3.5.2 T2 sol lmo0659 4,5 similar to transcription regulator (Rgg type) 3.5.2 T2 sol lmo2731 3,1 similar to transcription regulator (RpiR family) 3.5.2 T1 lag lmo1263 3,6 similar to transcriptional regulator 3.5.2 T2 lag lmo0326 16,7 similar to transcriptional regulators 3.5.2 T2 sol lmo0326 3,2 similar to transcriptional regulators 3.5.2 T1 lag lmo0178 15,8 similar to xylose repressor 3.5.2 T2 lag lmo0178 9,9 similar to xylose repressor 3.5.2 T2 lag lmo0032 3,1 similar to xylose repressor 3.5.2 T2 lag bvrA 59,9 transcription antiterminator 3.5.2 T2 sol bvrA 1587,2 transcription antiterminator 3.5.2 T2 lag lmo0602 2,1 weakly similar to transcription regulator 3.5.2 T2 sol lmo0602 3,6 weakly similar to transcription regulator 3.5.2 T2 sol lmo0513 2,7 weakly similar to transcription regulator 3.5.2 T2 sol lmo2672 6,7 weakly similar to transcription regulator 3.5.2 T2 sol lmo0918 3,1 similar to transcription antiterminator BglG family 3.5.3 T1 lag nusA 3,2 highly similar to N utilization substance protein A (NusA protein) 3.5.4 T1 lag ksgA 12,5 dimethyladenosine transferase (16S rRNA dimethylase) 3.6 T2 sol ksgA 4,3 dimethyladenosine transferase (16S rRNA dimethylase) 3.6 T1 lag lmo1822 2,7 similar to RNA-binding Sun protein 3.6 T1 lag rplK 3,8 ribosomal protein L11 3.7.1 T1 lag rpmE2 5,3 ribosomal protein L31 type B 3.7.1 T1 lag rpmH 3,3 ribosomal protein L34 3.7.1 T1 lag rpmI 2,1 ribosomal protein L35 3.7.1 T1 sol rpsN 6,3 ribosomal protein S14 3.7.1 T2 sol lmo1822 2,4 similar to RNA-binding Sun protein 3.7.1 T2 lag cysS 5,7 cysteinyl-tRNA synthetase 3.7.2 T1 lag gltX 2,1 highly similar to glutamyl-tRNA synthetase 3.7.2 T1 lag hisZ 5,9 histidyl-tRNA synthetase 3.7.2 T1 sol hisZ 6,5 histidyl-tRNA synthetase 3.7.2 T1 lag metS 5,6 methionyl-tRNA synthetase 3.7.2 T2 sol rpsN 2,6 ribosomal protein S14 3.7.2 T1 lag infB 2,4 highly similar to translation initiation factor IF-2 3.7.3 T2 sol lmo2541 2,1 similar to yeast translation initiation protein 3.7.3 T1 lag prfC 2,2 Peptide chain release factor 3 3.7.5 T1 lag pth 2,6 similar to peptidyl-tRNA hydrolase 3.7.5 T2 sol prmA 3,0 ribosomal protein L11 methyltransferase 3.8
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T2 sol lmo0067 182,5 similar to dinitrogenase reductase ADP-ribosylation system 3.8 T2 sol lmo1274 6,8 similar to polypeptide deformylase, similar to B. subtilis Smf protein 3.8 T1 lag lmo1800 2,4 similar to protein-tyrosine phosphatase 3.8 T2 lag lmo1800 12,7 similar to protein-tyrosine phosphatase 3.8 T2 sol lmo0938 4,4 similar to protein-tyrosine-phosphatase 3.8 T2 lag lmo1698 3,5 similar to ribosomal-protein-alanine N-acetyltransferase 3.8 T1 lag lmo1308 2,5 weakly similar to arginine N-methyltransferases 3.8 T1 lag tig 4,2 trigger factor (prolyl isomerase) 3.9 T1 lag rsbS 4,0 highly similar to negative regulation of sigma-B activity 4.1 T1 lag rsbT 3,7 highly similar to positive regulation of sigma-B activity 4.1 T1 lag RsbR 5,0 highly similar to positive regulator of sigma-B activity 4.1 T2 lag rsbU 3,0 highly similar to serine phosphatase RsbU 4.1 T2 lag rsbX 2,6 Indirect negative regulation of sigma B dependant gene expression (serine phosphatase) 4.1 T2 sol rsbX 2,0 Indirect negative regulation of sigma B dependant gene expression (serine phosphatase) 4.1 T2 sol ltrA 3,5 low temperature requirement protein A 4.1 T1 lag cspD 165,9 similar to cold shock protein 4.1 T1 lag cspL 7,9 similar to cold shock protein 4.1 T2 sol lmo0609 5,7 similar to E. coli phage shock protein E 4.1 T2 sol lmo1433 4,1 similar to glutathione reductase 4.1 T1 lag lmo0942 12,9 similar to heat shock protein HtpG 4.1 T1 sol lmo0942 124,8 similar to heat shock protein HtpG 4.1 T2 lag lmo0942 3,4 similar to heat shock protein HtpG 4.1 T2 sol lmo0942 13,7 similar to heat shock protein HtpG 4.1 T2 sol lmo1308 2,5 weakly similar to arginine N-methyltransferases 4.1 T2 sol rsbW 2,1 anti-anti-sigma factor (antagonist of RsbW) 4.2 T2 lag lmo1297 2,4 similar to aluminum resistance protein and to B. subtilis YnbB protein (hypothetical) 4.2 T2 lag lmo2230 2,2 similar to arsenate reductase 4.2 T1 lag lmo1400 3,0 similar to N-acetyltransferase 4.2 T2 sol lmo0446 46,4 similar to penicillin acylase and to conjugated bile acid hydrolase 4.2 T2 sol lmo0253 321,6 similar to penicillinase antirepressor 4.2 T2 lag lmo0754 2,0 weakly similar to a bile acid 7-alpha dehydratase 4.2 T2 sol lmo0754 3,5 weakly similar to a bile acid 7-alpha dehydratase 4.2 T2 sol lmo0395 2,2 weakly similar to blasticidin S-acetyltransferase 4.2 T2 sol lmo2291 46,4 major tail shaft protein [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo2293 65,4 Protein gp10 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo2292 63,2 Protein gp11 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo2290 34,9 Protein gp13 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 lag lmo2289 7,4 Protein gp14 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo2289 14,9 Protein gp14 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo2288 18,8 Protein gp15 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo2286 48,7 Protein gp17 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo2284 48,3 Protein gp19 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo2283 46,9 protein gp20 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo2282 4,5 protein gp21 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo2280 13,8 protein gp23 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 lag lmo2275 30,8 Protein gp28 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo2275 490,7 Protein gp28 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 lag lmo2274 22,8 protein gp29 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo2274 457,4 protein gp29 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 lag lmo2273 11,0 protein gp30 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo2273 423,2 protein gp30 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo2298 74,7 Protein gp4 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 lag lmo2303 2,6 Protein gp66 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo2295 43,4 Protein gp8 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 lag lmo2294 7,0 Protein gp9 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo2294 50,9 Protein gp9 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo2299 124,8 putative portal protein [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo2297 44,5 putative scaffolding protein [Bacteriophage A118] 4.3 T2 lag lmo2287 21,1 putative tape-measure [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo2287 109,5 putative tape-measure [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo2300 60,8 putative terminase large subunit from Bacteriophage A118 4.3 T2 sol lmo2313 18,7 similar to a bacteriophage protein 4.3 T2 lag lmo2276 68,0 similar to an unknown bacteriophage protein 4.3 T2 sol lmo2276 396,8 similar to an unknown bacteriophage protein 4.3 T2 lag lmo0121 2,5 similar to bacteriophage minor tail proteins 4.3 T2 sol lmo0121 2,5 similar to bacteriophage minor tail proteins 4.3 T2 sol lmo2296 69,8 similar to coat protein [Bacteriophage SPP1] 4.3
199
T2 lag lmo2306 3,8 similar to phage protein 4.3 T2 lag lmo0122 2,9 similar to phage proteins 4.3 T2 sol lmo0122 2,6 similar to phage proteins 4.3 T2 lag lmo0123 2,6 similar to protein gp18 from Bacteriophage A118 4.3 T2 sol lmo0123 2,7 similar to protein gp18 from Bacteriophage A118 4.3 T2 lag lmo2330 15,1 similar to protein gp33 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo2330 162,6 similar to protein gp33 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo0113 2,4 similar to protein gp35 from Bacteriophage A118 4.3 T2 sol lmo2326 88,8 similar to protein gp41 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 lag lmo2315 2,6 similar to protein gp51 [Bacteriophage A118] 4.3 T2 sol lmo2301 34,3 similar to putative terminase small subunit from Bacteriophage A118 4.3 T2 sol lmo2331 71,5 weakly similar to gp32_Bacteriophage A118 protein 4.3 T2 lag lmo0127 2,8 weakly similar to protein gp20 from Bacteriophage A118 4.3 T2 sol lmo0127 8,6 weakly similar to protein gp20 from Bacteriophage A118 4.3 T2 sol lmo1103 7,5 highly similar to TN916 ORF13 4.4 T2 sol lmo1105 36,6 highly similar to TN916 ORF15 4.4 T2 sol lmo1106 23,9 highly similar to TN916 ORF16 4.4 T2 sol lmo1107 6,7 highly similar to TN916 ORF17 4.4 T2 sol lmo1108 9,5 highly similar to TN916 ORF18 4.4 T2 sol lmo1109 5,4 highly similar to TN916 ORF19 4.4 T2 sol lmo1111 17,5 highly similar to TN916 ORF20 4.4 T2 sol lmo1113 93,2 highly similar to TN916 ORF22 4.4 T2 sol lmo1114 51,4 highly similar to TN916 ORF23 4.4 T2 sol lmo1098 6,5 highly similar to TN916 ORF8 4.4 T2 sol lmo1099 18,0 similar to a protein encoded by Tn916 4.4 T2 lag lmo1097 30,7 similar to integrases 4.4 T2 sol lmo0174 58,5 similar to transposase 4.4 T2 sol lmo0330 29,8 similar to transposase 4.4 T2 lag lmo0464 2,7 weakly similar to transposase 4.4 T2 sol lmo0028 56,9 similar to E. coli microcin C7 self-immunity protein (MccF) 4.5 T2 lag lmo0066 4,2 similar to toxin components 4.5 T2 sol lmo0066 2,7 similar to toxin components 4.5 T2 sol lmo0439 20,9 weakly similar to a module of peptide synthetase 4.5 T2 lag lmo2394 41,0 hypothetical CDS 5.1 T2 sol lmo2394 3,7 hypothetical CDS 5.1 T2 sol lmo0085 4,4 hypothetical protein lmo0085 5.1 T2 lag lmo0086 2,6 hypothetical protein lmo0086 5.1 T2 lag lmo0087 3,6 hypothetical protein lmo0087 5.1 T2 sol lmo0087 3,1 hypothetical protein lmo0087 5.1 T2 lag lmo0142 10,4 hypothetical protein lmo0142 5.1 T2 sol lmo0142 34,0 hypothetical protein lmo0142 5.1 T2 sol lmo0148 17,1 hypothetical protein lmo0148 5.1 T2 lag lmo0156 5,1 hypothetical protein lmo0156 5.1 T2 sol lmo0156 4,8 hypothetical protein lmo0156 5.1 T2 lag lmo0274 8,9 hypothetical protein lmo0274 5.1 T2 sol lmo0274 3,8 hypothetical protein lmo0274 5.1 T2 sol lmo0335 14,0 hypothetical protein lmo0335 5.1 T1 lag lmo0417 3,5 hypothetical protein lmo0417 5.1 T1 lag lmo0449 2,8 hypothetical protein lmo0449 5.1 T2 lag lmo0449 2,5 hypothetical protein lmo0449 5.1 T2 sol lmo0449 3,1 hypothetical protein lmo0449 5.1 T2 lag lmo0472 34,9 hypothetical protein lmo0472 5.1 T2 sol lmo0472 652,9 hypothetical protein lmo0472 5.1 T2 sol lmo0475 3,0 hypothetical protein lmo0475 5.1 T2 sol lmo0548 5,5 hypothetical protein lmo0548 5.1 T2 sol lmo0628 3,8 hypothetical protein lmo0628 5.1 T2 lag lmo0804 35,0 hypothetical protein lmo0804 5.1 T2 sol lmo0804 508,3 hypothetical protein lmo0804 5.1 T2 lag lmo0805 20,2 hypothetical protein lmo0805 5.1 T2 sol lmo0805 520,0 hypothetical protein lmo0805 5.1 T1 lag lmo0834 3,9 hypothetical protein lmo0833 5.1 T2 lag lmo0834 21,1 hypothetical protein lmo0833 5.1 T2 sol lmo0834 3,5 hypothetical protein lmo0833 5.1 T1 lag lmo0952 4,4 hypothetical protein lmo0952 5.1 T2 sol lmo0952 2,9 hypothetical protein lmo0952 5.1 T2 sol lmo1120 3,5 hypothetical protein lmo1120 5.1 T1 lag lmo1247 2,1 hypothetical protein lmo1247 5.1
200
T1 lag lmo2079 2,9 hypothetical protein lmo2079 5.1 T2 lag lmo2409 8,7 hypothetical protein lmo2409 5.1 T2 sol lmo2409 102,9 hypothetical protein lmo2409 5.1 T1 lag lmo2416 8,3 hypothetical protein lmo2416 5.1 T1 lag lmo2809 3,7 hypothetical secreted protein 5.1 T2 sol lmo2805 12,0 hypothetical secreted protein 5.1 T2 sol lmo2806 11,7 hypothetical secreted protein 5.1 T2 sol lmo2807 9,3 hypothetical secreted protein 5.1 T2 sol ispF 2,2 2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase 5.2 T1 lag hslO 3,9 33 kDa chaperonin 5.2 T1 sol hslO 19,2 33 kDa chaperonin 5.2 T1 lag spxA 3,4 Regulatory protein spx 5.2 T2 lag lmo0605 3,3 conserved hypothetical membrane protein 5.2 T2 sol lmo0605 5,9 conserved hypothetical membrane protein 5.2 T1 lag lmo0796 2,5 conserved hypothetical protein 5.2 T1 lag lmo0003 2,5 conserved hypothetical protein 5.2 T1 lag lmo0165 3,1 conserved hypothetical protein 5.2 T1 lag lmo0276 6,2 conserved hypothetical protein 5.2 T1 lag lmo0599 12,4 conserved hypothetical protein 5.2 T1 lag lmo0614 2,2 conserved hypothetical protein 5.2 T1 lag lmo0656 6,2 conserved hypothetical protein 5.2 T1 lag lmo0844 2,1 conserved hypothetical protein 5.2 T1 lag lmo0991 53,4 conserved hypothetical protein 5.2 T1 lag lmo0992 6,6 conserved hypothetical protein 5.2 T1 lag lmo1004 6,6 conserved hypothetical protein 5.2 T1 lag lmo1301 5,1 conserved hypothetical protein 5.2 T1 lag lmo1419 5,8 conserved hypothetical protein 5.2 T1 lag lmo2359 2,8 conserved hypothetical protein 5.2 T1 lag lmo2579 2,5 conserved hypothetical protein 5.2 T2 lag lmo1301 141,3 conserved hypothetical protein 5.2 T2 lag lmo0991 12,5 conserved hypothetical protein 5.2 T2 lag lmo0030 3,2 conserved hypothetical protein 5.2 T2 lag lmo0515 3,2 conserved hypothetical protein 5.2 T2 lag lmo0420 2,8 conserved hypothetical protein 5.2 T2 lag lmo0077 2,6 conserved hypothetical protein 5.2 T2 lag lmo2736 2,0 conserved hypothetical protein 5.2 T2 sol lmo0158 2,4 conserved hypothetical protein 5.2 T2 sol lmo0282 5,0 conserved hypothetical protein 5.2 T2 sol lmo0313 147,8 conserved hypothetical protein 5.2 T2 sol lmo0420 2,6 conserved hypothetical protein 5.2 T2 sol lmo0444 495,1 conserved hypothetical protein 5.2 T2 sol lmo0614 2,4 conserved hypothetical protein 5.2 T2 sol lmo0844 2,3 conserved hypothetical protein 5.2 T2 sol lmo1301 2493,5 conserved hypothetical protein 5.2 T2 sol lmo2359 16,1 conserved hypothetical protein 5.2 T2 sol lmo2577 2,8 conserved hypothetical protein 5.2 T2 sol lmo2579 4,2 conserved hypothetical protein 5.2 T2 sol lmo2602 10,7 conserved hypothetical protein 5.2 T2 sol lmo2670 4,9 conserved hypothetical protein 5.2 T2 sol lmo2736 2,7 conserved hypothetical protein 5.2 T2 sol lmo0581 3,0 conserved hypothetical protein 5.2 T1 lag lmo0454 5,2 conserved hypothetical protein similar to B. subtilis YeaC 5.2 T2 sol lmo0454 3,4 conserved hypothetical protein similar to B. subtilis YeaC 5.2 T2 sol lmo2391 4,4 conserved hypothetical protein similar to B. subtilis YhfK protein 5.2 T2 sol lmo0367 123,0 conserved hypothetical protein similar to B. subtilis YwbN protein 5.2 T1 lag lmo0272 3,1 conserved hypothetical protein similar to B. subtilis YxeH protein 5.2 T1 lag lmo2738 4,4 conserved hypothetical protein similar to hypothetical hemolysin 5.2 T2 sol lmo2738 3,3 conserved hypothetical protein similar to hypothetical hemolysin 5.2 T1 lag lmo1324 3,7 conserved hypothetical protein, similar to B. subtilis YlxQ protein 5.2 T2 sol lmo0453 4,6 conserved hypothetical proteins 5.2 T2 sol lmo0215 4,1 conserved membrane-spanning protein 5.2 T1 lag coaE 3,2 Dephospho-CoA kinase 5.2 T2 lag lmo2835 3,8 highly similar to an E. coli protein 5.2 T1 lag lmo2853 7,6 highly similar to B. subtilis Jag protein 5.2 T2 sol lmo2853 3,2 highly similar to B. subtilis Jag protein 5.2 T2 lag lmo0061 5,6 highly similar to B. subtilis YukA protein 5.2 T1 lag lmo1417 4,4 highly similar to B. subtilis YxiO protein 5.2
201
T2 lag lmo1417 2,5 highly similar to B. subtilis YxiO protein 5.2 T2 lag lmo0019 4,8 hypothetical protein lmo0019 5.2 T2 sol lmo0019 11,5 hypothetical protein lmo0019 5.2 T2 sol lmo0047 2,7 hypothetical protein lmo0047 5.2 T2 lag lmo0079 3,5 hypothetical protein lmo0079 5.2 T2 sol lmo0079 2,2 hypothetical protein lmo0079 5.2 T2 sol lmo0102 2,3 hypothetical protein lmo0102 5.2 T2 lag lmo0119 3,0 hypothetical protein lmo0119 5.2 T2 sol lmo0119 2,9 hypothetical protein lmo0119 5.2 T2 lag lmo0120 3,3 hypothetical protein lmo0120 5.2 T2 sol lmo0120 2,9 hypothetical protein lmo0120 5.2 T1 lag lmo0161 2,2 hypothetical protein lmo0161 5.2 T2 sol lmo0161 19,7 hypothetical protein lmo0161 5.2 T1 lag lmo0163 8,2 hypothetical protein lmo0163 5.2 T1 lag lmo0170 4,6 hypothetical protein lmo0170 5.2 T2 lag lmo0170 2,1 hypothetical protein lmo0170 5.2 T2 sol lmo0170 37,8 hypothetical protein lmo0170 5.2 T2 sol lmo0304 12,4 hypothetical protein lmo0304 5.2 T2 lag lmo0341 30,2 hypothetical protein lmo0341 5.2 T2 sol lmo0341 1029,8 hypothetical protein lmo0341 5.2 T1 lag lmo0408 2,7 hypothetical protein lmo0408 5.2 T2 lag lmo0408 4,5 hypothetical protein lmo0408 5.2 T2 sol lmo0408 6,4 hypothetical protein lmo0408 5.2 T2 lag lmo0471 349,1 hypothetical protein lmo0471 5.2 T2 sol lmo0471 3869,6 hypothetical protein lmo0471 5.2 T2 sol lmo0483 2,0 hypothetical protein lmo0483 5.2 T2 sol lmo0525 162,5 hypothetical protein lmo0525 5.2 T2 lag lmo0530 2,1 hypothetical protein lmo0530 5.2 T2 sol lmo0577 2,3 hypothetical protein lmo0577 5.2 T2 sol lmo0589 2,1 hypothetical protein lmo0589 5.2 T1 lag lmo0600 13,3 hypothetical protein lmo0600 5.2 T2 lag lmo0600 3,5 hypothetical protein lmo0600 5.2 T2 sol lmo0600 4,2 hypothetical protein lmo0600 5.2 T1 lag lmo0629 2,9 hypothetical protein lmo0629 5.2 T2 lag lmo0670 3,0 hypothetical protein lmo0670 5.2 T2 sol lmo0670 4,3 hypothetical protein lmo0670 5.2 T2 sol lmo0737 164,4 hypothetical protein lmo0737 5.2 T2 sol lmo0765 18,4 hypothetical protein lmo0765 5.2 T2 sol lmo0788 3,5 hypothetical protein lmo0788 5.2 T1 lag lmo0812 2,3 hypothetical protein lmo0812 5.2 T2 lag lmo0831 2,6 hypothetical protein lmo0831 5.2 T2 sol lmo0869 2,4 hypothetical protein lmo0869 5.2 T2 sol lmo0870 3,1 hypothetical protein lmo0870 5.2 T1 lag lmo0900 3,3 hypothetical protein lmo0900 5.2 T2 lag lmo0900 5,2 hypothetical protein lmo0900 5.2 T2 lag lmo0911 2,0 hypothetical protein lmo0911 5.2 T2 sol lmo0911 13,3 hypothetical protein lmo0911 5.2 T1 lag lmo0940 5,7 hypothetical protein lmo0940 5.2 T2 sol lmo0940 111,3 hypothetical protein lmo0940 5.2 T1 lag lmo0941 8,4 hypothetical protein lmo0941 5.2 T2 lag lmo0941 6,5 hypothetical protein lmo0941 5.2 T2 sol lmo0941 141,7 hypothetical protein lmo0941 5.2 T1 lag lmo0950 3,2 hypothetical protein lmo0950 5.2 T1 lag lmo0951 4,7 hypothetical protein lmo0951 5.2 T2 sol lmo1094 8,4 hypothetical protein lmo1094 5.2 T2 sol lmo1125 31,4 hypothetical protein lmo1125 5.2 T2 sol lmo1140 15,6 hypothetical protein lmo1140 5.2 T2 lag lmo1241 4,2 hypothetical protein lmo1241 5.2 T2 sol lmo1241 2,1 hypothetical protein lmo1241 5.2 T1 lag lmo1243 3,1 hypothetical protein lmo1243 5.2 T2 sol lmo1258 121,0 hypothetical protein lmo1258 5.2 T2 lag lmo1266 3,7 hypothetical protein lmo1266 5.2 T2 lag lmo1311 2,7 hypothetical protein lmo1311 5.2 T1 lag lmo1382 5,7 hypothetical protein lmo1382 5.2 T2 lag lmo1382 3,7 hypothetical protein lmo1382 5.2 T2 sol lmo1443 6,8 hypothetical protein lmo1443 5.2 T1 lag lmo1714 2,7 hypothetical protein lmo1714 5.2
202
T2 sol lmo1781 3,5 hypothetical protein lmo1781 5.2 T1 lag lmo2084 3,3 hypothetical protein lmo2084 5.2 T2 sol sepA 9,1 hypothetical protein lmo2157 5.2 T2 lag lmo2161 4,3 hypothetical protein lmo2161 5.2 T2 sol lmo2272 47,1 hypothetical protein lmo2272 5.2 T1 lag lmo2368 5,1 hypothetical protein lmo2368 5.2 T2 sol lmo2368 3,7 hypothetical protein lmo2368 5.2 T2 sol lmo2410 278,5 hypothetical protein lmo2410 5.2 T2 lag lmo2437 3,6 hypothetical protein lmo2437 5.2 T1 lag lmo2439 2,9 hypothetical protein lmo2439 5.2 T2 lag lmo2439 6,7 hypothetical protein lmo2439 5.2 T2 lag lmo2442 2,3 hypothetical protein lmo2442 5.2 T1 lag lmo2491 2,7 hypothetical protein lmo2491 5.2 T1 lag lmo2502 4,2 hypothetical protein lmo2502 5.2 T2 lag lmo2502 2,6 hypothetical protein lmo2502 5.2 T2 sol lmo2502 2,2 hypothetical protein lmo2502 5.2 T2 sol lmo2570 2,7 hypothetical protein lmo2570 5.2 T1 lag lmo2578 2,5 hypothetical protein lmo2578 5.2 T2 sol lmo2578 2,3 hypothetical protein lmo2578 5.2 T2 lag lmo2603 16,3 hypothetical protein lmo2603 5.2 T2 sol lmo2603 453,0 hypothetical protein lmo2603 5.2 T2 lag lmo2604 28,9 hypothetical protein lmo2604 5.2 T2 sol lmo2604 185,1 hypothetical protein lmo2604 5.2 T1 lag lmo2640 2,2 hypothetical protein lmo2640 5.2 T2 lag lmo2644 10,4 hypothetical protein lmo2644 5.2 T2 sol lmo2644 745,4 hypothetical protein lmo2644 5.2 T2 lag lmo2697 3,6 hypothetical protein lmo2697 5.2 T1 lag lmo2732 3,9 hypothetical protein lmo2732 5.2 T2 sol lmo2732 2,7 hypothetical protein lmo2732 5.2 T1 lag lmo2767 4,3 hypothetical protein lmo2767 5.2 T2 sol lmo2767 2,2 hypothetical protein lmo2767 5.2 T2 sol bvrC 48,5 hypothetical protein lmo2786 5.2 T1 lag lmo2852 10,4 hypothetical protein lmo2852 5.2 T2 sol lmo2852 7,0 hypothetical protein lmo2852 5.2 T2 sol lmo0477 58,2 putative secreted protein 5.2 T2 sol lmo0478 141,1 putative secreted protein 5.2 T2 sol lmo0479 64,1 putative secreted protein 5.2 T1 lag mraW 2,5 S-adenosyl-L-methionine-dependent methyltransferase mraW 5.2 T2 lag lmo0590 4,5 similar to a fusion of two types of conserved hypothetical proteinconserved hypothetical 5.2 T1 lag lmo0056 2,1 similar to a small heat shock protein of Clostridium acetobutylicum 5.2 T2 sol lmo2823 2,3 similar to an hypothetical protein from Thermotoga maritima 5.2 T1 lag lmo2590 11,9 similar to ATP binding proteins 5.2 T2 lag lmo2590 3,0 similar to ATP binding proteins 5.2 T1 lag lmo2490 2,4 similar to B. subtilis CsbA protein 5.2 T2 sol lmo2490 2,8 similar to B. subtilis CsbA protein 5.2 T1 lag lmo1001 4,5 similar to B. subtilis protein YkvS 5.2 T2 lag lmo2748 5,5 similar to B. subtilis stress protein YdaG 5.2 T2 sol lmo2748 21,5 similar to B. subtilis stress protein YdaG 5.2 T2 sol lmo2701 5,0 similar to B. subtilis YaaL protein 5.2 T2 lag lmo0186 4,1 similar to B. subtilis YabE protein 5.2 T2 sol lmo0186 2,7 similar to B. subtilis YabE protein 5.2 T1 lag lmo0230 9,2 similar to B. subtilis YacH protein 5.2 T2 sol lmo0230 4,5 similar to B. subtilis YacH protein 5.2 T2 sol lmo0242 3,0 similar to B. subtilis Yacp protein 5.2 T1 lag lmo0883 3,2 similar to B. subtilis YbtB protein 5.2 T2 lag lmo0883 2,2 similar to B. subtilis YbtB protein 5.2 T2 sol lmo0883 3,9 similar to B. subtilis YbtB protein 5.2 T2 sol lmo0921 3,5 similar to B. subtilis YcgQ protein 5.2 T2 sol lmo0920 2,4 similar to B. subtilis YcgR protein 5.2 T1 lag lmo0882 2,8 similar to B. subtilis YdbS protein 5.2 T1 lag lmo0887 2,9 similar to B. subtilis YdcD protein 5.2 T1 lag lmo1242 2,5 similar to B. subtilis YdeI protein 5.2 T2 lag lmo1242 2,7 similar to B. subtilis YdeI protein 5.2 T2 sol lmo1242 6,1 similar to B. subtilis YdeI protein 5.2 T1 lag lmo1050 2,5 similar to B. subtilis YdfE protein 5.2 T2 lag lmo1079 23,6 similar to B. subtilis YfhO protein 5.2 T2 sol lmo1079 467,8 similar to B. subtilis YfhO protein 5.2
203
T2 sol lmo0387 2,2 similar to B. subtilis YhdG protein 5.2 T1 lag lmo1019 6,6 similar to B. subtilis YitL protein 5.2 T1 lag lmo0976 8,0 similar to B. subtilis YjcF protein 5.2 T2 lag lmo0976 2,9 similar to B. subtilis YjcF protein 5.2 T1 lag lmo0977 10,3 similar to B. subtilis YjcH protein 5.2 T2 lag lmo0977 3,5 similar to B. subtilis YjcH protein 5.2 T1 lag lmo1323 3,7 similar to B. subtilis YlxR protein 5.2 T1 lag lmo0944 4,8 similar to B. subtilis YneR protein 5.2 T1 lag lmo1337 4,8 similar to B. subtilis yqgP 5.2 T1 lag lmo1338 4,6 similar to B. subtilis yqgQ 5.2 T1 lag lmo1353 3,4 similar to B. subtilis YqhQ protein 5.2 T1 lag lmo1358 5,5 similar to B. subtilis YqhY protein 5.2 T2 lag lmo1358 2,1 similar to B. subtilis YqhY protein 5.2 T1 lag lmo2585 13,3 similar to B. subtilis YrhD protein 5.2 T2 lag lmo2585 52,4 similar to B. subtilis YrhD protein 5.2 T2 sol lmo2585 6,6 similar to B. subtilis YrhD protein 5.2 T1 lag lmo1229 4,8 similar to B. subtilis YshA protein 5.2 T1 lag lmo1230 6,6 similar to B. subtilis YshB protein 5.2 T1 lag lmo0871 2,6 similar to B. subtilis YtcD protein 5.2 T2 sol lmo2344 4,8 similar to B. subtilis YtnI protein 5.2 T2 lag lmo0057 7,2 similar to B. subtilis YueB protein 5.2 T2 lag lmo0060 9,2 similar to B. subtilis YukC protein 5.2 T2 sol lmo2406 3,7 similar to B. subtilis YunF protein 5.2 T1 lag lmo0604 4,2 similar to B. subtilis YvlA protein 5.2 T2 lag lmo0604 8,3 similar to B. subtilis YvlA protein 5.2 T2 lag lmo0724 2,3 similar to B. subtilis YvpB protein 5.2 T2 lag lmo0406 2,9 similar to B. subtilis YyaH protein 5.2 T2 sol lmo0406 2,2 similar to B. subtilis YyaH protein 5.2 T1 lag lmo0289 2,9 similar to B. subtilis YycH protein 5.2 T2 sol lmo0289 2,3 similar to B. subtilis YycH protein 5.2 T2 lag lmo0290 3,1 similar to B. subtilis YycI protein 5.2 T2 sol lmo0290 2,5 similar to B. subtilis YycI protein 5.2 T1 lag lmo0793 2,6 similar to conserved hypothetical protein 5.2 T1 lag lmo1828 3,6 similar to conserved hypothetical protein 5.2 T1 lag lmo2699 2,2 similar to conserved hypothetical protein 5.2 T2 sol lmo0365 21,9 similar to conserved hypothetical protein 5.2 T2 sol lmo2699 5,1 similar to conserved hypothetical protein 5.2 T2 sol lmo1662 2,5 similar to conserved hypothetical protein 5.2 T1 lag lmo0185 3,8 similar to conserved hypothetical proteins 5.2 T1 lag lmo1845 3,6 similar to conserved hypothetical proteins 5.2 T1 lag lmo1854 2,1 similar to conserved hypothetical proteins 5.2 T1 lag lmo1865 9,4 similar to conserved hypothetical proteins 5.2 T1 lag lmo1890 4,0 similar to conserved hypothetical proteins 5.2 T2 lag lmo1661 4,2 similar to conserved hypothetical proteins 5.2 T2 lag lmo1029 2,7 similar to conserved hypothetical proteins 5.2 T2 lag lmo1845 2,7 similar to conserved hypothetical proteins 5.2 T2 sol lmo0185 2,5 similar to conserved hypothetical proteins 5.2 T2 sol lmo0789 4,0 similar to conserved hypothetical proteins 5.2 T2 sol lmo1865 4,9 similar to conserved hypothetical proteins 5.2 T1 lag lmo1858 3,0 similar to dehydogenases and hypothetical proteins 5.2 T2 lag lmo1858 2,1 similar to dehydogenases and hypothetical proteins 5.2 T2 lag lmo0042 2,6 similar to E. coli DedA protein 5.2 T2 sol lmo0042 3,8 similar to E. coli DedA protein 5.2 T1 lag lmo1309 2,9 similar to E. coli YbdM protein 5.2 T2 sol lmo0133 34,4 similar to E. coli YjdI protein 5.2 T2 sol lmo0134 36,9 similar to E. coli YjdJ protein 5.2 T1 lag lmo1864 4,7 similar to hemolysinIII proteins, putative integral membrane protein 5.2 T1 lag lmo2216 3,0 similar to histidine triad (HIT) protein 5.2 T1 lag lmo0998 3,7 similar to hypothetical protein 5.2 T1 lag lmo1715 2,0 similar to hypothetical proteins 5.2 T1 lag lmo1726 3,2 similar to hypothetical proteins 5.2 T1 lag lmo1862 2,6 similar to hypothetical proteins 5.2 T2 lag lmo1031 6,3 similar to hypothetical proteins 5.2 T2 sol lmo0757 4,5 similar to hypothetical proteins 5.2 T2 sol lmo1717 52,5 similar to hypothetical proteins 5.2 T2 sol lmo2043 2,7 similar to integral membrane proteins 5.2 T2 sol lmo0648 3,0 similar to membrane proteins 5.2
204
T2 lag lmo0495 5,0 similar to transmembrane protein 5.2 T2 lag lmo0591 2,4 similar to unknown membrane proteins 5.2 T2 sol lmo0591 3,6 similar to unknown membrane proteins 5.2 T1 lag lmo1213 6,0 similar to unknown protein 5.2 T1 lag lmo1385 2,5 similar to unknown protein 5.2 T1 lag lmo1514 2,1 similar to unknown protein 5.2 T1 lag lmo1595 5,3 similar to unknown protein 5.2 T1 lag lmo1753 6,2 similar to unknown protein 5.2 T1 lag lmo2208 3,9 similar to unknown protein 5.2 T1 lag lmo2217 3,4 similar to unknown protein 5.2 T2 lag lmo2177 22,7 similar to unknown protein 5.2 T2 lag lmo0666 2,4 similar to unknown protein 5.2 T2 lag lmo0419 2,1 similar to unknown protein 5.2 T2 sol lmo0255 22,8 similar to unknown protein 5.2 T2 sol lmo0309 36,3 similar to unknown protein 5.2 T2 sol lmo0626 3,3 similar to unknown protein 5.2 T2 sol lmo0688 2,2 similar to unknown protein 5.2 T2 sol lmo1771 2,8 similar to unknown protein 5.2 T2 sol lmo2177 371,5 similar to unknown protein 5.2 T2 sol lmo2208 2,2 similar to unknown protein 5.2 T2 sol lmo2228 2,9 similar to unknown protein 5.2 T2 sol lmo2357 2,5 similar to unknown protein 5.2 T2 sol lmo1798 2,8 similar to unknown protein 5.2 T1 lag lmo2245 3,3 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo0323 2,5 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo0646 10,8 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo0755 5,4 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo1408 3,0 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo1430 3,0 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo1434 4,2 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo1466 2,9 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo1489 5,1 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo1491 6,5 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo1528 7,2 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo1584 2,1 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo1613 2,1 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo1614 2,6 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo1842 3,2 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo1913 2,3 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo1914 2,9 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo1920 2,1 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo1922 4,6 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo1941 4,9 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo1979 2,9 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo1981 2,3 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo1982 4,7 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo2017 2,6 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo2056 5,9 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo2087 2,1 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo2148 3,9 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo2232 6,2 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo2246 3,0 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo2260 5,0 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo2261 2,4 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo2262 6,1 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo2595 2,4 similar to unknown proteins 5.2 T1 sol lmo0397 9,7 similar to unknown proteins 5.2 T2 lag lmo1941 8,9 similar to unknown proteins 5.2 T2 lag lmo2162 7,1 similar to unknown proteins 5.2 T2 lag lmo0457 5,3 similar to unknown proteins 5.2 T2 lag lmo1914 4,9 similar to unknown proteins 5.2 T2 lag lmo1612 4,0 similar to unknown proteins 5.2 T2 lag lmo1913 3,9 similar to unknown proteins 5.2 T2 lag lmo2245 3,8 similar to unknown proteins 5.2 T2 lag lmo2174 3,2 similar to unknown proteins 5.2 T2 lag lmo0321 3,1 similar to unknown proteins 5.2 T2 lag lmo1495 2,9 similar to unknown proteins 5.2
205
T2 lag lmo2160 2,8 similar to unknown proteins 5.2 T2 lag lmo2264 2,7 similar to unknown proteins 5.2 T2 lag lmo0755 2,6 similar to unknown proteins 5.2 T2 lag lmo0596 2,4 similar to unknown proteins 5.2 T2 lag lmo0646 2,4 similar to unknown proteins 5.2 T2 lag lmo0481 2,3 similar to unknown proteins 5.2 T2 lag lmo0455 2,3 similar to unknown proteins 5.2 T2 lag lmo2844 2,2 similar to unknown proteins 5.2 T2 lag lmo0260 2,2 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo0596 2,6 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo0260 4,1 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo0312 120,2 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo0321 7,5 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo0322 47,1 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo0323 4,2 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo0353 119,7 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo0397 9,8 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo0436 31,1 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo0450 3,3 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo0452 4,4 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo0455 2,1 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo0481 3,2 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo0624 3,0 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo0652 3,2 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo0661 5,2 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo0763 2,2 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo1110 7,4 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo1212 2,2 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo1584 5,9 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo1614 4,5 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo1790 2,2 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo1909 6,3 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo2017 2,7 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo2070 2,3 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo2087 3,2 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo2149 3,0 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo2162 2,3 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo2174 9,2 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo2221 15,8 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo2232 2,7 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo2245 3,5 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo2246 2,6 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo2260 7,2 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo2262 2,6 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo2264 3,5 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo2266 37,5 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo2724 2,1 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo2844 2,9 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo2254 2,7 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo1913 2,7 similar to unknown proteins 5.2 T2 sol lmo2013 7,3 similar to unknown proteins 5.2 T1 lag lmo1911 3,4 similar to unknown proteins (hypothetical sensory transduction histidine kinase) 5.2 T2 sol lmo1911 2,4 similar to unknown proteins (hypothetical sensory transduction histidine kinase) 5.2 T2 sol lmo1912 5,0 similar to unknown proteins (hypothetical sensory transduction histidine kinase) 5.2 T2 sol lmo2263 4,0 similar to unkown proteins 5.2 T1 lag lmo1668 3,3 some similarity to hypothetical proteins 5.2 T2 sol lmo2635 2,7 weakly similar to E. coli MenA protein 5.2
206
Annexe 3 - Tableau S2 : Classement des gènes dont le taux de transcrit est diminué (après enrichissement fonctionnel)
matrice gène
fold
change description
cat.
fonct
T1 lag dltA -2,8 D-alanine-activating enzyme (dae), D-alanine-D-alanyl carrier protein ligase (dcl) 1.1
T1 lag dltB -2,4 DltB protein for D-alanine esterification of lipoteichoic acid and wall teichoic acid 1.1
T2 sol dltB -3,1 DltB protein for D-alanine esterification of lipoteichoic acid and wall teichoic acid 1.1
T1 lag dltD -2,7 DltD protein for D-alanine esterification of lipoteichoic acid and wall teichoic acid 1.1
T2 sol dltD -3,0 DltD protein for D-alanine esterification of lipoteichoic acid and wall teichoic acid 1.1
T1 lag glmU -3,9 Bifunctional protein glmU 1.1
T1 sol glmU -3,6 Bifunctional protein glmU 1.1
T2 lag ispG -5,1 4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate synthase 1.1
T1 lag lmo0129 -3,5 similar to autolysin: N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase 1.1
T1 lag lmo0540 -3,8 similar to penicillin-binding protein 1.1
T2 lag lmo0540 -2,8 similar to penicillin-binding protein 1.1
T2 sol lmo0540 -12,2 similar to penicillin-binding protein 1.1
T2 sol lmo1215 -2,7 similar to N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase (autolysin) 1.1
T2 lag lmo1521 -4,1 similar to N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase 1.1
T2 sol lmo1521 -2,9 similar to N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase 1.1
T1 lag lmo1694 -2,4 similar to CDP-abequose synthase 1.1
T1 lag lmo2519 -2,0 similar to B. subtilis TagO teichoic acid linkage unit synthesis protein 1.1
T2 lag lmo2554 -4,0 similar to galactosyltransferase 1.1
T2 lag lmo2555 -4,2 weakly similar to human N-acetylglucosaminyl-phosphatidylinositol biosynthetic protein 1.1
T2 lag mbl -2,5 similar to MreB-like protein 1.1
T2 lag mreB -2,6 similar to cell-shape determining protein MreB 1.1
T2 sol mreB -3,6 similar to cell-shape determining protein MreB 1.1
T2 sol mreC -2,8 similar to cell-shape determining protein MreC 1.1
T2 lag mreD -4,7 similar to cell-shape determining protein MreD 1.1
T2 sol mreD -3,1 similar to cell-shape determining protein MreD 1.1
T2 lag murA -2,7 UDP-N-acetylglucosamine 1-carboxyvinyltransferase 1.1
T2 sol lmo0861 -6,4 similar to sugar ABC transporter, permease protein - 1.2
T2 lag cydC -4,2 highly similar to ABC transporter required for expression of cytochrome BD 1.2
T2 sol cydC -3,8 highly similar to ABC transporter required for expression of cytochrome BD 1.2
T2 sol cydD -2,9 highly similar to ABC transporter (ATP-binding protein) required for expression of cytochrome BD
1.2
T1 sol glpF -2,6 similar to glycerol uptake facilitator protein 1.2
T2 sol lmo0096 -5,3 similar to PTS system mannose-specific, factor IIAB 1.2
T2 sol lmo0098 -4,0 similar to PTS system mannose-specific, factor IID 1.2
T1 lag lmo0135 -3,3 similar to oligopeptide ABC transport system substrate-binding proteins 1.2
T2 sol lmo0301 -18,3 similar to PTS beta-glucoside-specific enzyme IIA component 1.2
T1 lag lmo0541 -3,9 similar to ABC transporter (binding protein) 1.2
T2 sol lmo0541 -3,1 similar to ABC transporter (binding protein) 1.2
T2 sol lmo0542 -2,5 similar to PTS system, glucitol/sorbitol-specific enzyme IIA component 1.2
T2 sol lmo0543 -2,8 similar to PTS system, glucitol/sorbitol-specific enzyme IIBC component 1.2
T2 sol lmo0544 -3,1 similar to PTS system, glucitol/sorbitol-specific enzyme II CII component 1.2
T1 lag lmo0593 -2,5 similar to transport proteins (formate?) 1.2
T2 lag lmo0641 -7,1 similar to heavy metal-transporting ATPase 1.2
T1 lag lmo0744 -2,1 similar to ABC transporter, ATP-binding protein 1.2
T1 sol lmo0803 -2,9 similar to putative Na+/H+ antiporter 1.2
T1 lag lmo0839 -3,9 similar to Tetracycline resistance protein 1.2
207
T2 sol lmo0860 -3,4 similar to sugar ABC transporter, permease protein 1.2
T1 lag lmo0897 -15,9 similar to transport proteins 1.2
T2 lag lmo0897 -4,3 similar to transport proteins 1.2
T2 sol lmo0897 -4,5 similar to transport proteins 1.2
T1 lag lmo0912 -4,5 similar to transporters (formate) 1.2
T1 lag lmo0923 -8,7 similar to ABC transporter, ATP-binding protein (N-terminal part) 1.2
T2 lag lmo0923 -2,0 similar to ABC transporter, ATP-binding protein (N-terminal part) 1.2
T2 sol lmo0923 -2,9 similar to ABC transporter, ATP-binding protein (N-terminal part) 1.2
T1 lag lmo0979 -20,4 similar to daunorubicin resistance ATP-binding proteins 1.2
T2 lag lmo0979 -7,4 similar to daunorubicin resistance ATP-binding proteins 1.2
T2 sol lmo0979 -3,3 similar to daunorubicin resistance ATP-binding proteins 1.2
T2 lag lmo0980 -2,0 similar to ABC transporter transmembrane component 1.2
T2 sol lmo0980 -2,5 similar to ABC transporter transmembrane component 1.2
T2 sol lmo1023 -13,8 similar to a bacterial K(+)-uptake system 1.2
T2 sol lmo1040 -3,2 similar to molybdenum ABC transporters (permease) 1.2
T1 lag lmo1250 -7,8 similar to antibiotic resistance protein 1.2
T2 lag lmo1250 -2,8 similar to antibiotic resistance protein 1.2
T2 sol lmo1250 -2,0 similar to antibiotic resistance protein 1.2
T1 lag lmo1409 -16,1 similar to multidrug-efflux transporter 1.2
T2 lag lmo1409 -2,6 similar to multidrug-efflux transporter 1.2
T2 sol lmo1409 -2,9 similar to multidrug-efflux transporter 1.2
T2 sol lmo1431 -2,4 similar to ABC transporter (ATP-binding protein) 1.2
T1 lag lmo1516 -4,9 similar to ammonium transporter NrgA 1.2
T2 sol lmo1516 -2,9 similar to ammonium transporter NrgA 1.2
T2 sol lmo1682 -4,7 similar to transmembrane transport proteins 1.2
T1 lag lmo1712 -2,7 similar to multidrug resistance protein, integral membrane protein 1.2
T2 lag lmo1712 -2,9 similar to multidrug resistance protein, integral membrane protein 1.2
T2 sol lmo1712 -5,0 similar to multidrug resistance protein, integral membrane protein 1.2
T1 lag lmo1738 -4,2 similar to amino acid ABC transporter (binding protein) 1.2
T2 lag lmo1738 -6,3 similar to amino acid ABC transporter (binding protein) 1.2
T2 sol lmo1738 -4,1 similar to amino acid ABC transporter (binding protein) 1.2
T2 sol lmo1740 -3,7 similar to amino acid (glutamine) ABC transporter, permease protein 1.2
T2 sol lmo1746 -2,6 similar to ABC transporter (permease) 1.2
T2 sol lmo1747 -2,5 similar to ABC transporter (ATP-binding protein) 1.2
T2 sol lmo1852 -3,1 similar to putative mercuric ion binding proteins 1.2
T1 lag lmo1884 -3,8 similar to xanthine permeases 1.2
T2 sol lmo1884 -2,0 similar to xanthine permeases 1.2
T1 lag lmo1959 -8,2 similar to ferrichrome binding protein 1.2
T2 sol lmo2002 -2,1 similar to PTS mannose-specific enzyme IIB component 1.2
T2 lag lmo2096 -7,9 similar to PTS system galactitol-specific enzyme IIC component 1.2
T2 sol lmo2096 -2,2 similar to PTS system galactitol-specific enzyme IIC component 1.2
T2 sol lmo2098 -7,6 similar to PTS system galactitol-specific enzyme IIA component 1.2
T1 lag lmo2140 -2,3 similar to ABC transporter (membrane protein) 1.2
T2 sol lmo2171 -3,2 similar to antiporter proteins 1.2
T1 lag lmo2237 -3,3 similar to transport system permease protein 1.2
T1 lag lmo2238 -2,5 similar to transport system permease protein 1.2
T1 lag lmo2249 -3,2 similar to low-affinity inorganic phosphate transporter 1.2
T2 sol lmo2249 -3,4 similar to low-affinity inorganic phosphate transporter 1.2
T1 sol lmo2353 -3,0 similar to putative Na+/H+ antiporter 1.2
T1 lag lmo2355 -2,1 Similar to multidrug resistance protein 1.2
T2 lag lmo2380 -4,2 similar to proteins involved in resistance to cholate and to NA(+) and in pH homeostasis 1.2
T1 lag lmo2463 -5,9 similar to transport protein 1.2
T1 lag lmo2569 -4,5 similar to dipeptide ABC transporter (dipeptide-binding protein) 1.2
208
T2 lag lmo2569 -4,5 similar to dipeptide ABC transporter (dipeptide-binding protein) 1.2
T1 lag lmo2741 -2,2 similar to drug-efflux transporters 1.2
T2 sol lmo2780 -2,0 similar to cellobiose PTS enzyme IIA 1.2
T1 lag lmo2818 -5,7 similar to transmembrane efflux protein 1.2
T2 sol lmo2826 -2,6 similar to efflux proteins 1.2
T1 lag pyrP -3,8 highly similar to uracil permease 1.2
T2 sol pyrP -2,2 highly similar to uracil permease 1.2
T1 lag lmo0050 -2,8 similar to sensor histidine kinase (AgrC from Staphylococcus) 1.3
T2 lag lmo0050 -3,5 similar to sensor histidine kinase (AgrC from Staphylococcus) 1.3
T2 sol lmo1021 -2,3 similar to two-component sensor histidine kinase in particular B. subtilis YvqE protein 1.3
T2 lag lmo1173 -2,3 similar to two-component sensor histidine kinase 1.3
T2 sol lmo1173 -6,3 similar to two-component sensor histidine kinase 1.3
T1 lag cydA -14,4 highly similar to cytochrome D ubiquinol oxidase subunit I 1.4
T2 lag cydA -6,6 highly similar to cytochrome D ubiquinol oxidase subunit I 1.4
T2 sol cydA -4,5 highly similar to cytochrome D ubiquinol oxidase subunit I 1.4
T1 lag cydB -10,4 highly similar to cytochrome D ubiquinol oxidase subunit II 1.4
T2 lag cydB -2,2 highly similar to cytochrome D ubiquinol oxidase subunit II 1.4
T2 sol cydB -3,8 highly similar to cytochrome D ubiquinol oxidase subunit II 1.4
T1 lag lmo0103 -3,6 similar to NADH oxidase 1.4
T1 lag lmo0295 -2,1 similar to FMN-containing NADPH-linked nitro/flavin reductase 1.4
T1 lag lmo0355 -6,9 similar to Flavocytochrome C Fumarate Reductase chain A 1.4
T2 sol lmo0355 -2,0 similar to Flavocytochrome C Fumarate Reductase chain A 1.4
T1 lag lmo0546 -3,0 similar to putative NAD(P)-dependent oxidoreductase 1.4
T1 lag lmo0936 -3,5 similar to Nitroflavin-reductase 1.4
T2 lag lmo0936 -6,5 similar to Nitroflavin-reductase 1.4
T1 lag lmo1609 -3,0 similar to thioredoxin 1.4
T2 lag lmo1609 -2,0 similar to thioredoxin 1.4
T1 lag lmo1789 -4,3 weakly similar to Nad(P)h Oxidoreductase chain B 1.4
T2 sol lmo1903 -2,1 similar to thioredoxin 1.4
T2 lag lmo1944 -4,2 similar to ferredoxin 1.4
T1 lag lmo2159 -2,2 similar to oxidoreductase 1.4
T1 lag lmo2235 -5,6 similar to NADH oxidase 1.4
T1 lag lmo2389 -4,4 similar to NADH dehydrogenase 1.4
T2 lag lmo2424 -9,6 similar to thioredoxin 1.4
T1 lag lmo2638
similar to NADH dehydrogenase 1.4
T2 lag lmo2638 -3,1 similar to NADH dehydrogenase 1.4
T1 lag lmo2830 -3,0 similar to thioredoxin 1.4
T1 lag trxB -2,4 thioredoxin reductase 1.4
T1 sol trxB -2,1 thioredoxin reductase 1.4
T2 sol trxB -2,1 thioredoxin reductase 1.4
T1 sol flaA -3,3 flagellin protein 1.5
T1 sol flgE -2,8 flagellar biosynthesis 1.5
T1 sol flgL -2,8 flagellar biosynthesis 1.5
T1 sol fliI -2,8 flagellar biosynthesis 1.5
T1 lag lmo0689 -3,3 similar to CheA activity-modulating chemotaxis protein CheV 1.5
T1 lag lmo0723 -5,2 similar to metyl-accepting chemotaxis protein 1.5
T2 sol lmo0723 -2,3 similar to metyl-accepting chemotaxis protein 1.5
T1 lag lmo1699 -5,7 some similarities to methyl-accepting chemotaxis proteins 1.5
T2 sol lmo1699 -13,4 some similarities to methyl-accepting chemotaxis proteins 1.5
T1 lag motB -3,4 similar to motility protein (flagellar motor rotation) MotB 1.5
T1 lag lmo0421
similar to rod shape-determining protein RodA 1.7
T1 sol lmo2687 -2,6 similar to cell division protein FtsW 1.7
T1 sol lmo2688 -4,8 similar to cell division protein FtsW 1.7
209
T1 lag lmo0160 -4,2 putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8
T1 lag lmo0327 -3,0 similar to cell surface proteins (LPXTG motif) 1.8
T1 lag lmo0552 -2,2 similar to unknown protein 1.8
T1 lag lmo0576 -3,8 hypothetical cell wall associated protein 1.8
T1 lag lmo0586 -2,9 hypothetical protein lmo0586 1.8
T1 lag lmo0721 -2,3 putative fibronectin-binding protein 1.8
T2 sol lmo0725 -2,4 putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8
T1 lag lmo0880 -5,2 similar to wall associated protein precursor (LPXTG motif) 1.8
T2 sol lmo1413 -3,8 putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8
T1 lag lmo1666 -3,0 peptidoglycan linked protein (LPxTG) 1.8
T1 lag lmo1799 -3,0 putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8
T1 lag lmo2178 -2,4 putative peptidoglycan bound protein (LPXTG motif) 1.8
T1 lag lmo2203 -4,1 similar to N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase and to internalin B 1.8
T2 lag lmo2203 -2,6 similar to N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase and to internalin B 1.8
T2 sol lmo2203 -2,7 similar to N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase and to internalin B 1.8
T1 lag lmo2591 -3,3 surface protein (GW repeat) similar to N-acetylmuramidase 1.8
T2 lag inlC -3,0 internalin C 1.9
T1 lag lmo1153 -5,3 highly similar to propanediol dehydratase, alpha subunit 2.1
T2 sol lmo1153 -2,4 highly similar to propanediol dehydratase, alpha subunit 2.1
T1 lag ackA -2,7 highly similar to acetate kinase 2.1.1
T2 lag alsS -4,6 similar to alpha-acetolactate synthase protein, AlsS 2.1.1
T2 sol eutA -3,1 similar to ethanolamine utilization protein EutA (putative chaperonin) 2.1.1
T1 lag fbaA -2,6 similar to fructose-1,6-bisphosphate aldolase 2.1.1
T2 sol gpsA -2,0 similar to NAD(P)H-dependent glycerol-3-phosphate dehydrogenase 2.1.1
T2 sol inlC -6,8 internalin C 2.1.1
T1 sol ipk -11,5 4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase 2.1.1
T1 lag lmo0033 -4,6 similar to endoglucanase 2.1.1
T2 sol lmo0033 -2,5 similar to endoglucanase 2.1.1
T1 lag lmo0035 -4,0 similar to Glucosamine--fructose-6-phosphate aminotransferase (C-terminal domain) 2.1.1
T1 lag lmo0078 -6,6 similar to phosphoglycerate dehydrogenase 2.1.1
T2 sol lmo0078 -2,6 similar to phosphoglycerate dehydrogenase 2.1.1
T1 lag lmo0084 -2,1 similar to oxidoreductases 2.1.1
T1 lag lmo0184 -2,1 similar to oligo-1,6-glucosidase 2.1.1
T2 lag lmo0261 -3,0 similar to phospho-beta-glucosidase 2.1.1
T2 sol lmo0261 -6,4 similar to phospho-beta-glucosidase 2.1.1
T1 lag lmo0268 -3,9 similar to phosphoglycerate mutase 2.1.1
T2 lag lmo0271 -4,6 highly similar to phospho-beta-glucosidase 2.1.1
T2 sol lmo0271 -4,7 highly similar to phospho-beta-glucosidase 2.1.1
T2 sol lmo0300 -8,4 similar to phospho-beta-glucosidase and phospho-beta-galactosidase 2.1.1
T1 lag lmo0372 -4,0 similar to beta-glucosidase 2.1.1
T2 lag lmo0372 -4,4 similar to beta-glucosidase 2.1.1
T2 sol lmo0372 -2,5 similar to beta-glucosidase 2.1.1
T1 lag lmo0431 -3,0 similar to acetyltransferase 2.1.1
T2 sol lmo0498 -12,2 similar to ribose 5-phosphate isomerase 2.1.1
T2 sol lmo0499 -8,1 similar to ribulose-5-phosphate 3 epimerase 2.1.1
T2 sol lmo0502 -2,2 similar to putative sugar-phosphate isomerase 2.1.1
T2 sol lmo0506 -6,3 similar to polyol (sorbitol) dehydrogenase 2.1.1
T1 lag lmo0521 -4,0 similar to 6-phospho-beta-glucosidase 2.1.1
T2 lag lmo0521 -2,0 similar to 6-phospho-beta-glucosidase 2.1.1
T2 sol lmo0521 -3,3 similar to 6-phospho-beta-glucosidase 2.1.1
T1 lag lmo0529 -2,2 conserved hypothetical protein similar to putative glucosaminyltransferase 2.1.1
T1 lag lmo0554 -3,4 similar to NADH-dependent butanol dehydrogenase 2.1.1
T1 lag lmo0574 -11,3 similar to beta-glucosidase 2.1.1
210
T2 lag lmo0574 -4,2 similar to beta-glucosidase 2.1.1
T2 sol lmo0574 -3,1 similar to beta-glucosidase 2.1.1
T1 lag lmo0643 -6,2 similar to putative transaldolase 2.1.1
T1 lag lmo0664 -3,9 similar to acetyl transferase 2.1.1
T2 sol lmo0664 -5,6 similar to acetyl transferase 2.1.1
T1 lag lmo0669 -5,3 similar to oxidoreductase 2.1.1
T1 lag lmo0862 -6,3 similar to oligo-1,6-glucosidase 2.1.1
T2 sol lmo0862 -4,2 similar to oligo-1,6-glucosidase 2.1.1
T2 sol lmo0877 -2,6 similar to B. subtilis NagB protein (glucosamine-6-phosphate isomerase) 2.1.1
T2 sol lmo0878 -2,4 similar to oxidoreductases 2.1.1
T1 lag lmo0913 -4,6 similar to succinate semialdehyde dehydrogenase 2.1.1
T1 lag lmo0982 -7,2 similar to glucanase and peptidase 2.1.1
T2 lag lmo0982 -5,2 similar to glucanase and peptidase 2.1.1
T2 sol lmo0982 -11,9 similar to glucanase and peptidase 2.1.1
T2 sol lmo1000 -2,2 similar to phytoene dehydrogenase 2.1.1
T2 sol lmo1057 -4,5 similar to L-lactate dehydrogenase 2.1.1
T2 sol lmo1066 -2,4 similar to extragenic suppressor protein SuhB and to myo-inositol-1(or 4)-monophosphatase 2.1.1
T1 lag lmo1154 -3,4 similar to diol dehydrase (diol dehydratase) gamma subunit 2.1.1
T1 lag lmo1155 -6,7 similar to diol dehydrase (diol dehydratase) gamma subunit (pddC) 2.1.1
T1 lag lmo1156 -3,1 similar to diol dehydratase-reactivating factor large subunit 2.1.1
T2 sol lmo1156 -2,1 similar to diol dehydratase-reactivating factor large subunit 2.1.1
T1 lag lmo1157 -4,0 similar to diol dehydratase-reactivating factor small chain 2.1.1
T2 sol lmo1157 -3,4 similar to diol dehydratase-reactivating factor small chain 2.1.1
T1 lag lmo1158 -7,0 similar to Salmonella enterica PduK protein 2.1.1
T2 lag lmo1158 -3,4 similar to Salmonella enterica PduK protein 2.1.1
T2 sol lmo1158 -2,5 similar to Salmonella enterica PduK protein 2.1.1
T1 lag lmo1159 -3,3 similar to carboxysome structural protein 2.1.1
T1 lag lmo1163 -4,0 similar to carbon dioxide concentrating mechanism protein 2.1.1
T2 sol lmo1163 -3,0 similar to carbon dioxide concentrating mechanism protein 2.1.1
T1 lag lmo1164 -2,3 hyghly similar to Salmonella enterica PduO protein 2.1.1
T1 lag lmo1165 -2,8 similar to ethanolamine utilization protein EutE 2.1.1
T1 lag lmo1166 -3,1 similar to NADPH-dependent butanol dehydrogenase 2.1.1
T2 sol lmo1177 -8,1 similar to putative carboxysome structural protein (eutL) 2.1.1
T2 sol lmo1178 -3,4 similar to putative carboxysome structural protein 2.1.1
T1 sol lmo1180 -6,0 similar to putative carboxysome structural protein 2.1.1
T2 sol lmo1180 -5,4 similar to putative carboxysome structural protein 2.1.1
T2 sol lmo1184 -5,1 similar to carbon dioxide concentrating mechanism protein 2.1.1
T2 sol lmo1185 -9,4 similar to Salmonella enterica PduT protein 2.1.1
T2 sol lmo1186 -8,2 similar to ethanolamine utilization protein EutH - Escherichia coli 2.1.1
T2 sol lmo1187 -8,9 similar to ethanolamine utilization protein EutQ 2.1.1
T2 lag lmo1254 -2,8 similar to alpha,alpha-phosphotrehalase 2.1.1
T2 sol lmo1254 -2,8 similar to alpha,alpha-phosphotrehalase 2.1.1
T1 lag lmo1634 -10,2 similar to Alcohol-acetaldehyde dehydrogenase 2.1.1
T2 lag lmo1634 -5,4 similar to Alcohol-acetaldehyde dehydrogenase 2.1.1
T2 sol lmo1634 -4,9 similar to Alcohol-acetaldehyde dehydrogenase 2.1.1
T1 lag lmo1684 -2,8 similar to glycerate dehydrogenases 2.1.1
T2 lag lmo1684 -2,0 similar to glycerate dehydrogenases 2.1.1
T2 lag lmo1688 -2,1 similar to glucose 1-dehydrogenase 2.1.1
T2 sol lmo1915 -6,3 similar to malolactic enzyme (malate dehydrogenase) 2.1.1
T2 sol lmo1999 -2,4 weakly similar to glucosamine-fructose-6-phosphate aminotransferase 2.1.1
T1 lag lmo2005 -9,6 similar to oxidoreductase 2.1.1
T2 lag lmo2005 -4,0 similar to oxidoreductase 2.1.1
T2 sol lmo2005 -3,1 similar to oxidoreductase 2.1.1
211
T1 lag lmo2015 -5,7 similar to alpha-mannosidase 2.1.1
T2 lag lmo2015 -5,8 similar to alpha-mannosidase 2.1.1
T2 sol lmo2015 -9,9 similar to alpha-mannosidase 2.1.1
T1 lag lmo2110 -2,8 similar to mannnose-6 phospate isomerase 2.1.1
T2 lag lmo2110 -3,4 similar to mannnose-6 phospate isomerase 2.1.1
T1 lag lmo2143 -2,9 weakly similar to mannose-6-phosphate isomerase 2.1.1
T2 lag lmo2341 -2,6 similar to carbohydrate kinases 2.1.1
T1 lag lmo2444 -2,2 similar to glycosidase 2.1.1
T1 lag lmo2592 -8,7 similar to oxidoreductase, aldo/keto reductase family 2.1.1
T2 lag lmo2592 -3,2 similar to oxidoreductase, aldo/keto reductase family 2.1.1
T2 sol lmo2592 -6,5 similar to oxidoreductase, aldo/keto reductase family 2.1.1
T1 lag lmo2696 -2,0 similar to hypothetical dihydroxyacetone kinase 2.1.1
T1 lag lmo2730 -4,4 similar to phosphatase 2.1.1
T2 lag lmo2730 -2,5 similar to phosphatase 2.1.1
T1 lag lmo2781 -2,6 similar to beta-glucosidase 2.1.1
T2 lag lmo2831 -2,2 similar to phosphoglucomutase 2.1.1
T1 lag pduQ -2,3 similar to NADPH-dependent butanol dehydrogenase 2.1.1
T2 sol pduQ -2,5 similar to NADPH-dependent butanol dehydrogenase 2.1.1
T1 lag pfkA -2,1 6-phosphofructokinase 2.1.1
T1 sol pfkA -3,1 6-phosphofructokinase 2.1.1
T2 sol pfkA -2,7 6-phosphofructokinase 2.1.1
T1 lag pflA -12,0 similar to pyruvate formate-lyase 2.1.1
T1 lag pflB -12,0 pyruvate formate-lyase 2.1.1
T2 lag pflC -2,3 pyruvate-formate lyase activating enzyme 2.1.1
T1 lag pykA -2,5 highly similar to pyruvate kinases 2.1.1
T1 sol tpiA -2,2 Triosephosphate isomerase 2.1.1
T1 lag eno -6,8 highly similar to enolase 2.1.2
T2 lag lmo0556 -7,6 similar to phosphoglycerate mutase 2.1.2
T2 sol lmo0556 -3,5 similar to phosphoglycerate mutase 2.1.2
T2 lag lmo0557 -6,1 similar to phosphoglycerate mutase 2.1.2
T2 sol lmo0557 -2,3 similar to phosphoglycerate mutase 2.1.2
T1 lag lmo0907 -2,2 similar to phosphoglycerate mutase 2.1.2
T2 lag lmo0907 -2,6 similar to phosphoglycerate mutase 2.1.2
T1 lag lmo1244 -2,0 weakly similar to phosphoglycerate mutase 1 2.1.2
T2 lag lmo1244 -5,1 weakly similar to phosphoglycerate mutase 1 2.1.2
T2 lag pdhA -3,5 highly similar to pyruvate dehydrogenase (E1 alpha subunit) 2.1.2
T2 sol pdhA -4,2 highly similar to pyruvate dehydrogenase (E1 alpha subunit) 2.1.2
T1 lag PdhB -5,0 highly similar to pyruvate dehydrogenase (E1 beta subunit) 2.1.2
T2 lag PdhB -2,3 highly similar to pyruvate dehydrogenase (E1 beta subunit) 2.1.2
T2 sol PdhB -4,5 highly similar to pyruvate dehydrogenase (E1 beta subunit) 2.1.2
T2 lag PdhD -4,1 highly similar to dihydrolipoamide dehydrogenase, E3 subunit of pyruvate dehydrogenase complex
2.1.2
T1 sol pgk -2,3 highly similar to phosphoglycerate kinase 2.1.2
T2 sol citB -2,6 highly similar to aconitate hydratases 2.1.3
T1 lag argH -3,0 argininosuccinate lyase 2.2
T2 lag aspB -2,2 similar to aspartate aminotransferases 2.2
T2 lag cysK -3,1 highly similar to cysteine synthase 2.2
T2 sol dapB -2,3 similar to dihydrodipicolinate reductase 2.2
T1 sol gltD -2,8 Glutamate synthase, small subunit 2.2
T2 sol hisG 5,1 similar to ATP phosphoribosyltransferase 2.2
T1 lag lmo0458 -2,3 similar to hydantoinase 2.2
T1 lag lmo0961 -3,7 similar to proteases 2.2
T1 lag lmo1217 -9,1 similar to endo-1,4-beta-glucanase and to aminopeptidase 2.2
T2 lag lmo1217 -6,9 similar to endo-1,4-beta-glucanase and to aminopeptidase 2.2
212
T2 sol lmo1217 -6,5 similar to endo-1,4-beta-glucanase and to aminopeptidase 2.2
T1 lag lmo1375 -6,4 similar to aminotripeptidase 2.2
T2 lag lmo1392 -4,8 similar to putative proteases 2.2
T2 lag lmo1393 -4,0 similar to putative protease 2.2
T2 sol lmo1393 -2,7 similar to putative protease 2.2
T1 lag lmo1611 -3,6 similar to aminopeptidase 2.2
T2 lag lmo1611 -2,2 similar to aminopeptidase 2.2
T1 lag lmo1711 -2,1 highly similar to aminopeptidases 2.2
T2 sol lmo1711 -3,7 highly similar to aminopeptidases 2.2
T1 lag lmo1734 -2,9 similar to glutamate synthase (large subunit) 2.2
T1 lag lmo1812 -4,2 similar to L-serine dehydratase 2.2
T2 sol lmo1812 -11,2 similar to L-serine dehydratase 2.2
T1 sol lmo1813 -8,0 similar to phosphoglycerate dehydrogenase 2.2
T2 lag lmo1813 -4,1 similar to phosphoglycerate dehydrogenase 2.2
T2 sol lmo1813 -9,4 similar to phosphoglycerate dehydrogenase 2.2
T2 lag lmo1886 -2,9 similar to probable thermostable carboxypeptidases 2.2
T1 lag lmo1992 -14,6 similar to alpha-acetolactate decarboxylase 2.2
T2 lag lmo1992 -3,0 similar to alpha-acetolactate decarboxylase 2.2
T2 sol lmo1992 -14,8 similar to alpha-acetolactate decarboxylase 2.2
T1 lag lmo2077 -2,5 similar to glycoprotease 2.2
T1 lag lmo2370 -3,7 similar to aminotransferase 2.2
T2 sol lmo2370 -5,3 similar to aminotransferase 2.2
T2 lag lmo2400 -5,3 similar to acetyltransferase 2.2
T2 lag lmo2414 -2,2 similar to aminotransferase 2.2
T1 lag lmo2694 -4,3 similar to lysine decarboxylase 2.2
T2 lag lmo2694 -4,4 similar to lysine decarboxylase 2.2
T2 sol lmo2694 -3,6 similar to lysine decarboxylase 2.2
T1 lag lmo2819 -4,1 similar to carboxypeptidase 2.2
T1 lag metK -2,6 similar to S-methionine adenosyltransferase 2.2
T1 lag metX -2,9 Homoserine O-acetyltransferase 2.2
T1 lag trpE -2,5 highly similar to anthranilate synthase alpha subunit 2.2
T1 lag adk -5,1 highly similar to adenylate kinases 2.3
T1 lag carB -2,2 carbamoyl-phosphate synthetase large chain (catalytic subunit) 2.3
T1 lag lmo0280 -3,7 highly similar to anaerobic ribonucleotide reductase activator protein 2.3
T1 lag lmo0802 -2,8 weakly similar to GTP-pyrophosphokinase 2.3
T1 lag lmo1691 -4,2 similar to deoxyuridine triphosphate nucleotidohydrolases 2.3
T2 lag lmo1691 -5,7 similar to deoxyuridine triphosphate nucleotidohydrolases 2.3
T2 sol lmo1691 -10,1 similar to deoxyuridine triphosphate nucleotidohydrolases 2.3
T1 lag purA -6,4 highly similar to adenylosuccinate synthetase 2.3
T1 lag purM -4,8 phosphoribosylaminoimidazole synthetase 2.3
T1 lag purN -3,4 highly similar to phosphoribosylglycinamide formyltransferases 2.3
T1 lag purQ -3,7 phosphoribosylformylglycinamidine synthetase I 2.3
T1 lag pyrAa -2,9 highly similar to carbamoyl-phosphate synthetase (glutaminase subunit) 2.3
T1 lag pyrB -2,3 highly similar to aspartate carbamoyltransferase 2.3
T1 lag pyrD -3,1 highly similar to dihydroorotase dehydrogenase 2.3
T1 lag pyrH -2,4 uridylate kinase 2.3
T2 sol udk -2,0 similar to Uridine kinase 2.3
T1 lag lmo0931 -4,3 similar to lipoate protein ligase A 2.4
T2 sol lmo1292 -3,3 similar to glycerophosphodiester phosphodiesterase 2.4
T2 lag lmo1356 -2,3 similar to acetyl-CoA carboxylase subunit (biotin carboxyl carrier subunit) 2.4
T2 lag lmo1371 -3,7 similar to branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase E3 subunit 2.4
T1 lag lmo1372 -3,2 similar to branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase E1 subunit (2-oxoisovalerate dehydrogenase alpha subunit)
2.4
T2 lag lmo1372 -4,3 similar to branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase E1 subunit (2-oxoisovalerate 2.4
213
dehydrogenase alpha subunit)
T1 lag lmo1373 -3,2 similar to branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase E1 subunit (2-oxoisovalerate dehydrogenase beta subunit)
2.4
T2 lag lmo1373 -2,3 similar to branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase E1 subunit (2-oxoisovalerate dehydrogenase beta subunit)
2.4
T2 lag lmo1394 -2,3 similar to 3-ketoacyl-acyl carrier protein reductase 2.4
T2 sol lmo1464 -2,2 similar to diacylglycerol kinase 2.4
T1 lag lmo1946 -2,7 similar to similar to acyl-CoA hydrolase 2.4
T2 lag lmo1946 -4,8 similar to similar to acyl-CoA hydrolase 2.4
T1 lag lmo2089 -3,6 similar to lipases 2.4
T2 lag lmo2089 -2,8 similar to lipases 2.4
T1 lag lmo2433 -4,9 similar to acetylesterase 2.4
T2 sol lmo2433 -2,4 similar to acetylesterase 2.4
T2 lag lmo2450 -2,1 similar to carboxylesterase 2.4
T1 lag lmo2452 -2,6 similar to carboxylesterase 2.4
T2 lag lmo2452 -2,9 similar to carboxylesterase 2.4
T2 sol lmo2452 -2,6 similar to carboxylesterase 2.4
T1 lag lmo2453 -5,1 similar to lipolytic enzyme 2.4
T2 lag lmo2453 -2,0 similar to lipolytic enzyme 2.4
T2 sol lmo2453 -2,8 similar to lipolytic enzyme 2.4
T1 lag lmo2829 -9,7 similar to yeast protein Frm2p involved in fatty acid signaling 2.4
T1 sol plcA -2,0 phosphatidylinositol-specific phospholipase c 2.4
T1 lag plsX -2,8 similar to plsX protein involved in fatty acid/phospholipid synthesis 2.4
T1 lag cbiF -3,2 similar to precorrin-3 methylase 2.5
T2 sol cobD -4,3 similar to Salmonella typhimurium CobD protein and to histidinol-phosphate aminotransferase 2.5
T2 lag folK -4,1 similar to 7,8-dihydro-6-hydroxymethylpterin pyrophosphokinase 2.5
T1 lag hemE -3,6 similar to uroporphyrinogen III decarboxylase 2.5
T1 lag hemH -3,4 similar to ferrochelatase 2.5
T2 lag hemH -3,0 similar to ferrochelatase 2.5
T2 lag lmo0728 -6,9 similar to riboflavin kinase / FAD synthase 2.5
T1 lag lmo1038 -2,8 weakly similar to molybdopterin-guanine dinucleotide biosynthesis protein A 2.5
T2 lag lmo1038 -2,6 weakly similar to molybdopterin-guanine dinucleotide biosynthesis protein A 2.5
T2 sol lmo1048 -12,0 similar to molybdenum cofactor biosynthesis protein B 2.5
T2 lag lmo1049 -2,2 similar to molybdopterin biosynthesis protein MoeB 2.5
T2 sol lmo1049 -3,4 similar to molybdopterin biosynthesis protein MoeB 2.5
T2 sol lmo1149 -4,0 similar to alpha-ribazole-5'-phosphatase 2.5
T2 sol lmo1181 -2,5 similar to cobalamin adenosyl transferase 2.5
T2 sol menB -7,3 similar to dihydroxynapthoic acid synthetase 2.5
T2 lag menD -3,3 similar to 2-succinyl-6-hydroxy-2,4-cyclohexadiene-1-carboxylate synthase / 2-oxoglutarate decarboxylase
2.5
T2 lag menF -4,8 similar to menaquinone-specific isochorismate synthase 2.5
T2 sol menF -6,8 similar to menaquinone-specific isochorismate synthase 2.5
T1 lag nadA -2,9 similar to quinolinate synthetase 2.5
T1 lag nadB -3,8 similar to L-aspartate oxidase 2.5
T1 lag panB -2,9 similar to ketopantoate hydroxymethyltransferases 2.5
T1 lag panC -2,8 similar to panthotenate synthetases 2.5
T1 lag panD -3,0 similar to aspartate 1-decarboxylases 2.5
T2 lag ribC -2,0 highly similar to riboflavin kinase and FAD synthase 2.5
T2 lag sul -5,7 highly similar to dihydropteroate synthases 2.5
T2 lag tktB -2,7 similar to D-1-deoxyxylulose 5-phosphate synthase 2.5
T2 sol lmo1418 -2,3 weakly similar to pyrophosphatase 2.6
T2 sol lmo1870 -2,1 similar to alkaline phosphatase 2.6
T1 lag lmo2540 -2,3 similar to phosphatases 2.6
T1 lag dnaD -2,1 similar to chromosome replication initiation protein 3.1
214
T2 sol dnaD -2,4 similar to chromosome replication initiation protein 3.1
T1 lag dinG -4,1 similar to ATP-dependent helicases 3.2
T2 lag dinG -2,7 similar to ATP-dependent helicases 3.2
T2 sol dinG -3,2 similar to ATP-dependent helicases 3.2
T1 lag lmo0157 -4,2 similar to ATP dependent helicase 3.2
T1 lag lmo0996 -6,8 similar to methylated-DNA-protein-cystein methyltransferase 3.2
T2 lag lmo1248 -3,7 weakly similar to 8-oxo-dGTPase (mutT) 3.2
T2 sol lmo1248 -7,0 weakly similar to 8-oxo-dGTPase (mutT) 3.2
T2 sol lmo1582 -3,5 weakly similar to site specific DNA-methyltransferase 3.2
T1 lag lmo1621 -3,6 weakly similar to E. coli MutT protein (dGTP pyrophosphohydrolase 3.2
T2 sol lmo1621 -3,1 weakly similar to E. coli MutT protein (dGTP pyrophosphohydrolase 3.2
T1 lag lmo1782 -2,6 similar to 3'-exo-deoxyribonuclease exoA 3.2
T2 lag lmo1782 -4,5 similar to 3'-exo-deoxyribonuclease exoA 3.2
T1 lag lmo2242 -12,4 similar to O6-methylguanine-DNA methyltransferase 3.2
T2 lag lmo2242 -3,1 similar to O6-methylguanine-DNA methyltransferase 3.2
T2 sol lmo2242 -2,8 similar to O6-methylguanine-DNA methyltransferase 3.2
T1 lag lmo2316 -3,8 similar to site-specific DNA-methyltransferase 3.2
T2 sol lmo2316 -10,6 similar to site-specific DNA-methyltransferase 3.2
T2 sol mutL -2,4 DNA mismatch repair protein 3.2
T2 sol mutS -2,6 DNA mismatch repair (recognition) 3.2
T2 lag nth -2,1 probable endonuclease III (DNA repair) 3.2
T1 sol codV -3,9 similar to integrase/recombinase 3.3
T2 lag codV -4,7 similar to integrase/recombinase 3.3
T1 lag lmo1509 -2,8 similar to exodeoxyribonuclease V 3.3
T2 lag lmo1509 -3,7 similar to exodeoxyribonuclease V 3.3
T2 sol lmo1509 -2,4 similar to exodeoxyribonuclease V 3.3
T1 sol recF -3,0 RecF recombination protein F 3.3
T2 sol recF -3,1 RecF recombination protein F 3.3
T2 sol codV -6,6 similar to integrase/recombinase 3.4
T1 lag lmo1412 -3,6 modulates DNA topology 3.4
T2 lag lmo1412 -10,2 modulates DNA topology 3.4
T2 lag parA -2,1 Partition protein, ParA homolog 3.4
T1 lag parB -2,5 Partition protein ParB homolg 3.4
T2 lag parB -3,9 Partition protein ParB homolg 3.4
T1 sol cheY -10,6 Chemotaxis response regulator CheY 3.5.2
T2 sol codY -3,2 highly similar to B. subtilis CodY protein 3.5.2
T2 sol gyrB -2,4 DNA gyrase subunit B 3.5.2
T1 sol hrcA -13,4 transcription repressor of class I heat-shock gene HrcA 3.5.2
T2 sol hrcA -5,6 transcription repressor of class I heat-shock gene HrcA 3.5.2
T1 lag lmo0032 -4,8 similar to xylose repressor 3.5.2
T2 sol lmo0032 -4,1 similar to xylose repressor 3.5.2
T1 lag lmo0051 -3,5 similar to 2-components response regulator protein (AgrA from Staphylococcus) 3.5.2
T2 lag lmo0051 -2,6 similar to 2-components response regulator protein (AgrA from Staphylococcus) 3.5.2
T2 lag lmo0192 -3,8 similar to PurR, transcription repressor of purine operon of B. subtilis 3.5.2
T2 sol lmo0192 -6,3 similar to PurR, transcription repressor of purine operon of B. subtilis 3.5.2
T1 lag lmo0325 -3,9 similar to transcriptional regulators 3.5.2
T1 lag lmo0459 -3,8 similar to transcription regulator (VirR from Streptococcus pyogenes) 3.5.2
T2 sol lmo0639 -3,7 similar to a transcription regulator (surface protein PAg negative regulator par) 3.5.2
T1 lag lmo0659 -13,5 similar to transcription regulator (Rgg type) 3.5.2
T2 sol lmo0776 -3,7 similar to transcription regulator (repressor) 3.5.2
T1 lag lmo0984 -2,0 weakly similar to two-component response regulator 3.5.2
T2 sol lmo0984 -3,8 weakly similar to two-component response regulator 3.5.2
T2 lag lmo1172 -3,0 similar to similar to two-component response regulator 3.5.2
215
T2 sol lmo1172 -7,0 similar to similar to two-component response regulator 3.5.2
T2 sol lmo1262 -2,5 similar to transcriptional regulator (phage-related) 3.5.2
T2 lag lmo1405 -3,3 similar to putative anti-terminator regulatory protein 3.5.2
T2 sol lmo1405 -2,8 similar to putative anti-terminator regulatory protein 3.5.2
T1 lag lmo2324 -3,1 similar to anti-repressor [Bacteriophage A118] 3.5.2
T2 lag lmo2334 -3,6 similar to transcriptional regulator 3.5.2
T2 sol lmo2334 -2,7 similar to transcriptional regulator 3.5.2
T1 lag lmo2365 -4,7 similar to S. pyogenes RofA regulatory protein 3.5.2
T1 lag lmo2460 -17,7 similar to B. subtilis CggR hypothetical transcriptional regulator 3.5.2
T2 lag lmo2460 -2,8 similar to B. subtilis CggR hypothetical transcriptional regulator 3.5.2
T2 sol lmo2460 -4,0 similar to B. subtilis CggR hypothetical transcriptional regulator 3.5.2
T1 lag lmo2672 -4,1 weakly similar to transcription regulator 3.5.2
T1 lag lmo2731 -3,4 similar to transcription regulator (RpiR family) 3.5.2
T2 lag lmo2731 -2,4 similar to transcription regulator (RpiR family) 3.5.2
T2 sol lmo2773 -2,3 similar to transcription antiterminator 3.5.2
T2 lag prfA -2,7 listeriolysin positive regulatory protein 3.5.2
T2 sol pyrR -4,3 highly similar to pyrimidine operon regulatory protein 3.5.2
T2 sol proB -2,4 RNA polymerase (beta subunit) 3.5.3
T2 sol rpoB -2,4 RNA polymerase (beta subunit) 3.5.3
T1 sol rpoC -2,1 RNA polymerase (beta' subunit) 3.5.3
T2 sol rpoC -2,4 RNA polymerase (beta' subunit) 3.5.3
T1 sol tsf -2,3 translation elongation factor 3.5.3
T2 sol tsf -3,6 translation elongation factor 3.5.3
T2 lag nusA -2,1 highly similar to N utilization substance protein A (NusA protein) 3.5.4
T2 sol nusA -2,5 highly similar to N utilization substance protein A (NusA protein) 3.5.4
T1 lag lmo0935 -2,9 similar to B. subtilis CspR protein, rRNA methylase homolog 3.6
T2 sol miaA -2,7 similar to tRNA isopentenylpyrophosphate transferase 3.6
T2 sol mnmA -2,6 tRNA-specific 2-thiouridylase mnmA 3.6
T2 lag queA -2,1 S-adenosylmethionine:tRNA ribosyltransferase-isomerase 3.6
T2 sol rph -2,4 ribonuclease PH 3.6
T1 sol truA -3,0 highly similar to pseudouridylate synthase I 3.6
T1 lag rplJ -2,1 ribosomal protein L10 3.7.1
T1 lag rplL -2,2 ribosomal protein L12 3.7.1
T1 sol rplL -2,0 ribosomal protein L12 3.7.1
T1 sol rplO -5,1 ribosomal protein L15 3.7.1
T2 sol rplT -2,0 ribosomal protein L20 3.7.1
T1 sol rplU -2,3 ribosomal protein L21 3.7.1
T2 sol rplU -2,7 ribosomal protein L21 3.7.1
T1 sol rpmA -2,2 ribosomal protein L27 3.7.1
T1 lag rpmF -6,0 ribosomal protein L32 3.7.1
T1 sol rpmF -9,0 ribosomal protein L32 3.7.1
T2 sol rpmF -4,3 ribosomal protein L32 3.7.1
T1 sol rpmG -5,6 ribosomal protein L33 3.7.1
T2 sol rpmG -2,7 ribosomal protein L33 3.7.1
T2 sol rpmI -2,2 ribosomal protein L35 3.7.1
T2 sol rpsB -3,3 30S ribosomal protein S2 3.7.1
T1 sol rpsF -2,2 ribosomal protein S6 3.7.1
T2 sol rpsF -2,6 ribosomal protein S6 3.7.1
T1 sol rpsO -7,1 ribosomal protein S15 3.7.1
T2 sol rpsO -5,2 ribosomal protein S15 3.7.1
T1 lag rpsP -2,1 ribosomal protein S16 3.7.1
T1 sol rpsR -4,1 ribosomal protein S18 3.7.1
T2 sol rpsR -4,1 ribosomal protein S18 3.7.1
216
T1 sol rpsT -5,0 ribosomal protein S20 3.7.1
T1 lag rpsU -3,3 30S ribosomal protein S21 3.7.1
T1 sol rpsU -9,8 30S ribosomal protein S21 3.7.1
T2 sol rpsU -10,8 30S ribosomal protein S21 3.7.1
T1 lag alaS -4,1 alanyl-tRNA synthetase 3.7.2
T1 lag cysS -2,0 cysteinyl-tRNA synthetase 3.7.2
T1 sol gatB -2,2 glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase (subunit B) 3.7.2
T1 sol gatC -3,6 glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase (subunit C) 3.7.2
T2 sol gatC -2,6 glutamyl-tRNA(Gln) amidotransferase (subunit C) 3.7.2
T1 lag glyQ -2,8 similar to glycyl-tRNA synthetase alpha chain 3.7.2
T1 lag glyS -2,4 similar to glycyl-tRNA synthetase beta chain 3.7.2
T1 lag ileS -2,1 isoleucyl-tRNA synthetase 3.7.2
T1 lag serS -2,3 seryl-trna synthetase 3.7.2
T1 sol trpS -4,4 tryptophanyl-tRNA synthetase 3.7.2
T2 sol trpS -4,1 tryptophanyl-tRNA synthetase 3.7.2
T1 sol valS -2,6 valyl-tRNA synthetase 3.7.2
T1 lag lmo2541 -2,0 similar to yeast translation initiation protein 3.7.3
T1 lag fus -4,8 highly similar to translation elongation factor G 3.7.4
T1 lag tuf -4,9 Elongation factor Tu 3.7.4
T1 lag frr -2,1 highly similar to ribosome recycling factors 3.7.5
T1 lag prfB -2,4 highly similar to peptide chain release factor 2 3.7.5
T1 sol def -3,8 Peptide deformylase 3.8
T2 sol def -2,7 Peptide deformylase 3.8
T2 sol hisZ 3,3 histidyl-tRNA synthetase 3.8
T2 lag lmo0618 -2,8 similar to protein kinase 3.8
T1 lag lmo0655 -7,4 similar to phosphoprotein phosphatases 3.8
T2 lag lmo0655 -2,1 similar to phosphoprotein phosphatases 3.8
T2 sol lmo1800 -3,2 similar to protein-tyrosine phosphatase 3.8
T1 sol dnaK -8,9 class I heat-shock protein (molecular chaperone) DnaK 3.9
T1 lag groEL -5,3 class I heat-shock protein (chaperonin) GroEL 3.9
T1 sol groEL -3,2 class I heat-shock protein (chaperonin) GroEL 3.9
T1 lag groES -4,7 class I heat-shock protein (chaperonin) GroES 3.9
T1 sol groES -3,7 class I heat-shock protein (chaperonin) GroES 3.9
T1 lag clpB -2,4 similar to endopeptidase Clp ATP-binding chain B (ClpB) 4.1
T1 lag cspB -6,5 similar to major cold-shock protein 4.1
T1 sol cspL -3,5 similar to cold shock protein 4.1
T2 sol cspL -5,7 similar to cold shock protein 4.1
T1 lag ctc -2,4 similar to B. subtilis general stress protein 4.1
T1 lag dnaJ -4,5 heat shock protein DnaJ 4.1
T1 sol fri -9,7 non-heme iron-binding ferritin 4.1
T1 lag grpE -3,0 heat shock protein GrpE 4.1
T1 sol grpE -9,0 heat shock protein GrpE 4.1
T1 sol hslU -2,3 ATP-dependent hsl protease ATP-binding subunit hslU 4.1
T2 sol lmo0292 -3,6 similar to heat-shock protein htrA serine protease 4.1
T1 lag lmo0609 -2,9 similar to E. coli phage shock protein E 4.1
T2 lag lmo0906 -3,7 similar to glutathione Reductase 4.1
T1 lag lmo1601 -2,4 similar to general stress protein 4.1
T1 lag lmo0476 -2,8 similar to oxetanocin A resistance protein oxrB 4.2
T2 lag lmo0476 -2,1 similar to oxetanocin A resistance protein oxrB 4.2
T2 sol lmo0476 -3,6 similar to oxetanocin A resistance protein oxrB 4.2
T1 lag lmo0752 -5,6 weakly similar to a putative haloacetate dehalogenase 4.2
T1 lag lmo1604 -4,6 similar to 2-cys peroxiredoxin 4.2
T2 sol lmo1604 -3,1 similar to 2-cys peroxiredoxin 4.2
217
T2 sol lmo1708 -6,3 similar to aminoglycoside N3'-acetyltransferases 4.2
T1 lag lmo2067 -7,3 similar to conjugated bile acid hydrolase 4.2
T1 lag lmo2230 -4,6 similar to arsenate reductase 4.2
T1 sol sod -4,9 superoxide dismutase 4.2
T1 sol fxsA -3,0 Bacteriophage A118 protein 4.3
T1 lag lmo0121 -4,6 similar to bacteriophage minor tail proteins 4.3
T1 lag lmo0122 -3,3 similar to phage proteins 4.3
T1 lag lmo0123 -3,4 similar to protein gp18 from Bacteriophage A118 4.3
T1 lag lmo0127 -2,9 weakly similar to protein gp20 from Bacteriophage A118 4.3
T2 lag lmo2291 -5,0 major tail shaft protein [Bacteriophage A118] 4.3
T2 lag lmo2292 -4,7 Portein gp11 [Bacteriophage A118] 4.3
T2 lag lmo2295 -3,5 Protein gp8 [Bacteriophage A118] 4.3
T1 lag lmo2303 -3,9 Protein gp66 [Bacteriophage A118] 4.3
T2 sol lmo2303 -5,9 Protein gp66 [Bacteriophage A118] 4.3
T1 lag lmo2304 -3,6 Bacteriophage A118 gp65 protein 4.3
T2 sol lmo2304 -8,5 Bacteriophage A118 gp65 protein 4.3
T1 lag lmo2306 -3,3 similar to phage protein 4.3
T1 lag lmo2315 -4,0 similar to protein gp51 [Bacteriophage A118] 4.3
T1 lag lmo2317 -4,7 similar to protein gp49 [Bacteriophage A118] 4.3
T2 sol lmo2317 -9,2 similar to protein gp49 [Bacteriophage A118] 4.3
T1 lag lmo2319 -3,9 similar to bacteriophage proteins 4.3
T2 sol lmo2319 -14,6 similar to bacteriophage proteins 4.3
T1 lag lmo2322 -3,5 gp44 [Bacteriophage A118] 4.3
T2 sol lmo2322 -11,2 gp44 [Bacteriophage A118] 4.3
T1 lag lmo2323 -3,3 gp43 [Bacteriophage A118] 4.3
T2 sol lmo2323 -6,0 gp43 [Bacteriophage A118] 4.3
T1 lag lmo0464 -5,0 weakly similar to transposase 4.4
T2 sol lmo0464 -3,2 weakly similar to transposase 4.4
T1 lag lmo0660 -21,7 similar to transposases 4.4
T2 sol lmo0832 -5,3 similar to transposase 4.4
T2 lag hly -2,7 listeriolysin O precursor 4.5
T1 lag lmaA -7,4 antigen A 4.5
T1 lag lmaB -7,7 antigen B 4.5
T1 lag lmaC -12,0 similar to Antigen C 4.5
T2 sol lmaC -2,6 similar to Antigen C 4.5
T1 lag lmaD -10,4 similar to Antigen D 4.5
T2 sol lmaD -2,2 similar to Antigen D 4.5
T2 lag lmo0189 -2,8 highly similar to B. subtilis Veg protein 4.5
T2 sol lmo0189 -13,4 highly similar to B. subtilis Veg protein 4.5
T1 lag lmo0439 -2,4 weakly similar to a module of peptide synthetase 4.5
T1 lag lmo0073 -3,2 hypothetical protein lmo0073 5.1
T2 lag lmo0073 -3,2 hypothetical protein lmo0073 5.1
T2 sol lmo0073 -3,5 hypothetical protein lmo0073 5.1
T1 lag lmo0095 -2,2 hypothetical protein lmo0095 5.1
T1 lag lmo0138 -2,1 hypothetical protein lmo0138 5.1
T1 lag lmo0139 -2,7 hypothetical protein lmo0139 5.1
T1 lag lmo0281 -2,1 hypothetical protein lmo0281 5.1
T2 lag lmo0281 -2,1 hypothetical protein lmo0281 5.1
T2 sol lmo0281 -2,5 hypothetical protein lmo0281 5.1
T1 lag lmo0328 -4,4 hypothetical protein lmo0328 5.1
T1 lag lmo0337 -3,2 hypothetical protein lmo0337 5.1
T2 sol lmo0617 -2,9 hypothetical protein lmo0617 5.1
T1 lag lmo0623 -2,4 hypothetical protein lmo0623 5.1
218
T2 sol lmo0623 -2,8 hypothetical protein lmo0623 5.1
T1 lag lmo0628 -2,9 hypothetical protein lmo0628 5.1
T1 lag lmo1123 -2,6 hypothetical protein lmo1123 5.1
T2 sol lmo1123 -2,1 hypothetical protein lmo1123 5.1
T1 lag lmo1124 -2,6 hypothetical protein lmo1124 5.1
T2 sol lmo1247 -7,2 hypothetical protein lmo1247 5.1
T1 lag lmo1249 -6,2 hypothetical protein lmo1249 5.1
T2 lag lmo1249 -2,3 hypothetical protein lmo1249 5.1
T2 sol lmo1249 -5,4 hypothetical protein lmo1249 5.1
T2 lag lmo1762 -2,5 hypothetical protein lmo1762 5.1
T2 sol lmo1762 -5,4 hypothetical protein lmo1762 5.1
T2 lag lmo2150 -3,3 hypothetical protein lmo2150 5.1
T2 sol lmo2150 -7,2 hypothetical protein lmo2150 5.1
T1 lag lmo2187 -6,3 hypothetical protein lmo2187 5.1
T2 lag lmo2187 -3,9 hypothetical protein lmo2187 5.1
T2 sol lmo2568 -2,9 hypothetical protein lmo2568 5.1
T2 sol lmo1715 -7,9 similar to hypothetical proteins 5.2
T2 lag lmo0004 -3,5 similar to B. subtilis YaaA protein 5.2
T2 sol lmo0004 -3,2 similar to B. subtilis YaaA protein 5.2
T1 lag lmo0019 -4,1 hypothetical protein lmo0019 5.2
T1 lag lmo0102 -3,8 hypothetical protein lmo0102 5.2
T1 lag lmo0119 -4,0 hypothetical protein lmo0119 5.2
T1 lag lmo0120 -4,0 hypothetical protein lmo0120 5.2
T1 lag lmo0134 -3,6 similar to E. coli YjdJ protein 5.2
T2 sol lmo0193 -3,2 hypothetical protein lmo0193 5.2
T1 lag lmo0242 -2,0 similar to B. subtilis Yacp protein 5.2
T1 lag lmo0267 -5,3 similar to other proteins 5.2
T1 lag lmo0304 -2,3 hypothetical protein lmo0304 5.2
T1 lag lmo0314 -3,1 similar to unknown protein 5.2
T2 lag lmo0414 -3,7 conserved membrane protein 5.2
T1 lag lmo0437 -9,8 conserved hypothetical protein 5.2
T2 sol lmo0437 -3,7 conserved hypothetical protein 5.2
T1 lag lmo0450 -2,4 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo0452 -2,1 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo0457 -2,2 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo0471
hypothetical protein lmo0471 5.2
T2 sol lmo0485 -2,8 hypothetical protein lmo0485 5.2
T1 lag lmo0515 -5,1 conserved hypothetical protein 5.2
T1 sol lmo0515 -2,4 conserved hypothetical protein 5.2
T1 lag lmo0518 -5,4 similar to unknown protein 5.2
T2 sol lmo0518 -3,1 similar to unknown protein 5.2
T1 lag lmo0523 -3,8 similar to B. subtilis YybC protein 5.2
T1 lag lmo0530 -2,6 hypothetical protein lmo0530 5.2
T1 lag lmo0551 -2,3 hypothetical protein lmo0551 5.2
T1 lag lmo0553 -4,7 hypothetical protein lmo0553 5.2
T2 lag lmo0553 -2,7 hypothetical protein lmo0553 5.2
T2 sol lmo0553 -2,9 hypothetical protein lmo0553 5.2
T2 lag lmo0558 -8,0 conserved hypothetical protein 5.2
T1 lag lmo0559 -2,7 putative membrane protein 5.2
T2 lag lmo0559 -3,0 putative membrane protein 5.2
T2 sol lmo0559 -6,0 putative membrane protein 5.2
T1 lag lmo0573 -7,1 conserved hypothetical protein 5.2
T1 lag lmo0577 -13,1 hypothetical protein lmo0577 5.2
219
T2 lag lmo0577 -2,0 hypothetical protein lmo0577 5.2
T1 lag lmo0578 -9,0 putative conserved membrane protein 5.2
T2 lag lmo0578 -3,3 putative conserved membrane protein 5.2
T2 sol lmo0578 -2,4 putative conserved membrane protein 5.2
T1 lag lmo0584 -3,4 conserved hypothetical membrane protein 5.2
T1 lag lmo0585 -4,9 putative secreted protein 5.2
T1 lag lmo0596 -5,5 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo0624 -6,4 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo0624 -2,8 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo0626 -2,3 similar to unknown protein 5.2
T1 lag lmo0642 -7,7 hypothetical protein lmo0642 5.2
T2 lag lmo0642 -2,4 hypothetical protein lmo0642 5.2
T1 lag lmo0652 -6,7 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo0652 -2,4 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo0653 -3,7 hypothetical protein lmo0653 5.2
T2 lag lmo0653 -3,5 hypothetical protein lmo0653 5.2
T2 lag lmo0658 -4,1 conserved hypothetical protein 5.2
T2 lag lmo0663 -3,3 conserved hypothetical proteins 5.2
T1 lag lmo0670 -4,2 hypothetical protein lmo0670 5.2
T1 lag lmo0688 -4,0 similar to unknown protein 5.2
T1 lag lmo0719 -7,8 similar to unknown protein 5.2
T2 lag lmo0719 -3,6 similar to unknown protein 5.2
T2 sol lmo0719 -2,2 similar to unknown protein 5.2
T1 lag lmo0720 -8,4 hypothetical protein lmo0720 5.2
T2 lag lmo0720 -3,7 hypothetical protein lmo0720 5.2
T1 lag lmo0724 -5,7 similar to B. subtilis YvpB protein 5.2
T2 sol lmo0724 -2,1 similar to B. subtilis YvpB protein 5.2
T1 lag lmo0758 -2,6 hypothetical protein lmo0758 5.2
T2 lag lmo0758 -4,4 hypothetical protein lmo0758 5.2
T1 lag lmo0759 -3,0 hypothetical protein lmo0759 5.2
T2 sol lmo0759 -2,1 hypothetical protein lmo0759 5.2
T1 lag lmo0760 -3,5 hypothetical protein lmo0760 5.2
T1 lag lmo0761 -2,8 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo0761 -2,9 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo0774 -3,1 conserved hypothetical protein 5.2
T2 lag lmo0774 -3,0 conserved hypothetical protein 5.2
T2 sol lmo0774 -3,7 conserved hypothetical protein 5.2
T1 lag lmo0788 -6,8 hypothetical protein lmo0788 5.2
T2 sol lmo0792 -2,2 similar to conserved hypothetical protein 5.2
T2 sol lmo0795 -4,0 conserved hypothetical protein 5.2
T2 sol lmo0796 -5,1 conserved hypothetical protein 5.2
T1 lag lmo0800 -7,0 similar to B. subtilis YqkB protein 5.2
T2 lag lmo0800 -2,7 similar to B. subtilis YqkB protein 5.2
T2 sol lmo0800 -24,1 similar to B. subtilis YqkB protein 5.2
T2 lag lmo0812 -3,2 hypothetical protein lmo0812 5.2
T2 sol lmo0867 -2,3 hypothetical protein lmo0867 5.2
T2 lag lmo0887 -2,3 similar to B. subtilis YdcD protein 5.2
T1 lag lmo0898 -2,8 conserved hypothetical protein 5.2
T2 lag lmo0898 -3,3 conserved hypothetical protein 5.2
T1 lag lmo0903 -4,4 conserved hypothetical protein 5.2
T1 sol lmo0903 -11,1 conserved hypothetical protein 5.2
T2 sol lmo0903 -7,1 conserved hypothetical protein 5.2
T2 lag lmo0910 -2,3 hypothetical protein lmo0910 5.2
220
T1 lag lmo0911 -2,4 hypothetical protein lmo0911 5.2
T1 lag lmo0920 -5,4 similar to B. subtilis YcgR protein 5.2
T1 lag lmo0921
similar to B. subtilis YcgQ protein 5.2
T2 lag lmo0925 -3,8 putative membrane protein 5.2
T2 sol lmo0925 -3,3 putative membrane protein 5.2
T2 sol lmo0927 -2,1 hypothetical transmembrane protein 5.2
T1 lag lmo0930 -3,7 conserved hypothetical protein, similar to B. subtilis YhfI protein 5.2
T2 lag lmo0930 -2,4 conserved hypothetical protein, similar to B. subtilis YhfI protein 5.2
T2 sol lmo0949 -2,1 conserved hypothetical membrane protein 5.2
T1 lag lmo0955 -3,2 hypothetical protein lmo0955 5.2
T2 sol lmo0955 -3,1 hypothetical protein lmo0955 5.2
T1 lag lmo0965 -3,3 similar to B. subtilis YjbK protein 5.2
T2 lag lmo0965 -2,9 similar to B. subtilis YjbK protein 5.2
T1 lag lmo0966 -3,4 hypothetical protein lmo0966 5.2
T2 lag lmo0966 -5,6 hypothetical protein lmo0966 5.2
T2 lag lmo0967 -10,7 similar to B. subtilis YjbM protein 5.2
T1 lag lmo0990 -6,4 conserved hypothetical protein 5.2
T1 lag lmo0994 -8,0 hypothetical protein lmo0994 5.2
T2 lag lmo0994 -10,9 hypothetical protein lmo0994 5.2
T2 sol lmo0994 -2,3 hypothetical protein lmo0994 5.2
T2 lag lmo1001 -2,3 similar to B. subtilis protein YkvS 5.2
T2 sol lmo1001 -3,7 similar to B. subtilis protein YkvS 5.2
T2 lag lmo1008 -4,5 similar to B. subtilis YkuJ protein 5.2
T2 sol lmo1008 -2,9 similar to B. subtilis YkuJ protein 5.2
T2 sol lmo1009 -3,8 similar to B. subtilis YkuL protein 5.2
T1 lag lmo1013 -5,3 similar to conserved hypothetical proteins like to B. subtilis YkuT protein 5.2
T2 lag lmo1013 -2,7 similar to conserved hypothetical proteins like to B. subtilis YkuT protein 5.2
T2 sol lmo1013 -5,5 similar to conserved hypothetical proteins like to B. subtilis YkuT protein 5.2
T2 sol lmo1020 -2,2 similar to B. subtilis YvqF protein 5.2
T2 sol lmo1025 -2,5 hypothetical protein lmo1025 5.2
T2 sol lmo1037 -5,8 highly similar to B. subtilis YoaT protein 5.2
T2 sol lmo1050 -2,0 similar to B. subtilis YdfE protein 5.2
T2 lag lmo1069 -4,4 similar to B. subtilis YlaI protein 5.2
T2 sol lmo1069 -5,3 similar to B. subtilis YlaI protein 5.2
T2 sol lmo1126 -3,9 similar to E. coli YjaB protein 5.2
T1 lag lmo1129 -2,2 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo1129 -3,0 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo1140 -2,5 hypothetical protein lmo1140 5.2
T1 lag lmo1210 -2,9 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo1210 -3,3 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo1211 -2,5 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo1213 -12,1 similar to unknown protein 5.2
T1 lag lmo1220 -3,9 similar to unknown protein 5.2
T2 lag lmo1220 -2,9 similar to unknown protein 5.2
T2 sol lmo1220 -29,7 similar to unknown protein 5.2
T2 lag lmo1236 -4,1 similar to B. subtilis YslB protein 5.2
T2 sol lmo1236 -5,5 similar to B. subtilis YslB protein 5.2
T2 lag lmo1240 -5,4 conserved hypothetical protein, similar to B. subtilis YsnB protein 5.2
T2 sol lmo1240 -7,0 conserved hypothetical protein, similar to B. subtilis YsnB protein 5.2
T1 lag lmo1241 -2,8 hypothetical protein lmo1241 5.2
T1 lag lmo1252 -3,1 similar to B. subtilis YxkD protein 5.2
T2 lag lmo1252 -4,3 similar to B. subtilis YxkD protein 5.2
T2 sol lmo1252 -5,7 similar to B. subtilis YxkD protein 5.2
221
T2 lag lmo1281 -3,1 similar to B. subtilis YneP protein 5.2
T2 sol lmo1281 -4,0 similar to B. subtilis YneP protein 5.2
T2 lag lmo1282 -2,1 similar to B. subtilis YneQ protein 5.2
T2 sol lmo1282 -3,1 similar to B. subtilis YneQ protein 5.2
T2 lag lmo1283 -2,5 similar to Lactococcus lactis LacX protein 5.2
T2 sol lmo1285 -3,9 conserved hypothetical protein, similar to B. subtilis YneT protein 5.2
T2 sol lmo1309 -2,4 similar to E. coli YbdM protein 5.2
T2 sol lmo1310 -3,1 similar to E. coli YbdN protein 5.2
T2 sol lmo1323 -3,2 similar to B. subtilis YlxR protein 5.2
T2 sol lmo1324 -3,4 conserved hypothetical protein, similar to B. subtilis YlxQ protein 5.2
T1 lag lmo1333 -2,8 similar to B. subtilis YqzC protein 5.2
T2 lag lmo1333 -2,1 similar to B. subtilis YqzC protein 5.2
T1 lag lmo1334 -2,3 similar to B. subtilis YqzD protein 5.2
T2 lag lmo1334 -4,6 similar to B. subtilis YqzD protein 5.2
T2 lag lmo1351 -3,9 hypothetical protein lmo1351 5.2
T2 sol lmo1351 -8,6 hypothetical protein lmo1351 5.2
T2 sol lmo1385 -5,2 similar to unknown protein 5.2
T2 sol lmo1395 -2,6 similar to unknown protein 5.2
T2 lag lmo1401 -4,9 conserved hypothetical protein 5.2
T2 sol lmo1408 -3,1 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo1411 -4,3 hypothetical protein lmo1411 5.2
T2 lag lmo1411 -2,3 hypothetical protein lmo1411 5.2
T2 lag lmo1416 -6,0 hypothetical protein lmo1416 5.2
T2 sol lmo1416 -5,4 hypothetical protein lmo1416 5.2
T2 sol lmo1419 -2,1 conserved hypothetical protein 5.2
T1 lag lmo1429 -4,4 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo1429 -3,6 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo1429 -10,9 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo1440 -2,3 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo1440 -2,1 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo1453 -2,8 conserved hypothetical protein 5.2
T2 sol lmo1466 -2,2 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo1468 -3,1 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo1468 -3,2 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo1468 -8,3 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo1485 -3,0 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo1485 -3,8 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo1487 -5,4 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo1487 -3,3 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo1491 -3,0 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo1495 -2,0 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo1510 -2,6 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo1510 -4,7 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo1510 -2,0 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo1511 -3,1 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo1511 -3,4 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo1511 -3,4 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo1515 -2,6 similar to unknown protein 5.2
T2 sol lmo1541 -2,3 similar to unknown protein 5.2
T1 lag lmo1575 -2,1 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo1575 -7,0 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo1575 -4,0 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo1580 -11,9 similar to unknown protein 5.2
222
T1 sol lmo1580 -3,5 similar to unknown protein 5.2
T1 lag lmo1602 -3,0 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo1612 -3,7 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo1613 -3,9 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo1613 -3,1 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo1623 -2,1 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo1623 -8,3 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo1635 -4,3 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo1635 -3,4 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo1635 -3,0 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo1637 -6,7 similar to membrane proteins 5.2
T2 sol lmo1637 -39,4 similar to membrane proteins 5.2
T2 lag lmo1650 -2,7 similar to hypothetical proteins 5.2
T2 sol lmo1650 -3,8 similar to hypothetical proteins 5.2
T2 lag lmo1686 -2,3 similar to hypothetical proteins 5.2
T2 sol lmo1686 -3,6 similar to hypothetical proteins 5.2
T2 lag lmo1690 -2,8 similar to hypothetical proteins 5.2
T2 sol lmo1690 -43,0 similar to hypothetical proteins 5.2
T1 lag lmo1692 -4,0 hypothetical protein lmo1692 5.2
T2 lag lmo1692 -2,6 hypothetical protein lmo1692 5.2
T2 sol lmo1692 -17,8 hypothetical protein lmo1692 5.2
T2 sol lmo1695 -2,1 similar to putative membrane proteins 5.2
T2 lag lmo1696 -2,7 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo1696 -2,1 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo1704 -2,8 similar to conserved hypothetical proteins 5.2
T1 sol lmo1704 -2,8 similar to conserved hypothetical proteins 5.2
T2 lag lmo1704 -2,3 similar to conserved hypothetical proteins 5.2
T2 lag lmo1715 -2,4 similar to hypothetical proteins 5.2
T2 sol lmo1715 -7,9 similar to hypothetical proteins 5.2
T2 sol lmo1750 -3,9 similar to unknown protein 5.2
T2 lag lmo1763 -2,8 similar to unknown protein 5.2
T2 sol lmo1763 -5,0 similar to unknown protein 5.2
T1 lag lmo1790 -4,5 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo1790 -2,2 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo1794 -2,4 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo1795 -2,0 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo1798 -2,7 similar to unknown protein 5.2
T2 lag lmo1814 -3,2 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo1814 -6,0 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo1815 -3,9 similar to unknown protein 5.2
T2 sol lmo1815 -4,1 similar to unknown protein 5.2
T2 lag lmo1828 -2,8 similar to conserved hypothetical protein 5.2
T1 lag lmo1830 -3,9 similar to conserved hypotheticl proteins 5.2
T2 sol lmo1845 -2,3 similar to conserved hypothetical proteins 5.2
T2 lag lmo1854 -2,9 similar to conserved hypothetical proteins 5.2
T2 sol lmo1854 -5,0 similar to conserved hypothetical proteins 5.2
T2 lag lmo1864 -3,4 similar to hemolysinIII proteins, putative integral membrane protein 5.2
T2 sol lmo1864 -4,0 similar to hemolysinIII proteins, putative integral membrane protein 5.2
T2 sol lmo1869 -2,0 similar to conserved hypothetical proteins, putative integral membrane protein 5.2
T2 sol lmo1887 -3,3 similar to conserved hypothetical proteins 5.2
T2 lag lmo1898 -19,9 similar to hypothetical proteins 5.2
T2 sol lmo1898 -2,6 similar to hypothetical proteins 5.2
T1 lag lmo1918 -2,2 similar to unknown proteins 5.2
223
T2 lag lmo1919 -2,4 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo1919 -4,5 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo1945 -8,5 similar to unknown protein 5.2
T2 lag lmo1945 -5,1 similar to unknown protein 5.2
T1 lag lmo1963 -9,1 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo1963 -2,7 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo1963 -3,3 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo1966 -2,4 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo2021 -5,3 similar to unknown protein 5.2
T2 lag lmo2021 -6,8 similar to unknown protein 5.2
T2 lag lmo2028 -3,8 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo2028 -2,8 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo2048 -3,4 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo2053 -3,0 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo2053 -3,0 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo2055 -3,3 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo2055 -3,4 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo2074 -2,5 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo2106 -3,5 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo2127 -9,0 hypothetical protein lmo2127 5.2
T2 lag lmo2127 -2,1 hypothetical protein lmo2127 5.2
T2 sol lmo2127 -2,7 hypothetical protein lmo2127 5.2
T1 lag lmo2160 -2,6 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo2167 -2,4 similar to unknown proteins 5.2
T1 sol lmo2199 -6,4 similar to unknown protein 5.2
T2 lag lmo2199 -2,5 similar to unknown protein 5.2
T2 sol lmo2199 -7,6 similar to unknown protein 5.2
T1 lag lmo2204 -7,1 similar to unknown protein 5.2
T2 lag lmo2204 -2,4 similar to unknown protein 5.2
T2 sol lmo2204 -8,3 similar to unknown protein 5.2
T2 lag lmo2216 -2,8 similar to histidine triad (HIT) protein 5.2
T1 lag lmo2218 -2,2 hypothetical protein lmo2218 5.2
T2 sol lmo2218 -4,2 hypothetical protein lmo2218 5.2
T1 lag lmo2234 -5,4 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo2234 -2,7 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo2256 -8,1 similar to unknown proteins 5.2
T2 lag lmo2256 -2,3 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo2256 -14,0 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo2261 -4,1 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo2318 -4,0 hypothetical protein lmo2318 5.2
T2 sol lmo2318 -2,0 hypothetical protein lmo2318 5.2
T1 lag lmo2354 -2,8 conserved hypothetical protein 5.2
T1 lag lmo2361 -14,3 conserved hypothetical protein 5.2
T2 lag lmo2386 -3,6 similar to B. subtilis YuiD protein 5.2
T1 lag lmo2387 -3,1 conserved hypothetical protein 5.2
T1 lag lmo2391 -4,0 conserved hypothetical protein similar to B. subtilis YhfK protein 5.2
T1 lag lmo2393 -4,1 similar to B. subtilis YuzD protein 5.2
T2 lag lmo2393 -4,9 similar to B. subtilis YuzD protein 5.2
T2 sol lmo2393 -8,7 similar to B. subtilis YuzD protein 5.2
T1 lag lmo2399 -2,6 similar to conserved hypothetical proteins 5.2
T2 lag lmo2401 -3,6 similar to conserved hypothetical protein and to B. subtilis YutF protein 5.2
T2 lag lmo2402 -2,2 similar to B. subtilis YutD protein 5.2
T2 lag lmo2403 -2,5 similar to B. subtilis YunD protein 5.2
224
T2 lag lmo2405 -5,3 hypothetical protein lmo2405 5.2
T1 lag lmo2411 -3,3 similar to conserved hypothetical proteins 5.2
T1 lag lmo2412 -2,7 similar to conserved hypothetical proteins 5.2
T2 lag lmo2412 -2,3 similar to conserved hypothetical proteins 5.2
T2 lag lmo2426 -4,1 conserved hypothetical proteins 5.2
T1 lag lmo2435 -3,0 similar to B. subtilis YfhL protein 5.2
T1 lag lmo2437 -6,6 hypothetical protein lmo2437 5.2
T1 lag lmo2438 -6,3 hypothetical protein lmo2438 5.2
T2 sol lmo2438 -4,9 hypothetical protein lmo2438 5.2
T2 sol lmo2440 -2,4 hypothetical protein lmo2440 5.2
T2 sol lmo2442 -2,3 hypothetical protein lmo2442 5.2
T1 lag lmo2484 -3,0 similar to B. subtilis YvlD protein 5.2
T1 lag lmo2485 -3,3 similar to B. subtilis yvlC protein 5.2
T1 lag lmo2486 -3,8 hypothetical protein lmo2486 5.2
T2 lag lmo2486 -2,4 hypothetical protein lmo2486 5.2
T2 lag lmo2490 -2,2 similar to B. subtilis CsbA protein 5.2
T1 lag lmo2508 -3,5 similar to conserved hypothetical proteins 5.2
T2 lag lmo2527 -2,5 similar to B. subtilis YwzB protein 5.2
T2 sol lmo2527 -2,7 similar to B. subtilis YwzB protein 5.2
T1 lag lmo2563 -2,1 conserved hypothetical protein 5.2
T2 lag lmo2563 -7,2 conserved hypothetical protein 5.2
T2 sol lmo2563 -2,5 conserved hypothetical protein 5.2
T1 lag lmo2565 -4,3 conserved hypothetical protein 5.2
T2 lag lmo2565 -3,0 conserved hypothetical protein 5.2
T2 sol lmo2565 -6,6 conserved hypothetical protein 5.2
T2 lag lmo2578 -3,1 hypothetical protein lmo2578 5.2
T1 lag lmo2602 -6,7 conserved hypothetical protein 5.2
T2 lag lmo2639 -6,5 hypothetical protein lmo2639 5.2
T2 lag lmo2640 -7,8 hypothetical protein lmo2640 5.2
T1 lag lmo2669 -15,5 hypothetical protein lmo2669 5.2
T2 lag lmo2669 -4,8 hypothetical protein lmo2669 5.2
T2 sol lmo2669 -2,9 hypothetical protein lmo2669 5.2
T1 lag lmo2670 -4,7 conserved hypothetical protein 5.2
T1 lag lmo2673 -5,1 conserved hypothetical protein 5.2
T1 lag lmo2723 -2,4 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo2725 -2,8 conserved hypothetical proteins 5.2
T1 lag lmo2729 -8,9 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo2736 -2,5 conserved hypothetical protein 5.2
T1 lag lmo2740 -2,0 hypothetical protein lmo2740 5.2
T1 lag lmo2742 -3,4 hypothetical protein lmo2742 5.2
T1 lag lmo2748 -2,3 similar to B. subtilis stress protein YdaG 5.2
T1 lag lmo2832 -4,1 similar to unknown proteins 5.2
T2 sol lmo2832 -3,0 similar to unknown proteins 5.2
T1 lag lmo2835 -4,8 highly similar to an E. coli protein 5.2
T1 lag recX -4,1 Regulatory protein recX 5.2
T2 sol rpoZ -2,2 DNA-directed RNA polymerase subunit omega 5.2
T1 lag sepA -3,2 hypothetical protein lmo2157 5.2
T2 sol sod, -3,1 superoxide dismutase 5.2
225
Résumé
La listériose est une maladie rare mais grave d’origine alimentaire provoquée par Listeria
monocytogenes. En raison de sa capacité de survie importante dans les sols, la présence de cette bactérie
dans les effluents d’élevages porcins destinés à être épandus constitue un problème de santé publique.
L’un des facteurs pouvant expliquer la persistance de L. monocytogenes dans l’environnement est sa
capacité à entrer dans un état viable mais non cultivable (VNC). Nos travaux avaient pour objectif, d’une
part de suivre le comportement de L. monocytogenes dans les effluents d'élevages porcins (lisier et
effluent de lagune) et notamment les formes VNC, et d’autre part d’étudier son adaptation lors de son
transfert dans les effluents de lagune et dans le sol.
Dans un premier temps, nous avons optimisé les conditions de la qPCR couplée au propidium
monoazide (qPCR-PMA) afin d’adapter cette méthode au dénombrement des formes VNC de
L. monocytogenes dans le lisier et l’effluent de lagune. Dans un second temps, nous avons comparé par
méthode culturale, qPCR-PMA et qPCR, la survie de deux souches de L. monocytogenes RifR de
sérogroupes IIb et IVb inoculées dans deux lisiers et dans deux effluents de lagune incubés à 8°C et 20°C.
Malgré leur origine et leur sérotype différents, les deux souches ont présenté une survie similaire dans
toutes les conditions testées. La survie des deux souches a été affectée par la température (une persistance
plus élevée a été observée à 8°C) et par l’origine des effluents. Cette étude a mis en évidence que
L. monocytogenes était capable d’entrer dans l’état VNC dans les lisiers et les effluents de lagune
indépendamment de la température. Les formes VBNC qui représentaient 83 à 99,8% des bactéries
viables après 60 jours d’incubation, sont apparues dès les premières heures de contact avec les effluents.
Leur proportion, plus élevée en début d’expérience dans les lisiers que dans les effluents de lagune, était
cependant du même ordre de grandeur dans les deux types de matrices après 60 jours.
Afin de mieux comprendre l’adaptation de L. monocytogenes lors de son transfert dans l’effluent
de lagune et dans le sol, nous avons comparé le transcriptome par la technologie RNA-seq de la souche
CIP 110868, isolée d’un lisier, inoculée dans des extraits stériles d’effluent de lagune et de sol. L’analyse
du transcriptome a été réalisée à T0 (génome de référence), après 20 minutes et 20 heures d’incubation.
L’analyse par enrichissement fonctionnel a révélé des modifications transcriptomiques dès les 20
premières minutes d’incubation dans les deux matrices. Une augmentation du taux de transcrit de gènes
impliqués dans le transport de protéines et de sucres a été observée. Le taux de transcrit des gènes
contrôlés par le facteur sigmaB est augmenté indiquant la mise en place d’une réponse aux stress
osmotiques et thermiques. De plus, l’adaptation de la souche CIP 110868 dans les extraits de sol et
d’effluent de lagune s’est accompagnée d’une augmentation au cours du temps des taux de transcrit des
gènes impliqués dans la virulence et des gènes sous le contrôle du régulateur prfA.
Mots clés : L. monocytogenes, persistance, effluents d’élevages porcins, VBNC, régulation
transcriptionnelle