karl michael beltrán ricaurte
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EVALUACIÓN DEL PAPEL DEL ESTRÉS DE RETÍCULO SOBRE LA AUTOFAGIA INDUCIDA POR LA FRACCIÓN ANTITUMORAL P2ET DE
CAESALPINIA SPINOSA
Karl Michael Beltrán Ricaurte
TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial para optar por el título de
MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL
PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA
FACULTAD DE CIENCIAS CARREA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL
BOGOTA, COLOMBIA
2016
NOTA DE ADVERTENCIA
Artículo 23 de la resolución N° 13 de Julio de 1946 “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos
en sus trabajos de tesis. Sólo velará porque no se publique nada contrario al dogma
y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra
persona alguna, antes bien se vean en ellas el anhelo de buscar la verdad y la
justicia”
Agradecimientos.
Inicialmente a mis padres, quienes me dieron la oportunidad de estudiar lo que me
gusta. De la misma forma, un agradecimiento especial a el profesor Alfonso Barreto,
quien más que un profesor, fue un modelo a seguir. Por último, a Karol Prieto, por
su disposición, entrega y paciencia a la hora de trasmitir el conocimiento.
TABLA DE CONTENIDO
1. INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 1
2. JUSTIFICACIÓN ......................................................................................................... 3
3. OBJETIVOS ................................................................................................................. 5 3.1 General ................................................................................................................................. 5 3.2 Específicos. .......................................................................................................................... 5
4. Marco Teórico ............................................................................................................. 6 4.1 Cáncer ................................................................................................................................... 6
4.1.1 Cáncer de piel tipo melanoma ...................................................................................... 7 4.1.2 Alteraciones genéticas en melanoma .......................................................................... 8
4.2 Fitoterapia ............................................................................................................................. 9 4.2.1 P2ET en tratamiento del cáncer ...................................................................................... 10 4.3 Estrés celular...................................................................................................................... 12
4.3.1 Estrés de retículo .......................................................................................................... 12 4.3.2 Respuesta al estrés de retículo endoplasmatico ..................................................... 14
4.3.3 Estrés de retículo y microambiente ................................................................................ 17 4.4 Autofagia ............................................................................................................................. 19
4.4.1 Estrés de retículo y autofagia. ..................................................................................... 21
5. Metodología ............................................................................................................... 23 5.1 Cultivo celular y tratamientos. ......................................................................................... 23 5.2 Construcción de los transfectantes. ............................................................................... 24 5.3 Evaluación del estrés de retículo. ................................................................................... 24 5.4 Evaluación de la autofagia. .............................................................................................. 25
6. Resultados y Discusión ......................................................................................... 26 6.1 La fracción antitumoral P2ET induce estrés de retículo en la línea celular B-16 .... 26 6.2 La autofagia inducida por p2ET está relacionada parcialmente con el estrés de Retículo Endoplasmatico............................................................................................................... 32
7. Conclusiones ............................................................................................................ 40
8. Bibliografía ................................................................................................................ 41
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. La fracción anti-tumoral p2Et induce estrés de retículo ……………… 28
Figura 2. Inmunoblot para la detección de GRP78 ……………………………….. 34
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1. INTRODUCCIÓN
El uso de plantas medicinales ha sido reconocido como una estrategia alterna para
el tratamiento de diferentes enfermedades, incluyendo el cáncer. El mecanismo de
acción de las plantas medicinales, debido a la heterogeneidad funcional de las
fracciones empleadas, representa una ventaja frente a las drogas sintéticas ya que
disminuye la probabilidad de la aparición de clones tumorales resistentes (Kuete et
al., 2016). En la medicina china tradicional se emplean una variedad de plantas a
las cuales se les han atribuido funciones anti-tumorales con un incremento en la
supervivencia de los pacientes.
Recientemente se obtuvo en el grupo de inmunología y biología celular de la
Pontificia Universidad Javeriana la fracción denominada P2Et a partir de
Caesalpinia spinosa, nombre común TARA, árbol nativo del Perú y ampliamente
distribuido en gran parte de América Latina, incluyendo Colombia. La estructura
química de esta fracción ha sido caracterizada como un compuesto rico en
galotaninos, que son polímeros formado por la esterificación del ácido gálico y su
unión con un poliol; de igual manera, contiene derivados de ácido quínico en altas
proporciones, así como compuestos que contienen pentagaloilglucosa (Sandoval et
al., 2016). Estudios anteriores demuestran que el p2Et presenta actividades
antitumorales en modelos de cáncer de seno y melanoma, reflejado en ensayos in
vivo. De igual manera, se ha visto que esta actividad antitumoral de la fracción p2Et
depende de la participación del sistema inmune (Gómez et al., 2016) (Ureña et al.,
2015). Por otro lado, acompañando la inducción de muerte celular por apoptosis se
ha visto que el p2Et también es capaz de inducir un flujo autofagico completo. La
autofagia es un mecanismo evolutivo altamente conservado de degradación
lisosomal de proteínas, macromoléculas, ribosomas y orgánelos que ayuda a
mantener la homeostasis en la célula. Actualmente en el laboratorio de inmunología
y biología celular se está evaluando si la inducción de autofagia por el p2Et hace
parte de un mecanismo pro-tumorogenico o anti-tumorogenico, ya que se ha
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demostrado que dependiendo del tipo de célula y el contexto, la macro autofagia
puede tener diferentes roles. Por ejemplo, en algunas células de cáncer la autofagia
puede funcionar como un mecanismo supresor de tumor, así como una autofagia
defectuosa se asocia con una carcinogénesis; por otro lado, en células normales y
algunas cancerígenas, pasa a ser un mecanismo de protección contra el estrés
celular (Dalby et al., 2010).
Por otro lado, el Retículo Endoplasmatico (RE) es el compartimiento en el que se
produce el plegamiento de proteínas antes de su transporte a la superficie
extracelular o a diferentes orgánelos intracelulares. Estudios recientes han
demostrado un incremento de estrés de retículo en las células tumorales como
mecanismo de supervivencia. El RE funciona como un sensor de estrés celular
mediante la activación del mecanismo conocido como Respuesta a Proteínas Mal
plegadas o UPR por sus siglas en ingles. En células de mamíferos, las proteínas
PERK, IRE1, y ATF6 detectan la presencia de proteínas mal plegadas en el lumen
del RE y transducen las señales al citoplasma y el núcleo. De igual manera, el estrés
del RE también ha sido asociado con la inducción de autofagia con el fin de
prolongar la supervivencia de las células en condiciones de estrés, sin embargo, el
estrés del RE y la autofagia también pueden inducir la muerte celular en los
tratamientos anti-cancerígenos (Ogata et al., 2006). Teniendo en cuenta lo anterior,
el propósito de este trabajo es determinar si previo a la autofagia inducida por p2Et
se induce estrés del RE.
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2. JUSTIFICACIÓN
El cáncer está asociado principalmente a alteraciones genéticas que conllevan a un
aumento en la tasa de proliferación, así como a una baja respuesta inmune frente a
estas células tumorales, entre otros factores asociados. La búsqueda de fármacos
para el tratamiento de esta enfermedad se ha enfocado en encontrar tratamientos
que logren disminuir la viabilidad de las células cancerígenas, así como estimular
una buena respuesta inmune frente a estas a bajos costos. En base a esto,
recientemente se han descritos tratamientos naturales y sintéticos como la
radiación, oxaliplatino, 7A7, entre otros, que pueden llegar a inducir una muerte
celular inmunogenica o ICD por sus siglas en inglés (Dudek et al., 2013). La ICD
puede estimular el sistema inmunológico mediante la expresión de patrones
moleculares asociados a daño (DAMPs) capaces de actuar como señales de
peligro. En condiciones de muerte, estrés o daños celulares, las células liberan o
exponen estos DAMPs, los cuales pueden funcionar como adyuvantes o señales de
peligro para el sistema inmune innato (Songa et al., 2016).
La fracción P2Et obtenida en el grupo de inmunología y biología celular de la
Pontificia Universidad Javeriana ha demostrado tener efectos anti-tumorales sobre
modelos de cáncer de seno y melanoma que vienen acompañados con la inducción
de autofagia y expresión de DAMPs. La autofagia se ha asociado en algunos casos
como un mecanismo de supervivencia celular en etapas avanzadas, lo que genera
una resistencia a los fármacos, y en otros como un mecanismo asociado a muerte
celular en estadios tempranos (Kroemer et al., 2010). Esta dualidad en el rol de la
autofagia asociada a P2Et aún no es del todo clara, y actualmente se está
evaluando su función en las células tumorales, sin embargo es posible que este
determinada principalmente por el tipo de estrés generado en la célula frente al
tratamiento.
El Retículo Endoplasmatico (RE) está asociado a la secreción de proteínas,
modificaciones postranscripcionales y el plegamiento de estas. Este organelo puede
4
actuar como sensor de estrés en la célula mediante el mecanismo UPR e inducir la
translocación de calreticulina en la membrana celular como señal de muerte
inmunogenica. El estrés de retículo parece estar vinculado a la autofagia de alguna
manera, por ejemplo, proteínas tóxicas que se acumulan en el RE pueden ser
eliminadas por medio de la autofagia, sugiriendo que la autofagia inducida por el
estrés de retículo puede desempeñar un papel en la protección de la célula tumoral.
Teniendo en cuenta lo anterior, poder determinar la conexión que existe entre el
estrés de retículo y la autofagia inducida por la fracción P2Et representa un aporte
importante a la comunidad científica ya que podría ayudar a entender los
mecanismos asociados a favorecer una muerte inmunogenica, así como desarrollar
futuros fármacos asociados a esta fracción.
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3. OBJETIVOS 3.1 General Estudiar el papel del estrés del retículo en la inducción de autofagia por el extracto antitumoral P2Et de Caesalpinia spinosa en la línea de melanoma B16 3.2 Específicos. Determinar si el p2Et induce estrés de retículo en la línea celular B-16 usando el sistema de expresión eIF2-a S/S o S/A PEGFP-C1 Determinar el efecto de la inhibición del estrés de retículo sobre la autofagia
inducida por la fracción P2Et en la línea tumoral B16
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4. Marco Teórico
4.1 Cáncer
El cáncer puede ser definido como una enfermedad en la que un grupo de células
anormales (cancerígenas) crecen sin control haciendo caso omiso a las
regulaciones que normalmente se aplican sobre el ciclo de división celular. Las
células normalmente son sometidas a una serie de señales que determinan si esta
debe dividirse, diferenciarse o morir. Las células cancerígenas desarrollan un grado
de autonomía con respecto a estas señales, lo que resulta en el crecimiento y la
proliferación incontrolada, llevando también a un crecimiento anormal de tejido, lo
que se conoce como tumor. Si se permite que esta proliferación se desarrolle y
propague, puede resultar mortal para el organismo, de hecho, alrededor del 90% de
las muertes relacionadas con cáncer se deben a la propagación del tumor, lo que
se conoce como metástasis (Hejmadi, 2010).
Los avances relacionados con cáncer en los últimos 50 años han permitido entender
un poco cómo las células cancerígenas desarrollan esta autonomía frente al ciclo
de división celular. Lo anterior ha permitido definir el cáncer como una enfermedad
que implica cambios o mutaciones en el genoma de la célula. Estos cambios
(mutaciones de ADN) producen proteínas que alteran el equilibrio celular entre la
división celular y la inactividad, lo que resulta en células que continúan dividiéndose
que finalmente llegan a formar un tumor. Actualmente se cree que el cáncer es una
enfermedad de múltiples genes y pasos procedentes de una sola célula anormal
(origen clonal) con una secuencia de ADN alterada (mutación). Una proliferación
descontrolada de esta célula anormal es seguida por una segunda mutación que
conduce a una etapa ligeramente aberrante, sucesivas rondas de mutaciones y la
expansión selectiva de estas células da como resultado la formación de una masa
tumoral (Hejmadi, 2010).
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4.1.1 Cáncer de piel tipo melanoma
La piel es un tejido complejo derivado del mesodermo y ectodermo embrionario que
proporciona una barrera entre el organismo y el medio ambiente. La epidermis, la
capa externa de la piel, es un epitelio escamoso de múltiples capas en su mayoría
formado por queratinocitos. Además de queratinocitos, existen otros tres tipos de
células especializadas en la epidermis; los melanocitos productores de melanina, la
célula de Langerhans, que actúa como una célula presentadora de antígenos en los
ganglios linfáticos; y las células de Merkel, que se consideran como un
mecanorreceptor. Adicionalmente, la epidermis tiene la función de proteger al
organismo de los ataques ambientales; como la radiación ultravioleta (UV),
productos químicos, virus y otros patógenos. Como resultado, las células
epidérmicas tienen un alto riesgo en la adquisición de mutaciones de genes que
podrían conducir al desarrollo de cáncer. En particular, la exposición de luz UV es
el principal responsable de las tres formas principales de cáncer de piel humana: el
melanoma maligno, carcinoma de células basales (BCC) y el carcinoma de células
escamosas (SCC) (Pons et al).
La incidencia del melanoma maligno ha incrementado en los últimos años. Los
estudios de vigilancia, epidemiologia e investigación en los Estados Unidos
mostraron un incremento en la tasa de incidencia para desarrollar este tipo de
cáncer en mujeres; para el año 1975 se registraron 7.44 casos por cada 100,000,
para el año 2011 se registraron 18,35 casos por cada 100,000. El melanoma
cutáneo es el cáncer de piel más agresivo y sigue siendo uno de los cánceres
humanos más difíciles de tratar. La enfermedad en etapa temprana es curable
mediante escisión quirúrgica, lo que resulta en una tasa de supervivencia promedio
de 5 años del 99%, una vez que se produce metástasis, la tasa de supervivencia se
reduce a menos del 10% (Tellez et al., 2016).
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Este tipo de cáncer se caracteriza porque surge de la alteración de los melanocitos,
células productoras de pigmento que residen en la base de la epidermis. Estas
células normalmente no se dividen rápido, pero algunas alteraciones como la luz
ultravioleta (UV) les producen una mayor tasa de división, además de producir
grandes cantidades de melanina. La distribución desigual de esta melanina conlleva
a que se formen lesiones cutáneas benignas conocidas como nevus, grupo de
melanocitos benignos (Pons et al).
4.1.2 Alteraciones genéticas en melanoma
Los cambios genéticos y fisiológicos que presentan los melanocitos en el cáncer de
piel tipo melanoma están sujetos a cambios del medio ambiente donde el principal
factor es la exposición a la luz UV presente en los rayos solares, de igual manera,
el microambiente compuesto de queratinocitos y matriz extracelular juega un papel
clave en el control de la proliferación y la expresión de moléculas de adhesión. La
pérdida de la expresión de moléculas implicadas en el contacto célula-célula y
células-matriz provocan un cambio de crecimiento radial a un crecimiento vertical,
característico de esta enfermedad (Corazzaria et al., 2013).
Las investigaciones relacionadas con alteración en el genoma de los melanocitos
han identificado varias mutaciones genéticas asociadas con el desarrollo y la
progresión del melanoma, lo que resulta en la quimio-resistencia y le confiere la
supervivencia al tumor. Una de las mutaciones menos frecuentes (5%-10%) en este
tipo de cáncer corresponde a la proteína supresora de tumores p53, sin embargo,
también se ha observado que se pueden inactivar funcionalmente sus vías de
señalización, lo cual es más frecuente. A pesar de que se ha relacionado algunos
genes con el melanoma se ha establecido que las mutaciones en la vía Ras/Raf son
las que tienen el mayor impacto en el desarrollo y progresión del tumor (Corazzaria
et al., 2013).
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4.2 Fitoterapia
La fitoterapia o la medicina herbal están centradas en la utilización de diferentes
partes de la planta como las hojas, raíces, tubérculos, tallos e incluso flores para
propósitos medicinales según la Organización Mundial de la Salud (OMS). De este
modo, los propósitos en investigación están en caminados a estabilizar las
fracciones naturales para poder resolver la eficacia terapéutica y las propiedades
anti-neoplásicas de las plantas medicinales. Dentro de los beneficios de este tipo
de terapias podemos destacar su costo y complejidad de las fracciones obtenidas a
partir de las plantas, donde se puede inducir más de un efecto sobre las células
cancerígenas (Nema et al. 2012).
Un ejemplo del potencial de los compuestos naturales son los compuestos fenólicos.
La dieta humana incluye un complejo de polifenoles a base de plantas. Los estudios
han demostrado que estos compuestos fenólicos tienen efectos citotóxicos en
diferentes tumores. Los principales mecanismos de estos compuestos se llevan a
cabo mediante la inducción de apoptosis. La curcumima es un compuesto fenólico
derivado de la rizoma de la cúrcuma. Investigaciones relacionadas con el cáncer
han demostrado que esta planta inhibe el proceso carcinogénico en la mayoría de
los cánceres, incluyendo el cáncer colorrectal, el páncreas, el estómago y la
próstata. La curcumina aumenta la respuesta de las células tumorales a la
doxorrubicina mediante el bloqueo de la vía de señalización de NF-Kβ. Así mismo,
los estudios de ensayos clínicos de fase II han demostrado que la curcumina no es
tóxica para humanos hasta una dosis de 8000 mg/día (Safarzadeh et al., 2014).
En cáncer, la terapia actualmente conocida como la terapia mixta, es decir la que
contempla la muerte tumoral, junto con la inducción de la respuesta inmune, es la
que tiene mayor probabilidad de generar una protección a largo plazo. Dentro de
este marco de búsqueda de terapias y comprensión de los mecanismos implicados
en la destrucción de los tumores, se han logrado encontrar fracciones, como el P2Et
obtenido de la planta Caesalpinia spinosa, la cual presentan actividad antitumoral
frente a diferentes líneas de células tumorales (Ureña et al., 2007) y aumenta la
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susceptibilidad a la quimioterapia en forma selectiva de línea celular y de la terapia
antitumoral (Castañeda et al., 2012).
4.2.1 P2ET en tratamiento del cáncer
En el grupo de inmunología y biología celular de la Pontificia Universidad Javeriana
se ha venido trabajando sobre la búsqueda de compuestos que tengan funciones
antitumorales derivados de plantas medicinales dadas sus ventajas frente a
tratamientos con fármacos. De esta forma, se obtuvo una fracción denominada
P2Et, proveniente de la planta Caesalpinia spinosa, la cual está normalizada
químicamente y en proceso de escalamiento. Esta fracción contiene derivados de
ácido galoilquinico en altas proporciones, así como pentagalloil glucosa y
compuestos que contienen ácido gálico (galatos) en proporciones más bajas
(Sandoval et al., 2016). Con esta fracción, se ha evaluado la actividad in vivo e in-
vitro en diferentes modelos, donde se incluye la línea de melanoma B-16. En este
modelo de melanoma, se ha observado que el tratamiento con este extracto se
asocia a la generación de una muerte inmunogenica (Gómez et al., 2016)
La muerte celular inmunogénica (MCI) es un tipo de muerte celular que ha sido
descrita recientemente después del tratamiento con algunos fármacos
convencionales empleados en quimioterapia, tales como las antraciclinas. Se ha
demostrado que estos fármacos quimioterapéuticos requieren un sistema
inmunológico intacto para ser eficaz contra los tumores. Estos agentes terapéuticos
inducen la activación de las células inmunes y una respuesta anti-tumoral. Se ha
propuesto que existen distintas señales moleculares proporcionadas por las células
moribundas que cooperan para hacer que las células tengan una muerte
inmunogénica y como consecuencia la activación del sistema inmune. Las
principales señales asociadas a este tipo de muerte son la exposición de
calreticulina (CRT) por la membrana celular, la secreción de ATP y
HMGB1(Kroemmer., 2013).
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Gómez et al. en el año 2016 demostró que el tratamiento in vivo con P2Et presenta
actividad antitumoral, evidenciado por el retraso en el crecimiento del tumor, en un
modelo in vivo de melanoma subcutáneo. Se puso en evidencia que el tratamiento
subcutáneo con P2Et in vivo en ratones C57BL/6 tiene la capacidad de tener un
efecto directo para inhibir el crecimiento del tumor, así mismo, se demostró que la
vacunación de ratones con células B16F10 tratadas con P2Et muestra un retraso
en el crecimiento del tumor respecto a ratones no vacunados, de hecho, se
demostró que estos ratones tratados muestran una mayor frecuencia de células T
CD8 activadas y de memoria. También se logró demostrar que esta propiedad anti-
tumoral del p2Et es dependiente del sistema inmune ya que induce una muerte
celular inmunogénica, probablemente mediante la activación de células y el
incremento de la generación de células T antígeno-especificas, determinado por
experimentos realizados en ratones depletados de CD8 y CD4. Esta inducción de
la respuesta inmune puede estar asociado con el hecho de que el p2Et in vitro
ocasiona una muerte celular que viene acompañada de la expresión de las 3
señales de una muerte celular inmunogenica, como lo son la expresión de
calreticulina, la deslocalización de HMGB1 y la liberación de ATP. Estas señales
inmunogénicas al parecer son las responsables de activar el sistema inmune y
participar en la actividad anti tumoral de la fracción p2Et (Gómez et al., 2016).
Por otro lado, estas señales inmunogénicas al parecer dependen del tipo de estrés
generado en la célula. Este estrés celular puede ser evidenciado a través del estrés
de retículo, el cual favorece la expresión de calreticulina sobre la membrana. De
igual forma, la autofagia ha sido descrita como un requerimiento esencial para la
inducción de MCI mediante la liberación de ATP. En este sentido, Gómez et al.
también demostraron que la fracción P2Et tiene la capacidad de inducir un flujo
autofagico completo evidenciado mediante la degradación de p62 y una alta
expresión de LC3. Este resultado sugiere que el fenotipo de MCI inducido por la
fracción P2Et está acompañado por la inducción de autofagia. Así mismo,
experimentos preliminares han mostrado que el P2Et puede inducir estrés del
retículo sobre las células B16.
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4.3 Estrés celular
Todas las células y en especial las células eucarióticas a lo largo de su desarrollo
se someten a diferentes situaciones de estrés provenientes del medio ambiente
externo y/o el microambiente que las rodea. Por lo tanto, dependiendo de una red
de señales generadas en sitios subcelulares específicos, las células pueden
responder al estrés intentando recuperar la homeostasis o mediante la activación
de cascadas moleculares que conducen a la muerte celular por apoptosis o necrosis
(Galluzzi, Bravo, & Kroemer, 2014). Son varios los factores que inducen estrés en
la célula, dentro de ellos se puede encontrar; agotamiento de nutrientes y de ATP,
bajas concentraciones de oxígeno, estrés oxidativo, choque térmico, altas presiones
osmóticas, rayos UV, hipertermia, entre otros. Así mismo, se puede inducir estrés a
partir de tratamientos antitumorales, sin embargo, estos van a provocar respuestas
diferenciales en cada organelo, decidiendo así el destino final de la célula (Mansouri
et al., 2012).
El retículo endoplásmico, el aparato de golgi, la mitocondria, los lisosomas y el
núcleo son los principales orgánelos que intervienen en las respuesta al estrés
celular. Cada organelo posee sensores que detectan alteraciones específicas, lo
que conlleva a que se active localmente las vías de transducción de señales.
Adicionalmente, la respuesta en cada organelo está caracterizada por la
permeabilización de la membrana, seguida de la secreción de unas señales que
permiten una comunicación inter-organelos, lo que provoca que otros organelos
también respondan frente a la situación de estrés (Ferri & Kroemer, 2001).
4.3.1 Estrés de retículo
El retículo endoplasmatico (RE) es un organelo fundamental presente en todas las
células eucariotas. Está compuesto principalmente por túbulos membranosos
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ramificados, vesículas y cisternas que conforman un compartimiento subcelular con
diversas funciones. El RE rugoso tiene en su superficie externa ribosomas que le
permite desempeñar un papel clave en la síntesis y secreción de proteínas. Por otro
lado, el RE liso carece de ribosomas y esta principalmente asociado a la síntesis de
ácidos grasos y fosfolípidos, ensamblaje de bicapas lipídicas, metabolismo de
carbohidratos y la regulación de la homeostasis de calcio (Schonthal, 2012).
El retículo endoplasmatico es un organelo ampliamente dinámico y sus funciones
pueden estar influenciadas por parámetros que pueden tener origen al interior de la
célula, así como hacer parte del microambiente. Por ejemplo, la disponibilidad de
oxígeno (hipoxia) o glucosa (hipoglucemia), la hipertermia, la acidosis, los niveles
de calcio, las condiciones redox, los niveles de energía (modulada por la hipoxia y
la hipoglucemia), y otros factores pueden impactar sobre el buen funcionamiento de
este organelo, lo que resulta en un estrés de retículo conllevando a que se altere el
plegamiento de proteínas en el lumen del RE. El plegamiento de proteínas es un
proceso complejo que depende de la correcta interacción entre chaperonas y las
enzimas implicadas en la glicosilación, así como los niveles de calcio adecuadas y
un entorno oxidante. El estrés de retículo afecta este proceso principalmente, lo que
conlleva a la acumulación de proteínas sin plegar o mal plegadas, seguido de la
activación de un proceso celular especifico conocido como la respuesta a proteínas
mal plegadas o UPR por sus siglas en ingles (Schonthal, 2012) (Hansen &
Ja a ttela , 2007).
La acumulación de proteínas sin plegar, mal plegadas, insolubles o dañadas puede
causar daños irreparables en las funciones de la célula y poner en riesgo su
supervivencia. El primer mecanismo que se activa para disminuir este riesgo es la
respuesta UPR, que tiene como objetivo el correcto plegamiento y procesamiento
de las proteínas, sin embargo, las proteínas que no pueden ser reparadas van a ser
removidas de la célula principalmente mediante dos mecanismos; uno de ellos es
la degradación asociada al retículo (ERAD) que exporta las proteínas dañadas de
nuevo al citoplasma y las degrada por medio de los proteasomas, y el otro proceso
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se lleva a cabo mediante la activación de la autofagia, mecanismo para el reciclaje
de los excedentes o componentes celulares defectuosos (Schonthal, 2012).
Frente a condiciones de estrés de retículo se ha reportado que la principal respuesta
ultraestructural está representada por una dilatación pronunciada del lumen del
retículo. Por ejemplo, las células de levadura son capaces de expandir el volumen
del retículo 5 veces más de lo normal en tratamientos con inductores de una
respuesta UPR, y efectos similares se han observado en células de mamífero en
ensayos in vivo e in vitro (Schonthal, 2012).
4.3.2 Respuesta al estrés de Retículo Endoplasmatico
Como se mencionaba anteriormente, una variedad de parámetros puede inducir una
respuesta UPR en la célula. Por ejemplo, bajo condiciones de un bajo suministro de
glucosa (hipoglucemia), la N-glicosilación ligada a las proteínas se deteriora. Una
perdida en el balance de la homeostasis redox puede ser causada por agentes
oxidantes o reductores, así como por la hipoxia, lo que interfiere con las uniones
disulfuro de las proteínas. Los niveles aberrantes de calcio tienen efecto
principalmente sobre las chaperonas dependientes de calcio (Schonthal, 2012).
Entre las proteínas residentes del retículo endoplasmatico, la chaperona GRP78 se
destaca porque además de su función para fijar calcio y procesar proteínas, ejerce
un papel clave en la iniciación de una respuesta frente a estrés de retículo/
respuesta UPR. Esta proteína fue caracterizada en un principio por estar regulada
principalmente por glucosa, donde la restricción de la disponibilidad de este
carbohidrato en el medio de cultivo da lugar a una transcripción pronunciada. Sin
embargo, un gran número de estudios posteriores establecieron que una variedad
de alteraciones celulares y microambientales, así como muchas de las
intervenciones farmacológicas, puede conducir a una mayor expresión de GRP78,
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junto con un aumento en el estrés de RE. Adicionalmente, se ha propuesto que
GRP78 también puede estar presente fuera del RE, por ejemplo, la proteína se
encuentra en el citosol, en la mitocondria, en el núcleo, y en la superficie celular de
las células tumorales (Schonthal, 2012).
En células que no están sometidas a condiciones de estrés, una fracción de GRP78
está unida a tres proteínas transmembrana del RE diferentes; la quinasa
dependiente de inositol/ endoribonucleasa 1 (IRE1), la proteína quinasa activada
por doble cadena de RNA (PERK), y el factor activador de la transcripción 6 (ATF6).
La unión de GRP78 a los dominios de estas proteínas mantiene su actividad
suprimida. Una vez la célula es sometida a estrés de RE, y se genera la acumulación
de proteínas mal plegadas y no procesadas, GRP78 es llevada fuera de la
interacción con PERK, IRE1, y ATF6 con el fin de atender la necesidad en el
plegamiento de proteínas. Como consecuencia de lo anterior, la disociación de
GRP78 conduce a la activación de las tres proteínas transmembrana, lo que permite
que se desarrollen tres ramas distintas de la respuesta de estrés RE / UPR.
Adicionalmente, se ha observado que estos eventos de señalización conllevan a un
aumento en la expresión de GRP78, que no solo sirve como una chaperona
adicional, sino también puede volverse a asociar con PERK, IRE1, y ATF6 con el
fin de devolver estas cascadas de señalización a sus modos inactivos cuando la
homeostasis ha sido restablecida (Schonthal, 2012).
La activación de IRE1 representa la cascada de señalización más conservada de
una respuesta UPR. Esta proteína es una enzima bifuncional con actividad
serina/treonina quinasa y endorribonucleasa (RNAsa) en su dominio citosólico. Tras
la liberación de GRP78 se desencadena su homodimerización y la autofosforilación
como parte del proceso de activación. IRE1 activado cliva la base 26 de un
fragmento de ARNm que codifica la caja X de unión a proteínas 1 (XBP 1), lo que
conlleva a el empalme y la traducción de un factor de transcripción que regula la
expresión de genes implicados en el mecanismo ERAD y el plegamiento de
proteínas, así como otros genes relacionados con la síntesis de fosfolípidos que son
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necesarios para la expansión de las membranas del RE durante el periodo de
estrés. La ruta de señalización IRE 1 y el empalme de XBP1 son particularmente
importantes en las células altamente secretoras donde la maquinaria de
plegamiento de proteínas se dedica de forma continua a la producción de proteínas
con una alta calidad (Schonthal, 2012).
Adicional al corte y empalme de ARNm, una segunda función de IRE1 es activar
una cascada de señalización que tiene como objetivo controlar el destino de la
célula con respecto a la muerte celular. En este caso, una vez activado IRE1 se
recluta el receptor del factor de necrosis tumoral (TNFR), factor asociado 2 (TRAF2),
lo que resulta en la activación de la apoptosis cascada abajo (ASK1 y JNK)
(Schonthal, 2012).
Por otro lado, ATF6 alberga un motivo de cremallera de leucina (bZIP) y tiene
propiedades como un factor de transcripción. Tras la liberación de GRP78, se ponen
de manifiesto una secuencia de señalización del aparato de golgi, con lo cual ATF6
se transloca al aparato de golgi. En este organelo es clivado por dos proteasas (S1P
y S2P) lo que conlleva a la liberación del dominio bZIP del factor de transcripción.
Con su translocación al núcleo, ATF6 estimula la expresión de varios genes
relacionados con contribuir al plegamiento de proteínas, secreción de proteínas, y
el mecanismo ERAD, apoyando así a la célula para que soporte el estrés de retículo
generado por la acumulación de proteínas mal plegadas. (Schonthal, 2012)
Por último, la activación de PERK involucra su homodimerización y
autofosforilación, lo que conlleva a la fosforilación del factor eucariota de iniciación
2 alfa (eIF2). La fosforilación de este factor provoca la atenuación global de la
síntesis de proteínas, de este modo disminuye la cantidad de proteínas en el RE en
apoyo a la acumulación de proteínas mal plegadas y el estrés generado. De igual
forma, la fosforilación del factor eIF2 cambia la eficiencia en el uso de los codones
de iniciación AUG y conlleva a la traducción preferencial de ARNm que codifican
genes que favorecen la adaptación al estrés, donde se incluye el factor activador de
17
la transcripción 4 (ATF-4). Adicionalmente, el factor Nrf2 también resulta ser
fosforilado por PERK. Tras la activación este factor viaja al núcleo donde es capaz
de activar genes que codifican para proteínas antioxidantes. Dado que el estrés de
RE puede implicar la acumulación de especies reactivas de oxígeno (ROS),
promoviendo así un estado de estrés oxidativo, Nrf2 juega un papel crítico en
promover la homeostasis redox en la célula (Schonthal, 2012).
Por otro lado, también existe un segundo mecanismo de respuesta al estrés y es la
liberación de Calcio+2 iónico al citosol como consecuencia de la activación de la
caspasa 4. La calreticulina (CRT) o la calnexina son las principales proteínas que
se encuentran asociadas a Ca+2, sin embargo, este ion también puede encontrarse
de forma libre. El Ca+2 entra y sale del RE para suplir su necesidad en las funciones
celulares y mantenerlas en un nivel adecuado. La liberación descontrolada de Ca+2
al citoplasma tienes como consecuencia la activación de proteasas y quinasas
involucradas con la apoptosis y con la autofagia (Garg & Agostinis, 2014).
4.3.3 Estrés de retículo y microambiente
Durante los últimos años, se ha reportado que una cascada de señalización
bioquímica conocida como la respuesta a estrés de retículo endoplásmico o la
respuesta a proteínas mal plegadas (UPR) representa un mecanismo intrínseco de
adaptabilidad crucial que favorece la supervivencia de las células cancerígenas,
haciendo frente a agentes nocivos en el microambiente tumoral que pueden
conllevar a condiciones de hipoglicemia, estrés oxidativo e hipoxia. La respuesta
UPR es un regulador importante de la respuesta inflamatoria, especialmente a nivel
de células mieloides como los macrófagos y las células dendríticas. En primer lugar,
coordina la activación del factor nuclear (NF) -κB, un regulador maestro de la
inflamación. La inhibición de la traducción mediada por PERK reduce la proporción
de IκB en relación a NF-κB, permitiendo de este modo la migración nuclear de NF-
kB y la transcripción de genes inflamatorios. Por otro lado, la activación del factor
de transcripción 6 (ATF6), participa en la activación de NF-KB en una manera
18
dependiente de AKT (proteina quinasa B). Finalmente, IRE1α forma un complejo
con TRAF2 en su dominio citosólico, y el complejo IRE1α-TRAF2 media la
fosforilación de IkB a través de IkB quinasa, que conduce a la activación de NF-kB
(Zanetti et al. 2016).
Así mismo, una respuesta UPR está ligada a la activación transcripcional de
citocinas proinflamatorias. IRE1α y la señalización por PERK tienen un papel en la
producción de interleucina 6 (IL-6) y la producción de TNF-alfa en macrófagos;
análisis moleculares demuestran que XBP1 tiene la capacidad de unirse a los
promotores de IL-6 y TNF-alfa (Zanetti et al. 2016).
Por otro lado, también se ha descrito que la respuesta UPR también tiene la
capacidad de regular la angiogénesis. Estudios en fibroblastos murinos
transformados (PERK-/-) muestran que estos disminuyeron tanto la angiogénesis
como la expresión de varios factores implicados en el control de la angiogénesis,
incluyendo VCIP y MMP13. Además, se ha encontrado que ATF4 puede inducir la
expresión del factor humano de crecimiento endotelial vascular (VEGF-A) y activar
su transcripción bajo condiciones de estrés ER, evidenciado en experimentos in
vitro. Trabajos más recientes han demostrado que la via IRE1α-XBP-1 es un
regulador adicional de la angiogenesis. De esta manera, la inhibición de IRE1α en
células de glioma humano conduce a la regulación negativa de los factores pro-
angiogénicos incluyendo VEGF-A, IL-1β, IL-6 y IL-8, y a la regulación positiva de
factores anti-angiogénicos. Adicionalmente, XBP-1 se une a dos regiones distintas
del promotor de VEGF-A en células de glioma de rata tras la inducción de estrés
ER, promoviendo su transcripción y, en última instancia, su secreción (Zanetti et al.
2016).
De igual forma, se ha sugerido que la respuesta a estrés de reticulo mediante el
mecanismo UPR en células tumorales y en células presentadoras de antígeno
puede tener un efecto sobre la presentación antigénica. Células B con acumulación
forzada de proteínas en el ER montan una UPR y regulan la expresión de MHC
19
clase II y moléculas co-estimuladoras, pero muestran un menor número de péptidos
de alta afinidad. Así mismo, se ha encontrado que la sobreexpresión de proteínas
mal plegadas que inducen estrés de reticulo, la expresión constitutiva de ATF6 o
XBP1 están asociadas con disminuir los niveles de MHC clase I. Por otra parte, la
señalización mediada por IRE1α regula miR-346, quien regula a su vez la proteína
transportadora asociada con el procesamiento antigénico 1, provocando un
descenso en la MHC clase I asociadas a presentamiento antigénico (Zanetti et al.
2016).
4.4 Autofagia
La homeostasis celular se logra mediante el equilibrio entre la biosíntesis y la
degradación. En las células eucariotas, el lisosoma es el organelo principal de
degradación a través de una amplia gama de hidrolasas ácidas. Bajo condiciones
de estrés, como la privación de nutrientes, se activa la autofagia como mecanismo
de respuesta adaptativa mediante la auto-digestión de componentes celulares vía
lisosoma. Lo anterior se logra mediante la formación de vesículas de doble
membrana denominadas autofagosomas que tienen la capacidad de ingerir
proteínas de larga vida, organelos dañados, e incluso patógenos invasivos, con el
posterior transporte de estos hacia los lisosomas. Posteriormente, la membrana
externa del autofagosoma se fusiona con la membrana lisosomal, y la vesícula
interior es degradada junto con su contenido. Las macromoléculas resultantes de
este proceso pueden ser recicladas de nuevo al citosol para su reutilización. Un mal
funcionamiento de la autofagia contribuye a que se desarrolle una variedad de
enfermedades, como cáncer, neurodegeneración, trastornos cardiovasculares, e
infecciones microbianas, porque el secuestro eficiente y liquidación de
componentes que no sean necesarios para la célula es de vital importancia para la
supervivencia y la función celular (Congcong & Klionsky, 2009).
20
El mecanismo de la autofagia se puede dividir en diferentes pasos; la inducción,
reconocimiento y selección del material, formación de la vesícula, fusión del
autofagosoma, y la descomposición del material celular seguido de la liberación de
macromoléculas resultantes de nuevo al citosol. Durante estos procesos intervienen
una serie de proteínas que son denominadas Atg y representan la maquinaria
central de la autofagia (Congcong & Klionsky, 2009).
En condiciones normales se presenta un nivel basal de autofagia, por lo cual el
organismo debe contar con un mecanismo eficaz para inducir y desactivar este
proceso, lo cual le confiere la capacidad de adaptarse al estrés y señales
extracelulares. Un inhibidor central de la autofagia es la serina/treonina quinasa
TOR. En levaduras, tras la inactivación de TOR, se aumenta la actividad quinasa de
Atg1 y se une a Atg 13 y Atg 17, lo cual promueve el reclutamiento de una serie de
proteínas implicadas en la formación del autofagosoma, por lo cual el complejo Atg1
es indispensable para la iniciación de la autofagia. En mamíferos existen dos
homólogos de Atg1 que son conocidos como ULK1 y ULK2 y también existe un
homólogo de Atg17 conocido como FIP200, que forman un complejo con Atg13 en
mamíferos y están relacionados con la iniciación. ULKs pueden fosforilar a Atg 13 y
FIP200, así como autofosforilarse para permitir la iniciación de la autofagia
(Congcong & Klionsky, 2009).
La formación y ensamblaje de la membrana inicial del fagoforo (estructura
intermedia) requiere del complejo Ptdlns3K que está compuesto por una proteína
vacuolar de clasificación 4 (Vps34), una serina/treonina quinasa (p150), Atgm14, y
beclina 1. La función de la beclina 1 en la autofagia está regulada por Bcl-2, una
proteína antiapoptótica que inhibe la autofagia mediante la unión y secuestro de
beclina 1 bajo condiciones ricas en nutrientes; se requiere la disociación de Bcl-2 y
beclina 1 para la inducción de la autofagia. Este complejo tiene la capacidad de
reclutar una serie de proteínas Atg, además de reclutar los sistemas Atg12-ATG5-
Atg16 y Atg8-PE que desempeñan un papel esencial en la regulación de la
formación del autofagosoma (Congcong & Klionsky, 2009).
21
4.4.1 Estrés de retículo y autofagia.
El Retículo Endoplasmatico no solo está implicado en la síntesis y maduración de
proteínas, la respuesta UPR frente al estrés ha demostrado ser un potente estimulo
en la inducción de autofagia. Como se mencionó anteriormente la respuesta a este
tipo de estres está liderado por las proteínas PERK, IRE1 y ATF6. Algunos estudios
han demostrado que PERK y ATF6 pueden actuar como inductores de la autofagia,
mientras IRE1 puede ser un regulador negativo de este proceso (Kroemer et al.,
2010).
PERK puede activar la transcripción de las proteínas LC3 y ATG5 en las respuestas
frente a hipoxia a través de la acción de los factores de transcripción ATF4 y CHOP,
respectivamente. PERK fosforila el factor de iniciación eucariota 2 α (eIF2α) en el
residuo de serina 51, que a continuación inicia una cascada de señalización que
disminuye la sobrecarga de proteínas mal plegadas, aliviando de ese modo el estrés
del RE. eIF2α fosforilado conlleva a una inhibición general de la traducción de
proteínas, así como la traducción selectiva de algunos genes de respuesta a estrés
incluyendo el factor de transcripción ATF4 y ciertos genes autofagia. Estudios en
celulas que llevan un mutante eIF2α no fosforilado no inducen la autofagia en
respuesta a la inanición, lo que sugiere que la fosforilación de la serina 51 en eIF2α
juega un papel importante en la regulación de la autofagia. Este evento de
fosforilación integra varios tipos de señales de estrés ambiental y endógenos más
allá del estrés de RE, tales como la privación de aminoácidos, la exposición a RNA
viral de doble cadena, estrés osmótico, exposición a la luz UV, la hipoxia y el estrés
oxidativo (Kroemer et al., 2010).
El mecanismo por el cual eIF2α fosforilado tiene la capacidad de inducir la iniciación
de la autofagia aun no es del todo claro. Una posibilidad es que eIF2α fosforilado
podría afectar de algún modo el RE conllevando a que se promueva la formación
22
física de la membrana de aislamiento. Otra posibilidad es que la fosforilación de
eIF2α estimula la autofagia a través de sus efectos sobre la activación de genes
relacionados con la autofagia. Así mismo, existen interacciones directas entre
subunidades eIF2α y proteinas autofagicas, aunque todavia no se sabe si estas
interacciones son biológicamente significativas (Kroemer et al., 2010).
Por otro lado, la inhibición de IRE1 y su efector cascada abajo XBP1 aumenta la
inducción de la autofagia. Estudios con ratones que carecen del factor XBP1 en
neuronas mostraron un incremento en los niveles de autofagia basal. Dado que el
resultado más predominante del estrés de RE es la inducción de autofagia, en lugar
de la inhibición, es posible que las señales dependientes de IRE1 / XBP1 tienen la
función de amortiguar la autofagia excesiva provocada por la via PERK / eIF2α
(Kroemer et al., 2010).
23
5. Metodología
5.1 Cultivo celular y tratamientos.
Para el desarrollo de los objetivos planteados se trabajó con una línea celular de
melanoma murino (B-16), en las cuales ya se tenían establecidos la mayoría de
protocolos experimentales. Las células se cultivaron en medio RPMI-1640
suplementado con 10% de SFB, 0.01 M de Hepes, 100 ug/ml de penicilina/
estreptomicina, 2 mM de glutamina y 0.01 M de piruvato de sodio, y se mantuvieron
a 37 grados centígrados con 5% de CO2.
La línea celular se expuso a diferentes inductores de estrés; El Salubrinal se usó
como inhibidor farmacológico de estrés de Retículo Endoplasmatico (ER), la
Tunicamicina (20nM) se usó para la inducción de estrés en el retículo endoplásmico
a partir de la acumulación de proteínas mal plegadas, para el control negativo de
este estimulo se usó DMSO ya que la Tunicamicina se encuentra diluida en este
vehículo. Adicionalmente, se trataron las células con la fracción P2Et (72,7 μg/mL)
usando como control negativo el vehículo, etanol. Por otro lado, se utilizó la
metformina (50nM) como control positivo en la inducción de autofagia. Los
tratamientos se llevaron a cabo en un rango de tiempo de 24H.
Para establecer el sistema de inhibición de estrés de retículo, las células se
transfectaron con los vectores de expresión S/A y S/S. Para estudiar el efecto del
estrés del retículo sobre la autofagia inducida por p2ET, las células B16 fueron
sometidas a un pre tratamiento con Salubrinal y enseguida a los tratamientos
anteriormente mencionados y luego se marcaron con Faloidina y monodacil
cadaverina (MDC) para evaluar el efecto sobre la autofagia.
24
5.2 Construcción de los transfectantes.
Antes de someter las células a estímulos que conllevaran a la inducción de estrés
de retículo, se realizó la transfección de estas mediante lipofectamina 2000 y 2
vectores de expresión pEGFP-C1 (amablemente regalado Dr. Paulo Rodríguez de
la Universidad de Georgia). En uno de los plásmidos (S/S) se tenía la secuencia
para la expresión ectópica de la proteína eIF2 normal, que se usó como control
(Wild Type). En el otro plásmido (S/A) la serina 51 fue reemplazada por una alanina
(S/A) donde se provocó una perdida funcional de la proteína eIF2 al no poder ser
fosforilada, como consecuencia se inhibió la vía de respuesta a estrés mediada por
eIF2.
La eficiencia de la transfección se evaluó por medio de la fluorescencia emitida por
la proteína GFP presente en el plásmido con el que se transfectaron las células.
Teniendo en cuenta lo anterior, se analizó por medio de microscopia de
fluorescencia la cantidad de fluorescencia presente en las células, evidenciada por
la aparición de puntos verdes, y de esta manera se estableció el porcentaje de
fluorescencia que fue equivalente al porcentaje de transfección.
5.3 Evaluación del estrés de retículo.
Para la evaluación de la inducción de estrés en el RE por acumulación de proteínas
mal plegadas posterior al tratamiento con los distintos inductores de estrés, se
realizó la detección de las proteínas eIF2α total, fosforilada y GRP78 mediante el
uso de anticuerpos dirigidos por medio de un inmunoblot. El análisis de este ensayo
se hizo de acuerdo a protocolos ya estandarizados en el laboratorio. Para lo anterior,
las células se lisaron (50 mM tris a pH 7.5, 0.3 M NaCl, 0.5% TX-100, 0.1% azida
de sodio) en presencia de un coctel de inhibidores de proteasas. Las proteínas se
resolvieron en geles pre-cast 4-12% (BioRad) y se transfirieron a membranas de
PVDF (BioRad). El inmunoblot se realizó con anticuerpos primarios específicos de
25
cada ligando, y con anticuerpos secundarios apropiados conjugados con HRP.
Finalmente, se revelo las membranas con el uso de luminol.
5.4 Evaluación de la autofagia.
Una vez las células fueron sometidas a los tratamientos, y con el objetivo de mirar
el efecto de inhibir el estrés de retículo sobre la inducción de autofagia por p2Et, se
realizó un análisis mediante microscopia confocal. Para lo anterior, las células se
fijaron con paraformaldehido (3.7%) y se permeabilizarán con tritón X-100.
Posteriormente, se usó la marcación con Faloidina y la retención de la sonda
fluorescente monodacil cadaverina (MDC) en los organelos ácidos de la célula, lo
que permite la detección por microscopia de fluorescencia de los autofagolisosomas
inducidos durante la autofagia. Las células se visualizaron y se adquirieron
imágenes para su análisis usando el microscopio confocal FV1000 de Olympus.
26
6. Resultados y Discusión
A medida que la biotecnología va mejorando se ha ido generando nuevas
estrategias de tratamiento contra el cáncer. Muchas de las investigaciones se han
enfocado en explotar los recursos naturales debido a su complejidad y potencial
para el desarrollo de distintos fármacos con aplicación en esta enfermedad. En este
sentido, durante este proyecto se evaluó si la fracción anti-tumoral p2ET obtenida
de Caesalpinia spinosa es capaz de inducir estrés de retículo, y si ese estrés de
retículo está relacionado con la inducción de autofagia.
6.1 La fracción antitumoral P2ET induce estrés de retículo en la línea
celular B-16
Inicialmente, la primera aproximación para determinar si la fracción p2ET tiene la
capacidad de inducir estrés de RE en la línea celular de melanoma murino B-16, fue
establecer un sistema de inhibición de estrés de RE para evaluar su impacto sobre
la respuesta celular ante el tratamiento con la fracción p2ET. Con este propósito,
primero se realizó el cultivo celular de la línea B-16, y posteriormente se transfectó
con los vectores de expresión S/S y S/A, y en seguida se realizó el tratamiento con
DMSO, etanol, tunicamicina y p2ET durante 12 horas. El vector de expresión S/S
promueve la expresión ectópica de la secuencia Wild Type de la proteína eIF2.
Por otro lado, el vector de expresión S/A conlleva a la expresión ectópica de una
secuencia mutada de la proteína eIF2, donde se cambió la serina 51 por una
alanina, impidiendo su fosforilación. Para determinar la eficiencia de la transfección
se visualizaron las células en microscopio óptico observando los agregados de
lipofectamina dentro de la célula, y de igual manera se realizó una visualización en
microscopio de fluorescencia observando la proteína verde fluorescente o GFP
contenida dentro de los plásmidos. De este modo se pudo determinar que la
eficiencia de la transfección era alrededor del 80% por cada campo visualizado.
27
El potencial del p2ET para la inducción de estrés de retículo y la eficacia del sistema
de inhibición, se determinó por medio de anticuerpos dirigidos a la detección de las
proteínas eIF2α fosforilado (eIF2-P), eIF2α total (eIF2-T) y GRP78 como
marcadores de estrés de retículo mediante un Western Blot (Figura 1 A y B). En el
inmunoblot se logró evidenciar que el tratamiento con tunicamicina en las células
transfectadas con el vector wild type (S/S) presentaba bandas de mayor intensidad
para eIF2-P, respecto al p2Et y los controles negativos (Etanol y DMSO). El
tratamiento con P2Et en estas células mostró un incrementó pequeño en la
expresión de esta proteína respecto al etanol. Cuando se inhibió la fosforilación del
eIF2 en las células transfectadas con el vector mutante S/A, el tratamiento con
tunicamicina en estas células mostró bandas con una expresión considerablemente
inferior, respecto a la obtenida en las células con el vector wild type. El mismo efecto
se logró evidenciar cuando las células S/A se trataron con p2Et donde la expresión
de esta proteína (eIF2-P) se disminuyó considerablemente. Para el caso de
GRP78, se observó el mismo efecto. El tratamiento con tunicamicina en las células
con el vector wild type (S/S) mostraron un aumento en la expresión de esta proteína
respecto al p2Et y los controles negativos. Este mismo efecto se obtuvo con el p2Et
cuando se compara con su control negativo (etanol). En la células con el vector S/A,
esta expresión se vio significativamente disminuida para los tratamientos con p2Et
y tunicamicina.
Estos resultados se pueden corroborar por las diferencias entre los valores
obtenidos por densitometría. Para las células con el vector S/S el tratamiento con
tunicamicina proporciono valores de densitometría de 34.19 respecto al P2Et donde
se obtuvieron valores de 14.20. Los valores del p2Et son superiores a los obtenidos
con el DMSO y etanol donde se obtuvieron valores de 11.02 y 10.15
respectivamente. La relación eIF2-P/ eIF2-T también evidencia el mismo efecto
en los tratamientos (Figura 1 C). Los resultados obtenidos a partir de estos análisis
sugieren que el P2ET puede de alguna forma inducir estrés de retículo en la línea
celular B-16.
28
GRP78
3.2
29.6
18.4
5.8
4.27 9.27 17.3
9.0
A
eIF2-T
eIF2-P
S/S S/A
11.02 10.15 15.25 34.19 5.32 20.93
11.51 16.94 22.57 19.82 16.60 13.57
B
DMSO (S/S
)
ETOH (S/S
)
p2ET (S/S
)
Tunicamicin
a (S/S
)
p2ET (S/A
)
Tunicamicin
a (S/A
)0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
Rel
aciò
n eI
F2-P
/eIF
2-T
C
29
Figura 1. La fracción anti-tumoral p2Et induce estrés de reticulo. Las células B-16 fueron transfectadas con los vectores de expresión S/A y S/S. Posteriormente fueron expuestas al tratamiento con DMSO, Etanol, p2Et y tunicamicina por 12 horas, y enseguida se lisaron para evaluar la inducción de estrés de retículo mediante la detección de la
proteína eIF2 fosforilada y total (A) , y GRP78 (B). Para normalizar los datos, se realizó el
análisis por densitometría y se estableció la relación eIF2-P/ eIF2-T (C). Las imágenes son los resultados representativos de dos experimentos independientes.
Inicialmente, los resultados demuestran el potencial de la Tunicamicina como
inductor de estrés de RE en la línea celular de melanoma murino B-16. Dentro de
las principales respuestas a estrés de Retículo Endoplasmatico se destaca la
respuesta a proteínas mal plegadas o UPR. Esta respuesta involucra una
atenuación rápida y global de la síntesis de proteínas que es controlada por la
proteína PERK a través de la fosforilación directa del factor de iniciación eucariótico
2α (eIF2α) (García et al., 2016). Así mismo, el aumento en la expresión de GRP78
por la Tunicamicina también está relacionado con la inducción de estrés de RE en
la célula. En condiciones normales, la chaperona regulada por glucosa 78 (GRP78)
se encuentra unida a los sensores de estrés (PERK, IRE1 y ATF6) manteniéndolos
de forma inactiva. Una vez la célula es sometida a condiciones de estrés, se produce
la disociación de esta proteína lo que activa las diferentes vías de señalización que
tiene como consecuencia una respuesta UPR. Dentro de las consecuencias de esta
respuesta está la expresión de genes relacionados con el plegamiento de proteínas,
donde se encuentra la proteína GRP78 que ejerce su función como chaperona para
ayudar a disminuir el impacto del estrés en la célula. De acuerdo a lo anterior, es
lógico que en condiciones de estrés de retículo se genere un aumento de la proteína
GRP78 (Khadir et al., 2016).
Lo anterior se ve reflejado por el potencial que tiene la Tunicamicina para inducir
estrés de retículo mediante la alteración de la maquinaria de plegado de proteínas
en células eucariotas. La Tunicamicina es un antibiótico que inhibe la N-glicosilación
de proteínas, causa un bloqueo en la síntesis de ADN y provoca la detención del
ciclo celular en la fase G1. La N-glicosilación es un evento esencial para el correcto
plegamiento de las proteínas, y la inhibición por la Tunicamicina impide que se lleve
a cabo de manera eficiente este proceso lo que tiene como consecuencia la
30
acumulación de proteínas mal plegadas en el lumen del Retículo Endoplasmatico.
La acumulación de proteínas mal plegadas en el lumen del RE es un fenómeno
tóxico que conduce de forma directa a que se desarrolle la respuesta a proteínas
mal plegadas (UPR) (Nami et al., 2016).
De igual forma, la inmunodetección de la proteína eIF2α-P en células con el vector
S/S tratadas con DMSO y Etanol, controles negativos, se puede atribuir a la
expresión endógena de la proteína, ya que se ha demostrado que la fosforilación
reversible en la serina 51 de la subunidad α del factor de iniciación eucariota 2 α
(eIF2 α) es un evento regulador altamente conservado en la célula eucariota, como
mecanismo de respuesta a diversas tensiones. Por lo anterior, la baja expresión de
esta proteína en estos tratamientos puede ser considerada como una expresión
basal de la proteína (B’chir et al., 2013).
Los resultados obtenidos para la detección de la proteína eIF2α-T mostraron el
mismo efecto que los resultados obtenidos para eIF2α-P y GRP78 en relación a la
Tunicamicina. En condiciones normales la célula expresa eIF2α endógeno, así
como el que fue introducido en el vector de expresión S/S, ya que este factor cumple
la función de ayudar a la traducción global de proteínas. En condiciones de estrés
se va a fosforilar este factor para inducir una respuesta UPR. De acuerdo a lo
anterior, para los casos donde se indujo estrés de retículo, era de esperar bandas
de mayor expresión porque se inmunodetectan tanto la proteína fosforilada como la
no fosforilada.
Por otro lado, el tratamiento con P2ET demostró inducir estrés de Retículo
Endoplasmatico en la línea celular B-16, esta fracción, al igual que la Tunicamicina,
demostró un aumento en la expresión de eIF2α-P y GRP78 respecto a su control
(Etanol). En el grupo de Inmunología y Biología Celular de la Pontificia Universidad
Javeriana se ha venido investigando en busca de compuestos que tengan funciones
antitumorales derivados de plantas medicinales. De este modo, se obtuvo la fracción
denominada P2Et, la cual está normalizada químicamente como un polifenol y en
31
proceso de escalamiento. En ese sentido, Se ha encontrado que esta fracción
presenta actividad antitumoral en modelos in vivo e in vitro de melanoma (Gómez
et al., 2016). De igual forma, ya se ha reportado que los polifenoles tienen la
propiedad de inducir estrés oxidativo en la célula, y a su vez este tipo de estrés
puede conllevar a la inducción de estrés de retículo mediante la acumulación de
proteínas mal plegadas, lo que culmina en una respuesta UPR. Un ejemplo de esto
es el estudio realizado por Qiao et al. quienes demostraron que el tratamiento con
Thiostrepton, un inductor de estrés oxidativo, en una línea celular de melanoma
tiene la capacidad de inducir estrés de Retículo Endoplasmatico, evidenciado por la
fosforilación de eIF2α (Qiao et al., 2012).
Los organismos aerobios producen radicales libres y especies reactivas de
oxígenos (ROS) durante el metabolismo celular, el metabolismo de toxinas, de
drogas por el citocromo p450, monooxigenasas, o durante la exposición a factores
ambiéntales. Está bien establecido que los ROS pueden ejercer efectos
beneficiosos o perjudiciales en la célula dependiendo de sus concentraciones. En
términos generales, a niveles bajos, los ROS pueden actuar como segundos
mensajeros en vías de transducción de señales relacionadas con la producción de
energía, el crecimiento celular, etc., y se requieren para mantener eventos de
señalización en niveles homeostáticos. Sin embargo, cuando el nivel de ROS
excede la capacidad antioxidante de la célula, la homeostasis redox intracelular se
altera y el estrés oxidativo se produce, lo que puede resultar en daño irreversible al
ADN, proteínas y lípidos. De hecho, la creciente evidencia indica que el estrés
oxidativo es fundamental en el desarrollo de enfermedades crónicas no
transmisibles, como el cáncer, las enfermedades cardiovasculares y la diabetes
(Martin & Ramos, 2016).
Por último, los resultados permiten evidenciar de forma clara la eficacia del vector
de expresión S/A para inhibir los efectos del p2Et y la tunicamicina como inductores
de estrés, y de esta forma revelar el papel inductor de estrés de RE de estos
tratamientos. La expresión de eIF2α-P, eIF2α-T y GRP78 se vio significativamente
32
disminuida cuando las células fueron transfectadas con este vector. La disminución
en la expresión para eIF2α-P y eIF2α-T está directamente relacionada con la
sustitución en la secuencia que porta el vector de expresión. El cambio de la serina
51 impide totalmente que la proteína pueda ser fosforilada ya que este el
aminoácido que se fosforila cuando la célula está sometida a condiciones de estrés
de retículo. En este caso, las proteínas eIF2α-P que se logran inmuno detectar en
el western blot están asociadas a la expresión endógena de esta, ya que adicional
a la secuencia defectuosa puesta en el plásmido la célula cuenta con su secuencia
constitucional la cual no ha sido modificada.
Para el caso de GRP78, la disminución en su expresión también está relacionada
con la inhibición de la fosforilación de eIF2α. La fosforilación de este factor no solo
atenúa la traducción global de proteínas, sino que también cambia la eficiencia en
el uso de los codones de iniciación AUG y conlleva a la traducción preferencial de
ARNm que codifica para genes que favorecen la adaptación al estrés, donde se
incluye el factor activador de la transcripción 4 (ATF-4). De acuerdo a lo anterior, es
de esperarse que si se bloquea la vía de señalización de PERK en respuesta al
estrés de retículo, inhibiendo la fosforilación de eIF2α, como consecuencia se
obtiene una baja en la expresión de GRP78. Cabe mencionar que esta regulación
génica es importante en la recuperación de la homeostasis celular, ya que GRP78
es de vital importancia para inactivar los sensores de estrés y frenar la respuesta
UPR una vez se ha superado la condición de estrés en la célula (Schonthal, 2012).
6.2 La autofagia inducida por p2ET está relacionada parcialmente con el estrés de Retículo Endoplasmatico.
Con el objetivo de poder determinar si el estrés de Retículo Endoplasmatico estaba
implicado en la autofagia inducida por la fracción p2ET se realizó el cultivo celular
de la línea de melanoma B-16, y posteriormente se realizó un pre-tratamiento con
Salubrinal por 1 hora para inhibir el estrés de retículo, y enseguida se trataron las
células con ETOH, DMSO, Metformina, p2ET y Tunicamicina. El impacto de los
33
tratamientos y de la inhibición de estrés de retículo sobre la autofagia inducida por
la fracción p2ET se evaluó por medio del marcaje con faloidina, que permite la
visualización de los microtúbulos, y el uso de la retención de la sonda fluorescente
monodacil cadaverina (MDC) en los organelos acidos de la célula, lo que permite la
detección por microscopia de fluorescencia o confocal de los autofagolisosomas
inducidos durante la autofagia por medio de la aparición de unos puntos verdes
típicos en las células autofágicas (Figura 2 A). Para cada tratamiento se analizaron
dos laminas en el microscopio confocal (Duplicado), y por lamina se tomaron 3
campos diferentes para un total de 6 campos observados por tratamiento. Con estos
datos se determinó el porcentaje de células autofágicas en cada campo y se elaboró
una gráfica de dispersión de los datos, lo que permite evidenciar las diferencias
entre estos y el efecto del Salubrinal sobre la autofagia inducida por p2ET (Figura 2
B).
Para confirmar indirectamente el potencial del p2Et para inducir estrés de retículo
en la línea celular B-16, y la relación entre este tipo de estrés y la inducción de
autofagia por esta fracción, se realizó la inmunodetección de la nucleoporina p62.
Los resultados muestran claramente que el tratamiento con p2Et produjo bandas de
expresión menores respecto a su control negativo. De igual forma se obtuvo que
para el tratamiento con Tunicamicina y metformina se obtuvieron bandas de
expresión muy similares a las de los controles. Por otro lado, en las células tratadas
con Salubrinal, donde se inhibió el estrés de retículo, para todos los tratamientos se
produjeron bandas de expresión mayores, en especial para el p2Et donde el
aumento fue el más significativo.
34
ET
OH
P
2E
T
Sin Salubrinal Con Salubrinal
DM
SO
T
UN
M
ET
S
OL
AS
A
DM
SO
DM
SO +
Sal
Eta
nol
ETO
H +
Sal
p2ET
p2ET +
Sal
Met
form
ina
Met
+ S
al
Tunic
amic
ina
Tunic
a +
Sal
Sal
0
10
20
30
40
50
% C
elu
las A
uto
fag
icas/C
am
po
B
35
Figura 2. La autofagia inducida por p2Et depende parcialmente del estrés de reticulo. Las células B-16 fueron pre-tratadas con Salubrinal por 1 horas, y posteriormente se trataron con DMSO, Etanol, p2Et, tunicamicina y metformina por 12 horas. La evaluación de la inducción de autofagia se evaluó por medio de la retención de la sonda fluorescente monodacil cadaverina (MDC) en los organelos acidos de la célula y el marcaje con Faloidina (A). De acuerdo a los campos visualizados por tratamiento (6), se determino el porcentaje de autofagia por campo (B). Con el propósito de confirmar el efecto del Salubrinal sobre la autofagia se realizo un western blot para la detección de p62 (C). Los datos de este western blot fueron normalizados respecto a la B-tubulina (D).
C
DM
SO
ETOH
p2ET
Tunic
amic
ina
Met
form
ina
DM
SO +
Sal
ETOH +
Sal
p2ET +
Sal
Met
for +
Sal
0.0
0.5
1.0
1.5
Rela
ciò
n P
62/B
-tu
bu
lin
a
DM
SO
TU
NIC
AM
ET
OH
P2
ET
ME
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OR
MI
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DM
SO
+ S
AL
ET
OH
+ S
AL
P2
ET
+ S
AL
ME
T +
SA
L
P62
B-Tubulina
10.88
11.39 7.62
11.93
10.83
9.89
11.24
12.29
13.93
10.52
15.58 8.23
10.88
12.26
10.36
12.31
8.72 11.13
C
D
36
Los resultados obtenidos por medio de microscopia confocal permiten evidenciar
inicialmente el potencial que tiene el p2Et y la metformina para inducir autofagia en
la línea celular B-16. En las imágenes se puede observar que la formación de
autofagosomas fue claramente detectable (puntos verdes) en células tratadas con
P2Et o con metformina, pero no en las condiciones control, DMSO y ETOH (Figura
3). Así mismo, al determinar los porcentajes de células autofagicas para el
tratamiento con metformina y p2Et, se obtuvieron medias de 20% y 30%
respectivamente, frente a los controles donde la media fue alrededor del 3%. Para
el caso de la tunicamicina se obtuvo una media del 10%, respecto su control
negativo (DMSO), donde la media del porcentaje de células autofagicas fue
alrededor del 3%.
Por otro lado, las imágenes también revelan el efecto del Salubrinal sobre la
autofagia. Para el caso del p2Et se logró evidenciar que en las células tratadas con
Salubrinal no se obtuvieron puntos verdes, típicos de las células autofagicas. Así
mismo, que el Salubrinal disminuyo la media del porcentaje de células autofágicas
del 20% hasta el 2%. El mismo efecto fue observado para la metformina, donde se
evidencio la desaparición de puntos verdes en las células tratadas con Salubrinal y
una disminución de la media del porcentaje de células autofagicas del 30% al 2%.
Los resultados confirman de forma clara el potencial de la metformina y el p2Et para
inducir autofagia en la línea celular de melanoma murino B-16. La autofagia es un
proceso de reordenación de la membrana subcelular para formar un autofagosoma
de membrana doble que posteriormente se fusiona con el lisosoma, y envuelve los
constituyentes citoplásmicos y organelos para su degradación, este proceso es
acelerado por la deficiencia de nutrientes o condiciones de estrés en la célula.
Aunque se ha reportado que la metformina tiene mecanismos independientes de
AMPK para la mejora del perfil metabólico, la mayoría de los investigadores están
de acuerdo en que la metformina ejerce su efecto a través de la activación de AMPK.
Por lo tanto, la metformina puede mejorar o inducir la autofagia en la célula, ya que
la activación de AMPK se sabe que aumenta la actividad autofágica a través de la
37
fosforilación directa de la quinasa unc-51-like y Beclina 1, moléculas clave
implicadas en la iniciación de la autofagia (Hur & Lee, 2015)
Por otro lado, Los resultados obtenidos para el p2Et se relacionan con los resultados
obtenidos por Gómez et al. en el 2016, quien estudio los efectos in vivo e in vitro de
esta fracción en modelos de melanoma. En este estudio también se demostró que
la fracción P2Et tiene la capacidad de inducir un flujo autofagico completo,
evidenciado mediante experimentos con MDC por medio de microscopia confocal,
la degradación de P62 y una alta expresión de LC3 detectado por medio de western
blot. De igual forma, Gómez et al también obtuvo en su estudio la formación de
puntos verdes (MDC), característico de las células autofagicas, después del
tratamiento con p2Et por 24 horas en células de melanoma B16F10.
Adicionalmente, demostró que esta autofagia inducida por el p2Et es un proceso
determinante en inducir un fenotipo MCI.
La tunicamicina se usó como control positivo para inducir estrés de retículo debido
a su potencial para inhibir la N-glicosilación. Se esperaba que este tratamiento
lograra inducir una autofagia en la célula, sin embargo, no se obtuvieron muchos
puntos verdes de MDC en las imágenes por microscopia confocal y la media del
porcentaje de células autofagicas fue muy baja. Es posible que este resultado este
atribuido a la cinética de acción de este compuesto. En los resultados anteriores
(Figura 1 A), se demostró que la cinética de la tunicamicina respecto al p2Et es más
rápida, evidenciada en la inducción de estrés de retículo, por el contrario la acción
del p2Et parece ser más lenta. Teniendo en cuenta lo anterior, puede ser que la
inducción de autofagia por la tunicamicina se logre en un tratamiento por menos
tiempo. De igual forma, se debe considerar la posibilidad de que la tunicamicina no
se capaz de inducir autofagia en la línea celular B-16.
Para evaluar la relación que existe entre el estrés de retículo y la autofagia inducida
por la fracción p2Et, se inhibió el estrés de retículo con Salubrinal. Este compuesto
es un droga que tiene la propiedad de inhibir la defosforilación del eIF2 lo que
38
conlleva a que se inhiba el estrés de Retículo Endoplasmatico (Sokka, y otros,
2007). El efecto de este inhibidor sobre la autofagia inducida por p2Et se puede
observar claramente en la imágenes por microscopia confocal, donde después del
tratamiento con Salubrinal los puntos verdes, que representan las células
autofagicas, disminuyen considerablemente. Lo anterior permite inferir que la
propiedad del p2Et para inducir estrés de retículo, demostrada anteriormente, se
relaciona con una inducción eficiente de autofagia.
El resultado anterior puede estar atribuido a que como se mencionaba
anteriormente, dentro de la respuesta UPR a estrés de retículo, se produce la
expresión del factor de transcripción ATF4 controlada por PERK. Como
consecuencia, se ha visto que este factor puede inducir la expresión diferencial de
genes que ayuden a la adaptación a estrés, dentro de los cuales se incluyen genes
relacionados con la autofagia implicados en la adaptación al estrés incluyendo
genes implicados en la formación, elongación y la función del autofagosoma. De
igual forma, se ha reportado que la vía de señalización IRE1 participa en la conexión
entre la UPR y la autofagia a través de la unión de TRAF2 a su dominio citosólico y
la activación de JNK. Así mismo, cabe mencionar el poder de los polifenoles para
inducir estrés oxidativo en la célula. Este estrés puede conllevar a que se genere un
estrés de retículo que no pueda ser compensado con la respuesta UPR ni la
degradación por el proteasoma, generando acumulación de proteínas mal plegadas
en el citosol, lo que puede desencadenar una activación directa de la autofagia
(García et al., 2016).
Por otro lado, con el propósito de confirmar que efectivamente el estrés de retículo
estaba implicado parcialmente en la autofagia inducida por la fracción antitumoral
p2ET, se realizó la detección de la nucleoporina p62 mediante anticuerpos dirigidos
por medio de un western blot (Figura 2 C). p62 es un factor que marca las moléculas
que van a ser degradadas por medio de un proceso de autofagia y después se
degrada durante el desarrollo del flujo autofagico completo (Rusten & Stenmark,
2010). Los resultados demuestran un aumento en la degradación de esta proteína
39
cuando las células fueron tratadas con P2Et y metformina, respecto a los controles.
Una vez se inhibió el estrés de retículo se evidencio una mayor expresión de esta
proteína, lo que demuestra que no se está llevando a cabo un flujo autofagico en la
célula. Este resultado se contrasta con lo que se mencionó anteriormente, y con los
resultados obtenidos por Gómez et al. en el 2016, quienes también encontraron por
medio de western blot que cuando se trataba las células de melanoma B16F10 con
p2Et por 24 horas se producía la degradación de esta nucleoporina, indicando la
inducción de un flujo autofagico completo.
40
7. Conclusiones
Usando el sistema de plásmidos eIF2a S/S y S/A se mostró que la fracción anti-
tumoral P2Et tiene la capacidad de inducir estrés de retículo en la línea celular B16.
Por otro lado, se dio una aproximación preliminar de la relación que existe entre el
estrés de retículo y la autofagia inducida por la fracción p2Et, donde se demostró
que la autofagia inducida por p2Et depende parcialmente de la inducción previa de
estrés de retículo.
41
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