khảo sát thành phần hóa học rễ khí sinh của cây gừa (ficus microcarpa)

8/17/2019 Khảo sát thành phần hóa học rễ khí sinh của cây Gừa (Ficus microcarpa)

http://slidepdf.com/reader/full/khao-sat-thanh-phan-hoa-hoc-re-khi-sinh-cua-cay-gua-ficus 1/91

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐOÀN VĂN KHÔI

KHẢO SÁTTHÀNH PHẦN HOÁ HỌC RỄ KHÍ SINH CỦA CÂY GỪA

( Ficus microcarpa )

LUẬN VẶN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH HOÁ HỌC

2014

W.DAYKEMQUYNHON.UCOZ.COM WWW.FACEBOOK.COM/DAYKEM.QUYNHON

WWW.BOIDUONGHOAHOCQUYNHON.BLOGSPOT.COMng góp PDF b ở i GV. Nguy ễ n Thanh Tú



TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐOÀN VĂN KHÔI

KHẢO SÁTTHÀNH PHẦN HOÁ HỌC RỄ KHÍ SINH CỦA CÂY GỪA

( Ficus microcarpa )

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH HOÁ HỌC

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Ts. LÊ THANH PHƯỚC

2014





Trường Đại học Cần Thơ CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAMKhoa Khoa học Tự nhiên Độc lập – Tự do – Hạnh phúc Bộ môn Hoá học NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Cán bộ hướng dẫn: TS. Lê Thanh Phước

Tên đề tài:Khảo sátthành phần hoá học rễ khí sinh của cây gừa( Ficus microcarpa )Sinh viên thực hiện: ĐOÀN VĂN KHÔI MSSV: 2112034 Lớp: Hoá dược- Khoá 37 Nội dung nhận xét:

Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp: ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… Những vấn đề còn hạn chế:…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài:…………………………………………………………………………………

…………………………………………………………………………………K ết luận, kiến nghị và điểm:……...……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..

C ần Thơ, ngày ….tháng …. năm ….

Cán bộ hướng dẫn





Trường Đại học Cần Thơ CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Khoa Khoa học Tự nhiên Độc lập – Tự do – Hạnh phúc Bộ môn Hoá học NHẬN XÉT VÀ ĐÁNH GIÁ CỦA CÁN BỘ PHẢN BIỆN

Cán bộ hướng dẫn: TS. Lê Thanh Phước Tên đề tài:Khảo sátthành phần hoá học rễ khí sinh của cây gừa

( Ficus microcarpa )Sinh viên thực hiện: Đoàn Văn Khôi MSSV: 2112034 Lớp: Hoá dược- Khoá 37 Nộidung nhận xét:

Nhận xét về hình thức luận văn tốt nghiệp: ……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………

Nhận xét về nội dung luận văn tốt nghiệp: Đánh giá nội dung thực hiện đề tài:…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… Những vấn đề còn hạn chế:…………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………… Nhận xét đối với sinh viên thực hiện đề tài:……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………K ết luận, kiến nghị và điểm:……………………………………………………………………………………………………………………………………………………………………..

C ần Thơ, ngày ….tháng …. năm ….

Cán bộ phản biện





i

LỜI CẢM ƠN ----- -----

Sau hơn 4 tháng thực hiện đề tài, em đã học hỏi được nhiều kinh nghiệm quý báu, hữu ích cho những chặng đường tiếp theo của mình. Trong quá trình thực

hiện đề tài, Em nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy, cô, anh chị và các bạn bè cùng lớp. Nhân đây em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất đến: Thầy Lê Thanh Phước, Người thầy luôn tận tình giúpđỡ, chỉ bảo em trongcông việc học tập cũng như những kinh nghiệm quý báu trong đời sống. Emluôn ghi nhớ công ơn, sự tần tình của thầy đã dành cho em và các bạn. Emchân thành cảm ơn thầy. Tất cả quý thầy cô thuộc bộ môn Hoá học khoa Khoa học Tự nhiên cũng nhưnhững thầy cô thuộc các bộ môn, khoa viện khác đã tận tình giúpđỡ, tạo điềukiện thuận lợi để em có thể hoàn thành tốt luận văn. Gia đình, bạn bè và các anh chị, những người luôn theo sát, ủng hộ, giúp đỡ và

động viên em, đã giúp em vượt qua những khó khăn, trở ngại để hoàn thànhtốt luận văn này.Chúng em xin chân thành cảm ơn tất cả mọi người.

C ần Thơ, ngày …. tháng …. năm….

Đoàn Văn Khôi





ii

TÓM TẮT Cây Gừa (Ficus microcarpa ), là một loài cây cảnh được trồng phổ biến tạinhiều nơi trên lãnh thổ Việt Nam. Trong y học cổ truyền, cây Gừa được sửdụng để điều trị một số bệnh như cảm cúm, viêm amidan,… Trong nghiên cứunày, các hợp chất friedeline, epifriedelanol, (23 E )-27-nor -3 -Hydroxycycloart-23-en-25-one, β -sitosterol và β -sitosterol-3-O- β -D-glucosideđã được phân lập từ dịch chiết rễ k hí sinh cây Gừa. Cấu trúc được xác định bằng phổ1H-NMR và so sánh với những dữ liệu phổ đã được công bố trướcđây. Từ khóa: Cây Gừa,Ficus microcarpa , (23 E )-27-nor -3 -Hydroxycycloart-23-en-25-one, friedeline, epifriedelanol.





iii

ABSTRACT Ficus microcarpa L. f. (Moraceae), which is a popular ornamental plant in

Viet Nam, has been used as traditional medicine for treating several diseasessuch as flu, tonsillitis… in this investigation, friedeline, epifriedelanol, (23 E )-27-nor -3 -Hydroxycycloart-23-en-25-one, β -sitosterol and β -sitosterol-3-O- β -D-glucoside were isolated from its aerial root. The structure of the isolatedcompounds were characterized on the basis of extensive spectral data (1H) andin comparison with spectral data of those previously reported.

Key words:Ficus microcarpa , (23 E )-27-nor -3 -Hydroxycycloart-23-en-25-one, friedeline, epifriedelanol.





iv

LỜI CAM KẾT Chúng tôi xin cam k ết luận văn này đượ c hoàn thành dựa trên các k ết

quả nghiên cứu của chúng tôi và các k ết quả của nghiên cứu này chưa đượ cdùng cho bất cứ luận văn cùng cấ p nào khác.

Ký Tên

Ngày: …………….





v

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN......................................................................................................... i TÓM TẮT .............................................................................................................. ii ABSTRACT .......................................................................................................... iii LỜI CAM KẾT......................................................................................................iv MỤC LỤC...............................................................................................................v DANH MỤC BẢNG............................................................................................. vii DANH MỤC HÌNHẢNH................................................................................... viii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT................................................................................ ix DANH MỤC PHỤ LỤC......................................................................................... x CHƯƠNG 1 GIỚ I THIỆU.......................................................................................................... 1

1.1Đặt vấn đề..................................................................................................... 1 1.2Mục tiêu nghiên cứ u..................................................................................... 1 1.4 Nội dung nghiên cứ u và giớ i hạn của đề tài nghiên cứ u. ............................ 1

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................................... 3

2.1 Khái quát vềcây Gừ a (Ficus microcarpa)và họdâu tằm (Moraceae) ...... 3 2.1.1 Khái quát về họDâu tằm (Moraceae)................................................... 3 2.1.2Đại cương vềcây Gừ a ........................................................................... 4 2.1.3Vị trí trong hệthống phânloại thự c vật. .............................................. 4 2.1.4 Hình thái thự c vật.................................................................................. 5 2.1.5 Phân bố.................................................................................................. 6 2.1.6 Côngdụng và hoạt tính sinhhọc........................................................... 6

2.1.7 Nhữ ng nghiên cứ u khoahọc vềcây Gừ a ............................................... 6 2.2 Giớ i thiệu vềmột sốhợ p chất hữu cơ ........................................................ 9

2.2.1 Steroid.................................................................................................... 9

2.2.2 Terpenoid..............................................................................................10 2.2.3 Glycoside...............................................................................................11 2.3Cơ sở lýthuyết và một số phươngpháp thự c nghiệm................................12

2.3.1 Dung môiđểchiết tách hợ p chất ra khỏi mẫu cây ..............................13 2.3.2 Một số kĩthuật chiết tách hợ p chất ra khỏi cây ..................................15 2.3.3 Sắc ký lớp mỏng và định tính sựhiện diện của một số hợp chất hữu cơ ........................................................................................................................19 2.3.4Phươngpháp sắc ký cột........................................................................25 2.3.5 Các phươngpháp khác.........................................................................29

CHƯƠNG 3 PHƯƠNGPHÁP VÀPHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨ U .....................................31

3.1 Thờ i gian vàđịa điểm nghiên cứ u...............................................................31

3.2Phương tiện nghiên cứ u ..............................................................................31 3.2.1Dụng cụ, thiết bị....................................................................................31 3.2.2 Hóa chất sử dụng..................................................................................31

3.3Phươngpháp nghiên cứ u ............................................................................32 3.3.1Phươngpháp thu mẫu và xử lýmẫu....................................................32 3.3.2 Xác định độ ẩm nguyên liệu .................................................................32 3.3.3Điều chế các cao thành phần................................................................33 3.3.4 Phương pháp phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc........................34





vi

CHƯƠNG 4 KẾT QUẢTHỰ C NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN .................................................35

4.1Điều chế các loại cao....................................................................................35 4.1.1 Chuẩn bị nguyên liệu............................................................................35 4.1.2Điều chếcao ethanol tổng.....................................................................36 4.1.3Điều chế các cao thành phần từcao ethanol tổng................................36

4.2 Thửnghiệm hoạt tính kháng khuẩn trên một sốcao thành phần.............39 4.3 Quá trình phân lập và tinh chế các chất.....................................................42 4.3.1Khảo sát cao Petroleum ether ..............................................................42 4.3.2 Hợ p chất PHUOC-K5...........................................................................52

4.4 Biện luận cấu trúc các hợ p chất phân lập đượ c .......................................53 4.4.1 Biện luận cấu trúc của hợ p chất PHUOC-K1 ....................................53 4.4.2 Biện luận cấu trúc của hợ p chất PHUOC-K2 .....................................54 4.4.3 Biện luận cấu trúc hợ p chất PHUOC-K3 ..........................................56 4.4.4 Biện luận cấu trúc hợ p chất PHUOC-K5 ...........................................57 4.4.5 Biện luận cấu trúc hợ p chất PHUOC-K6 ..........................................58

CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...............................................................................61

5.1 Kết luận .......................................................................................................61 5.2 Kiến nghị .....................................................................................................61

TÀI LIỆU THAM KHẢO....................................................................................62 PHỤ LỤC ..............................................................................................................63





vii

DANH MỤC BẢNG

Bảng 2.1 Một vài thuốc thửhiện hiện SKLM 24

Bảng 3.1 Các dung môi, hóa chất đã đượ c sử dụng 31Bảng 4.1 Hoạt tính kháng khuẩncác loại cao chiết r ễ khísinh cây Gừa 39Bảng 4.2 K ết quảsắc ký cột cao PE 43Bảng 4.3 K ết quảsắc ký cột phân đoạn PE_III 43Bảng 4.4 K ết quảsắc ký cột phân đoạn PE_II 47Bảng 4.5 K ết quảsắc kí cột phân đoạn PE_VII(*) 49

Bảng 4.6 So sánh dữliệu phổ của hợ p chất PHUOC-K1 và epifriedelanol

54

Bảng 4.7 So sánh dữliệu phổhợ p chất PHUOC-K2vớ i friedeline 55Bảng 4.8 So sánh phổhợ p chất PHUOC-K3vớ i -sitosterol 56Bảng 4.9 So sánh dữliệu phổhợ p chất PHUOC-K5vớ i hợ p chất daucosterol 57Bảng 4.10 So sánh phổhợ p chất PHUOC-K6và hợ p chất 27-nor -3 -Hydroxy-25-oxocycloartane 59





viii

DANH MỤC HÌNHẢNH

Hình 2.1 Một sốcây thuộc họDâu tằm Moraceae:(1) Sung; (2) Dâu tằm; (3) Sakê 3

Hình 2.2 Cây Gừa mọc ven bờsông. 4Hình 2.3 Cây Gừa F. microcarpa (từ trái sang phải):(1) cành mang lá,quả; (2) r ễ khísinh; (3)quảGừa vàmặt trêncủa lá Gừa. 5Hình 2.4 Thân một cây Gừa lớ n. 5Hình 2.5 Cách tínhgiá trịR f 20Hình 2.6 Cột sắc ký. 25Hình 3.1 Chuẩn bịnguyên liệu. 32Hình 3.2 Cô quay thu hồi dung môi. 33Hình 4.1 Bột cây đượ c ngâm trong cồn 96. 35Hình 4.2 Sơ đồ điều chế các loại cao. 38Hình 4.3 Thửnghiệm hoạt tínhức chếtrên haichủng khuẩn Escherichia coli và Bacillus pumilus . 40Hình 4.4 Đườ ng kính vòng vô khuẩn của các mẫu thử. 41Hình 4.5 Cao PE. 42Hình 4.6 SKLM cao PE hệ giải ly PE:Ea (9:1). 42Hình 4.7 Sắc ký cột cao PE. 43Hình 4.8 Sắc ký cột phân đoạn PE_III. 45Hình 4.9 Tinh thể hợ p chất PHUOC-K1. 46Hình 4.10 SKLM hợ p chất PHUOC-K1. 46Hình 4.11 Tinh thểhợ p chất PHUOC-K2. 48Hình 4.12 SKLM hợ p chất PHUOC-K2. 48Hình 4.13 SKC phân đoạn PE_VII(*) 49Hình 4.14 Tinh thể các hợ p chất PHUOC-K6;PHUOC-K3 và PHUOC-K4 51Hình 4.15 SKLM hợ p chất PHUOC-K4 51Hình 4.16 SKLM hợ p chất PHUOC-K6 52Hình 4.17 Tinh thểhợ p chất PHUOC-K5 52Hình 4.18 SKLM hợ p chất PHUOC-K5 53





ix

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

NMR Nuclear Magnetic Resonance1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Chemical shift

d Doublet (NMR)t Triplet (NMR)s Singlet (NMR)SKLM Sắc ký lớ p mỏngPE Petroleum ether 60-90Ea Ethyl acetateMe MethanolHex n-HexanC Chloroform ppm Parts per milionR f Retention factorEtOH Ethanol





x

DANH MỤC PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Phổ1H-NMR trong CDCl3 của hợ p chất PHUOC-K1 63

Phụ lục 2. Phổ1H-NMR (hex) trong CDCl3 của hợ p chất PHUOC-K1 64

Phụ lục 3. Phổ1

H-NMR trong CDCl3 của hợ p chất PHUOC-K265

Phụ lục 4. Phổ1H-NMR(hex) trong CDCl3 của hợ p chất PHUOC-K2 66








Phụ lục 12. Phổ IR của hợp chất PHUOC-K2 74

Phụ lục 13. K ết quảkháng khuẩn cao PE 75

Phụ lục 14. K ết quả kháng khuẩn cao Ea 76

Phụ lục 15. K ết quả kháng khuẩn cao tổng 77





1

Chương 1

GIỚ I THIỆU

1.1Đặt vấn đề

Cây Gừa có tên khoahọc làFicus microcarpa là một loài thực vật có hoathuộc họDâu tằm (Moraceae). Loài Gừa có nguồn gốc từkhu vực Đông NamÁ.ỞViệt Nam, cây thườ ng mọc hoangở vùng có thủy triều, mọc dựa bờsông, kênhrạch. Câycũng đượ c tr ồng trong chậu, làmcảnhởmột số nơi.

Cây Gừa còn đượ c dùngđể làm thuốc. Lá và r ễ phụ được thu quanh năm,r ửa sạch, chặt nhỏr ồi phơi khô để dùng dần. Theo Đông y Việt Nam,nó có vịđắng và se, tính mát, có tácdụng thanh nhiệt, tiêu viêm, làm ra mồhôi và lợ itiểu. R ễ phụ dùng chữa cảm mạo, sốt cao, viêm amidan,đau nhức xươngkhớ p,…ỞTrung Quốc, dùng Gừa trị viêm phế quản, phong thấ p, gãy xương.Lá dùng chữa cúm, viêm khí quản, ho gà, sốt rét, viêm ruột cấp, lỵ.

Tuy nhiên,ởnướ c ta, việc sử dụng loài cây này trong các bài thuốc namchủyếu dựa trên kinh nghiệm dân gian chứ chưacó nhiều các nghiên cứukhoahọc. Do đó, đề tài “KHẢO SÁT THÀNH PHẦ N HÓAHỌC R Ễ KHÍSINHCỦA CÂY GỪ A (Ficus microcarpa ) ” đượ c thực hiện vớ i mong muốntìm hiểu đượ c thành phần hóahọc của r ễ khísinh cây loài cây nàyđể tạo cơ sởkhoahọc cho việcứng dụng chúng trong yhọc.

1.2 Mục tiêu nghiên cứ u.

Tìm hiểu về cây Gừa cũng nhưcác bài thuốc đượ c sử dụng trong dângian từ các bộ phận của cây Gừa.

Góp phần nghiên cứu thành phần hóahọc của r ễ khísinh cây Gừa (Ficusmicrocarpa ) họMoraceaeđể giải thích những tácdụng của chúng trong yhọc.

Phân lậ p và xác định cấu trúc các hợ p chất phân lập đượ c từ các dịchchiết của r ễ khísinh cây Gừa Ficus microcarpa. , họMoraceae.

1.4 Nội dung nghiên cứ u và giớ i hạn của đề tài nghiên cứ u.

Nội dung chính của đề tài là ly trích và phân lập một số hợp chất cótrong r ễ khísinh cây Gừa Ficus microcarpa.

Xác định độ ẩm của mẫu. Điều chế cao alcol tổng bằng phương pháp ngâm dầm.





2

Từ cao tổng, sử dụng phương pháp chiết lỏng-lỏng điều chế các cao cóđộ phân cực khác nhau: cao petroleum ether, cao ethyl acetate, cao nướ c.

Cô lập và tinh chế các chất từ một cao phân đoạn bằng sắc ký cột.

Gửi mẫu chất phân lập được đi đo phổ1H- NMR để xác định cấu trúc

hóa học.





3

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Khái quát vềcây Gừ a ( Ficus microcarpa ) và họdâu tằm (Moraceae)

2.1.1 Khái quát về họDâu tằm (Moraceae)[1]

Họ Dâu tằm là một họ trong số các thực vật có hoa, trong hệ thốngCronquist được xếp vào bộ Gai (Urticales). Họ này là một họ lớn, chứa từ 40-60 chi và khoảng 1.000-1.500 loài thực vật phổ biến rộng r ãi ở các khu vựcnhiệt đới và cận nhiệt đới, nhưng ít phổ biến ở các vùng ôn đới. Trong họ nàycó một số loài được biết đến nhiều như đa, đề, dâu tằm, dâu đỏ hay mít.

Họ này chứa các loài cây thân gỗ hay cây bụi, thường xanh hoặc rụng látheo mùa. Cây thường có nhựa màu tr ắng như sữa. Lá mọc cách, đơn lá kèm bọc lấy chồi, sớm rụng để lại vết sẹo. Trong họ này, nhiều loài có r ễ mọc từcành, cắm xuống đất (ví dụ: các loài trong chi Ficus). Một số loài Ficus bámlên các thân cây to khác, đâm nhiều rễ phụ bám tr ên thân cây chủ, gây nênhiện tượng thắt nghẹn làm cho cây chủ bị chết. Hoa đơn tính cùng cây haykhác cây, hợp thành cụm hoa xim, bông đuôi sóc, hay hình đầu nằm tr ên mộttr ục chung lồi (như mít, dâu tằm), hay lõm bọc lấy hoa ở bên trong (như sung,ngái). Bao hoa có 2-4 mảnh, nhị bằng số mảnh bao hoa và mọc đối diện với bao hoa. Bộ nhụy gồm 2 lá noãn mà một thường sớm tiêu giảm, bầu 1 buồngchứa một noãn đảo hay cong, bầu noãn thượng, đôi khi là hạ. Quả phức donhiều quả đơn dính lại với nhau. Hạt phần lớn có nội nhũ, đôi khi không có.

Hình 2.1 Một sốcây thuộc họDâu tằm: (1) Sung, (2) Dâu tằm, (3) Sakê





4

2.1.2Đại cương vềcây Gừ a [2]

Cây Gừa còn có tên khoahọc là Ficus microcarpa , thuộc họDâu tằmMoraceae. Cây Gừa còn có nhiều têngọi khác như: Gajumaru, Indian Laurel,Chinese Banyan, Malayan Banyan,….

Hình 2.2 Cây Gừa mọc ven bờsông2.1.3 Vị trí trong hệthống phân loại thự c vật.





5

Hình 2.3 Cây Gừa F.microcarpa (từ trái sang phải): (1) cành mang lá, q uả; (2) r ễ khísinh; (3)quảGừa và mặt trêncủa lá Gừa

2.1.4 Hình thái thự c vật. Gừa là cây gỗ nhỏhoặc trung bình, thườ ng xanh, cao 15-20(25)m, có

hệr ễ khísinh phát triển mạnh,vỏ ngoài màu xám.Lá mọc cách, phiến lá hình bầu dục-tr ứng hoặc gần tr ứng-bầu dục, kích thướ c 3-12 x 1,5 – 9 cm, gốc láhình nêm, chóp lá tù hoặc hơi nhọn, mép lá nguyên, 5-9đôi gân bên, thườ ngnhẵn. Trái mọc ở nách lá, thường từng đôi một, không cuống, gần hình cầu,đường kính chừng 8-12 mm, nhẵn, khi chín có màu tím hoặc thẫm. Cả hoa đựcvà hoa cái đều không cuống, bao hoa 3 (4)mảnh, hoa đực chỉ có 1 nhị.

Hình 2.4 Thân một cây Gừa lớ n





6

2.1.5 Phân bố Gừa là loài có vùng phân bố r ộng từ Ấn Độ, Sri Lankađến Thái Lan,

Malaysia, miền Nam Trung Quốc, quần đảo Ryukyu, quần đảo Solomon,Australia, quần đảo Lovalty và Palau….Ở nướ c ta, loài này thườ ng mọchoang hoặc đượ c tr ồng nhiều ở các nơi nhưHà Nội, thành phốHồ ChíMinh,Quảng Nam, Bình Phướ c, Đồng Nai,…

Gừa sinh trưởng trong nhiều điều kiện sinh thái khác nhau từ các hốc đáven bờ biển đến đồi núi đá, từ các khu vực đầm lầy ven biển đến vùng r ừngnúi. Thường gặp mọc ven theo sông suối, k ênh r ạch, vùng có triều. Cây ra hoak ết quả hầu như quanh năm.

2.1.6 Côngdụng và hoạt tính sinhhọc.

R ễ khísinh dùng sắc uống chữa cảm mạo, viêm amidan,đau nhức khớ p

xương…. Nhựa từ lá, r ễ, vỏcây Gừa đượ c dùng làm thuốc chữa đau đầu,đaurăng, các chỗ sưng đau. Nướ c sắc từ lá dùng làm thuốc uống chữa cảm cúm,ho gà, viêmkhí quản, viêm ruột cấ p, sốt rét….

Tại quần đảo Admiralty, ngườ i ta dùng lá Gừa non nấu nướ c xôngđểchữa cảm và đau nhức đầu. Nhựa từ lá và vỏ đượ c dùng làm thuốc trị viêmgan và tiêuchảy.

2.1.7 Nhữ ng nghiên cứ u khoahọc vềcây Gừ a [2]

2.1.7.1. Nghiên cứ u về hoạt tính sinhhọc [3]

Theo các k ết quả hoạt tính sinhhọc cho thấy dịch chiết methanolcủa vỏ,quả và lácây Gừa Ficus microcarpa thểhiện hoạt tính chống oxi hóamạnh. Ngoài ra, cặn chiết methanolcủa vỏ cây Gừa còn thểhiện hoạt tính khángkhuẩn trên các chủng Gram(-) như Escherichia coli và Achromobacter

polymorph hay trên cácchủng Gram(+) như Bacillus brevis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis …..

Những nghiên cứu tiế p theo về các hoạt tính kháng khuẩn và chống oxihóa của các cao chiết từ r ễ khísinh cây Gừa của nhóm tácgiảAo Changwei

còn cho thấy phân đoạn chiết ethyl acetate có chứa các hợ p chất phenol caonhất đồng thờ i cũng thểhiện hoạt tính chống oxi hóamạnh nhất.

Các nghiên cứu tiế p theocủa nhóm tácgiảngườ i Ấn Độcho thấy bêncạnh hoạt tính chống oxi hóamạnh thì phân đoạn chiết ethyl acetatecủa vỏcây Gừa còn thể hiện hoạt tính bảo vệganmạnh (thểhiện ởmức độ làm giảmsự thay đổi các chỉ số sinh hóaở chuột khi đượ c kích thích bằng CCl4 và paracetamol). Các nghiên cứu về hóa thực vật cho thấy có sự xuất hiện của





7

một hợ p chất phenol làcatechin đóng vaitrò tạo nênhoạt tính chống oxi hóavà bảo vệgan.

Sau đó, các nghiên cứu tiế p theocủa nhóm tácgiảngườ i Ai Cậ p cho thấycặn chiết n-hexanecủa lá cây Gừa có tácdụng chống oxi hóavà giảm lipid

máuởchuột gây tăng cholesterolmáu do nó có tácdụng làmgiảm sựoxi hóaLDL (low-density lipoprotein),tăng cườ ng tổng hợ p HDL (high-densitylipoprotein)và ức chếsự peroxy hóa lipid.

2.1.7.2 Nghiên cứ u về thành phần hóahọc [2] [3]

Thành phần hóahọc của cây Gừa đã đượ c các nhà khoahọc trên thếgiớ iđể ýnghiên cứu từ khásớ m. Theo các nghiên cứu gần đâythì thành phần hóahọc của cây Gừa chủyếu gồm các chất có khung triterpene. Bêncạnh đó, còncó sự xuất hiện các nhóm hợ p chất như flavonoid, lignan, phenylpropanoid,chlorin, monoterpene, dẫn xuất của tocopherol….

Theo các nghiên cứu của các nhà khoa học trên thếgiớ i thì trong thành phần của cây Gừa có nhiều các thành phần triterpene trong đó có cáctriterpene mớ i thuộc các khung như lupan, olean, taraxastan, ursan… Bêncạnhđó, việc khảo sát thành phần r ễ khísinh cây Gừa đã phát hiện đượ c cáctriterpene mớ i và hiếm gặp nhưcác triterpene có cấu trúc 13,27-cycloursan,29(20->19)abeolupane-3,20-dione và 19,20-secoursane-3,19,20-trione.

3 -Acetoxy-15 -hydroxy-13,27-cyclours-11-ene

3 -Acetoxy-12 -formyloxy-13,27-cycloursan-11 -ol





8

29(20 19)abeolupane-3,20-dione

19,20-secoursane-3,19,20-trione

Bên cạnh các triterpene thì Gừa cũng đượ c coi là nguồn cung cấ p cácflavone, isoflavone và các hợ p chất phenol có triển vọng. Nhiều nhóm hợ pchất có các cấu trúc mới đã đượ c phân lậ p và xác định cấu trúc từ các dịchchiết các bộ phận cây Gừa.

Năm 2009, một hợ p chất flavonoid dạng khung chalcone mớ i là4-(2-Methylbut-3-en-2-yl)-4-methoxy-2,5-dihydroxychalcone được phân lậ pvà xác định cấu trúc từ rễ khí sinh cây Gừa. Hợp chất này thể hiện hoạt tínhyếu ức chế sự sản sinh khí NO và gây độc đối với các dòng tế bào ung thưK562 và PC3.

O

OH

HO

MeO

4-(2-Methylbut-3-en-2-yl)-4-methoxy-2,5-dihydroxychalcone Năm2010, hai hợ p chất catechin vàepicatechin đượ c công bố khi tiến

hành khảo sátvỏcây Gừa. Hai chất này thể hiện hoạt tính chống oxi hóa vàức chế enzymhyaluronidase r ất tốt (enzym xúctác thủy phân hyaluronic acidvà được cho là giữ vai tr ò quan tr ọng trong quá tr ình di căn của các tế bào ung thư).





9

Epicatechin Catechin

Năm 2014, hai hợ p chất mớ i là ficuflavoside,ficumegasoside đã đượ c NguyễnXuân Cườ ng công bố trong luận án tiến sĩ của mình khikhảo sát dịch chiếtmethanol lá cây Gừa.

Ficumegasoside Ficuflavoside

2.2 Giớ i thiệu vềmột sốhợ p chất hữu cơ [4] [5] [6]

2.2.1 Steroid

Steroid là nhóm hợ p chất tựnhiên phân bố r ộng rãi trong giới động vậtvà thực vật, vớ i cấu trúc tổng quát là hệ thống vòngcyclopentanoperhydrophenantren hoặc trong một vài tr ườ ng hợ p hiếm gặ p làsự biến đổi của hệthống vòng nói trên.

Hệthống vòng cyclopentanoperhydrophenantren

Steroid phân bố rộng r ãi, thường có mặt song song với các alkaloid hoặcsaponinsteroid. Các steroid nguồn gốc thực vật gọi là phytosterol, nguồn gốcđộng vật gọi là zoosterol.

Người ta thấy chúng ở thể ở dạng tự do hoặc ở thể hóa hợp như ester,glycosid. Steroid là chất không phân cực, rất ít tan trong nước,tan trong dầu béo; tan nhiều trong các dung môi không phân cực như petroleum ether, benzene, chloroform, nên thường dùng các dung môi này để chiết sterol. Sản





10

phẩm chiết được bằng dung môi hữu cơ thường là hỗn hợp các ester sterol kếthợp với lipid, caroten, lecitin. Phải qua giai đoạn xà phòng hóađể tách cácchất này ra khỏi sterol, sau đó chiết sterol bằng dung môi hữu cơ. Tinh chế bằng kết tinh phân đoạn. Các steroid có tác động đặc biệt đối với cơ timthường tồn tại dưới dạng glycoside trong tự nhiên được gọi là glycoside tr ợtim. Các sapogenin steroid phân lập chủ yếu từ sự thủy phân glycoside thựcvật còn gọi là saponin.

H

H

HO

H

H

Cycloartenol Solasodin

Cholesterol

2.2.2 Terpenoid

Terpenoid là nhóm hợp chất tự nhiên mà cấu trúc hóa học dựa trên cơ sởcác phân tử isoprene liên k ết lại vớinhau, có công thức tổng quát (C5H8)n vớin ≥ 2. Tuy là dẫn xuất của isoprene nhưng isoprene lại không phải là tiền chấtcủa quá tr ình sinh tổng hợp terpenoid. Chất liệu cơ bản để sinh tổng hợpterpenoid là pharnesyl pyrophosphate.

Dựa vào số đơn vị isoprene, người ta phân chia thành: monoterpene(C10H16), sesquiterpene (C15H24), diterpene (C20H32), sesterterpene (C25H40),triterpene (C30H48), tetraterpene (C40H64), polyterpene (C5H8)n.

Monoterpene (C10H16) là thành phần chính của tinh dầu, hiện diện trongkhoảng 60 họ thực vật, nhưng chủ yếu trong 10 họ. Hàm lượng tinh dầu trongcây thường thấp, khoảng 1 %, ngoại trừ nụ hoa cây Đinh hương Syzygiumaromaticum (L.)có hàm lượng tinh dầu chiếm15-20 %. Cấu trúc hóa học của





11

các monoterpene có thể là mạch hở 1, 2 hoặc 3 vòng với khoảng 10 khungsườn carbon cơ bản chính.

Sesquiterpene (C15H24): Tinh dầu cũng chứa những hợp chất loạisesquiterpene, thường gặp các sesquiterpene lacton trong các cây họ Cúc. Cấu

trúc hóa học của các hợp chất tự nhiên sesquiterpene có thể là mạch hở, 1, 2, 3hoặc 4 vòng với 80 khung sườn carbon cơ bản chính.

Diterpene (C20H32): Trong tự nhiên, diterpene không vòng là hợp chất phytol, diterpene đơn vòng là vitamin A. Diterpene bốn vòng có khung cơ bảnlà gibberelan với ví dụ là gibberilin, chất tăng trưởng thực vật. Cấu trúc hóahọc của các hợp chất tự nhiên diterpene có thể là mạch hở , 1, 2, 3 hoặc 4 vòngvới 70 khung sườn carbon cơ bản chính.

Sesterterpene (C25H40): Trong tự nhiên, các hợp chất loại sesterterpenehiện diện với số lượng nhỏ. Cấu trúc hóa học của các sesterterpene có thể làmạch hở, 1, 2, 3 hoặc 4 vòng với 6 khung sườn carbon cơ bản chính.

Triterpene (C30H48) được phân bố rộng r ãi trong giới động vật và thựcvật, hiện diện ở dạng tự do hoặc glycoside. Cấu trúc hóa học của các triterpencó thể là mạch hở, 3, 4 hoặc 5 vòng với 33 khung sườn carbon cơ bản chính.

Tetraterpene (C40H64) còn được gọi là carotenoid. Các hợp chất nàythường có cấu trúc hóa học gồm hệ thống các nối đôi liên hợp, nên hợp chấtcó màu từ vàng, cam đến đỏ tạo nên màu sắc cho hoa và trái cây. Cấu trúc hóahọc của các tetraterpene có thể là mạch hở, 1 hoặc 2 vòng.

Polyterpene (C5H8)n: Các polyterpene luôn có cấu trúc mạch hở, thẳng.Các polyterpene tự nhiên với độ polymer hóa cao (từ 500 đến 5000 đơn vịisoprene) là những hợp chất nhựa cây hiện diện trong khoảng 300 loài thựcvật.

Hầu hết hợp chất terpenoid có cấu trúcvòng với một số nhóm chức như –OH, >CO, -CHO, -O-. Đặc tính chung của chúng là ít tan trong nước, tantrong chất béo ngoại trừ các glycoside (tạo thành khi chúng k ết hợp với oza)thì tan trong nước.

2.2.3 GlycosideCác glycoside hiện diệntrong r ất nhiều họ thực vật và ở tất cả các bộ

phận cây: lá, vỏ, hạt,…Các glycoside thường là chất kết tinh và có vị đắng.Trong cây, chúng tồn tại dưới dạng glycoside hòa tan trong các dịch tế bào.Glycoside là hợp chất mà cấu trúc hóa học gồm có hai phần: phần aglycone và phần đường. Phần đường của glycoside: phần đường phổ biến là D-glucose,





12

D-galactose, L-arabinose, L-rhamnose, D-xylose, acid glucuronic, acidgalacturonic và một số đường khác. Phần aglycone của glycoside: phầnaglycone r ất đa dạng và gồm tất cả các hợp chất tự nhiên như: monoterpene,sesquiterpene, diterpene, triterpene, steroid, iridoid, alkaloid, quinonoid, polyphenol,…

Các glycoside có tính phân cực khá mạnh nên không tan trong petroleum ether, hexane, benzene nhưng tan được trong chloroform, diethylether (các monoglycoside), tan tốt trong alcol, nước.

Osmundalacton

O

O

O

HO HO

OHO

O CH 3OH

OH

OH

OHHO

OH

O

Rutin

2.3Cơ sở lýthuyết và một số phươngpháp thự c nghiệm [4] [5]

Thiên nhiên vốn đa dạng, mỗi loài có tính đặc thù riêng. Protein vànucleic acid là hợp chất cần thiết cho sự sống sinh vật. Ngoài những hợp chấtđó, còn có các chất biến dưỡng thứ cấp (alkaloid, quinonoid, steroid,terpenoid, iridoid, flavonoid, glycoside,…) cần thiết hoặc không cần thiết chosinh vật. Cấu trúc hóa học của các hợp chất rất đa dạng, do đó không có quy

trình tách chiết tổng quát nào có thể áp dụng cho tất cả các loài mà mỗi loạimỗi nhóm có phương pháp khác nhau tùy theo mục đích người khảo sát. Lựachọn dung môi và qui trình phù hợp để chiết tách hợp chất ra khỏi cây là r ấtquan tr ọng, điều này tùy thuộc vào đặc tính của chất biến dưỡng thứ cấp cótrong cây mà người khảo sát mong muốn cô lập.





13

2.3.1 Dung môiđểchiết tách hợ p chất ra khỏi mẫu cây

2.3.1.1 Dung môi chiết tách

Do cấu tạo của cây cỏ hoặc sinh khối thường là những chất liệu đại phântử (polymer, ví dụ như cellulose có trong cây cỏ, nấm mốc, thành tế bào visinh vật) tương đối trơ, không hoà tan trong dung môi hữu cơ, vì thế việc khảosát hợp chất thiên nhiên là chiết lấy và khảo sát các chất biến dưỡng thứ cấp cótr ọng lượng phân tử nhỏ.

Thông thường người ta muốn nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có tính áidầu có mức độ phân cực khác nhau, tuy nhiên, đôi khi cũng nghiên cứu cáchợp chấttự nhiên có tính ái nước. Điều này được thực hiện bằng cách chiếtnhững hợp chất có trong cây lần lượt bằng các dung môi có tính phân cực tăngdần hoặc chiết một lần lấy tất cả các loại hợp chất bằng cách sử dụng du

môi vạn năng methanol (có thể chiết hầu hết các loại hợp chất tự nhiên). Nguyên tắc tổng quát là lựa chọn dung môi và quy trình phù hợp để chiết

tách hợp chất ra khỏi mẫu cây, điều này tuỳ thuộc vào đặc tính của chất biếndưỡng thứ cấp có trong cây mà người khảo sát mong muốn tách cô lập. Các hợp chất tự nhiên có cấu trúc hóa học đa dạng, với tính chất phân cực khác biệt nên không thể có một quy tr ình tổng quát nào có thể áp dụng chung chotất cả các nhóm, mà mỗi loại nhóm phải có một số quy tr ình chiết tách đặctrưng, vì vậy, khi tiến hành thực nghiệm phải thu thập đầy đủ các tài liệu thamkhảo có liên quan tr ực tiếp tr ên cây mới có thể chọn được quy tr ình phù hợp.

Muốn chiết hợp chất ra khỏi cây cỏ cần chọn dung môi phù hợp, sử dụngk ỹ thuật chiết tách phù hợp bằng cách ngâm dầm, bằng máy chiết Soxhlet,...Sau khi chiết, phần bã cây hay sinh khối còn lại được loại bỏ, dung môi qualọc được thu hồi bằng máy cô quay chân không ở nhiệt độ thấp khoảng 30-40°C vì thực hiện ở nhiệt độ cao có thể làm hư hại một vài hợp chất kém bềnnhiệt.

2.3.1.2 Lự a chọn dung môiđểchiết tách

Chọn dung môi phải có tính trung tính, không độc, không quá dễ cháy,

hoà tan được hợp chất cần khảo sát, sau khi chiết tách xong, dung môi đó cóthể được loại bỏ dễ dàng. Cần tránh các dung môi độc như benzene hoặc dễcháy do có nhiệt độ sôi thấp như diethyl ether, carbon tetraclorua,…





14

Dung môi dùng để chiết cần thỏa một số điều kiện sau: Có nhiệt độ sôi thấp, tuy nhiên nếu thấp quá thì dung môi dễ hao hụt do bay hơivà dễdẫn đến dễ cháy nổ.

Không tác dụng hóa học vớ i các chất có trong nguyên liệu và không bị

thay đổi tính chất khi sử dụng lại. Nhiệt hóa hơi thấp để tránh tiêu hao nhiều nhiệt. Có độ nhớt bé để không làm giảm tốc độ khuếch tán. Có khả năng hòa tan lớn các hoạt chất nhưng rất bé đối với tạp chất. Không tạo thành hỗn hợp nổ đối với không khí, không được có những tạp

chất không bay hơi và khi bay hơi không được để lại các tạp chất có mùilạ.

Phải tinh khiết, không ăn mòn thiết bị. Không gây mùi lạ đối với sản phẩmvà không độc hại với người sử dụng.

Dễ tìm và rẻtiền.

2.3.1.3 Một số điều cần thiết khi sử dụng dung môiđểchiết tách hợ p chất

Các dung môi cần được chưng cất lại và tồn trữ trong các chai lọ thủytinh do trong dung môi thường hay chứa một số tạp bẩn mà thường gặp nhất làchất dẻo hóa. Các chất dẻo lẫn vào dung môi do dung môi thường được chứatrong các thùng làm bằng nhựa dẻo.

Methanol và chloroform thường chứa tạp chất là di(2-etylhexyl) phthalatvà chất này thường bị nhiều tác giả nhầm lẫn rằng là hợp chất tự nhiên có chứatrong cây cỏ đang khảo sát.

Chloroform, dichloromethane có thể tạo phản ứng với các loại alkaloidnhư brucin, strychnin, ephedrine,… để tạo thành các alkaloid dạng muối tứcấp và một vài hợp chất giả tạo khác. Tương tự, các vết HCl có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước, sự đồng phân hoá cho vài hợp chất hữu cơ.

Diethyl ether ít được sử dụng để chiết vì có nhiệt độ sôi thấp, dễ cháy,độc, có thể gây mê cho người sử dụng và có khuynh hướng tạo thành peroxiddễ gây nổ. Peroxid này r ất hoạt động, có thể oxid hoá các hợp chất mang nhiềunối đôi liên hợp như carotenoid.

Acetone có thể tạo ra dẫn xuất acetonid nếu hợp chất chiết có chứa nhómcis-1,2-diol hiện diện trong môi trường acid.





15

Chiết bằng môi trường acid hay kiềm có thể thuỷ giải các hợp chấtglycoside (môi trường acid sẽ cắt đứt glycoside tại nối acetal làm mất đi phầnđường) hoặc cắt đứt nối ester (môi trường kiềm) hoặc tạo ra sự chuyển vị.

2.3.1.4 Sự hòa tan của các chất trong dung môi

Dựa vào tính phân cực của dung môi và của các nhóm hợp chất ta có thểdự đoán sự có mặt của các chất trong mỗi phân đoạn chiết.

Trong cao petroleum ether hoặc cao hexane, cao diethyl ether: có thể cócác hydrocar bon béo và thơm (như triglyceride, alkane mạch carbon dài, alcol béo, ester béo, acid béo,…), các thành phần của tinh dầu (monoterpene,sesquiterpene, một vài diterpene bay hơi được), các sterol thực vật(phytosterols), các chất màu thực vật như carotene,…

Trong cao chloroform hoặc cao ethyl acetate: có thể có cácsesquiterpene, diterpene, coumarin, quinone, các aglycone do hợp chấtglycoside bị thủy giải, các monoglycoside (chỉ mang một phân tử đường), mộtsố alkaloid loại base yếu.

Trong cao methanol hoặc cao nước: có thể có các chất màu thực vật nhưchlorophyl, các glycoside (saponin), các alkaloidở dạng muối tứ cấp, kết hợpvới các acid hữu cơ, các muối amine, các tanin, các hydrate carbon có trọnglượng phân tử nhỏ như monosaccharide, oligosaccharide, các protein thực vật,các muối vô cơ, một số polysaccharide như: pectin, chất nhầy, chất gôm,…

2.3.2 Một số kỹ thuật chiết tách hợ p chất ra khỏi câyCó nhiều cách để chiết tách hợp chất hữu cơ ra khỏi cây cỏ. Cáckỹ thuật

đều xoay quanh hai phương pháp chính là chiết lỏng-lỏng và chiết rắn-lỏng. Trong thực nghiệm, việc chiết rắn-lỏng được áp dụng nhiều hơn gồm sự

ngấm kiệt, sự ngâm dầm, sự trích với máy chiết Soxhlet,… Ngoài ra, còn cóthể chiết bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏnsiêu tới hạn (lưu chất siêu tới hạn), chiết có sự hỗ trợ của vi sóng. 2.3.2.1 Kỹ thuật chiết lỏng-lỏng

K ỹ thuật này cònđược gọi là sự chiết bằng dung môi, thường được sửdụng để chia cao alcol thô ban đầu, hoặc dung dịch ban đầu thành các phânđoạn có tính phân cực khác nhau.

Nguyên tắc: Nguyên tắc căn bản của sự chiết lỏng-lỏng là sự phân bố của mộtchất tan vào hai pha lỏng và hai pha lỏng này không hòa tan vào nhau. Khảnăng hòa tan của một chất tan đối với hai pha lỏng tại thời điểm cân bằngđược biểu diễn bằng hằng số phân bố K. Nói đơn giản, dung môi không phân





16

cực (ví dụ như: hexane, petroleum ether,…) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tínhkém phân cực (như alcol béo, ester béo,…), các dung môi có tính phân cựctrung bình (như diethyl ether, chloroform,…) sẽ hòa tan tốt các chất có tính phân cực trung bình (như các hợp chất có chứa nhóm chức như ether –O–,aldehyde –CH=O, ketone >CO, ester –COO–…) và dung môi phân cực mạnh(ví dụ như methanol, ethanol,…) sẽ hòa tan tốt các hợp chất có tính phân cựcmạnh (các hợp chất chứa nhóm chức alcol –OH, acid –COOH…).

Việc chiết lỏng – lỏng được thực hiện bằng bình lóngở nhiệt độ phòng,trong đó cao alcol thô ban đầu được hòa tan vào pha nước. Việc chiết sẽ đượcthực hiện lần lượt từ dung môi hữu cơ kém phân cực đến dung môi hữu cơ phân cực. Với mỗi loại dung môi, việc chiết được thực hiện nhiều lần, mỗi lầmột lượng nhỏ thể tích dung môi, chiết đến khi không còn chất hòa tan vàodung môi thìđổi sang dung môi phân cực hơn. Dung dịch thu được sau các lầnchiết sẽ được gom chung lại, làm khan nước bằng các chất làm khan như Na2SO4, MgSO4, CaSO4,… đuổi dung môi thu được cao chiết.

Có thể theo dõi quá trình chiết cũng như kiểm tra các chất nào đã đượcchiết vào pha hữu cơ, còn lại chất nào trong pha nước bằng phương pháp sắcký lớp mỏng. Sự chiết với một loại dung môi hữu cơ nào đó được coi là hoàntất khi kiểm tra dịch chiết lần thứ n, tr ên lớp mỏng không còn thấy vết của chấttrong pha nước cũng như trong pha hữu cơ. Một cách khác để kiểm tra sựchiết là nhỏ dịch chiết thứ n lên một tấm kính sạch, sau đó làm bay hết dungmôi, quan sát nếu thấy không cònđể lại vết gì trên mặt kính chứng tỏ sự chiết

đã hoàn tất. Cần lưuý r ằng sự chiết lỏng-lỏng được thực hiện ở nhiệt độ phòng, nếu gia tăng nhiệt độ cho dung môi thì khả năng hòa tan của dung môisẽ tăng lên và nguyên tắc nêu trên sẽ có nhiều thay đổi

2.3.2.2 Kỹ thuật chiết rắn – lỏng

a. Kỹ thuật chiết ngấm kiệt

Phương pháp này được sử dụng khá phổ biến vì khôngđòi hỏi thiết bị tốnkém, phức tạp.

Dụng cụ: gồm một bình ngấm kiệt bằng thủy tinh, hình tr ụ đứng, dướiđáy bình là một van khóa để điều chỉnh vận tốc của dung dịch chảy ra, một bình chứa đặt bên dưới để hứng dung dịch chiết. Phía tr ên cao của bình ngấmkiệt là bình lóngđể dung môi tinh khiết.

Phương pháp thực hiện: bột cây được xây thô, lọt được qua lỗ rây 3mm. Đáy của bình ngấmkiệt được lót bằng bông thủy tinh và một tờ giấy lọc.Bột cây được đặt vào bình, lên trên lớp bông thủy tinh, lên gần đầy bình. Đậy





17

bề mặt lớp bông bằng một tờ giấy lọc và chặn lên trên bằng những viên bithủy tinh để cho dung môi không làm xáo tr ộn bề mặt lớp bột. Từ từ rót dungmôi cần chiết vào bình chođến khi dung môi phủ xấp xấp phía tr ên lớp mặt,có thể sử dụng dung môi nóng hoặc nguội. Để yên sau một thời gian, thườnglà 12-24 giờ. Mở van bình ngấm kiệt cho dung dịch chiết chảy ra từng giọtnhanh và đồng thời mở khóa bình lóngđể dung môi tinh khiết chảy xuống bình ngấm kiệt. Điều chỉnh sao cho vận tốc dung môi tinh khiết chảy vào bìnhngấm kiệt bằng với vận tốc dung dịch chiết chảy ra khỏi bình.

Kiểm tra việc chiết kiệt mẫu bột cây bằng sắc ký lớp mỏng hoặc nhỏ mộtgiọt dịch chiết lên tấm kiếng sạch, để bốc hơi và xem có còn để lại vết gì trênmặt kiếng hay không, nếu không còn vết gì làđã chiết kiệt.

Hiệu quả phương pháp: So sánh với phương pháp ngâm dầm, phương pháp này đòi hỏi thiết bị phức tạp hơn một chút nhưng hiệu quả lại cao hơn và

ít mất công hơn vì đây là quá tr ình chiết liên tục dung môi trong bình ngấmkiệt đã bão hòa mẫu chất sẽ được liên tục thay thế bằng dung môi tinh khiết.

b. Kỹ thuật chiết ngâm dầm.

K ỹ thuật chiết ngâm dầm cũng tương tự như kỹ thuật chiết ngấm kiệtnhưng không đòi hỏi thiết bị phức tạp, vì thế có thể dễ dàng thao tác với mộtlượng lớn mẫu cây.

Dụng cụ: bình chứa bằng thủy tinh hoặc thép không gỉ, hình tr ụ đứng, cónắp đậy. Tránh sử dụng bình bằng nhựa vì dung môi hữu cơcó thể hòa tan một

ít nhựa gây nhầm lẫn là hợ p chất đó có chứa trong cây.Phương pháp thực hiện: bột cây được đặt vào bình, rót dung môi tinh

khiết vào bình chođến xấp xấp bề mặt của lớp bột cây. Giữ yên ở nhiệt độ phòng trong một đêm hoặc một ngày để cho dung môi xuyên thấm vào cấutrúc của tế bào thực vật và hòa tan các hợp chất tự nhiên. Sau đó, dung dịchchiết được lọc ngang qua một tờ giấy lọc, cô quay thu hồi dung môi sẽ cóđược cao chiết. Tiếp theo, rót dung môi mớivào bình chứa bột cây và tiếp tụcquá trình chiết thêm một số lần nữa cho đến khi chiết kiệt mẫu cây. Có thể giatăng hiệu quả sự chiết bằng cách thỉnh thoảng đảo trộn, xóc đều lớp bột câhoặc có thể gắn vào máy lắc để lắc nhẹ (chú ý nắp bình bị bung ra làm dungdịch chiết bị tr ào ra ngoài). Mỗi lần ngâm dung môi, chỉ cần 24 giờ là đủ vìvới một lượng dung môi cố định trong bình, mẫu chất chỉ hòa tan vào dungmôi đến đạt mức bão hòa, không thể thêm được nhiều hơn nên có ngâm lâucũng chỉ làm mất thời gian. Dung môi sau khi thu hồi được làm khan nước bằng các chất làm khan và được tiếp tục sử dụng để chiết các lần sau.





18

Trong thực nghiệm, việc chiết rắn-lỏng được áp dụng nhiều, gồm sựngấm kiệt, sự ngâm dầm, sự trích với máy chiết Soxhlet,…Ngoài ra, còn có sựchiết với phương pháp lôi cuốn hơi nước, phương pháp sử dụng chất lỏng siêutới hạn.

2.3.2.3 Một số thủ thuật khi cô lập các hợp chất hữu cơ a. Làm khô mẫu chất

Sau khi chiết mẫu cây bằng dung môi, lọc, thu hồi dung môi có đượccao. Cao chiết này cần được làm khô vì các lý do sau: Các hợp chất trong cao sẽ ổn định bền nếu chúng hiện diện ở trạng thái khô

hơn ở trạng thái lỏng. Để tính đúng hiệu suất của cao chiết so với lượng cây thô ban đầu. Để tiếp tục tinh chế cao bằng sắc ký cột: biết lượng cao để lấy lượng sili

gel cần thiết cho sắc ký cột. Nếu mẫu là hợp chất tinh khiết muốn đo các số liệu phổ thì mẫu cần được

sấy khô, nếu còn lẫn vết nước, tr ên phổ đồ xuất hiện tính hiệu của nướcgây khó khăn trong việc giải đoán cấu trúc.

Các phương pháp làm khô mẫu:

Sấy khô bằng khí trơ trong máy cô quay chân không: khi cô quay chânkhông đến lúc mẫu đã khô hoàn toàn, cho một luồng khí trơ đi vào máy, đi nhènhẹ từ đầu tr ên của máy cô quay (tại đầu tr ên của máy, chỗ đóng-mở áp suấtđể tạo chân không cho máy, có một ống để châm dung dịch vào bình cô quaymà không cần tắt ngưng máy; cho khí vào bằng ngõ này).

Sấy khô bằng bình hútẩm: mẫu cần làm khô được đặt trong một becher,miệng của becher được đậy bằng một tờ giấy lọc, tr ên bề mặt tờ giấy lọc tạomột số lỗnhỏ. Đặt becher vào bình hútẩm, đậy nắp bình lại. Cho máy bơmhút hoạt động cho đến khi thấy mẫu chất khô thì ngừng máy.

b. Sự kết tinh lại

Trong hóa học các hợp chất thiên nhiên, một mẫu chất được gọi là tinhkhiết để xác định cấu trúc hóa học thì độ tinh khiết của hợp chất cần phải lớnhơn 95%. Hợp chất càng tinh khiết thì việc xác định cấu trúc càng chính xác.

Để đạt được hợp chất có độ tinh khiết càng cao, công việc thực hiện càngkhó khăn, phức tạp. Trước tiên, khởi đầu từ cao chiết thô để loại bỏ nhữngchất không cần thiết; kế đến, từ những phân đoạn nhỏ, muốn cô lập hợp ch





19

có độ tinh khiết 95% đã phải tốn công sắc ký nhiều lần và nâng cao độ tinhkhiết từ 95 lên 99,5% là r ất khó. Không có hợp chất nào tinh khiết 100%.

Các hợp chất cô lập được sau quá trình sắc ký cột, khi quan sát bằng mắtthường ta thấy chúng ở dạng bột trắng, đôi khi là tinh thể không màu, khi sắc

ký lớp mỏng với nhiều hệ dung môi khác nhau vẫn cho một vết tr òn gọn đẹpnhưng thực ra độ tinh khiết của chúng cũng chỉ từ 90-95% mà thôi. Sở dĩ nhưthế là vì một tinh thể của một hợp chất nếu quan sát được bằng mắt thường làgồm nhiều phân tử của các hợp chất đó kết hợp lại với nhau, chúng cũng gomluôn một ít tạp bẩn từ môi trường bên ngoài và lượng này khá ít nên không thểnhìn thấy được.Với độ tinh khiết từ 90-95%, việc xác định cấu trúc bằng các phương pháp hóa lý sẽ kém hiệu quả. Do vậy, việc kết tinh lại hợp chất là r ấtcần thiết.

c. Phương pháp kết tinh phân đoạn

Trong một vài trường hợp đặc biệt, người ta có thể tách riêng một hợpchất ra khỏi hỗn hợp là nhờ vào độ tan khác nhau trong một dung môi nào đó,kĩ thuật này được gọi là k ết tinh phân đoạn.

Thí dụ có một hỗn hợp gồm ba hợp chất A, B và C. Giả sử có thể tìmmột dung môi hòa tan vô hạn B và Cở bất k ì nhiệt độ nào và chỉ hòa tan A bình thường. Thực hành bằng cho hỗn hợp vào dung môi nóng, lọc nóng quatờ giấy lọc. Để yên cho dung môi nguội từ từ, hợp chất A sẽ kết tinh lại thànhchất rắn (dĩ nhiên là có k ết tinh lẫn theo nó một ít B và C), trong khi đó lượnglớn B và C vẫn còn lại ở trong dung dịch. Lọc để lấy riêng tinh thể A. Thựchành việc kết tinh như thế thêm vài lần nữa bằng dung môi tinh khiết sẽ cótinh thể A tinh khiết.

Thực hiện như thế có nhược điểm là hao hụt sản phẩm chính, có thể khắc phục bằng cách nhập hai lần dung dịch nước cái của lần kết tinh một và hai, côquay để thu hồi hợp chất và thực hiện kết tinh lại.

2.3.3 Sắc ký lớp mỏng và định tính sự hiện diện của một số hợp chất hữucơ

2.3.3.1 Cơ sở lýthuyếta. Sắc ký lớ p mỏng

Sắc ký lớp mỏng ((SKLM) (Thin Layer Chromatography (TLC)) hay còngọi là sắc ký phẳng (planar chromatography), dựa chủ yếu vào hiện tượng hấpthu, trong đó pha động là một dung môi hay một hỗn hợp dung môi, di chuyểnqua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ. Thí dụ: Silicagel hay Aluminium





20

oxide. Pha t ĩnh này được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc plastic. Do chất hấp thu được trángthành một lớp mỏng nên phương pháp này gọi là sắc ký lớp mỏng.

Người ta cho mẫu cần phân tích hòa tan vào một dung môi dễ bay hơi,

dùng vi quản để chấm một ít dung dịch mẫu chất này, thành một vết nhỏ gọntrên tấm lớp mỏng. Sấy nhẹ để đuổi phần dung môi hòa tan mẫu, như vậy,mẫu chất chỉ còn ở dạng bột khô tr ên tấm lớp mỏng. Đặt tấm lớp mỏng nàytheo chiều thẳng đứng trong một bình có chứa sẵn dung môi thích hợp. Dungmôi sẽ bị lực mao quản hút di chuyển lên cao trong tấm lớp mỏng, mẫu chất sẽ bị phân chia thành những vết riêng biệt. Các vết sẽ được xác định bằng phương pháp vật lý (nhìn tr ực tiếp bằng mắt, soi dưới đèn UV,…) hoặc bằngnhững phương pháp hóa học (phun lên tấm lớp mỏng các loại dung dịch thuốchiện hình).

Một chất tinh khiết sẽ cho một vết tr òn, có giá tr ị Rf không đổi trong một hệdung môi xác dịnh. Trị số R f được tính như sau:

Giá trịR f đượ c tính theo công thức: f

a R

b; trong đó:

a: khoảng cách từ vạch xuất phátđến trung tâm chất. b: khoảng cách từ vạch xuất phátđến vạch dung môi.

Hình 2.5 Cách tínhgiá trịR f





21

b. Chất hấp phụ dùng trong sắc ký lớp mỏng

Trong SKLM thường dùng các loại chất hấp phụ như silica gel, Al2O3,kieselguhr, cellulose, …Ngoài ra, người ta còn tr ộn thêm chất kết dính hoặcchất chỉ thị huỳnh quang. Chất kết dính giúp cho chất hấp phụ bám tốt vào tấm

kính hoặc tấm plastic, làm cho lớp mỏng bền, không bị trầy xước. c. Dung môi khai triển

Dung môi khai triển trong SKLM thường là một hỗn hợp có 2, 3 hoặc 4loại dung môi khác nhau với tỷ lệ thích hợp.

Nên chọn dung môi có độ tinh khiết cao, có thể hòa tan được mẫu phântích. Một mẫu chất cần phân tích có thể chứa nhiều cấu tử khác nhau. Khảnăng tách riêng các hợp chất này bằng SKLM tùy thuộc vào sự tươngtác củacác hợp chất này vớ i chất hấp phụ và dung môi khai triển. Muốn thay đổi khả

năng tách, người ta thay đổi thành phần các dung môi hoặc thay đổi tỉ lệ giữacác thành phần đó.

Với mẫu sắc ký mà chưa biết thành phần hợp chất, chưa có tài liệu thamkhảo thì phải làm một loạt thử nghiệm với các loại dung môi khác nhau, quansát các vết. Một hệ dung môi khai triển phù hợp khi các vết có R f rõ, cách xavà trong giới hạn từ 0,3 đến 0,7; nếu R f quá thấp thì dung môi chưa đủ phâncực, nếu cao quá thì dung môiđã quá phân cực.

d. Các kỹ thuật sắc ký lớp mỏng

K ỹ thu ật sắc ký lớp mỏng một chiều: bảng mỏng được khai triển mộtlần hoặc nhiều lần tr ên cùng một hướng với một hay vài hệ dung môi. Muốnkhai triển nhiều lần thì nên dùng bảng hấp phụ có trộn chất huỳnh quang. Saukhi khai triển lần thứ nhất, quan sát lớp mỏng dưới đèn UV (không phun thuốcthử hiện màu), để bay hơi hết dung môi rồi tiến hành khai triển lần thứ hai, ba,…cho đến khi đạt giá trị R f theo yêu cầu.

Lưuý các vết chấm tr ên lớp mỏng không được ngập vào dung môi trong bình triển khai vì mẫu chất sẽ bị khuếch tán ngay lập tức ra dung môi làm chocác vết bị lem. Khi soi dưới đèn UV một số chất tinh khiết sẽ bị biến thành

chất khác, do đó ở lần khai triển tiếp theo có thể xuất hiện vài vết lạ (như mộtsố courmarin, xanthon). Đôi khi, do nhiều nguyên nhân khách quan lẫn chủ quan nên khi SKLM

sẽ gặ p một số hiện tượng ngoại ý. Khi đó, cần tìm hiểu và xác định guyênnhân để có hướng khắc phục.





22

Kỹ thu ật sắc ký lớp mỏng hai chiều: Trong trường hợp chất phân tích cónhiều cấu tử nên k ĩ thật SKLM một chiều không đủ độ tin cậy thì cần thựchiện thêm SKLM hai chiều để kết quả tách được r õ ràng hơn.

Thực hiện khai triển hai chiều (thẳng góc với nhau) với hai hệ dung môi

khác nhau. Dùng loại lớp mỏng có trộn chất huỳnh quang loại 10×10 hoặc12×12 hoặc 15×15 cm, chấm chất phân tích ở góc lớp mỏng cho vào bình sắcký chạy hệ dung môi thứ nhất, quay một góc 90º, sau đó chạy hệ dung môi thứhai.

Kỹ thu ật SKLM điều chế : SKLM điều chế còn được gọi là kĩ thuật sắcký chế hóa, thường dùng để tách các chất với lượng nhỏ và có R f cách xanhau.

Dùngkĩ thuật SKLM một chiều, lớp mỏng có kích thước 20×20 cm, độdày chất hấp phụ từ 0,5 – 1 mm. Hỗn hợp cần tách được chấm lên lớp mỏngthành một đường liên tục. Sau đó nhúng lớp vào dung dịch khai triển thíchhợp. Trường hợp các chất trong hỗn hợp phân tích rất gần nhau cóthể tiếnhành làm lại nhiều lần, trước mỗi lần chạy lại phải sấy khô lớp mỏng.

Phát hiện các vết bằng soi dưới đèn tử ngoại hoặc phun thuốc thử hiệnhìnhở một mép lớp mỏng (thuốc hiện hình khôngđược phun lên hết lớp mỏngvì sẽ phá vỡ cấu trúc của hợp chất để tạo phản ứng màu).

Đánh dấu vùng muốn tách mẫu, cạo riêng từng vùng.

Dùng dung môi thích hợp (có thể dùng dung môi khai triển) để lấy riêngmẫu chất trong chất hấp phụ, quá tr ình này gọi là phản hấp phụ.

Để làm các băng trong SKLM điều chế nét hơn, gọn hơn người ta thườngdung một dung môi phân cực mạnh (ví dụ như CH3OH đối với lớp mỏng phathường) khai triển một đoạn chừng 1 cm. Sau đó lấy bảng ra, để cho bay hếdung môi r ồi mới khai triển thực sự bằng hệ dung môi đã chọn.

Lưuý: Do CH3OH có khả năng hòa tan một lượng ít silica gel nên dịchCH3OH phản hấp phụ có thể lẫn một ít silica gel dưới dạng bột trắng. Khi đó phải chiết dịch CH3OH phản hấp phụ với một dung môi khác có khả năng hòa

tan chất cần tách nhưng không hòa tanđược silica gel, tiếp tục làm bay hơidung môi để thu chất tinh khiết.





23

2.3.3.2 Hiện hình các vết sau giải ly

Sau khi giải ly, các hợp chất có màu sẽ được nhìn bằng mắt thường,nhưng phần lớn các chất hữu cơ không có màu nên muốn nhìn thấy các vếtcần sử dụng các phương pháp hóa học hoặc vật lý.

Phương pháp vật lý: Có nhiều phương pháp khác nhau nhưng phương pháp thông dụng nhất là phát hiện bằng tia tử ngoại (UV)

Đèn chiếu UV 254 nm: Ánh sáng này để nhận ra những hợp chất có thểhấp thu tia UV. Đèn chiếu UV 365 nm: Ánh sáng này dùng để phát hiện những hợpchất có phát huỳnh quang.

M ột số điểm cần lưu ý:

Có thể thay thế dụng cụ nêu trên bằng máy kiểm tra tiền, nhưng sử dụngcần cẩn thận vì máy này không có thùng che chắn tia UV giống như dụngcụ nói trên, nhưng biết rằng tia UV có thể gây đột biến gene. Bản mỏng với chất hấp thu có trộn thêm chất chỉ thị phát huỳnh quang cóthể gây nên sự thay đổi vị trí của các vết tr ên bản: vết ở đúng vị trí nàynhưng lại nhìn thấy vết ở vị trí khác, điều này gây nên những nhầm lẫntai hại.

Phương pháp hóa học: Phương pháp hóa học là phương pháp phát hiệncác vết bằng thuốc thử, bằng cách hòa thuốc thử vào một dung môi thích hợp

r ồi phun xịt dung dịch thuốc thử này lên bản mỏng. Thuốc thử sẽ kết hợp vớicác hợp chất để tạo ra các dẫn xuất có màu. Các thuốc thử được xếp thành 2loại: đặc trưng và không đặc trưng.

Thuốc thử không đặc trưng khi nó tạo vết màu hầu hết với tất cả các loạihợp chất hữu cơ, ví dụ như: Iodine, sulfuric acid, rhodamine B, chất chỉ thị phát huỳnh quang.

Thuốc thử đặc trưng khi nó chỉ tác dụng với những hợp chất có chứanhóm chức hóa học đặc biệt, tạo vết có màu đặc trưng. Ví dụ: Thuốc thử

dinitrophenylhydrazine tác dụng với những hợp chất có chứa nhóm carbonylđể tạo màu đỏ đậm.





24

Bảng 2.1 Một vài thuốc thửhiện hình SKLM.

Thuốc thử Màucủa vết Hợ p chất

Hơi Iodine Vàng hoặc nâu Hợ p chất hữu cơnói chungHợ p chất bất bão hòa.

2,7-Fluorescein Lục – vàng Đa số các hợ p chất hữu cơ Nihydrine Tím – hồng Amino acid, amine

2,4-Dinitrophenylhydrazine

Đỏ- cam Aldehyde, ketone

Clorur antimony Màu đặc trưng Steroid, hợ p chất chi hoànVitamin, carotenoid

Bromophenol blue

Bromocresol green

Vàng Acid carboxylic

Diphenylcarbazid Màu đặc trưng KimloạiVanilin/H2SO4 Màu đặc trưng Alcohol, aldehyde, ketone,

phenol

H2SO4 / MeOH Màu đặc trưng Hợ p chất hữu cơnói chungKMnO4/ NaOH Vàng Hợ p chất không bão hòa

và alcohol

2.3.3.3Ứng sụng của SKLM

Đối với SKLM điều chế: có thể phân lập được đơn chất tinh khiết vớikhối lượng đủ để khảo sát điểm chảy, các loại phổ và làm chất chuẩn.

Đối với SKLM phân tích: Kĩ thuật SKLM hiện nay vẫn là công cụ rấtđắc lực trong ngành hóa hữu cơ, đặc biệt trong hóa học hợp chất thiên nhiênnhư:

Cho biết đặc điểm của hợp chất cần ly trích, cô lập được (một chất tinhkhiết sẽ có Rf không đổi trong hệ dung môi xác định).

Có thể tiên đoán sơ bộ là trong hỗn hợp chiết xuất ban đầu có chứa baonhiêu hợp chất và tính phân cực của hỗn hợp mẫu chiết.

Để định hướng loại dung môi thích hợp cho sắc ký cột. Trước khi dùngsắc ký cột để tách một lượng lớn mẫu chất, các nhà nghiên cứu thườnghay sử dụng SKLM để thăm dò tìm hệ dung môi thích hợp cho quá trình sắc ký cột.





25

SKLM là công cụ rất đắc lực để theo dõi quá trình sắc ký cột, để nhậnđịnh các phân đoạn thu được từ sắc ký cột. Việc quan sát các vết tr ênlớp mỏng rất quan trọng để có thể nhận định rằng phân đoạn đó là hỗnhợp hay tinh khiết hoặc để gộp các phân đoạn có cùng Rf với nhau.

Để theo dõi diễn tiến của một phản ứng.

2.3.4Phươngpháp sắc ký cột. 2.3.4.1 Cơ sở lýthuyết.

Trong phân tích hóa thực vật có rất nhiều phương pháp phân tích. Sắc kýcột (SKC) là một trong những phương pháp quan tr ọng, được ứng dụng rộngrãi trong việc phân lập các hợp chất thiên nhiên.

SKC là loại sắc ký trong đó pha tĩnh được nhồi trong một cột bằng thủy

tinh hay bằng thép không gỉ. Pha tĩnh (chất hấp phụ) thường được sử dụng làsilica gel. Pha động là các dung môi hữu cơ với nhiều tỷ lệ khác nhau, tìm hệdung môi dựa vào SKLM. Pha động di chuyển qua lớp chất hấp phụ dưới ảnhhưởng của trọng lực. Đối với mỗi chất riêng biệt trong hỗn hợp cần tách tùytheo ái lực với pha tĩnh và pha động để lấy ra được trước hoặc sau.

Hình 2.6 Cột sắc ký

Các chất hấp thu thường dùng: nhôm oxit, silica gel, polyamide,CaCO3,… Chất hấp thu thường được sử dụng là silica gel, pha động là cácdung môi hữu cơ với nhiều tỷ lệ khác nhau, tìm hệ dung môi dựa vào sắc kýlớp mỏng. Thông thường người ta nạp silica gel vào cột dưới dạng sệt (nạpướt) do silica gel có khả năng trương nở khi bị solvat hóa.





26

Có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng táchcác chất, bao gồm: o Sự lựa chọn chất hấp phụ.o Sự lựa chọn dung môi giải ly.o Kích thướ c cột sắc ký, lượ ng chất hấp phụ, lượ ng mẫu đượ c nạ p lên cột.o Vận tốc giải ly

Cách tiến hành SKC gồm 5 bước: Chuẩn bị cột Nhồi cột (cho chất hấp phụ vào cột). Đưa chất phân tích vào cột. Triển khai cột. Hứng và kiểm tra các phân đoạn.

2.3.4.2 Kích thước cột và lượng chất hấp thu Kích thước cột sắc ký và lượng chất hấp thu cần được lựa chọn thích hợ p

để có thể tách tốt các mẫu cần sắc ký. Các khảo sát thực nghiệm cho thấmuốn tách chất tốt thì khối lượng chất hấp thu phải lớn hơn 25-50 lần khốilượng mẫu chất cần sắc ký. Tuy nhiên, với những hỗn hợp các hợp chất khótách riêng thì cần số lượng chất hấp thu nhiều hơn (lớn hơn 100-200 lần), cònvới các hỗn hợp dễ tách thì có thể sử dụng lượng chất hấp thu ít hơn. Ngoài ra,chiều cao của lượng chấthấp thu cần đạt tỉ lệ giữa chiều cao chất hấp thuvàđường kính trong của cột vào khoảng 10:1.

2.3.4.3 Chuẩn bị cột

Yêu cầu của cột sắc ký là chất rắn trong cột phải phân tán đồng đều ởmỗi điểm trong cột thành một khối đồng nhất.

Chuẩn bịcột:o R ửa cột thật sạch, tráng vớ i acetone vài lần và sấy khô.o K ẹp cột thẳng đứng tr ên giá sắt. o Cho bông gòn vàođáy cột.

2.3.4.4 Lự a chọn dung môigiải ly cột

Các hệ dung môi dùng cho sắc ký lớp mỏng đều có thể ứng dụng vào sắcký cột. Tuy vậy, đối với các dung môi có độ sôi quá thấp hoặc có mùi khóchịu hoặc độc thì không nên dùng làm dung môi giải ly cột. Trước khi triểnkhai sắc ký cột, nhất thiết phải sử dụng sắc ký lớp mỏng để dò tìm hệ dungmôi giải ly cho phù hợp. Sau khi đã chọn được thì có thể áp dụng hệ dung môi





27

này cho sắc ký cột. Cần phải chỉnh tỉ lệ dung môi sao cho có tính kém phâncực một ít so với hệ dung môi đã chọn. Thông thường nên bắt đầu bằng mộtdung môi không phân cực để loại một cách tương đối các hợp chất không phâncực ra khỏicột và k ế đó dung môi giải ly sẽ được tăng dần độ phân cực đểđuổi các hợp chất có tính phân cực hơn. Muốn thay đổi một dung môi có tính phân cực hơn, thì phải thay đổi bằng cách cho thêm vào mỗi lần vài phần trămmột lượng dung môi có tính phân cực hơn vào dung môi đang giải ly. Thí dụđang giải ly với ether dầu hỏa, sau đó muốn đổi sang ethyl acetate thì phảithêm từ từ tỉ lệ ether dầu hỏa: ethyl acetate lần lượt (99:1); (98:2); ( 95:5);(90:10); (70:30); (50:50); (10:90); (0:100). Nếu cho thêm vào đột ngột thì sẽlàm gãy cột do silica gel được trộn với dung môi sẽ tạo ra nhiệt, nhiệt này làmcho dung môi bốc hơi một cách cục bộ, hơi sinh ra sẽ tạo bọt khí và làm nứt,gãy cột, cột gãy sẽ làm khả năng tách của cột kém đi. Thông thường, hợp chấtkhông phân cực di chuyển nhanh và được giải ly ra khỏi cột trước còn các hợpchất phân cực sẽ di chuyển chậm hơn (khối lượng phân tử cũng liên quan đếnthứ tự giải ly, một hợp chất không phân cực và có khối lượng phân tử lớn sẽ dichuyển chậm hơn một hợp chất không phân cực và có khối lượng phân tử nhỏhơn).

2.3.4.5 Nạp chất hấp thu vào cột.

Nạp chất hấp thu dạng sệt vào cột

Dùng k ẹp để giữ cho cột thẳng đứng tr ên giá. Nếu phần đầu ra của cộtkhông có miếng thủy tinh xốp để chặn thì nhồi vào một lớp bông gòn để thaythế. Chất hấp thu được nạp vào cột ở dạng sệt được chuẩn bị như sau: Trong một becher đã chứa sẵn dung môi (loại bắt đầu cho quá tr ình giải ly

cột), cho chất hấp thu vào becher, đều đặn, mỗi lần một lượng nhỏ, vừa róvừa khuấy nhẹ đều. Lượng dung môisử dụng phải vừa đủ để hỗn hợpkhông được quá sệt khiến cho bọt khí sẽ bị bắt giữ trong cột và cũng khôngđược quá lỏng.

Nhờ một phễu lọc có đuôi dài đặt trên đầu cột, rót hỗn hợp sệt vào cột, vừamở nhẹ khóa ở bên dưới cột để cho dung môi chảy ra, hứng vào một

becher sạch ở bên dưới cột, dung môi này được rót trả lại lên đầu cột. Tiếp tục rót chất sệt vào cột cho đến khi hết số lượng, vừa rót vừa dùng

một thanh cao sugõ nhẹ vào bên ngoài thành cột để chất hấp thu nén đềutrong cột.





28

Sau khi nạp xong, chodung môi chảy ra và rót tr ở lại đầu cột vài ba lần đểcột được nạp chặt hơn, cho đến khi thấy chất hấp thu trong cột có dạngđồng nhất.

Trong quá trình nạp cột, dung môi vẫn liên tục chảy nhẹ đều ra khỏi cột,

luôn luôn phải có dung môi phủ tr ên phần đầu cột. Sau khi nạp xong, mặt thoáng chất hấp thu ở đầu cột phải nằm ngang.

Nếu mặt thoáng không nằm ngang phải cho dung môi thêm cao lên trên phần đầu cột, dùng đũa thủy tinh khuấy nhẹ phần dung môi sát mặt thoánglàm xáo một phần chất hấp thu ở trên đầu cột, để yên, chất hấp thu lắng xuốngtừ từ tạo nên một mặt thoáng bằng phẳng.

Nạp chất hấp thu dạng khô vào cột

Cho dung môi loại kém phân cực nhất có thể vào khoảng hai phần ba

chiều cao cột, sau đó cho từ từ bột hấp thu vào cột, dùng thanh cao su gõ nhẹvào bên ngoài thành cột theo chiều từ dưới lên để bột xuống được đều đặn.

Khi lớp chất hấp thu đạt chiều cao khoảng 2 cm thì mở nhẹ khóa chodung môi chảy ra, hứng vào một becher trống để bên dưới cột, dung môi nàyđược sử dụng lại để rót trả lại tr ên đầu cột. Tiếp tục cho bột hấp phụ vào đếnkhi cột đạt được chiều cao nhất định.Tiếp đến, rót dung môi vào cột và chochảy liên tục một thời gian để ổn định cột. Từ lúc này tr ở đi không được đểkhô dung môiở đầu cột.

2.3.4.6 Kỹ thuật nạp mẫu vào đầu cột

Có hai cách để nạp mẫu chất cần tách lên đầu cột: nạp mẫu chất dạndung dịch và nạp mẫu chất dạng bột khô.

a. Nạp mẫu chất ở dạng dung dịch: để nạp mẫu vào cột, phải theo tiếntrình sauđây: mở khóa cột để hạ mực dung môi xuống bằng sát với mực chất hấp phụ đang có trong cột, khóa cột lại, dùng một ống nhỏ giọt để hút dungdịch mẫu cho vào đầu cột thật chậm. Từ từ mở khóa cột để cho dung dịchmẫu thấm xuống bề mặt chất hấp phụ trên đầu cột, lúc thấy mức dung dịch đãxuống sát mực chất hấp phụthì khóa cột lại, dung dịch không chạyra nữa;

tiếp tục nạp cho hết lượ ng mẫu chất vào đầu cột. Mở khóa để hạ mực dung dịch mẫu xuống sát mặt thoáng chất hấp phụ,

khóa lại, dùngống nhỏ giọt cho một lượ ng nhỏ 5-10 mL dung môi bắt đầu rửagiải vào đầu cột lại mở khóa để dung dịch chảy ra.





29

b. Nạp mẫu ở dạng bột khô: nếu chất mẫu không tan trong loại dungmôi lựa chọn để bắt đầu quá tr ình giải ly cột, vì đây là loại dung môi kém phâncực, thay vì phải hòa tan mẫu trongdung môi phân cực có thể ảnh hưởng vàoquá trình giải ly, có thể nạp mẫu “khô”.

Trong một bình cầu dùng để cô quay, mẫu chất cần sắc ký (x g) được hòatan trong dung môi như ethyl acetate hoặc methanol (50x g), cho thêm vàosilica gel cỡ hạt lớn (10x g). Hỗn hợp này được cô quay chân không đến khicó bột silica gel khô, bấy giờ, mẫu cần sắc ký đã được tẩm lên bề mặt củanhững hạt silica gel.

Đặt mẫu bột khô này lên đầu cột, dùng một ít dung môi (loại lựa chọn để bắt đầu quá tr ình sắc ký cột), thấm ướt một phần bột silica gel. Cho một lớ pcát dày khoảng 3-6 mm đặt nhẹ lên trên mặt thoáng của chất hấp thu để bảo vệmặt cột. Cuối cùng cho dung môi vào đầy cột để bắt đầu quá tr ình giải ly.

2.3.4.7 Theo dõi quá trìnhgiải ly cộtĐối với các mẫu nguyên liệu ban đầu có màu, ta có thể theodõi quá trình

giải ly bằng mắt thường, nhờ nhìn thấy các dãy lớp có màu sắc ký khác nhau,đang tách xa nhau ra. Theo dõi các dãy màu và hứng chúng khi được giải ly rakhỏi cột. Nhưng đa số các hợp chất hữu cơ thường không có màu, nên dungdịch giải ly cũng trong suốt không màu; do đó ta phải theo dõi bằng nhữngcách khác nhau.

Phương pháp thông dụng nhất là hứng dung dịch giải ly trong những lọ

có đánh số thứ tự. Hứng mỗi lọ một thể tích như nhau. Nên pha một lượ ng lớndung môi giải ly để hạn chế sai lệch nồng độ trong mỗi lọ.

Dung dịch trong những lọ hứng sẽ đượ c SKLM trên cùng một bản mỏng. Những lọ nào có k ết quả SKLM giống nhau(giống nhau nhưng có thể chứanhiều hợp chất, vì hỗn hợp) sẽ đượ c gom chung lại với nhau thành một phânđoạn. Đuổi dung môiở áp suất kém các phân đoạn này sẽ cho cao của phânđoạn đó.

2.3.5 Các phươngpháp khác

2.3.5.1 Sắc ký cột pha đảo

Khi tiến hành sắc ký cột tr ên những chất rất phân cực, nếu sử dụng silicagel làm chất hấp thu, khả năng các chất bị giữ lạitrên cột sẽ rất lớn, do đó, gâyhao hụt nhiều mẫu phân tích. Các chất phân cực cũng rất khó tách ra khỏi nhautrên các chất hấp thu phân cực như silica gel. Để khắc phục tình tr ạng nàyngười ta sử dụng loại silica gel pha đảo, bề mặt loại silica gel này ít phân cực,





30

do đó, không giữ chặt những chất phân cực. Có nhiều loại silica gel pha đảonhưng phổ biến nhất là C8 và C18. Sắc ký cột trên silica gel pha đảo xảy ratheo cơ chế phân bố, chất càng phân cực thì được giải ly ra khỏi cột càngnhanh.

Bên cạnh silica gel thường và silica gel pha đảo, còn có nhiều loại phat ĩnh khác như alumin, các loại silica gel chế hóa dùng cho pha thường, các loại pha t ĩnh dùng trong sắc ký lọc gel,… Tùy vào mục đích sử dụng mà lựa chọnloại pha tĩnh phù hợp.

Diaion là tên gọi chung của nhiều loại polymer được điều chế nhờ quátrìnhđồng tr ùng hợp giữa styrene và divinylbenzene do hãng Mitsubishi (NhậtBản) sản xuất. Cũng như silica gel của Merck hay sephadex của Pharmacia,Diaion cũng có nhiều loại hoạt động theo nhiều cơ chế khác nhau, thông dụngnhất là các loại Diaion hoạt động theo cơ chế phân bố kiểu pha đảo, dưới tên

chung là Diaion HP. Tùy kích thước hạt và đường kính xoang, có 4 loạiDiaion HP phổ biến là Diaion HP-10, HP-20, HP-30 và HP-40. Trong đóthông dụng nhất là Diaion HP-20. Diaion HP-20ở dạng hạt nhẹ, xốp, diệntích bề mặt khoảng 600 m2/g, đường kính xoang trung bình khoảng 0,04 mm.Diaion không tan trong nước và cũng không tan trong các dung môi hữu cơ.Diaion có thể sử dụng được ngay cả khi dung môi khai triển là acid hoặckiềm. Diaion HP-20 chủ yếu được sử dụng như là một pha tĩnh cho mục đích phânchia các cao thô ban đầu, ít khi được sử dụng cho mục đích cô lập chấttinh khiết.

2.3.5.2 Sắc ký lớ p mỏng pha đảo.Chất hấp thu cho sắc ký lớp mỏng loại này là silica gel pha đảo (C18),

pha t ĩnh này có tính chất không phân cực, hấp thu mạnh các hợp chất không phân cực. Khi giải ly bản mỏng với các loại dung môi phân cực, các chất phân cực của mẫu chất, do không bị pha tĩnh níu giữ mạnh, sẽ đượ c giải lyđi lên trên cao, còn các chất không phân cực của mẫu chất sẽ ở vị trí thấp;ngh ĩa là thứ tự các loại hợp chất phân cực và không phân cực hiện diện tr ên bản có trật tự ngược lại với bản tráng silica gel thông thường.

Pha động là hệ dung môi phâncực, thường dùng các dung môi tan trongnước, trong rất nhiều trường hợp, nước là thành phần chính của pha động.Thường dùng hỗn hợp methanol-nước, acetonitril-nước với các tỉ lệ thích hợp,có thể thêm vào các dung dịch đệm, chất điện ly,…

So với sắc ký lớp mỏng pha thường, sắc ký lớp mỏng pha đảo có một số ưu điểm như: tính chọn lọc cao, tách tốt các hợp chất, nhưng giá rất đắt. Cóthể dùng để tách hai đối phân bằng cách tẩm một số hóa chất có tính thủ tính.





31

CHƯƠNG 3

PHƯƠNGPHÁP VÀPHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨ U

3.1 Thờ i gian vàđịa điểm nghiên cứ u Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm Hóa Dượ c, Khoa Khoahọc Tự Nhiên- Tr ường đại học Cần Thơ.

Thờ i gian thực hiện: Từ tháng 8/2014 đến tháng 11/2014.

3.2 Phương tiện nghiên cứ u

3.2.1 Dụng cụ, thiết bị o Tủsấy: dùngđểsấy cácdụngcụ thủy tinh.o Máy cô quay chân không.o Bếp điện.o Cân điện tử.o Ống đong 10mL, 100mL. o Ống nhỏ giọt.o Bình lóng.o Cốc 50mL, 100mL, 250mL,…o Cột sắc ký.o Ống maoquản, hủ bi thuỷ tinh.

3.2.2 Hóa chất sử dụngBảng 3.1 Các dung môi, hóa chất đã đượ c sử dụng

Tên hóa chất Xuất xứ

Ethanol 96o Việt NamPetroleum ether 60 – 90 Việt Nam

Chloroform Việt Nam

Hexane Việt Nam

Ethyl acetate Việt Nam

Na2SO4 khan Trung QuốcBản mỏng Đức





32

Silica gel Ấn Độ, Đức

Acetone Việt Nam

Methanol Việt Nam

Vanilin và H2SO4 đậm đặc dùngđểhiện hình bản mỏng. Nướ c cất và một sốhóa chất khác.

3.3 Phươngpháp nghiên cứ u

3.3.1Phươngpháp thu mẫu và xử lýmẫu

Hình 3.1 Chuẩn bịnguyên liệu R ễ khísinh cây Gừa (Ficus microcarpa ) đượ c thu háiở huyện Châu

Thành,tỉnh Tiền Giang. Sau khiloại bỏ các phần hư, sâu; mẫu r ễ cây đượ c r ửasạch, cắt nhỏr ồi đem phơi đến khô.Sau đó xay nhuyễn thu đượ c bột nguyênliệu.

3.3.2 Xác định độ ẩm nguyên liệuCách tiến hành: Chuẩn bị 3 chén sứ sạch, đánh dấu các chén sứ, cho vào

tủ sấy ở nhiệt độ 85oC. Sau khi sấy, đặt chén sứ vào bình hútẩm, để nguội ởnhiệt độ phòng r ồi cân các chén sứ ta được khối lượng m1.

Cho vào mỗi chén sứ m gam mẫu, đem sấy ở nhiệt độ bằng 85°C. Sau 5

giờ lấy ra cân, cứ như vậy cho đến khi khối lượng chén sứ có chứa mẫu khôngthay đổi. Đặt chén sứ có chứa mẫu vào bình hútẩm, để nguội ở nhiệt độ phòngr ồi đem cân ta được khối lượng m2.

Độ ẩm của mẫu đượ c xác định theo công thức:

1 2(%) 100m m mw

m





33

Độ ẩm trung bìnhcủa mẫu:

1 2 3

(%) 3w w w

W

3.3.3Điều chế các cao thành phần Điều chế cao ethanol tổng bằng phương pháp ngâm dầm, mỗi lần ngâm

24 giờ , dịch chiết từ các lần được gom lại, cô quay thu hồi dung môi. Điều chế các cao thành phần: sử dụng phương pháp chiết lỏng-lỏng. Cao

ethanol được chiết lỏng-lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần(petroleum ether, ethyl acetate,n- butanol,…). Sau đó cô quay thu hồi dungmôi sẽ thu được các cao tương ứng.

3.3.3.1Điều chế cao petroleum ether (cao PE)

Hòa tan cao ethanol vào một lượng tối thiểu methanol(Me), thêm vàomột lượng rất ít nước cất, thu được dung dịch ban đầu, dung dịch này đượcchiết lỏng-lỏng vớiPE. Cho 50 mL PE vào bình lóng 1000 mL, sau đó chovào một lượng cao ethanol khoảng 50 mL; tiếp tục cho thêm một lượng PEkhoảng 100-200 mL, lắc mạnh nhiều lần. Sau khi lắc, để yên bình lóng trêngiá đỡ cho đến khi hỗn hợp trong bình lóng phân thành 2 pha, pha hữu cơ cótỷ trọng thấp hơn chứa các chất tan trong PE nằm phía tr ên, phần nằm dưới là

pha nước. Mở van bình lóng, hứng riêng pha hữu cơ và pha nước. Pha nướcđược chiết tiếp với dung môi cho đến khi chấm SKLM tr ên pha hữu cơ khôngcòn chất nữa thì dừng lại. Tiến hành chiết cho đến hết lượng cao ethanol banđầu. Dịch chiết PE từ các lần chiết được gom lại, làm khan với Na2SO4, đuổidung môi thu được cao PE. 3.3.3.2Điều chếcao ethyl acetate (cao Ea)

Hình 3.2 Cô quay thu hồi dung môi





34

Pha nước thu được sau khi chiết với PE tiếp tục được chiết lỏng-lỏng vớiethyl acetate, quá trình chiết được thực hiện tương tự chiết với PE. Dịch chiếtEa thu được đem cô quay loại dung môi thu được cao Ea.

3.3.4Phươngpháp phân lập, tinh chế và xác định cấu trúc

Sử dụng phương pháp sắc ký cột pha thường để tách các chất. Dùng sắc ký lớp mỏng để dò tìm hệ dung môi giải ly cho sắc ký cột.

Dùng sắc ký lớ p mỏng để theo dõi quá trình sắc ký cột và kiểm tra mứcđộ tinh sạchcủa hợp chất.

Có thể sử dụng phương pháp sắc ký lớp mỏng điều chế để tách chất ở phân đoạn có lượng ít.

Dùng phương pháp kết tinh lại để tinh chế hợp chất.

Mẫu chất sau khi phân lập được gửi đo phổ tại Viện Hóa Học Việt Nam,số 18 Hoàng Quốc Việt – Quận Cầu Giấy – Hà Nội.





35

CHƯƠNG 4

KẾT QUẢTHỰ C NGHIỆM VÀ THẢO LUẬN

4.1 Điều chế các loại cao

4.1.1 Chuẩn bị nguyên liệuR ễ khísinh cây Gừa (Ficus microcarpa)đượ c thu háiở huyện Châu

Thành,tỉnh Tiền Giang. Sau khi thu hái r ễ được rửa sạch, loại bỏ phế phẩm,để ráo rồi cắt nhỏ, sau đó phơi cho đến khi khối lượng không đổi. Đem nghiềnthành bột, cho vào các túi vải và tiến hành chiết ngâm dầm với ethanol 96°trong bình thủy tinh có thể tích 10 lít.

Hình 4.1 Bột cây đượ c ngâm dầm trong cồn 96

K ết quả xác định độ ẩm của mẫu

195.48 5.12 97.41100 62.30(%)

5.12w

294.85 5.03 96.78100 61.63(%)

5.03w

395.3 5.07 97.2 100 62.52(%)

5.07w





36

Độ ẩm trung bìnhcủa mẫu:

62.3% 61.63% 62.52%W 62.15%3

4.1.2 Điều chếcao ethanol tổngMẫu nguyên liệu ban đầu(khối lượng 8kg) sau khi phơi khô, nghiền

thành bột (khối lượng 3 kg) đượ c cho vào các túi vải nhỏ sau đó được ngâmvới lượng vừa đủ ethanol96°. Sau thời gian ngâm khoảng 24 giờ , dịch chiếtđược lọc qua giấy lọc rồi cô quay thu hồi dung môi. Dung môi thu hồi đượctrong quá trình cô quay sẽ được cho trở lại vào bình thủy tinh để tiếp tục chiết,tiếp tục thực hiện quá tr ình như thế vài lần cho đến khi chiết kiệt các chất từmẫu bột nguyên liệu. Phần dịch chiết được cô quay đuổi dung môi, thu đượccao alcol tổng có màu xanh đen(khối lượ ng cao tổng là 240g).

Hiệu suất trích cao alcol tổng từ nguyên liệu ban đầu: 240 100 8(%)3000

H

4.1.3 Điều chế các cao thành phần từcao ethanol tổng

Để điều chế các cao thành phần có độ phân cực khác nhau, ta sử dụng phương pháp chiết lỏng-lỏng.

4.1.3.1 Điều chếcao Petroleum ether

Hòa tan cao ethanol vào một lượng tối thiểu methanol(Me), thêm vàomột lượng rất ít nước cất, thu được dung dịch ban đầu, dung dịch này đượcchiết lỏng-lỏng với PE. Cho 50 mL PE vào bình lóng 1000 mL, sauđó chovào một lượng cao ethanol khoảng 50 mL; tiếp tục cho thêm một lượng PEkhoảng 100-200 mL, lắc mạnh nhiều lần. Sau khi lắc, để yên bình lóng trêngiá đỡ cho đến khi hỗn hợp trong bình lóng phân thành 2 pha, pha hữu cơ cótỷ trọng thấp hơn chứa các chất tan trong PE nằm phía trên, phần nằm dưới là pha nước. Mở van bình lóng, hứng riêng pha hữu cơ và pha nước. Pha nướcđược chiết tiếp với dung môi cho đến khi chấm SKLM tr ên pha hữu cơ không

còn chất nữa thì dừng lại. Tiến hành chiết cho đến hết lượng cao ethanol banđầu. Dịch chiết PE từ các lần chiết được gom lại, làm khan với Na2SO4, đuổidung môi thu được cao PE. Sau khi cao khô hoàn toàn, đem đi cân, thu đượckhoảng 80g cao PE.





37

Hiệu suất chiết cao PE từ cao ethanol là:

80 100 33.33(%)240

H

4.1.3.2Điều chếcao ethyl acetate

Phần lớp dưới khi trích với petroleum ether sẽ được đem chiết với dungmôi ethyl acetate bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng. Khi chiết với ethylacetate ta thu lớp tr ên chính là dịch chiết của ethyl acetate. Chiết tới lớp tr ênkhông còn màu nữa thì ngưng. Cô quay, thu hồi dung môi ta được cao ethylacetate có khối lượng là 48 g.Hiệu suất điều chếcao ethyl acetate:

48 100 20(%)240

H

4.1.3.2 Điều chếcao nướ cPhần lớ p dướ i sau khi chiết ethyl acetate đem cô quay lại, thu đượ c cao

nướ c có khối lượ ng 112g.

Hiệu suất điều chếcao nướ c:

112 100 46.67(%)240

H





38

Từ nguyên liệu đã thu hái, tiến hành điều chếcao petroleum ether, caoethyl acetate và cao nướ c. Quy trình điều chế các cao đượ c trình bàyở sơ đồsau.

Hình 4.2 Sơ đồ điều chế các loại cao.





39

4.2 Th ử nghi ệ m hoạ t tính kháng khu ẩ n trên m ộ t số cao thành ph ầ n

Những nghiên cứu tr ước đây cho thấy cácdịch chiết từ r ễ khísinh câyGừa cho tácdụng kháng khuẩn trên các các chủng vi khuẩn Gram(-)( Escherichia coli và Achromobacter polymorph ) và Gram (+) ( Bacillus

brevis , Bacillus cereus và Bacillus subtilis ) khi thử nghiệm bằng phương pháp khuếch tán đĩa thạch. Khi tiến hành thửnghiệm hoạt tính kháng khuẩntrên cácdịch chiết của r ễ khísinh cây Gừa trên haichủng khuẩn Escherichiacoli và Bacillus pumilus thì cácdịch chiết ethanol, PE và Eađều thểhiện hoạttính kháng haichủng khuẩn này. Mẫu nghiên cứu kháng khuẩn đượ c gửi thửtại Phòng Dượ c Lý – Vi Sinh, trung tâm kiểm nghiệm thuốc – mỹ phẩm – thực phẩm TP.Cần Thơ.

K ết quả kháng khuẩn đượ c chứng nhận bở i trung tâm kiểm nghiệm thuốc-mỹ phẩm, thực phẩm TP.Cần Thơ( phụ lục 13-15) vàđượ c trình bày trong bảng

sau.Bảng 4.1 Hoạt tính kháng khuẩn cácloại cao chiết r ễ khísinh cây Gừa.

K ết quả Các loại cao

Thể tích thử ởnồngđộ0,02 g/ml Escherichia coli Bacillus pumilus

Cao Ethanol 90 l Có ức chế Có ức chế

Cao PE 90 l Có ức chế Có ức chế

Cao Ea 90 l Có ức chế Có ức chế





40

Hình 4.3 Thửnghiệm hoạt tínhức chếtrên 2chủng khuẩn Escherichia coli và Bacillus pumilus.

Ngoài ra, thửnghiệm còn cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiếtethyl acetate mạnh hơn so vớ i hai dịch chiết ethanol và petroleum ether. Khithử nghiệm ở thể tích thử 70 l/đĩ a thì dịch chiết Ea đã thểhiện hoạt tínhkháng khuẩn trong khiở dịch chiết PE và Ethanol thì thểhiện khi thửnghiệmởthể tích thử là90 l.

E. coli B. pumilus E. coli

E. coli E. coli

B. pumilus

B. pumilus B. pumilus





41

Hình 4.4 Đườ ng kính vòng vô khuẩn của các mẫu thử





42

4.3 Quá trình phân lập và tinh chế các chất

4.3.1 Khảo sát cao Petroleum ether

4.3.1.1Khảo sát SKLM cao Petroleum ether

Hình 4.5 Cao PE Hình 4.6 SKLM cao PEKhikhảo sát SKLM cao PE vớ i các dung môi cóđộ phân cực khác nhau,

nhận thấy r ằng khikhảo sát vớ i dung môigiải ly hệPE:Ea (9:1) cho một vệtdài vớ i nhiều vết tròn cách khá xa nhau. Từ đó cho thấy trong cao PE có khánhiều chất vớ i các độ phân cực khác nhau và có tiềm năng phân lập đượ c.

4.3.1.2 Sắc ký cột cao PE

Từ kết quả SKLM cao PE thu được bên trên, tiến hành sắc ký cột đểkhảo sát sợ bộ cao PE ban đầu.

Tiến hành sắc ký cột thường cao PE với các số liệu như sau: - Đường kính cột: 2.5 cm. - Khối lượng pha tĩnh (silica gel 60 F254): 50 g. - Khối lượng cao PE: 3g. - Dung môiổn định cột: petroleum ether 60-90 100%.- Phương pháp nhồi cột: nhồi cột ướt.





43

Hình 4.7 SKC cao PE

Dung môi triển khai cột ban đầu là PE,sau đó dùng hệdung môi PE:Eavớ i tỉ lệ Ea tăng dần.

Dung dịch ra khỏi cột được hứng vào các lọ với thể tích như nhau. Sauđó chấm SKLM các lọ theo thứ tự, các lọ có vết giống nhau được gom chunglại thành một phân đoạn. Các vết chấm được so sánh trong cùng một bảnmỏng và cùng một hệ dung môi giải ly bản mỏng để việc so sánh giá trị R f dễdàng. Dung dịch hiện hình bản mỏng là vanilin trong môi tr ườ ng acid.

K ết quảsắc ký cột cao PE đượ c trình bày trong bảng sau:

Bảng 4.2 K ết quảsắc ký cột cao PE.

Phânđoạn

Thứ tựlọ

Dung môitriển khaicột

Dung môigiải ly bảnmỏng

K ết quảSKLM

Ghi chú

PE_I 1-12 PE 100% PE:Ea (9:1) 2 vết màutím

Dung dịchmàu vàng,lượ ng nhiều.

PE_II 13-29 PE:Ea(95:5)

PE:Ea (9:1) 3 vết màutím

Dung dịchmàu vàng,k ết tinh màutr ắng

PE_III 30-54 PE:Ea(95:5)

PE:Ea (9:1) 1 vết chínhmàu tím, 2vết mờ ởtrên, 2 vếtmờ ởdướ i.

Dung dịchtrong suốtkhông màu,k ết tinh màutr ắng





44

PE_IV 55-82 PE:Ea(9:1)

PE:Ea (9:1) 4 vết màutím: 1 vếtchính đậm bên dướ i, 3vết mờ hơn bên trên.Các vết đềukéo vệt.

PE_V 83-86 PE:Ea(9:1)

PE:Ea (9:1) Nhiều vếtkéo vệt vớ inhau

PE_VI 87-125 PE:Ea(9:1)

PE:Ea (9:1) Nhiều vếtkéo vệt vớ i

nhauPE_VII 126-

165PE:Ea(9:1)

PE:Ea (9:1) 2 vết chínhmàu tím, 2vết mờ hơn

Tiế p tụckhảo sát

*SKLM đượ c hiện hình bằng thuốc thửvanilin trong môi tr ườ ng acid.

4.3.1.3Khảo sát phân đoạn PE_III Khi quan sát SKLM phân đoạn PE_III thấy có 1 vết chính màu tím, 2 vết

mờ ởtrên và 2 vết mờ ởdướ i. Do vết chính hiện khá rõ r ệt có tiềm năng phânlập đượ c chất nên đoạn này đượ c tiến hànhkhảo sát. Sử dụng cột sắc ký cóđườ ng kính 1cm và dùng 5 g pha phatĩ nh đểtiến hành phân lậ p vết chính hiệnrõ trong phân đoạn PE_III này. Dung môi triển khai cột ban đầu là Petroleumether 60-90 100%sau đó sử dụng hệdung môi PE:Eađể làm dung môi triểnkhai cột (sử dụng hệdung môicó tỉ lệ Ea tăng dần).





45

Hình 4.8SKC phân đoạn PE_III

Dung dịch ra khỏi cột được hứng vào các lọ với thể tích như nhau. Sauđó chấm SKLM các lọ theo thứ tự, các lọ có vết giống nhau được gom chunglại. Các vết chấm được so sánh trong cùng một bản mỏng và cùng một hệdung môi giải ly bản mỏng để việc so sánh giá trị R f dễ dàng. Dung dịch hiệnhình bản mỏng là vanilin trong môi tr ườ ng acid.

K ết quảsắc ký phân đoạn PE_ III đượ c trình bày trong bảng sau:

Bảng 4.3 K ết quảsắc ký cột phân đoạn PE_IIIPhân đoạn Thứ tự lọ Dung môi

triển khaicột

Dung môi

giải ly

K ết quả

SKLM

Ghi chú

PE_III.1 1 – 7 PE 100% PE:Ea(9:1)

Không cóvết

PE_III.2 8 – 24 PE:Ea(95:5)

PE:Ea(9:1)

Vết tạ p kéodài

PE_III.3 25 - 40 PE:Ea(9:1)

PE:Ea(8:2)

1 vết màutím

Tinh thểhình kim,màu tr ắng

PE_III.4 41 - 60 PE:Ea(9:1)

PE:Ea(8:2)

Vết tạ p kéodài

Sau khi tiến hành sắc ký cột, ở phân đoạn PE_III.3 thu được một chất kếttinh màu tr ắng, khảo sát SKLM chất này với 3 hệ dung môi cóđộ phân cựckhác nhau chỉ cho 1 vết cho thấy đây là chất sạch, gọi là chất PHUOC-K1.





46

Hình 4.9 Tinh thểhợ p chất PHUOC-K1

Chất này được gửi đo phổ để xác định cấu trúc hóa học.

K ết quả khảo sát SKLMcủa hợ p chất PHUOC-K1 vớ i 3 hệ dung môigiải ly đượ c trình bày trong hình sau:

K ết quả khảo sát SKLM hợ p chất PHUOC-K1 vớ i 3 hệdung môi khác nhau

(1) Hệ giải ly PE:Ea (8:2), R f = 0,74(2) Hệ giải ly PE:C (7:3), R f = 0,25(3) Hệ giải ly Hex:C (8:2), R f = 0,21

Hình 4.10 SKLM hợ p chất PHUOC-K1

4.3.1.4Khảo sát phân đoạn PE_II Khi quan sát SKLM phân đoạn PE_II thấy có 3 vết màu tím trong đó có

1 vết đậm cách khá xa hai vết cònlại nên phân đoạn này đượ c tiến hànhkhảosát. Sử dụng cột sắc ký cóđườ ng kính 1cm và dùng 5 g pha phatĩ nh đểtiếnhành khảo sát phân đoạn này. Dung môi triển khai cột ban đầu là Petroleumether 60-90 100%sau đó sử dụng hệdung môi PE:Eađể làm dung môi triểnkhai cột (sử dụng hệdung môi có tỉ lệ Ea tăng dần).

Dung dịch ra khỏi cột được hứng vào các lọ với thể tích như nhau. Sauđó chấm SKLM các lọ theo thứ tự, các lọ có vết giống nhau được gom chunglại. Các vết chấm được so sánh trong cùng một bản mỏng và cùng một hệ





47

dung môi giải ly bản mỏng để việc so sánh giá trị Rf dễ dàng. Dung dịch hiệnhình bảnmỏng là vanilin trong môi tr ườ ng acid.

K ết quảsắc ký phân đoạn PE_ II đượ c trình bày trong bảng sau:Bảng 4.4 K ết quảsắc ký cột phân đoạn PE_II

Phân đoạn Thứ tự lọ Dung môitriển khaicột

Dung môigiải ly

K ết quảSKLM

Ghi chú

PE_II.1 1-10 PE 100% PE:Ea(9:1)

Không cóvết

PE_II.2 11-18 PE:Ea(98:2)

PE:Ea(9:1)

1 vết tạ pkéo vệt

PE_II.3 19 - 25 PE:Ea

( 95:5)

PE:Ea

(9:1)

1 vết tạ p

màu tím, 1vết mờ ởtrên

PE_II.4 26-38 PE:Ea( 95:5)

PE:Ea(9:1)

1 vết màucamchuyểnsang tím

Tinh thểhình kim,màu tr ắng

PE_II.5 39-45 PE:Ea( 95:5)

PE:Ea(9:1)

1 vết mờkéo vệt

*Bản mỏng đượ c hiện hình bằng thuốc thửvanilin trong môi trườ ng acid.

Sau khi tiến hành sắc ký cột, ở phân đoạn PE _II.4 thu được một chất kếttinh màu tr ắng, khảo sát SKLM chất này với 3 hệ dung môicó độ phân cựckhác nhau chỉ cho 1 vết cho thấy đây là chất sạch, gọi là chất PHUOC-K2.Chất này được gửi đo phổ để xác định cấu trúc hóa học.





48


K ết quả khảo sát SKLMcủa hợ p chất PHUOC-K2 vớ i 3 hệdung môigiải lyđượ c trình bày trong hình sau.

K ết quả khảo sát SKLM hợ p chất PHUOC-K2 vớ i 3 hệdung môi khác nhau(1) Hệ giải ly Hex:C (8:2), R f = 0,17(2) Hệ giải ly PE:C (7:3), R f = 0,52(3) Hệ giải ly PE:Ea (9:1), R f = 0,75


4.3.1.5 Khảo sát phân đoạn PE_VII

Phân đoạn PE_VII khiđể bay hơi tựnhiên thấy xuất hiện chất r ắn k ếttinh màu tr ắng. Lấy riêng các phần k ết tinh đó ra và chấm SKLM thì nhậnthấy chỉ có1 vết màu tím đậm. R ửa nhiều lần tinh thểk ết tinh đó vớ i PE tađượ c một hợ p chất có tinh thểk ết tinh hình kim màu tr ắng. Khảo sát SKLM

của hợ p chất này trên 3 hệdung môi cóđộ phân cực khác nhau thì nhận thấychỉ có1 vết tròn cho thấy chất sạch được đặt tên là PHUOC-K3. Hợ p chất nàyđượ c gửi đo phổ NMRđể xác định cấu trúc.

Phần còn lại của phân đoạn PE_VII và dungdịch sau khi r ửa tinh thểđượ c gom chunglại vớ i nhau ký hiệu là phân đoạn PE_VII(*).





49

Khikhảo sát lại phân đoạn PE_VII(*) bằng SKLM thì thấy có 2 vết màutím đậm có tạ p ở phần trên đầu và 2 vết mờ hơn ở phía dướ i. Các vết cókhoảng R f cách khá xa nhau nên có tiềm năng phân lập đượ c các chất ở đoạnnày do đó phân đoạn PE_VII(*)đượ c tiến hànhkhảo sát.

Sử dụng cột sắc ký cóđườ ng kính 1cm và dùng 5 g pha phatĩ nh đểtiếnhành khảo sát phân đoạn này. Dung môi triển khai cột ban đầu là Petroleumether 60-90 100%sau đó sử dụng hệdung môi PE:Eađể làm dung môi triểnkhai cột (sử dụng hệdung môicó tỷlệ Ea tăng dần). Mẫu chất đượ c nạ p vàocột bằng phương pháp nhồi cột ướ t.

Dung dịch ra khỏi cột được hứng vào các lọ với thể tích như nhau. Sauđó chấm SKLM các lọ theo thứ tự, các lọ có vết giống nhau được gom chunglại. Các vết chấm được so sánh trong cùng một bản mỏng và cùng một hệdung môi giải ly bản mỏng để việc so sánh giá trị Rf dễ dàng. Dung dịch hiện

hình bản mỏng là vanilin trong môi tr ườ ng acid. K ết quả quá tr ình sắc ký đượcthể hiện trong bảng bên dưới.

Hình 4.13SKC phân đoạn PE_VII(*)Bảng 4.5 K ết quả sắc ký cột phân đoạn PE_VII(*)Phân đoạn Thứ tự lọ Dung môi

triển khai

cột

Dung môigiải ly

K ết quảSKLM

Ghi chú

PE_VII.1 1 - 13 PE 100% PE:Ea(9:1)

Không cóvết

PE_VII.2 14 - 20 PE:Ea(95:5)

PE:Ea(9:1)

Vết tạ pkéo dài





50

PE_VII.3 21 - 31 PE:Ea(9:1)

PE:Ea(9:1)

1 vết mờmàu tímkéo vệtdài.

PE_VII.4 32 - 47 PE:Ea(9:1)

PE:Ea(9:1)

1 vết màutím đậm,còn dơ phía dướ i

Dung dịchtrong suốtkhông màu

PE_VII.5 48-55 PE:Ea(8:2)

PE:Ea(8:2)

1 vết mờkéo vệtmàu tím

PE_VII.6 56-68 PE:Ea

(8:2)

PE:Ea

(8:2)

1 vết màu

tím kéo vệtPE_VII.7 69-73 PE:Ea

(8:2)PE:Ea(8:2)

1 vết mờkéo vệt

PE_VII.8 74-80 PE:Ea( 8:2)

Hex:C(1:1)

1 vết màuhồng

Tinh thểtr ắng, hiệnUV

PE_VII.9 81-96 PE:Ea( 8:2)

PE:Ea(8:2)

Nhiều tạ pkéo vệt

*Bản mỏng hiện hình bằng thuốc thửvanilin trong môi tr ườ ng acid.Khi tiến hành sắc ký cột phân đoạn này ta nhận thấy ở phân đoạn

PE_VII.8thu đượ c một chất có khả năng hiện hình khi chiếu bằng đèn UV có bướ c sóng 254 nm. Khikhảo sát SKLM hợ p chất này trên 3 hệdung môi cóđộ phân cực khác nhau thì nhận thấy chỉ có1 vết màu hồng khi hiện hình bằngthuốc thử vanilin trong môi tr ườ ng acid. Hợ p chất này được đặt tên làPHUOC-K4. Chất này đượ c gửi đo phổ để xác định cấu trúc hóahọc.

Bên cạnh đó, khi chấm SKLM phân đoạn PE_VII.4 nhận thấy có xuấthiện một vết màu tím đậm nhưngcòn dơ ở phía dướ i. Sử dụng phương phápSKLM điều chế đểtinh chế lại hợ p chất này.

Sử dụng một tấm bản mỏng có kích thướ c khoảng 10 cm x 10 cm. Hỗnhợ p cần tách đượ c chấm lên tấm bản mỏng thành một đườ ng dài liêntục. Chotấm bản mỏng trên vào hộ p giải ly chứa sẵn pha động là hệdung môi PE:Ea(9:1). Sau khi giải ly, lấy bản mỏng ra khỏi bình sắc ký, để bay hơi dung môi





51

sau đó hiện hình bằng đèn UVở bướ c sóng 254 nm, dùng viếtchì khoanhvùng chứa vết chính cần phân lậ p.

Tiến hành cạo phần silica gel trên bản mỏng chứa vết chính đã đượcđánh dấu bằng viết chì. Sau đó, giải hấp phụ chất bằng dung môi ethyl acetate.

Kiểm tra lại bằng SKLM với3 hệ dung môicó độ phân cực khác nhau thì thấymột vết tròn màu tím đậm cho thấy vết sạch. Đặt tên hợ p chất này làPHUOC-K6. Hợ p chất này đượ c gửi đo phổ NMRđể xác định cấu trúc.

Hình 4.14 Các hợ p chất PHUOC-K6, PHUOC-K3 và PHUOC-K4

Khigiải ly hợ p chất PHUOC-K3 vớ i 3 hệdung môi cóđộ phân cực khácnhau ta thu đượ c 1 vết tròn. Ba hệdung môigiải ly hợ p chất PHUOC-K3 là:Hex:C (7:3)khi đó cho 1 vết tròn tại điểm có R f = 0.14; khigiải ly bằng hệPE:C (6:4) thì cho một vết có R f = 0.34 và khigiải ly bằng hệdung môiPE:Ea (9:1) thì cho vết tại điểm có R f = 0.49.Qua các k ết quảSKLM vớ i 3 hệ

dung môi k ể trên cho thấy PHUOC-K3 là một chất sạch nên đượ c tiến hànhgửi đi đo phổ để xác định cấu trúc.

K ết quả khảo sát SKLM hợ p chất PHUOC-K4 vớ i 3 hệdung môi khác nhau(1) Hệ giải ly PE:Ea (9:1), R f = 0,2(2) Hệ giải ly Hex:C (1:1), R f = 0,14(3) Hệ giải ly Hex:Ea (6:4), R f = 0,63






52

K ết quả khảo sát SKLM hợ p chất PHUOC-K6 vớ i 3 hệdung môi khác nhau(1) Giải ly vớ i C 100%, R f = 0,77(2) Hệ giải ly PE:Ea (9:1), R f = 0,5(3) Hệ giải ly Hex:C (1:1), R f = 0,43


4.3.2 Hợ p chất PHUOC-K5


Trong quá trình điều chếcao ethyl acetate, khi thực hiện cô quayđuổidung môi ta thấy có nhiều các chất r ắn k ết tinh trên thành bình cầu đem côquay. Lấy riêng các phần k ết tinh đó ra và chấm SKLM thì nhận thấy chỉ cómột vết tròn đậm. Thực hiện phương pháp k ết tinhlại nhiều lần vớ i dung môita thu đượ c một chất sạch được đặt tên là hợ p chất PHUOC-K5.Khảo sátSKLMcủa hợ p chất này trên 3 hệdung môi cóđộ phân cực khác nhau thìnhận thấy chỉ có1 vết tròn cho thấy chất sạch. Hợ p chất này đượ c gửi đo phổ

NMRđể xác định cấu trúc.K ết quảSKLM hợ p chất PHUOC-K5 khigiải ly bằng 3 hệdung môi có

độ phân cực khác nhau.





53

K ết quả khảo sát SKLM hợ p chất PHUOC-K6 vớ i 3 hệdung môi khác nhau(1) Giải ly vớ i Ea 100%, R f = 0,18(2) Hệgiải ly Ea:Me (9:1), R f = 0,6(3) Hệ giải ly C:Me (8:2), R f = 0,76


4.4 Biện luận cấu trúc các hợ p chất phân lập đượ c [7] [8]

4.4.1 Biện luận cấu trúc của hợ p chất PHUOC-K1 [2] [9]

Hợ p chất PHUOC_K1 sau khi phân lập đượ c xác định cấu trúc bằng phổ1H-NMR.

Quan sát phổ1H-NMR (500MHz, CDCl3) của hợp chất PHUOC-K1 (phụlục 1,2) ta thấy có sựxuất hiện của 8 tín hiệu protoncủa nhóm methyl. Trongđó có 7 tín hiệu của proton methyl singlet có ppmở0,86 (3H, s); 0.94 (3H,

s); 0.96 (3H, s); 0.99 (3H, s); 0,99 (3H, s), 1,00 (3H, s); 1,17 (3H,s) và một tínhiệu proton methyl doublettại ppm là 0.93 (3H, d, J=7,5 Hz). Bêncạnh đó,còn có sựxuất hiện của một proton doubletở vị trí ppm là 3,73 (1H, d, J=2Hz) cho thấy có sựxuất hiện của một proton gắn vớ i carbon carbinol.

Từ các dữ liệu phổ ởtrên nhận thấy hợ p chất PHUOC-K1 có thể làmộthợ p chất triterpene thuộc khung friedelane và có một nhóm hydroxy trong phân tử.

So sánh các dữliệu phổ của hợ p chất PHUOC-K1 vớ i hợ p chất

epifriedelanol.Các sốliệu so sánh đượ c trình bày trong bảng sau.





54

Bảng 4.6 So sánh dữliệu phổ của hợ p chất PHUOC-K1 và epifriedelanol.

Vị trí của C Hợ p chất PHUOC-K1 Hợ p chất Epifriedelanol3 3,73 (1H, d, J = 2 Hz) 3,73 (1H, d, J = 2 Hz)23 0,93 (3H, d, J = 7,5 Hz) 0,93 (3H, d, J=6,5 Hz)

24 0,99 (3H, s) 0,99 (3H, s)25 0,86 (3H, s) 0,72 (3H, s)26 0,96 (3H, s) 0,96 (3H, s)27 1,00 (3H, s) 1,00 (3H, s)28 1,17 (3H, s) 1,17 (3H, s)29 0,94 (3H, s) 0,94 (3H, s)30 0,99(3H, s) 0,99 (3H, s)

Từviệc so sánh các dữliệu phổ của hợ p chất PHUOC-K1 vớ i hợ p chấtepifriedelanol cho thấy có sự trùng khớ p giữa các tín hiệu phổ protoncủa haihợ p chất này nên có thể k ết luận hợ p chất PHUOC-K1 là epifriedelanol haycòn đượ c gọi vớ i tên là friedelan-3-ol.

HO

1

2

3

4

5

6

7

89

10

11

12

13

14

15

16

1718

19

20

21

22

23

24

25 26

27

28

29 30

Epifriedelanol

4.4.2 Biện luận cấu trúc của hợ p chất PHUOC-K2 [2] [9]

Hợ p chất PHUOC-K2 sau khi phân lập đượ c gửi đi đo phổ 1H-NMR vàIR để xác định cấu trúc.

Quan sát dữ liệu phổ1H-NMR (500MHz, CDCl3) của hợ p chất PHUOC-

K2 (phụ lục 3,4) ta thấy có sựxuất hiện của 8 nhóm proton methyl trong đó có7 tín hiệu proton methyl singlettại cácvị trí có ppm lần lượ t là 0,72 (3H, s);0,87 (3H, s); 0,95 (3H, s); 1,00 (3H, s); 1,01 (3H, s); 1,05 (3H, s), 1,18 (3H, s). Ngoài 7 tín hiệu proton singlet thì trên phổ đồ còn có sựxuất hiện của 1 nhóm proton methyl doublettại vị trí có ppm là 0,88 ( 3H, d, J = 6,5 Hz). Qua cácdữ kiện trên ta nhận thấy hợ p chất PHUOC-K2 có thể làmột triterpene cókhung friedelane.





55

Trên phổ 1H-NMR của hợ p chất PHUOC-K2 không thấy có sựxuất hiệncủa mũi tín hiệu proton gắn vớ i carbon carbinol nên có thểdự đoán hợ p chấtPHUOC-K2 không có sựxuất hiện của nhóm hydroxy (-OH) trong phân tử.Bên cạnh đó, k ết quả phổhồng ngoại của hợp chất PHUOC-K2 (phụ lục 12) xuất hiện một mũi hấ p thumạnhở1714,69 cm-1 là dao động đặc trưng của nốiC=O nên có thểdự đoán nhóm hydroxy trong phân tửhợ p chất PHUOC-K1có thể đã bịoxy hóatạo thành nhóm chức C=O trong hợ p chất PHUOC-K2.

Tiến hành nghiên cứu các tài liệu thamkhảo và so sánh các dữ liệu phổcủa hợ p chất PHUOC-K2 vớ i hợ p chất friedeline ta đượ c bảng sau.Bảng 4.7 So sánh dữliệu phổhợ p chất PHUOC-K2 vớ i hợ p chất Friedeline.Vị trí của C Hợ p chất PHUOC-K2 Hợ p chất Friedeline

23 0,88 ( 3H, d, J = 6,5Hz)

0,88 ( 3H, d, J = 6,5Hz)

24 0,72 (3H, s) 0,72 (3H, s)25 0,87 (3H, s) 0,87 (3H, s)26 1,01 (3H, s) 1,01 (3H, s)27 1,05 (3H, s) 1,05 (3H, s)28 1,18 (3H, s) 1,18 (3H, s)29 1,00 (3H, s) 1,00 (3H, s)30 0,95 (3H, s) 0,95 (3H, s)

Qua bảng so sánh trên cho thấy các dữ liệu phổ của hai hợ p chất trênhoàn toàn trùng khớ p, vì vậy có thểk ết luận hợ p chất PHUOC-K2đã phân lậ pđượ c là hợ p chất friedeline hay còn có têngọi khác là friedelan-3-one.

1

2

3

4

5

6

7

89

10

11

12

13

14

15

16

1718

19

20

21

22

23

24

25 26

27

28

29 30

O

Friedeline





56

4.4.3 Biện luận cấu trúc hợ p chất PHUOC-K3 [10]

Hợ p chất PHUOC-K3 sau khi phân lập đượ c gửi đo phổ1H-NMRđểtiếnhành xác định cấu trúc.

Quan sát phổ 1H-NMR (500MHz , CDCl3) của hợ p chất PHUOC-K3(phụ lục 5,6) ta thấy có sựxuất hiện các tín hiệu của proton nhóm methylởcác vị trí có ppm lần lượ t là: 0,68 ppm(3H, s); 0,81 (3H, s); 0,82 (3H, d, J =4 Hz); 0,84 (3H, d, J = 7,5 Hz); 0,92 ppm (3H, d, J = 6,5 Hz); 1,01 (3H, s). Ngoài ra, còn có sựxuất hiện của mũi tín hiệu tại vị trí có ppm là 3,53 ( 1H,m) đượ c xác định là proton gắn vớ i carbon carbinol. Trên phổ đồ còn có sựxuất hiện của một mũi tín hiệu của proton vinyltại vị trí có ppm là 5, 35 (1H, dd, J = 5 Hz). Qua các dữkiện trên ta có thểthấy hợ p chất PHUOC-K3 làmột steroid và có 1 nối đôi trong phân tử.

Thamkhảo các tài liệu đã công bố k ết hợ p vớ i so sánh dữ liệu phổ của hợ pchất PHUOC-K3 vớ i hợ p chất -sitosterol ta đượ c bảng sau.

Bảng 4.8 So sánh phổhợ p chất PHUOC-K3 vớ i -sitosterol.

Vị trí của C Hợ p chất PHUOC-K3 Hợ p chất -sitosterol

3 3,53 (1H, m) 3,53 (1H, tdd, J = 4,5 ;4,2; 3,8 Hz)

6 5,35 (1H, dd, J = 5 Hz) 5,36 (1H, t, J = 6,4 Hz)18 1,01 (3H, s) 1,01 (3H, s)19 0,68 (3H, s) 0,68 (3H, s)21 0,92 (3H, d, J = 6,5 Hz) 0,93 (3H, d, J =6,5 Hz)26 0,84 (3H, d, J = 7,5 Hz) 0,84 (3H, t, J = 7,2 Hz)27 0,81 (3H, s) 0,81 (3H, d, J = 6,4 Hz)29 0,82 (3H, d, J = 4 Hz) 0,83 (3H, d, J = 6,4 Hz )

Từviệc so sánh các dữ liệu phổ của hợ p chất PHUOC-K3 vớ i hợ p chất-sitosterol cho thấy có sự trùng khớ p giữa các tín hiệu phổ protoncủa hai hợ p

chất này nên có thểk ết luận hợ p chất PHUOC-K3đã phân lập đượ c là -sitosterol.





57

-sitosterol.

4.4.4 Biện luận cấu trúc hợ p chất PHUOC-K5 [10] [11]

Hợ p chất PHUOC-K5 sau khi phân lập đượ c gửi đi đo phổ1H-NMRđểxác định cấu trúc.

Quan sát phổ 1H-NMR (500MHz, CDCl3) của hợ p chất PHUOC-K5 chothấy có xuất hiện cácmũi tín hiệu protontại cácvị trí:o Sáu tín hiệu proton methyltại: 0,68 (3H, s); 0,81 (3H, d, J =7 Hz); 0,83

(3H, d, J= 7 Hz); 0,86 (3H, d, J = 7,5 Hz), 0,93 (3H, d, J =6,5 Hz), 1,01(3H, s).

o Một tín hiệu proton vinyltại vị trí có ppm là 5,37 (1H, d, J = 5 Hz).o Các tín hiệu protoncủa một phân tử đườ ng tại cácvị trí có ppm là: 4,41

(1H, d, J = 7,5 Hz); 3,58 (1H, m); 3,76 (1H, dd, J= 4,5 Hz và J = 12 Hz);3,85 (1H, dd, J = 3 Hz và J = 12 Hz) và các proton trongkhoảng 3,15-3,38 ppm.

Qua các dữ liệu phổ trên có thểdự đoán hợ p chất PHUOC-K5 là mộthợ p chất steroid có gắn vớ i một phân tử đườ ng . Thamkhảo các tài liệu k ếthợ p so sánh phổ của hợ p chất PHUOC-K5 vớ i hợ p chất daucosterol tacó bảngso sánh sau.

Bảng 4.9 So sánh dữ liệu phổhợ p chất PHUOC-K5 vớ i hợ p chất daucosterolVị trí của C Hợ p chất PHUOC-K5 Hợ p chất daucosterol

3 3,58 (1H, m) 3,57 (1H, m)6 5,37 (1H, d, J = 5 Hz) 5,37 (1H, dd, J= 3 Hz và

J = 3 Hz)18 1,01 (3H, s) 1,01 (3H, s)19 0,68 (3H, s) 0,67 (3H, s)21 0,93 (3H, d, J = 6,5 Hz) 0,93 (3H, d, J = 6,5 Hz)26 0,81 (3H, d, J = 7 Hz) 0,82 (3H, d, J = 7 Hz)





58

27 0,83 (3H, d, J = 7 Hz) 0,84 (3H, d, J = 6,5 Hz)29 0,86 (3H, d, J = 7,5 Hz) 0,85 (3H, t, J = 7,5 Hz)

1 4,41 (1H, d, J = 7,5 Hz) 4,41 (1H, d, J = 7,5 Hz)

2 3,28 (1H, m)

3 3,58 (1H, m) 3,57 (1H, m)

4 3,28 (1H, m)

5 3,28 (1H, m)

6 3,76 (1H, dd, J = 4,5 Hzvà J = 12 Hz)3,85 (1H, dd, J = 3 Hzvà J = 12 Hz)

3,76 (1H, dd, J = 4,5 Hzvà J = 12 Hz)3,84 (1H, dd, J = 3 Hzvà J = 12 Hz)

Qua bảng so sánh trên ta thấy có sự trùng khớ p nhau giữa các dữ liệu phổcủa hợ p chất PHUOC-K5 và hợ p chất daucosterol nên có thểk ết luận hợ pchất PHUOC-K5đã đượ c phân lậ p là hợ p chất daucosterol hay còn đượ c gọivớ i tên là -sitosterol-3-O- -D-glucopyranoside có công thức phân tửC35H60O6 và có công thức hóahọc nhưhình sau.

-sitosterol-3-O- -D-glucopyranoside

4.4.5 Biện luận cấu trúc hợ p chất PHUOC-K6 [12] [2]

Hợ p chất PHUOC-K6 sau khi phân lập đượ c gửi đi đo phổ1H-NMRđểxác định cấu trúc.

Quan sát phổ1H-NMRcủa hợ p chất PHUOC-K6 thấy xuất hiện các tínhiệu đặc trưng của một triterpenetại vùng tr ườ ng cao. Bêncạnh đó, có sựxuấthiện 2 mũi tín hiệu của cyclopropyl proton tại cácvị trí có ppm lần lượ t là0,33( 1H, d, J = 4,5 Hz); 0,55 (1H, d, J = 4). Trên phổhợ p chất PHUOC-K6cũng xuất hiện một mũi tín hiệu của proton gắn vớ i carbon carbinoltại vị trí3,28 ppm (1H, dd, J = 11 Hz và J = 4,5); hai tín hiệu tại 5,1 ppm (1H, dd, J =12,5 Hz và J = 3,5 Hz) và 4,7 ppm (1H, t, J = 13,5 Hz). Qua các dữ liệu phổ





59

k ể trên có thểk ết luận hợ p chất PHUOC-K6 có thể là một triterpene chứavòng cyclopropyl bêncạnh đó còn chứa một nhóm chức alkenedạng trans vàcó 1 nhóm OH trong phân tử.

Thamkhảo các tài liệu cho thấy hợ p chất PHUOC-K6 có thể làhợ p chất

(23 E )-27-nor -3 -Hydroxycycloart-23-en-25-one. Tiến hành so sánh phổ củahợ p chất PHUOC-K6 vớ i phổ của hợ p chất 27-nor -3 -Hydroxy-25-oxocycloartane ( một hợ p chất tương tự vớ i (23 E )-27-nor -3 -Hydroxycycloart-23-en-25-one nhưng khôngcó nối đôi ở vị tríC23) ta thấy cónhiều điểm tương đồng vớ i nhau.Bảng 4.10 So sánh phổhợ p chất PHUOC-K6 và hợ p chất 27-nor -3 -Hydroxy-25-oxocycloartaneCác tín hiệu Hợ p chất PHUOC-K6 Hợ p chất 27-nor -3 -

Hydroxy-25-

oxocycloartaneCác tín hiệu khungtriterpene.

Xuất hiện các tín hiệukhung triterpeneở vùngtr ườ ng cao.

5 mũi methyl singlettại0,78; 0,86; 0,93; 0,94;2,11ppm và 1 mũimethyl doublettại 0,85 ppm (J = 5,2 Hz)

Mũi tín hiệu proton gắn

vớ i carbon carbinol.

3,28 (1H, dd, J = 11 Hz

và J = 4,5 Hz)

3.26(1H, dd, J = 10.8

Hz, J = 4.0 Hz)Hai tín hiệu của protonalkenedạng trans

2 tín hiệu tại 5,1 ppm(1H, dd, J = 12,5 Hz vàJ = 3,5 Hz) và 4,7 ppm(1H, t, J = 13,5 Hz)

Qua bảng so sánh trên ta thấy hợ p chất PHUOC-K6 có nhiều điểmtương đồng vớ i hợ p chất 27-nor-3 -hydroxy-25-oxocycloartane và có thêmmột nối đôi trong phân tửnên có thểdự đoán hợ p chất đượ c phân lậ p ra là

(23E)-27-nor-3-hydroxycycloart-23-en-25-one có công thức phân tửC29H46O2.





60

27-nor -3 -Hydroxy-25-oxocycloartane

(23 E )-27-nor -3 -Hydroxycycloart-23-en-25-one





61

CHƯƠNG 5

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

5.1 Kết luận

Sau thời gian thực hiện đề tài “Khảo sát thành phần hóa học r ễ khísinhcủa cây Gừa Ficus microcarpa ”.

Đề tài đã được hoàn thành và đạt được một số kết quả như sau:

- Xác định được độ ẩm của mẫu tươi rễ khísinh cây Gừa là 62,15%.

- Điều chế đượ c cao ethanol vớ i hiệu suất trích cao từnguyên liệu ban đầu là8%.

- Điều chế đượ c các cao thành phần bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng, gồmcó cao PE ( 33,33%), cao Ea (20%) và cao nướ c (46,67%).

- Phân lập đượ c 5 hợ p chất từcao PE: epifriedelanol, friedeline, -sitosterol,

-sitosterol-3-O- -D-glucopyranoside, (23 E )-27-nor -3 -Hydroxycycloart-23-en-25-one

- Hợ p chất PHUOC-K4đượ c gửi đo phổ1H-NMRđểcác định cấu trúc nhưngchỉ với thông tin từ phổ1H-NMR vẫn chưa đủ cơ sở để giải đoán cấu trúc củahợp chấtPHUOC-K4.

5.2 Kiế n nghị

Do hạn chế về mặt thời gian nên đề tài chỉ khảo sát một số phân đoạntrên cao PE. Kiến nghị tiếp tục nghiên cứu mở rộng đề tài theo các hướng sau:

Khảo sát các phân đoạn còn lại của cao PE. Khảo sát thêm các cao phân cực hơn như: cao Ea, cao nướ c. Điều chế và khảo sát cao n-butanol.





62

TÀI LIỆU THAM KHẢO

[1] P. H. Hộ,"Cây cỏ Việt Nam, " T.II, Hồ ChíMinh: Nhà Xuất Bản Trẻ,trang 561, 2000.

[2] N. X. Cường, " Nghiên cứu hoạt tính sinhhọc và thành phần hóahọc của mộtsố loài thuộc chi Ficus Việt Nam," Viện Hàn Lâm và Khoa Học Việt Nam,Viện Công Nghệ Sinh Học, Hà Nội, 2014.

[3] C. Ao, "Studies on antioxidant, antibacterial and anti-inflammatory," Repository, 2009.

[4] N. K. P. Phụng, Phương phápcô lập hợp chất thiên nhiên, Hồ Chí Minh: Đạihọc Quốc gia TP. Hồ Chí Minh, 2007.

[5] T. N. L. Hướng, Hoá học hợp chất thiên nhiên, Cần Thơ: Đại Học Cần Thơ. [6] T. V. H. D. Đ. H. T. H. K. D. K. B. Lã Văn Mỡ i, Tài Nguyên thực vật Việt

Nam những cây chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học, Hà Nội: Nhà Xuất

Bản Nông Nghiệp, 2005. [7] N. K. P. Phụng, Phổ NMR sử dụng trong phân tích hữu cơ, TP. Hồ Chí Minh:Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh, 2005.

[8] E. o. P. B. u. a. M. Badertscher, NMR, UV/Vis, MS, IR Structuredetermination of Organic compound, Springer, 2009.

[9] N. T. M. Hằng, "Nghiên cứu thành phần hoá học của một số loài Calophyllum(Clusiaceae) cóở Việt Nam," Thư Viện Quốc Gia Việt Nam, Hà Nội, 2009.

[10] I. P. Venkata Sai Prakash Chaturvedula, "Isolation of Stigmasterol and β-Sitosterol from the dichloromethane extract of Rubus suavissimus,"

International Current Pharmaceutical Journal, vol. 1, no. 9, pp. 239-242,2012.

[11] N. C. H. N. C. K. Nguyễn Hoàng Hạt, "NGHIÊN CỨU THÀNH PH N H AHỌC CỦA CÂY MỘC KÝ NGŨHÙNG DENDROPHTOE PENTANDRA(L.) MIQ., HỌCHÙM GỬI (LORANTHACEAE) KÝ SINH TR ÊN CÂY MÍT(ARTOCARPUS INTEGRIFOLIA) VÀ CÂY NA (ANNONASQUAMOSA),"T ạp chí hoá học,vol. 48, no. 4, 2010.

[12] Y.-M. e. a. Chiang, "New cyclopropyl-triterpenoids from the aerial roots ofFicus microcarpa,"Chemical and pharmaceutical bulletin, vol. 49, no. 5, pp.581-583, 2001.





63

PHỤ LỤC

Phụ lục 1. Phổ1H-NMR trong CDCl3 của hợ p chất PHUOC-K1





64

Phụ lục 2. Phổ1H-NMR (hex) trong CDCl3 của hợ p chất PHUOC-K1





65






66






67






68






69

Phụ lục 7. Phổ1H-NMR

trong CDCl3 của hợ p chất PHUOC-K5





70






71






72






73

Phụ lục 11. Phổ1H-NMR (hex) trong CDCl3 của hợ p chất PHUOC-K6.





74

Phụ lục 12. Phổ IR của hợp chất PHUOC-K2





75

Phụ lục 13. K ết quả kháng khuẩn cao PE.





76

Phụ lục 14. K ết quả kháng khuẩn cao Ea



khảo sát thành phần hóa học rễ khí sinh của cây gừa (ficus microcarpa)

Documents