kinetika enzimatik 02
DESCRIPTION
mari di lihatTRANSCRIPT
Kinetika REAKSI ENZIMATIK
Kinetika reaksi enzimatik
menyediakan informasi tentang mekanisme dasar reaksi enzim dan parameter-parameter lainnya
Laju reaksi yang dikembangkan dari studi kinetik dapat digunakan untuk perhitungan waktu reaksi, perolehan dan kondisi operasi yang optimum
Kinetika reaksi enzimatik sederhana
S PE
Laju reaksi dituliskan :
atau
S : substrat / media / umpan / bahan bakuP : produk
Kinetika enzimatik reaksi sederhana
pengukuran/pengamatan konsentrasi terhadap waktu
t
Cs
substrat
produk
Kinetika enzimatik reaksi sederhana
pengukuran/pengamatan konsentrasi terhadap waktu
t
Cs Laju reaksi
rS,1
t1 t2 t3
CS,1
CS,2
CS,2
rS,2 rS,3
CS1
t1
Kinetika enzimatik reaksi sederhana
Jika dilakukan pengukuran laju pada awal reaksi pada konsentrasi substrat dan enzim berbeda:
CS
rS
rS,max
CS rS
CS,1 rS,1
CS,2 rS,2
CS,3 rS,3
CS,4 rS,4
CS,5 rS,5
…… ……
…… ……
CS,n rS,n
Persamaan laju reaksi
Henri (1902) :
rmax dan KM ditentukan secara eksperimental
Jika KM = CS
Persamaan laju reaksi
Henri (1902) :
rmax dan KM ditentukan secara eksperimental
CS
rp
rmax
KM
½ rmax
Persamaan laju berdasarkan mekanisme
S + E k1
k2
ES
ES k3 E + P
Brown (1902):
Model kinetika Brown telah menyimpulkan adanya senyawa komplek enzim-substrat, 40 tahun sebelum spektrofotometrik dapat mendeteksi senyawa kompleks
#
*
+
E S ES
Teori lock and key
Asumsi:1. Konsentrasi enzim total, tetap
CEo = CES + CE
2. CE << CS, sehingga pembentukan ES tidak menurunkan CS secara signifikan
3. Konsentrasi produk cukup kecil sehingga inhibisi oleh produk diabaikan
Asumsi tersebut menghasilkan :1. Pendekatan Michaelis-Menten (1913)
2. Pendekatan Briggs-Haldane (1925)
3. Penyelesaian numerik
Pendekatan Michaelis-Menten (1913)
S + E k1
k2
ES
ES k3 E + P
1. Persamaan (1) mencapai kesetimbangan2. Persamaan (2) lebih lambat dari (1)3. Laju keseluruhan dikendalikan yang lambat
(1)
(2)
(3)
Pendekatan Michaelis-Menten (1913)
(3)
Dari kesetimbangan pada persamaan (1):
(4)
(5)
S + E k1
k2
ES
Pendekatan Michaelis-Menten (1913)
(3)
(6)
+
E S ES
Jika konsentrasi enzim pada saat awal, CEo Enzim yang berikatan substrat, CES Maka enzim yang bebas:
(5)
(6)
Substitusi (6) ke (5): (7)
(3)
Substitusi (7) ke (3):
(8)
(9)
Pendekatan Briggs-Haldane (1925)
AsumsiPerubahan konsentrasi intermediat (pada pers. 1 dan 2) terhadap waktu, diabaikan
Dari persamaan (1) dan (2)
(1)
(2)
(10)
Pendekatan Briggs-Haldane (1925)
Dari persamaan (1), (2) dan (10)
(11)
Substitusi (6) ke (11):
(6)
(12)
(12)
Substitusi (12) ke (1)
(13)
Contoh 2.1Konversi glukosa menjadi fruktosa oleh glukosa isomerase, tahap reaksi yang lambat juga merupakan reaksi reversibel seperti berikut:
S + E ES
ES P + E
k1
k2k3
k4
Turunkan persamaan laju menggunakan
a. Pendekatan Michaelis-Menten
b. Pendekatan Briggs-Haldane
a. Menggunakan pendekatan Michaelis-Menten
S + E ES P + Ek1
k2
k3
k4
rp = k3 CES – k4 CP CE 2.19
CEo = CES + CE 2.20CE = CEo – CES
rp = k3 CES – k4 CP (CEo – CES)
rp = k3 CES – k4 CP CEo + k4 CP CES
rp = (k3 + k4 CP)CES – k4 CP CEo
Reaksi 1 dianggap setimbang 2.22
2.21
a. Menggunakan pendekatan Michaelis-Menten
2.222.20
2.24
CE = CEo – CES
Substitusi (2.20) ke (2.22)
2.23
b. Menggunakan pendekatan Briggs-Haldane
S + E ES P + Ek1
k2
k3
k4
2.25
2.26
Laju pembentukan produk antara, CES = 0
CE = CEo – CES Substitusi CE oleh:
b. Menggunakan pendekatan Briggs-Haldane
Menggunakan pendekatan Briggs-HaldaneEvaluasi parameter kinetik
Pers Michaelis-Menten:
Line-Weaver Burk
Menggunakan pendekatan Briggs-HaldaneEvaluasi parameter kinetik
Langmuir
CS
Pers Michaelis-Menten:
Menggunakan pendekatan Briggs-HaldaneEvaluasi parameter kinetikLangmuir :
Eadie-Hofstee
r/CS
SMmaks C
rK r r
r
rmaks
-KM
S
maks
Cr
S
maks
maks
M
maks
SS
Cr .r
rk
rC
rC
Cso
(mmol/L)ro
(mmol/L.menit)12357
101520
0,200,220,300,450,410,500,540,55
Contoh: Hasil pengamatan memberikan data hubungan laju reaksi sebagai berikut
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.20
1
2
3
4
5
6
f(x) = 3.4575111518788 x + 1.9450134226708R² = 0.846252339075781
1/CS
1/r
maksr1 = 1.945 rmaks = 0,514
maks
M
rK = 3,457 KM = 1,777
Metoda Line-Weaver Burk
CS
0 2 4 6 8 10 120
5
10
15
20
25
f(x) = 1.58660484596389 x + 4.64170920778974R² = 0.949654896508446
CS/r
rmaks = 0,630
KM = 2,926
Metoda Langmuir
r
r/CS
0.0 0.1 0.2 0.30
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
f(x) = − 1.89232077075659 x + 0.538602059129121R² = 0.661838206758566
Metoda Eadie - Hofstee
0 5 10 15 20 25 3005
101520253035
f(x) = 0.317283655759 x + 21.33459686912R² = 0.739705582168541
CSo/ro
CS
0
5
10
15
20
25
f(x) = 19.48405221442 x + 0.519136528724R² = 0.999675846523834
1/So
1/r
o
0.03 0.035 0.04 0.045 0.05 0.0550
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
f(x) = − 44.35599284437 x + 2.242853309481R² = 0.705496198520464
r/CS
r
JAWABAN TUGAS
0 5 10 15 20 25 300
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
LangmuirLW-BE-H
So
ro
CSo Data LW-B Lang E-H (D - Eq)2 LW-B Lang E-H
1 0.05 0.050 0.046 0.049 6.3 10-12 1.4 10-05 3.2 10-07
5 0.23 0.227 0.218 0.227 1.2 10-05 1.4 10-04 8.1 10-06
10 0.38 0.405 0.408 0.413 6.4 10-04 7.9 10-04 1.1 10-03
15 0.52 0.550 0.575 0.567 9.1 10-04 3.0 10-03 2.2 10-03
30 1.03 0.856 0.973 0.905 3.0 10-02 3.3 10-03 1.6 10-02
Sum of Square 3.2 10-02 7.3 10-03 1.9 10-02
5 mL selobiosa (substrat) yang mengandung 100 mol/mL selobiosa + 44 mL buffer + 1mL enzim.
50)100(5
CSo = 10 mol/mL
Aktivitas = mol glukosa yang dihasilkan per menit
t (menit) CG(umol/mL)0 01 0.055 0.23
10 0.3815 0.5230 1.03
0 5 10 15 20 25 300
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
f(x) = 0.0349320543565148 xR² = 0.997015724237278
waktu (menit)
CG (m
mol
/mL)
Pengukuran Aktivitas Enzim Selobiose
a. Dari grafik tampak bahwa glukosa yang dihasilkan rata-rata selama 30 menit adalah 0,034 mol/mL dengan enzim yang digunakan 1 mL dengan volume larutan 50 mL.
Glukosa yang dihasilkan = 50 x 0,034 = 1,7 mol/menit
Aktivitas glukosa = 1,7 mol/menit.mL = 1,7 Unit/mL
b. Data yang ada: konsentrasi produk (glukosa) terhadap vs waktu
Data yang dibutuhkan untuk menentukan laju adalah konsentrasi substrat vs waktu
reaksi: C12H22O11 + H2O 2C6H12O6
t (menit)
CG
(umol/mL)CS
(mmol/mL)0 0 101 0.05 9.9755 0.23 9.885
10 0.38 9.81015 0.52 9.7430 1.03 9.485
0 4 8 12 16 20 24 28 328
8.5
9
9.5
10
10.5
f(x) = 5.01993946414063E-05 x² − 0.0183229116985768 x + 9.9916496951528R² = 0.997234668539322
t (menit)
CS
Soal Latihan
2.1 Untuk menjamin aktivitas enzim dan laju reaksi awal, 5 mL selobiosa (100 mol) dan 44 mL larutan buffer larutan dicampur dalam CSTR. Reaksi diinisiasi dengan menambahkan 1 mL enzim (-glukosidase) yang mengandung protein 0,1 mg/mL. Sampel yang diperoleh sebagai berikut:
t (menit) 1 5 10 15 30C(mol/mL) 0,05 0,23 0,38 0,52 1,03
a. Tentukan aktivitas -glukosidase dalam mol/mL dan dalam mol/g. aktivitas didefinisikan sebagai mol glukosa yang dihasilkan per menit.
b. Tentukan laju reaksi awal.
Soal Latihan
2.5 Eadie (1942) mengukur laju reaksi awal pada hidrolisis asetilkolin (substrat) menggunakan serum (enzim) dan dihasilkan data sbb:
CSo (mol/L) 0,0032 0,0049 0,0062 0,0080 0,0095
ro (mol/L.mneit) 0,111 0,148 0,143 0,166 0,200
Tentukan parrameter kinetik Michaelis-Menten menggunakan metoda:a. Langmuirb. Line-Weaver Burkc. Eadie-Hofstee
Inhibisi pada reaksi enzimatik
ModulatorSubstrat yang dapat bergabung dengan enzim
Inhbitor modulator yang dapat menurunkan aktivitas enzim
Jenis Inhibisikompetitive dan nonkompetititve
Inhibisi kompetitive
Inhibitor kompetitive memiliki struktur molekul yang sangat mirip dengan substrat dan berkompetisi dengan substrat menempati sisi aktif
Mengurangi sisi aktif enzim yang dapat diisi oleh substrat
Umumnya reversibel Dapat diminimalkan dengan meningkatkan
konsentrasi substrat
Inhibisi kompetitive
E + S ESk1
k2
E + I EIk3
k4
ES E + Pk5
rp = k5 CES
CEo = CE + CES + CEI
S1
2
ES
SE Kkk
CCC
I3
4
EI
IE Kkk
CCC
MIS
Smaksp KC
Crr
I
IsMI K
C1KK
Inhibisi nonkompetitive
E + S ESk1
k2
E + I EIk3
k4
ES E + Pk9 SS
Smaks,Ip KC
Crr
EI + S EISk5
k6
ES + I ESIk7
k8
IS5
6S
1
2 Kkk
Kkk
SI7
8I
3
4 Kkk
Kkk
II
maksmaks,I K/C1
rr
Lengkapi !!
Inhibisi kompetitive vs nonkompetitive
1/r
1/Cs
1/KM
1/KMI
1/r
1/Cs1/KM
1/rmaks1/rmaks
Inhibisi kompetitive Inhibisi nonkompetitive
II
maksmaks,I K/C1
rr
SS
Smaks,Ip KC
Crr
MIS
Smaksp KC
Crr
I
IsMI K
C1KK
Pengaruh lain terhadap aktifitas
Faktor yang paling berpengaruh terhadap aktivitas enzim: pH temperatur shear
Reaktor enzimatik reaksi sederhana
Bioreaktor:
tempat berlangsungnya transformasi biokimia oleh enzim atau sel hidup
Reaktor batch = paling sederhana Dilengkapi pengaduk, pengendali pH Asumsi : pengadukan sempurna
Bio-Reaktor Batch
Pengisian : umpan dimasukkan seluruhnya sebelum reaksi berlangsung
Pengeluaran : dilakukan setelah reaksi dianggap selesai
Pereaksian : dilakukan sampai reaksi dianggap selesai
umpan
produk
Reaktor batch atau PFRKinetika reaksi: Michaelis-Menten
Reaktor batch
umpan
produk
Reaktor batch atau PFR
Suatu reaksi enzimatik memiliki rmax = 0,514 g/L.menit dan konstanta Michaelis-Menten 1,777 g/L.menit. Reaksi tersebut dilangsungkan dalam reaktor batch dengan konsentrasi awal substrat 5 g/L. Tentukan waktu yang diperlukan sampai substrat yang tersisa 1,2 g.
Bio-Reaktor PFR
F, CSo F, CSf
o p
Plug Flow Reactor = reaktor aliran sumbat = reaktor yangalirannya seperti sumbat
Umpan (reaktan) dimasukkan ke reaktor dan produk dikeluarkan secara terus menerus
: waktu ruang mirip dengan waktu reaksi untuk reaktor batch
Bio-Reaktor PFR
F, CSo F, CSf
o p
Reaktor batch atau PFR
Suatu reaksi enzimatik memiliki rmax = 0,6 g/L.menit dan konstanta Michaelis-Menten 1,5 g/L.menit. Reaksi tersebut dilangsungkan dalam reaktor batch dengan konsentrasi awal substrat 4 g/L. Berapa volume reaktor jika diinginkan konversi substrat 90% dengan laju alir 20 L/menit.
Steady state CSTR
F, CSo
F, CS
0dt
dCVrVCFFC S
SSSo
)CK)(CC(Cr1
DVF
SMSSo
Smaks
MSSo
SmaksS K
CCCr
C