kloning gen human interferon alpha 2a pada …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20334169-t32560-arizah...

UNIVERSITAS INDONESIA

KLONING GEN HUMAN INTERFERON ALPHA 2a PADA VEKTOR pET-32b(+) DAN EKSPRESI PADA Escherichia coli

TESIS

ARIZAH KUSUMAWATI 1006787092

FAKULTAS FARMASI PROGRAM S2 ILMU KEFARMASIAN

DEPOK JANUARI 2013

Kloning gen..., Arizah Kusumawati, F Farmasi, 2013

UNIVERSITAS INDONESIA

KLONING GEN HUMAN INTERFERON ALPHA 2a PADA VEKTOR pET-32b(+) DAN EKSPRESI PADA Escherichia coli

TESIS

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Farmasi

ARIZAH KUSUMAWATI 1006787092

FAKULTAS FARMASI PROGRAM STUDI S2 ILMU KEFARMASIAN

DEPOK JANUARI 2013


KATA PENGANTAR

Puji syukur saya panjatkan kepada Allah SWT, karena atas berkat dan

rahmatNya, saya dapat menyelesaikan tesis ini. Penulisan tesis ini dilakukan

dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar Magister Farmasi

pada Fakultas Farmasi Universitas Indonesia. Saya menyadari banyaknya bantuan

dan bimbingan dari berbagai pihak dari masa perkuliahan sampai pada

penyusunan tesis ini, sehingga tesis ini dapat terselesaikan. Oleh karena itu,

perkenankanlah saya dengan setulus hati mengucapkan rasa terima kasih yang

sebesar-besarnya kepada:

(1) Prof. Dr. Maksum Radji, M.Biomed., Apt. dan Dr. Adi Santoso, M.Sc.,

selaku dosen pembimbing yang telah menyediakan waktu, tenaga, dan

pikiran untuk mengarahkan saya dalam penelitian dan penyusunan tesis ini;

(2) Prof. Dr. Yahdiana Harahap, MS., Apt., selaku Dekan Fakultas Farmasi

Universitas Indonesia;

(3) Prof. Dr. Effionora Anwar, MS., Apt., selaku Ketua Program Studi S2 Ilmu

Kefarmasian Fakultas Farmasi Universitas Indonesia yang telah

memberikan dorongan untuk menyelesaikan program S2 Ilmu Kefarmasian;

(4) Dr. Amarila Malik, M.Si., Apt., Dr. Herman Suryadi, MS., Apt., dan Dr.

Mahdi Jufri, M.Si., Apt. selaku Dewan penguji yang telah banyak

memberikan penilaian maupun saran-saran untuk perbaikan dan

penyempurnaan tesis ini;

(5) Pusat Penelitian Bioteknologi Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia yang

telah memberikan kesempatan kepada saya untuk menjadi peserta tugas

belajar program pasca sarjana dan memfasilitasi saya demi kelancaran

penelitian tesis ini;

(6) Kementerian Riset dan Teknologi yang telah memberikan bantuan dana

pendidikan kepada saya untuk dapat mengikuti program tugas belajar S2

Ilmu Kefarmasian di Universitas Indonesia;

(7) Ayah, Ibu, Kakak, Mertua dan Suami yang senantiasa memberikan doa,

semangat dan kasih sayang kepada saya;


(8) Teman-teman di Laboratorium Terapetik Protein dan Vaksin atas bantuan

yang telah diberikan selama melaksanakan penelitian di Pusat Penelitian

Bioteknologi LIPI;

(9) Semua pihak yang telah memberikan bantuan hingga tesis ini dapat

diselesaikan.

Akhir kata, saya berharap Allah SWT berkenan membalas segala kebaikan

semua pihak yang telah membantu. Semoga tesis ini membawa manfaat bagi

pengembangan ilmu.

Depok, 2 Januari 2013

Penulis


ABSTRAK

Nama : Arizah Kusumawati Program Studi : S2 Ilmu Kefarmasian Judul : Kloning Gen Human Interferon Alpha 2a pada Vektor

pET-32b(+) dan Ekspresi pada Escherichia coli Interferon (IFN) merupakan sitokin yang diproduksi oleh berbagai tipe sel sebagai respon rangsangan terhadap stimulasi virus, bakteri, parasit, sel tumor, atau antigen lain. Interferon α termasuk kelompok IFN tipe I yang mempunyai berbagai efek biologis yang meliputi antiviral, antitumor dan juga sebagai immunoterapetik. Penelitian ini bertujuan untuk mensintesis protein rekombinan human IFN α2a melalui sistem ekspresi pada bakteria E. coli BL21(DE3). Pada gen human ifn α2a dilakukan penambahan situs pemotongan enzim restriksi Nco I dan Xho I menggunakan metode PCR, kemudian dilanjutkan dengan proses ligasi ke vektor pET-32b(+) dan selanjutnya ditransformasikan pada E. coli DH5α. Hasil sekuensing menunjukkan bahwa vektor rekombinan (pET-32b(+)-IFN α2a) memiliki urutan nukleotida yang benar. Vektor rekombinan ini selanjutnya ditransformasikan ke dalam E.coli BL21(DE3). Klon transforman yang diperoleh dikultur dan diinduksi dengan penambahan IPTG 1 mM sehingga mengekspresikan protein rekombinan human IFN α2a. Dari hasil isolasi, diperoleh protein rekombinan human IFN α2a dalam bentuk protein terfusi sehingga mempermudah proses deteksi dan purifikasi. Protein dikarakterisasi melalui metode SDS PAGE dilanjutkan dengan Western blot dan pewarnaan CBB. Pita protein rekombinan human IFNα2a yang diperoleh berukuran 36 kDa. Hasil maksimal ditunjukkan ekspresi pada suhu 37⁰C dengan waktu inkubasi 5 jam setelah induksi. Kata Kunci : Interferon, vektor pET-32b(+), E. coli DH5α, E. coli

BL21(DE3). xiv+74 halaman : 34 gambar; 1 tabel; 5 lampiran Daftar Pustaka : 48 (1990-2011)


ABSTRACT

Name : Arizah Kusumawati Study Program : Magister of Pharmacy Title : Cloning Human Interferon Alpha 2a Gene at pET-32b(+) Vector and Expression in Escherichia coli

Interferon (IFN) is a cytokine produced by various cell types as a response of stimulation to viruses, bacteria, parasites, tumor cells, or other antigens. Interferon α type I IFN groups have various biological effects, including antiviral, antitumor and immunotherapeutic. The aim of this research is to synthesize recombinant human IFN α2a proteins through bacterial expression systems in E. coli BL21 (DE3). Addition genes of human IFN α2a, which are restriction enzyme cutting sites for Nco I and Xho I, are added through PCR method. This step is followed by ligation process to the pET-32b(+) vector and then transformed into E. coli DH5α. The recombinant vector (pET-32b(+)-IFN α2a) has a nucleotide right sequence after it was being sequenced, after was transformed into E. coli BL21 (DE3). Obtained transformant clones were cultured and induced by addition of IPTG 1 mM to produce the expression of recombinant human IFN α2a proteins. As result of isolation process, recombinant protein of human IFN α2a are collected in fused protein thus can simplify the detection and purification method. The proteins are characterized by the SDS PAGE method followed by Western blot and CBB staining. The results show that the recombinant human IFN α2a protein bands are exactly 36 kDa. The maximum expression results were obtained at 37⁰C with 5 hours incubation after induction process.

Key Words : Interferon, pET-32b(+) vector, E. coli DH5α, E. coli BL21(DE3)

xiv+74 pages : 34 pictures; 1 tables; 5 appendices Bibliography : 48 (1990-2011)


DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ……….......................................................................... i HALAMAN PERNYATAAN BEBAS PLAGIARISME ............................... ii HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ........................................... iii HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................ iv KATA PENGANTAR ..................................................................................... v LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI ...................................................... vii ABSTRAK ....................................................................................................... viii ABSTRACT ..................................................................................................... ix DAFTAR ISI ………………………………………………….............…...... x DAFTAR GAMBAR ...………………………………………........................ xii DAFTAR TABEL ………………………………………............................... xiv DAFTAR LAMPIRAN …………………………………………................... xv BAB 1 PENDAHULUAN …………………………………........................ 1

1.1 Latar Belakang ......……………………………..….................... 1 1.2 Rumusan Masalah ………………………………..................… 2 1.3 Hipotesis ..................................................................................... 2 1.4 Tujuan Penelitian ........................................................................ 3 1.5 Manfaat Penelitian ...................................................................... 3

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA …………………….................….....……. 4

2.1 Interferon .............……....................................................…….... 4 2.2 Kloning dan Isolasi DNA ............................................................ 8 2.3 Vektor pET-32b(+) ...................................................................... 11 2.4 Manipulasi Enzimatis DNA ......................................................... 13

2.4.1 Enzim Endonuklease Restriksi .......................................... 13 2.4.2 Enzim DNA Ligase ........................................................... 14 2.4.3 Enzim DNA Polimerase ................................................... 15

2.5 Amplifikasi DNA ....................................................................... 15 2.6 Analisis DNA ............................................................................. 17

2.6.1 Pemisahan Menggunakan Gel ........................................... 17 2.6.2 Sekuensing DNA ............................................................... 18

2.7 Ekspresi Protein pada Escherichia coli ...................................... 20 2.8 Analisis Protein .......................................................................... 23

2.8.1 Western Blot ...................................................................... 23 2.8.2 Analisis Densitometri ........................................................ 23

BAB 3 METODE PENELITIAN ............................................................... 25

3.1 Tempat dan Waktu ..................................................................... 25 3.2 Bahan dan Alat .......................................................................... 25

3.2.1 Bahan ................................................................................ 25 3.2.2 Alat .................................................................................... 26

3.3 Tahap Kerja ................................................................................. 26 3.3.1 Penyiapan DNA Insert ...................................................... 26 3.3.2 Penyiapan Vektor pET-32b(+) .......................................... 29


3.3.3 Pembuatan Sel Kompeten E. coli ...................................... 29 3.3.4 Kloning Gen human ifn α2a ........................................... 30 3.3.5 Skrining dan Verifikasi Klon Transforman di E. coli DH5α ................................................................................. 31 3.3.6 Kultivasi dan Isolasi Vektor Rekombinan ........................ 31 3.3.7 Transformasi Vektor Rekombinan ke E. coli BL21(DE3) ........................................................................ 34 3.3.8 Skrining dan Verifikasi Klon Transforman di E. coli BL21(DE3) ........................................................................ 34 3.3.9 Ekspresi, Isolasi dan Karakterisasi Protein Rekombinan Human IFN α2a ................................................................. 35

BAB 4 HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................ 39 4.1 Penyiapan DNA Insert ................................................................ 39 4.2 Penyiapan Vektor pET-32b(+) .................................................. 42 4.3 Kloning Gen human ifn α2a .................................................... 44 4.4 Skrining dan Verifikasi Klon Transforman di E. coli DH5α .......................................................................................... 46 4.5 Kultivasi dan Isolasi Vektor Rekombinan .................................. 48 4.6 Transformasi Vektor Rekombinan ke E. coli BL21 BL21(DE3) ................................................................................. 53 4.7 Skrining dan Verifikasi Klon Transforman di E. coli BL21(DE3) ................................................................................. 54 4.8 Ekspresi, Isolasi dan Karakterisasi Protein Rekombinan Human IFN α2a .......................................................................... 56

BAB 5 KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 68 5.1 Kesimpulan ................................................................................. 68 5.2 Saran ........................................................................................... 68

DAFTAR PUSTAKA .................................................................................... 69


DAFTAR GAMBAR

Gambar 2.1 Gambar 2.2 Gambar 2.3 Gambar 2.4 Gambar 4.1 Gambar 4.2 Gambar 4.3 Gambar 4.4 Gambar 4.5 Gambar 4.6 Gambar 4.7 Gambar 4.8 Gambar 4.9 Gambar 4.10 Gambar 4.11 Gambar 4.12 Gambar 4.13 Gambar 4.14 Gambar 4.15 Gambar 4.16 Gambar 4.17 Gambar 4.18 Gambar 4.19 Gambar 4.20 Gambar 4.21 Gambar 4.22

Mekanisme Aksi Interferon ............................................................. Jalur Jak-Stat ………………………………………………….... Gen human interferon α2a …………………………………… ... Vektor pET-32b(+) ………...................................................... Elektroforesis Hasil PCR untuk Penyiapan DNA Insert ........... Elektroforesis Hasil Purifikasi Produk PCR dan Hasil Pemotongan Ganda dengan Enzim Nco I dan Xho I ............... .. Elektroforesis Hasil Purifikasi Metode Fenol Kloroform Setelah Pemotongan Ganda ....................................................... Elektroforesis Hasil Pemotongan Vektor pET-32b(+) ……… Elektroforesis Hasil Purifikasi Vektor pET-32b(+) Setelah Pemotongan Ganda dengan Enzim Xho I dan Nco I .................. Hasil Transformasi pada E. coli DH5α ...................................... Elektroforesis Hasil PCR dengan Primer IFN_NcoI_F dan IFN_XhoI_R pada Klon Transforman 1-11 E. coli DH5α ....... Elektroforesis Hasil PCR dengan Primer pET_Screen_F dan pET_Screen_R pada Klon Transforman 1-11 E. coli DH5α . ... Elektroforesis Hasil Miniprep Klon Transforman di E. coli DH5α ………………………………………………………. ... Elektroforesis Skrining Metode PCR Menggunakan Primer (IFN_NcoI_F dengan pET_Screen_R) dan (Primer pET_Screen_F dengan IFN_XhoI_R) pada Hasil Miniprep Klon 1, 2, 3, 4, dan Klon 11 E. coli DH5α ……………......... Elektroforesi Hasil Pemotongan Vektor Rekombinan Klon 2 .. Elektroforesis Hasil Qiagen Plasmid Maxi Kit ……………... Hasil Alignment Sekuen Klon 2 dengan Stag-18mer-primer .... Hasil Alignment Sekuen Klon 2 dengan T7terminator- primer ……………………………………….….................... Hasil Transformasi Vektor Rekombinan pada E. coli BL21(DE3) ………………………………………………….. .. Elektroforesis Hasil PCR Skrining dengan Primer pET_Screen_F dan pET_Screen_R pada Klon Transforman E. coli BL21(DE3) ..................................................................... Elektroforesis Hasil PCR Skrining dengan Primer IFN_NcoI_F dan IFN_XhoI_R pada Klon Transforman E. coli BL21(DE3) …………………………………………….. Western Blot Klon 1 Inkubasi 37⁰C IPTG 1 mM …………... Pewarnaan CBB Klon 2, 3, 6, dan 7 Inkubasi 37⁰C IPTG 1 mM ....................................................................................... Pewarnaan CBB Klon 4 dan Klon 5 Inkubasi 37⁰C IPTG 1 mM ……………………………………………………....... Pewarnaan CBB Pelet Klon 3 Inkubasi 37⁰C IPTG 1 mM .... Pewarnaan CBB Supernatan Klon 3 Inkubasi 37⁰C IPTG 1 mM ………………………………………………………..

5 6 8

12 39

40

41 42

43 45

47

47

48

495051 52

52

54

55

55 57

58

58 60

60


Gambar 4.23 Gambar 4.24 Gambar 4.25 Gambar 4.26 Gambar 4.27 Gambar 4.28 Gambar 4.29 Gambar 4.30

Western Blot Klon 3 Inkubasi 30⁰C IPTG 1 mM..................... Pewarnaan CBB Klon 3 Inkubasi 30⁰C IPTG 1 mM................ Pewarnaan CBB Pelet Klon 3 Inkubasi 28⁰C IPTG 1 mM....... Pewarnaan CBB Supernatan Klon 3 Inkubasi 28⁰C IPTG 1 mM …...……………………………………….................... Pewarnaan CBB Pelet Klon 3 Suhu 28⁰C, 30⁰C, 37⁰C IPTG 1 mM ...…………………......................................................... Western Blot Pelet Klon 3 Suhu 28⁰C, 30⁰C, 37⁰C IPTG 1 mM ……………………......................................................... Western Blot Supernatan Klon 3 Suhu 28⁰C, 30⁰C, 37⁰C IPTG 1 mM …….…….............................................................. Pewarnaan CBB Hasil Isolasi Protein dari Pelet ……………..

61 61 62

62

63

63

64 66


DAFTAR TABEL

Tabel 4.1

Hasil Kuantifikasi Tingkat Ekspresi pada Pelet dan Supernatan ……………………..............................................

65


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1 Lampiran 2 Lampiran 3 Lampiran 4 Lampiran 5

Skema Kerja Penelitian ........................................................... Vektor pcDNA3.1+:IFN-Gene ............................................... Hasil Sekuen Klon 2 E. coli DH5α dengan Stag-18mer- primer ...................................................................................... Hasil Sekuen Klon 2 E. coli DH5α dengan T7terminator- primer ...................................................................................... Nukleotida Human Interferon Alpha 2a (GenBank: DI084466.1) …………………………………………………

73 74 75 77 79


BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Interferon (IFN) adalah obat yang pada awalnya dikembangkan untuk

terapi penyakit kanker, tetapi pada saat ini interferon juga digunakan untuk

pengobatan berbagai penyakit. Terapi interferon telah digunakan secara luas untuk

pengobatan hepatitis kronis (hepatitis B dan C), kaposi’s sarkoma, dan karsinoma

lainnya (Tae-Ok Bae et al., 1995). Interferon α termasuk interferon tipe I dan

merupakan obat yang potensial untuk dikembangkan karena tingginya kebutuhan

interferon α dalam pengobatan. Interferon α memiliki berbagai efek biologis

meliputi antiviral, antitumor dan juga sebagai immunoterapetik (Brassard, 2002).

Interferon α2a merupakan bagian dari fokus produksi protein teraputik

interferon α dengan teknologi DNA rekombinan. Beberapa penelitian sebelumnya

tentang interferon α2a diantaranya adalah purifikasi dan karakterisasi rekombinan

human interferon α2a yang diproduksi dari Saccharomyces cerevisiae (Tae-Ok

Bae et al., 1995), dan efek heat shock produksi rekombinan human interferon α2a

pada Escherichia coli galur MSD462 dengan vektor ekspresi pZe0148 (Roy et al.,

2005). Pada penelitian ini akan dilakukan kloning gen human interferon α2a pada

vektor pET-32b(+) dan ekspresinya menggunakan inang Escherichia coli galur

BL21(DE3).

Sistem pET merupakan sistem yang didesain untuk kloning dan ekspresi

tingkat tinggi pada E. coli. Vektor pET-32b(+) dilengkapi dengan multipel situs

restriksi, fusi sekuen thioredoxin (Trx.Tag), histidin (His•Tag), S•Tag, serta situs

pemotongan thrombin dan enterokinase (pET Sistem Manual, 2006). Protein yang

dihasilkan dalam bentuk protein terfusi sehingga dapat memudahkan proses

deteksi dan purifikasi protein rekombinan. Tag thioredoxin pada vektor pET-

32b(+) berfungsi untuk mendukung pembentukan ikatan disulfida, meningkatkan

kelarutan protein, serta melindungi protein rekombinan terhadap agregasi yang

tidak diinginkan selama ekspresi. Tag histidin kedepannya akan digunakan untuk

purifikasi protein rekombinan. Situs pemotongan enterokinase yang terdapat di

1


vektor pET-32b(+) kedepannya akan digunakan untuk pemisahan antara fusi tag

dengan protein target setelah proses purifikasi.

Sebagian besar produk farmasi yang telah dipasarkan pada kelompok

rekombinan interferon α diproduksi dan dipurifikasi dari E. coli (Rabhi-Essafi,

2007). Inang E. coli galur BL21(DE3) dipilih sebagai sistem ekspresi karena

mempunyai berbagai keuntungan. Escherichia coli BL21(DE3) merupakan

bakteri yang umum untuk ekspresi protein yang menggunakan promotor T7. DE3

menunjukkan bahwa inang merupakan lisogen dari α prophage (DE3), oleh

karena itu membawa salinan kromosom gen T7 RNA polimerase di bawah kontrol

promotor lacUV5 yang diinduksi dengan penambahan isopropyl-1-thio-β-D-

galactopyranoside (IPTG). T7 RNA polimerase diekspresikan pada saat

penambahan IPTG yang mana akan menginduksi level ekspresi tinggi protein

pada vektor ekspresi dengan promotor T7 (Studier, 1991). Escherichia coli

BL21(DE3) merupakan inang umum yang digunakan untuk ekspresi protein

karena defisiensi protease Lon dan OmpT, yang mana kedua protease tersebut

dapat menginduksi proteolisis dari protein yang dioverekspresi (Sørensen dan

Mortensen, 2005).

1.2 Rumusan Masalah

Interferon α2a adalah salah satu agen terapetik berbasis bioteknologi yang

dibutuhkan dan mempunyai nilai ekonomi yang tinggi. Rekombinan interferon

α2a yang beredar dan digunakan di indonesia merupakan produk impor. Oleh

karena itu, sangat perlu adanya pengembangan sistem produksi rekombinan

interferon α2a di dalam negeri untuk meningkatkan kemampuan produksi bahan

obat berbasis bioteknologi serta mengurangi ketergantungan dari luar negeri. Pada

penelitian ini dilakukan kloning gen human interferon α2a pada vektor pET-

32b(+) dan ekspresi pada inang sel E. coli BL21(DE3) untuk menghasilkan

protein rekombinan human interferon α2a.

1.3 Hipotesis

Sintesis protein rekombinan human interferon α2a dapat dilakukan dengan

menggunakan gen sintetik human interferon α2a yang dikloning pada vektor pET-


32b(+) dan diekspresikan menggunakan sistem ekspresi prokariotik pada sel

bakteria E. coli BL21(DE3).

1.4 Tujuan penelitian

Tujuan umum pada penelitian ini adalah untuk mensintesis protein

rekombinan human interferon α2a melalui sistem ekspresi pada bakteria E. coli

BL21(DE3). Adapun tujuan khusus pada penelitian ini yaitu untuk mendesain

vektor rekombinan pET-32b(+)-IFN α2a dan melakukan analisis ekspresi protein

rekombinan human interferon α2a pada inang ekspresi E. coli BL21(DE3).

1.5 Manfaat Penelitian

Manfaat dari penelitian ini yaitu dihasilkannya protein rekombinan human

interferon α2a sehingga dapat diuji lebih lanjut untuk dapat digunakan dalam

pengobatan.


BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Interferon

Interferon (IFN) termasuk kelompok glikoprotein yang diproduksi oleh

berbagai tipe sel sebagai respon terhadap rangsangan yang diterima oleh sel.

Rangsangan tersebut bisa disebabkan oleh virus, bakteri, parasit, sel tumor, atau

antigen lain. Interferon mempunyai berat molekul sekitar 20-30 kDa. Interferon

juga termasuk dalam golongan sitokin seperti interleukin (ILS), colony-

stimulating factors dan growth factors. Sitokin bekerja pada reseptor spesifik di

permukaan sel dan berfungsi sebagai pengatur kelangsungan hidup sel, proliferasi

sel, diferensiasi dan aktivasi fungsional sel (Obeid dan Bouvois, 2006).

Interferon berdasarkan tipe reseptornya dikelompokkan menjadi 2 tipe.

Interferon tipe I berikatan pada reseptor tipe 1, yaitu IFN alpha (α), IFN beta (β),

IFN omega (ω), dan IFN tao (τ). Interferon tipe 2 berikatan pada reseptor tipe 2,

yaitu IFN gamma (γ). Hampir semua tipe sel memproduksi IFN tipe I. Interferon

tipe II hanya diproduksi oleh sel limfosit T dan NK-cells (Natural Killer Cells)

(Jonasch dan Haluska, 2001).

Interferon memiliki aktivitas spektrum luas dan mekanisme kerjanya

melalui interaksi yang komplek. Interferon mempunyai aktivitas antivirus,

antitumor, berpengaruh pada metabolisme dan diferensiasi sel serta memodulasi

sistem imun (Jonasch dan Haluska, 2001). Interferon dapat mencegah replikasi

virus pada sel, serta dapat mengaktifkan fungsi khusus dari sel meliputi

deferensiasi, pertumbuhan, pengekspresian antigen permukaan dan

immunoregulasi sel (Meager, 2006). Aktivitas antivirus IFN melalui mekanisme

pencegahan replikasi pada sel-sel sekitar yang terinfeksi. Pencegahan replikasi

dilakukan melalui pengikatan IFN pada reseptor permukaan membran sel yang

mengaktifkan gen-gen pengkode protein yang menghalangi replikasi virus.

Ekspresi gen pengkode IFN terjadi melalui jalur transduksi sinyal dan aktivasi

transkripsi yang dikenal dengan jalur Jak-Stat. Interferon α dan β berikatan pada

tipe reseptor yang sama, sedangkan IFN γ berikatan pada tipe reseptor yang

berbeda (Samuel, 2001).

4


Mekanisme aksi dari IFN dimulai dengan zat penginduksi IFN akan

memicu sel untuk mengaktifkan gen ifn sehingga dihasilkan mRNA yang

kemudian ditranslasikan menjadi protein IFN. Protein IFN selanjutnya

disekresikan keluar sel. Interferon ekstraseluler akan terikat ke reseptor pada

membran sel sekitarnya. Proses pengikatan IFN pada reseptor ini akan

menginisiasi sinyal kaskade JAK/STAT yang selanjutnya akan menstimulasi

ekspresi gen penghasil protein efektor. Protein efektor akan memediasi efek IFN

sebagai antivirus, anti tumor, dan imunomodulator (Pang et al., 2005). Sel yang

teraktivasi juga dapat menghasilkan protein aktivator bagi sel lain sehingga

menghasilkan protein efektor (Samuel, 2001).

Gambar 2.1 Mekanisme Aksi Interferon (Pang et al., 2005).

Jalur transduksi sinyal untuk aktivasi transkripsi dan pengekspresian gen

pengkode ifn yaitu melalui jalur Jak-Stat. Protein Signal Transducer and Activator

of Transcription (STAT) merupakan faktor transkripsi yang dapat difosforilasi

pada residu asam amino tirosin oleh enzim tirosin kinase Janus Family of

Tyrosine Kinase (JAK). Protein STAT terdiri atas tujuh macam yaitu Stat-1, Stat-

2, Stat-3, Stat-4, Stat-5a, Stat-5b dan Stat-6. Protein JAK terdiri 4 macam yaitu

Jak-1, Jak-2, Jak-3 dan Tyk-2 (Samuel, 2001).

Proses transduksi sinyal diinisiasi oleh pengikatan IFN pada subunit

reseptor tirosin kinase. Pengikatan IFN akan mengaktivasi faktor transkripsi Jak

dan Stat melalui fosforilasi tirosin. Kinase Jak-1 dan Tyk-2 yang teraktivasi oleh


IFN α dan IFN β akan menghasilkan fosforilasi dan dimerisasi protein Stat-1

(p91) dan Stat-2 (p113) yang selanjutnya ditranslokasi bersama IRF-9 (p48) ke

inti sel. Komplek ketiga protein ini disebut dengan IFN-Stimulated Gene Factor 3

(ISGF 3) yang dapat mengaktifkan gen-gen pengkode ifn α dan β melalui IFN-

Stimulted Response Element (ISRE). Pada IFN γ kinase Jak-1 dan Jak-2 yang

teraktivasi akan memfosforilasi dan menyebabkan homodimerisasi protein Stat-1

yang kemudian ditranslokasi ke inti sel. Komplek dimer ini disebut dengan Jak-1

dan Gamma Activation Factor (GAF) yang mengaktifkan gen-gen pengkode ifn γ.

Komplek GAF akan mengaktivasi gen-gen IFN γ melalui elemen Gamma-

Activated Sequence (GAS) (Samuel, 2001).

Gambar 2.2 Jalur Jak-Stat (Samuel, 2001).

Interferon α dan β dibentuk oleh berbagai sel sebagai reaksi terhadap

infeksi viral, bakteri, mikoplasma dan protozoa. Interferon α diproduksi oleh

leukosit dan IFN β dipoduksi oleh fibroblas. Kedua IFN tersebut sama-sama

dikodekan oleh gen yang terletak pada kromosom 9 manusia. Interferon α dan β

berfungsi sebagai virustatis yaitu mencegah infeksi lebih lanjut dengan cara

menduduki reseptor-reseptor khas pada membran sel normal sehingga tidak dapat


dipenetrasi oleh virus. Kedua IFN tersebut juga bersifat sitostatis yaitu

menghambat pertumbuhan sel-sel tumor dan menstimulasi makrofag serta NK-

cells (Natural Killer Cells) yang mana dapat mendeteksi sel-sel tumor dan sel-sel

yang diinvasi virus dan kemudian menghancurkannya. Interferon α digunakan

untuk pengobatan pada hepatitis dan jenis leukimia tertentu. Interferon β

digunakan pengobatan pada penyakit multiple sclerosis (Tan Hoan Tjay, 2007).

Interferon gamma (IFN γ) diproduksi oleh limfosit T dan NK-cells dengan

gen pengkode ifn γ terletak pada kromosom 12 manusia. Gen ifn γ memiliki 3

intron dan terdiri dari 146 asam amino dengan kandungan karbohidrat 30%

(Arbabi, 2003). Interferon γ berfungsi sebagai immunostimulator (Tan Hoan Tjay,

2007). Interferon γ memiliki daya antiviral lebih lemah dibandingkan IFN α dan

IFN β. Aktivitas biologis dari IFN γ juga dapat mencegah pertumbuhan sel

neoplastik (Arbabi, 2003).

Interferon α merupakan glikoprotein yang terdiri atas 165 asam amino

dalam bentuk 2a dan 2b dengan masing-masing asam amino lisin dan arginin pada

posisi 23. Interferon α memiliki dua ikatan disulfida yaitu antara Cys1 ke Cys98

dan Cys29 ke Cys138 (Tae-ok Bae et al., 1995). Interferon β adalah glikoprotein

yang terdiri atas 165 asam amino dalam bentuk 1a dan 1b dengan masing-masing

asam amino sistein dan serin pada posisi 17. Interferon γ adalah glikoprotein yang

terdiri atas 140 asam amino dengan bentuk 1a dan 1b yang memiliki masing-

masing asam amino glutamin atau arginin diposisi 137 (Tan Hoan Tjay, 2007).

Interferon α2a merupakan subtipe dari IFN α yang terdiri atas 165 asam

amino sistein dengan 4 sistein dan 2 ikatan disulfida. Interferon α2a adalah

glikoprotein dengan berat molekul sekitar 19.000 dalton (Tae-Ok Bae et al.,

1995). Struktur 3 dimensi protein IFN α2a yang ditentukan menggunakan

spektroskopi nuclear magnetic resonance (NMR) pada pH 3,5 menunjukkan

bahwa IFN α2a sebagian besar mengandung alpha heliks (6 alpha heliks, 65%

alpha heliks) dalam struktur sekunder dan sisanya adalah kumparan koil dan loop

(Klaus et al., 1997).


Gambar 2.3 Gen human interferon α2a.

(http://www.roche-australia.com/fmfiles/re7229005/downloads/anti-virals/roferon-pi.pdf)

Penggunaan IFN α2a telah disetujui oleh FDA (Food and Drug

Administration) untuk pengobatan non-hodgkin’s lymphoma (NHL), hairy cell

leukemia, chronic myelogenous leukemia (CML), AIDS-related kaposi’s sarcoma,

dan hepatitis C kronis (Jonasch dan Haluska, 2001). Banyak upaya yang telah

dilakukan untuk kloning dan ekspresi rekombinan human IFN α2a pada berbagai

mikroorganisme. Beberapa studi mengenai IFNα2a diantaranya dilakukan oleh

Tae-Ok Bae et al. (1995) purifikasi dan karakterisasi rekombinan human IFN α2a

yang diproduksi dari Saccharomyces cerevisiae, dan Roy et al. (2005) efek heat

shock produksi rekombinan IFN α2a pada Escherichia coli galur MSD462 dengan

vektor ekspresi pZe0148. Pada penelitian ini akan dilakukan kloning gen human

ifn α2a pada vektor pET-32b(+) dan ekspresinya menggunakan inang E. coli galur

BL21(DE3).

2.2 Kloning dan Isolasi DNA

Kloning DNA (deoxyribonucleic acid) merupakan proses penggandaan

jumlah DNA rekombinan yang dapat melalui proses perkembangbiakan sel

bakteri, sel ragi, sel mamalia (Muladno, 2010). Kloning DNA merupakan teknik


DNA rekombinan yang memungkinkan untuk dibuatnya satu DNA tertentu dalam

jumlah besar dan murni. Metode kloning DNA melibatkan ligasi sekuen tertentu

misalnya gen manusia ke dalam vektor. Vektor merupakan urutan DNA yang

terdapat di dalam satu sel, tetapi bukan merupakan bagian dari genom sel.

Pembawa kloning dengan DNA yang diklon di dalamnya akan diperbanyak dalam

sel inang untuk menghasilkan sejumlah besar DNA dengan urutan spesifik yang

kemudian dilakukan isolasi untuk studi selanjutnya (Grompe et al., 1998).

Vektor adalah DNA untai ganda sirkuler yang ukurannya kecil (2000-5000

pb) yang dapat bereplikasi di dalam sel inang. Vektor berdasarkan jumlah

salinannya dibedakan menjadi dua yaitu vektor dengan jumlah salinan tinggi dan

salinan rendah. DNA vektor murni dapat dipisahkan dari DNA genom sel inang,

karena DNA vektor memiliki ukuran jauh lebih kecil. Ukuran DNA genom sel

inang memiliki ukuran yang besar misalnya pada genom E. coli 1x106 pb. Vektor

memiliki origin of replication (ORI) sendiri sehingga mampu memperbanyak diri

dengan bantuan mesin-mesin seluler endogen. Vektor kloning juga memiliki

marka untuk seleksi yang umumnya berupa gen yang membawa resistensi

terhadap antibiotika tertentu. Hanya klon rekombinan yang mengandung vektor

maka yang akan mampu tumbuh dalam media yang mengandung antimikroba

tertentu (Grompe et al., 1998).

Vektor modern saat ini telah direkayasa sehingga memiliki beberapa situs

restriksi (polylinker sites). Vektor pada saat sekarang ini telah dibuat mempunyai

jumlah salinan tinggi dan memiliki ukuran 3 kb sehingga dapat menerima DNA

sisipan sampai 15 kb. Kebanyakan DNA yang diklon ke dalam vektor berukuran

relatif kecil kurang dari 10 kb, karena ukuran DNA yang jauh lebih besar biasanya

tidak stabil. Oleh karena itu, juga dikembangkan vektor kloning yang dapat

membawa DNA dengan ukuran besar diantaranya vektor kloning faga (phage),

kosmid, Bacterial Artificial Chromosomes (BAC) dan Yeast Artificial

Chromosomes (YAC) (Grompe et al., 1998).

Prosedur kloning suatu gen tertentu didahului dengan pemotongan DNA

vektor dengan menggunakan enzim restriksi, sehingga DNA vektor sirkuler

terbuka dan menjadi linier. DNA untai ganda linier lain yang diinginkan dibuat

dengan ujung-ujungnya sesuai untuk diligasikan ke dalam celah sehingga


terbentuk kembali vektor sirkuler yang mengandung insert. Vektor rekombinan

yang diperoleh kemudian akan dimasukkan ke dalam sel inang melalui proses

transformasi (Grompe et al., 1998).

Proses pemasukan molekul DNA ke dalam sel disebut transformasi karena

masuknya molekul DNA ke dalam sel dapat mengubah fenotip sel tersebut

(Muladno, 2010). Proses transformasi pada bakteri dapat dilakukan dengan cara

memanaskan campuran DNA dan sel bakteri yang kompeten pada suhu 42⁰C

selama 1 menit (heat shock) atau dengan memberikan aliran listrik

(electroporation), sehingga DNA vektor rekombinan dapat melalui dinding

bakteri kemudian masuk ke dalam sel bakteri. Setelah proses transformasi selesai,

bakteri ditumbuhkan pada media agar yang mengandung marka antibiotik. Pada

kondisi ini, hanya sel yang mengandung vektor rekombinan yang dapat tumbuh

dan membentuk koloni. Tiap koloni bakteri ini disebut klon, tiap klon

diperbanyak dalam media cair untuk dilakukan isolasi DNA dalam jumlah besar.

Klon yang mengandung vektor rekombinan merupakan sumber DNA yang

permanen, karena sel bakteri tidak mati dan dapat terus menerus membelah tanpa

batas (Grompe et al., 1998).

Isolasi DNA terdiri dari beberapa tahap yaitu (1) kultivasi sel dalam media

yang sesuai; (2) pemecahan dinding sel; (3) ekstraksi DNA; (4) purifikasi DNA.

Proses pemecahan dinding sel bakteri dapat dilakukan secara fisik dengan cara

sonikasi maupun secara kimia dengan menggunakan enzim lisozim, etilendiamin

tetra asetat (EDTA), dan sodium diodesil sulfat (SDS). Seteleh dinding sel lisis,

dilanjutkan pemisahan debris sel menggunakan metode disentrifus. Metode

disentrifus digunakan untuk memisahkan antara komponen sel yang tidak larut

akan mengendap dan ekstrak sel dalam supernatan yang jernih. Ekstrak sel dalam

supernatan selain mengandung DNA juga masih mengandung protein dan RNA,

sehingga perlu untuk dimurnikan (Radji, 2011).

Proses pemurnian DNA yang umumnya dilakukan yaitu dengan

penambahan larutan fenol ataupun dengan campuran fenol kloroform dengan

perbandingan 1:1, untuk mengendapkan protein dengan cara disentrifus dan

dihancurkan secara enzimatis dengan proteinase. Pemurnian DNA selanjutnya

dengan penambahan RNAse untuk membersihkan DNA dari RNA. Molekul DNA


yang diperoleh kemudian dilakukan presipitasi menggunakan etanol absolut

disimpan pada suhu -20⁰C, kemudian disentrifus untuk mengendapkan DNA dan

mempermudah pemisahan (Radji, 2011).

2.3 Vektor pET-32b(+)

Sistem pET adalah sistem unggul yang dikembangkan untuk kloning dan

ekspresi protein rekombinan pada E. coli. Studier et al. (1990) pertama kali

menjelaskan tentang sistem ekspresi pET, yang mana telah dikembangkan untuk

berbagai aplikasi ekspresi. Lebih dari 40 jenis vektor pET yang berbeda tersedia

secara komersial (pET Sistem Manual, 2006). Sistem pET mencakup promotor

hibrid, multipel situs kloning yang tergabung dengan fusi yang berbeda, situs

pemotongan protease, dan modifikasi latar belakang genetik dari vektor pBR322

untuk berbagai tujuan ekspresi (Sørensen dan Mortensen, 2005).

Vektor pET-32b(+) merupakan sistem yang dilengkapi dengan multipel

situs restriksi dan terdapat fusi sekuen thioredoxin (Trx.Tag), histidin (His•Tag),

S•Tag, serta situs pemotongan thrombin dan enterokinase (pET Sistem Manual,

2006). Protein yang dihasilkan dalam bentuk protein terfusi sehingga

memudahkan untuk proses deteksi dan purifikasi protein rekombinan. Tag

thioredoxin berfungsi untuk mendukung pembentukan ikatan disulfida dan

meningkatkan kelarutan protein. Tag histidin 6x pada terminal N dan terminal C

berfungsi untuk deteksi protein target menggunakan metode Western blot. Tag

histidin juga dapat digunakan untuk purifikasi protein target menggunakan

Immobilized metal-affinity chromatography (IMAC) dengan matriks Ni2+-NTA,

Co2+-CMA (Talon) dan dielusi menggunakan imidazol (Terpe, 2002). Fusi

peptida S•Tag dapat digunakan untuk uji kuantitatif, deteksi menggunakan metode

Western blot serta purifikasi protein rekombinan berdasarkan metode pemisahan

afinitas. Situs pemotongan enterokinase digunakan untuk pemisahan antara fusi

tag dan protein target setelah proses purifikasi.


Gambar 2.4 Vektor pET-32b(+).

(https://wasatch.biochem.utah.edu/chris/links/pET32.pdf)

Sistem pET dapat mengekspresikan protein tingkat tinggi karena

mekanisme ekspresinya dikontrol dengan menggunakan promotor T7lac, inang

pET-32b(+) (5899 pb)


dengan pylsS, serta penambahan glukosa ke media berdasarkan karakteristik

protein target. PlysS pada inang ekspresi berfungsi untuk meningkatkan toleransi

λDE3 lisogen untuk vektor dengan insert yang toksik, serta vektor menjadi lebih

stabil. Vektor pET-32b(+) memiliki promotor T7lac dengan sekuen lac operator

downstream dari promotor T7. Vektor juga membawa sekuen pengkode untuk

represor lac (lacI) dengan orientasi dari promotor T7lac dan lacI berbeda. Vektor

apabila digunakan dalam DE3 lisogen, maka represor lac beraksi di promotor

lacUV5 dalam kromosom inang untuk menekan transkripsi gen T7 RNA

polimerase dan juga pada promotor T7lac dalam vektor untuk memblokir

transkripsi gen target (pET Sistem Manual, 2006).

Vektor rekombinan ditransformasikan ke dalam galur sel E. coli yang

kromosomnya mempunyai salinan gen untuk T7 RNA polimerase (T7 gen 1)

untuk memproduksi protein. Inang dengan galur DE3 lisogen dipilih karena

defisiensi protease, auksotrof asam amino, dapat meningkatan kelarutan, dan

suplementasi kodon yang jarang (rare codon) (pET Sistem Manual, 2006).

Escherichia coli galur BL21(DE3) adalah inang yang umum untuk ekspresi

protein yang menggunakan promotor T7. DE3 menunjukkan bahwa inang

merupakan lisogen dari α prophage (DE3), oleh karena itu membawa salinan

kromosom dari gen T7 RNA polimerase di bawah kontrol promotor lacUV5 yang

diinduksi dengan penambahan isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside (IPTG).

Escherichia coli BL21(DE3) adalah inang yang paling banyak digunakan untuk

ekspresi protein karena defisiensi protease Lon dan OmpT (Sørensen dan

Mortensen, 2005).

2.4 Manipulasi Enzimatis DNA

Manipulasi DNA dapat dilakukan secara enzimatis dengan menggunakan

berbagai macan enzim diantaranya yaitu :

2.4.1 Enzim Endonuklease Restriksi

Enzim endonuklease restriksi umumnya diperoleh dari bakteri, yang mana

dapat mengenal DNA untai ganda dengan urutan basa spesifik serta memotong

pada tempat yang tertentu. Enzim endonuklease restriksi berfungsi untuk

membatasi masuknya DNA asing dengan cara memotong DNA pada situs


restriksi yang tidak terdapat pada bakteri. Setiap enzim endonuklease restriksi

dapat mengenal, mengikat dan memotong urutan basa tertentu. Urutan basa yang

dipotong biasanya terdiri dari 4-8 pasang basa (pb), dan enzim endonuklease

restriksi hanya memotong DNA yang mempunyai urutan basa yang benar-benar

persis dengan kode tersebut. Sebagai contohnya yaitu urutan basa yang dikenal

oleh enzim EcoRI adalah GAATTC. Semua situs yang memiliki urutan basa

GAATTC akan dipotong oleh enzim EcoR1, namun jika ada satu basa yang

berbeda misalnya CAATTC maka mampu mencegah terjadinya pemotongan.

Proses pemotongan DNA dengan enzim endonuklease restriksi dapat

menghasilkan potongan asimetris 5' atau 3' terbuka sehingga ujungnya kohesif

(sticky end), ataupun potongan simetris sehingga ujungnya tumpul (blunt end)

(Grompe et al., 1998).

Enzim endonuklease restriksi diberi nama sesuai dengan bakteri

penghasilnya, misalnya EcoRI berasal dari Escherichia coli. Penggunaan enzim

restriksi adalah dengan menginkubasi enzim bersama-sama dengan DNA dalam

larutan bufer yang sesuai, sehingga akan dihasilkan potongan-potongan DNA

dengan ukuran tertentu. Pemotongan enzim restriksi bersifat spesifik untuk urutan

basa tertentu, sehingga DNA yang berbeda akan menghasilkan pola pemotongan

yang khas. Pola yang khas ini dapat diketahui setelah dilakukan elektroforesis gel

dan pewarnaan sehingga fragmen DNA yang berbeda-beda ukurannya dapat

terlihat (Grompe et al., 1998). Enzim endonuklease restriksi sangat bermanfaat

diaplikasian pada teknologi DNA rekombinan karena sangat selektif dalam

memotong untai DNA (Radji, 2011).

2.4.2 Enzim DNA Ligase

Enzim DNA ligase adalah enzim yang berfungsi mengikatkan dua potong

DNA secara kovalen (Grompe et al., 1998). Enzim DNA ligase merupakan enzim

yang terdapat pada sistem biologis yang dapat mengkatalis pembentukan ikatan

kovalen yang merekatkan kembali potongan fragmen-fragmen DNA. Enzim DNA

ligase adalah salah satu enzim yang sangat penting dalam perkembangan

teknologi DNA rekombinan (Radji, 2011). Enzim DNA ligase ini terutama

digunakan untuk menyisipkan sepotong DNA ke dalam vektor kloning. Enzim

DNA ligase yang paling banyak digunakan adalah T4 DNA ligase. Reaksi ligasi


terjadi antara gugus 3'OH dari salah satu untai DNA dengan gugus fosfat dari

untai DNA pasangannya. Reaksi ligasi menggunakan ATP sebagai sumber energi

(Grompe et al., 1998).

Proses ligasi menggunakan T4 DNA ligase memerlukan kofaktor ATP

yang kemudian membentuk kompleks enzim-AMP. Kompleks ini menempel dan

menyambung gugus 5'-fosfat dan 3'-hidroksi dengan ikatan kovalen sehingga

terbentuk rantai fosfodiester (Sudjadi, 2008). Ligasi DNA hanya dapat terjadi

antara dua ujung fragmen DNA yang kompatibel. Kompatibilitas inilah yang

digunakan untuk mengatur ligasi beberapa fragmen DNA yang berbeda secara

sekaligus dalam satu campuran reaksi (Grompe et al., 1998). Proses

penyambungan fragmen DNA dengan ujung kohesif dengan enzim DNA ligase

cukup efisien dan telah banyak digunakan dalam pembuatan vektor rekombinan.

Pada fragmen DNA dengan ujung tumpul memerlukan kondisi ligasi yang spesial,

yaitu kadar fragmen DNA harus tinggi dan larutan reaksi agak kental sehingga

gerakan molekul lebih lambat (Sudjadi, 2008).

2.4.3 Enzim DNA Polimerase

Enzim DNA polimerase adalah enzim yang menggunakan satu DNA untai

tunggal sebagai cetakan (template) untuk mensintesis untai kedua yang

komplemen dengan cetakannya. Enzim DNA polimerase membutuhkan primer

dalam mensintesis DNA baru dari arah 5' ke 3'. Primer adalah sepotong kecil

DNA yang komplemen terhadap untai DNA yang akan disalin, polimerase

melekat pada primer dan kemudian akan memperpanjang primer dengan cara

menambahkan blok-blok deoksinukleotida dari arah 5' ke 3' (Grompe et al., 1998).

Primer merupakan oligonukleotida rantai pendek yang dibuat secara sintetik dan

umumnya memiliki panjang 15-32 pasang basa. Enzim DNA polimerase memiliki

aktivitas optimal pada suhu 92-95⁰C dan digunakan dalam polymerase chain

reaction (PCR) (Radji, 2011).

2.5 Amplifikasi DNA

Amplifikasi atau perbanyakan DNA untai ganda selain dengan

menggunakan vektor kloning dalam sel inang hidup juga dapat dilakukan dengan

metode polymerase chain reaction (PCR). Dengan menggunakan metode PCR


mampu diperoleh DNA dalam jumlah besar dan murni secara kimia. Metode PCR

memungkinkan untuk dibuat sejumlah besar DNA dengan urutan basa tertentu

dalam waktu yang singkat dan tanpa kloning. Sejumlah kecil DNA untai tunggal

dapat disintesis dari nukleotida tunggal dengan bantuan oligonukleotida (Grompe

et al., 1998). Metode PCR merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk

mengamplifikasi fragmen DNA secara in vitro. Teknik PCR dapat meningkatkan

jumlah fragmen DNA hingga mencapai 106-107 kali dalam waktu singkat (Radji,

2011).

Prosedur PCR menggunakan DNA polimerase yang tahan terhadap panas

(thermostable) dan dua primer oligonukleotida sintetik. Urutan DNA gen yang

akan diamplifikasi harus diketahui sebagian sehingga dapat dibuat primer yang

membatasi ujung DNA target. Prosedur PCR terdiri dari 3 tahap yaitu: (1)

denaturasi DNA untai ganda, (2) penempelan primer ke DNA (annealing), dan (3)

memperpanjang primer (extension) (Grompe et al., 1998). Ketiga tahapan siklus

tersebut diatas diulang sesuai dengan jumlah siklus amplifikasi yang akan

dilakukan (Radji, 2011).

Pada tahap denaturasi terjadi pemanasan pada suhu 94-98⁰C, yang mana

bertujuan untuk memisahkan untai ganda DNA target menjadi untai tunggal.

Untai tunggal lalu siap dihibridisasikan dengan oligonukleotida yang sesuai pada

proses annealing. Pada proses annealing temperatur diturunkan sampai di bawah

titik leleh hibrid DNA-oligonukleotida yaitu pada suhu sekitar 50-68⁰C. Tahapan

selanjutnya yaitu setelah primer menempel maka enzim DNA polimerase dapat

menyalin urutan DNA untai tunggal pada temperatur 72⁰C (extension), dengan

deoksinukleotida trifosfat (dNTP) yang tersedia. Setiap untai DNA target yang

ada sejak awal akan disalin dan jumlah DNA akan menjadi dua kali lipat pada

akhir tiap siklus. Jadi, setelah 25-30 siklus maka urutan DNA yang diinginkan

diperbanyak sampai jutaan kali lipat. DNA hasil PCR dapat divisualisasikan

sebagai pita (band) pada gel agarosa dengan pengecatan menggunakan etidium

bromida (EtBr), dan selanjutnya dapat digunakan untuk kloning ataupun

sekuensing DNA. Perubahan temperatur berturut-turut pada PCR dilakukan pada

mesin thermocycler. Satu kali proses PCR biasanya selesai dalam jangka waktu 3


jam. Oleh karena itu, metode PCR merupakan metode tercepat untuk membuat

DNA tertentu untuk dilakukan studi lebih lanjut (Grompe et al., 1998).

Keterbatasan dari metode PCR diantaranya yaitu adanya salah

menambahkan nukleotida oleh enzim Taq polimerase (Taq error) dan

ketidakmampuan untuk mengamplifikasi fragmen DNA yang besar. Modifikasi

Taq generasi baru yang mampu mengamplifikasi sampai 20 kb dengan tingkat

fidelitas tinggi dapat mengurangi kesalahan PCR dan meningkatkan kemampuan

amplifikasi. Kegunaan PCR diantaranya yaitu: (1) untuk mengamplifikasi DNA

pada daerah tertentu sebagai strategi rekayasa genetik; (2) memperbanyak DNA

genom untuk keperluan diagnostik; (3) memperbanyak DNA untuk sekuensing;

(4) untuk memnyisipkan atau membuat mutasi (site directed mutagenesis); (5)

dikombinasikan dengan reverse transcription untuk mengkuantifikasi jumlah

mRNA awal (RT-PCR) (Grompe et al., 1998).

2.6 Analisis DNA

Analisis DNA dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai metode

diantaranya yaitu :

2.6.1 Pemisahan Menggunakan Gel

Teknik dasar pemisahan DNA dan RNA menggunakan elektroforesis pada

sistem gel berdasarkan prinsip perbedaaan ukuran. DNA dan RNA pada pH netral

bermuatan negatif dan akan bermigrasi ke arah anoda. Pada saat migrasi pada

matriks polimer gel, maka fragmen kecil akan bergerak lebih cepat daripada

fragmen yang besar. Migrasi elektroforetik melalui gel akan dapat memisahkan

campuran fragmen DNA sehingga tampak sebagai pita-pita yang berbeda

ukurannya. Matriks gel yang dapat dipakai untuk pemisahan asam nukleat

diantaranya yaitu gel agarosa dan gel poliakrilamid. Gel agarosa dapat digunakan

untuk pemisahan fragmen DNA berukuran 0.1-20 kb, sedangkan poliakrilamid

untuk fragmen DNA berukuran 0.025-2 kb (Grompe et al., 1998). Gel agarosa

mempunyai daya pemisahan lebih rendah dibandingkan dengan gel poliakrilamid,

tetapi mempunyai rentang pemisahan yang lebih besar. Gel agarosa biasanya

dilakukan dalam konfigurasi horisontal dalam kekuatan medan listrik dan arah

tetap (Sudjadi, 2008).


Gel agarosa dibuat dengan melarutkan serbuk agarosa dalam bufer

kemudian dipanaskan dan lalu dituang pada cetakan dan didiamkan sampai

dingin. Setelah dingin dan mengeras, agarosa membentuk matriks dengan

kerapatan yang ditentukan oleh konsentrasi agarosa. Jika medan magnet diberikan

antara kedua ujung gel, maka DNA yang bermuatan negatif pada pH netral dan

bergerak ke anoda. Kecepatan migrasi dari DNA tergantung dari ukuran (panjang)

DNA, konformasi DNA, konsentrasi agarosa, dan besaran tegangan yang

digunakan (Sudjadi, 2008). Fragmen DNA yang telah dipisahkan dengan

elektroforesis gel dapat divisualisasikan dengan cara pewarnaan gel setelah

elektroforesis selesai sehingga fragmen DNA dapat terlihat. Pewarna yang

biasanya digunakan adalah etidium bromida yang mana dapat mengikat DNA dan

akan berfluoresensi merah dibawah sinar UV (Grompe et al., 1998).

Akrilamid merupakan suatu monomer yang digunakan dalam pembuatan

gel akrilamid, yang ditambahkan amonium persulfat dan distabilkan oleh

TEMED, maka terjadi reaksi berantai sehingga monomer terpolimerisasi menjadi

rantai panjang. Jika dalam reaksi terdapat bisakrilamid, maka reaksi menjadi

bersambung melintang menjadi gel yang pori-porinya ditentukan oleh panjang

rantai dan jumlah sambungan silang. Gel poliakrilamid dibuat dengan cara

menuangkan antara dua lempeng kaca yang dipisahkan dengan pembatas dengan

ketebalan tertentu. Elektroforesis gel poliakrilamid yang digunakan untuk

memisahkan protein dengan sistem vertikal (Sudjadi, 2008).

2.6.2 Sekuensing DNA

Sekuensing adalah analisis DNA yang paling detil karena menggunakan

penentuan urutan basa-basa nukleotida. Teknik sekuensing DNA merupakan salah

satu teknik yang penting dalam teknologi DNA rekombinan karena sangat

bermanfaat untuk menentukan urutan basa nukleotida suatu gen ataupun sekuen

genom total suatu sel atau organisme. Teknik sekuensing DNA untuk pengurutan

basa DNA terdiri 2 macam cara yaitu (1) cara degradasi kimiawi oleh A. Maxam

dan W. Gilbert di Amerika, dan (2) cara determinasi rantai oleh F. Sanger dan

A.R. Coulson di Inggris (Radji, 2011).

Metode penghentian rantai dengan dideoksi (dideoxy chain termination)

yang dikembangkan oleh Sanger merupakan metode yang paling banyak


digunakan. Pada mulanya DNA didenaturasi dan dipisahkan menjadi untai

tunggal dengan cara pemanasan. Satu primer oligonukleotida yang telah dilabel

radioaktif ditambahkan ke dalam reaksi dan akan menempel pada sekuen

pasangannya pada DNA target. DNA polimerase digunakan untuk menyalin DNA

untai tunggal. Penambahan dNTP dalam jumlah banyak dan sampai jenuh akan

menghasilkan produk ekstensi dengan ujung terlabel radioaktif, tetapi tidak

menghasilkan informasi urutan basa. Penambahan sedikit ddNTP ke dalam

campuran dNTP akan dapat memberikan informasi urutan basa DNA.

Dideoksinukleotida akan terinkorporasi pada ujung 3' untai DNA yang baru

disintesis. DNA polimerase tidak dapat menambahkan basa baru pada ddNTP,

sehingga inkorporasi ddNTP akan mengakibatkan penghentian sintesis rantai

DNA. Penambahan dNTP dan ddNTP dengan rasio yang tepat memungkinkan

untuk menghentikan sintesis rantai DNA pada tiap posisi nukleotida (Grompe et

al., 1998).

Sebagai contohnya, jika ektensi primer dilakukan menggunakan dATP,

dTTP, dGTP dan ddCTP, maka polimerase akan mensintesis untai DNA baru

sampai harus menggunakan ddCTP. Inkorporasi ddCTP pada titik ini

menyebabkan DNA polimerase tidak dapat melanjutkan ekstensi. Dengan

demikian, panjang produk hasil ekstensi yang terlabel radioaktif menentukan

posisi G pertama yang disalin. Untuk menentukan posisi G yang lainnya, maka

reaksi sekuensing yang sebenarnya dilakukan dengan menggunakan campuran

dCTP dan ddCTP dengan perbandingan ~200:1. Pada kondisi ini kemungkinan

terjadi penghentian rantai DNA adalah ~1:200 yang terjadi ketika terdapat G pada

DNA yang disekuensing. Hasilnya akan diperoleh produk ekstensi dengan

berbagai panjang, yang kemudian divisualisasi dengan elektroforesis pada gel

poliakrilamid. Berdasarkan pada panjang produk, maka tiap fragmen akan

menentukan posisi satu G. Untuk menentukan posisi keempat basa, empat reaksi

sekuensing dilakukan untuk tiap sampel. Pada tiap reaksi dicampurkan dNTP dan

ddNTP yang sesuai dikombinasi dengan 3 dNTP lainnya dalam konsentrasi jenuh.

Keempat reaksi sekuensing kemudian dielektroforesis bersebelahan pada gel

(poliakrilamid denaturasi), sehingga hasil sekuens DNA dapat langsung dibaca

(Grompe et al., 1998). Berdasarkan perbedaan migrasi masing-masing fragmen


DNA, maka akan dapat ditentukan urutan basa-basa DNAnya. Hasil sekuensing

DNA merupakan urutan basa yang komplementer terhadap urutan basa-basa yang

terbaca pada hasil elektroforesis (Radji, 2011).

Perkembangan teknologi modern dewasa ini telah memungkinkan

dilakukannya automatisasi sekuensing DNA. Perkembangan peralatan yang ada

pada saat ini telah memungkinkan dapat membaca hasil sekuensing secara

langsung dan sekaligus menyimpan data ke dalam database komputer. Adanya

automasisasi dapat mengurangi faktor kesalahan yang sering terjadi dalam

pembacaan dan pemulisan urutan DNA secara manual. Mesin sekuensing

sekarang telah menggunakan fluoresen sebagai pengganti radioaktif. Senyawa

fluoresen dapat diinkorporasikan ke dalam primer sekuensing atau ke dalam

nukleotida. Pada sekuensing manual menggunakan elektroforesis gel atau

elektroforesis kapiler untuk memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukurannya.

Pada sekuensing otomatis deteksi fragmen DNA yang berfluoresensi dilakukan

dengan bantuan sinar laser dan sinyal diproses oleh komputer (Grompe et al.,

1998).

2.7 Ekspresi Protein pada Escherichia coli

Pemilihan sistem ekspresi untuk produksi protein rekombinan tergantung

pada banyak faktor. Faktor-faktor tersebut diantaranya karakteristik pertumbuhan

sel, tingkat ekspresi, modifikasi pascatranslasi, aktivitas biologis protein, dan

regulasi produksi protein terapetik (Hodgson, 1993). Dalam pemilihan sistem

ekspresi juga perlu mempertimbangkan rincian biaya dalam proses, desain, dan

pertimbangan ekonomi lainnya (Makrides, 1996). Inang E. coli. merupakan inang

pertama yang digunakan untuk kloning dan ekspresi protein rekombinan. Inang E.

coli baik digunakan untuk ekspresi protein intraseluler yang relatif kecil dan tidak

memerlukan modifikasi pascatranslasi yang terlalu banyak untuk membuat protein

tersebut fungsional. Keuntungan sistem ekspresi pada E. coli diantaranya yaitu

mudah untuk dilakukan manipulasi DNA rekombinan serta proses seleksi dan

ekspresi yang cepat (Grompe et al., 1998).

Tidak setiap gen dapat diekspresikan secara efisien pada organisme E.

coli. Hal ini bisa disebabkan oleh sekuen gen yang unik, stabilitas dan efisiensi


translasi mRNA, kemudahan dalam folding protein, degradasi protein oleh

protease sel inang, perbedaan besar dalam penggunaan kodon antara gen asing

dan di E. coli, serta potensi toksisitas protein ke inang. Kelemahan E. coli sebagai

sistem ekspresi mencakup ketidakmampuannya untuk melakukan banyak

modifikasi pascatranslasi pada protein eukariotik, kurangnya mekanisme sekresi

untuk efisiensi pelepasan protein ke dalam medium kultur, serta keterbatasan

kemampuan untuk memfasilitasi pembentukan ikatan disulfida yang luas. Di sisi

lain, banyak protein eukariot yang masih memiliki aktivitas biologis dalam bentuk

nonglikosilasi dan oleh karena itu dapat diproduksi dalam E. coli (Fuh et al.,

1990).

Sistem ekspresi protein rekombinan E. coli merupakan sistem pilihan

untuk produksi IFN α mengingat gen ifn α tidak memiliki intron, dan IFN α non

glikosilasi telah diketahui bioaktif. Escherichia coli dapat ditumbuhkan mencapai

kepadatan sel yang tinggi, dan galur yang digunakan untuk produksi protein

rekombinan umumnya adalah aman. Escherichia coli juga dapat menjadi pilihan

untuk fermentasi skala besar. Sebagian besar produk farmasi yang telah

dipasarkan pada kelompok rekombinan IFN α diproduksi dan dipurifikasi dari E.

coli (Rabhi-Essafi, 2007).

Sistem ekspresi untuk produksi protein rekombinan dalam E. coli melalui

kombinasi antara vektor dan galur E. coli sebagai inang ekspresi (Sørensen dan

Mortensen, 2005). Protein dapat diekspresikan dengan bantuan vektor melalui

induksi ekspresi menggunakan pemberian reagen seperti isopropyl-1-thio-β-D-

galactopyranoside (IPTG). Reagen IPTG berfungsi melepas represi promotor

sehingga mengasilkan ekspresi protein rekombinan dalam jumlah yang tinggi.

Dilekatkannya protein tertentu pada molekul protein misalnya β galaktosidase

dapat lebih menstabilkan protein, yang mana jika tidak dilekatkan mungkin akan

terdegradasi dalam E. coli. Penambahan tag pada protein yang diekspresikan

berfungsi untuk memudahkan menemukan dan mengisolasi protein setelah

diekspresikan. Tag yang banyak digunakan diantaranya Glutation-S-transferase

(GST) yang dapat diisolasi menggunakan kolom glutation atau tag histidin yang

diisolasi menggunakan kolom nikel (Grompe et al., 1998).


Ekspresi protein rekombinan pada dasarnya dapat diarahkan ke tiga lokasi

yaitu sitoplasma, periplasma atau media kultivasi (Sørensen dan Mortensen,

2005). Protein IFN α yang diekspresikan pada E.coli seringnya dalam bentuk

presipitasi agregat tidak larut dalam sitoplasma yang disebut dengan badan inklusi

(Swaminathan dan Khanna, 1999; Bedarrain et al., 2001; Srivasta et al., 2005),

yang umumnya merupakan protein misfolding dan secara biologis inaktif

(Villaverde dan Carrio, 2003). Proses refolding dari badan inklusi kurang

diinginkan karena hasil perolehan kembalinya rendah dan memerlukan optimasi

kondisi refolding yang berbeda untuk setiap protein target (Middelberg, 2002).

Selain itu, proses resolubilisasi tidak dapat secara penuh mengembalikan pelipatan

protein dan fungsi yang optimal protein (Fathallah et al., 2009).

Beberapa bagian dari protein yang diekspresikan seperti ikatan disulfida

(Lilie et al., 1998; Makrides, 1996), modifikasi pascatranslasi (Zhang et al.,

1998), hidrofobisitas, muatan (net charge) dan struktur sekunder merupakan

faktor-faktor yang menentukan dalam pembentukan badan inklusi (Chiti et al.,

2003). Faktor-faktor lain yang juga menentukan pembentukan badan inklusi yaitu

terkait dengan lingkungan tempat protein diekspresikan diantaranya pH dan

temperatur (Yon, 2002). Reaksi agregasi terjadi pada suhu yang tinggi karena

temperatur yang kuat dapat meningkatkan kekuatan interaksi hidrofobik sehingga

membuat pelipatan protein salah (Kiefhaber et al., 1991).

Tujuan utama ekspresi protein rekombinan pada sistem bakteria adalah

mendapatkan akumulasi tingkat tinggi produk terlarut protein rekombinan

(Villaverde dan Carrio, 2003). Kelarutan protein target dapat dipengaruhi oleh

temperatur induksi dan waktu induksi. Temperatur yang lebih rendah menjadikan

level ekspresi lebih lambat sehingga terjadi peningkatkan pelipatan protein target,

meskipun dapat menurunkan hasil protein target. Waktu induksi yang lama juga

dapat meningkatkan ekspresi, akan tetapi dapat menginduksi proteolisis protein

target, terjadinya heterogenitas sampel dan menurunkan hasil yang diperoleh

(Fathallah et al., 2009).


2.8 Analisis Protein

Analisis protein dapat dilakukan dengan menggunakan berbagai metode

diantaranya yaitu :

2.8.1 Western Blot

Protein spesifik dalam campuran protein dapat diidentifikasi dengan teknik

Western blotting. Pada metode Western blotting, protein dipisahkan berdasarkan

ukuran massanya dengan cara elektroforesis gel poliakrilamida SDS-PAGE

(sodium dodecyl sulfate polyacrilamide gel electrophoresis) dengan sistem

vertikal (Kuby, 1994). Protein yang akan dielektroforesis sebelumnya ditambah

dengan SDS dan kemudian dipanaskan. Sodium dedosil sulfat merupakan suatu

detergen anionik yang berguna untuk menyelubungi molekul protein.

Penyelubungan protein menyebabkan terganggunya interaksi non-kovalen

sehingga molekul protein dalam struktur primer. Merkaptoetanol juga

ditambahkan untuk mereduksi ikatan disulfida. Kompleks SDS dengan protein

yang terdenaturasi memiliki jumlah muatan negatif yang sebanding dengan

ukuran protein (Sudjadi, 2008)

Kompleks protein-SDS kemudian dielektroforesis sehingga molekul

protein bergerak menuju kutub positif dan terpisah berdasarkan ukuran massanya.

Protein yang telah terpisahkan menjadi pita-pita pada gel poliakriamid kemudian

ditransfer ke membran nitroselulosa. Proses transfer makromolekul dari gel ke

membaran nitriselulosa disebut dengan proses blotting (Radji, 2011). Identifikasi

protein dilakukan dengan merendam membran nitroselulosa dalam larutan yang

mengandung antibodi primer, kemudian dicuci untuk menghilangkan antibodi

primer yang tidak berikatan dengan protein target. Langkah selanjutnya adalah

penambahan antibodi sekunder yang hanya melekat pada antibodi sekunder dan

tidak melekat pada protein target. Antibodi sekunder telah terkonjugasi dengan

suatu enzim yang dapat divisualisasikan dengan penambahan substrat karena

dapat mengoksidasi substrat yang tidak berwarna menjadi berwarna (Sudjadi,

2008).

2.8.2 Analisis Densitometri

Densitas merupakan kemampuan sebuah material untuk menyerap atau

memantulkan sinar. Densitas dapat dibedakan menjadi dua bagian yaitu densitas


transmisi yaitu kemampuan lapisan material untuk menyerap sinar yang datang

dan densitas refleksi yaitu kemampuan lapisan material untuk memantulkan sinar

yang datang. Pengukuran densitas dapat menggunakan sebuat alat ukur yang

disebut densitometer. Densitometer merupakan alat yang berfungsi untuk

mengukur besarnya densitas atau dengan kata lain merupakan alat yang digunakan

untuk mengukur derajat kehitaman atau kepekatan (densitas optis) suatu model

atau bahan semi-transparan (Siregar, 2009).

Analisis densitometri merupakan salah satu cara untuk konfirmasi hasil

elektroforesis. Hasil analisis densitometri terhadap pita-pita pada gel hasil

elektroforesis dapat digunakan untuk konfirmasi keberadaan pita, dan untuk

kuantifikasi proporsi penyusun protein yang dielektroforesis (Aulanni’am, 2004).

Suatu pita menandakan adanya akumulasi protein pada gel hasil elektroforesis

diidentifikasi sebagai oleh suatu puncak (peak). Masing-masing puncak memiliki

karakteristik ketinggian (height) sebagai intensitas densitograf dan luas daerah di

bawah kurva (area) sebagai gambaran kuantitas protein pada pita tersebut.

Ketebalan pita pada gel hasil SDS-PAGE dikuantifikasi dalam bentuk luas daerah

di bawah kurva pada kurva densitograf (Mustofa et al., 2006).

Kuantifikasi intensitas pita Western blot dapat dilakukan dengan sistem

digitalisasi automatik menggunakan UN-SCAN-IT. Program UN-SCAN-IT dapat

mengkuantifikasi data Western blot dengan menggunakan dua metode. Metode

analisis segmental memberikan informasi piksel total dan analisis pita pada setiap

segmen, sedangkan analisis lane yang memberikan informasi profil densitas

ekstraksi dan analisis pita untuk seluruh jalur (lane). Pada pengukuran pita

dilakukan pemindaian sebagai JPEG dalam format 8 bit grayscale pada 600 dpi

dan intensitas piksel. Pada pengukuran intensitas piksel dilakukan pengkoreksian

terhadap latar (background). Derajat kehitaman atau kepekatan digunakan

program UN-SCAN-IT untuk menganalisa pita dan diukur dalam bentuk piksel.

Piksel adalah unsur gambar atau representasi sebuah titik terkecil dalam sebuah

gambar grafis yang dihitung per inci. Data digital piksel total yang diperoleh dapat

digunakan untuk menghitung kepadatan optik relatif pada setiap pita untuk

analisis yang lebih lanjut (Rezvani et al., 2009).


BAB 3 METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu

Penelitian ini dilakukan di laboratorium Terapetik Protein dan Vaksin,

Bidang Biologi Molekuler, Pusat Penelitian Bioteknologi, Lembaga Ilmu

Pengetahuan Indonesia. Waktu pelaksaan penelitian adalah dari bulan Juli 2011

sampai Juli 2012.

3.2 Bahan dan Alat

3.2.1 Bahan

Aquades, aquabides (ddH2O), nuclease free water, GoTaq Green Master

Mix (Promega), enzim restriksi Nco I, Xho I, dan Mlu I (Roche), primer

IFN_NcoI_F 5' CATGCCATGGCCTGTGATCTGCCTCAAACC 3' (1st BASE),

primer IFN_XhoI_R 5' CCGCTCGAGTCATTCCTTACTTCTTAAAC 3' (1st

BASE), primer pET_Screen_F 5' TAATACGACTCACTATAGGGGAAT 3' (1st

BASE), primer pET_Screen_R 5' TTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGC 3' (1st

BASE), STag-18mer-primer 5' GAACGCCAGCACATGGAC 3' (Macrogen),

T7terminator-primer 5' GCTAGTTATTGCTCAGCGG 3' (Macrogen), agarosa

(Fermentas), marker DNA 1 kilo basa (Fermentas), loading buffer, etidium

bromida (EtBr), enzim T4 DNA ligase (NEB), DNA ligation buffer (NEB),

Agarose Gel DNA Extrction Kit (Roche), metanol, etanol, kalsium klorida

(CaCl2), ampisilin (Sigma), ekstrak ragi (Difco), tripton (Difco), agar bakto

(Difco), isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside /IPTG (Roche), natriun klorida

(NaCl), sodium deodesil sulfat (SDS), akrilamid, ammonium persulfat (APS),

separating gel buffer, stacking gel buffer, tetrametil metilen diamin (TEMED),

bufer elektroforesis, nitro blue tetrazolium/NBT (Promega), 5-bromo-4chloro-3-

indolyl-phosphate/BCIP (Promega), Anti-α-Interferon Mouse mAb (MMHA-2)

(Calbiochem), Anti-mouse IgG (H+L) AP conjugate (Promega), etanol, metanol,

gen sintetik human ifn α2a dalam vektor pcDNA3.1+:IFN-Gene (DNA 2.0 Inc.,

Menlo Park), vektor pET-32b(+) (Novagen), E. coli galur DH5α (Invitrogen), E.

coli galur BL21(DE3) (Novagen).

25


3.2.2 Alat

Alat PCR (Biometra), alat elektroforeis DNA (Advance), alat elektroforeis

protein (Bio-rad), Ultraviolet (UV) Transiluminator, autoklaf, inkubator shaker,

penangas air, laminar, lemari pendingin -20⁰C, lemari pendingin 4⁰C, oven,

mikropipet, vortex, sentrifus, cawan petri, labu erlenmeyer, tabung reaksi, tip,

tabung PCR, tabung sentrifus.

3.3 Tahap Kerja

Metode yang digunakan dalam penelitian ini secara garis besar

berdasarkan metode pada buku panduan pET Sistem Manual (2006).

3.3.1 Penyiapan DNA insert

Penyiapan DNA insert dilakukan dengan metode PCR menggunakan

cetakan gen human ifn α2a dalam vektor pcDNA3.1+IFN-Gene. Proses PCR

dilakukan dengan menggunakan sepasang primer yaitu IFN_Nco_I F 5'

CATGCCATGGCCTGTGATCTGCCTCAAACC 3' dan IFN_Xho_I R 5'

CCGCTCGAG

Produk hasil PCR selanjutnya dilakukan pengecekan dengan metode

elektroforesis pada medium agarosa 1% dengan sampel hasil PCR (5 µl), ddH2O

(5 µl), loading buffer (2 µl) dengan tegangan 100 volt selama kurang lebih 30

menit. Elektroforesis dilakukan sampai loading buffer mencapai dua pertiga dari

panjang gel. Gel agarosa kemudian diwarnai dengan larutan EtBr dan diamati

diatas sinar UV. Hasil PCR yang benar kemudian dilakukan purifikasi dengan

menggunakan 2 metode yang berbeda yaitu gel (Agarose Gel DNA Extraction Kit)

dan metode fenol kloroform.

TCATTCCTTACTTCTTAAAC 3' yang telah ditambahkan situs

pemotongan Nco I dan Xho I yang dicetak miring dan digaris bawahi. Proses PCR

dimulai dengan dicampurkannya semua komponen yang dibutuhkan dalam reaksi

ke dalam tabung PCR, yaitu ddH2O (6,5 µl), DNA (2 µl), primer IFN_NcoI_F (2

µl), primer IFN_XhoI_R (2 µl), dan GoTaq Green Master Mix (12,5 µl) sehingga

volume totalnya 25µl. Reaksi PCR dilakukan dengan siklus sebagai berikut:

denaturasi awal pada suhu 94⁰C selama 5 menit, denaturasi 94⁰C selama 1 menit,

penempelan 55⁰C selama 1 menit, dan polimerisasi 72⁰C selama 2 menit (tiga

tahap ini dilakukan sebanyak 30 siklus) serta polimerisasi akhir pada suhu 72⁰C

selama 6 menit (pET Sistem Manual, 2006).


Tahapan purifikasi hasil PCR menggunakan Agarose Gel DNA Extraction

Kit dilakukan berdasarkan manual (Roche) adalah:

1. Hasil PCR 60 µl dielektroforesis pada gel agarosa 1%, kemudian

divisualisasikan dengan etidium bromida (EtBr).

2. Gel agarosa dilihat pada UV transiluminator, selanjutnya pita fragmen hasil

PCR diambil dengan dipotong menggunakan scalpel kemudian dimasukkan ke

tabung 2 ml.

3. Berat agarosa lalu ditimbang dan ditambahkan 300 µl agarose solubilisation

buffer (vial 2) per 100 mg gel agarosa.

4. Sebanyak 10 µl suspensi silika (vial 1) ditambahkan ke campuran untuk

mengikat DNA.

5. Campuran diinkubasi selama 10 menit pada suhu 57⁰C dan divortex setiap 2

menit.

6. Campuran selanjutnya disentrifus 12.000 rpm selama 1 menit dan

supernatannya dibuang dengan pemipetan.

7. Pelet ditambahkan 500 µl nucleic acid binding buffer (vial 3) dan divortex.

8. Campuran lalu disentrifus 12.000 rpm selama 1 menit dan supernatannya

dibuang dengan pemipetan.

9. Pelet dicuci dengan 500 µl washing buffer (vial 4).

10. Campuran disentrifus 12.000 rpm selama 1 menit dan supernatannya dibuang

dengan pemipetan.

11. Pelet dicuci lagi dengan 500 µl washing buffer (vial 4).

12. Campuran disentrifus 12.000 rpm selama 1 menit dan supernatannya dibuang

dengan pemipetan.

13. Proses pengeringan dilakukan pada suhu kamar selama 10-15 menit.

14. Pelet dilarutkan dengan 20 µl nuclease free water dan diinkubasi 10 menit

pada suhu 15-25⁰C untuk DNA insert, sedangkan untuk vektor diinkubasi 10

menit pada suhu 56-60⁰C dengan divortex setiap 2-3 menit.

15. Campuran disentrifus 12.000 rpm selama 1 menit dan supernatan diambil dan

dipindahkan ke tabung baru.


Tahapan proses purifikasi hasil PCR dengan metode fenol kloroform

yaitu:

1. Hasil PCR 60 µl ditambahkan ddH2O 90 µl kemudian ditambahkan 150 µl

fenol kloroform dan divortex.

2. Campuran disentrifus 12.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4⁰C.

3. Bagian atasnya diambil dan dipindahkan ke tabung baru kemudian

ditambahkan etanol absolut (2,5 kali volume) dan disimpan semalam.

4. Campuran disentrifus 12.000 rpm selama 30 menit pada suhu 4⁰C dan

supernatan dibuang dengan pemipetan.

5. Pelet dicuci dengan 1 ml etanol 70%, disentrifus 12.000 rpm selama 5 menit

pada suhu 40C kemudian supernatan dibuang dengan pemipetan.

7. Pelet dikeringkan pada suhu kamar kurang lebih 30 menit selanjutnya

dilarutkan dengan 20 µl nuclease free water.

Hasil PCR yang telah dipurifikasi kemudian dipotong menggunakan enzim

restriksi Nco I dan Xho I dan dilanjutkan purifikasi dengan fenol kloroform.

Proses pemotongan dimulai dengan dicampurkannya semua komponen ke dalam

tabung, yaitu ddH2O (10,5 µl), bufer H (2,5 µl), hasil PCR yang telah dipurifikasi

(10 µl), enzim Nco I (1 µl), enzim Xho I (1 µl) dengan volume total 25 µl dan

diinkubasi pada suhu 37⁰C dalam penangas air (waterbath) selama 1 jam. Hasil

dari proses pemotongan kemudian dilakukan pengecekan dengan metode

elektroforesis pada medium agarosa 1% dengan sampel (2 µl), ddH2O (8 µl),

loading buffer (2 µl) dan diamati diatas sinar UV. Tahapan proses purifikasi DNA

insert yang telah dipotong dengan metode fenol kloroform yaitu:

1. DNA insert hasil pemotongan 23 µl ditambahkan ddH2O 100 µl kemudian

ditambahkan 130 µl fenol kloroform dan divortex.


3. Bagian atasnya diambil dan dipindahkan ke tabung baru kemudian

ditambahkan etanol absolut (2,5 kali volume) dan disimpan semalam.

4. Campuran disentrifus 12.000 rpm selama 30 menit pada suhu 4⁰C, kemudian

supernatan dibuang dengan pemipetan.

5. Pelet dicuci dengan 1 ml etanol 70% dan disentrifus 12.000 rpm selama 5

menit pada suhu 4⁰C kemudian supernatan dibuang dengan pemipetan.


7. Pelet dikeringkan pada suhu kamar kurang lebih 30 menit selanjutnya

dilarutkan dengan 20 µl nuclease free water.

3.3.2 Penyiapan Vektor pET-32b(+)

Vektor pET-32b(+) dengan konsentrasi 300 ng/µl dilakukan pemotongan

dengan enzim restriksi Nco I dan Xho I pada suhu 37⁰C selama 1 jam. Proses

pemotongan vektor pET-32b(+) dimulai dengan dicampurkannya semua

komponen ke dalam tabung, yaitu ddH2O (16,5 µl), bufer H (2,5 µl), vektor pET-

32b(+) (4 µl), enzim Nco I (1 µl), enzim Xho I (1 µl) dengan volume total 25 µl

dan selanjutnya diinkubasi pada suhu 37⁰C dalam penangas air selama 1 jam.

Hasil proses pemotongan kemudian dilakukan pengecekan dengan metode

elektroforesis pada medium agarosa 1% dengan sampel (3 µl), ddH2O (7 µl),

loading buffer (2 µl) dan dilakukan pengamatan diatas sinar UV. Vektor pET-

32b(+) yang telah dipotong kemudian dipurifikasi menggunakan fenol kloroform

yang mana metodenya serupa dengan purifikasi fenol kloroform pada penyiapan

DNA insert.

Vektor pET-32b(+) yang telah linear selanjutnya dilakukan tahapan ligasi

dengan DNA insert (gen human ifn α2a) yang telah dipersiapkan. Reaksi ligasi

terdiri dari nuclease free water (12 µl), bufer T4 DNA ligase (2 µl), vektor pET-

32b(+) (2 µl), DNA insert (3 µl), enzim T4 DNA ligase (1 µl) dengan volume

total 20 µl dan diinkubasi pada suhu 4⁰C semalam. Hasil dari proses ligasi

diharapakan dapat diperoleh vektor rekombinan pET-32b(+)-IFN α2a yang

sirkuler.

3.3.3 Pembuatan Sel Kompeten E. coli

Proses pembuatan sel kompeten E. coli adalah sebagai berikut :

1. Stok beku 20 µl dari koloni tunggal E. coli diinokulasikan pada 4 ml LB cair

dan ditumbuhkan pada suhu 37⁰C dikocok 200 rpm semalam.

2. Sebanyak 800 µl kultur semalam diinokulasikan pada 100 ml LB cair dan

ditumbuhkan pada suhu 37⁰C dikocok 250 rpm selama 3 jam.

3. Kultur didinginkan di es selama 5-10 menit kemudian dituang ke 3 tabung

sentrifus masing-masing 35 ml.


4. Kultur disentrifus 6000 rpm pada suhu 4⁰C selama 5 menit dan supernatan

dibuang.

5. Pelet diresuspen dalam 4 ml CaCl2 60 mM dingin untuk masing-masing

tabung, dikocok-kocok supaya homogen.

6. Campuran didiamkan di es 30 menit lalu disentrifus 6000 rpm pada suhu 4⁰C

selama 5 menit dan supernatannya dibuang.

7. Pelet diresuspen dalam 4 ml CaCl2 60 mM dingin untuk masing-masing

tabung, dikocok-kocok supaya homogenkan.

8. Campuran didiamkan di es selama 30 menit lalu disentrifus 6000 rpm pada

suhu 4⁰C selama 5 menit dan supernatannya dibuang.

9. Pelet diresuspen dengan 1 ml CaCl2 60 mM dingin untuk masing-masing

tabung, kemudian digabung menjadi satu dan ditambah 1 ml CaCl2 60 mM

sehingga volume akhir 4 ml. Sel kompeten dapat langsung digunakan atau

disimpan semalam dalam lemari es 4⁰C untuk meningkatkan kompetensi.

3.3.4 Kloning Gen human ifn α2a

Hasil ligasi kemudian ditransformasikan pada sel kompeten E. coli galur

DH5α sebagai inang kloning. Proses transformasi dilakukan dengan menggunakan

metode heat shock pada suhu 42⁰C selama 90 detik (Radji, 2011). Adapun proses

dari transformasi adalah sebagai berikut:

1. Sel kompeten 100 µl ditambahkan hasil ligasi 5-10 µl.

2. Campuran diinkubasi di es selama 30 menit.

3. Campuran dilakukan heat shock pada penangas air suhu 42⁰C selama 90 detik.

4. Campuran didinginkan di es selama 1 menit.

5. Campuran ditambahkan 400 µl LB cair steril.

6. Campuran diinkubasi pada suhu 37⁰C dengan dikocok selama 45 menit.

7. Campuran diinokulasi ke media LB agar yang telah ditambah ampisilin

dengan metode sebar 20 µl, 50 µl, 80 µl, dan 350 µl (suspensi sel 350 µl

disentrifus dulu dan buang supernantan sisakan 80 µl).

8. Tahap inkubasi dilakukan pada inkubator 37⁰C semalan dan selanjutnya

diisolasi koloni tunggal yang tumbuh.


Hasil transformasi ditumbuhkan pada media LB padat yang ditambah

ampisilin (pET Sistem Manual, 2006). Sebagai kontrol negatif digunakan suspensi

sel kompeten yang ditumbuhkan pada media LB padat yang ditambah ampisilin.

Klon transforman E. coli diseleksi dengan menggunakan marker antibiotik

ampisilin. Hanya klon E. coli yang mengandung vektor rekombinan pET-32b(+)-

IFN α2a yang dapat tumbuh pada media LB padat yang ditambah ampisilin.

3.3.5 Skrining dan Verifikasi Klon Transforman di E. coli DH5α

Verifikasi masuknya gen DNA insert pada vektor rekombinan dilakukan

dengan beberapa metode yaitu PCR colony screening, isolasi vektor rekombinan

pET-32b(+)-IFN α2a, analisis restriksi dan juga sekuensing (pET Sistem Manual,

2006). Proses PCR colony screening dilakukan dengan menggunakan primer

pET_Screen_F 5' TAATACGACTCACTATAGGGGAAT 3' dan pET_Screen_R

5' TTATTGCTCAGCGGTGGCAGCAGC 3'. Metode PCR colony screening

dilakukan dengan tahapan sebagai berikut:

1. Koloni yang tumbuh berdiameter lebih dari 1 mm diambil dengan pipet tip.

2. Pipet tip dicelupkan ke tabung 0,5 ml yang telah diisi 50 µl aquades.

3. Tabung dipanaskan di heat block pada suhu 99⁰C selama 5 menit untuk

melisiskan sel dan merusak DNAse.

4. Campuran disentrifus pada 12.000 rpm selama 1 menit untuk mengendapkan

debris sel.

5. Campuran diambil 10 µl supernatan dan dilakukan prosesPCR.

6. Reaksi PCR terdiri atas supernatan (10µl), primer pET_Screen_F (2 µl),

primer pET_Screen_R (2 µl), GoTag Green Master Mix (12,5 µl) dengan

volume total 26,5 µl.

7. Setelah proses PCR selesai dilakukan pengecekan dengan elektrofosesis gel

agarosa dan divisualisasikan menggunakan EtBr.

3.3.6 Kultivasi dan Isolasi Vektor Rekombinan

Metode isolasi vektor rekombinan pET-32b(+)-IFN α2a dilakukan dengan

tahapan sebagai berikut:

1. Media LB cair dibuat dan disterilisasi dengan autoklaf.


Contoh pembuatan media LB cair 10 ml yaitu: bakto tripton 1% = 0,2 gram,

ekstrak ragi 0,5% = 0,1 gram, NaCl 1% = 0,2 gram (pET Sistem Manual,

2006). Setelah steril dan sebelum digunakan perlu ditambahakan 10 µl

ampisilin 5%.

2. Koloni tunggal diinokulasikan ke dalam tabung yang berisi media 3 ml yang

telah ditambah ampisilin dan diinkubasi semalam pada suhu 37⁰C dengan

dikocok 200 rpm.

3. Kultur diambil dan dimasukkan ke tabung steril 1,5 ml kemudian disentrifus

12.000 rpm selama 1 menit. Selain itu juga dilakukan pembuatan kultur stok

yang disimpan pada suhu -20⁰C dengan ditambah gliserol.

4. Supernatan dibuang dengan pemipetan kemudian pelet divortex.

5. Pelet ditambahkan 150 µl larutan 1 diaduk sampai larut dan divortex

kemudian diinkubasi di es selama 10 menit. Larutan 1 terdiri dari 50 mM

glukosa, 25 mM tris pH 8, 10 mM EDTA dan ddH2O.

6. Campuran ditambahkan 180 µl larutan 2 diaduk perlahan-lahan sampai ada

lendir kemudian ditaruh dies selama 10 menit. Larutan 2 terdiri dari 0,2 M

NaOH, SDS 1% dan ddH2O.

7. Campuran ditambahkan 135 µl larutan 3 dingin (sodium asetat 3 M pH 5,7)

diaduk perlahan-lahan dan dibolak-balik.

8. Campuran disentrifus 12.000 rpm pada suhu 4⁰C selama 5 menit. Pada pelet

berisi DNA genom, sedangkan pada supernatan berisi DNA vektor.

9. Supernatan diambil dan dipindahkan ke tabung baru, ditambahkan 400 ml

fenol kloroform (1:1) kemudian divortex.


11. Bagian atas diambil dan pindahkan ke tabung baru kemudian ditambahkan

etanol absolut (2,5 kali volume) dan disimpan semalam.

12. Campuran disentrifus 12.000 rpm selama 30 menit pada suhu 4⁰C kemudian

supernatan dibuang dengan dipipet.

13. Pelet dicuci dengan ditambahkan 1 ml etanol 70%.

14. Campuran disentrifus 12.000 rpm selama 5 menit pada suhu 4⁰C kemudian

supernatan dibuang dengan aspirasi.


15. Pelet dikeringkan pada suhu kamar kurang lebih 30 menit dan dilarutkan

dengan 20 ml ddH2O yang ditambah 1 µl RNAse 1:5.

16. Campuran diinkubasi selama 20-60 menit pada 37⁰C, lalu disimpan di -20⁰C.

Vektor rekombinan pET-32b(+)-IFN α2a yang telah diisolasi selanjutnya

dilakukan analisis restriksi dan disekuen untuk konfirmasi adanya DNA insert dan

peletakan kodon yang tepat. Vektor rekombinan pET-32b(+)-IFN α2a dilakukan

pemotongan kembali menggunakan enzim restriksi Nco I dan Xho I. Komponen

analisis restriksi terdiri dari ddH2O (12,5 µl), bufer H (2,5 µl), vektor rekombinan

(8 µl), enzim Nco I (1 µl), enzim Xho I (1 µl) dengan total volume 25 µl dan

diinkubasi 37⁰C pada penangas air selama 1 jam. Hasil pemotongan kemudian

dielektroforesis pada gel agarosa 1%.

Vektor rekombinan pET-32b(+)-IFNα2a yang telah benar selanjutnya

dilakukan perbanyakan dengan dikultivasi. Isolasi dan purifikasi purifikasi vektor

rekombinan dilakukan dengan Qiagen Plasmid Maxi Kit serta diukur

konsentrasinya menggunakan alat Nanophotometer. Prosedur Qiagen Plasmid

Maxi Kit adalah sebagai berikut:

1. Kultur stok gliserol 35 µl ditumbuhkan ke dalam LB cair 5 ml yang telah

ditambah ampisilin dan diinkubasi pada 37⁰C dikocok 200 rpm semalam.

2. Kultur diambil 4 ml dan diinokulasikan ke LB cair 200 ml yang telah

ditambah ampisilin.

3. Kultur diinkubasi pada 37⁰C dikocok 200 rpm selama 6 jam.

4. Kloramfenikol 30 mg ditambahkan dan diinkubasi pada 37⁰C dikocok 200

rpm semalam.

5. Pemanenan sel dilakukan dengan disentrifus pada 4000 rpm 4⁰C selama 15

menit dan supernatannya dibuang.

6. Pelet diresuspensi dengan 10 ml bufer P1 yang mana sudah mengandung

RNase.

7. Bufer P2 10 ml ditambahkan dengan dibolak-balik 5 kali dan campuran

selanjutnya diinkubasi selama 5 menit pada suhu kamar.

8. Bufer P3 10 ml dingin ditambahkan dan dihomogenkan dengan dibolak-balik

5 kali dan campuran selanjutnya diinkubasi selama 20 menit pada suhu kamar.


9. Campuran disentrifus pada 13.000 rpm 4⁰C selama 30 menit dan

supernatannya diambil.

10. Qiagen tip 500 diekuilibrasi dengan ditambahkan 10 ml bufer QBT dan bufer

dibiarkan keluar menetes karena gaya gravitasi sampai kolom menjadi kosong.

11. Supernatan dimasukkan ke Qiagen tip 500.

12. Qiagen tip 500 dilakukan pencucian 2 kali dengan 30 ml bufer QC.

13. DNA plasmid dielusi dengan ditambahkan 15 ml buffer QF.

14. Hasil elusi dipresipitasi dengan ditambahkan 10,5 ml isopropanol.

15. Campuran disentrifus pada 13.000 rpm 4⁰C selama 30 menit dan

supernatannya dibuang.

16. Pelet dicuci dengan ditambahkan 5 ml etanol 70% dan disentrifus pada 13.000

rpm 4⁰C selama 10 menit dan supernatannya dibuang.

17. Pelet dikeringkan pada suhu ruang selama 10 menit kemudian pelet dilarutkan

2 ml nuclease free water.

Karakterisasi selanjutnya yaitu dengan analisis urutan nukleotida

menggunakan metode sekuensing. Pembacaan dilakukan dua arah yaitu

menggunakan STag-18mer-primer dan T7terminator-primer. Penentuan urutan

nukleotida dilakukan di Korea (Macrogen).

3.3.7 Transformasi Vektor Rekombinan ke E.coli BL21(DE3)

Vektor rekombinan pET-32b(+)-IFNα2a yang benar selanjutnya

ditransformasikan ke sel kompeten E. coli BL21(DE3) untuk mengekspresikan

protein rekombinan human IFN α2a. Metode transformasi yang digunakan yaitu

heat shock pada suhu 42⁰C selama 90 detik. Tahapan transformasi vektor

rekombinan pET-32b(+)-IFNα2a ke sel kompeten E. coli BL21(DE3) dilakukan

seperti metode transformasi hasil ligasi ke sel kompeten E. coli DH5α. Hasil

transformasi kemudian ditumbuhkan pada media LB padat yang ditambah

ampisilin (pET Sistem Manual, 2006).

3.3.8 Skrining dan Verifikasi Klon Transforman di E. coli BL21(DE3)

Klon transforman E. coli BL21(DE3) yang diperoleh diseleksi dengan

media selektif LB padat yang mengandung antibiotik ampisilin. Verifikasi


masuknya vektor rekombinan pET-32b(+)-IFN α2a pada inang ekspresi E. coli

BL21(DE3) dilakukan menggunakan PCR colony screening dan indentifikasi

protein terfusi. Proses PCR colony screening klon transforman E. coli BL21(DE3)

dilakukan seperti PCR colony screening pada klon transforman E. coli DH5α.

Hasil proses PCR colony screening kemudian dilakukan pengecekan dengan

metode elektroforesis pada medium agarosa 1% dengan sampel (5 µl), ddH2O (5

µl), loading buffer (2 µl) dilakukan pewarnaan dengan EtBr dan diamati diatas

sinar UV.

3.3.9 Ekspresi, Isolasi dan Karakterisasi Protein Rekombinan Human IFN

α2a

Klon transforman E. coli BL21(DE3) yang terpilih selanjutnya dilakukan

uji ekspresi protein rekombinan pada skala kecil menggunakan medium produksi

yaitu media LB cair 10 ml yang ditambah 50 µg/ml ampisilin. Inkubasi dilakukan

dengan variasi suhu pada 28⁰C, 30⁰C dan 37⁰C. Kultur sel bakteri pada OD600

sekitar 0,5 diinduksi menggunakan IPTG konsentrasi akhir 1 mM. Adapun

protokol induksi yang digunakan adalah sebagai berikut:

1. Kultur stok gliserol 20 µl ditumbuhkan pada media LB cair 3 ml yang telah


2. Kultur semalam diambil 0,5 ml dan dimasukkan ke LB cair 10 ml yang telah

ditambah ampisilin.

3. Kultur ditumbuhkan dengan dikocok 250 rpm pada suhu 37⁰C mencapai

OD600: 0,5 sekitar 2 jam.

4. Kultur diambil 0,5 ml dimasukkan ke tabung 1,5 ml dan disentrifus pada 8000

rpm 4⁰C selama 10 menit, selanjutnya dipisahkan antara supernatan dan pelet

sebagai sampel 0 jam sebelum induksi lalu disimpan pada -20⁰C.

5. Kultur diinduksi dengan penambahan IPTG konsentrasi akhir 1 mM dan

dilanjutkan inkubasi pada variasi suhu 28⁰C, 30⁰C, dan 37⁰C dengan dikocok

250 rpm.

6. Pengambilan sampel 0,5 ml dilakukan pada waktu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 jam dan

semalam, selanjutnya disentrifus dan dipisahkan antara supernatan dan pelet


lalu disimpan pada -20⁰C. Pelet selanjutnya diresuspensi dengan

menggunakan 100 µl buffer PBS 1x.

Isolasi protein rekombinan human IFN α2a dari pelet dilakukan dengan

metode sebagai berikut:

1. Kultur stok gliserol 20 µl ditumbuhkan pada media LB cair 3 ml yang telah


2. Kultur semalam diambil 1,25 ml dan dimasukkan ke LB cair 25 ml yang telah

ditambah ampisilin.

3. Kultur ditumbuhkan dengan dikocok 250 rpm pada suhu 37⁰C mencapai

OD600: 0,5 sekitar 2 jam.

4. Kultur diinduksi dengan penambahan IPTG konsentrasi akhir 1 mM dan

dilanjutkan inkubasi pada suhu 37⁰C dengan dikocok 250 rpm.

5. Pemanenan sel dilakukan setelah 5 jam inkubasi dengan disentrifugasi 12.000

rpm pada suhu 4⁰C selama 10 menit untuk memisahkan pelet dan supernatan.

6. Pelet diresuspensi dengan 2,5 ml bufer 50 mM tris HCl pH 8 yang ditambah 1

mM EDTA dan 1 mM PMSF.

7. Campuran disonikasi sebanyak 10 kali selama 30 detik di es dengan selang

waktu 30 detik di es.

8. Campuran disentrifugasi pada 12.000 rpm suhu 4⁰C selama 10 menit untuk

memisahkan antara supernatan (protein terlarut di sitoplasma) dan pelet.

9. Pelet dicuci dengan bufer 50 mM tris HCl yang ditambah 1% triton X-100

(750 µl bufer untuk 0,1 gram pelet).

10. Campuran diikubasi 5 menit pada suhu kamar dan selanjutnya disentrifus

12.000 rpm pada suhu 4⁰C selama 5 menit.

11. Tahap pencucian dilakukan sebanyak 2 kali.

12. Pelet disolubilisasi dengan bufer 50 mM tris HCl yang ditambah 6 M guanidin

HCl dan 800 mM merkaptoetanol (750 µl bufer untuk 0,1 gram pelet).

13. Campurn diinkubasi selama 30 menit pada suhu kamar dan selanjutnya

disentrifus pada 12.000 rpm pada suhu 4⁰C selama 15 menit.

14. Supernatan dipisahkan dari pelet selanjutnya di cek menggunakan SDS PAGE

dengan pewarnaan CBB atau Western blot dan penyimpanan dilakukan pada


suhu -20⁰C. Supernatan merupakan protein yang tidak terlarut yaitu sebagai

badan inklusi di dalam sitoplasma.

Karakterisasi protein rekombinan human IFN α2a yang diperoleh

dilakukan dengan metode elektroforesis SDS-PAGE yang dilanjutkan dengan

pewarnaan CBB atau Western blot. Tahapan metode elektroforesis SDS-PAGE

adalah sebagai berikut:

1. Pembuatan gel poliakrilamid yang terdiri atas separating gel dan stacking gel.

Larutan separating gel 12%: 1,5 M tris HCl pH 8,8 (2,5 ml); 10% SDS (100

µl); 40% akrilamid (3 ml); aquades (4,4 ml); APS 10% (100 µl); TEMED (6

µl). Larutan separating gel dimasukkan dalam cetakan dan dibiarkan selama

30 menit supaya berpolimerisasi sehingga terbentuk gel.

Larutan stacking gel: 0,5 M tris HCl pH 6,8 (1,25 ml); 10% SDS (100 µl);

40% akrilamid (900 µl); aquades (7 ml); APS 10% (100 µl); TEMED (15 µl).

Larutan stacking gel dimasukkan ke dalam cetakan pada posisi diatas

separating gel kemudian sisir dimasukkan pada cetakan dan gel akan

terbentuk setelah 30 menit.

2. Penyiapan sampel untuk dielektroforesis.

Pada supernatan dan pelet masing-masing diambil 10 µl dimasukkan ke dalam

tabung dan ditambahkan 10 µl loading buffer RSB 2x (1:1) lalu dipanaskan

pada 95⁰C selama 4 menit. Marker 5 µl ditambah 5 µl loading bufer RSB 2x.

3. Sampel dimasukkan kedalam sumuran dan dielektroforesis dalam bufer

elektroforesis pada tegangan 90 volt selama 90 menit.

Bufer elektroforesis untuk 1 liter pH 8,3: tris 15,5 g, glisin 72 g, SDS 5 g, lalu

ditambah aquades sampai 1 liter.

Gel poliakrilamid yang telah selesai dielektroforesis SDS PAGE kemudian

dikarakterisasi dengan pewarnaan commasie brilliant blue (CBB) atau

menggunakan Western blot. Proses pewarnaan CBB adalah sebagai berikut:

1. Gel SDS-PAGE diinkubasi dengan stain (40% metanol: 20 ml; 7% asam

asetat glasial: 3,5 ml; ddH2O: 26,5 ml; CBB stain: 6 ml) dan dikocok 3 jam.

2. Gel dicuci dengan destain I (40% metanol: 20 ml; 7% asam asetat glasial: 3,5

ml; ddH2O: 26,5 ml) dan dikocok semalam.


3. Gel dicuci dengan destain II (5% methanol: 2,5 ml; 7% asam asetat glasial:

3,5 ml; ddH2O 44 ml) dikocok 1 jam.

Tahapan metode Western blot adalah sebagai berikut:

1. Protein sebelumnya telah dipisahkan dengan metode SDS PAGE.

2. Protein selanjutnya ditransfer ke membran nitriselulosa dengan cara

dielektroforesis dalam bufer transfer pada tegangan 90 volt selama 90 menit.

Bufer transfer untuk 1 liter: tris 25 mM 3,03 g, glisin 192 mM 14,4 g, 20%

metanol 200 ml, ditambah aquades sampai 1 liter.

3. Membran diambil kemudian diinkubasi dengan 10% susu bebas lemak dalam

bufer TBS 1x dengan dikocok selama 1 jam.

Bufer TBS (Tris Buffer Saline) untuk 1 liter dengan pH 7,6: tris 2,42 g, NaCl

8g, HCl 1N 3,8 g, ditambah aquades sampai 1 liter.

4. Pencucian dilakukan 3 kali menggunakan 0,1% Tween 20 dalam TBS 1x

selama 15 menit, 5 menit dan 5 menit dengan dikocok.

5. Larutan antibodi primer ditambahkan dan diinkubasi 1 jam dengan dikocok.

Larutan antibodi primer: 10 µl anti-α-Interferon Mouse mAb dilarutkan pada

10 ml 10% susu bebas lemak dalam bufer TBS 1x.



7. Larutan antibodi sekunder ditambahkan dan diinkubasi 1 jam dengan dikocok.

Larutan antibodi sekunder: 3 µl anti-mouse IgG (H+L) AP conjugate

dilarutkan pada 10 ml 10% susu bebas lemak dalam bufer TBS 1x.



9. Hasil analisis diketahui dengan munculnya pita pada membran nitriselulosa

setelah pemberian substrat NBT-BCIP (bufer alkaline phosphatase 5 ml; NBT

33 µl; dan BCIP 16,5 µl).

Hasil SDS PAGE yang dilanjutkan Western blot difoto yang selanjutnya

dilakukan analisis densitometri dengan sistem digitalisasi automatik

menggunakan UN-SCAN-IT Gel versi 6.1.


BAB 4

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Penyiapan DNA insert

Penyiapan DNA insert dilakukan dengan metode PCR menggunakan

cetakan gen sintetik human ifn α2a dalam vektor pcDNA3.1:IFN-Gene. Metode

PCR dipilih karena mampu diperoleh sejumlah besar DNA dengan urutan basa

tertentu dalam waktu yang singkat (Grompe et al., 1998). Primer spesifik dibuat

berdasarkan sekuen gen human ifn α2a pada GenBank DI084466.1. Sepasang

primer digunakan untuk tahap amplifikasi gen human ifn α2a yaitu IFN_NcoI_F

dan IFN_XhoI_R yang telah ditambahkan situs restriksi Nco I dan Xho I.

Penambahan situs restriksi bertujuan untuk menempelkan situs restriksi pada gen

human ifn α2a yang selanjutnya digunakan untuk proses ligasi ke vektor pET-

32b(+). Dua jenis enzim endonuklease restriksi digunakan untuk menghindari

keterbalikan arah transkripsi atau translasi gen yang disisipkan ke dalam plasmid

(Radji, 2011). Hasil amplifikasi gen human ifn α2a selanjutnya dilakukan

pengecekan dengan dielektroforesis pada gel agarosa 1%.

1 2 3 4 5 6 7

Gambar 4.1 Elektroforesis Hasil PCR untuk Penyiapan DNA Insert.

Keterangan: (1) Marker; (2-7) Produk PCR.

Metode PCR yang digunakan pada penelitian ini dapat mengamplifikasi

gen human ifn α2a dengan baik. Amplifikasi dengan primer IFN_NcoI_F dan

IFN_XhoI_R menghasilkan produk yang berukuran 510 pb (Gambar 4.1).

Berdasarkan pita DNA pada hasil elektroforesis dapat diketahui bahwa primer

IFN_NcoI_F dan IFN_XhoI_R secara spesifik mengamplifikasi gen target yang

500 pb 750 pb

510 pb

39


diindikasikan dengan terdapatnya pita tunggal. Adanya perbedaan ketebalan pita

yang tampak pada hasil elektroforesis kemungkinan dikarenakan oleh proses

pemipetan dalam pengambilan sampel pada tabung kurang diaduk homogen,

meskipun volume yang diambil sama akan tetapi konsentrasinya dapat berbeda.

Hasil amplifikasi dengan metode PCR selanjutanya dilakukan purifikasi

sebelum digunakan untuk tahapan kloning. Purifikasi bertujuan untuk

menghilangkan sisa-sisa primer, garam, enzim, dan pengotor-pengotor lain yang

dapat mengganggu proses kloning. Purifikasi produk PCR untuk penyiapan DNA

insert pada penelitian ini dilakukan dengan menggunakan dua metode yang

berbeda yaitu metode Agarose Gel DNA Extraction Kit (Roche) dan metode

purifikasi fenol kloroform. Hasil purifikasi produk PCR selanjutnya dilakukan

pengecekan dengan dielektroforesis pada gel agarosa 1%.

1 2 3 4 5 6 7

Gambar 4.2 Elektroforesis Hasil Purifikasi Produk PCR dan Hasil Pemotongan

Ganda dengan Enzim Nco I dan Xho I.

Keterangan: (1) Produk PCR; (2) Produk PCR dipurifikasi Agarose gel DNA extraction kit; (3) Produk PCR dipurifikasi Fenol kloroform; (4 dan 6) Kosong; (5) Marker (7) Hasil purifikasi Agarose gel DNA extraction kit dipotong enzim

Nco I dan Xho I.

Pita hasil purifikasi menggunakan metode Agarose Gel DNA Extraction

Kit dan metode fenol kloroform sama-sama mempunyai ukuran 510 pb (Gambar

4.2 nomor 2 dan 3). Akan tetapi hasil elektroforesis purifikasi dengan metode

Agarose Gel DNA Extraction Kit menunjukkan pita yang lebih bersih daripada

purifikasi dengan metode fenol kloroform. Pita hasil purifikasi dengan metode

fenol kloroform terlihat smear, hal ini menunjukkan masih terdapatnya pengotor

500 pb 750 pb

510 pb 510 pb


meskipun telah dilakukan proses purifikasi. Purifikasi metode Agarose gel DNA

extraction kit adalah dengan menggunakan silika. Silika digunakan karena dapat

mengabsorbsi DNA, tidak mengadsorbsi protein, RNA, dan oligonukleotida yang

panjangnya kurang dari 50 pb sehingga dapat diperoleh DNA yang cukup murni.

Purifikasi metode fenol kloroform merupakan campuran pelarut organik yang

dapat mendenaturasi protein dan melarutkan komponen lipid, sehingga antara

protein dan DNA dapat dipisahkan. Fenol dapat mengikat protein dan sebagian

kecil RNA, sedangkan kloroform dapat membersihkan protein dan polisakarida

dari larutan (Muladno, 2010). Purifikasi dengan metode Agarose Gel DNA

Extraction Kit menunjukkan hasil yang lebih baik sehingga hasilnya digunakan

untuk tahapan penelitian selanjutnya.

Proses pemotongan ganda dengan enzim restriksi Nco I dan Xho I

dilakukan produk PCR yang telah dipurifikasi. Hasil elektroforesis yang diperoleh

menunjukkan pita yang berukuran 510 pb (Gambar 4.2 nomor 7), hal ini

menunjukkan proses pemotongan ganda telah berhasil dilakukan. Beberapa faktor

yang perlu diperhatikan dalam pemotongan menggunakan enzim restriksi

diantaranya yaitu jumlah DNA, enzim, dan bufer dalam volume reaksi total yang

sesuai. Hasil dari proses pemotongan ganda selanjutnya dilakukan purifikasi

menggunakan metode fenol kloroform. Hasil purifikasi dengan metode fenol

kloroform dilakukan pengecekan dengan dielektroforesis pada gel agarosa 1%.

1 2 3

Gambar 4.3 Elektroforesis Hasil Purifikasi Metode Fenol Kloroform Setelah

Pemotongan Ganda.

Keterangan: (1) Marker; (2) Kosong; (3) Hasil purifikasi.

750 pb 500 pb 510 pb


Hasil elektroforesis menunjukkan terdapat hanya satu pita tanpa smear

yang berukuran 510 pb (Gambar 4.3). Hal ini menunjukkan bahwa tahap akhir

purifikasi dengan menggunakan metode fenol kloroform untuk penyiapan DNA

insert telah berhasil dilakukan dengan baik. DNA insert (gen human ifn α2a) hasil

purifikasi tahap akhir diatas telah siap digunakan pada tahapan selanjutnya untuk

diligasikan ke vektor pET-32b(+) .

4.2 Penyiapan Vektor pET-32b(+)

Vektor pET-32b(+) yang mempunyai konsentrasi 300 ng/µl terlebih

dahulu dilakukan pemotongan dengan menggunakan enzim restriksi. Untuk

mengetahui kemampuan pemotongan enzim restriksi Nco I pada vektor, maka

dilakukan pemotongan ganda dengan menggunakan enzim restriksi lainnya yaitu

Mlu I. Hasil pemotongan menggunakan enzim restriksi Nco I dan Mlu I akan

terlihat dua pita yang ukurannya berbeda. Vektor pET-32b(+) selanjutnya

dilakukan pemotongan ganda menggunakan enzim restriksi Nco I dan Xho I. Hasil

dari pemotongan kemudian dielektroforesis pada agel agarosa 1%, dilanjutkan

pewarnaan dengan larutan EtBr dan diamati diatas sinar UV.

1 2 3 4 5

Gambar 4.4 Elektroforesis Hasil Pemotongan Vektor pET-32b(+).

Keterangan: (1) Vektor pET-32b(+) dipotong Xho I dan Nco I; (2) Vektor pET-32b(+) dipotong Nco I dan Mlu I; (3) Kosong; (4) Marker;

(5) Vektor pET-32b(+).

Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa enzim Xho I dan Nco I

kondisinya masih bagus dan mampu untuk memotong vektor pET-32b(+)

1000 pb

1500 pb

5845 pb 5899 pb

1309 pb

4590 pb


(Gambar 4.4). Hal ini terbukti dari hasil pemotongan ganda menggunakan enzim

Mlu I menghasilkan dua pita yang ukurannya benar. Vektor pET-32b(+) yang

dipotong dengan enzim Nco I dan enzim Mlu I diperoleh dua pita yang berukuran

4590 pb dan 1309 pb. Hasil pemotongan ganda vektor pET-32b(+) dengan enzim

Xho I dan Nco I terlihat pita yang mempunyai ukuran 5845 pb. Pita kecil yang

berukuran 54 pb tidak dapat terlihat dikarenakan konsentrasinya yang kecil dan

sewaktu proses elektroforesis pita tersebut bermigrasi dengan cepat pada gel

agarosa 1% sehingga keluar dari gel. Terdapatnya pita yang berukuran 5845 pb

menunjukkan bahwa pemotongan ganda pada vektor pET-32b(+) dengan enzim

Xho I dan Nco I telah berhasil dilakukan.

Vektor pET-32b(+) yang telah dipotong ganda menggunakan enzim Xho I

dan Nco I selanjutnya dilakukan purifikasi menggunakan metode fenol kloroform.

Purifikasi dilakukan pada vektor pET-32b(+) yang telah terpotong bertujuan

untuk menghilangkan sisa-sisa enzim, dan pengotor-pengotor lainnya. Pemurnian

DNA yang umum dilakukan yaitu melalui penambahan larutan fenol dan

kloroform dengan perbandingan 1:1. Pengendapan DNA dilakukan menggunakan

cara presipitasi etanol absolut dan dipisahkan dengan cara disentrifus (Radji,

2011). Hasil purifikasi vektor pET-32b(+) dengan metode fenol kloroform

dilakukan pengecekan dengan dielektroforesis pada gel agarosa 1%.

1 2 3 4

Gambar 4.5 Elektroforesis Hasil Purifikasi Vektor pET-32b(+) Setelah

Pemotongan Ganda dengan Enzim Xho I dan Nco I.

Keterangan: (1) Marker; (2) Vektor pET-32b(+) dicek 2 µl; (3) Vektor pET-32b(+) dipotong Xho I dan Nco I lalu dipurifikasi dicek 2 µl; (5) Vektor pET-

32b(+) dipotong Xho I dan Nco I dicek 3 µl.

5845 pb 5899 pb


Elektroforesis hasil purifikasi metode fenol kloroform pada vektor pET-

32b(+) yang telah dilakukan pemotongan ganda dengan enzim Xho I dan Nco I

menunjukkan hanya satu pita dan tidak ada smear (Gambar 4.5). Hal ini

menunjukkan bahwa proses purifikasi vektor pET-32b(+) telah berhasil

dilakukan. Vektor pET-32b(+) telah bersih dan siap digunakan untuk diligasikan

ke DNA insert (gen human ifn α2a) yang telah dipersiapkan. Tahapan ligasi harus

menggunakan DNA insert dan vektor yang bersih supaya proses ligasinya benar

dan tidak mengalami gangguan.

4.3 Kloning Gen human ifn α2a

Kloning diawali dengan memasukkan DNA insert ke dalam vektor. Ligasi

dilakukan antara vektor pET-32b(+) yang dilinearkan dengan gen human ifn α2a

(insert) yang telah dipersiapkan sebelumnya. Proses ligasi menggunakan enzim

ligase yang berfungsi untuk mengkatalis pembentukan ikatan kovalen DNA untuk

menyisipkan sepotong DNA ke dalam vektor (Radji, 2011). Pada penelitian ini

reaksi ligasi dilakukan dengan menggunakan enzim T4 DNA ligase yang

diinkubasi pada suhu 4⁰C semalam. Komposisi vektor dan insert yang digunakan

untuk proses ligasi adalah sekitar 1:3. Hasil dari proses ligasi diharapakan

diperolehnya vektor rekombinan pET-32b(+)-IFN α2a yang sirkuler. Reaksi ligasi

dikerjakan sedemikian rupa sehingga akan meghasilkan rekombinan yang banyak

(Sudjadi, 2008)

Hasil ligasi kemudian ditransformasikan pada sel kompeten E. coli DH5α

sebagai inang kloning. Sel E. coli DH5α mempunyai laju rekombinasi yang

rendah sehingga memungkinkan digunakan untuk pemeliharaan yang stabil

plasmid DNA (Tolia dan Joshua-Tor, 2006). Faktor penting yang mempengaruhi

efisiensi transformasi adalah kualitas dari sel kompeten (Xiaowei Li et al., 2010).

Sel E. coli dibuat kompeten supaya permeabilitas dinding sel meningkat sehingga

vektor rekombinan lebih mudah masuk ke dalam sel. Sel E. coli dibuat kompeten

dengan penambahan larutan CaCl2 dingin. Laruan CaCl2 dalam keadaan dingin

efektif menyebabkan perubahan permeabilitas dinding sel bakteri menjadi lebih

permiabel (Radji, 2011). Perlakuan heat shock yang diikuti dengan pendinginan

akan menjadikan dinding sel kembali seperti semula.


Proses transformasi dilakukan dengan metode heat shock pada suhu 42⁰C

selama 90 detik (Radji, 2011). Metode heatshock dipilih karena metodenya

sederhana, pori-pori membran sel E. coli dapat terbuka dalam waktu yang singkat

dan siap untuk menerima vektor rekombinan yang akan masuk. Hasil dari

transformasi dicek keberhasilannya dengan cara ditumbuhkan pada media LB

padat yang ditambahkan ampisilin. Sebagai kontrol negatif digunakan suspensi sel

kompeten yang ditumbuhkan pada media LB padat yang ditambahkan ampisilin.

Klon transforman E. coli diseleksi dengan menggunakan marker antibiotik

ampisilin. Hanya klon E. coli yang mengandung vektor rekombinan pET-32b(+)-

IFN α2a yang dapat tumbuh pada media padat LB yang ditambah dengan

ampisilin.

A B

C

Gambar 4.6 Hasil Transformasi pada E. coli DH5α.

Keterangan: (A) Inokulasi 80 µl; (B) Inokulasi 350 µl; (C) Kontrol negatif.

Hasil transformasi ke inang kloning E. coli DH5α diperoleh 13 klon

transforman (Gambar 4.6). Tiga klon transforman tumbuh pada inokulasi 80 µl


dan sepuluh klon transforman tumbuh pada inokulasi 350 µl. Proses transformasi

ke sel kompeten E. coli DH5α telah berhasil dilakukan yang mana ditunjukkan

dengan terdapatnya klon transforman yang tumbuh pada media LB padat yang

ditambah ampisilin meskipun efisiensinya rendah. Efisiensi transformasi yang

rendah kemungkinan disebabkan oleh kurang optimalnya proses ligasi yang

dilakukan. Suhu optimum untuk ligasi merupakan kompromi antara kecepatan

aksi enzim dan penyambungan kedua ujung yang berdasarkan percobaan sekitar

4-15⁰C (Sudjadi, 2008). Tingkat efisiensi transformasi juga dipengaruhi oleh

konsentrasi DNA dan kondisi sel inang. Klon transforman yang diperoleh masih

perlu dilakukan skrining dan verifikasi untuk mengetahui masuknya vektor

rekombinan ke dalam sel E. coli DH5α. Pada kontrol negatif terlihat tidak ada

yang tumbuh pada media LB padat yang telah ditambah ampisilin, hal ini

menunjukkan sel kompeten E. coli DH5α yang digunakan untuk transformasi

kondisinya baik.

4.4 Skrining dan Verifikasi Klon Transforman di E. coli DH5α

Skrining dan verifikasi klon transforman pada penelitian ini dilakukan

dengan beberapa metode yaitu PCR colony screening, isolasi vektor rekombinan

pET-32b(+)-IFN α2a, analisis restriksi dan juga dilakukan sekuensing (pET

Sistem Manual, 2006). Beberapa metode skrining dan verifikasi dilakukan

bertujuan untuk memastikan keberhasilan ligasi gen human ifn α2a pada vektor

pET-32b(+) membentuk vektor rekombinan (pET-32b(+)-IFN α2a) dan juga

keberhasilan proses transformasi ke inang kloning E. coli DH5α. Proses seleksi

klon bakteri ini tergolong sulit karena dari ribuan sel bakteri, hanya beberapa sel

bakteri saja yang kemunginan menerima plasmid DNA rekombinan yang masuk

ke dalam sel bakteri (Radji, 2011).

Skrining koloni rekombinan E. coli untuk mengetahui terdapatnya gen

target dapat dilakukan dengan metode PCR koloni. Metode PCR koloni

merupakan metode yang mudah dan sederhana untuk skrining klon bakteri

(Azhahianambi et al., 2008). Metode PCR colony screening dilakukan dengan

menggunakan sepasang primer upstream dan downstream dari DNA insert.

Sepasang primer dibuat yaitu primer pET_Screen_F dan pET_Screen_R yang


digunakan untuk mengetahui terdapatnya insert pada vektor pET-32b(+)

sehingga membentuk vektor rekombinan (pET-32b(+)-IFN α2a) dan juga untuk

mengetahui masuknya vektor rekombinan tersebut ke dalam sel E. coli DH5α.

Skrining koloni dengan metode PCR juga dilakukan dengan menggunakan primer

IFN_NcoI_F dan IFN_XhoI_R. Hasil skrining menggunakan metode PCR dan

pada klon transforman 1-11 dicek dengan dielektroforesis pada agarosa 1%.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Gambar 4.7 Elektroforesis Hasil PCR dengan Primer pET_Screen_F dan

pET_Screen_R pada Klon Transforman 1-11 E. coli DH5α.

Keterangan: (1) Marker; (2) Klon 1; (3) Klon 2; (4) Klon 3; (5) Klon 4 (6) Klon 5; (7) Klon 6; (8) Klon 7; (9) Klon 8; (10) Klon 9; (11) Klon 10; (12) Klon 11.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Gambar 4.8 Elektroforesis Hasil PCR dengan Primer IFN_NcoI_F dan

IFN_XhoI_R pada Klon Transforman 1-11 E. coli DH5α.

Keterangan: (1) Marker; (2) Klon 1; (3) Klon 2; (4) Klon 3; (5) Klon 4 (6) Klon 5; (7) Klon 6; (8) Klon 7; (9) Klon 8; (10) Klon 9; (11) Klon 10; (12) Klon 11.

Elektroforesis hasil PCR colony screening dengan primer pET_Screen_F

dan pET_Screen_R pada klon transforman 1-11 adalah positif semuanya dengan

terdapatnya pita yang berukuran sekitar 1100 pb (Gambar 4.7). Hal ini

1000 pb 1500 pb

500 pb 750 pb

1100 pb

510 pb


menunjukkan bahwa insert telah masuk pada vektor pET-32b(+) membentuk

vektor rekombinan dan vektor rekombinan (pET-32b(+)-IFN α2a) telah masuk ke

sel E. coli DH5α. Elektroforesis hasil PCR dengan primer IFN_NcoI_F dan

IFN_XhoI_R pada klon transforman 1-11 menunjukkan positif semuanya dengan

terdapatnya pita yang berukuran 510 pb (Gambar 4.8). Hasil keseluruhan

menunjukkan bahwa pada 11 klon transforman terdapat insert gen human ifn α2a

pada vektor rekombinan (pET-32b(+)-IFN α2a) yang telah masuk ke inang

kloning E. coli DH5α.

4.5 Kultivasi dan Isolasi Vektor Rekombinan

Klon transforman 1-11 hasil transformasi pada inang kloning E. coli DH5α

selanjutnya dikultivasi pada media LB cair yang ditambah ampisilin untuk proses

miniprep. Isolasi vektor rekombinan (miniprep) pada 11 klon transforman

dilakukan dengan metode lisis alkali. Tahap pelisisan dilakukan pada suasana

alkali (pH 12) karena molekul DNA kromosom terfragmentasi dan terdenaturasi,

sedangkan DNA plasmid terdenaturasi tetapi masih saling terpaut antara masing-

masing untai dan tidak terpotong karena ukurannya kecil (Sudjadi, 2008). Tujuan

kultivasi dan isolasi plasmid adalah untuk memperoleh vektor rekombinan yang

selanjutnya dilakukan analisis restriksi dan disekuensing.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Gambar 4.9 Elektroforesis Hasil Miniprep Klon Transforman di E. coli DH5α.

Keterangan: (1) Marker; (2) Klon 1; (3) Klon 2; (4) Klon 3; (5) Klon 4; (6) Klon 5; (7) Klon 6; (8) Klon 7; (9) Klon 8; (10) Klon 9; (11) Klon 10; (12) Klon 11.

Elektroforesis hasil miniprep pada klon transforman 1-11 menunjukkan

positif semua dengan terdapatnya pita yang berukuran 6355 pb pada sumuran 2

6355 pb


sampai 12 (Gambar 4.9). Hal ini menunjukkan bahwa proses miniprep pada klon

transforman 1-11 telah berhasil dilakukan dengan baik. Dalam melakukan isolasi

DNA plasmid harus memperhatikan keberadaan DNA genom yang berasal dari

sel bakteri. Adanya kontaminasi dari DNA genom bakteri dapat mempengaruhi

keberhasilan kloning DNA (Radji, 2011). Hasil isolasi vektor rekombinan (pET-

32b(+)-IFN α2a) pada klon transforman 1, 2, 3, 4, 11 dipilih untuk dilakukan

pengecekan lebih lanjut menggunakan metode PCR. Proses PCR menggunakan

primer gabungan antara primer IFN_NcoI_F dengan pET_Screen_R dan

pET_Screen_F dengan IFN_XhoI_R. Hasil PCR yang diperoleh selanjutnya

dilakukan cek dengan dielektroforesis pada gel agarosa 1,5%.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Gambar 4.10 Elektroforesis Skrining Metode PCR Menggunakan Primer

(IFN_NcoI_F dengan pET_Screen_R) dan (Primer pET_Screen_F dengan

IFN_XhoI_R) pada Hasil Miniprep Klon 1, 2, 3, 4, dan Klon 11 E. coli DH5α.

Keterangan: (1) Klon 1; (2) Klon 2; (3) Klon 3; (4) Klon 4; (5) Klon 11; (6) Marker; (7) Klon 1; (8) Klon 2 ; (9) Klon 3; (10) Klon 4; (11) Klon 11.

Elektroforesis hasil PCR dengan primer IFN_NcoI_F dan pET_Screen_R

pada hasil miniprep klon transforman 1, 2, 3, 4, dan klon 11 menunjukkan positif

semuanya dengan terdapatnya pita yang berukuran benar disekitar 600 pb

(Gambar 4.10 nomor 1-5). Elektroforesis hasil PCR dengan primer pET_Screen_F

dengan IFN_XhoI_R pada hasil miniprep klon transforman 1, 2, 3, 4, dan klon 11

juga menunjukkan hasil positif semuanya dengan terdapatnya pita yang berukuran

500 pb

1000 pb

600 pb

1000 pb


benar disekitar 1000 pb. Hal ini menunjukkan bahwa pada klon transforman 1, 2,

3, 4, dan klon 11 terdapat vektor rekombinan (pET-32b(+)-IFN α2a) yang telah

masuk ke dalam inang E. coli DH5α.

Hasil minirep vektor rekombinan pada klon transforman 2 selanjutnya

dipilih dan dipurifikasi dengan menggunakan metode fenol kloroform. Proses

purifikasi bertujuan untuk menghilangkan RNAse pada proses isolasi DNA

rekombinan. RNAse digunakan pada proses miniprep berfungsi untuk

membersihkan DNA dari RNA (Radji, 2011). Metode analisis restriksi dilakukan

pada hasil miniprep klon transforman 2 yang sudah dilakukan purifikasi. Hasil

miniprep pada klon transforman 2 dilakukan pemotongan ganda dengan

menggunakan enzim restriksi Xho I dan Nco I. Vektor rekombinan (pET-32b(+)-

IFN α2a) yang telah dipotong selanjutnya dilakukan pengecekan dengan

dielektroforesis pada gel agarosa 1%.

1 2 3

Gambar 4.11 Elektroforesi Hasil Pemotongan Vektor Rekombinan Klon 2.

Keterangan: (1) Marker; (2) Vektor pET-32b(+); (3) Vektor rekombinan klon 2 dipotong enzim Xho I dan Nco I.

Pemotongan hasil miniprep vektor rekombinan klon transforman 2 yang

sudah dipurifikasi dengan metode menghasilkan dua buah pita yang berukuran

5845 pb dan 510 pb (Gambar 4.11). Pita yang berukuran 5845 pb menunjukkan

vektor pET-32b(+), sedangkan pita yang berukuran 510 pb menunjukkan

terdapatnya insert. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa vektor rekombinan

pada klon transforman 2 telah berhasil dipotong oleh enzim Xho I dan Nco I dan

mempunyai insert (gen human ifn α2a). Klon transforman 2 selanjutnya dipilih

500 pb 750 pb

5899 pb 5845 pb

510 pb


untuk dikultivasi pada media LB cair 200 mL yang telah ditambah ampisilin

untuk perbanyakan vektor rekombinan (pET-32b(+)-IFN α2a). Isolasi dan

purifikasi vektor rekombinan dilakukan dengan menggunakan Qiagen Plasmid

Maxi Kit.

Hasil Qiagen Plasmid Maxi Kit selanjutnya diukur konsentrasinya dengan

menggunakan alat Nanophotometer. Hasil pengukuran menunjukkan A260/A280:

1,851 dan diperoleh konsentrasi 405 ng/µl. Kemurnian larutan DNA dihitung

dengan membandingkan absorbansi pada panjang gelombang 260 nm dan

absorbansi pada panjang gelombang 280 nm. Nilai kemurnian DNA hasil isolasi

dan purifikasi menggunakan Qiagen Plasmid Maxi Kit adalah 1,851 sehingga

telah murni dan dapat digunakan untuk tahapan selanjutnya. Rasio A 260/A280

antara 1,8-2,0 mencerminkan DNA yang relatif murni dan terbebas dari

kontaminan protein (Muladno, 2010).

1 2

Gambar 4.12 Elektroforesis Hasil Qiagen Plasmid Maxi Kit.

Keterangan: (1) Marker; (2) Hasil Qiagen Plasmid Maxi Kit Klon 2.

Elektroforesis hasil Qiagen Plasmid Maxi Kit pada gel agarosa 1%

menunjukkan terdapatnya pita yang berukuran 6355 pb (Gambar 4.12). Hal ini

menunjukkan bahwa proses isolasi dan purifikasi menggunakan Qiagen Plasmid

Maxi Kit telah berhasil dilakukan dan diperoleh vektor rekombinan dengan

konsentrasi 405 ng/ µl. Hasil elektroforesis vektor rekombinan terdapat dua pita

menunjukkan vektor yang dicek mempunyai 2 bentuk yaitu supercoil dan relaxed

circular. Urutan migrasi bentuk-bentuk vektor pada elektroforesis gel dari yang

paling cepat adalah supercoil, supercoiled denaturated, relaxed circular, linear,

6355 pb


dan nicked open circular. Vektor rekombinan (pET-32b(+)-IFN α2a) dari klon 2

hasil Qiagen Plasmid Maxi Kit selanjutnya dilakukan analisis sekuensing untuk

mengetahui urutan nukleotidanya. Sekuensing DNA merupakan teknik yang dapat

dimanfaatkan untuk menentukan urutan basa nukleotida suatu gen ataupun sekuen

genom total suatu sel atau organisme (Radji, 2011). Analisis urutan nukleotida

dengan metode sekuensing dilakukan di perusahaan Macrogen Korea dengan

menggunakan dua primer yaitu Stag-18mer-primer dan T7terminator-primer.

Gambar 4.13 Hasil Alignment Sekuen Klon 2 dengan Stag-18mer-primer.

Gambar 4.14 Hasil Alignment Sekuen Klon 2 dengan T7terminator-primer.


Urutan nukleotida hasil sekuensing vektor rekombinan klon transforman 2

selanjutnya disejajarkan dengan urutan nukleotida human IFN α2a pada GenBank

menggunakan program MultAlin (Multiple sequence alignment). Berdasarkan

analisis urutan nukleotida menggunakan primer Stag-18mer-primer dan

T7terminator-primer menunjukkan bahwa urutan nukleotida DNA insert (gen

human ifn α2a) klon transforman 2 memiliki urutan yang sama dengan urutan

nukleotida human IFN α2a pada GenBank DI084466.1 dan tidak terdapat mutasi

(Gambar 4.13 dan 4.14). Berdasarkan data yang diperoleh, maka dapat

disimpulkan bahwa pada klon transforman 2 telah membawa gen human ifn α2a

yang benar dalam vektor rekombinan sehingga vektor rekombinan (pET-32b(+)-

IFN α2a) dapat digunakan untuk tahapan penelitian selanjutnya.

4.6 Transformasi Vektor Rekombinan ke E. coli BL21(DE3)

Vektor rekombinan (pET-32b(+)-IFNα2a) dari klon transforman 2 dengan

insert yang benar selanjutnya ditransformasikan ke sel E. coli galur BL21(DE3)

sebagai inang ekspresi. Sistem ekspresi untuk produksi protein rekombinan dalam

E. coli melalui kombinasi antara vektor dan galur E. coli sebagai inang ekspresi

(Sørensen dan Mortensen, 2005). Proses transformasi dilakukan dengan perlakuan

kejut panas (heat shock) pada suhu 42⁰C selama 90 detik (Radji, 2011). Hasil dari

transformasi selanjutnya ditumbuhkan pada media padat LB yang telah

ditambahkan ampisilin.

A B


C D

E

Gambar 4.15. Hasil Transformasi Vektor Rekombinan pada E. coli BL21(DE3).

Keterangan: (A) Inokulasi 20 µl; (B) Inokulasi 50 µl; (C) Inokulasi 80 µl; (D) Inokulasi 350 µl; (E) Kontrol negatif.

Hasil transformasi vektor rekombinan ke inang ekspresi sel kompeten E.

coli BL21(DE3) diinokulasikan pada media LB padat yang mengandung ampisilin

dengan metode sebar. Hasil transformasi vektor rekombinan (pET-32b(+)-

IFNα2a) dari klon transforman 2 ke sel kompeten E. coli BL21(DE3)

menunjukkan diperolehnya banyak klon transforman (Gambar 4.15). Banyaknya

klon transforman yang tumbuh menunjukkan bahwa proses transformasi yang

dilakukan berhasil dengan baik. Escherichia coli merupakan inang umum yang

digunakan untuk produksi protein rekombinan, meskipun terdapat gen yang

kurang efisien apabila diekspresikan pada organisme ini (Srivastva et al., 2005).

4.7 Skrining dan Verifikasi Klon Transforman di E coli BL21 (DE3)

Klon transforman E. coli BL21(DE3) yang diperoleh diseleksi

menggunakan media padat LB selektif yang mengandung ampisilin. Verifikasi


masuknya vektor rekombinan pET-32b(+)-IFN α2a pada inang ekspresi E. coli

BL21(DE3) dilakukan dengan menggunakan metode PCR colony screening. Klon

transforman dipilih 7 secara acak dan dilakukan PCR skrining menggunakan

primer pET_Screen_F dengan pET_Screen_R dan IFN_NcoI_F dengan

IFN_XhoI_R. Hasil dari PCR colony screening kemudian dilakukan pengecekan

dengan metode elektroforesis pada medium agarosa 1%.

1 2 3 4 5 6 7 8

Gambar 4.16 Elektroforesis Hasil PCR Skrining dengan Primer pET_Screen_F

dan pET_Screen_R pada Klon Transforman E. coli BL21(DE3).

Keterangan: (1) Marker; (2) Klon 1; (3) Klon 2; (4) Klon 3; (5) Klon 4; (6) Klon 5; (7) Klon 6; (8) Klon 7.

1 2 3 4 5 6 7 8

Gambar 4.17 Elektroforesis Hasil PCR Skrining dengan Primer IFN_NcoI_F dan

IFN_XhoI_R pada Klon Transforman E. coli BL21(DE3).

Keterangan: (1) Marker; (2) Klon 1; (3) Klon 2; (4) Klon 3; (5) Klon 4; (6) Klon 5; (7) Klon 6; (8) Klon 7.

1000 pb 1500 pb

500 pb 750 pb

1100 pb

510 pb


Metode PCR colony screening pada ketujuh klon transforman di E. coli

BL21(DE3) dilakukan menggunakan metode yang serupa dengan PCR colony

screening pada klon transforman di E. coli DH5α. Elektroforesis hasil PCR

skrining dengan primer pET_Screen_F dan pET_Screen_R pada ketujuh klon

transforman diperoleh pita yang berukuran sekitar 1100 pb (Gambar 4.16). Hal ini

menunjukkan bahwa vektor rekombinan (pET-32b(+)-IFNα2a) telah masuk ke

inang ekspresi E. coli BL21(DE3). Ketujuh klon transforman juga dilakukan PCR

skrining dengan menggunakan primer IFN_NcoI_F dan IFN_XhoI_R diperoleh

pita berukuran 510 pb yang mana merupakan ukuran gen human ifn α2a (Gambar

4.17). Keselruhan hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa vektor rekombinan

(pET-32b(+)-IFNα2a) telah berhasil ditranformasikan pada inang ekspresi E. coli

BL21(DE3) dengan baik.

4.8 Ekspresi, Isolasi dan Karakterisasi Protein Rekombinan Human IFN α2a

Klon transforman E. coli BL21(DE3) yang telah dipastikan mempunyai

vektor rekombinan (pET-32b(+)-IFNα2a) selanjutnya dilakukan uji ekspresi

protein. Ketujuh klon transforman dilakukan uji ekspresi protein pada skala kecil

dengan menggunakan medium produksi yaitu media LB cair 10 ml yang ditambah

ampisilin dan diinkubasi pada suhu 37⁰C. Induksi dilakukan dengan penambahan

IPTG pada kultur sel yang telah mencapai OD600 sekitar 0,5 dengan konsentrasi

akhir IPTG 1 mM. Reagen IPTG berfungsi melepas represi promotor sehingga

diperoleh ekspresi protein rekombinan dalam jumlah yang tinggi (Grompe et al.,

1998). Pemanenan kultur dilakukan pada waktu 1, 2, dan 3 jam setelah inkubasi.

Isolasi protein rekombinan human IFN α2a dilakukan pada protein yang terlarut

pada medium kultivasi (supernatan) dan protein tidak terlarut (pelet). Pelet

selanjutnya diresuspensi menggunakan bufer PBS 1x. Hasil isolasi protein pada

supernatan dan pelet kemudian dianalisis menggunakan SDS-PAGE yang

dilanjutkan dengan Western blot atau pewarnaan CBB.


1 2 3 4 5 6 7 8 9

Gambar 4.18 Western Blot Klon 1 Inkubasi 37⁰C IPTG 1 mM.

Keterangan: (1) Pelet 0 jam; (2) Supernatan 0 jam; (3) Marker; (4) Pelet 1 jam; (5) Supernatan 1 jam; (6) Pelet 2 jam; (7) Supernatan 2 jam; (8) Pelet 3 jam;

(9) Supernatan 3 jam.

Hasil SDS PAGE yang dilanjutkan Western blot pada klon 1 yang

diinkubasi pada suhu 37⁰C dengan induksi IPTG 1 mM menunjukkan terdapatnya

pita tebal pada pelet dan pita tipis pada supernatan yang mempunyai berat

molekul sekitar 36 kDa (Gambar 4.18). Pita tersebut merupakan berat molekul

dari protein rekombinan IFN α2a yang terfusi dengan thioredoxin dan 6x histidin.

Pendeteksian terdapatnya protein rekombinan IFN α2a pada Western blot

menggunakan antibodi monoklonal anti interferon α yang spesifik. Waktu 0 jam

merupakan level basal ekspresi protein sebelum dilakukan induksi. Hasil yang

diperoleh juga menunjukkan bahwa inkubasi pada suhu 37⁰C dengan induksi

IPTG 1 mM maka protein rekombinan human IFN α2a lebih dominan

diekspresikan dalam bentuk tidak terlarut.

Ekspresi protein rekombinan sebagai protein terfusi mempunyai manfaat

dapat dibuat konstruksi gen yang lebih menguntungkan, memungkinkan ekspresi

level tinggi protein terlarut (Kapust dan Waugh, 1999) dengan menurunkan

kecenderungan pembentukan badan inklusi (Lilie et al., 1998). Formasi pelipatan

dan pembentukan ikatan disulfida pada protein target dapat ditingkatkan dengan

fusi thioredoxin pada E. coli galur defisiensi thioredoxin reductase (trxB)

(Fathallah et al., 2009). Banyak protein yang normalnya diproduksi dalam bentuk

tidak terlarut pada E. coli menjadi lebih terlarut jika difusikan dengan sekuen N-

terminal thioredoxin (LaValline et al., 1993; Novy et al., 1995).

20 kDa

30 kDa

36 kDa

60 kDa

80 kDa 120 kDa

35 kDa


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Gambar 4.19 Pewarnaan CBB Klon 2, 3, 6, dan 7 Inkubasi 37⁰C IPTG 1 mM.

Keterangan: (1) Pelet 3 jam klon 7; (2) Supernatan 3 jam klon7; (3) Supernatan 3 jam klon 6; (4) Pelet 3 jam klon 6; (5) Supernatan 3 jam klon 2; (6) Pelet 3 jam

klon 2; (7) Supernatan 3 jam klon 3; (8) Pelet 3 jam klon 3; (9) Pelet 0 jam klon 3; (10) Marker.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Gambar 4.20 Pewarnaan CBB Klon 4 dan Klon 5 Inkubasi 37⁰C IPTG 1 mM.

Keterangan: (1) Supernatan 4 jam klon 5; (2) Supernatan 3 jam klon 5; (3) Supernatan 4 jam klon 4; (4) Supernatan 3 jam klon 4; (5) Marker; (6) Pelet 4 jam klon 5; (7) Pelet 3 jam klon 5; (8) Pelet 4 jam klon 4;

(9) Pelet 3 jam klon 4; (10) Pelet 0 jam klon 4.

Hasil elektroforesis SDS-PAGE dengan pewarnaan CBB pada klon 2, 3, 6,

dan klon 7 dengan membandingkan waktu inkubasi 3 jam setelah induksi IPTG

juga menunjukkan adanya pita tebal yang mempunyai berat molekul sekitar 36

kDa pada pelet (Gambar 4.19). Hasil elektroforesis SDS-PAGE dengan

pewarnaan CBB pada klon 4 dan klon 5 dengan membandingkan waktu inkubasi

3 jam dan 4 jam setelah induksi IPTG juga menunjukkan terdapatnya pita tebal

yang mempunyai berat molekul sekitar 36 kDa pada pelet (Gambar 4.20). Hasil

yang diperoleh menunjukkan bahwa inkubasi pada suhu 37⁰C dengan induksi

36 kDa

36 kDa


IPTG 1 mM klon 2, 3, 4, 5, 6, dan klon 7 maka protein rekombinan human IFN

α2a yang lebih dominan diekspresikan dalam bentuk tidak terlarut sama seperti

hasil ekspresi pada klon 1.

Hasil uji ekspresi skala kecil pada klon 1, 2, 3, 4, 5, 6, dan klon 7

menunjukkan bahwa protein rekombinan human IFN α2a telah berhasil

diekspresikan pada sel E. coli BL21(DE3). Pita tebal protein terdapat pada E. coli

setelah dilakukan induksi dengan IPTG. Hal ini menunjukkan bahwa

overproduksi protein rekombinan human IFN α2a telah berhasil dilakukan.

Protein rekombinan yang diperoleh dalam bentuk protein terfusi sehingga

mengalami penambahan berat molekul. Protein rekombinan human IFN α2a

mempunyai berat molekul 19 kDa dengan fusi tagnya mempunyai berat molekul

17 kDa sehingga berat molekul total adalah 36 kDa. Penelitian Yu-Ling Sun et al.

(2011) tentang ekspresi rabbit neutrophil peptide-1 dalam vektor pET-32b(+)

pada inang E. coli Rosetta-gami(DE3)pLysS menyatakan bahwa fusi Trx-(His)6-

tag mempunyai ukuran sekitar 17 kDa setelah dilakukan pemotongan

menggunakan enterokinase. Ekspresi rabbit neutrophil peptide-1 dengan induksi

IPTG 1 mM pada suhu 37⁰C dihasilkan protein terlarut setelah dilakukan

ekstraksi dengan disonikasi.

Klon 3 selanjutnya dipilih dan dilakukan uji ekspresi lebih lanjut

menggunakan variasi suhu 28⁰C, 30⁰C, dan 37⁰C dengan induksi IPTG 1 mM.

Pemanenan kultur setelah induksi dilakukan pada waktu 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 jam, dan

kultur semalam. Variasi suhu dilakukan pada penelitian ini bertujuan untuk

mencari optimasi suhu pada ekspresi protein rekombinan human IFN α2a terfusi

sehingga diperoleh hasil ekspresi protein rekombinan human IFN α2a yang

maksimal. Pemanenan kultur dilakukan pada berbagai waktu inkubasi bertujuan

untuk mencari waktu yang tepat untuk pemanenan sehingga diperoleh hasil

ekspresi maksimal protein rekombinan human IFN α2a.


1 2 3 4 5 6 7 8 9

Gambar 4.21 Pewarnaan CBB Pelet Klon 3 Inkubasi 37⁰C IPTG 1 mM.

Keterangan: (1) Pelet 10 jam; (2) Pelet 9 jam; (3) Pelet 8 jam; (4) Pelet 7 jam; (5) Pelet 6 jam; (6) Pelet 5 jam; (7) Pelet 4 jam; (8) Pelet 3 jam; (9) Marker.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Gambar 4.22 Pewarnaan CBB Supernatan Klon 3 Inkubasi 37⁰C IPTG 1 mM.

Keterangan: (1) Marker; (2) Supernatan 0 jam; (3) Supernatan 3 jam; (4) Supernatan 4 jam; (5) Supernatan 5 jam; (6) Supernatan 6 jam; (7) Supernatan

7 jam; (8) Supernatan 8 jam; (9) Supernatan 9 jam; (10) Supernatan 10 jam.

Hasil SDS PAGE dengan pewarnaan CBB pada klon 3 yang diinkubasi

pada suhu 37⁰C dengan induksi IPTG 1 mM menunjukkan terdapatnya pita yang

mempunyai berat molekul sekitar 36 kDa (Gambar 4.21 dan Gambar 4.22).

Perbandingan hasil ekspresi protein pada supernatan dan pelet menunjukkan

bahwa ekspresi protein rekombinan human IFN α2a dengan waktu pemanenan 3,

4, 5, 6, 7, 8, 9, dan 10 jam setelah induksi lebih dominan diekspresikan dalam

bentuk tidak terlarut yaitu terdapat pada pelet sel.

36 kDa

36 kDa


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Gambar 4.23 Western Blot Klon 3 Inkubasi 30⁰C IPTG 1 mM.

Keterangan: (1) Marker; (2) Pelet 0 jam; (3) Pelet 5 jam; (4) Supernatan 5 jam; (5) Pelet 6 jam; (6) Supernatan 6 jam; (7) Pelet 7 jam; (8) Supernatan 7 jam;

(9) Pelet semalam; (9) Supernatan semalam.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Gambar 4.24 Pewarnaan CBB Klon 3 Inkubasi 30⁰C IPTG 1 mM.

Keterangan: (1) Pelet 4 jam; (2) Pelet 3 jam; (3) Pelet 2 jam; (4) Pelet 1 jam; (5) Marker; (6) Supernatan 4 jam; (7) Supernatan 3 jam; (8) Supernatan 2 jam;

(9) Supernatan 1 jam; (10) Supernatan 0 jam.






2, 3, 4, 5, 6, 7 jam dan semalam setelah induksi lebih dominan diekspresikan

dalam bentuk tidak terlarut pada pelet sel.

36 kDa

36 kDa


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Gambar 4.25 Pewarnaan CBB Pelet Klon 3 Inkubasi 28⁰C IPTG 1 mM.

Keterangan: (1) Pelet semalam; (2) Pelet 8 jam; (3) Pelet 7 jam; (4) Pelet 6 jam; (5) Pelet 5 jam; (6) Pelet 4 jam; (7) Pelet 3 jam; (8) Pelet 2 jam;

(9) Marker; (10) Pelet 0 jam.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Gambar 4.26 Pewarnaan CBB Supernatan Klon 3 Inkubasi 28⁰C IPTG 1 mM.

Keterangan: (1) Pelet 1 jam; (2) Marker; (3) Supernatan 2 jam; (4) Supernatan 3 jam (5) Supernatan 4 jam; (6) Supernatan 5 jam; (7) Supernatan 6 jam (8) Supernatan 7 jam; (9) Supernatan 8 jam; (10) Supernatan semalam.






2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 jam dan semalam setelah induksi lebih dominan diekspresikan

dalam bentuk tidak terlarut yaitu terdapat pada pelet sel.

36 kDa

36 kDa


Keberhasilan ekspresi protein rekombinan dipengaruhi oleh banyak faktor

diantaranya plasmid dengan fusi tag yang digunakan, galur E. coli untuk inang

ekspresi dan sifat protein yang diekspresikan. Beberapa strategi yang berbeda

dapat digunakan tergantung pada kebutuhan protein untuk diekspresikan. Ekspresi

protein yang toksik pada sel inang dapat menyebabkan lisisnya sel sehingga hasil

yang diperoleh kurang optimal (Tolia dan Joshua-Tor, 2006). Pada penelitian ini

telah berhasil dilakukan ekspresi protein rekombinan human IFN α2a pada E. coli

galur BL21(DE3).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Gambar 4.27 Pewarnaan CBB Pelet Klon 3 Suhu 28⁰C, 30⁰C, 37⁰C IPTG 1 mM.

Keterangan: (1) Marker; (2) Pelet 3 jam (28⁰C); (3) Pelet 4 jam (28⁰C); (4) Pelet 5 jam (28⁰C); (5) Pelet 3 jam (30⁰C); (6) Pelet 4 jam (30⁰C); (7) Pelet 5 jam

(30⁰C); (8) Pelet 3 jam (37⁰C); (9) Pelet 4 jam (37⁰C); (10) Pelet 5 jam (37⁰C).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Gambar 4.28 Western Blot Pelet Klon 3 Suhu 28⁰C, 30⁰C, 37⁰C IPTG 1 mM.

Keterangan: (1) Marker; (2) Pelet 3 jam (28⁰C); (3) Pelet 4 jam (28⁰C); (4) Pelet 5 jam (28⁰C); (5) Pelet 3 jam (30⁰C); (6) Pelet 4 jam (30⁰C); (7) Pelet 5 jam

(30⁰C); (8) Pelet 3 jam (37⁰C); (9) Pelet 4 jam (37⁰C); (10) Pelet 5 jam (37⁰C).

36 kDa

36 kDa


1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Gambar 4.29 Western Blot Supernatan Klon 3 Suhu 28⁰C, 30⁰C, 37⁰C

IPTG 1 mM.

Keterangan: (1) Marker; (2) Supernatan 3 jam (28⁰C); (3) Supernatan 4 jam (28⁰C); (4) Supernatan 5 jam (28⁰C); (5) Supernatan 3 jam (30⁰C);

(6) Supernatan 4 jam (30⁰C); (7) Supernatan 5 jam (30⁰C); (8) Supernatan 3 jam (37⁰C); (9) Supernatan 4 jam (37⁰C); (10) Supernatan 5 jam (37⁰C).

Hasil SDS PAGE klon 3 dengan pewarnaan CBB (Gambar 4.27) dan

Western blot (Gambar 4.28) yang membandingkan hasil ekspresi protein

rekombinan human IFN α2a pada pelet sel yang diinduksi IPTG 1 mM dengan

variasi suhu 28⁰C, 30⁰C, dan 37⁰C menunjukkan bahwa ekspresi optimal

diperoleh pada suhu inkubasi 37⁰C dengan rentang waktu pemanenan antara 3

sampai 5 jam setelah induksi. Hasil SDS PAGE klon 3 dengan Western blot

(Gambar 4.29) yang membandingkan hasil ekspresi protein rekombinan human

IFN α2a pada supernatan yang diinduksi IPTG 1 mM dengan variasi suhu 28⁰C,

30⁰C, dan 37⁰C menunjukkan bahwa ekspresi maksimal diperoleh pada suhu

inkubasi 30⁰C dengan waktu pemanenan 3 jam setelah induksi.

Kuantifikasi data tingkat ekspresi pada penelitian ini dilakukan dengan

cara analisis densitometri pita hasil Western blot pada pelet (Gambar 4.28) dan

supernatan (Gambar 4.29) menggunakan sistem digitalisasi automatik program

UN-SCAN-IT Gel versi 6.1. Kuantifikasi yang dilakukan yaitu dengan

membandingkan hasil piksel total pada masing-masing sampel yang terdeteksi

sehingga dapat dibandingkan tingkat ekspresi pada masing-masing perlakuan dan

diketahui hasil yang maksimal. Piksel total merupakan jumlah total keseluruhan

piksel dalam area pita.

36 kDa


Tabel 4.1

Hasil Kuantifikasi Tingkat Ekspresi pada Pelet dan Supernatan.

Hasil kuantifikasi menggunakan program UN-SCAN-IT menunjukkan

bahwa piksel total tertinggi pada pelet diperoleh pada suhu inkubasi 37⁰C dengan

waktu pemanenan 5 jam, sedangkan piksel total tertinggi pada supernatan

diperoleh pada suhu inkubasi 30⁰C dengan waktu pemanenan 3 jam (Tabel 4.1).

Oleh karena itu, dapat diambil kesimpulan bahwa ekspresi protein rekombinan

human IFN α2a yang diinduksi IPTG 1 mM dengan variasi suhu 28⁰C, 30⁰C, dan

37⁰C menunjukkan hasil ekspresi maksimal pada pelet sel diperoleh pada suhu

inkubasi 37⁰C dengan waktu pemanenan 5 jam setelah induksi. Hasil ekspresi

maksimal pada supernatan diperoleh pada suhu inkubasi 30⁰C dengan waktu

pemanenan 3 jam setelah induksi. Berdasarkan keseluruhan hasil penelitian, maka

hasil terbaik ditunjukkan pada ekspresi protein rekombinan human IFN α2a yang

diinduksi IPTG 1 mM pada suhu inkubasi 37⁰C dengan waktu pemanenan 5 jam

setelah induksi.

Isolasi protein human IFN α2a pada pelet sel pada penelitian ini dilakukan

dengan pemecahan dinding sel bakteri menggunakan metode sonikasi. Sonikasi

merupakan aplikasi gelombang ultrasonik untuk mengaduk partikel dalam suatu

sampel yang dapat digunakan untuk mempercepat pelarutan suatu materi dengan

memecah reaksi intermolekuler. Isolasi pada pelet sel bertujuan untuk mengetahui

protein human IFN α2a diekspresikan dalam bentuk terlarut atau bentuk agregrat

yang tidak terlarut (badan inklusi) pada sitoplasma. Isolasi badan inklusi

Perlakuan Piksel Total Pelet Supernatan

3 jam (28⁰C) 143960 71505 4 jam (28⁰C) 154760 77770 5 jam (28⁰C) 149549 82115 3 jam (30⁰C) 142012 129810 4 jam (30⁰C) 135055 87573 5 jam (30⁰C) 150057 65391 3 jam (37⁰C) 148327 39584 4 jam (37⁰C) 173122 24274 5 jam (37⁰C) 181773 18872


dilakukan dengan metode sentrifugasi dan solubilisasi menggunakan bufer yang

mengandung guanidine hydrochloride dan merkaptoetanol.

1 2 3 4 5

Gambar 4.30 Pewarnaan CBB Hasil Isolasi Protein dari Pelet.

Keterangan: (1) Badan inklusi; (2) Pencucian ke 2; (3) Pencucian ke 1; (4) Protein terlarut; (5) Marker.

Hasil SDS PAGE dengan pewarnaan CBB menunjukkan bahwa pita

protein rekombinan human IFN α2a yang mempunyai berat molekul sekitar 36

kDa lebih banyak diekspresikan dalam bentuk terlarut dibandingkan bentuk badan

inklusi (Gambar 4.30). Pada proses pencucian yang pertama juga masih

menunjukkan terdapatnya protein rekombinan human IFN α2a (Gambar 4.30 no

3). Hal ini bisa disebabkan pada proses pengambilan supernatan masih

terdapatnya sisa-sisa pada tabung. Hasil penelitian yang telah diperoleh

menunjukkan bahwa protein rekombinan human IFN α2a lebih dominan

diekspresikan dalam bentuk terlarut di sitoplasma. Ekspresi protein rekombinan

dalam bentuk terlarut mempunyai keuntungan diantaranya yaitu proses

purifikasinya lebih menghemat biaya dan tidak memakan waktu daripada

refolding dan purifikasi pada badan inklusi (Fathallah et al., 2009). Data

peneletian yang sebelumnya menyatakan bahwa protein IFN α yang diekspresikan

pada E.coli seringnya dalam bentuk badan inklusi dalam sitoplasma

(Swaminathan dan Khanna, 1999; Bedarrain et al., 2001; Srivasta et al., 2005).

Berbagai strategi untuk meningkatkan kelarutan protein rekombinan yang

diproduksi pada E. coli dapat dilakukan dengan cara pembatasan agregrasi invivo

protein yang diantaranya melaui kultivasi pada temperatur yang lebih rendah,

36 kDa


penurunan konsentrasi penginduksi, dan sistem ekspresi dengan promotor yang

indusibel. Level induksi yang rendah juga dilaporkan dapat meningkatkan

kelarutan protein yang diekspresikan (Baneyx dan Mujacic, 2004). Oleh karena

itu, perlu dilakukan optimasi faktor-faktor lingkungan seperti temperatur, media,

dan konsentrasi penginduksi dalam mengekspresikan suatu gen. Pada penelitian

ini telah berhasil diperoleh protein terfusi rekombinan human IFN α2a dalam

bentuk terlarut di sitoplasma yang diekspresikan pada inang E. coli BL21(DE3)

menggunakan media LB dengan suhu inkubasi 37⁰C dan waktu pemanenan 5 jam

setelah induksi IPTG 1 mM.


BAB 5

KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan

Berdasarkan hasil penelitian secara keseluruhan menunjukkan bahwa gen

human ifn α2a telah berhasil dimasukkan ke dalam vektor pET-32b(+)

membentuk vektor rekombinan pET-32b(+)-IFN α2a. Vektor rekombinan juga

telah berhasil ditransformasikan pada inang kloning E. coli DH5α dan selanjutnya

ditansformasikan pada inang ekspresi E. coli BL21(DE3). Ekspresi protein

rekombinan human IFN α2a dengan induksi IPTG 1 mM pada variasi suhu 28⁰C,

30⁰C, dan 37⁰C menunjukkan bahwa hasil optimal diperoleh pada suhu inkubasi

37⁰C dengan waktu pemanenan 5 jam setelah induksi. Protein rekombinan human

IFN α2a yang diperoleh lebih dominan diekspresikan dalam bentuk terlarut di

sitoplasma sebagai protein terfusi dengan berat molekul sekitar 36 kd.

5.2 Saran

Protein rekombinan human IFN α2a pada penelitian masih perlu dilakukan

pemisahan fusi tag dan purifikasi sehingga didapatkan protein rekombinan yang

murni. Protein rekombinan human IFN α2a yang telah murni perlu diuji

aktivitasnya secara in vitro mengunakan sel mamalia dan uji in vivo menggunakan

hewan uji dengan dibandingkan IFN α2a komersial. Hasil penelitian ini juga perlu

dilakukan scale up untuk mendapatkan protein rekombinan human IFN α2a dalam

jumlah yang lebih banyak.

68


DAFTAR PUSTAKA

Arbabi M., Alasti F., Sanati M.H., Hosseini S., Deldar A., and Maghsoudi N. (2003). Kloning and expression of human gamma-interferon cDNA in E. Coli. Iraian Journal of Biotechnology, 1 (2), 87-94.

Aulanni’am. (2004). Prinsip dan Teknik Analisis Biomolekul. Fakultas Pertanian

Universitas Brawijaya Press. Azhahianambi P., Ghosh S., Kumar A., and Suryanaraya V.V.S. (2008). Cost

effectiveness of colony lysis and colony PCR methods for screening of recombinant Escherichia coli colonies--a comparative study. Indian J Exp Biol. 46 (10), 731-735.

Baneyx F., and Mujacic M. (2004). Recombinant protein folding and misfolding

in Escherichia coli. Nat. Biotechnol., 22, 1399-1408. Bedarrain A., Cruz Y., Cruz O., Navarro M., and Gil M. (2001). Purification and

conformational properties of a human interferon alpha2b produced in Escherichia coli. Biotechnol. Appl. Biochem., 33, 173-182.

Brassard D.L., Grace M.J., and Bordens R.W. (2002). Interferon-α as an

immunotherapeutic protein. Journal of Leukocyte Biology, 71, 565-581. Chiti F., Stefani M., Taddei N., Ramponi G., and Dobson C.M. (2003).

Rationalization of the effects of mutations on peptide and protein aggregation rates. Nature, 424, 805-808.

Fathallah M.D., Carthage T., Rabhi-Essafi I., and Coteaux M. (2009). Method for

the production of high-level soluble human recombinant interferon alpha in E. coli and vectors useful for such a production. US Patent Application Publication. US 2009/0258394 A1.

Fuh G., Mulkerrin M. G., Bass S., McFarland N., Brochier M., Bourell J. H.,

Light D. R., and Wells J. A. (1990). The human growth hormone receptor. Secretion from Escherichia coli and disulfide bonding pattern of the extracellular binding domain. J. Biol. Chem., 265, 3111-31153.

Grompe M., Johnson W., and Jameson L. (1998). Recombinant DNA and genetic

techniques. In Principles of molecular medicine. Edited by J. Larry Jameson. Humana Press Inc. Totowa, New Jersey.

Hodgson J. (1993). Expression sistems: a user’s guide. Bio/Technology, 11, 887-

893.


Jeong W., and Shin H.C. (1998). Supply of the argU gene product allows high-level expression of recombinant human interferon-α2a in Escherichia coli. Biotechnology Letters, 20 (1), 19-22.

Jonasch E., and Haluska F.G. (2001). Interferon in oncological practice : review

of interferon biology, clinical application, and toxicities. The Oncologist, 6, 34-55.

Kapust R.B., and Waugh D.S. (1999). Escherichia coli maltose-binding protein is

uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused. Protein Sci., 8, 1668-1674.

Klaus W., Gsella B., Labhardta A.M., Wipfa B., Senn H. (1997). The three-

dimensional high relarutan structure of human interferon α-2a determined by heteronuclear NMR spectroscopy in larutan. Journal of Molecular Biology, 274 (4), 661-675.

Kiefhaber T., Rudolph R., Kohler H.H., and Buchner J. (1991). Protein

aggregation in vitro and in vivo: a quantitative model of the kinetic competition between folding and aggregation. Biotechnology (NY), 9, 825-829.

LaVallie E.R., DiBlasio E.A., Kovacic S., Grant K.L., Schendel P.F., and McCoy

J.M. (1993). A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Bio/Technology, 11, 187-93.

Lilie H., Schwarz E., and Rudolph,R. (1998). Advances in refolding of proteins

produced in E. coli. Curr. Opin. Biotechnol., 9, 497-501. Makrides S.C. (1996). Strategies for achieving high-level expression of genes in

Escherichia coli. Microbiol Rev., 60 (3), 512-538. Meager A. (2006). The Interferons: characterization and application. WILEY-

VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim. Middelberg A. (2002). Preparative protein refolding. Trend Biotechnol., 20, 437. Muladno. (2010). Teknologi rekayasa genetika, Edisi Kedua. Penerbit IPB Press.

Bogor. Mustofa I., Mahaputra L., Dachlan Y.P., Rantam F.A., dan Hinting A. (2006).

Analisis densitometrik protein reseptor fertilisasi (ZP3) pada zona pelusida kambing sebagai kandidat bahan imunokontrasepsi. Media Kedokteran Hewan., 22 (2).

Novagen. https://wasatch.biochem.utah.edu/chris/links/pET32.pdf.


https://wasatch.biochem.utah.edu/chris/links/pET32.pdf�

Novy R., Berg J., Yaeger K., and Mierendorf,R. (1995). inNovations, 3, 7-9. Obeid D., and Bauvois B. (2006). Interferons: mechanisms, biological activities

and survey of their use in human diseases. Current Bioactive Compounds, 2 (4), 431-444.

Pang K.R., Wu J.J., Huang D.B., Tyring S.K., and Baron S. (2005). Biological

and clinical basis for molecular studies of interferons. In Interferon methods and protocols. Edited by Daniel J.J. Carr. Humana Press Inc., Totowa, New Jersey.

pET Sistem Manual (11th ed). (2006). Novagen. EMD Biosciences Inc., an

affiliate of Merck KGaA, Darmstadt, Germany. Rabhi-Essafi I., Sadok A., Khalaf S.A., and Fathallah D.M. (2007). A strategy for

high-level expression of soluble and functional interferon f as a GST fusion protein in E. coli. Protein Engineering, Design & Selection, 20 (5), 201-209.

Radji M. (2011). Rekayasa genetika pengantar untuk profesi kesehatan. Penerbit

Sagung Seto. Jakarta. Rezvani K., Teng Y., Pan Y., Dani J.A., Lindstrom J., Gras E.A.G., McIntosh

J.M., and Biasi M.D. (2009). UBXD4, a UBX-containing protein, regulates the cell surface number and stability of 3-containing nicotinic acetylcholine receptors. The Journal of Neuroscience, 29 (21), 6883-6896.

Roche. 2010. Roferon-A (Interferon alpha-2a). Australia. http://www.roche-

australia.com/fmfiles/re7229005/downloads/anti-virals/roferon-pi.pdf. Roy R.K., Sapatnekar S.M., and Deshmukh R.A. (2005). The Effect of heat shock

on production of recombinant human interferon alpha 2a by Escherichia coli. Iranian Biomedical Journal, 9 (4), 155-162.

Samuel C.E. (2001). Antiviral actions of interferons. Clin Microbiol Rev., 14 (4),

778-809. Siregar M.L. (2009). Peningkatan mutu standar kualitas hasil cetakan

mengunakan kombinasi pengaturan. Tesis. Fakultas Teknik Universitas Indonesia Press-Jakarta.

Sørensen H.P., and Mortensen K.K. (2005). Advanced genetic strategies for

recombinant expression in Escherichia coli. J Biotechnol, 115,113-128. Srivasta P., Bhattacharaya P., Pandey G., and Mukherjee K.J. (2005).

Overexpression and purification of recombinant human interferon alpha2b in Escherichia coli. Protein Expr. Purif., 41, 313-322.


http://www.roche-australia.com/fmfiles/re7229005/downloads/anti-virals/roferon-pi.pdf�

http://www.roche-australia.com/fmfiles/re7229005/downloads/anti-virals/roferon-pi.pdf�

Studier F.W., Rosenberg A.H., Dunn J.J., Dubendorff J.W. (1990). Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol., 185, 60-89.

Sudjadi. (2008). Bioteknologi kesehatan. Penerbit Kanisius. Yogyakarta, Swaminathan,S. and Khanna,N. (1999). Affinity purification of recombinant

interferon-alpha on a mimetic ligand adsorbent. Protein Expr. Purif., 15, 236-242.

Tae-Ok Bae, Ho-Jin Chang, Jung Ho Kim, and Soon Jae Park. (1995).

Purification and Characteization of Recombinant Human Interferon Alpha 2a Produced from Saccharomyces cerevisiae. J. Biochem. Mol. Biol., 28 (6), 477-483.

Tan Hoan Tjay, dan Rahardja K. (2007). Obat-Obat Penting Khasiat,

Penggunaan, dan Efek-Efek Sampingya. Jakata: PT Elex Media Komputindo.

Tolia N. H., and Joshua-Tor L. (2006). Strategies for protein coexpression in

Escherichia coli. Nature Methods, 3 (1), 55-64. Villaverde A., and Carrio M.M. (2003). Protein aggregation in recombinant

bacteria: biological role of inclusion bodies. Biotechnol Lett., 25, 1385-1395.

Xiaowei Li, Xin sui, Yan Zhang, Yepen Sun, Yan Zhao, Ying Zhai and Qingyu

Wang. (2010). An improved calcium chloride method preparation and transformation of competent cells. African Journal of Biotechnology, 9 (50), 8549-8554.

Yon J.M. (2002). Protein folding in the post-genomic era. J Cell Mol Med., 6,

307-327. Yu-Ling Sun, Yi-Juain Lin, and Chih-Sheng Lin. (2011). Soluble expression and

production of rabbit neutrophil peptide-1 in Escherichia coli. Romanian Biotechnological Letters, 16 (5), 6618-6629.

Zhang Y., Olsen D.R., Nguyen K.B., Olson P.S., Rhodes E.T. and Mascarenhas

D. (1998). Expression of eukaryotic proteins in soluble form in E. coli. Protein Exp Purif., 12, 159-165.


Lampiran 1. Skema Kerja Penelitian

Amplifikasi dengan PCR Pemotongan Purifikasi Purifikasi fenol kloroform Pemotongan Purifikasi fenol kloroform

Skrining dan verifikasi klon transforman (PCR colony screening, isolasi vektor rekombinan, analisis restriksi, sekuensing)

Kultivasi dan isolasi vektor rekombinan pET-32b(+)-IFN α2a

Skrining dan verifikasi klon transforman (PCR colony screening)

Kultivasi dan ekspresi sel transforman

(induksi dengan IPTG)

Isolasi protein rekombinan human IFN α2a

Analisis elektroforesis SDS-PAGE (Western blot dan Pewarnaan CBB)

Penyiapan vektor pET-32b(+)

Penyiapan DNA insert

Ligasi DNA insert dan vektor pET-32b(+)

Transformasi ke E. coli DH5α (inang kloning)

Transformasi ke E. coli BL21(DE3) (inang ekspresi)


Lampiran 2. Vektor pcDNA3.1+:IFN-Gene


Lampiran 3. Hasil Sekuen Klon 2 E. coli DH5α dengan Stag-18mer-primer


“Lanjutan”


Lampiran 4. Hasil Sekuen Klon 2 E. coli DH5α dengan T7terminator primer


”Lanjutan”


Lampiran 5. Nukleotida Human Interferon Alpha 2a (GenBank: DI084466.1)


kloning gen human interferon alpha 2a pada …lib.ui.ac.id/file?file=digital/20334169-t32560-arizah...

Documents