128 • PETNIÈKE SVESKE 73 DEO I

Janko Šušteršiè i Marija Milutinoviæ

Konstrukcija digitalnogholografskog mikroskopa

Princip rada digitalnog holografskog mikro-skopa zasniva se na snimanju holograma, in-terferentne slike dva svetlosna talasa, na CCDkameri i rekonstrukciji holograma numerièkimputem uz moguænost promene uveæanja, kojenije ogranièeno osobinama optièkih elemenata,veæ prvenstveno zavisi od procesa rekonstrukcijei karakteristika kamere. Osnova procesa nume-rièke rekonstrukcije je Frenel-Kirhofov integralkoji opisuje difrakciju talasa na mikro-strukturiholograma. Uspešno su snimljeni i rekonstrui-sani hologrami krila insekata i tkiva pokoriceluka za razlièite vrednosti uveæanja u opsegu od100 do 400 puta, a zatim su dobijeni hologramiuporeðeni sa izgledom uzoraka pod optièkim mi-kroskopom uveæanja od 400 puta. Za konstruk-ciju aparature korišæen je He-Ne laser talasnedu�ine 633 nm kao izvor koherentne svetlosti imikroskopski objektiv uveæanja 40 puta. Maksi-malno postignuto uveæanje u kombinaciji saobjektivom je pribli�no 400 puta. Znaèaj radaogleda se u prednosti upotrebe digitalnog holo-grafskog mikroskopa, kao i jednostavnosti, pre-glednosti i kratkom vremenu izvršavanja pro-grama.

Uvod

Denis Gabor je 1971. godine dobio Nobelovunagradu za izuzetan doprinos optici koji je daopronalaskom holografije, jednostavnog naèinaza zapisivanje trodimenzionalne slike. Holo-gram, koji je najèešæe dvodimenzionalni zapis nafotoosetljivom materijalu, omoguæava dobijanjetrodimenzionalnog lika koristeæi interferenciju idifrakciju svetlosti.

Intereferencija predstavlja prostornu prera-spodelu jaèine svetlosti usled superpozicije sve-tlosnih, elektromagnetnih talasa. Jaèina svetlostijednaka je srednjoj vrednosti energije koja ujedinici vremena proðe kroz jedinicu površinenormalno na pravac prostiranja svetlosti i pro-porcionalna je kvadratu talasne amplitude. Uko-liko dva sferna monohromatska talasa jednakihamplituda A0, kru�nih frekvencija � i talasnogbroja k, u poèetnom trenutku osciluju u fazi, unekom trenutku t, u datoj taèki na udaljenosti s1

od prvog i s2 od drugog izvora, njihove elon-gacije æe imati vrednosti A A t ks1 0 1� � sin( )� iA A t ks2 0 2� � sin( )� , a fazna razlika ovih talasaæe biti �� � ks ks2 1 . Kao rezultat superpozicijetalasa formira se talasni front takav da je u svakojtaèki rezultujuæeg monohromatskog zraèenjaelongacija jednaka zbiru elongacija pojedinaènih

talasa A A ks s

t� ��

�

����2

202 2cos sin � . Dakle, pri

slaganju talasa dolazi do preraspodele jaèine sve-tlosti u prostoru, pri èemu intenzitet dobijenogtalasa mo�e imati vrednosti od 0 do 4I0, u zavi-snosti od fazne razlike (Kadelburg et al. 2011).

Dva zraka su koherentna ukoliko imaju jed-nake kru�ne frekvencije i konstantnu faznu raz-liku tokom vremena. Kako su za interferencijupotrebna dva koherentna svetlosna zraka, zarazliku od fotografije, za snimanje hologramaneophodan je laser koji predstavlja izvor kohe-rentne svetlosti.

Difrakcija je pojava odstupanja talasa od pra-volinijskog prostiranja pri prolasku kroz otvoreili pored neprovidnih prepreka reda velièine tala-sne du�ine svetlosti. Na osnovu zakona geome-trijske optike u ovim sluèajevima bi razlikovali

Janko Šušteršiè (1996), Kragujevac, PrvoslavaStojanoviæa 6/7, uèenik 3. razreda Prvekragujevaèke gimnazije u Kragujevcu

Marija Milutinoviæ (1996), Loznica, SlobodanaPeneziæa 4, uèenica 3. razreda Gimnazije ,,VukKarad�iæ” u Loznici

MENTOR: Dr Dejan Panteliæ, Institut za fiziku,Zemun

mesta jasne osvetljenosti i oblasti senke. Meðu-tim, prilikom pojave difrakcije svetlost zalazi ugeometrijsku senku, a u okolini granica preprekejaèina svetlosti postaje neravnomerno raspo-reðena. Difrakcija se kvalitativno objašnjavaHajgensovim principom, po kome se sve taèketalasnog fronta mogu posmatrati kao meðusobnonezavisni jednaki taèkasti izvori sfernih talasaèije obvojnice formiraju novi talasni front. Uposmatranoj taèki sredine, amplituda i intenzitettalasa se odreðuju kao rezultat interferencijesekundarnih talasa koji kao da izviru iz odre-ðenih zona. Tako dobijena interferentna slika senaziva difrakciona slika (Nedeljkoviæ 2009).

Kada na fotoploèu padaju dva sferna kohe-rentna talasa ili jedan ravan i jedan sferni, na fo-toploèi se dobija interferentna slika sastavljenaod koncetriènih prstenova razlièitih polupre-ènika i debljina koja se naziva zonska ploèa. De-bljina prstenova i razmaci izmeðu susednihprstenova su reda velièine talasne du�ine svet-losti, pa nakon ponovnog prolaska svetlosti krozzonsku ploèu mo�e doæi do difrakcije svetlostikoja predstavlja uslov za rekonstrukciju holo-grama.

Proces dobijanja holograma se mo�e podelitina dva dela: snimanje holograma i rekonstrukcijuholograma.

Šema snimanja holograma prikazana je naslici 1. Najpre se rašireni laserski snop podelideliteljem snopa na dva talasa od kojih jedanpada direktno na fotoploèu, a drugi se reflektujeod predmeta i potom pada na ravan holograma.Reflektovani talas nastaje superpozicijommnogo sfernih talasa koji se odbijaju od površinepredmeta, a njegov talasni front zavisi od oblika

reflektujuæe površine. Ovaj talas se nazivanoseæi, jer nosi informaciju o osvetljenom pred-metu. Uporedni talas je ravan ili sferni talas kojineometano sti�e na fotoploèu. Na fotoploèi do-lazi do interferencije uporednog i noseæeg talasa,a dobijena interferenta slika na odgovarajuæinaèin zapisana na fotoploèi predstavlja holo-gram. Na hologramu dolazi do preklapanja višezonskih ploèa nastalih od brojnih talasa refle-ktovanih od predmeta snimanja koje se seku podrazlièitim uglovima. Dakle, prilikom nastankaholograma na njemu se zapisuju odnos intenzi-teta svetlosnih talasa, koji je srazmeran kvadratutalasne amplitude, i fazna razlika svetlosnihtalasa, koja zavisi od reljefa površine objekta, štoomoguæava dobijanje prostornog, trodimenz-ionalnog lika.

Pri snimanju holograma u svaku taèku foto-ploèe dolazi reflektovani svetlosni talas sa svaketaèke predmeta tj. svaki deliæ holograma sadr�iinformaciju o celom snimljenom objektu. Tro-dimenzionalni lik predmeta stvara se difrakcijomuporednog talasa èak i na malom delu holo-grama. Meðutim, dobijeni lik ima proporci-onalno manju površinu i manju jasnoæu od likadobijenog rekonstrukcijom celog holograma, jeršto je manji deo holograma to je manje svetlostipalo na njega.

Difrakcija je osnovni proces pri rekonstru-kciji holograma. Prilikom rekonstrukcije na ho-logram se usmeri referentni talas, isti kao onajkoji je korišèen prilikom snimanja. Na mikro-strukturi holograma dolazi do difrakcije svet-losnog talasa èime se dobija snop divergirajuæihzraka koji formiraju realan lik predmeta, sime-trièno polo�aju predmeta u odnosu na fotoploèu.

ZBORNIK RADOVA 2014 FIZIKA • 129

Slika 1. Snimanje holograma

Figure 1. Hologram recording

130 • PETNIÈKE SVESKE 73 DEO I

Ukoliko referentni talas pada na ploèu pod istimuglom pod kojim je padao i prilikom snimanja,imaginarni lik nastaje na istom mestu i u istompolo�aju u odnosu na ploèu kao što je bio polo�ajpredmeta tokom snimanja. Na slici 2 je prikazanposmatraè koji gleda iza holograma i u presekuprodu�etaka difraktovanih zraka vidi imaginarnilik na istom mestu gde se nalazio predmet u tre-nutku snimanja holograma. Dobijeni lik pred-meta je trodimenzionalan, a menjanjem uglaposmatranja moguæe je videti predmet iz razli-èitih perspektiva.

Napredak i razviæe kompjuterske tehnologijeomoguæilo je prelazak procesa snimanja ili pro-cesa rekonstrukcije na raèunar. Prvi prilaz preds-tavlja kompjuterski generisanu holografiju(CGH), proces nastajanja veštaèkih hologramanumerièkim metodama, koji se mogu rekonstru-isati optièkim putem. Ovaj rad æe se, meðutim,oslanjati na numerièku rekonstrukciju holo-grama koju su osnovali Jaroslavski et al. poèet-kom 70-ih godina prošlog veka. Oni su prikazalioptièki uveæane delove Frenelovih holograma,kod kojih su dimenzije holograma zanemarljiveu odnosu na rastojanje od predmeta do fotoploèe,i Furijeovih holograma, kod kojih se dimenzijeholograma ne mogu zanemariti, snimljenih nafotoploèi, a zatim su ovi digitalizovani „tradici-onalni” hologrami rekonstruisani numerièki(Yaroslavskii et al. 1980). Hadad et al. su prviopisali holografski mikroskop zasnovan na nu-merièkoj rekonstrukciji Furijeovih holograma(Haddad et al. 1992).

Veliki iskorak bio je Šnars i Juptnerov razvojdirektnog snimanja Frenelovih holograma po-moæu CCD (eng. charged coupled device) sen-zora. Ovaj metod omoguæava snimanje i obradu

holograma bez nepotrebnih meðukoraka i nepo-uzdanih hemijskih reakcija, što je znaèajnopojednostavilo i ubrzalo proces digitalne holo-grafije. Termin digitalna holografija prvi putupotrebljavaju Šnars i Juptner u ovom radu i od-nosi se na celokupni proces optièkog snimanjaholograma na CCD-u i numerièke rekonstrukcijedobijenog holograma (Schnars et al. 2002).

Najva�nija karakteristika digitalnih hologra-fskih mikroskopa je da uveæanje nije ogranièenoosobinama optièkih elemenata, veæ prvenstvenozavisi od procesa rekonstrukcije i karakteristikaCCD kamere. Osim dobijanja prostornog, trodi-menzionalnog lika predmeta, digitalna holo-grafija pru�a moguænost snimanja tela u pokretu,snimanje oblika neprovidnih i indeksa prela-manja providnih tela, zbog èega ima široku pri-menu, naroèito u biofizici (Wenbo et al. 2001).

Aparatura i metod

Za stvaranje dva koherentna svetlosna talasa,kao jedno od moguæih rešenja iskorišæen je de-litelj snopa za podelu laserskog zraka na objektnii uporedni. Šema aparature je data na slici 3.

U eksperimentu je korišæen He-Ne laser ta-lasne du�ine 633nm, èiji zrak koji je padao poduglom od 45° na prvi delitelj laserskog snoparazdvojen na dva, meðusobno ortogonalna sve-tlosna snopa. Prvi zrak, nakon prolaska kroz de-litelj, prolazi kroz polarizator i pada na ogledalopostavljeno pod uglom od 45° u odnosu na pra-vac zraka. Ovaj zrak predstavlja objektni talas.Laserski zrak zatim nailazi na uzorak postavljenna pokretnu šinu, koja omoguæava fino pode-šavanje razdaljine uzorka od objektiva, u svrhufokusiranja slike na odgovarajuæem rastojanju.

Slika 2.Rekonstrukcija holograma

Figure 2.Hologram reconstruction

Iza uzorka postavljen je objektiv, tako da deosnopa koji proðe kroz uzorak pada direktno nasoèivo objektiva. Korišæeni objektiv uveæanja 40puta i numerièke aperture 0.65 ima sliènu ulogukao i kod optièkih mikroskopa, obezbeðuje pri-marno uveæanje snimljenog uzorka jer stvarauveæan, realan lik na poznatom rastojanju odre-ðenom udaljenosti uzorka i ujedno širi laserskisnop kako bi došlo do interferencije dva zraka naèitavoj površini CCD kamere. Objektni talaszatim prolazi kroz drugi delitelj laserskog snopa ipada na CCD senzor.

Drugi zrak, referentni talas, nakon odbijanjaod delitelja prolazi kroz polarizator i reflektuje seod ogledala postavljenog pod uglom od 45° uodnosu na pravac zraka i pada na soèivo �i�nedaljine 25 mm, èija je glavna optièka osa para-lelna laserskom snopu i podlozi i koje ima uloguda raširi laserski snop, pretvarajuæi ravan talaskoji potièe od lasera u sferni, koji se zatim odbijaod delitelja i pada ortogonalno na CCD kameru.

Pre nego što objektni i referentni talas inter-feriraju na površini CCD senzora oni prolazekroz dodatni polarizator. Upotreba polarizatora udigitalnoj holografskoj mikroskopiji u ovomradu proizašla je iz potrebe za izjednaèavanjemintenziteta referentnog i objektnog talasa. Kakoreferentni talas nesmetano dolazi do CCD ka-mere, dok objektni prolazi kroz uzorak i nekolikooptièkih elemenata, on ima mnogo veæi intenzitetod objektnog, što dovodi do manje izra�ene in-terferencije i velikog šuma pri rekonstrukcijiholograma. Kao rešenje ovog problema namet-nulo se uvoðenje tri polarizatora, prvi i drugi koji

æe razlièito polarizovati objektni i referentnizrak, i treæi kroz koji æe oba zraka proæi i koji æenjihov polaritet izjednaèiti, jer prethodno na-vedeni zakoni inerferencije ne va�e za razlièitopolarisane svetlosne talase. Prvi i treæi polariza-tor imaju pribli�no paralelne ravni polarizacije,dok se rotacijom ravni polarizacije drugog po-larizatora mo�e kontrolisati intenzitet referent-nog talasa.

Velièina piksela CCD kamere Sony XCL--V500 iznosi 7.4 μm � 7.4 μm, a broj piksela podu�ini kraæe i du�e stranice iznosi 494 i 648redom. Objektni i referentni talas interferiraju napovršini CCD senzora, intenzitet dobijenog ta-lasa se zapisuje u svakom pikselu CCD kamere,nastaje interferentna slika u vidu brojnih svetlih itamnih pruga èime je proces snimanja hologramazavršen.

Metod rekonstrukcijeholograma numerièki

Hologram se rekonstruiše tako što se osvetlionim uporednim zrakom koji je korišæen za pra-vljenje istog. Time nastaje imaginarni lik pred-meta koji se ni po èemu ne razlikuje od stvarnogpredmeta. Matematièki, talas se mo�e predstavitikompleksnim brojem èiji moduo predstavlja am-plitudu, a argument fazu datog talasa. Oznaèimosa O x y o x y ei x yO( , ) ( , ) ( , )� � � objektni i sa R x y( , ) �� �r x y ei x yR( , ) ( , )� uporedni talas. Interferencijomovih talasa nastaje hologram. Intenzitet inter-ferentne slike u taèki (x, y) srazmeran je kvadratuamplitude zbira objektnog i uporednog talasa u

ZBORNIK RADOVA 2014 FIZIKA • 131

Slika 3. Šema aparature

Figure 3. Scheme of theapparatus

132 • PETNIÈKE SVESKE 73 DEO I

toj taèki, I x y O x y R x y( , ) ( , ) ( , )� | |2 . Koristeæiosobinu komplesnih brojeva da je proizvod ko-mpleksnog broja i njemu konjugovanog kom-pleksnog broja jednak kvadratu amplitude,dobija se razvijeni oblik prethodne jednakosti:

� � � �I x y O x y R x y O x y R x y( , ) ( , ) ( , ) ( , ) ( , )� �

� o r O x y R x y O x y R x y2 2 ( , ) ( , ) ( , ) ( , )

gde z oznaèava konjugovano kompleksni brojbroju z. Elongacija zapisa h x y( , )na fotoploèi (ilibilo koje druge sredine), koja se još naziva i ho-logramska funkcija, data je formulom h x y( , ) �� h I x y

0�� ( , ), gde je � konstanta, � vreme izlo-

�enosti ploèe svetlosnom zraku i h0

amplitudazapisa neizlo�ene ploèe. U digitalnoj holografijikoja koristi CCD kameru kao sredinu za sni-manje h

0se mo�e izostaviti. Pri rekonstrukciji

holograma, fotoploèa se osvetljava referentnimzrakom, što je u digitalnoj holografiji ekviva-lentno mno�enju hologramske fukcije komp-leksnim brojem koji opisuje uporedni zrak i timese dobija:

R x y h x y o r R x y( , ) ( , ) ( ) ( , )� � �� 2 2

�� ��r O x y R x y r O x y R x y2 2( , ) ( , ) ( , ) ( , )

Prvi sabirak u ovoj formuli, referentni zrakpomno�en koeficijentom ��( )o r2 2 , predstavljaneprelomljeni zrak, zrak najveæeg intenzitetakoji nije difraktovao, veæ je pravolinijski prošaokroz fotoploèu. Drugi sabirak predstavlja talaskoji kreira imaginarni lik, dok koeficijent ��r 2

utièe na osvetljenost lika. Treæi sabirak pred-stavlja talas od koga nastaje stvaran lik i koji senalazi na istom rastojanju od ploèe kao i ima-ginarni, samo sa suprotne strane.

Ukoliko se umesto jednog objektnog talasaiskoriste dva talasa reflektovana od dva razlièitastanja predmeta, prethodna formula se mo�e is-koristiti u svrhu holografske interferometrije,vrlo precizne metode za posmatranje deforma-cija neprovidnih tela ili variacija indeksa prela-manja providnih sredina, npr. teènosti i gasova(mogu se primetiti promene du�ine puta zraka dostotog dela talasne du�ine). U tom sluèaju, for-mula dobija oblik I x y o( , ) ( cos )� 2 12 �� iz kogase vidi direktna zavisnost intenziteta interfe-rentne slike od fazne razlike, koja sadr�i in-formaciju o deformaciji objekta. Kako je kosinusparna funkcija, nije moguæe izraèunati faznurazliku i deformaciju predmeta samo na osnovujedne informacije, te je nastalo nekoliko tehnikarekonstrukcije fazne razlike snimanjem dodatnihinformacija. Jedna od tehnika jeste rekonstru-kcija pomoæu Frenelove transformacije.

Difrakcija svetlosnog talasa na hologramukoji je postavljen normalno na izvor svetlostiopisana je Frenel-Kirhofovim integralom, èiji jerezultat kompleksan broj koji opisuje realan liksnimljenog predmeta:

G R x y h x ye

i

( , ) ( , ) ( , )� �� �

���

� � ��

�

�

�

��1

2

� 12

1( cos )� d dx y

gde je � � �� ( ) ( )x y d2 2

1

2 rastojanje iz-

meðu taèke na hologramu i taèke na ravni rekon-strukcije, � ugao koji nakon prolaska krozhologramsku ploèu zaklapa svetlosni zrak sa no-rmalom, a x i y i � i� su horizontalne i vertikalnekoordinate holograma i ravni rekonstrukcije,

Slika 4. Rekonstrukcijaholograma numerièki

Figure 4. Numericalreconstruction ofholograms

redom, kao što je prikazano na slici 4. Rekonst-rukcija imaginarnog lika je moguæa dodavanjem

karakteristika soèiva L x y ei

fx y

( , )( )

�

��

2 2

u Fre-nel-Kirhofov integral. Intenzitet I( , )� � se mo�eizraèunati kao kvadrat amplitude talasa | |2G( , )� �

a faza � � � � �� �

( , ) arctanIm( ( , ))

Re( ( , ))� G

G, gde se Im od-

nosi na imaginarni, a Re na realni deo kompleks-nog broja.

Ako su x, y, � i�koordinate male u poreðenjusa rastojanjem d1 izmeðu ravni holograma i ravnirekonstrukcije, mo�e se iskoristiti aproksimacija

� � �� d

x

d

y

d1

2

1

2

12 2( ) ( )

kao i da je cos� �1, što

nakon uvšæavanja u formulu dovodi do jednaèinekoja se naziva Frenelova transformacija. Frene-lovom transformacijom dobija se realan lik kon-

stantne rezolucije izra�ene formulom ��

� �� d

N xi

��

� �� d

M y, gde je � talasna du�ina svetlosti kori-

šæena prilikom snimanja holograma, d rastojanjepredmeta od ravni holograma, N i M broj pikselapo du�ini i širini CCD kamere, a �x i �y du�ina iširina piksela. Da bi se postigla bolja rezolucijapri veæim uveæanjima potrebno je sve više sma-njivati rastojanje d. Meðutim, pri malim rasto-janjima se ne mo�e iskoristiti aproksimacija, pase ni Frenelov transform ne mo�e primeniti udigitalnoj holografskoj mikroskopiji.

Upravo s namerom da se prevaziðu fizièkeprepreke uveæanju slike pri numerièkoj rekon-strukciji holograma, razvijen je drugi pristupobrade dobijenih informacija sa CCD kamere,metod konvolucije. Frenel-Kirhofov integral semo�e zapisati kao:

G R x y h x y g x y x y( , ) ( , ) ( , ) ( , , , )� ��

� ���

�

�

�

��1

d d

gde je funkcija g x y( , , , )� � data sa

g x yi e

x y

i x y d

( , , , )( ) ( )

( ) ( )

� �� � �

��

� �

� �

2

2 2

2 2 2

d 2,

pri èemu je ponovo korišæna aproksimacijacos � �1. Kako je g x y g x y( , , , ) ( , )� � � �� pro-storna invarijanta, prethodni integral zadovo-ljava uslove za primenu teoreme konvolucije,koja tvrdi da Furijeov transform proizvoda fun-

kcija R h� i g jednak proizvodu Furijeovihtransforma tih funkcija. Prema tome, konaènaformula za dobijanje realnog lika je:

G( , )� � � 1{ {h R� } � {g}}

gde predstavlja Furijeov, 1 inverzni Furijeovtransform date funkcije.

Za potrebe numerièke rekonstrukcije fun-kciju g je neophodno diskretizovati, èime onadobija finalni oblik:

g k li e

kN

x

i kN

x lM

y dr

( , )

( )

( ) ( )

� �

�

��2

2 2

2

2 2 2 2 2

2

� �

� 2 2 2 2

2 ( )l

My dr�

U ovom eksperimentu kao referentni talaskorišæen je sferni talas èiji se izvor nalazi na ra-stojanju dr od CCD kamere, pa se funkcija R

mo�e predstaviti kao:

R k le

kN

x

i kN

x lM

y dr

( , )

( ) (

( ) ( )

�

2

2 2

2 2

2 2 2 2 2

2

��

� �

� lM

y dr 2

2 2 2) �

Velièina piksela dobijene slike primenomkonvolucione metode jednaka je velièini pikselana CCD kameri. Meðutim, ukoliko se numerièkarekonstrukcija vrši pomoæu referentnog talasa narastojanju manjem ili veæem od dr, dobija se uve-æena, odnosno umanjena slika sa istim brojempiksela. Prema tome, i rezolucija dobijene slikedirektno zavisi od uveæanja koje je dato for-

mulom Md

d

d

dr r

� !"#

$%&

11

1

, gde je dr1 rastojanje

referentnog talasa od ravni holograma korišæenoprilikom rekonstrukcije (Schnars et al. 2002). Naovaj naèin moguæe je postiæi bilo koje uveæanjebirajuæi odgovarajuæe rastojanje prilikom rekon-strukcije. U stvarnosti to nije moguæe, kako jeformula samo aproksimacija koja va�i u ideali-zovanim uslovima. Nesavršenost aparature, kao ièinjenica da pikseli CCD kamere nisu bezdi-menzione taèke veæ kvadrati konaène površine,dovode do toga da pri veæim uveæanjima slikagubi kvalitet, pa je uveæanje rekonstrukcije na tajnaèin ogranièeno.

Kako je neprelomljeni zrak mnogo veæegintenziteta nego ostatak holograma, neophodnoje prvo izvršiti trešholding (eng. thresholding), tj.odstranjivanje piksela svetlijih i tamnijih od ne-

ZBORNIK RADOVA 2014 FIZIKA • 133

134 • PETNIÈKE SVESKE 73 DEO I

kih empirijski utvrðenih granica. Tako dobijenusliku potrebno je logaritmovati, kako bi se sma-njio uticaj neprelomljenog zraka. Tek tada slikapostaje jasno vidljiva.

Ukoliko dolazi do preklapanja slike i ne-prelomljenog zraka, moguæe ga je delimièno ilipotpuno ukloniti koristeæi se odgovarajuæim ma-tematièkim modelom. Kako je h x y( , ) = h x y( , ) =� o r ro2 2 2 prva dva sabirka dovode do stva-ranja neprelomljenog zraka, dok treæi variraizmeðu +2ro i –2ro i njegova srednja vrednost je-dnaka je 0. Oduzimanjem srednje vrednosti ma-trice h:

IMN

I k x l ym

l

N

k

M

� ��

�

''1

0

1

0

1

( , )� �

od svakog njenog èlana, a zatim njenom rekon-strukcijom, dobija se slika kojoj je odstranjenneprelomljeni zrak èime je proces rekonstrukcijezavršen.

Rezultati i diskusija

Od raspolo�ivih optièkih elemenata u Istra-�ivaèkoj stanici Petnica, uspešno je konstruisanaaparatura za snimanje i ostvaren digitalni procesrekonstrukcije dobijenih holograma, koji zahte-vaju veliku stabilnost jer vibracije reda velièinemikrometra dovode do velikih promena. Ovimeje pokazano da se u uslovima optièke laboratorijekorišæenjem elementarnih optièkih elemenata

Pseudokod za funkciju rekonstrukcije digitalnog holograma

funkcija holo (matrica realnih brojeva h, realan broj dr1){

h = h – suma_elemenata(h)/(du�ina_matrice_h* širina_matrice_h)for k = 1 do du�ina_matrice_h

for k = 1 do širina_matrice_hg(j,k) = (i/lmb)*exp((-2*i*pi/lmb)*sqrt(d1^2+((j-M/2)*dy1)^2+((k-N/2)*dx1)^2))/sqrt(d1^2+((j-M/2)*dy1)^2+((k-N/2)*dx1)^2);R(j,k) = exp((i*2*pi/lmb)*sqrt((dr1)^2+(dy*(j-M/2))^2+(dx*(k-N/2))^2))/sqrt((dr1)^2+(dy*(j-M/2))^2+(dx*(k-N/2))^2);

h(j,k) = h(j,k)*R(j,k);end_for

end_forcon1 = fast_fourier_transform(h);con2 = fast_fourier_transform (g);img = inverse_fast_fourier_transform (con1*con2);for k = 1 do du�ina_matrice_h

for k = 1 do širina_matrice_himg(j,k) = abs(img(j,k))^2;if (img(j,k)>gornja_granica)

img(j,k) = gornja_granica;end_ifif (img(j,k)<donja_granica)

img(j,k) = donja_granica;end_ifimg(j,k) = log10(img(j,k));if (img(j,k)<min) min = img(j,k); end_ifif (img(j,k)>max) max = img(j,k); end_if

end_forend_forimg = img – min;img = img/max;

}

mo�e konstruisati holografski mikroskop, pa kaotakav pru�a moguænost upotrebe kao alternativnemetode mikroskopiranja.

Maksimalna postignuta vrednost uveæanjaputem numerièke rekonstrukije je pribli�no 10puta. U kombinaciji sa upotrebljenim objek-tivom èije je uveæanje 40 �, ukupno uveæanjekoje je postignuto konstruisanim digitalnimholografskim mikroskopom je oko 400 �. Ovavrednost se ne mo�e taèno odrediti, jer zavisiprvenstveno od rezolucije kamere i drugih kara-kteristika aparature, ali i od potreba u èiju svrhuse mikroskop koristi. Ispitivanjem karakteristika

konstruisanog mikroskopa utvrdili smo posto-janje graniène vrednosti uveæanja, takve da se priveæim uveæanjima rezolucija rekonstrukcije nemenja, odnosno uveæanje se vrši na raèun pove-æanja broja istovetnih piksela. Teorijski se pred-viða da je ova vrednost obrnuto proporcionalnadimenzijama piksela CCD kamere. U sluèajuaparature korišæene u ovom radu, vrednost grani-ènog uveæanja je 364 �. Na slikama su prikazanisnimljeni hologrami, rekonstruisani hologrami ioptièke slike snimljenih objekata pomoæu optiè-kog mikroskopa uveæanja 400 �.

ZBORNIK RADOVA 2014 FIZIKA • 135

Slika 5. a) Hologram pokorice luka; b) Rekonstruisani hologram pokorice luka uveæan 125 puta;c) Rekonstruisani hologram pokorice luka uveæan 125 puta bez neprelomljenog zraka; d) Optièka slika

pokorice luka

Figure 5. a) Hologram of onion crust; b) Reconstruction of onion crust hologram magnified 125� ;c) Reconstruction of onion crust hologram magnified 125�without DC term; d) Optical image of onion crust

136 • PETNIÈKE SVESKE 73 DEO I

Podudarnost koja se uoèava na rekonstruisa-nim hologramima i optièkim slikama dobijenimna mikroskopu ukazuje na moguænost upotrebeove vrste mikroskopa kao alternativne metode zaposmatranje bioloških uzoraka. Postignuto uve-æanje ogranièeno je velièinom piksela i površi-nom CCD kamere, pa bi se upotrebom kamereboljih karakteristika ostvarila moguænost veæeguveæanja i stvaranje slika digitalnog holograf-skog mikroskopa bolje rezolucije.

Zakljuèak

U laboratorijskim uslovima uspešno je kon-struisan holografski mikroskop od raspolo�ivihoptièkih elemenata. U kombinaciji sa objekti-vom uveæanja 40 �, ukupno postignuto uveæanjeprimenom programa za rekonstrukciju je prib-li�no 400 puta. Princip rekonstrukcije hologramaodlikuje se nestandardnom jednostavnošæu ipreglednošæu, kao i zadovoljavajuæom brzinom

Slika 6. a) Rekonstruisani hologram krila mušice uveæan 400 puta; b) Optièka slika krila mušice

Figure 6. a) Reconstruction of fly wing hologram magnified 400�; b) Optical image of fly wing

Slika 7. a) Rekonstruisani hologram krila mušice uveæan 400 puta; b) Optièka slika krila mušice

Figure 7. a) Reconstruction of fly wing hologram magnified 400�; b) Optical image of fly wing

izvršavanja koja omoguæava snimanje i rekon-strukciju video snimaka u realnom vremenu. Us-pešno su snimljeni i rekonstruisani hologramikrila insekata i tkiva pokorice luka za razlièitevrednosti uveæanja u opsegu od 100 do 400 puta,a zatim su dobijeni hologrami uporeðeni sa op-tièkim slikama uzoraka snimljenim optièkim mi-kroskopom uveæanja 400 puta. Primeæena jepodudarnost rekonstruisanih holograma i opti-èkih slika uzoraka.

Znaèaj ovog projekta ogleda se u promeniuveæanja rekonstruisanog holograma snimljenogdigitalnim holografskim mikroskopom neza-visno od osobina optièkih elemenata. Ograni-èenje koje se javlja uslovljeno je samo velièinompiksela na CCD kameri, ali i pored toga, pokaza-no je da je moguæe konstruisati digitalni hologra-fski mikroskop u uslovima optièke laboratorije.U daljem istra�ivanju, konstruisana aparatura bise mogla koristiti kao metod za prouèavanje pro-mene oblika neprovidinih tela, indeksa prelama-nja providnih tela kao i snimanja tela u pokretušto pru�a široku moguænost primene digitalneholografske mikroskopije posebno u biofizici.

Zahvalnost. Zahvaljujemo se svom mentorudr Dejanu Panteliæu sa Instituta za fiziku u Beo-gradu, rukovodiocu seminara fizike Jeleni Pajo-viæ, saradnicima seminara fizike u Istra�ivaèkojstanici Petnica, Marku Kuzmanoviæu i VladanuPavloviæu, na korisnim savetima i pru�enoj po-moæi tokom teorijskih priprema i konstrukcijeeksperimentalne postavke. Takoðe se zahvalju-jemo Tomici Mišljenoviæu, rukovodiocu semi-nara biologije na pomoæi tokom snimanja slikauzoraka optièkim mikroskopom.

Literatura

Haddad W. S., Cullen D., Solem J. C.,Longworth J. W., McPherson A., Boyer K.,Rhodes C. K. 1992. Fourier-transformholographic microscope. Applied Optics, 31:4973.

Kadelburg N., Rapajiæ V. 2011. Fizika za treæirazred Matematièke gimnazije. Beograd: Krug

Kim M. K. 2010. Principles and techniques ofdigital holographic microscopy. SPIE Reviews,1 (1): 018005.

Nedeljkoviæ N. 2009. Talasi i optika. Beograd:Fizièki fakultet Univerziteta u Beogradu

Schnars U., Juptner W. P. O. 2002. Digitalrecording and numerical reconstruction ofholograms. Measurement Science andTechnology, 13: R85.

Xu W., Jericho M. H., Meinertzhagen I. A.,Kreuzer H. J. 2002. Digital in-line holographyfor biological applications. Proc. Natl. Acad.Sci. U.S.A., 98: 11301.

Yaroslavskii L. P., Merzlyakov N. S. 1980.Methods of Digital Holography. New York:Consultants Bureau

Janko Šušteršiè and Marija Milutinoviæ

Construction of Digital HolographicMicroscope

The purpose of this project was the construc-tion of an experimental setup of digital holo-graphic microscopy, reconstruction of recordedholograms and observing performances of digi-tal holographic microscope. In digital hologra-phy the first step is recording holograms usingcharged coupled devices (CCD), and the secondstep is numerical reconstruction of hologramswhich enables the change of magnificationwithin boundaries not set by properties of opticalelements, but mostly by reconstruction methodand the performances of CCD sensor. In hologra-phy, on photosensitive material you can recordlight waves’ intensity in each point of hologramand also light waves’ phase difference which de-pends on deformations of the object’s surfaceand that allows us to obtain a three-dimensionalfigure.

Unlike the photography, holographic record-ing requires two coherent light beams. One wavethat illuminates the object is scattered and re-flected to the recording medium. The secondwave, called the reference wave, illuminates the

ZBORNIK RADOVA 2014 FIZIKA • 137

138 • PETNIÈKE SVESKE 73 DEO I

plate directly. Both waves are interfering on theholographic plate creating interference pattern.The interference pattern recorded on CCD iscalled a digital hologram. The He-Ne laser withwavelength of 633 nm was used in this experi-ment as a source of coherent light that is neces-sary for recording holograms. We used 40�microscope objective as optical magnifier andand also to widen the object wave over the wholesurface.

The diffraction of a light wave at an aperturewhich is fastened perpendicular to the incomingbeam is described by the Fresnel-Kirchhoff inte-gral. In the process of numerical reconstructionof holograms, convolution approach was used.The essence of this code reflects in its unusualsimplicity and speed.

In this project, we successfully recorded andreconstructed holograms of fly wings and onioncrust for different values of magnification be-tween 100� and 400� and determined the bound-ary magnification for apparatus used in thispaper. The reconstructed holograms were com-pared with optical images of the same objects un-der an optical microscope of 400�magnification.We observed clear similarity between these im-ages and it indicates that digital holographic mi-croscopy can be used as an alternative methodfor observing biological samples. The signifi-cance of the project lies in the advantages of us-ing digital holographic microscopy especially inbiophysics, as well as simplicity of the code thatallows the reconstruction of holograms in realtime.