kronik myelojenik losemili a wt1 gen ekspresyonu ve genetik degisikliklerin arastirilmasi wt1 gene...

Upload: gercekh

Post on 08-Apr-2018

224 views

Category:

Documents


0 download

TRANSCRIPT

  • 8/6/2019 Kronik Myelojenik Losemili a Wt1 Gen Ekspresyonu Ve Genetik Degisikliklerin Arastirilmasi Wt1 Gene Expression an

    1/112

    "B. SC. EVA SHYQYRIU" STANBUL NVERSTES SA. BL. ENST. YKSEK LSA

    YKSEKLSANSTEZ

    MoleklerBiyologEvaShyqyriu

  • 8/6/2019 Kronik Myelojenik Losemili a Wt1 Gen Ekspresyonu Ve Genetik Degisikliklerin Arastirilmasi Wt1 Gene Expression an

    2/112

    T.C.

    STANBUL NVERSTES

    SALIK BLMLER ENSTTS

    DANIMAN

    "PROF.DR. SENHA HACIHANEFOLU"

    "TEMEL ONKOLOJ / KANSER GENET"

    STANBUL-2006

    "MOL. BYO. EVA SHYQYRIU"

    KRONK MYELOJENK LSEML HASTALARDA WT1GEN EKSPRESYONU VE GENETK DEKLKLERN

    ARATIRILMASI

    ( YKSEK LSANS )

  • 8/6/2019 Kronik Myelojenik Losemili a Wt1 Gen Ekspresyonu Ve Genetik Degisikliklerin Arastirilmasi Wt1 Gene Expression an

    3/112

    2

    TEZ ONAYI

  • 8/6/2019 Kronik Myelojenik Losemili a Wt1 Gen Ekspresyonu Ve Genetik Degisikliklerin Arastirilmasi Wt1 Gene Expression an

    4/112

    3

    BEYAN

  • 8/6/2019 Kronik Myelojenik Losemili a Wt1 Gen Ekspresyonu Ve Genetik Degisikliklerin Arastirilmasi Wt1 Gene Expression an

    5/112

    4

    THAF

    Sevgili annem Olimbjadha Shyqyriu ve babam Nefail Shyqyriuye

  • 8/6/2019 Kronik Myelojenik Losemili a Wt1 Gen Ekspresyonu Ve Genetik Degisikliklerin Arastirilmasi Wt1 Gene Expression an

    6/112

    5

    TEEKKR

    Onkoloji Enstits mdr Prof. Dr. Erkan Topuza,

    almam boyunca bilgileri ve saladklar olanaklarla beni ynlendiren tez

    danmanm Prof. Dr. Seniha Hachanefiolu ve Anabilimdal bakanmz Prof. Dr.

    Nejat Dalaya,

    Yardm ve desteklerini esirgemeyen Prof. Dr. Vildan Yasasevere,

    statistiksel hesaplamalar konusunda bana yardmc olan Sn. Prof. Dr. Riyan

    Diiye,

    alma rneklerinin ve klinik bilgilerinin toplanmasndaki yardmlarndan

    dolay Do. Dr. Selim Yavuz, Dr. Mesut Ayer ve Dr. Naciye Yldrm Demirele,

    almam ve tez yazm srasnda destek ve yardmlarndan dolay Dr. Asl

    Rehber Beere,

    Destek ve yardmlarndan dolay alma arkadalarm Dr. Uur Deligezer, Dr.

    Semra Demokan, zlem zgven, Elif Akk, Ebru Akk, Zbeyde Yalnz ve Trkan

    ene,

    Bana yksek lisans renimim srasnda maddi ve manevi destekte bulunan

    ablam Dr. Liliana Ramasao, aabeyim Julian Shyqyriu ve nianlm Dr. Arjet Gegaya,

    Beni her zaman destekleyen arkadalarma ve tm sevdiklerime,

    Teekkrlerimi sunarm.

    Bu alma stanbul niversitesi Bilimsel Aratrma Projeleri Birimi tarafndan

    T-780/27122005 nolu proje olarak desteklemitir.

  • 8/6/2019 Kronik Myelojenik Losemili a Wt1 Gen Ekspresyonu Ve Genetik Degisikliklerin Arastirilmasi Wt1 Gene Expression an

    7/112

    6

    NDEKLER

    TEZ ONAYI ................................................................................................................ 2

    BEYAN .......................................................................................................................3THAF .........................................................................................................................4

    TEEKKR.................................................................................................................5

    NDEKLER ............................................................................................................6

    TABLOLAR LSTES ................................................................................................. 9

    EKLLER LSTES.................................................................................................. 10

    SEMBOLLER / KISALTMALAR LSTES ..............................................................11

    ZET......................................................................................................................... 13

    ABSTRACT............................................................................................................... 14

    1. GR VE AMA.......................................................................................15

    2. GENEL BLGLER .................................................................................... 17

    2.1.Kronik Myelojenik Lsemi ................................................................................. 18

    2.1.1.Snflandrma ................................................................................................. 18

    2.1.2.Epidemiyoloji ve Etiyolojisi...........................................................................18

    2.1.3. Evreleme.......................................................................................................20

    2.1.4. Sitokinetii ................................................................................................... 20

    2.1.5. Sitogenetii ................................................................................................... 22

    2.1.6. Molekler Biyolojisi ..................................................................................... 25

    2.1.6.1. ABL ve BCR genleri ................................................................................ 25

    2.1.6.2. BCR/ABL fzyon proteini ve Sinyal letim Yollar .................................. 28

    2.1.7. oklu ila direnci..........................................................................................30

    2.1.8.Klinik zellikleri ...........................................................................................31

    2.1.8.1.Kronik Faz ................................................................................................ 31

    2.1.8.2. leri Faz.................................................................................................... 312.1.8.3.Biyokimyasal Deiiklikler .......................................................................32

    2.1.9. Tedaviler.......................................................................................................32

    2.1.9.1. Imatinib Mesylate.....................................................................................32

    2.1.9.2. Hidroksire ..............................................................................................35

    2.1.9.3. Interferon- ..............................................................................................35

  • 8/6/2019 Kronik Myelojenik Losemili a Wt1 Gen Ekspresyonu Ve Genetik Degisikliklerin Arastirilmasi Wt1 Gene Expression an

    8/112

    7

    2.1.9.4. Busulfan...................................................................................................35

    2.1.9.5. Homoharringtonin .................................................................................... 36

    2.1.9.6. Kemik ilii transplantasyonu.................................................................... 36

    2.1.10. Kronik Myeloid Lsemi Varyantlar................... ......................................... 37

    2.1.10.1. Ph-negatif kronik myeloid lsemi ........................................................... 37

    2.1.10.2. Kronik myelomonositik lsemi...................... ......................................... 37

    2.1.10.3. Eozinofilik lsemi .................................................................................. 38

    2.2. WT1 geni........................................................................................................... 39

    2.2.1. Genin yaps .................................................................................................. 39

    2.2.2. Lsemide WT1 Geninin Rol........................................................................ 43

    2.2.3. Lsemide WT1 mutasyonlar ........................................................................45

    2.2.4. WT1 sinyal iletim mekanizmas .................................................................... 472.2.5. WT1 geninin onkogenik aktivitesi................................................................. 49

    3. GERE VE YNTEM ............................................................................... 51

    3.1. Gere.................................................................................................................51

    3.1.1. Materyal........................................................................................................ 51

    3.1.2. Kimyasal maddeler ve malzemeler................................................................ 52

    3.1.3. Kullanlan Cihazlar .......................................................................................53

    3.1.4. Tampon ve zeltiler....................................................................................53

    3.1.4.1. Lenfosit zolasyonu ve Jel Elektroforezi Tampon ve zeltiler................. 53

    3.1.4.2. FISHte kullanlan tampon ve zeltiler.................................................... 54

    3.2. YNTEMLER .................................................................................................. 56

    3.2.1. Molekler Biyoloji........................................................................................ 56

    3.2.1.1. Kandan Lenfosit zolasyonu ..................................................................... 56

    3.2.1.2. Lenfositlerden RNA zolasyonu ............................................................... 57

    3.2.1.3. cDNA Sentezi ..........................................................................................58

    3.2.1.4. NESTED PCR..........................................................................................59

    3.2.1.5. Elektroforez lemleri............................................................................... 62

    3.2.2. Floresan n Situ Hibridizasyon (FISH) ........................................................63

    3.2.2.1. Periferik kandan direkt yayma teknii ...................................................... 64

    3.2.2.2. Lenfositlerden yayma teknii ................................................................... 64

    3.2.2.3. n lem ve Prob uygulanmas ................................................................. 64

    3.2.2.4. Probun hazrlanmas ................................................................................. 65

  • 8/6/2019 Kronik Myelojenik Losemili a Wt1 Gen Ekspresyonu Ve Genetik Degisikliklerin Arastirilmasi Wt1 Gene Expression an

    9/112

    8

    3.2.2.5. Hibridizasyon sonras ykamalar............................................. .................. 66

    4. BULGULAR ..............................................................................................67

    4.1.Hasta ve kontrol grubunun zellikleri ................................................................. 67

    4.2. WT1 Ekspresyonunun Sonular........................................................................68

    4.3. FISH incelenmesinin deerlendirmesi ................................................................ 72

    4.3.1. Sinyallerin deerlendirilmesi.........................................................................75

    4.3.2. D-FISH ynteminin normal hcre aral ...................................................... 75

    4.4. statistikler......................................................................................................... 81

    5. TARTIMA................................................................................................84

    KAYNAKLAR ..........................................................................................................87

    FORMLAR .............................................................................................................. 105

    ETK KURUL KARARI .......................................................................................... 108ZGEM ............................................................................................................. 110

  • 8/6/2019 Kronik Myelojenik Losemili a Wt1 Gen Ekspresyonu Ve Genetik Degisikliklerin Arastirilmasi Wt1 Gene Expression an

    10/112

    9

    TABLOLAR LSTES

    Tablo 2-1: Kronik myeloproliferatif hastalklarda grlen sitogenetik anomaliler........23

    Tablo 2-2: WT1 geninin hedef genleri.........................................................................47

    Tablo 3-1: Ya ortalamas ve cinsiyete gre hastalarn dalm...................................51

    Tablo 3-2: Ya ortalamas ve cinsiyete gre kontrollerin dalm................................51

    Tablo 3-3: Kandan Lenfosit zolasyonu.......................................................................56

    Tablo 3-4: Hcrelerden RNA izolasyonu.....................................................................57

    Tablo 3-5: cDNA sentez yntemi ................................................................................58

    Tablo 3-6: GAPDH Geninin Primer Dizileri................................................................60

    Tablo 3-7: Birinci PCR iin Reaksiyon Karm .........................................................60

    Tablo 3-8: Birinci PCR iin Reaksiyon artlar ...........................................................60

    Tablo 3-9: kinci PCR iin Reaksiyon Karm...........................................................61

    Tablo 3-10: kinci PCR iin Reaksiyon artlar ...........................................................61

    Tablo 3-11: n lem aamalar...................................................................................65

    Tablo 3-12: Prob uygulama aamalar..........................................................................66

    Tablo 3-13: Hibridizasyon sonras aamalar. ...............................................................66

    Tablo 4-1: Hastalarn klinik bulgularna gre dalm.................................................67

    Tablo 4-2: Hastalarn PCR sonular............................................................................70

    Tablo 4-3: Kontrol Grubunda PCR sonular...............................................................71

    Tablo 4-4: Sinyal dalm ekillerinin snflandrlmas................................................75

    Tablo 4-5: Hastalarn FISH sonular ..........................................................................76

    Tablo 4-6: Hastalar ve kontroller arasnda WT1 gen ekspresyonunun karlatrlmas 81

    Tablo 4-7: Hastalarda fazlara gre WT1 ekspresyonu..................................................81

    Tablo 4-8: Hastalarda klinik fazlara gre Philadelphia kromozom pozitiflii...............82

    Tablo 4-9: Hastalarda FISH sonucu ve WT1 ekspresyonunun karlatrlmas ............82

    Tablo 4-10: Normal granulositlerin faz ile ilikisi........................................................83

    Tablo 4-11: Normal granulositlerin Philadelphia yzdesi ile ilikisi.............................83

  • 8/6/2019 Kronik Myelojenik Losemili a Wt1 Gen Ekspresyonu Ve Genetik Degisikliklerin Arastirilmasi Wt1 Gene Expression an

    11/112

    10

    EKLLER LSTES

    ekil 2-1: KML hcrelerinin oluumu .........................................................................21

    ekil 2-2: Translokasyonlarn gen ekspresyonunu etkileme yollar ........... ...................22

    ekil 2-3:BCR/ABL Fzyon proteininin aktivitesi.......................................................26

    ekil 2-4: BCR ve ABL genleri ve fzyon sonucu oluan transkriptler ........................27

    ekil 2-5: Sinyal iletim yollar.....................................................................................29

    ekil 2-6: Lsemi hcrelerinde oklu ila direncinden sorumlu mekanizmalar ............30

    ekil 2-7: Tirozin kinaz inhibitrlerin etki mekanizmas..............................................33

    ekil 2-8: WT1 genin yaps ........................................................................................40

    ekil 2-9: WT1 geninin izoformlar.............................................................................41

    ekil 2-10: WT1 Proteinin Yaps................................................................................42

    ekil 2-11: WT1 geninin transkripsiyonu dzenlenme mekanizmas...........................48

    ekil 3-1: WT1 geninin Nested PCR emas................................................................59

    ekil 3-2: Probun baland blge..............................................................................63

    ekil 4-1: Birinci PCR sonular..................................................................................68

    ekil 4-2: Birinci PCR Sonular (Devam) ..................................................................69

    ekil 4-3: Hastalarn ikinci PCR Sonular ..................................................................69

    ekil 4-4: Hastalarn ikinci PCR Sonular (Devam)....................................................70

    ekil 4-5: Kontrollerin ikinci PCR sonular................................................................71

    ekil 4-6: BCR/ABL translokasyonu D-FISH sinyal ekilleri......................................73

    ekil 4-7: Ayn hcrede farkl filtrelerle alnan resimlerdeki deiiklikler....................74

    ekil 4-8: Farkl hcre yaplarnda Philadelphia kromozomu.......................................77

    ekil 4-9: Farkl hastalarda 3 fzyon (3F) sinyal dalm............................................78

    ekil 4-10: Farkl hastalarda 2R2G normal sinyal dalm ekli...................................78

    ekil 4-11 Farkl hcrelerde delesyona ait tipik sinyaller.............................................79

    ekil 4-12: Hastalarda grlen farkl atipik sinyal ekilleri ..........................................80

  • 8/6/2019 Kronik Myelojenik Losemili a Wt1 Gen Ekspresyonu Ve Genetik Degisikliklerin Arastirilmasi Wt1 Gene Expression an

    12/112

    11

    SEMBOLLER / KISALTMALAR LSTES

    ABL: Abelson murine leukemia virus (A-MuLV) onkogeni

    ALL: Akut lenfoblastik lsemi

    AML: Akut myelojenik lsemi

    BCR /ABL: BCR ve ABL genlerini ieren fzyon geni

    BCR: Break point cluster region geni

    cDNA: Complementary DNA (single stranded DNA)

    CEP110: Centrosome-associated protein 110

    D-FISH: ift Renk ift Fzyon FISH (Dual color dual fusion FISH)

    EDTA: Etilendiamintetraasetikasit

    EGR1: Epidermal growth factor receptor 1

    EtOH: Etil Akol

    FAB: French-American-British cooperative group classification

    FGFR1: Fibroblast growth factor receptor 1

    FIP1L1: FIP1-like 1 geni

    FISH: Floresan in situ hibridizasyon

    FOP: FGFR1 oncogene partner

    GAPDH: Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

    G-CSF: Granulosit koloni-tetikleyici faktr

    GM-CSF: Granulosit-makrofaj koloni-tetikleyici faktr

    H4: Histone 4

    HERV-K: Human endogenous retrovirus protein (K family)

    HIP1: Huntingtin interacting protein 1

    HLA: Human leukemia antigen

    IL-3: interlkin 3

  • 8/6/2019 Kronik Myelojenik Losemili a Wt1 Gen Ekspresyonu Ve Genetik Degisikliklerin Arastirilmasi Wt1 Gene Expression an

    13/112

    12

    JAK2: Janus kinaz 2

    KML: Kronik myelojenik lsemi

    MML: Mixed lineage leukemia geni

    MRD: Minimal residual disease

    mRNA: messenger RNA

    PBS: Fosfat tamponu

    PDGFRA: Platelet-derived growth factor receptor

    PDGFRB: Platelet-derived growth factor receptor

    Ph: Philadelphia kromozomu

    PK - FISH: Periferik Kan yaymasnda Floresan in situ hibridizasyon

    RAB5: Rabaptin-5 geni

    RT PCR: Ters transkriptaz Polimeraz Zincir Reaksiyonu

    SCF: Kk hcre faktr

    siRNA: Small interference RNA

    TEB: Tris Borat Tamponu

    TEL: Translocation E26 transforming-specific leukemia protein

    WAGR: Wilms tmr, aniridia, genitoriner anomaliler ve mental retardasyon

    WT1: Wilms tmr geni 1

    ZNF198: inko parmak proteini 198

  • 8/6/2019 Kronik Myelojenik Losemili a Wt1 Gen Ekspresyonu Ve Genetik Degisikliklerin Arastirilmasi Wt1 Gene Expression an

    14/112

    13

    ZET

    Shyqyriu E. Kronik Myelojenik Lsemili hastalarda WT1 gen ekspresyonu ve Genetik

    Deiikliklerin Aratrlmas. stanbul niversitesi Salk Bilimleri Enstits, TemelOnkoloji ABD. Yksek Lisans Tezi. stanbul. 2006.

    Kronik myeloid lsemi (KML) gnmzde en ok aratrlan kanserlerdenbiridir. Wilms tmr geni 1 (WT1) mezotelyal dokularda ve rogenital organlarngeliiminde rol oynayan, inko-parmak yapsna sahip bir transkripsiyon faktrdr.mmatr hematopoetik ncl hcrelerde yksek seviyede ifade edilmesine vefarkllama srasnda ekspresyonunda grlen azalmaya dayanarak WT1 genininhematopoezde etkili olabilecei dnlmtr. Akut lsemilerde, yksek seviyedeifade edilmesi ve somatik mutasyonlarnn grlmesi nedeniyle WT1 geninin lsemi

    geliiminde etkili olabilecei ne srlmtr. WT1 gen ekspresyonunun KMLprognozu ile ilikisi halen aratrlmaktadr. Bu almada 57 KML hastas ve 50salkl bireyden oluan gruplarda WT1 gen ekspresyonu nested RT-PCR yntemi iledeerlendirilmitir. Kontrol geni olarak GAPDH geni kullanlmtr. KML hastalarnn%85,9unda (49/57) WT1 ekspresyonu pozitif bulunmutur. WT1 ekspresyonu salklbireylerin %38inde (19/50) pozitif bulunmutur. WT1 geninin KML hastalar ilekontrol grubunda tespit edilen ekspresyon deerleri arasnda istatistiksel olarak anlamlfark gzlenmitir (p < 0,001).

    KML hastalarnn %95inde grlen t(9;22)(q34;q11) Philadelphiakromozomunun varl BCR ve ABL genlerinin fzyonuna neden olmaktadr. BCR-ABL fzyonunun periferik kan yaymasnda floresan in situ hibridizasyon (PK-FISH)yntemi ile deerlendirilmesi hastalarn takibinin daha sk ve pratik bir ekilde

    yaplmas iin yeni bir yaklam olabilir. Bu almada deiik klinik fazlarda bulunan35 KML hastasnn periferik kan yaymasndan BCR-ABL fzyonu deerlendirilmitir.Hastaln klinik faz ile PK-FISH sonular arasnda anlaml iliki bulunmutur (p